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WO2020022782A1 - 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020022782A1
WO2020022782A1 PCT/KR2019/009202 KR2019009202W WO2020022782A1 WO 2020022782 A1 WO2020022782 A1 WO 2020022782A1 KR 2019009202 W KR2019009202 W KR 2019009202W WO 2020022782 A1 WO2020022782 A1 WO 2020022782A1
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WO
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seq
cells
immunoglobulin
region
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/009202
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English (en)
French (fr)
Inventor
김정호
김범석
Original Assignee
주식회사 굳티셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to CN201980049336.8A priority patent/CN112543644A/zh
Priority to CA3107159A priority patent/CA3107159A1/en
Priority to AU2019309472A priority patent/AU2019309472A1/en
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Definitions

  • the present invention relates to a composition capable of effectively preventing or treating an immune related disease.
  • Immunoglobulins comprise four polypeptide chains, ie two heavy and two light chains associated via interchain disulfide bonds. Each light chain has two domains, the variable light domain (VL) and the constant light chain domain (CL), and each heavy chain has two regions, namely the variable heavy chain region (VH) and the constant heavy chain region (CH).
  • the constant heavy chain region (CH) consists of the constant heavy chain region (e.g., CH1, CH2, CH3, etc.) designated by a number (e.g., US 6,086,875 (Blumberg RS, et al.), US 5,624,821 (Winter GP et al.) And US 5,116,964 (Capon DJ and Lasky LA).
  • Immunoglobulins are classified into different isotypes (ie, IgG, IgM, IgA, IgD and IgE) based on their biological properties, their location in the organism and their ability to process different antigens.
  • the constant heavy chain region may have three or four CH domains.
  • the heavy chain in some isotypes (IgA, IgD and IgG), contains a hinge region that adds flexibility to the molecule (Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.).
  • IgG1 There are four IgG subclasses (IgG1, 2, 3, 4) in humans, and such IgGs are named in the order in which they are abundant in serum (ie, IgG1 is most abundant).
  • the IgG isotype consists of two light chains and two heavy chains, each heavy chain comprising three constant heavy chain domains (CH1, CH2, CH3).
  • the two heavy chains of IgG are linked by disulfide bonds (-S-S-) to each other and to the light chain, respectively.
  • the antigen binding site of IgG is located in a fragment antigen binding region (Fab region) comprising the variable light (VL) and variable heavy (VH) domains as well as the constant light (CL) and constant heavy (CH1) domains.
  • Fab region fragment antigen binding region
  • the fragment crystallizable region (Fc region) of IgG is part of a heavy chain that contains CH2 and CH3 domains that bind Fc receptors found on the surface of certain cells, including neonatal Fc receptors (FcRn).
  • the heavy chain of IgG also has a hinge region between CH1 and CH2, which participates in separating the Fab region from the Fc region and joining the two heavy chains together via disulfide bonds.
  • the structure of the hinge region contributes to the unique biological properties of each of the four IgG subclasses.
  • IgG is secreted into small monomers that allow for easy perfusion of tissue. This is the only isotype with a receptor (newborn Fc receptor (FcRn)) that promotes passage through the human placenta to protect the fetus in the uterus. IgG absorbed through the placenta provides humoral immunity to newborns before their own immune system develops.
  • FcRn newborn Fc receptor
  • the IgG neonatal Fc receptor binding site is located in the Fc region of the antibody.
  • FcRn is commonly expressed in human placental and epithelial cells and participates in the endocytosis salvage pathway that prevents degradation of IgG. This salvage pathway is mediated by the high pH dependent binding affinity of IgG for FcRn at acidic pH.
  • the high affinity of IgG for FcRn at acidic pH is thought to induce binding of internalized IgG to FcRn after uptake into acidic endosomes (Goebl NA, et al., 2008); Junghans RP, et al., 1996].
  • the salvage pathway provides one mechanism for the development of next generation protein drugs with extended half-lives in the blood circulation compared to unmodified protein drugs.
  • unmodified protein drugs have a short circulating half-life and therefore require frequent administration over the long period of treatment required.
  • Extensive efforts have been made to extend the half-life of protein drugs by a number of methods including PEGylated fusion protein technology (Food and Drug Administration, Osborn BL, et al., 2002). The result was not ideal.
  • Immune disorders are diseases in which components of the mammalian immune system cause, mediate or otherwise contribute to the pathological condition of mammals, in particular inflammatory disorders are one of the most important health problems in the world.
  • Inflammation is generally a localized protective response of body tissues to host invasion by foreign substances or harmful stimuli.
  • causes of inflammation include infectious causes such as bacteria, viruses and parasites; Physical causes such as burns or irradiation; Chemicals such as toxins, drugs or industrial preparations; It may be an immune response, such as an allergic and autoimmune response, or a condition associated with oxidative stress.
  • Inflammation is characterized by pain, redness, swelling, fever and ultimate loss of function of the infected area. These symptoms are the result of a series of complex interactions between cells of the immune system.
  • the response of the cell results in an interactive network of different groups of inflammatory mediators: proteins (eg cytokines, enzymes (eg proteases, peroxidases), major basic proteins, adhesion molecules (ICAM, VCAM), lipid mediators (e.g. eicosanoids, prostaglandins, leukotriene, platelet activating factor (PAF)), reactive oxygen species (e.g.
  • autoimmune diseases one of immune diseases, are characterized by the immune system attacking its own organs and causing spontaneous reactions. These responses are due to the recognition of auto-antigens by T lymphocytes, leading to humoral (autoantigen production) and cellular (increased lymphocyte and macrophage cytotoxic activity) immune responses.
  • autoimmune diseases include the following: rheumatic diseases, psoriasis, systemic dermatitis, multiple sclerosis, lupus erythematosus, or worsening of the immune response by antigen, ie asthma, allergies to drugs or food These are all limited and chronic diseases, and in some cases fatal, to date there is no effective treatment for treating these diseases. Therefore, any drug, medicine or medium that can alleviate or alleviate the disease during the course of these diseases will be an important solution for the health of the patient.
  • autoimmune diseases mainly consists of immunosuppressive drugs such as glucocorticoids, calcineurin inhibitors. inhibitors and antiproliferatives-antimetabolites.
  • immunosuppressive drugs such as glucocorticoids, calcineurin inhibitors. inhibitors and antiproliferatives-antimetabolites.
  • pharmacological therapies act on a variety of targets, and as a whole, may lower immune function. Otherwise, long-term use of these pharmacological therapies poses a problem for several cytotoxic effects, which may expose the patient to risk of infectious diseases and immune related diseases by inhibiting the immune system in a nonspecific manner. Since calcineurin and glucocorticoids present another problem due to their nephrotoxicity and diabetes-causing properties, their use is limited for some clinical symptoms (eg renal failure, diabetes, etc.).
  • One object of the present invention is immune related comprising a fusion protein comprising an extracellular domain and an immunoglobulin Fc region of the leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1 (Lrig-1) protein as an active ingredient. It is to provide a composition for preventing, ameliorating or treating a disease.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing, ameliorating or treating the above immune related diseases.
  • compositions for preventing, improving or treating immune related diseases are provided.
  • One embodiment of the present invention provides a composition for preventing, ameliorating or treating an immune related disease.
  • composition of the present invention is a pharmaceutical composition; Food compositions; Or as a cosmetic composition.
  • composition of the present invention comprises a fusion protein comprising an extracellular domain and an immunoglobulin Fc region of Lrig-1 (leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) protein; Nucleic acid molecules encoding them; An expression vector comprising the nucleic acid molecule; Or a host cell transformed with the expression vector as an active ingredient.
  • Lrig-1 leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1
  • the Lrig-1 protein is a transmembrane protein consisting of 1091 amino acids present on the surface of regulatory T immune cells, leucine-rich repeat (LRR) and three immune bodies of the extracellular or lumen side. It consists of immunoglobulin-like domains, cell membrane penetration sequences and cytoplasmic tails.
  • the LRIG gene family includes LRIG1, LRIG2 and LRIG3, and the amino acids between them are highly conserved.
  • the LRIG1 gene is highly expressed in normal skin and can be expressed in basal and hair follicle cells to control the proliferation of epithelial stem cells.
  • the extracellular domain of the Lrig-1 protein may be an extracellular domain of Lrig-1 protein derived from a mammal including a human, a primate such as a monkey, a rodent such as a mouse and a rat.
  • the extracellular protein of the Lrig-1 protein may be an extracellular domain of Lrig-1 protein derived from human or mouse, but is not limited thereto.
  • the extracellular domain of the Lrig-1 protein may be represented by SEQ ID NO: 1 corresponding to the 35 th to 794 amino acid sequences of the human-derived Lrig-1 protein, which is a nucleic acid represented by SEQ ID NO: 2 It may be encoded by the sequence, but is not limited thereto (see Table 1).
  • the extracellular domain of the Lrig-1 protein may be represented by SEQ ID NO: 3 corresponding to the 35th to 794th amino acid sequence of the mouse-derived Lrig-1 protein, which is a nucleic acid represented by SEQ ID NO: 4 It may be encoded by the sequence, but is not limited thereto (see Table 2).
  • immunoglobulin Fc region means a site including heavy chain constant region 2 (CH2) and / or heavy chain constant region 3 (CH3) moieties excluding the heavy and light chain variable regions of an immunoglobulin.
  • the immunoglobulin Fc region may be one component forming a moiety of the protein conjugate of the present invention.
  • the immunoglobulin Fc region may include a hinge portion in the heavy chain constant region, thereby affecting structural flexibility of the fusion protein to be finally manufactured, and may increase productivity and stability of the fusion protein.
  • the present invention is not limited thereto.
  • immunoglobulin Fc region of the present invention has a substantially equivalent or improved effect to the natural type, only some or all heavy chain constant region 1 (CH1) and / or light chain constant except for the heavy and light chain variable regions of immunoglobulin It may be an extended Fc region including region 1 (CL1). It may also be a region from which some fairly long amino acid sequences corresponding to CH2 and / or CH3 have been removed.
  • CH1 heavy chain constant region 1
  • CL1 region 1
  • the immunoglobulin Fc regions of the present invention may comprise 1) CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain, 2) CH1 domain and CH2 domain, 3) CH1 domain and CH3 domain, 4) CH2 domain and CH3 domain, 5) Combination of one or two or more of the CH1 domain, CH2 domain, CH3 domain and CH4 domain with an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), 6) heavy chain constant region may be a dimer of each domain and light chain constant region .
  • an immunoglobulin hinge region or a portion of the hinge region
  • the immunoglobulin Fc region includes not only a native amino acid sequence but also a sequence derivative thereof.
  • Amino acid sequence derivatives mean that one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331 which are known to be important for binding for the IgG Fc may be used as appropriate sites for modification.
  • various kinds of derivatives may be removed such as a site capable of forming a disulfide bond, a few amino acids at the N-terminus in a native Fc, or a methionine residue may be added at the N-terminus of a native Fc. It is possible.
  • complement binding sites such as C1q binding sites may be removed, or ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) sites may be removed to eliminate effector function.
  • Techniques for preparing sequence derivatives of such immunoglobulin Fc regions are disclosed in WO 97/34631, WO 96/32478, and the like.
  • Amino acid exchange in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole in the present invention is known in the art (H. Neuroath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly.
  • it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation and amidation. may be modified.
  • the above-described Fc derivatives may exhibit biological activities equivalent to those of the Fc region of the present invention and may increase structural stability to heat, pH, etc. of the Fc region.
  • the Fc region may be obtained from a natural type separated in vivo from animals such as humans, cows, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats or guinea pigs, or may be obtained from transformed animal cells or microorganisms. It may be a recombinant or derivative thereof obtained.
  • the method of obtaining from the natural form may be a method of separating the whole immunoglobulin from a human or animal living body, and then processing the protease. When treated with papain, it is cleaved into Fab and Fc, and when treated with pepsin, it is cleaved into pF'c and F (ab) 2.
  • Fc or pF'c may be separated by size-exclusion chromatography or the like.
  • the recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism is an Fc region derived from human or mouse.
  • the immunoglobulin Fc region may be a natural sugar chain, an increased sugar chain compared to the natural form, a reduced sugar chain or a sugar chain removed from the natural form.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms can be used to increase or decrease such immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region in which the sugar chain is removed from the Fc is significantly reduced in binding strength with complement (c1q), and antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated, thereby not causing an unnecessary immune response in vivo. Do not.
  • a form more consistent with the original purpose as a carrier of the drug would be the immunoglobulin Fc region from which the sugar chains have been removed or unglycosylated.
  • “Deglycosylation” refers to the Fc region from which sugar is removed by an enzyme
  • Aglycosylation refers to an Fc region that is not produced by glycosylation in prokaryotes and, more specifically, in Escherichia coli. .
  • the immunoglobulin Fc region may be derived from humans or animals such as cattle, goats, pigs, mice, rabbits, hamsters, rats, guinea pigs, and the like, and may be derived from humans or mice.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention is IgG, IgA, IgD, IgE, IgM-derived Fc region, heavy chain constant region 2 (CH2), heavy chain constant region 3 (CH3), hinge, fragments thereof, or Hybrid Fc, including a combination, or a combination thereof.
  • the term "combination” refers to a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin Fc region, heavy chain constant region 2 (CH2) or heavy chain constant region 3 (CH3) when forming a dimer or multimer. Is meant to form a bond with single chain polypeptides of different origin. That is, it is possible to prepare dimers or multimers from two or more fragments selected from the Fc region, heavy chain constant region 2 (CH2) or heavy chain constant region 3 (CH3) derived from IgG, IgA, IgM, IgD or IgE.
  • the "hybrid Fc" may be derived from a combination of human IgG subclasses or a combination of human IgD and IgG.
  • the hybrid Fc may include, for example, an IgD hinge region and a CH2 N-terminal region + IgG4 CH2 and CH3 regions, for example, a hybrid Fc form disclosed in Korean Patent No. 0897938. May be used in the same manner, and is incorporated herein by reference.
  • the hybrid Fc when the hybrid Fc binds to a biologically active molecule, a polypeptide, or the like, it not only increases the serum half-life of the biologically active molecule, but also increases the expression level of the polypeptide when the nucleic acid molecule encoding the Fc-polypeptide fusion protein is expressed.
  • the height is effective.
  • the immunoglobulin Fc region is an Fc region derived from IgG, IgA, IgM, IgD or IgE, or heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constants derived from IgG, IgA, IgM, IgD or IgE.
  • Region 3 may be included, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be the IgG or IgM-derived Fc region that is most abundant in human blood, or may include the IgG or IgM-derived heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3).
  • IgG-derived Fc region known to enhance half-life of a ligand binding protein, or may comprise heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from said IgG, and another
  • the Fc region may be derived from IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4, or may include heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from the IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4.
  • the immunoglobulin Fc region comprises heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 5, or derived from mouse IgG2 represented by SEQ ID NO: 6
  • the heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of may include, but are not limited thereto (see Table 3 below).
  • Sequence Listing Sequence information SEQ ID NO: 5 LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEKFSQVVSL SEQ ID NO: 6 IFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCVVVDDFMPEDIYVEVEKKNKKVKTKVHTAQV
  • the immunoglobulin Fc region may include a hinge region derived from IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, or Abatacept, and as another example, IgG, IgD or Abatacept It may include a hinge region derived from, or may include, but is not limited to, a hinge region derived from IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD or Abatacept.
  • the immunoglobulin Fc region may comprise a hinge region derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 7; A hinge region derived from mouse IgG2 represented by SEQ ID NO: 8; A hinge region derived from human IgD represented by SEQ ID NO: 9; And a hinge region of Abatacept represented by SEQ ID NO: 10 (see Table 4 below) to increase structural flexibility of the fusion protein to be finally produced and to improve productivity of the fusion protein. And it can significantly improve the stability, but is not limited thereto.
  • the linker when the extracellular domain and the Fc region of the Lrig-1 protein are linked through a linker, the linker may be linked to the N-terminus, C-terminus or free radical of the Fc fragment, and Lrig-1 It may be linked to the N-terminus, C-terminus or free group of the extracellular domain of the protein. If the linker is a peptide linker, the linkage may occur at any site. For example, the linker may be linked to the C-terminus of the extracellular domain of the Lrig-1 protein and the N-terminus of the Fc region of the immunoglobulin, or the C-terminus and the Lrig of the Fc region of the immunoglobulin -1 protein may be linked to the N-terminus of the extracellular domain.
  • the "linker” reduces the interference effect between the extracellular domain of the Lrig-1 protein and the immunoglobulin Fc region in the fusion protein, thereby reducing the desired activity of the extracellular domain of the Lrig-1 protein in the target cell. It can increase.
  • the linker may include a sequence that can be cleaved by an enzyme that is overexpressed in a tissue or cell of a desired disease. When it can be cleaved by the overexpressed enzyme as described above it can effectively prevent the activity of the polypeptide is reduced due to the Fc portion.
  • the linker preferably has 1 to 100 amino acids, but is not limited thereto, and may be any peptide capable of separating the extracellular domain and the immunoglobulin Fc region of the Lrig-1 protein.
  • the amino acid sequence constituting the linker it is preferable to include glycine (G) and serine (S), or to include them repeatedly or in a random pattern.
  • the linker may be a peptide linker represented by SEQ ID NO: 11; And a peptide linker represented by SEQ ID NO: 12; It may include at least one of (see Table 5 below), or may be at least one selected from the group consisting of a peptide linker consisting of the amino acid sequence represented by the following formula 1 to 4.
  • n, m and p are each independently an integer of 1 or more;
  • q is an integer from 5 to 40;
  • X is A (Ala), C (Cys), D (Asp), E (Glu), F (Phe), G (Gly), H (His), I (Ile), K (Lys), L (Leu ), M (Met), N (Asn), O (Pyl), P (Pro), Q (Gln), R (Arg), S (Ser), T (Thr), U (Sec), V (Val ), W (Trp) and Y (Tyr).
  • n, m and q of the formulas 1 to 3 may be an integer of 1 or more, preferably 1 to 20, but is not limited thereto.
  • X in Formula 4 may be A (Ala), but is not limited thereto.
  • the linker is a peptide linker represented by SEQ ID NO: 96 (A (EAAAK) 4 ALEA (EAAAK) 4 A); Peptide linker represented by SEQ ID NO: 97 (PAPAP); Peptide linker represented by SEQ ID NO: 98 (AEAAAKEAAAKA); Peptide linker represented by SEQ ID NO: 99 (IEGRMD); And it may include at least one selected from the group consisting of a peptide linker (DIEGRMD) represented by SEQ ID NO: 100, but is not limited thereto.
  • DIEGRMD peptide linker represented by SEQ ID NO: 100, but is not limited thereto.
  • the fusion protein when the fusion protein further comprises the peptide linker, it is possible to increase the stability of the active material in the cell and further improve productivity.
  • a peptide linker consisting of 33 amino acids located in the 282th to 314th portions of the human albumin most present in the blood, more preferably 13 located in the 292 to 304th portion It may be a peptide linker consisting of four amino acids, and this part is a part that is mostly exposed to the outside of the three-dimensional structure is a part that minimizes the possibility of inducing an immune response in the body. However, it is not limited thereto.
  • the linker when the linker and the Fc region are separately expressed and then bound to each other, the linker may be a crosslinking agent known in the art.
  • the crosslinking agent is, for example, 1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane (1,1-bis (diazoacetyl) -2-phenylethane), glutaraldehyde, 4-azidosalicyl N-hydroxysuccinimide esters such as 4-azidosalicylic acid, 3,3'-dithiobis (succinimidylpropionate) Imidoesters, including disuccinimidyl esters, and bifunctional maleimides such as bis-N-maleimido-1,8-octane, but It is not limited.
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 1; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 5 (see Table 6 below).
  • the fusion protein represented by SEQ ID NOs: 13 to 16 in Table 6 may be encoded by the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 17 to 20 in Table 7 below (see Table 7 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 5 (see Table 8 below).
  • the fusion proteins represented by SEQ ID NOs 21 to 24 in Table 8 below may be encoded by nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOs 25 to 28 in Table 9 below (see Table 9 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from mouse IgG2 represented by SEQ ID NO: 6 (see Table 10 below).
  • the fusion proteins represented by SEQ ID NOs: 29 to 32 in Table 10 may be encoded by nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOs: 33 to 36 in Table 11, respectively (see Table 11 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 1; A linker represented by SEQ ID NO: 11; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 5 (see Table 12 below).
  • the fusion proteins represented by SEQ ID NOs 37 to 40 in Table 12 below may be encoded by nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOs 41 to 44 in Table 13, respectively (see Table 13 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3; A linker represented by SEQ ID NO: 11; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 5 (see Table 14 below).
  • the fusion proteins represented by SEQ ID NOs: 45 to 48 in Table 14 below may be encoded by nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOs: 49 to 52 in Table 15, respectively (see Table 15 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3; A linker represented by SEQ ID NO: 11; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from mouse IgG2 represented by SEQ ID NO: 6 (see Table 16 below).
  • the fusion proteins represented by SEQ ID NOs 53 to 56 in Table 16 below may be encoded by nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOs 57 to 60 in Table 17 below (see Table 17 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 1; A linker represented by SEQ ID NO: 12; A linker represented by SEQ ID NO: 11; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 5 (see Table 18 below).
  • the fusion protein represented by SEQ ID NOs: 61 to 64 in Table 18 may be encoded by the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 65 to 68 in Table 19 (see Table 19 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3; A linker represented by SEQ ID NO: 12; A linker represented by SEQ ID NO: 11; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1 represented by SEQ ID NO: 5 (see Table 20 below).
  • the fusion proteins represented by SEQ ID NOs: 69 to 72 in Table 20 below may be encoded by nucleic acid sequences represented by SEQ ID NOs: 73 to 76 in Table 21 below (see Table 21 below).
  • a fusion protein is an extracellular domain of Lrig-1 protein represented by SEQ ID NO: 3; A linker represented by SEQ ID NO: 12; A linker represented by SEQ ID NO: 11; A hinge region represented by any one of SEQ ID NOs: 7 to 10; It may be a fusion protein comprising heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from mouse IgG2 represented by SEQ ID NO: 6 (see Table 22 below).
  • the fusion protein represented by SEQ ID NOs: 77-80 of Table 22 below may be encoded by the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NOs: 81-84 of Table 23 (see Table 23).
  • composition of the present invention provides a nucleic acid molecule encoding the fusion protein provided in the present invention.
  • Nucleic acid molecules of the invention include both nucleic acid molecules in which the amino acid sequence of the fusion protein provided herein is translated into a polynucleotide sequence as known to those skilled in the art. Therefore, various polynucleotide sequences can be prepared by an open reading frame (ORF), all of which are also included in the nucleic acid molecules of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • composition of the present invention provides an expression vector into which the isolated nucleic acid molecule provided in the present invention is inserted.
  • the "vector” is the nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which a nucleic acid molecule is linked.
  • a vector which refers to circular double stranded DNA into which additional DNA segments can be ligated.
  • a phage vector Another type of vector is a viral vector, where additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Some vectors are capable of autonomous replication in the host cell into which they are introduced (eg, bacterial vectors are episomal mammalian vectors of bacterial replication origin).
  • vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • Other vectors can enter the host cell and integrate into the genome of the host cell, thereby replicating with the host genome.
  • some vectors can direct the expression of the genes to which they are linked in a working dimension.
  • Such vectors are referred to herein as “recombinant expression vectors” or simply "expression vectors.”
  • expression vectors of utility in recombinant DNA techniques are often in the form of plasmids.
  • plasmid and vector may be used interchangeably since the plasmid is the most commonly used form of the vector.
  • the expression vector in the present invention include commercially widely used pCDNA vectors, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vectors; Cosmid; Phages such as lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7; It may be selected from the group consisting of plant viruses, but is not limited thereto, and all expression vectors known to those skilled in the art can be used in the present invention, and the selection of the expression vector depends on the properties of the host cell of interest.
  • the introduction of the vector into the host cell may be performed by calcium phosphate transfection, viral infection, DEAE-dextran controlled transfection, lipofectamine transfection or electroporation, but is not limited thereto.
  • An introduction method suitable for the expression vector and the host cell can be selected and used.
  • the vector contains one or more selection markers, but is not limited thereto, and may be selected depending on whether the product is produced using a vector that does not include the selection marker.
  • the selection of the selection marker is selected by the host cell of interest, which uses methods already known to those skilled in the art and the present invention is not so limited.
  • tag sequences can be inserted and fused to an expression vector.
  • the tag may include, but is not limited to, a hexa-histidine tag, a hemagglutinin tag, a myc tag, or a flag tag. Any tag that facilitates purification known to those skilled in the art may be used in the present invention.
  • composition of the present invention provides a host cell transfected with the expression vector provided in the present invention.
  • host cell in the present invention includes individual cells or cell cultures that may or may have been recipients of the vector (s) for incorporation of the polypeptide insert.
  • Host cells include the progeny of a single host cell, which may not necessarily be exactly the same (in morphological or genomic DNA complement) as the original parent cell because of natural, accidental or deliberate mutations.
  • Host cells include cells transfected in vivo with the polypeptide (s) herein.
  • the host cell may include cells of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin, for example, bacterial cells such as E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Fungal cells such as yeast cells and peach pastoris; Insect cells such as Drozophila and Spodoptera Sf9 cells; Chinese hamster ovary cells (CHO), SP2 / 0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse myeloma), 293T, bow melanoma cells, HT-1080, BHK Animal cells of (Baby Hamster Kidney Cells), HEK (Human Embryonic Kidney Cells) or PERC.6 (Human Retinal Cells); Or it may be a plant cell, but is not limited thereto, any cell that can be used as a host cell line known to those skilled in the art is available.
  • bacterial cells such as E. coli, Streptomyces,
  • the composition may further include a V-domain Ig suppressor of T cell activation (VISTA) or a fragment thereof.
  • VISTA V-domain Ig suppressor of T cell activation
  • the linker may further comprise a linker between the VISTA or one fragment thereof and an immunoglobulin Fc region.
  • V-domain immunoglobulin inhibitor corresponds to an immune checkpoint protein that functions to suppress immune activity against T cells.
  • VISTA corresponds to a surface protein comprising an extracellular domain containing an IgG-V domain and a short cytoplasmic domain containing no ITAM, ITIM.
  • VISTA is expressed in CD11b + myeloid dendritic cells (DCs), CD4 + and CD8 + T cells, and Foxp3 + CD4 + regulatory T cells, and inhibits the secretion and proliferation of cytokines following activation of T cells. can do.
  • DCs myeloid dendritic cells
  • CD4 + and CD8 + T cells CD4 + and CD8 + T cells
  • Foxp3 + CD4 + regulatory T cells CD11b + myeloid dendritic cells
  • the VISTA may be derived from a mammal including a human, a primate such as a monkey, a rodent such as a mouse and a rat.
  • the VISTA may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 85, which is a human-derived VISTA, or may be encoded by a nucleotide represented by SEQ ID NO: 87, but is not limited thereto.
  • the VISTA may consist of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 86, which is a mouse-derived VISTA, or may be encoded by a nucleotide represented by SEQ ID NO: 88, but is not limited thereto.
  • one fragment of the VISTA may be an extracellular domain of the VISTA, but is not limited thereto.
  • the extracellular domain of VISTA may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 89 corresponding to the 33rd to 194th amino acid sequence of human-derived VISTA, but is not limited thereto.
  • the extracellular domain of VISTA may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 90 corresponding to the 33rd to 191th amino acid sequence of mouse-derived VISTA, but is not limited thereto.
  • one fragment of the VISTA may be one fragment of the extracellular domain of the VISTA, but is not limited thereto.
  • the fragment of the extracellular domain of VISTA may be composed of an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 91 to 93 which is a fragment of the extracellular domain of human-derived VISTA, but is not limited thereto.
  • the fragment of the extracellular domain of VISTA may be composed of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 94 or 95 which is a fragment of the extracellular domain of mouse-derived VISTA, but is not limited thereto.
  • VISTA or a fragment thereof, or a fusion protein comprising the same inserts an expression vector into which a nucleic acid molecule translated into a polynucleotide sequence is inserted into a host cell, as known to those skilled in the art. After incubation, it can be easily obtained through purification using chromatography.
  • nucleic acid molecule the expression vector, and the host cell are also duplicated as described above, and the description thereof is omitted below to avoid excessive complexity of the specification.
  • the "immune related disease” is induced by excessive activation and / or proliferation of various immune cells, for example effector T cells or cytotoxic T cells and inflammatory cells.
  • various immune cells for example effector T cells or cytotoxic T cells and inflammatory cells.
  • diseases autoimmune diseases; Graft-versus-host disease; Organ transplant rejection; asthma; atopy; Or an acute or chronic inflammatory disease, but is not limited thereto.
  • the "autoimmune disease” is rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Bechesi disease, Sjogren's syndrome, It may be at least one selected from the group consisting of Glia-Barre syndrome, chronic thyroiditis, multiple sclerosis, multiple myositis, ankylosing spondylitis, fibromyalitis, and nodular polyarteritis.
  • the "autoimmune disease” may be caused by a process in which activated T cells penetrate cells constituting nerves to induce inflammation or induce death of cells, for example, neurodegenerative diseases. Disease or neuro-inflammatory disease (Neuromolecular Med. 2005; 7 (3): 255-64.).
  • the neurodegenerative disease or neuroinflammatory disease is stroke, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, Niemann-Pick disease, prion disease prion disease, Creutzfeldt-Jakob disease, frontal temporal dementia, Louis dementia, AlzAmyotrophic lateral sclerosis, Paraeoplastic syndrome, cortical hypodegeneration, multiple system atrophy, May be selected from the group consisting of advanced nuclear palsy, neurological autoimmune diseases, spinocerebellar ataxia, inflammatory and neuropathic pain, cerebrovascular disease, spinal cord injury and tauopathy It is not limited to this.
  • the immune-related diseases such as autoimmune diseases, high levels of autoimmune T cells (e.g., effect T cells or toxic T cells, etc.) in the disease-induced patients compared to healthy controls.
  • Frequency or its activity is significantly increased, which may be induced by inducing an excessive immune response or by disrupting cells of a particular organ (Clinical & Experimental Immunology, 180: 353-360., Immunity, Vol. 17, 1-6, July, 2002., Ann Rheum Dis 2004; 63 (Suppl II): 96-101., Immunol Res. 2013 December; 57 (0): 12-22.
  • the immune-related disease is prevented, ameliorated by interfering with intracellular signal transduction pathways essential for the activation and / or proliferation of T cells (e.g. effector T cells or toxic T cells), preferably autoreactive T cells. Or can be treated (Ann Rheum Dis 2004; 63 (Suppl II): 96-101.).
  • T cells e.g. effector T cells or toxic T cells
  • the fusion protein according to the present invention may induce co-inhibitory signals in effector T cells to regulate the proliferation inhibition and activation of effector T cells.
  • various immune related diseases that may arise due to excessive activation and / or proliferation of T cells (eg, effector T cells or toxic T cells).
  • autoimmune diseases include, but are not limited to, immunosuppressive agents such as corticosteroids, cyclosporin, cyclophosphamide, prednisone, azathioprine, methotrexate, rapamycin, tacrolimus, biological agents, for example , TNF- ⁇ blockers or antagonists, or any other biological agent that targets any inflammatory cytokine, nonsteroidal anti-inflammatory drug / Cox-2 inhibitor, hydroxychloroquine, sulphasalazopryine, gold salt, etanercept (etanercept), infliximab, mycophenolate mofetil, basiliximab, ataccept, rituximab, cytoxan, interferon ⁇ - 1a, interferon ⁇ -1b, glatiramer acetate, mitoxantrone hydrochloride, anakinra and
  • Non-limiting examples of such known therapeutic agents include interferons such as IFN- ⁇ -1a (REBIF®, AVONEX® and CINNOVEX) Trademark)) and IFN- ⁇ -1b (BETASERON (registered trademark), EXTAVIA (registered trademark), BETAFERON (registered trademark), ZIFERON (registered trademark)) ; Glatiramer acetate (COPAXONE®), polypeptides; Natalizumab (TYSABRI®); And mitoxantrone (NOVANTRONE®), cytotoxic agents.
  • interferons such as IFN- ⁇ -1a (REBIF®, AVONEX® and CINNOVEX) Trademark)
  • IFN- ⁇ -1b BETASERON (registered trademark), EXTAVIA (registered trademark), BETAFERON (registered trademark), ZIFERON (registered trademark)
  • COPAXONE® Glatiramer acetate
  • COPAXONE® polypeptide
  • composition of the present invention can be used in combination with any known therapeutic agent for treating multiple sclerosis or a method for treating multiple sclerosis.
  • known therapeutic agents for treating multiple sclerosis or methods for treating multiple sclerosis include the interferon class, IFN- ⁇ -1a (Lviv (registered trademark), Avonex (registered trademark), and Sinobex (registered trademark)) And IFN- ⁇ -1b (betaceron®, EXTAVIA®, betaferon®, Zipferon®); Glatiramer acetate (copacson®), polypeptides; Natalizumab (Tisabri®); And mitoxantrone (Novantron®), cytotoxic agents, Fampridine (AMPYRA®).
  • drugs include corticosteroids, methotrexate, cyclophosphamide, azathioprine, and intravenous immunoglobulin (IVIG), inosine, okrelizumab (R1594), mylinax (Caldribine), alemtu Jumab (Campath), Daclizumab (Zenapax), Panaclar / Dimethyl Fumarate (BG-12), Teriflunomide (HMR1726), Fingolimod (FTY720) Hematopoietic stem cell transplantation, neurobox (Neurovax), rituximab (Rituxan) BCG vaccine, low dose naltrexone, antiparasitic therapy, angioplasty, venous stent, as well as laquinimod (ABR216062) And alternative therapies such as vitamin D, polyunsaturated fats, medical marijuana.
  • IVIG intravenous immunoglobulin
  • inosine okrelizumab
  • mylinax Caldrib
  • compositions of the present invention may be used in combination with any known therapeutic agent for the treatment of rheumatoid arthritis or a method for the treatment of rheumatoid arthritis.
  • known therapeutic agents for the treatment of rheumatoid arthritis or methods of treating rheumatoid arthritis include glucocorticoids, nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as salicylate or cyclooxygenase-2 inhibitors.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • DMARD disease control antirheumatic drug
  • DMARD-Oral DMARD Auranofin (Ridaura (Ridaura) Ridaura), Azathioprine (Imuran), Cyclosporine (Sandimmune, Gengraf, Neoral, Generic), D-Penisilamine ( Cuprimine), Hydroxychloroquine (Plaquenil), IM Gold Gold Sodium Thiomalate (Myochrysine) Aurothioglucose (Solganal) , Leflunomide (Ara (Arava), methotrexate (Rheumatrex), minocycline (Minocin), staphylococcal protein A immunosorbent (Prosorba column), sulfasalazine (Azulfidine), biological DMARD: TNF- ⁇ blockers, such as a
  • compositions of the present invention may be used in combination with any known therapeutic agent for type 1 diabetes or a method for treating type 1 diabetes.
  • known therapeutic agents for the treatment of type 1 diabetes include insulin, insulin analogues, pancreatic islet transplantation, stem cell therapies such as PROCHYMAL®, non-insulin therapies, for example , IL-1 ⁇ inhibitors, for example Anakinra (Kineret®), Avatarcept (Orencia®), Diamyd, Alefacept (Ameviv (registered) Trademarks)), Otelixizumab, DiaPep277 (Hsp60 derived peptide), Alpha 1-antitrypsin, Prednisone, Azathioprine, Cyclosporin, E1-INT (epithelial growth factor analogs and gastrin analogs) Injectable islet angiogenesis treatment), statins, e.g., Zocor® (registered trademark), Simup® (registered trademark), Simcard (registere
  • compositions of the present invention can be used in combination with any known therapeutic agent for the treatment of Sjögren's syndrome or Sjögren's syndrome.
  • therapeutic agents for the treatment of such known Sjogren's syndrome include cyclosporine, pilocarpine (Salagen) and cevimeline (Evoxac), hydrochloroquine (Placuque) Plaquenil), cortisone (prednisone and others) and / or azathioprine (Imuran) or cyclophosphamide (Cytoxan), dexamethasone, thalidomide, dehydroepi Androsterone, NGX267, Rebamipide, FID 114657, etanercept, Raptiva, Belimmumab, MabThera (rituximab); Anakinra, intravenous immunoglobulin (IVIG), allogeneic mesenchymal stem cells (AlloMSC), automatic
  • compositions of the present invention may be used in combination with any known therapeutic agent for the treatment of systemic lupus erythematosus or with the treatment of systemic lupus erythematosus.
  • therapeutic agents for the treatment of such known systemic lupus erythematosus include corticosteroids and disease-modulating antirheumatic drugs (DMARDs), usually anti-malarial drugs such as plaqueenyl and immunosuppressive agents (eg For example, methotrexate and azathioprine), hydroxychloroquine, cytotoxic drugs (eg cyclophosphamide and mycophenolate), hydroxychloroquine (HCQ), benlysta (belimumab) ), Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, prednisone, Celcept, Prograf, Atacicept, Lupusor, Intravenous immunoglobulin (IVIG), Celcept (mycophenol) Late mofetil), Orencia, CTLA4-
  • DMARDs
  • prevention may include without limitation any action that blocks the symptoms of, or inhibits or delays the symptoms of the disease using the composition of the present invention.
  • “improvement” or “treatment” may be used without limitation as long as all the actions of the symptoms of the disease are improved or benefited using the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be characterized in that the capsule, tablets, granules, injections, ointments, powder or beverage form, the pharmaceutical composition may be characterized in that it is intended for humans.
  • the pharmaceutical composition is not limited thereto, but may be used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, such as powders, granules, capsules, tablets, and aqueous suspensions, respectively, according to conventional methods.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may include binders, suspending agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersants, stabilizers, suspending agents, pigments, flavors, and the like in the case of oral administration, and in the case of injections, buffers, preservatives, analgesic Topical agents, solubilizers, isotonic agents, stabilizers and the like can be mixed and used, and for topical administration, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like can be used.
  • the formulation of the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with a pharmaceutically acceptable carrier as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, in the case of injections, in unit dosage ampoules or multiple dosage forms. have. And other solutions, suspensions, tablets, capsules, sustained release preparations and the like.
  • suitable carriers, excipients, and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, malditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil and the like can be used.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like may further be included.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition in the present invention is not limited thereto, but is oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention depends on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may vary depending on the patient's condition, weight, extent of disease, drug form, route of administration, and duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art, and 0.0001 to 50 mg / kg per day. Or 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the food composition may be prepared in the form of various foods, for example, beverages, gums, teas, vitamin complexes, powders, granules, tablets, capsules, sweets, rice cakes, breads, and the like.
  • the amount may be added in a ratio of 0.1 to 50% of the total weight, but is not limited thereto.
  • the food composition when the food composition is prepared in the form of a beverage, there is no particular limitation other than including the food composition in the ratio indicated, and may include various flavors or natural carbohydrates, etc. as additional ingredients, as in general beverages. .
  • monosaccharides such as glucose, disaccharides such as fructose, sucrose and the like, and common sugars such as polysaccharides, dextrins and cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol are used as natural carbohydrates. It may include.
  • the flavourant may be a natural flavourant (tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.), synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.).
  • the food composition may include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavoring agents, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages may further include.
  • the above components may be used independently or in combination.
  • the ratio of the additive is not a key element of the present invention, but may be selected from 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the food composition of the present invention, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition is a lotion, nutrition lotion, nutrition essence, massage cream, beauty bath additives, body lotion, body milk, bath oil, baby oil, baby powder, shower gel, shower cream, sunscreen lotion, sunscreen cream , Suntan cream, skin lotion, skin cream, sunscreen cosmetic, cleansing milk, depilatory cosmetics, face and body lotion, face and body cream, skin whitening cream, hand lotion, hair lotion, cosmetic cream, jasmine oil, bath Manufactured in the form of soap, water soap, beauty soap, shampoo, hand cleaner (hand cleaner), medical soap soap, cream soap, facial wash, systemic cleaner, scalp cleaner, hair rinse, cosmetic soap, gel for whitening teeth, toothpaste Can be.
  • the composition of the present invention may further comprise a solvent or a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of the cosmetic composition.
  • the kind of the solvent that may be further added in the cosmetic composition is not particularly limited, and for example, water, saline, DMSO, or a combination thereof may be used.
  • Carriers, excipients or diluents also include purified water, oils, waxes, fatty acids, fatty acid alcohols, fatty acid esters, surfactants, humectants, thickeners, antioxidants, viscosity stabilizers, chelating agents, buffers, lower alcohols, and the like. Included, but not limited to.
  • a whitening agent, a moisturizing agent, vitamins, sunscreens, perfumes, dyes, antibiotics, antibacterial agents, antifungal agents may be included as necessary.
  • Hydrogenated vegetable oil, castor oil, cottonseed oil, olive oil, palm oil, jojoba oil, avocado oil may be used as the oil in the present invention, and waxes, beeswax, carnauba, candelilla, montan, ceresin, and liquid paraffin may be used as waxes.
  • Lanolin may be used.
  • Stearic acid, linoleic acid, linolenic acid, oleic acid may be used as the fatty acid in the present invention
  • cetyl alcohol, octyl dodecanol, oleyl alcohol, pantenol, lanolin alcohol, stearyl alcohol, hexadecanol Isopropyl myristate, isopropyl palmitate, butyl stearate may be used as the fatty acid ester.
  • surfactants cationic surfactants, anionic surfactants and nonionic surfactants known in the art can be used, and surfactants derived from natural products are preferred as much as possible.
  • it may include a hygroscopic agent, a thickener, an antioxidant, and the like, which are widely known in the cosmetic field, and their types and amounts are known in the art.
  • a fusion protein according to the present invention; Nucleic acid molecules encoding them; An expression vector comprising the nucleic acid molecule; A host cell transformed with the expression vector; Or to a method for preventing, ameliorating or treating an immune related disease comprising administering to a subject a composition comprising the same.
  • the contents related to the fusion protein, the nucleic acid molecule, the expression vector, the host cell, the composition and the immune-related disease are omitted in order to avoid excessive complexity of the specification overlapping with that described in the pharmaceutical composition.
  • the "individual” is an individual suspected of developing an immune-related disease, and the suspected individual of developing an immune-related disease includes a mammal including a mouse, a livestock, and the like, including a human who may or may develop the disease.
  • the fusion protein of the present invention or the subject treatable with the composition comprising the same is included without limitation.
  • the methods of the present invention may comprise administering a fusion protein or a composition comprising the same in a pharmaceutically effective amount.
  • Appropriate total daily usage may be determined by the treating physician within the scope of good medical judgment and may be administered once or in divided doses.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved and, in some cases, whether other agents are used, the age, weight, general state of health, sex of the patient.
  • various factors and similar factors well known in the medical field including diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or concurrent with the specific composition.
  • the method of preventing, ameliorating or treating an immune related disease may be a combination therapy further comprising administering a compound or substance having therapeutic activity against one or more immune related diseases.
  • the "combination” should be understood to denote simultaneous, separate or sequential administration. If the administration is sequential or separate, the interval of administration of the secondary components should be such that the beneficial effect of the combination is not lost.
  • the dosage of the fusion protein may be about 0.0001 ⁇ g to 500 mg per kg of patient's body weight, but is not limited thereto.
  • the fusion protein provided by the present invention interacts with a ligand for the Lrig-1 protein present in activated T cells, thereby killing the activated T cells by giving a co-inhibitor signal to the activated T cells. Or by inducing inhibition of activity, which can effectively prevent, ameliorate or treat an immune related disease.
  • Figure 1 shows the structure of Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows the structure of the Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the expression level of Lrig-1 protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the expression level of Lrig-1 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of comparing the expression level of Lrig-1, Lrig-2 and Lrig-3 mRNA according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 7 shows the results of comparing the expression level of Lrig-1 protein in regulatory T cells and non-regulated T cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 8 shows the results of confirming the expression level of Lrig-1 protein on the surface of various immune cells according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows a subset of T cells in which there is a ligand recognized by the fusion protein according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 10 shows staining of activated T cells activated using na ⁇ ve T cells and anti-CD3 / 28 antibodies by concentration using a fusion protein and PD-L1-IgG according to an embodiment of the present invention. One result is shown.
  • FIG. 11 illustrates immunoprecipitation of activated T cells (Act) and Th1 cells (TH1) according to an embodiment of the present invention, followed by Western blot analysis using anti-VISTA antibodies. It is shown.
  • 12A and 12B show the activation of the cells using an anti-CD3 / 28 antibody according to an embodiment of the present invention, followed by binding to the cell surface for 30 minutes using the VISTA antibody, followed by Lrig-1-IgG.
  • the fusion protein was first bound to the surface of the activated T cells for 30 minutes, and then stained the cell surface using VISTA antibody, and then flow cytometry. Through analysis (B) is shown.
  • 13A and 13B show the change in the expression level of VISTA through flow cytometry by staining the surface of T cells every 24 hours using VISTA antibody after activating na ⁇ ve T cells with an anti-CD3 / 28 antibody.
  • the culture medium was recovered every 24 hours, and then the expression level of the extracellular domain was measured using the VISTA ELISA kit.
  • the measurement result (B) is shown.
  • FIGS. 14A and 14B illustrate blood through centrifugation by extracting blood from normal mouse and mouse animal models induced with rheumatoid arthritis (RA) or inflammatory bowel disease (IBD) according to an embodiment of the present invention. After isolation, the result of measuring the concentration of the extracellular VISTA extracellular domain in the serum using an ELISA targeting the extracellular extracellular domain is shown graphically.
  • RA rheumatoid arthritis
  • IBD inflammatory bowel disease
  • Figure 15 shows the results of analyzing the expression level of CD25, a surface protein induced on the cell surface after activating na ⁇ ve T cells according to an embodiment of the present invention by FACS.
  • 16a, 16b, 16c and 17 show the results of confirming the proliferation inhibitory effect by the fusion protein according to the present invention in the activated T cells of the fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • the fusion protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21; Nucleic acid molecules encoding them; An expression vector comprising the nucleic acid molecule; Or it provides a composition for the prevention, improvement or treatment of immune-related diseases comprising the host cell transformed with the expression vector as an active ingredient.
  • T cells In order to confirm that Lrig-1 protein is expressed only in regulatory T cells (Treg), subsets of T cells, Th0, Th1, Th2, Th17 and iTreg, were prepared.
  • the iTreg refers to cells which artificially induced differentiation in a medium containing the following composition, unlike nTreg, which is naturally isolated.
  • Subtypes of T cells were first isolated from na ⁇ ve T cells obtained from the spleen of the rat, and then RPMI1640 (FB; hyclone, logan, UT) 10% RPMI1640 (Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) In order to further include the components of Table 24 in the nutrient medium, differentiation was induced to each cell through 72 hours incubation in 37 °C, 5% CO2 incubator.
  • the three-dimensional conformation of the extracellular domain of Lrig-1 protein was predicted to produce a fusion protein including the extracellular domain of Lrig-1 protein, which is a surface protein of regulatory T cells.
  • LRR1 to LRR15 existed in the Lrig-LRR domain (amino acid sequence Nos. 41 to 494) in the extracellular domain of Lrig-1 protein.
  • LRR domains consisted of 23 to 27 amino acids, with 3 to 5 leucine present.
  • three immunoglobulin-like domains exist in amino acid sequences 494 to 781 of the Lrig-1 protein in the extracellular domain of the Lrig-1 protein.
  • Lrig-1 protein was tested to act as a biomarker specific for regulatory T cells.
  • CD4 + T cells were isolated from the spleen of mice using magnet-activated cell sorting (MACS) through CD4 beads. Thereafter, regulatory T (CD4 + CD25 + T) cells and non-regulated T (CD4 + CD25 ⁇ T) cells were separated using a fluorescent activated cell sorter (FACS) using a CD25 antibody.
  • FACS fluorescent activated cell sorter
  • Each cell and the cells differentiated in Preparation Example 1 extracted mRNA using Trizol, and genomic RNA was removed gDNA by a protocol provided by a company using gDNA extraction kit (Qiagen). . gDNA removed mRNA was synthesized into cDNA through the BDsprint cDNA Synthesis Kit (Clonetech).
  • the real-time polymerase chain reaction was performed by SYBR Green (Molecular Probes) using a protocol provided by the manufacturer for 3 minutes at 95 °C, 15 seconds at 61 °C, 40 cycles of 30 seconds at 72 °C, Table 25 It was performed using a primer, relative gene expression was calculated using the delta CT method, and normalized using HPRT, the results are shown in Figures 4-6.
  • the expression of Lrig-1 in regulatory T cells was 18.1 times higher than in non-regulated T cells (CD4 + CD25 + T cells). This was about 10-fold higher expression level compared to Lag3 and Ikzf4, markers of known regulatory T cells.
  • Lrig-1 expression was the highest among the Lrig-1, Lrig-2 and Lrig-3 corresponding to the Lrig family.
  • Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells, particularly naturally occurring regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein expressed from Lrig-1 mRNA was specifically expressed only in regulatory T cells.
  • a magnet-activated cell sorter (magnet-activated) from a mouse's spleen to CD4 beads using FOXP3-RFP-knocked-in mice incorporating a red fluorescence protein (RFP) to the FOXP3 promoter, a regulatory T cell-specific transcription factor.
  • CD4 + T cells were isolated using cell sorting (MACS). Then, using a RFP protein, regulatory T cells (CD4 + RFP + T cells) and non-regulated T cells (CD4 + RFP-T cells) were obtained by fluorescence activated cell sorter (FACS). Each of the cells was purchased Lrig-1 antibody and negative control group isotype (isotype) to measure the expression level of Lrig-1 with a fluorescent active cell sorter, the results are shown in Figure 7.
  • the non-regulated T cells indicated by dotted lines showed almost the same expression level of Lrig-1 as the negative control, but there were a large number of cells with high expression levels of Lrig-1 in the case of regulatory T cells. .
  • Lrig-1 protein according to the present invention is specifically expressed in regulatory T cells.
  • Lrig-1 protein was confirmed whether it is expressed on the surface of regulatory T cells.
  • Each differentiated T cell subtype of Preparation Example 1 was stained with anti-CD4-APC and anti-Lrig-1-PE antibodies and surfaced on each cell using a Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS). The expression level of Lrig-1 protein at was measured, and the results are shown in FIG. 8.
  • FACS Fluorescence-Activated Cell Sorter
  • Lrig-1 is expressed in an amount of 0.77 to 15.3 in activated T cells, Th1 cells, Th2 cells, Th17 cells, and Naive T cells, whereas differentiation was highly expressed as 83.9 in T-induced T cells (iTreg).
  • the Lrig-1 protein according to the present invention is not only specifically expressed in regulatory T cells (Treg) cells, but also specifically expressed at higher levels on the surface of the regulatory T cells. .
  • each nucleic acid sequence encoding each fusion protein in Table 26 was synthesized. NheI and EcoRI restriction enzyme sequences were added to the 5 'and 3' ends of the nucleic acid sequence, respectively.
  • Mouse IgG kappa light chain signal peptide (ATGGAAACCGATACTCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCTCTACCGGG) was inserted to allow the protein to be secreted out of the cell.
  • nucleic acid sequence encoding each of the fusion proteins of Table 26 the extracellular domain of a human-derived Lrig-1 protein or VISTA protein; Optionally a linker; Hinge area; A stop codon was inserted after the nucleic acid sequence encoding heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) derived from human IgG1.
  • CH2 heavy chain constant region 2
  • CH3 heavy chain constant region 3
  • the 293F cells were transformed using polyethyleneimine (Polyethylenimine), and the expression vector prepared in 1. was incubated for 6 days at 37 ° C. and 8% CO 2 . The culture supernatant was filtered and poured into Protein A resin and washed with 1X PBS. The solution was eluted with a 0.1 M glycine solution at pH 3.5, and then neutralized by adding 1 M TRIS solution at pH 9.0. The solution was then dialyzed into PBS solution and concentrated.
  • polyethyleneimine Polyethylenimine
  • Example 5 recognized by the fusion protein according to the invention Lrig The distribution of -1 ligands
  • the fusion protein of Preparation Example 5 was hardly bound with antigen on the surface of na ⁇ ve T cells, so staining was weakly observed (0.71%), and activated T cells, Th1 cells, and Th2 cells. And the antigen on the surface of Th17 cells and the fusion protein of Preparation Example 5 was observed to be bound at a very high level and stained more than 96%.
  • the ligand of the Lrig-1 protein was found to be a surface protein induced by the stimulation of the T cell receptor (receptor).
  • PD-L1-IgG fusion protein capable of recognizing PD-1 which is known to be highly expressed in previously activated T cells and T cell subsets (trade name: rmB7-H1 / Fc Chimera, manufactured by R & D systems) , Cat No .: 1019-B7) (hereinafter referred to as 'PD-L1-IgG'); Or concentration-dependent staining on the surface of the na ⁇ ve T cells and activated T cells with the fusion protein of Preparation Example 5, by measuring the level of binding of the fusion protein of Preparation Example 5 on each cell surface using a cell sorter The results are shown in FIG. 10.
  • the ligand of the Lrig-1 protein was expressed at a high expression level on the surface of activated T cells or T cell subsets compared to na ⁇ ve T cells.
  • Example 6 after confirming that the ligand of the Lrig-1 protein is highly expressed on the surface of the activated T cells, the fusion protein of Preparation Example 5 was used to confirm what molecule the ligand is expressed in the activated T cells.
  • Cell lysates of activated T cells and Th1 cells were immunoprecipitation.
  • Western blot monoclonal antibody
  • V-domain Ig suppressor of T cell activation VISTA
  • VISTA binds to the fusion protein of Preparation Example 5 at a very high level in both activated T cells (Act) and Th1 cells (TH1). This shows that the ligand of the Lrig-1 protein is VISTA.
  • VISTA present on the surface of activated T cells directly interacts with Lrig-1 protein
  • concentration-dependent binding of VISTA mAb to the surface of activated T cells was performed using the fusion protein of Preparation Example 5 After staining, the degree of staining was confirmed using a Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS), and the results are shown in FIGS. 12A and 12B.
  • FACS Fluorescence-Activated Cell Sorter
  • the staining rate of VISTA was decreased even when the fusion protein of Preparation Example 5 was first bound to the surface of the activated T cells and VISTA mAb was bound.
  • VISTA is expressed on the surface of activated T cells, and it can be seen that Lrig-1 protein recognizes and interacts with each other.
  • mouse na ⁇ ve T cells were activated with an anti-CD3 / 28 antibody, and then the expression level of VISTA was confirmed at each time, and the results are shown in FIG. 13A. .
  • the expression level of VISTA was gradually increased until 72 hours of activation, but after 96 hours, the expression level was gradually decreased on the surface.
  • the expression level of the VISTA extracellular domain present in the cell culture medium of activated T cells through ELISA that recognizes the extracellular domain of VISTA is measured over time, and the result is shown in FIG. 13. It is shown in B.
  • the extracellular domain of VISTA was hardly detected in the culture medium until 72 hours after activation, but after 96 hours, the extracellular domain of VISTA extracellular domain was observed in the culture medium. It was confirmed that the level of expression is rapidly increased (Fig. 13 (B)). That is, the expression level of the VISTA extracellular domain shows a pattern opposite to the expression level of VISTA present on the surface of the activated T cells, and the VISTA extracellular domain in the culture medium is present on the surface of the activated T cells. It was found that VISTA was cleaved and secreted.
  • CsA cyclosporine
  • Na ⁇ ve T cells, CD4 + CD62L + T cells, were isolated from the spleen of 8-week-old C57BL / 6 mice, and then the na ⁇ ve T cells were activated using an anti-CD3 / anti-CD28 mAb immobilized on a plate. The activated T cells were then dispensed into 96 well plates. Then, the 96 well plate was treated with 1 ⁇ g / ml of anti-CD3 mAb and the fusion protein of Preparation Example 5 corresponding to a concentration of 1 ⁇ g / ml, 5 ⁇ g / ml or 10 ⁇ g / ml, followed by CSFE. After staining using the FACS to observe the degree of proliferation of cells in the manner of analysis, the results are shown in Figures 16 and 17. An anti-FLAG antibody was used in place of the fusion protein of Preparation Example 5 as a control.
  • a co-inhibitory signal is generated on the activated T cells, thereby significantly inhibiting the activation of the T cells, thereby enabling the activated T cells to be activated. It can be applied very effectively to the prevention, amelioration or treatment of the resulting immune-related diseases.
  • the fusion protein provided by the present invention interacts with a ligand for the Lrig-1 protein present in activated T cells, thereby killing the activated T cells by giving a co-inhibitor signal to the activated T cells. Or by inducing inhibition of activity, which can be used very effectively in the field of prevention, amelioration or treatment of immune related diseases.

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Abstract

본 발명은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 세포 외 도메인(extracellular domain) 및 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 상기의 융합 단백질은 활성화된 T 세포에 존재하는 Lrig-1 단백질에 대한 리간드와 상호 작용하여, 활성화된 T 세포에 동시억제(co inhibitory) 시그널을 줌으로써 상기 활성화된 T 세포의 사멸 또는 활성의 억제를 유도함으로써 면역 관련 질환을 매우 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 면역 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
면역글로불린(immunoglobulin)은 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 회합된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인, 즉 가변 경쇄 도메인 (VL) 및 불변 경쇄 도메인 (CL)을 갖고, 각각의 중쇄는 2개의 영역, 즉 가변 중쇄 영역 (VH) 및 불변 중쇄 영역 (CH)을 갖는다. 불변 중쇄 영역 (CH)은 숫자에 의해 지정된 불변 중쇄 영역 (예를 들어, CH1, CH2, CH3 등)으로 이루어진다 (예를 들어, US 6,086,875 (블룸버그 알. 에스.(Blumberg R. S.) 등), US 5,624,821 (윈터 (Winter G. P.) 등) 및 US 5,116,964 (카폰 디. 제이.(Capon D. J.) 및 라스키 엘. 에이.(Lasky L. A.)) 참조). 면역글로불린은 그의 생물학적 특성, 유기체 내의 위치 및 상이한 항원을 처리하는 능력에 기초하여 상이한 이소형(즉, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE)으로 분류된다. 이뮤노글로불린 이소형에 따라, 불변 중쇄 영역 (CH)은 3개 또는 4개의 CH 도메인을 가질 수 있다. 또한, 일부 이소형 (IgA, IgD 및 IgG)에서, 중쇄는 분자에 유연성을 부가하는 힌지 영역을 포함한다 (Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.).
인간에는 4개의 IgG 하위클래스 (IgG1, 2, 3, 4)가 있고, 이와 같은 IgG는 혈청에 풍부한 순서에 따라 명명된다 (즉, IgG1이 가장 풍부하다). IgG 이소형은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어지고, 각각의 중쇄는 3개의 불변 중쇄 도메인 (CH1, CH2, CH3)을 포함한다. IgG의 2개의 중쇄는 서로에 대해 및 경쇄에 각각 다이설파이드 결합 (-S-S-)에 의해 연결되어 있다. IgG의 항원 결합 부위는 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 도메인뿐만 아니라 불변 경쇄 (CL) 및 불변 중쇄 (CH1) 도메인을 포함하는 단편 항원 결합 영역 (Fab 영역)에 위치한다. IgG의 단편 결정화가능 영역 (Fc 영역)은 신생아 Fc 수용체 (FcRn)를 포함하는 특정 세포의 표면에서 발견되는 Fc 수용체에 결합하는 CH2 및 CH3 도메인을 함유하는 중쇄의 일부이다. IgG의 중쇄는 또한 Fab 영역을 Fc 영역으로부터 분리하고 2개의 중쇄를 디술피드 결합을 통해 함께 연결할 때 참여하는, CH1과 CH2 사이의 힌지 영역을 갖는다. 힌지 영역의 구조는 4개의 IgG 하위클래스 각각의 특유한 생물학적 특성에 기여한다.
IgG는 쉽게 조직을 관류할 수 있도록 허용하는 크기가 작은 단량체로 분비된다. 이것은 자궁 내의 태아를 보호하기 위해 인간 태반을 통과하는 것을 촉진하는 수용체 (신생아 Fc 수용체 (FcRn))를 갖는 유일한 이소형이다. 태반을 통해 흡수된 IgG는 그 자체 면역계가 발달하기 전에 체액성 면역을 신생아에게 제공한다.
IgG 신생아 Fc 수용체 결합 부위는 항체의 Fc 영역에 위치한다. FcRn은 일반적으로 인간의 태반 및 상피 세포에서 발현되고, IgG의 분해를 막는 세포내 이입 샐비지 경로에 참여한다. 이 샐비지 경로는 산성 pH에서 FcRn에 대한 IgG의 높은 pH 의존성 결합 친화도에 의해 매개된다. 산성 pH에서 FcRn에 대한 IgG의 높은 친화도는 산성 엔도솜 내로의 흡수 후에 내재화된 IgG의 FcRn에 대한 결합을 유발하는 것으로 생각된다 ([Goebl NA, et al., 2008]; [Junghans RP, et al., 1996]). 대부분의 가용성 단백질은 내재화 후에 리소솜으로 향하지만, 내재화된 FcRn-결합 IgG는 형질 막으로 되돌아가고, 기본 분해 경로로부터 효과적으로 구출된다. 세포외 공간의 중성 pH에 노출시, IgG는 FcRn으로부터 해리되어 순환계로 되돌아갈 수 있다. 따라서, 항체의 연장된 혈청 반감기 특성은 Fc 단편에서 유지된다.
상기 샐비지 경로는 비변형된 단백질 약물에 비해 혈액 순환에서 반감기가 연장된 차세대 단백질 약물의 개발을 위한 하나의 메커니즘을 제공한다. 특히, 비변형된 단백질 약물은 순환 반감기가 짧고, 따라서 필요한 장기간의 치료 기간에 걸쳐 빈번한 투여가 필요하다. PEG화 융합 단백질 기술 (미국 식품의약국 (Food and Drug Administration), [Osborn BL, et al., 2002])을 포함한 많은 방법에 의해 단백질 약물의 반감기를 연장하기 위한 광범위한 노력이 이루어졌지만, 이러한 노력의 결과는 이상적이지 않았다.
면역 질환은 포유류 면역계의 구성 성분들이 포유류의 병리 상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환으로서, 특히 염증성 장애는 전 세계에서 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학 약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.
염증은 통증, 적화 현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자의 상호작용 네트워크가 생성된다: 단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O2-, 산화질소(NO) 등). 그러나 염증의 이들 매개자 중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다.
또한, 면역 질환 중 하나인 자가면역질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상 (림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다. 자가면역질환으로서는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 류마티스성 질환, 건선, 전신성 피부근염, 다발성 경화증, 홍반성 낭창, 또는 항원에 의한 면역반응 악화, 즉, 천식, 약물 또는 음식에 대한 알레르기 등 이러한 질환들은 모두 제한성이고 만성인 질환들이며, 경우에 따라서는 치명적이고 현재까지 상기 질환들을 치료할 수 있는 효과적인 치료 방법이 존재하지 않는 실정이다. 그러므로 이들 질환의 진행 중에 질환을 경감시키거나 완화시킬 수 있는 약물, 의약 또는 매체라면 환자의 건강을 위해서 중요한 해결 수단이 된다고 할 것이다.
많은 연구자들은 자가면역질환의 치료 방법을 탐색하여 적당한 약물과 방법을 찾고자 집중적인 노력을 해왔으며, 오늘날, 자가면역질환의 치료는 주로 면역억제 약물, 예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitors) 및 증식억제제-대사물 작용 억제제(antiproliferatives-antimetabolites)의 사용에 근거한 것이다. 그러나 이와 같은 약리 요법은 다양한 표적들에 대하여 작용하므로, 전체적으로는 면역기능을 저하시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 이러한 약리 요법을 장기간 사용하였을 경우 여러 가지 세포 독성 작용이 문제가 되어, 면역 체계를 비특이적인 방식으로 억제함으로써, 환자를 감염증 및 면역 관련 질환에 걸릴 위험에 노출시킬 수 있다. 칼시뉴린과 글루코코르티코이드는, 그들의 신독성과 당뇨병 유발 특성에 기인하여 또 다른 문제점을 나타내기 때문에, 몇 가지 임상학적 증상의 경우(예: 신기능 부전, 당뇨병 등)에는 그 사용이 제한된다.
따라서 자가면역질환, 염증성 질환, 이식거부반응 등과 같은 면역 관련 질환을 치료할 수 있는 물질로서, 부작용이 없으면서도 치료 효과가 우수한 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 세포 외 도메인(extracellular domain)과 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
1. 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명의 일 구현 예에서는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 조성물은 약학 조성물; 식품 조성물; 또는 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 세포 외 도메인(extracellular domain) 및 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질; 이를 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포를 유효 성분으로 포함한다.
이하, 본 발명의 각 구성에 대해 자세히 설명한다.
유효성분
1) 융합 단백질
Lrig -1 단백질의 세포 외 도메인
본 발명에서 상기 Lrig-1 단백질은 조절 T 면역 세포의 표면에 존재하는 1091개의 아미노산으로 이루어진 막관통 단백질로서, 세포 외 혹은 루멘 쪽의 루신 반복 서열(leucine-rich repeat(LRR))과 세개의 면역체 유사 도메인(immunoglobulin-like domains), 세포막 관통 서열 및 세포질 꼬리부분으로 구성되어 있다. LRIG 유전자 패밀리는 LRIG1, LRIG2와 LRIG3이 존재하며, 이들간의 아미노산들은 매우 보전적으로 구성되어 있다. 상기 LRIG1 유전자는 정상 피부에서 높게 발현하고 있으며, 기저와 모낭 세포에 발현하여 상피 줄기세포의 증식을 조절할 수 있다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류, 등을 포함하는 포유류로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인일 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 단백질은 인간 또는 마우스로부터 유래된 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 인간 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 1로 표시될 수 있고, 이는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(표 1 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000001
본 발명의 다른 예시에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 마우스 유래 Lrig-1 단백질의 35번째 내지 794번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 3으로 표시될 수 있고, 이는 서열번호 4로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(표 2 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000002
면역글로불린 Fc 영역
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 단백질 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다.
본 발명에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함함으로써 최종 제조될 융합 단백질의 구조적 유연성(flexibility)에 영향을 줄 수 있고, 융합 단백질의 생산성 및 안정성을 보다 높일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
본 발명에서 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번째 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
본 발명에서 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제WO96/32478호 등에 개시되어 있다.
본 발명에서 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
본 발명에서 상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질 전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인으로 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신으로 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 또는 마우스 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
본 발명에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물 유래일 수 있으며, 바람직한 일 예시로 인간 또는 마우스 유래일 수 있다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 Fc 영역, 중쇄 불변영역 2(CH2), 중쇄 불변영역 3(CH3), 힌지(hinge), 이의 단편, 또는 이들의 조합(combination), 또는 이들의 조합을 포함하는 하이브리드 Fc(hybrid Fc)일 수 있다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역, 중쇄 불변영역 2(CH2) 또는 중쇄 불변영역 3(CH3)을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 유래의 Fc 영역, 중쇄 불변영역 2(CH2) 또는 중쇄 불변영역 3(CH3)으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 상기 "하이브리드 Fc"는 인간 IgG 서브클래스의 조합 또는 인간 IgD 및 IgG의 조합으로부터 유도될 수 있다. 하나의 실시예에서, 상기 하이브리드 Fc는 예를 들어, IgD 힌지 영역 및 CH2 N-말단 영역 + IgG4 CH2 및 CH3 영역을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 한국등록특허 제0897938호에 개시된 하이브리드 Fc 형태를 동일하게 차용하여 사용할 수 있고, 본 명세서에 참조로서 도입된다. 본 발명에서 상기 하이브리드 Fc는 생물학적 활성 분자, 폴리펩타이드 등에 결합하는 경우, 생물학적 활성 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 뿐만 아니라 Fc-폴리펩타이드 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 발현될 때 폴리펩타이드의 발현 수준을 높이는 효과가 있다.
본 발명에서 일 예시로 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 유래의 Fc 영역이거나, 혹은 상기 IgG, IgA, IgM, IgD 또는 IgE 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 일 예시로 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래 Fc 영역이거나, 혹은 상기 IgG 또는 IgM 유래 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있고, 다른 예시로 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래 Fc 영역이거나, 혹은 상기 IgG 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있고, 또 다른 예시로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래 Fc 영역이거나, 혹은 상기 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있으며, 또 다른 예시로 IgG1 또는 IgG2 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있다.
본 발명에서 바람직한 예시로서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 5로 표시되는 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하거나, 서열번호 6으로 표시되는 마우스 IgG2 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다(하기 표 3 참조).
서열목록 서열정보
서열번호 5 LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
서열번호 6 IFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
본 발명의 일 예시로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, 또는 아바타셉트(Abatacept) 유래의 힌지 영역을 포함할 수 있고, 또 다른 예시로 IgG, IgD 또는 아바타셉트(Abatacept) 유래의 힌지 영역을 포함할 수 있으며, 혹은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD 또는 아바타셉트(Abatacept) 유래의 힌지 영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 바람직한 예시로서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 7로 표시되는 인간 IgG1 유래의 힌지 영역; 서열번호 8로 표시되는 마우스 IgG2 유래의 힌지 영역; 서열번호 9로 표시되는 인간 IgD 유래의 힌지 영역; 및 서열번호 10으로 표시되는 아바타셉트(Abatacept)의 힌지 영역;으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함함으로써(하기 표 4 참조) 최종 제조될 융합 단백질의 구조적 유연성(flexibility)을 높이고, 융합 단백질의 생산성 및 안정성을 현저히 향상시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
서열목록 서열정보
서열번호 7 EPKSSDKTHTSPPCPAPELLGGPSVF
서열번호 8 EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVF
서열번호 9 RNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVF
서열번호 10 EPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVF
본 발명에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인과 Fc 영역이 링커를 통해 연결되는 경우, 상기 링커는 Fc 단편의 N-말단, C-말단 또는 유리기 (free radical)에 연결될 수 있고, Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인의 N-말단, C-말단 또는 유리기에 연결될 수 있다. 링커가 펩타이드 링커인 경우, 연결은 임의의 부위에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 상기 링커는 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인의 C-말단 및 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단에 연결될 수 있고, 혹은 상기 면역글로불린의 Fc 영역의 C-말단 및 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인의 N-말단에 연결될 수 있다.
링커
본 발명에서 상기 "링커(linker)"는 융합 단백질 내 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인과 면역글로불린 Fc 영역 사이의 간섭 효과를 줄여 타겟 세포에서 상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인의 목적하는 활성을 높일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 링커는 목적하는 질환의 조직 또는 세포 내에서 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 상기와 같이 과발현되는 효소에 의해 절단될 수 있는 경우에는 Fc 부분으로 인하여 폴리펩타이드의 활성이 저하되는 것을 효과적으로 방지할 수 있다.
본 발명의 일 예시로서 상기 링커는 1 내지 100개의 아미노산을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지는 않으며, Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인과 면역글로불린 Fc 영역을 분리시킬 수 있는 어떠한 펩타이드라도 가능하다. 상기 링커를 구성하는 아미노산 서열에는 특별한 제한은 없으나, 글라이신(G) 및 세린(S)을 포함하거나, 이들을 반복적으로 또는 무작위적 패턴으로 포함하는 것이 바람직하다. 그러한 예로서, 상기 링커는 서열번호 11로 표시되는 펩타이드 링커; 및 서열번호 12로 표시되는 펩타이드 링커; 중 적어도 하나를 포함할 수 있고(하기 표 5 참조), 혹은 하기 식 1 내지 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다:
[식 1]
(G)n
[식 2]
(GGGGS)m
[식 3]
(EAAAK)p
[식 4]
(XP)q
상기 식 1 내지 4에서,
n, m 및 p는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
q는 5 내지 40의 정수이며;
X는 A(Ala), C(Cys), D(Asp), E(Glu), F(Phe), G(Gly), H(His), I(Ile), K(Lys), L(Leu), M(Met), N(Asn), O(Pyl), P(Pro), Q(Gln), R(Arg), S(Ser), T(Thr), U(Sec), V(Val), W(Trp) 및 Y(Tyr)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산이다.
서열목록 서열정보
서열번호 11 GS
서열번호 12 GGG
본 발명에서 상기 식 1 내지 식 3의 상기 n, m 및 q는 1 이상의 정수, 바람직하게는 1 내지 20의 정수일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 식 4의 상기 X는 A(Ala)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 일 예시로서 상기 링커는 서열번호 96으로 표시되는 펩타이드 링커(A(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4A); 서열번호 97로 표시되는 펩타이드 링커(PAPAP); 서열번호 98로 표시되는 펩타이드 링커(AEAAAKEAAAKA); 서열번호 99로 표시되는 펩타이드 링커(IEGRMD); 및 서열번호 100으로 표시되는 펩타이드 링커(DIEGRMD)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 융합 단백질이 상기 펩타이드 링커를 더 포함하는 경우 세포 내 활성 물질의 안정성을 높이고, 생산성을 보다 향상시킬 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 링커의 일 예시로, 혈액 내에 가장 많이 존재하는 인간 알부민의 282번 내지 314번째 부분에 위치한 33개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커, 보다 바람직하게는 292번 내지 304번째 부분에 위치한 13개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 이러한 부분은 3차원적인 구조상 대부분 외부에 노출된 부분으로서 체내에서 면역반응을 유도할 가능성이 최소화된 부분이다. 단, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 링커 및 Fc 영역이 별개로 발현된 후에 서로 결합될 때, 링커는 당업계에 알려진 가교제일 수 있다. 상기 가교제는, 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄 (1,1-bis(diazoacetyl)-2-phenylethane), 글루타르알데하이드 (glutaraldehyde), 4-아지도살리실릭산 (4-azidosalicylic acid)과 같은 N-하이드로옥시석신이미드 에스테르 (N-hydroxysuccinimide ester), 3,3'-디사이오비스(석신이미딜프로피오네이트) (3,3'-dithiobis(succinimidylpropionate))와 같은 디석신이미딜에스테르 (disuccinimidyl esters)를 포함하는 이미도에스테르 (imidoesters), 및 비스-N-말레이미도-1,8-옥테인과 같은 이중 기능적 말레이미드 (bifunctional maleimides)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Lrig -1 세포외 도메인; 및 면역글로불린을 포함하는 융합 단백질
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 일 예시는 상기 서열번호 1로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 5로 표시되는 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 6 참조). 하기 표 6의 서열번호 13 내지 16으로 표시되는 융합 단백질은 하기 표 7의 서열번호 17 내지 20으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 7 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000003
Figure PCTKR2019009202-appb-I000001
Figure PCTKR2019009202-appb-T000004
Figure PCTKR2019009202-appb-I000002
Figure PCTKR2019009202-appb-I000003
Figure PCTKR2019009202-appb-I000004
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 일 예시는 상기 서열번호 3로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 5로 표시되는 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 8 참조). 하기 표 8의 서열번호 21 내지 24로 표시되는 융합 단백질은 각각 하기 표 9의 서열번호 25 내지 28으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 9 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000005
Figure PCTKR2019009202-appb-I000005
Figure PCTKR2019009202-appb-T000006
Figure PCTKR2019009202-appb-I000006
Figure PCTKR2019009202-appb-I000007
Figure PCTKR2019009202-appb-I000008
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 다른 일 예시는 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 6으로 표시되는 마우스 IgG2 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 10 참조). 하기 표 10의 서열번호 29 내지 32로 표시되는 융합 단백질은 각각 하기 표 11의 서열번호 33 내지 36으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 11 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000007
Figure PCTKR2019009202-appb-I000009
Figure PCTKR2019009202-appb-T000008
Figure PCTKR2019009202-appb-I000010
Figure PCTKR2019009202-appb-I000011
Figure PCTKR2019009202-appb-I000012
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 또 다른 일 예시는 상기 서열번호 1로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 11로 표시되는 링커; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 5로 표시되는 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 12 참조). 하기 표 12의 서열번호 37 내지 40으로 표시되는 융합 단백질은 각각 하기 표 13의 서열번호 41 내지 44로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 13 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000009
Figure PCTKR2019009202-appb-I000013
Figure PCTKR2019009202-appb-T000010
Figure PCTKR2019009202-appb-I000014
Figure PCTKR2019009202-appb-I000015
Figure PCTKR2019009202-appb-I000016
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 또 다른 일 예시는 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 11로 표시되는 링커; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 5로 표시되는 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 14 참조). 하기 표 14의 서열번호 45 내지 48로 표시되는 융합 단백질은 각각 하기 표 15의 서열번호 49 내지 52로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 15 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000011
Figure PCTKR2019009202-appb-I000017
Figure PCTKR2019009202-appb-T000012
Figure PCTKR2019009202-appb-I000018
Figure PCTKR2019009202-appb-I000019
Figure PCTKR2019009202-appb-I000020
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 또 다른 일 예시는 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 11로 표시되는 링커; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 6로 표시되는 마우스 IgG2 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 16 참조). 하기 표 16의 서열번호 53 내지 56으로 표시되는 융합 단백질은 각각 하기 표 17의 서열번호 57 내지 60으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 17 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000013
Figure PCTKR2019009202-appb-I000021
Figure PCTKR2019009202-appb-T000014
Figure PCTKR2019009202-appb-I000022
Figure PCTKR2019009202-appb-I000023
Figure PCTKR2019009202-appb-I000024
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 또 다른 일 예시는 상기 서열번호 1로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 12로 표시되는 링커; 서열번호 11로 표시되는 링커; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 5로 표시되는 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 18 참조). 하기 표 18의 서열번호 61 내지 64로 표시되는 융합 단백질은 하기 표 19의 서열번호 65 내지 68로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 19 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000015
Figure PCTKR2019009202-appb-I000025
Figure PCTKR2019009202-appb-T000016
Figure PCTKR2019009202-appb-I000026
Figure PCTKR2019009202-appb-I000027
Figure PCTKR2019009202-appb-I000028
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 또 다른 일 예시는 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 12로 표시되는 링커; 서열번호 11로 표시되는 링커; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 5로 표시되는 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 20 참조). 하기 표 20의 서열번호 69 내지 72로 표시되는 융합 단백질은 각각 하기 표 21의 서열번호 73 내지 76으로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 21 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000017
Figure PCTKR2019009202-appb-I000029
Figure PCTKR2019009202-appb-T000018
Figure PCTKR2019009202-appb-I000030
Figure PCTKR2019009202-appb-I000031
Figure PCTKR2019009202-appb-I000032
본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 또 다른 일 예시는 상기 서열번호 3으로 표시되는 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인; 서열번호 12로 표시되는 링커; 서열번호 11로 표시되는 링커; 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역; 서열번호 6으로 표시되는 마우스 IgG2 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)을 포함하는 융합 단백질일 수 있다(하기 표 22 참조). 하기 표 22의 서열번호 77 내지 80로 표시되는 융합 단백질은 하기 표 23의 서열번호 81 내지 84로 표시되는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있다(하기 표 23 참조).
Figure PCTKR2019009202-appb-T000019
Figure PCTKR2019009202-appb-I000033
Figure PCTKR2019009202-appb-T000020
Figure PCTKR2019009202-appb-I000034
Figure PCTKR2019009202-appb-I000035
Figure PCTKR2019009202-appb-I000036
2) 핵산 분자
본 발명의 조성물은 본 발명에서 제공하는 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
3) 발현 벡터
본 발명의 조성물은 본 발명에서 제공하는 상기 단리된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다. 상기 태그로는 헥사-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, myc 태그 또는 flag 태그를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
4) 숙주 세포
본 발명의 조성물은, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질 감염된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩타이드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩타이드(들)로 체내에서 형질주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포주로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
5) VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)와의 병용
본 발명에서 상기 조성물은, VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation) 또는 이의 일 단편을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은, VISTA 또는 이의 일 단편; 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 VISTA 또는 이의 일 단편과 면역글로불린 Fc 영역 사이에 링커를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "V-도메인 면역글로불린 억제자(VISTA)"는 T 세포에 대하여 면역 활성 억제 기능을 하는 면역 체크포인트(immune checkpoint) 단백질에 해당한다. VISTA는 IgG-V 도메인을 포함하는 세포 외(extracellular) 도메인과 ITAM, ITIM을 포함하지 않는 짧은 세포질(cytoplasmic) 도메인을 포함하는 표면 단백질에 해당한다. VISTA는 CD11b+ 골수성 수지상 세포(myeloid dendritic cells; DCs), CD4+ 및 CD8+ T 세포와, Foxp3+CD4+ 조절 T 세포에서 발현하며, T 세포의 활성화에 따른 사이토카인(cytokine)의 분비와 증식을 억제하는 기능을 할 수 있다. VISTA가 없는 넉-아웃(knock-out) 마우스에서는 만성 염증에 의해 장기의 기능이 떨어져 있으며, 다발성 경화증 증상이 정상 쥐에 비해 월등히 빠르게 나타난다.
본 발명의 일 예시에서 상기 VISTA는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시에서 상기 VISTA는 인간 유래 VISTA인 서열번호 85로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 87로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 VISTA는 마우스 유래 VISTA인 서열번호 86으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나, 서열번호 88로 표시되는 뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 VISTA의 일 단편은 상기 VISTA의 세포 외 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 VISTA의 세포 외 도메인은 인간 유래 VISTA의 33번째 내지 194번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 89로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 VISTA의 세포 외 도메인은 마우스 유래 VISTA의 33번째 내지 191번째 아미노산 서열에 해당하는 서열번호 90으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시에서 상기 VISTA의 일 단편은 상기 VISTA의 세포 외 도메인의 일 단편일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 VISTA의 세포 외 도메인의 단편은 인간 유래 VISTA의 세포 외 도메인의 일부 단편인 서열번호 91 내지 93 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 VISTA의 세포 외 도메인의 단편은 마우스 유래 VISTA의 세포 외 도메인의 일부 단편인 서열번호 94 또는 95로 표시된 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기서, 상기 면역글로불린 Fc 영역, 링커에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이하 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 VISTA 또는 이들의 일 단편이나, 이를 포함하는 융합 단백질은 본 발명에서 제공되는 상기 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 숙주 세포에 삽입 및 배양한 뒤, 크로마토 그래피 등을 이용하여 정제하는 과정을 통해 용이하게 수득될 수 있다.
여기서, 상기 핵산 분자, 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 기재 역시 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 이하 그 기재를 생략한다.
6) 면역 관련 질환 및 병용
면역 관련 질환
본 발명에서 상기 "면역 관련 질환"은 다양한 면역 세포, 예를 들면 이펙터 T 세포(effector T cell) 또는 독성 T 세포(cytotoxic T cell) 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및/또는 증식에 의하여 유도되는 질환으로서, 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "자가면역질환"은 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 전신홍반루프스, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 "자가면역질환"은 활성화된 T 세포가 신경을 구성하는 세포에 침투하여 염증을 유발하거나, 세포의 사멸을 유도하는 과정을 통해 발생된 것일 수 있고, 예를 들면 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환일 수 있다(Neuromolecular Med. 2005; 7 (3) : 255-64. 참고).
본 발명에서 상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 면역관련질환, 예를 들면 자가면역질환의 경우, 건강한 대조군과 비교하여 질환이 유발된 환자에서 자가면역성 T 세포(예를 들면, 효과 T 세포 또는 독성 T 세포 등)가 높은 수준의 빈도로 존재하거나, 그 활성이 현저하게 증가되어 있음으로써, 과도한 면역반응을 유도하거나 특정 기관의 세포를 파괴함으로써 유도되는 것일 수 있다(Clinical & Experimental Immunology, 180: 353-360., Immunity, Vol. 17, 1-6, July, 2002., Ann Rheum Dis 2004;63(Suppl II): 96-101., Immunol Res. 2013 December ; 57(0): 12-22. 참고).
본 발명에서 상기 면역 관련 질환은 T 세포(예를 들면, 이펙터 T 세포 또는 독성 T 세포), 바람직하게는 자가반응성 T 세포의 활성화 및/또는 증식에 필수적인 세포 내 신호 전달 경로를 방해함으로써 예방, 개선 또는 치료될 수 있다(Ann Rheum Dis 2004;63(Suppl II): 96-101. 참고). 구체적으로, 본 발명에 따른 상기 융합 단백질은 이펙터 T 세포에 동시억제 시그널(co-inhibitory signal)을 유도하여 이펙터 T 세포의 증식 억제 및 활성화를 조절할 수 있다. 따라서, T 세포(예를 들면, 이펙터 T 세포 또는 독성 T 세포)의 과도한 활성화 및/또는 증식으로 인해 발생될 수 있는 다양한 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
면역 관련 질환 치료제와의 병용
본 발명의 조성물은 상기 면역 관련 질환을 치료하기 위한 다른 약제와 병용할 수 있다. 예를 들어, 자가면역 질환은 비제한적으로, 면역억제제, 예를 들어, 코르티코스테로이드, 사이클로스포린, 사이클로포스파미드, 프레드니손, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 라파마이신, 타크롤리무스, 생물학적 제제, 예를 들어, TNF-α 차단제 또는 길항제, 또는 임의의 염증성 사이토카인을 표적화하는 임의의 다른 생물학적 제제, 비스테로이드성 항염증 약물/Cox-2 저해제, 하이드록시클로로퀸, 술파살라조프린(sulphasalazopryine), 금염, 에타너셉트(etanercept), 인플릭시맙(infliximab), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil), 바실릭시맙(basiliximab), 아타시셉트(atacicept), 리툭시맙, 사이톡산(Cytoxan), 인터페론 β-1a, 인터페론 β-1b, 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate), 미톡산트론(mitoxantrone) 하이드로클로라이드, 아나킨라(anakinra) 및/또는 기타 생물학적물질 및/또는 정맥내 면역글로불린(IVIG)과 함께 본 발명의 적어도 일부 구현예들에 따른 분자로 치료될 수 있다. 이러한 공지되어 있는 치료제의 비제한적인 예에는 인터페론, 예를 들어, IFN-β-1a(레비프(REBIF)(등록 상표), 아보넥스(AVONEX)(등록 상표) 및 시노벡스(CINNOVEX)(등록 상표)) 및 IFN-β-1b(베타세론(BETASERON)(등록 상표), 엑스타비아(EXTAVIA)(등록 상표), 베타페론(BETAFERON)(등록 상표), 지페론(ZIFERON)(등록 상표)); 글라티라머 아세테이트(glatiramer acetate)(코팍손(COPAXONE)(등록 상표)), 폴리펩티드; 나탈리주맙(natalizumab)(타이사브리(TYSABRI)(등록 상표)); 및 미톡산트론(mitoxantrone)(노반트론(NOVANTRONE)(등록 상표)), 세포독성제가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물은 임의의 공지되어 있는 다발성 경화증 치료용 치료제 또는 다발성 경화증 치료 방법과 병용할 수 있다. 이러한 공지되어 있는 다발성 경화증 치료용 치료제 또는 다발성 경화증 치료 방법의 비제한적인 예에는 인터페론 부류, IFN-β-1a(레비프(등록 상표), 아보넥스(등록 상표) 및 시노벡스(등록 상표)) 및 IFN-β-1b(베타세론(등록 상표), 엑스타비아(EXTAVIA)(등록 상표), 베타페론(등록 상표), 지페론(등록 상표)); 글라티라머 아세테이트(코팍손(등록 상표)), 폴리펩티드; 나탈리주맙(타이사브리(등록 상표)); 및 미톡산트론(노반트론(등록 상표)), 세포독성제, 팜프리딘(Fampridine)(암피라(AMPYRA)(등록 상표))이 포함된다. 다른 약물에는 코르티코스테로이드, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 아자티오프린 및 정맥 면역글로불린(IVIG), 이노신, 오크렐리주맙(R1594), 마이리낙스(Mylinax)(칼드리빈(Caldribine)), 알렘투주맙(캄파쓰(Campath)), 다클리주맙(제나팍스(Zenapax)), 파나클라르/디메틸 푸마레이트(BG-12), 테리플루노미드(Teriflunomide)(HMR1726), 핑골리모드(FTY720), 라퀴니모드(ABR216062)뿐만 아니라 조혈 줄기 세포 이식, 뉴로박스(Neurovax), 리툭시맙(리툭산(Rituxan)) BCG 백신, 저용량 날트렉손(naltrexone), 구충 치료법, 혈관성형술, 정맥 스텐트(venous stent) 및 대체 요법, 예를 들어, 비타민 D, 다중불포화 지방, 의료용 마리화나가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물은 임의의 공지되어 있는 류마티스 관절염의 치료용 치료제 또는 류마티스 관절염의 치료 방법과 병용될 수 있다. 이러한 공지되어 있는 류마티스 관절염의 치료용 치료제 또는 류마티스 관절염의 치료 방법의 비제한적인 예에는 글루코코르티코이드, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID), 예를 들어, 살리실레이트 또는 사이클로옥시게나제-2 저해제, 이부프로펜(ibuprofen) 및 나프록센(naproxen), 디클로페낙(diclofenac), 인도메타신(indomethacin), 에토돌락(etodolac), 질환 조절 항류마티스 약물(DMARD)- 경구 DMARD: 아우라노핀(Auranofin)(리다우라(Ridaura)), 아자티오프린(이무란(Imuran)), 사이클로스포린(Cyclosporine)(산디뮨(Sandimmune), 젠그라프(Gengraf), 네오랄(Neoral), 제네릭(generic)), D-페니실라민(쿠프리민(Cuprimine)), 하이드록시클로로퀸(플라쿠에닐(Plaquenil)), IM 골드 골드 소듐 티오말레이트(미오크리신(Myochrysine)) 아우로티오글루코스(Aurothioglucose)(솔가날(Solganal)), 레플루노미드(Leflunomide)(아라바(Arava)), 메토트렉세이트(류마트렉스(Rheumatrex)), 미노사이클린(Minocycline)(미노신(Minocin)), 스타필로코칼 단백질 A 면역흡착(프로소르바 컬럼(Prosorba column)), 술파살라진(Sulfasalazine)(아줄피딘(Azulfidine)), 생물학적 DMARD: TNF-α 차단제, 예를 들어, 아달리무맙(Adalimumab)(휴미라(Humira)), 에타너셉트(Etanercept)(엔브렐(Enbrel)), 인플릭시맙(Infliximab)(레미카데(Remicade)), 골리무맙(golimumab)(심포니(Simponi)), 서톨리주맙 페골(certolizumab pegol)(심지아(Cimzia)) 및 기타 생물학적 DMARD, 예를 들어, 아나킨라(Anakinra)(키네레트(Kineret)), 리툭시맙(리툭산), 토실리주맙(Tocilizumab)(아크템라(Actemra)), CD28 저해제, 예를 들어, 아바타셉트(Abatacept)(오렌시아) 및 벨라타셉트(Belatacept)가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물은 임의의 공지되어 있는 1형 당뇨병용 치료제 또는 1형 당뇨병 치료 방법과 병용될 수 있다. 이러한 공지되어 있는 1형 당뇨병의 치료용 치료제의 비제한적인 예에는 인슐린, 인슐린 유사체, 췌도 이식, 줄기세포 치료법, 예를 들어, 프로키말(PROCHYMAL)(등록 상표), 비인슐린 치료법, 예를 들어, IL-1β 저해제, 예를 들어, 아나킨라(키네레트(등록 상표)), 아바타셉트(오렌시아(등록 상표)), 디아마이드(Diamyd), 알레파셉트(alefacept)(아메비브(Ameviv)(등록 상표)), 오텔릭시주맙(Otelixizumab), DiaPep277(Hsp60 유래 펩티드), 알파 1-항트립신, 프레드니손, 아자티오프린, 시클로스포린(Ciclosporin), E1-INT(상피 성장 인자 유사체 및 가스트린 유사체를 포함하는 주사가능한 소도 신생 치료법), 스타틴(statin), 예를 들어, 조코르(Zocor)(등록 상표), 심루프(Simlup)(등록 상표), 심카드(Simcard)(등록 상표), 심바코르(Simvacor)(등록 상표), 시타글리프틴(Sitagliptin)(디펩티딜 펩티다제(DPP-4) 저해제), 항-CD3 mAb(예를 들어, 테플리주맙(Teplizumab)); CTLA4-Ig(아바타셉트(abatacept)), 항 IL-1β(카나키누맙(Canakinumab)), 항-CD20 mAb(예를 들어, 리툭시맙)가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물은 임의의 공지되어 있는 쇼그렌 증후군의 치료용 치료제 또는 쇼그렌 증후군의 치료 방법과 병용될 수 있다. 이러한 공지되어 있는 쇼그렌 증후군의 치료용 치료제의 비제한적인 예에는 사이클로스포린, 필로카르핀(pilocarpine)(살라겐(Salagen)) 및 세비멜린(cevimeline)(에복삭(Evoxac)), 하이드로클로로퀸(플라쿠에닐(Plaquenil)), 코르티손(프레드니손 및 기타의 것) 및/또는 아자티오프린(이무란) 또는 사이클로포스파미드(사이톡산(Cytoxan)), 덱사메타손, 탈리도미드(Thalidomide), 데하이드로에피안드로스테론, NGX267, 레바미피드(Rebamipide), FID 114657, 에타너셉트, 라프티바(Raptiva), 벨리무맙(Belimumab), 맙테라(MabThera)(리툭시맙); 아나킨라, 정맥내 면역글로불린(IVIG), 동종이계 중간엽 줄기세포(AlloMSC), "살리웰 크라운(Saliwell Crown)"에 의한 자동 신경-전기자극이 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물은 임의의 공지되어 있는 전신 홍반성 낭창의 치료용 치료제 또는 전신 홍반성 낭창의 치료 방법과 병용될 수 있다. 이러한 공지되어 있는 전신 홍반성 낭창의 치료용 치료제의 비제한적인 예에는 코르티코스테로이드 및 질환-조절 항류마티스 약물(DMARD), 통상 항-말라리아 약물, 예를 들어, 플라쿠에닐 및 면역억제제(예를 들어, 메토트렉세이트 및 아자티오프린), 하이드록시클로로퀸, 세포독성 약물(예를 들어, 사이클로포스파미드 및 미코페놀레이트), 하이드록시클로로퀸(HCQ), 벤리스타(Benlysta)(벨리무맙(belimumab)), 비스테로이드성 항염증 약물, 프레드니손, 셀셉트(Cellcept), 프로그라프(Prograf), 아타시셉트(Atacicept), 루푸조르(Lupuzor), 정맥내 면역글로불린(IVIG), 셀셉트(미코페놀레이트 모페틸), 오렌시아(Orencia), CTLA4-IgG4m(RG2077), 리툭시맙, 오크렐리주맙, 에프라투주맙(Epratuzumab), CNTO 136, 시팔리무맙(Sifalimumab)(MEDI-545), A-623(이전에는 AMG 623), AMG 557, 론탈리주맙(Rontalizumab), 파퀴니모드(paquinimod)(ABR-215757), LY2127399, CEP-33457, 데하이드로에피안드로스테론(Dehydroepiandrosterone), 레보티록신(Levothyroxine), 아베티무스 소듐(abetimus sodium)(LJP 394), 메만틴(Memantine), 아편제, 라파마이신, 신장 이식, 줄기 세포 이식이 포함된다.
7) 용어 및 조성물
본 발명에서, "예방"은 본 발명의 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서, "개선" 또는 "치료"는 본 발명의 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명에서 상기 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 유효성분이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 포함하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 구체적으로, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등일 수 있다.
본 발명에서 상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 성분은 독립적 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 핵심적인 요소에 해당하지 아니하지만, 본 발명의 식품 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양에센스, 마사지 크림, 미용목욕물첨가제, 바디로션, 바디밀크, 배스오일, 베이비오일, 베이비파우더, 샤워겔, 샤워크림, 선스크린로션, 선스크린크림, 선탠크림, 스킨로션, 스킨크림, 자외선차단용 화장품, 클렌징밀크, 탈모제화장용, 페이스 및 바디로션, 페이스 및 바디크림, 피부미백크림, 핸드로션, 헤어로션, 화장용 크림, 쟈스민오일, 목욕비누, 물비누, 미용비누, 샴푸, 손세정제(핸드클리너), 약용비누비의료용, 크림비누, 페이셜 워시, 전신 세정제, 두피 세정제, 헤어린스, 화장비누, 치아 미백용 겔, 치약 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 용매나, 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 화장료 조성물 내에 더 추가될 수 있는 용매의 종류는 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 물, 식염수, DMSO 또는 이들의 조합을 사용할 수 있다. 또한, 담체, 부형제 또는 희석제로는 정제수, 오일, 왁스, 지방산, 지방산 알콜, 지방산 에스테르, 계면활성제, 흡습제(humectant), 증점제, 항산화제, 점도 안정화제, 킬레이팅제, 완충제, 저급 알콜 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 필요에 따라 미백제, 보습제, 비타민, 자외선 차단제, 향수, 염료, 항생제, 항박테리아제, 항진균제를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 오일로서는 수소화 식물성유, 피마자유, 면실유, 올리브유, 야자인유, 호호바유, 아보카도유가 이용될 수 있으며, 왁스로는 밀랍, 경랍, 카르나우바, 칸델릴라, 몬탄, 세레신, 액체 파라핀, 라놀린이 이용될 수 있다.
본 발명에서 상기 지방산으로는 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 올레산이 이용될 수 있고, 지방산 알콜로는 세틸 알콜, 옥틸 도데칸올, 올레일 알콜, 판텐올, 라놀린 알콜, 스테아릴 알콜, 헥사데칸올이 이용될 수 있으며 지방산 에스테르로는 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트가 이용될 수 있다. 계면 활성제로는 당업계에 알려진 양이온 계면활성제, 음이온 계면활성제 및 비 이온성 계면활성제가 사용가능하며 가능한 한 천연물 유래의 계면활성제가 바람직하다. 그 외에도 화장품 분야에서 널리 알려진 흡습제, 증점제, 항산화제 등을 포함할 수 있으며, 이들의 종류와 양은 당업계에 공지된 바에 따른다.
2. 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 융합 단백질; 이를 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포; 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 융합 단백질, 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포, 조성물 및 면역 관련 질환과 관련된 내용은 상기 약학 조성물에서 기재한 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략한다.
본 발명에서 상기 "개체"는 면역 관련 질환의 발병이 의심되는 개체로서, 상기 면역 관련 질환 발병의 의심 개체는 해당 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 의미하나, 본 발명의 융합 단백질 또는 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 방법은 융합 단백질 또는 이를 포함하는 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
한편, 이에 제한되지 않으나, 상기 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법은 하나 이상의 면역 관련 질환에 대한 치료적 활성을 가지는 화합물 또는 물질을 투여하는 것을 더 포함하는 병용 요법일 수 있다.
본 발명에서 상기 "병용"은 동시, 개별 또는 순차 투여를 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 상기 투여가 순차 또는 개별적인 경우, 2차 성분 투여의 간격은 상기 병용의 이로운 효과를 잃지 않도록 하는 것이어야 한다.
본 발명에서 상기 융합 단백질의 투여 용량은 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 ㎍ 내지 500 mg일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공하는 상기의 융합 단백질은 활성화된 T 세포에 존재하는 Lrig-1 단백질에 대한 리간드와 상호 작용하여, 활성화된 T 세포에 동시억제(co inhibitory) 시그널을 줌으로써 상기 활성화된 T 세포의 사멸 또는 활성의 억제를 유도함으로써 면역 관련 질환을 매우 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 단백질의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1 mRNA의 발현 정도를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 mRNA의 발현 정도를 비교한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 조절 T 세포와 비-조절 T 세포 내 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 면역 세포의 표면에서 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질에 의해 인식되는 리간드가 존재하는 T 세포 서브세트(subset)를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 나이브 T 세포(naive T cell)와 항-CD3/28 항체를 이용하여 활성화시킨 활성화된 T 세포를 융합 단백질과 PD-L1-IgG를 이용하여 농도 별로 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 활성화된 T 세포(Act) 및 Th1 세포(TH1)에서 면역 침전(immunoprecipitation)을 수행한 뒤, 항-VISTA 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 12a 및 도 12b의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포를 항-CD3/28항체를 이용하여 활성화시킨 뒤 VISTA 항체를 이용하여 30분간 세포 표면에 결합시킨 후 Lrig-1-IgG를 이용하여 세포 표면을 염색하여 유세포 분석기를 통해 분석한 결과(A)와, 활성화된 T 세포의 표면에 융합 단백질을 우선 30분간 결합시킨 뒤 VISTA 항체를 이용하여 세포 표면을 염색한 후 유세포 분석기를 통해 분석한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 13a 및 도 13b의 A 및 B는 나이브 T 세포를 항-CD3/28 항체로 활성화시킨 뒤 VISTA 항체를 이용하여 24시간 마다 T 세포의 표면을 염색하여 유세포 분석기를 통해 VISTA의 발현 수준의 변화를 측정한 결과(A)와, 활성화된 T 세포의 배양액에 존재하는 VISTA의 세포 외 도메인의 양을 측정하기 위하여 24시간 마다 배양액을 회수한 뒤 VISTA ELISA 키트를 이용하여 상기 세포 외 도메인의 발현 수준을 측정한 결과(B)를 나타낸 것이다.
도 14a 및 도 14b의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 정상 마우스와 류마티스 관절염(RA) 또는 염증성 장 질환(IBD)이 유도된 마우스 동물 모델으로부터 혈액을 추출하여 원심 분리를 통해 혈청을 분리한 뒤 VISTA 세포 외 도메인을 타겟하는 ELISA를 이용하여 상기 혈청 내 VISTA 세포 외 도메인의 농도를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 나이브 T 세포를 활성화한 다음 세포 표면에 유도되는 표면 단백질인 CD25의 발현정도를 FACS로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16a, 도 16b, 도 16c 및 도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합 단백질의 활성화된 T 세포에서 본 발명에 따른 융합 단백질에 의한 증식 억제 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 융합 단백질; 이를 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면 서열번호 25로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 융합 단백질; 이를 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터가 형질전환된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] T 세포 아형 세포 배양
조절 T 세포(Treg)에서만 Lrig-1 단백질이 발현되는지 확인하기 위하여, T 세포의 아형(subset)인 Th0, Th1, Th2, Th17 및 iTreg을 준비하였다. 상기 iTreg은 자연적으로 분리한 nTreg과는 달리 하기 조성을 포함하는 배지에서 분화를 인공적으로 유도한 세포를 의미한다.
T 세포의 아형은 우선, 쥐의 비장으로부터 얻은 나이브(naive) T 세포를 분리한 뒤, 우태아혈청(FBS; hyclone, logan, UT) 10%를 포함하는 RPMI1640(Invitrogen Gibco, Grand Island, NY) 영양배지에 하기 표 24의 성분을 각각 더 포함하도록 하여, 37℃, 5 % CO2 배양기 내에서 72시간 배양을 통해 각각의 세포로 분화 유도하였다.
분화 세포 조성
Th0 anti-CD3, anti-CD28
Th1 IL-12, anti-IL-4 항체
Th2 IL-4, anti-IFNβ
Th17 IL-6, TGFβ, anti-IFNβ, anti-IL-4
iTreg IL-2, TGFβ
[ 실시예 1] Lrig -1 구조 분석
조절 T 세포의 표면 단백질인 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제작하기 위하여 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인의 3차원 입체 구조를 예측하였다.
우선, 항원 결정기(Epitope) 염기서열 예측을 위해 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인(Extracellular domain; ECD)의 구조를 확인하기 위하여 Uniprot(http://www.uniprot.org)과 RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb) 툴을 이용하여 3차원 입체 구조를 예측한 뒤, 그 결과를 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인 중 Lrig-LRR 도메인(아미노산 서열 41 ~ 494번) 내에는 LRR1 내지 LRR15의 총 15개의 류신 리치 부위(Leucine rich region)가 존재하였다. 상기 LRR 도메인 각각은 23 내지 27개의 아미노산으로 구성되고, 류신은 3 내지 5개가 존재하였다.
또한, 도 2에서 보는 바와 같이, Lrig-1 단백질의 세포외 도메인 중 Lrig-1 단백질의 아미노산 서열 494 내지 781번에는 면역글로불린 유사 도메인(Immunoglobulin-like domain)이 3개 존재하였다.
[실시예 2] Lrig-1 mRNA의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에 특이적인 바이오마커(biomarker)로 작용할 수 있는지 검증하였다.
상기 검증을 위하여, 쥐의 비장으로부터 CD4 비드를 통해 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, CD25 항체를 이용하여 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 이용해 조절 T (CD4+CD25+ T) 세포 및 비 조절 T (CD4+CD25- T) 세포를 분리하였다. 각각의 세포 및 상기 준비예 1에서 분화된 세포는 트리졸(Trizol)을 이용하여 mRNA를 추출한 뒤, 게노믹 RNA는 gDNA 추출 키트(Qiagen)를 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 gDNA를 제거하였다. gDNA가 제거된 mRNA는 BDsprint cDNA 합성 키트 (Clonetech)를 통해 cDNA로 합성하였다.
상기 cDNA에서 Lrig-1 mRNA의 발현량을 정량적으로 확인하기 위하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 수행하였다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응은 SYBR Green (Molecular Probes)을 이용하여 업체에서 제공한 프로토콜에 의해 95℃에서 3분, 61 ℃에서 15초, 72 ℃에서 30초씩 40 사이클의 조건으로, 하기 표 25의 프라이머를 이용하여 수행하였고, 상대적인 유전자 발현량은 델타 CT 방법을 이용하여 계산하였으며, HPRT를 이용하여 일반화(normalization) 하여, 그 결과를 도 4 내지 6에 나타내었다.
프라이머 서열
쥐 Lrig-1 Forward 5' - GAC GGA ATT CAG TGA GGA GAA CCT - 3'
Reverse 5' - CAA CTG GTA GTG GCA GCT TGT AGG - 3'
쥐 Lrig-2 forward 5' - TCA CAA GGA ACA TTG TCT GAA CCA- 3'
reverse 5' - GCC TGA TCT AAC ACA TCC TCC TCA- 3'
쥐 Lrig-3 forward 5' - CAG CAC CTT GAG CTG AAC AGA AAC - 3'
reverse 5' - CCA GCC TTT GGT AAT CTC GGT TAG - 3'
쥐 FOXP3 forward 5' - CTT TCA CCT ATC CCA CCC TTA TCC - 3'
reverse 5' - ATT CAT CTA CGG TCC ACA CTG CTC - 3'
ACTG1 forward 5' - GGC GTC ATG GTG GGC ATG GG - 3'
reverse 5' - ATG GCG TGG GGA AGG GCG TA - 3'
도 3에서 보는 바와 같이, 비-조절 T 세포(CD4+CD25- T cell)에 비하여 조절 T 세포(CD4+CD25+ T cell)에서 Lrig-1의 발현이 18.1배 높은 것을 알 수 있다. 이는, 기존에 알려져 있는 조절 T 세포의 마커인 Lag3 및 Ikzf4와 비교하였을 때 약 10배 정도 발현양이 높은 수준이었다.
또한, 도 4 및 5에서 보는 바와 같이, 다른 종류의 면역 세포에 비하여 조절 T 세포, 특히 유도된 조절 T 세포(iTreg)에 비해 자연적으로 분리한 조절 T 세포(nTreg)에서 Lrig-1 mRNA의 발현이 현저하게 높았다.
또한, 도 6에서 보는 바와 같이, Lrig 패밀리에 해당하는 Lrig-1, Lrig-2 및 Lrig-3 중에서 Lrig-1의 발현이 가장 높았다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포, 특히 자연적으로 존재하는 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 3] Lrig-1 단백질의 조절 T 세포에서의 특이적 발현 확인
Lrig-1 mRNA로부터 발현된 Lrig-1 단백질이 조절 T 세포에서만 특이적으로 발현되는지 확인하였다.
조절 T 세포 특이적인 전사 인자인 FOXP3 프로모터에 RFP(Red fluorescence protein)이 결합된 FOXP3-RFP 주입(Knock-in) 쥐를 이용하여, 상기 쥐의 비장으로부터 CD4 비드로 자석 활성 세포 분류기(magnet-activated cell sorting; MACS)를 이용하여 CD4+ T 세포를 분리하였다. 이후, RFP 단백질을 이용하여, 형광 활성 세포 분류기(FACS)를 통해 조절 T 세포(CD4+RFP+ T cell) 및 비-조절 T 세포(CD4+RFP- T cell)를 분리하여 얻었다. 각각의 상기 세포는 구입한 Lrig-1 항체 및 음성 대조군은 아이소타입(isotype)을 통해 염색하여 형광 활성 세포 분류기로 Lrig-1의 발현량을 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에서 보는 바와 같이, 점선으로 표시되는 비-조절 T 세포의 경우 음성 대조군과 거의 동일한 Lrig-1의 발현 수준을 보였지만, 조절 T 세포의 경우 Lrig-1의 발현 수준이 높은 세포가 다수 존재하였다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포에서 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있다.
[실시예 4] 조절 T 세포 표면에서의 Lrig-1 단백질 특이적 발현 확인
Lrig-1 단백질이 세포 치료의 타겟이 되기 위해서는 조절 T 세포의 표면에서 발현되는 것인지를 확인하였다.
상기 준비예 1의 각각의 분화된 T 세포 아형을 항-CD4-APC 및 항 Lrig-1-PE 항체로 염색하고, 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 Lrig-1 단백질의 발현 수준을 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포(activated T cell), Th1 세포, Th2 세포, Th17 세포 및 나이브(Naive) T 세포에서는 Lrig-1의 발현이 0.77 내지 15.3의 양으로 발현되는 반면, 분화가 유도된 T 세포(iTreg)에서는 83.9로 높게 발현되었다.
상기 결과를 통해 본 발명에 따른 Lrig-1 단백질은 조절 T 세포(Treg) 세포에서 특이적으로 발현될 뿐만 아니라, 특히 상기 조절 T 세포의 표면에서 특이적으로 더욱 높은 수준으로 발현되는 것을 알 수 있다.
[제조예] 융합 단백질의 제작
1. 발현 벡터의 제작
본 발명에 따른 융합 단백질을 제조하기 위하여, 하기 표 26의 각각의 융합 단백질을 코딩하는 각 핵산 서열을 합성하였다. 핵산 서열의 5' 말단과 3' 말단에 각각 NheI과 EcoRI 제한효소 서열을 첨가하였고, 5' 말단의 제한효소 서열 뒤에 코작 서열(Kozak's sequence)(GCCACC)과, 단백질 번역을 위한 시작 코돈과 발현된 단백질을 세포 밖으로 분비하게 하는 마우스 IgG 카파 경쇄 시그널 펩타이드(Mouse kappa light chain signal peptide)(ATGGAAACCGATACTCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCAGGCTCTACCGGG)를 삽입하였다. 이후 하기 표 26의 각각의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열로, 인간 유래 Lrig-1 단백질 또는 VISTA 단백질의 세포 외 도메인; 선택적으로 링커; 힌지 영역; 인간 IgG1 유래의 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3);을 코딩화하는 핵산 서열 뒤에는 종결 코돈을 삽입하였다. NheI 과 EcoRI 두 제한효소 서열을 이용하여 본 발명의 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 pcDNA3.1(+) 발현 벡터에 클로닝하였다.
연번 융합 단백질의 아미노산 서열 융합 단백질의 핵산 서열
제조예 1 서열번호 13 서열번호 17
제조예 2 서열번호 14 서열번호 18
제조예 3 서열번호 15 서열번호 19
제조예 4 서열번호 16 서열번호 20
제조예 5 서열번호 21 서열번호 25
제조예 6 서열번호 22 서열번호 26
제조예 7 서열번호 23 서열번호 27
제조예 8 서열번호 24 서열번호 28
제조예 9 서열번호 29 서열번호 33
제조예 10 서열번호 30 서열번호 34
제조예 11 서열번호 31 서열번호 35
제조예 12 서열번호 32 서열번호 36
제조예 13 서열번호 37 서열번호 41
제조예 14 서열번호 38 서열번호 42
제조예 15 서열번호 39 서열번호 43
제조예 16 서열번호 40 서열번호 44
제조예 17 서열번호 45 서열번호 49
제조예 18 서열번호 46 서열번호 50
제조예 19 서열번호 47 서열번호 51
제조예 20 서열번호 48 서열번호 52
제조예 21 서열번호 53 서열번호 57
제조예 22 서열번호 54 서열번호 58
제조예 23 서열번호 55 서열번호 59
제조예 24 서열번호 56 서열번호 60
제조예 25 서열번호 61 서열번호 65
제조예 26 서열번호 62 서열번호 66
제조예 27 서열번호 63 서열번호 67
제조예 28 서열번호 64 서열번호 68
제조예 29 서열번호 69 서열번호 73
제조예 30 서열번호 70 서열번호 74
제조예 31 서열번호 71 서열번호 75
제조예 32 서열번호 72 서열번호 76
제조예 33 서열번호 77 서열번호 81
제조예 34 서열번호 78 서열번호 82
제조예 35 서열번호 79 서열번호 83
제조예 36 서열번호 80 서열번호 84
2. 융합 단백질의 정제
293F 세포에 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine)을 이용하여 상기 1.에서 제작한 발현 벡터를 형질 전환시킨 뒤 37 ℃ 및 8% CO2 조건 하에서 6일 동안 배양하였다. 배양 상청액을 여과한 뒤 단백질 A 레진(Protein A resin)에 흘려준 후 1X PBS 로 세척하였다. pH 3.5의 0.1M 글리신(glycine) 용액을 이용하여 용출한 뒤 얻어진 용액에 pH 9.0의 1M TRIS 용액을 첨가하여 pH 중화하였다. 이후 용액을 투석하여 PBS 용액 상태로 만든 후 농축하여 사용하였다.
[ 실시예 5] 본 발명에 따른 융합 단백질에 의해 인식되는 Lrig -1 리간드의 분포 확인
상기 Lrig-1 단백질의 리간드가 존재하는 면역 세포들을 발굴하기 위하여, 조절 T 세포의 타겟으로 생각되는 나이브 T 세포(naive T cell)로부터, 활성화된 T 세포, Th1 세포, Th2 세포 또는 Th17 세포로 분화를 유도시킨 뒤 이들 세포를 상기 제조예 5의 융합 단백질(1차 항체) 및 항-인간-PE 항체(2차 항체)로 염색(staining) 하였다. 형광 이용 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 각각의 세포 표면에서 상기 제조예 5의 융합 단백질이 결합된 수준을 측정하여, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서 보는 바와 같이, 제조예 5의 융합 단백질은 나이브 T 세포의 표면에 있는 항원(antigen)과 거의 결합되지 않아 염색이 약하게 관찰되었고(0.71%), 활성화된 T 세포, Th1 세포, Th2 세포 및 Th17 세포의 표면에 있는 항원과 상기 제조예 5의 융합 단백질은 매우 높은 수준으로 결합되어 96% 이상 염색된 것이 관찰되었다.
이를 통하여 Lrig-1 단백질의 리간드는 T 세포 리셉터(receptor)의 자극에 의하여 유도되는 표면 단백질인 것을 알 수 있었다.
[실시예 6] 활성화된 T 세포에서의 Lrig-1 단백질의 발현 수준 확인
비교를 위하여 기존에 활성화된 T 세포와 T 세포 서브세트에서 높게 발현하는 것으로 알려진 PD-1을 인지할 수 있는 PD-L1-IgG 융합 단백질(제품명: rmB7-H1/Fc Chimera, 제조회사: R&D systems, Cat No.: 1019-B7)(이하, 'PD-L1-IgG'라 한다.); 또는 상기 제조예 5의 융합 단백질로 나이브 T 세포와 활성화된 T 세포의 표면에 농도 의존적으로 염색하고, 세포 분류기를 이용하여 각각의 세포 표면에서 상기 제조예 5의 융합 단백질이 결합된 수준을 측정하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, PD-L1-IgG로 염색된 비율에 비하여 제조예 5의 융합 단백질로 염색하였을 때, 농도에 의존적으로 활성화된 T 세포의 표면에서 월등히 높은 발현 수준을 확인하였다.
이를 통하여 Lrig-1 단백질의 리간드가 나이브 T 세포에 비하여 활성화된 T 세포 혹은 T 세포 서브세트의 표면에 높은 발현량으로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 활성화된 T 세포의 Lrig-1 단백질의 리간드 확인
상기 실시예 6에서 Lrig-1 단백질의 리간드가 활성화된 T 세포의 표면에서 높게 발현된다는 사실을 확인한 뒤 활성화된 T 세포에서 발현되는 리간드가 어떠한 분자인지를 확인하기 위하여, 제조예 5의 융합 단백질을 이용해 활성화된 T 세포 및 Th1 세포의 세포 용해물(cell lysate)을 면역 침전(immunoprecipitation)시켰다. Lrig-1 단백질의 후보 리간드 중 여러가지의 항체를 이용하여 확인한 결과, 면역 체크포인트(immune checkpoint)인 VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)의 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 통해 웨스턴 블럿(western blot)을 수행하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, 제조예 5의 융합 단백질에 결합되는 분자는 VISTA임을 알 수 있었다. 또한 활성화된 T 세포(Act)와 Th1 세포(TH1)에서 모두 제조예 5의 융합 단백질에 VISTA가 매우 높은 수준으로 결합되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 Lrig-1 단백질의 리간드가 VISTA임을 알 수 있다.
[실시예 8] 활성화된 T 세포의 VISTA와 Lrig-1 단백질 간의 상호작용 확인
활성화된 T 세포의 표면에 존재하는 VISTA가 직접적으로 Lrig-1 단백질과 상호 작용하는지 확인하기 위하여, 활성화된 T 세포의 표면에 VISTA mAb를 농도 의존적으로 결합시킨 뒤 제조예 5의 융합 단백질을 이용하여 염색한 뒤, 세포 분류기(Fluorescence-Activated Cell Sorter; FACS)를 이용하여 염색 정도를 확인하고 그 결과를 도 12의 A 및 B에 나타내었다.
도 12의 A에서 보는 바와 같이, 제조예 5의 융합 단백질만을 통해 세포 표면을 염색하였을 때에는 95% 정도의 결합율을 보인 반면, 농도 의존적으로 VISTA mAb를 먼저 결합시킨 경우 경쟁적 저해(competition)에 의하여 제조예 5의 융합 단백질이 결합하는 비율이 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.
이와는 반대로, 도 12의 B에서 보는 바와 같이, 활성화된 T 세포의 표면에 제조예 5의 융합 단백질을 먼저 결합시키고 VISTA mAb를 결합시킨 경우에도 VISTA의 염색 비율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통하여 활성화된 T 세포의 표면에서 VISTA가 발현되며, 이를 Lrig-1 단백질이 인지하여 서로 상호 작용을 한다는 것을 알 수 있었다.
[실시예 9] T 세포의 표면에서 VISTA의 발현 패턴 확인
T 세포의 표면에서 VISTA의 발현 패턴을 확인하기 위하여, 마우스 나이브 T 세포를 항-CD3/28 항체로 활성화시킨 뒤 각 시간 별로 VISTA의 발현 수준을 확인하여, 그 결과를 도 13의 A에 나타내었다.
도 13의 A에서 보는 바와 같이, 활성화 72 시간 째까지는 VISTA의 발현 수준이 점점 증가하였지만 96시간이 경과한 이후부터는 표면에서 발현 수준이 점차 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
위와 같은 현상의 원인을 확인하기 위하여, VISTA의 세포 외 도메인을 인지하는 ELISA를 통해 활성화된 T 세포의 세포 배양 배지에 존재하는 VISTA 세포 외 도메인의 발현 수준을 시간 별로 측정하여, 그 결과를 도 13의 B에 나타내었다.
도 13의 B에서 보는 바와 같이, 활성화 후 72시간이 경과할 때까지는 상기 배양 배지에서 VISTA의 세포 외 도메인이 거의 검출되지 않았지만, 96시간이 경과한 이후부터 상기 배양 배지 내에서 VISTA 세포 외 도메인의 발현 수준이 급격하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 13(B)). 즉, VISTA 세포 외 도메인의 발현 수준은 활성화된 T세포의 표면에 존재하는 VISTA의 발현 수준과는 정반대의 패턴을 보이는 바, 상기 배양 배지 내 VISTA 세포 외 도메인은 활성화된 T 세포의 표면에 존재하는 VISTA가 절단(cleavage)되어 분비된 것임을 알 수 있었다.
[ 실시예 10] VISTA의 세포 외 도메인의 분비와 자가면역질환의 발병 간의 상관관계 확인
VISTA의 세포 외 도메인의 분비와 자가면역질환의 발병 사이 상관관계를 규명하기 위하여, 류마티스 관절염(Rheumatoid Arthritis, RA) 또는 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD)의 자가면역질환이 유도된 마우스 동물 모델의 혈청(serum)을 준비한 뒤, VISTA 특이적인 항체를 이용하여 상기 혈청 내에 존재하는 VISTA 세포 외 도메인의 양을 ELISA로 분석하여, 그 결과를 도 14 나타내었다.
도 14에서 보는 바와 같이, 정상적인 마우스의 혈청과 비교하여 상기 RA 또는 IBD 자가면역질환이 유도된 마우스의 혈청에서, VISTA 세포 외 도메인이 많은 양으로 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실시예 11] VISTA의 세포 외 도메인의 분비와 자가면역질환의 발병 사이 상관관계 확인
8주령 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 나이브 T 세포인 CD4+ CD62L+ T 세포를 분리한 다음, 플레이트(plate)에 고정화(immobilized)된 항-CD3/항-CD28 mAb를 이용하여 상기 나이브 T 세포를 활성화시킨 후, T 세포의 활성화 정도를 T 세포 표면에 유도 발현되는 CD25표면 단백질의 발현 정도를 FACS로 분석하여, 그 결과를 도 15에 나타내었다. 도 15에서 보는 바와 같이, T 세포의 활성화를 억제(suppression)하는 비교군으로는, 임상에서 사용되고 있는 면역억제제인 사이클로스포린(cyclosporine; CsA)을 처리하자, T 세포의 활성화가 저해되어, CD25의 발현이 43.1%에서 0.33%로 감소하는 것을 볼 수 있었다.
이를 통하여, VISTA를 상기 VISTA의 리간드인 Lrig1-IgG로 자극하였을 때 활성화된 T 세포에 공동 억제 신호(co-inhibitory signal)가 발생되어 T 세포의 활성화가 현저히 저해되었으며, 제조예 5의 융합 단백질의 T 세포의 활성화 저해 정도는 PD-1을 자극하는 PD-L1-IgG 보다 더욱 뛰어난 것을 알 수 있다.
나아가, VISTA의 세포외 도메인 또는 이의 단편; 또는 VISTA의 세포 외 도메인 또는 이의 단편; 및 면역글로불린을 포함하는 융합 단백질과, 상기 제조예 5의 융합 단백질을 병용하여 투여하는 경우에는 T 세포에 공동 억제 신호가 더욱 효율적으로 유도되어 T 세포의 활성화를 더욱 효과적으로 유도할 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 12] 본 발명에 따른 융합 단백질의 면역 관련 질환의 치료 효과
8주령 C57BL/6 마우스의 비장으로부터 나이브 T 세포인 CD4+ CD62L+ T 세포를 분리한 다음, 플레이트(plate)에 고정화(immobilized)된 항-CD3/항-CD28 mAb를 이용하여 상기 나이브 T 세포를 활성화시킨 후, 상기 활성화된 T 세포를 96웰 플레이트에 분주하였다. 그런 다음, 상기 96웰 플레이트에 1 ㎍/ml의 항-CD3 mAb와, 1 ㎍/ml, 5 ㎍/ml 또는 10 ㎍/ml의 농도에 해당하는 제조예 5의 융합 단백질을 처리한 뒤, CSFE를 이용하여 염색한 뒤 FACS로 관찰하는 방식으로 세포의 증식 정도를 분석하여, 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다. 이때 대조군으로는 제조예 5의 융합 단백질을 대신하여 항-FLAG 항체를 사용하였다.
도 17 및 도 18에서 보는 바와 같이, 대조군(control) 및 CD3 단독으로 처리된 경우에는 활성화된 T 세포의 증식 억제 정도가 최대 7.87% 또는 9.82%에 해당한 반면, 제조예 5의 융합 단백질인 Lrig-1-IgG(mL1-hFc)를 처리한 경우에는 5㎍/ml의 농도에서는 18.17%, 10㎍/ml의 농도에서는 47.60%의 활성화된 T 세포 증식이 억제되는 것을 확인하였다(도 17 및 도 18).
이를 통하여, 본 발명에 따른 융합 단백질이 처리되었을 때, 활성화된 T 세포에 공동 억제 신호(co-inhibitory signal)가 발생되어 T 세포의 활성화가 현저히 저해될 수 있고, 이를 통해 활성화된 T 세포에 의해 발생되는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 효과적으로 적용될 수 있다.
이상에서 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
본 발명에서 제공하는 상기의 융합 단백질은 활성화된 T 세포에 존재하는 Lrig-1 단백질에 대한 리간드와 상호 작용하여, 활성화된 T 세포에 동시억제(co inhibitory) 시그널을 줌으로써 상기 활성화된 T 세포의 사멸 또는 활성의 억제를 유도함으로써 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 분야에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (22)

  1. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 세포 외 도메인(extracellular domain) 및 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질; 이를 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 또는 상기 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포를 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 서열번호 1 또는 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 내지 4개 도메인을 포함하는, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 유래 Fc 영역, 중쇄 불변영역 2(CH2), 중쇄 불변영역 3(CH3), 힌지(hinge), 이의 단편, 이들의 조합(combination), 또는 이들의 조합을 포함하는 하이브리드 Fc(hybrid Fc)인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 유래의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지(hinge) 영역을 포함하는, 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, 또는 아바타셉트(Abatacept) 유래의 힌지 영역을 포함하는, 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 힌지(hinge) 영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD 또는 아바타셉트(Abatacept) 유래의 힌지 영역을 포함하는, 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 5 또는 6으로 표시되는 CH2 및 CH3을 포함하는, 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 7 내지 10 중 어느 하나로 표시되는 힌지 영역을 포함하는, 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 직접 연결되는, 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 Lrig-1 단백질의 세포 외 도메인은 링커를 통하여 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단에 연결되는, 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 11로 표시되는 펩타이드 링커; 및 서열번호 12로 표시되는 펩타이드 링커; 중 적어도 하나인, 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 링커는 하기 식 1 내지 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 약학 조성물:
    [식 1]
    (G)n
    [식 2]
    (GGGGS)m
    [식 3]
    (EAAAK)p
    [식 4]
    (XP)q
    n, m 및 p는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이고;
    q는 5 내지 40의 정수이며;
    X는 A(Ala), C(Cys), D(Asp), E(Glu), F(Phe), G(Gly), H(His), I(Ile), K(Lys), L(Leu), M(Met), N(Asn), O(Pyl), P(Pro), Q(Gln), R(Arg), S(Ser), T(Thr), U(Sec), V(Val), W(Trp) 및 Y(Tyr)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산이다.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 96 내지 서열번호 100로 표시되는 펩타이드 링커로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은, VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation) 또는 이의 일 단편; 또는
    VISTA 또는 이의 일 단편과, 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질;을 더 포함하는 것인, 약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 장기이식거부반응; 천식; 아토피; 또는 급성 또는 만성의 염증 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것인, 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 제1형 당뇨, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 전신홍반루프스, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 만성 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염 및 결절성 다발성 동맥염으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 약학 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환인 것인, 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 신경 퇴행성 질환 또는 신경 염증성 질환은 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 니만-피크병(Niemann-Pick disease), 프리온병(prion disease), 크로이펠츠-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 전두측두치매, 루이치매, 근위축성 측삭경화증(AlzAmyotrophic lateral sclerosis), 부신생물증후군(Paraneoplastic syndrome), 피질기저퇴행증, 다계통위축병, 진행성핵상마비, 신경계 자가면역질환, 척수 소뇌 실조(spinocerebellar ataxia), 염증성 및 신경병증성 통증, 뇌혈관 질환, 척수 손상(spinal cord injury) 및 타우병증(tauopathy)으로 이루어진으로부터 선택되는 적어도 하나인 것인, 약학 조성물.
  22. Lrig-1(leucine-rich and immunoglobulin-like domains 1) 단백질의 세포 외 도메인(extracellular domain) 및 면역글로불린(immunoglobulin) Fc 영역을 포함하는 융합 단백질; 이를 암호화하는 핵산 분자; 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포; 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료 방법.
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