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WO2020090892A1 - 抗ヒトＦｎ１４抗体 - Google Patents

抗ヒトＦｎ１４抗体 Download PDF

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Publication number
WO2020090892A1
WO2020090892A1 PCT/JP2019/042587 JP2019042587W WO2020090892A1 WO 2020090892 A1 WO2020090892 A1 WO 2020090892A1 JP 2019042587 W JP2019042587 W JP 2019042587W WO 2020090892 A1 WO2020090892 A1 WO 2020090892A1
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WO
WIPO (PCT)
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antibody
human
amino acid
antigen
binding fragment
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/042587
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
美聖 伊藤
梨佐 柏木
政勝 川上
Original Assignee
アステラス製薬株式会社
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Publication date
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Priority to US17/290,180 priority patent/US20210388096A1/en
Priority to BR112021008424-0A priority patent/BR112021008424A2/pt
Priority to JOP/2021/0093A priority patent/JOP20210093A1/ar
Application filed by アステラス製薬株式会社 filed Critical アステラス製薬株式会社
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Priority to AU2019369771A priority patent/AU2019369771A1/en
Priority to SG11202104463YA priority patent/SG11202104463YA/en
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Priority to CN201980071220.4A priority patent/CN112930195B/zh
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    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to anti-human Fn14 antibody.
  • Cachexia is a complex metabolic disorder syndrome that occurs in association with underlying diseases, and is characterized by a decrease in muscle mass with or without a decrease in fat mass. As clinical symptoms, weight loss in adults and growth disorder in children are seen (Non-patent document 1). About 80% of patients with advanced cancer have cachexia, which is called cancer cachexia. Cachexia not only reduces the prognosis and quality of life (QOL) of patients due to treatment resistance, but is also associated with an increase in mortality. However, there is no effective therapeutic agent for cachexia. Although the mechanism of cachexia is unclear in many cases, cachexia has recently been recognized as a systemic inflammatory state mediated by various cytokines (Non-Patent Document 2).
  • Fibroblast growth factor-inducible 14 (Fibroblast factor-inducible 14; Fn14) (also referred to as TNFRSF12A) is a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily. Fn14 is also known as a Tweak receptor by binding to a weak inducer of TNF-like apoptosis (TNF-like weak inducer of apoptosis; Tweak). Tweak-dependent or independent activation of Fn14 activates the NFkB signaling pathway and regulates cell proliferation, migration, differentiation, and apoptosis, as well as inflammation involved in angiogenesis, tissue damage, and regeneration. Is known (Non-Patent Document 3).
  • Non-patent Document 4 Fn14 is overexpressed in various solid cancers
  • Patent Document 5 Fn14 is involved in tumor progression and metastasis
  • Patent Document 6 anti-Fn14 antibody is effective in ameliorating the symptoms of cachexia in a mouse cancer cachexia model, and its action is due to Fn14 inhibition in tumors
  • Enavatuzumab As an agonist antibody against human Fn14, Enavatuzumab (Patent Document 1), which is under clinical development, has been reported. However, Enavatuzumab has been reported to have hepatotoxicity in a phase I clinical trial (Nonpatent Document 7), and Enavatuzumab. It has been suggested that it may be due to inflammation caused by treatment (Non-Patent Document 8).
  • CRCBT-06-002 has been reported as an antibody that binds to human Fn14 and has antagonistic activity and does not have agonistic activity under specific conditions (Patent Document 2). It has been reported that CRCBT-06-002 has an antagonistic activity to inhibit IL-8 production by Tweak stimulation in human malignant melanoma-derived cell line A375 cells, and its efficacy in a mouse cachexia model. However, the agonist activity that induces IL-8 production from A375 cells in the absence of Tweak remains (Patent Document 2).
  • No anti-Fn14 antagonist antibody is known that has no agonist activity and can avoid unwanted side effects.
  • An object of the present invention is to provide an anti-human Fn14 antibody with excellent safety, which has high agonistic activity and reduced agonistic activity as compared with conventional antibodies.
  • CDR1 consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 31 to 35 of SEQ ID NO: 2 and amino acid numbers of 50 to 65 of SEQ ID NO: 2
  • a heavy chain variable region comprising CDR2 consisting of an amino acid sequence and CDR3 consisting of an amino acid sequence of amino acid numbers 98 to 114 of SEQ ID NO: 2, and CDR1 consisting of an amino acid sequence of amino acid numbers 24 to 40 of SEQ ID NO: 4;
  • an antibody obtained by converting the above antibody into a mouse suppresses a decrease in body weight and muscle mass in a mouse cancer cachexia model (Example 9), and when gemcitabine and the antibody are used in combination.
  • the survival period was prolonged as compared with the case where the antibody was administered alone or the case where gemcitabine was administered alone (Example 10).
  • CDR1 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 31 to 35 of SEQ ID NO: 2
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 50 to 65 of SEQ ID NO: 2
  • a heavy chain variable region comprising CDR3, and CDR1 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 24 to 40 of SEQ ID NO: 4,
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 56 to 62 of SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 4
  • An anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region comprising CDR3 consisting of an amino acid sequence of amino acid numbers 95 to 103.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof according to [1], selected from the following (1) and (2): (1) An anti-human Fn14 antibody comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 125 of SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 114 of SEQ ID NO: 4 or An antigen-binding fragment thereof; and (2) an antibody or an antigen-binding fragment thereof produced by post-translational modification of the anti-human Fn14 antibody or the antigen-binding fragment thereof of (1) above.
  • a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 125 of SEQ ID NO: 2, wherein the glutamine of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 2 is modified with pyroglutamic acid, and the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 4
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof according to [2] which comprises a light chain variable region consisting of an amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 114.
  • the anti-human Fn14 antibody according to [8] which comprises a light chain consisting of [10]
  • An expression vector comprising the polynucleotide according to [11] and / or [12].
  • a host cell selected from the group consisting of the following (a) to (d): (A) A polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or the antigen-binding fragment thereof described in [3], and the light chain variable region of the antibody or the antigen-binding fragment thereof.
  • a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence (B) An expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or the antigen-binding fragment thereof according to [3], and the light chain variable of the antibody or the antigen-binding fragment thereof A host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the region; (C) A host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or the antigen-binding fragment thereof described in [3]; and (d) [3 ] The host cell transformed with the expression vector containing the polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the anti-human Fn14
  • a host cell selected from the group consisting of the following (e) to (h): (E) Transformation with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody according to [7] and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the antibody Host cells; (F) An expression vector containing a polynucleotide containing a base sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody according to [7], and an expression vector containing a polynucleotide containing a base sequence encoding the light chain of the antibody A host cell transformed with, (G) A host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody described in [7]; and (h) the anti-human Fn14 described in [7].
  • a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of an antibody [16] A host cell selected from the group consisting of (A) to (C) below is cultured to produce an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof, which comprises a step of expressing the anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence (B) An expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or the antigen-binding fragment thereof described in [3], and the light chain variable of the antibody or the antigen-binding fragment thereof
  • a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence, and transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the antibody or antigen-binding fragment thereof. Host cells.
  • a method for producing an anti-human Fn14 antibody which comprises the step of culturing a host cell selected from the group consisting of (D) to (F) below and expressing the anti-human Fn14 antibody:
  • E An expression vector containing a polynucleotide containing a base sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody according to [7], and an expression vector containing a polynucleotide containing a base sequence encoding the light chain of the antibody.
  • a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody according to (F) [7] and A host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of an anti-human Fn14 antibody.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [10], [18], and [19], and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof described in [3], the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof described in [5], and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-human Fn14 antibody according to [7], the anti-human Fn14 antibody according to [9], and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • [24] Preventing cachexia of cancer, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [10], [18], and [19] Or a method of treatment.
  • cancer or cancer cachexia which comprises the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of [1] to [10], [18], and [19] as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition which is a pharmaceutical composition and is used in combination with an anticancer agent.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or cancer cachexia comprising an anticancer agent, which comprises the anti-cancer agent according to any one of [1] to [10], [18] and [19].
  • the anti-human Fn14 antibody of the present invention has an anti-inflammatory effect by inhibiting the activation of human Fn14 by Tweak stimulation without exhibiting agonistic activity against human Fn14, and has a preventive effect on cancer cachexia or It may be used as a therapeutic agent.
  • FIG. 8 shows the inhibitory effect of anti-human Fn14 antibody on Tweak-stimulated inflammatory cytokine IL-8 production in A375 cells.
  • the vertical axis represents the inhibition rate (%), and the horizontal axis represents the antibody concentration (ng / mL).
  • 6 shows the IL-8 secretory action in A375 cells induced by anti-human Fn14 antibody stimulation.
  • the vertical axis represents the IL-8 concentration (pg / mL), and the horizontal axis represents the antibody concentration (ng / mL).
  • 4 shows the inhibitory action of mouse anti-human Fn14 antibody 4-1m on the weight loss caused by transplanting mouse colon cancer cell line C26 cells into mice.
  • the vertical axis represents the body weight (g), and the horizontal axis represents the number of days elapsed after the injection of cancer cells.
  • 4 shows the inhibitory effect of mouse anti-human Fn14 antibody 4-1m on muscle mass loss caused by transplantation of mouse colon cancer cell line C26 cells into mice.
  • the vertical axis represents the weight (mg) of the tibialis anterior muscle.
  • 4 shows the inhibitory effect of mouse anti-human Fn14 antibody 4-1m on the decrease in muscle function caused by transplantation of mouse colon cancer cell line C26 cells into mice.
  • the vertical axis represents grip strength (g).
  • Fig. 8 shows the effect of combined use of the mouse anti-human Fn14 antibody 4-1m and gemcitabine on the survival time of mice transplanted with the mouse colon cancer cell line C26 cells.
  • FIG. 7 shows the combined effect of mouse anti-human Fn14 antibody 4-1m with gemcitabine on the volume of tumor formed by transplanting mouse colon cancer cell line C26 cells into mice.
  • the vertical axis represents the tumor volume (mm 3 ) and the horizontal axis represents the number of days elapsed after the injection of cancer cells.
  • the basic structure of an antibody molecule is common to all classes and is composed of heavy chains with a molecular weight of 50,000 to 70,000 and light chains with a molecular weight of 20,000 to 30,000.
  • the heavy chain usually consists of a polypeptide chain containing about 440 amino acids, has a characteristic structure for each class, and corresponds to IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, Ig ⁇ , Ig ⁇ , Ig ⁇ , Ig ⁇ , Ig ⁇ . Is called.
  • IgG has subclasses of IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4, and the heavy chains corresponding to them are called Ig ⁇ 1, Ig ⁇ 2, Ig ⁇ 3, and Ig ⁇ 4.
  • the light chain usually consists of a polypeptide chain containing about 220 amino acids, and two types, L-type and K-type, are known, and they are called Ig ⁇ and Ig ⁇ , respectively.
  • the peptide structure of the basic structure of an antibody molecule has a molecular weight of 150,000 to 190,000, in which two heavy chains and two light chains that are homologous to each other are bound by a disulfide bond (SS bond) and a non-covalent bond. ..
  • the two light chains can pair with any heavy chain.
  • Each antibody molecule always consists of two identical light chains and two identical heavy chains.
  • the antigen-binding site of an antibody is composed of VH and VL, and the specificity of binding depends on the amino acid sequence of this site.
  • biological activities such as binding to complement and various Fc receptor-expressing cells reflect the difference in the structure of the constant region of each class Ig.
  • the variability of the light and heavy chain variable regions has been found to be limited to three small hypervariable regions that are present in both chains, and these regions are complementarity determining regions (CDRs; N-terminals, respectively). From the side, they are called CDR1, CDR2, CDR3).
  • CDR1, CDR2, CDR3 complementarity determining regions
  • the rest of the variable region is called the framework region (FR) and is relatively constant.
  • antigen-binding fragments including VH and VL of the antibody also have antigen-binding activity, and as such representative antigen-binding fragments, single-chain variable region fragment (scFv), Fab, Fab ′, F (ab ′) There are two .
  • scFv is a monovalent antibody fragment composed of VH and VL linked by a linker
  • Fab is composed of a light chain and a heavy chain fragment containing VH, CH1 domain and a part of hinge region. It is a monovalent antibody fragment.
  • Fab ′ is a monovalent antibody fragment composed of a heavy chain fragment containing a light chain, VH, CH1 domain, and a part of hinge region, and the hinge region has an inter-heavy chain SS sequence. Includes cysteine residues that made up the bond.
  • F (ab ′) 2 fragments are divalent antibody fragments in which two Fab ′ fragments are linked by an inter-heavy chain SS bond in the hinge region.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention includes an anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof having the following characteristics.
  • CDR1 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 31 to 35 of SEQ ID NO: 2
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 50 to 65 of SEQ ID NO: 2
  • a heavy chain variable region containing CDR3 and CDR1 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 24 to 40 of SEQ ID NO: 4
  • CDR2 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 56 to 62 of SEQ ID NO: 4
  • amino acid of SEQ ID NO: 4 An anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region comprising CDR3 consisting of the amino acid sequences of Nos. 95 to 103.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid Nos. 1 to 125 of SEQ ID NO: 2 and amino acid numbers 1 to 114 of SEQ ID NO: 4.
  • An anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof comprising a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has the above characteristics and further comprises a heavy chain constant region and a light chain constant region.
  • a constant region a constant region of any subclass (eg, Ig ⁇ 1, Ig ⁇ 2, Ig ⁇ 3 or Ig ⁇ 4 as a heavy chain and Ig ⁇ or Ig ⁇ as a light chain) can be selected.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises a human Ig ⁇ 1 constant region as a heavy chain constant region and a human Ig ⁇ constant region as a light chain constant region.
  • L234A and L235A are substitutions of leucines at amino acids 234 and 235 with alanine according to the EU index of Kabat et al.
  • Examples of the human Ig ⁇ 1 constant region having amino acid mutations of L234A and L235A include a human Ig ⁇ 1 constant region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 126 to 455 of SEQ ID NO: 2.
  • the anti-human Fn14 antibody of the present invention is an anti-human Fn14 antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the antibody When the antibody is expressed in cells, it is known that the antibody undergoes post-translational modification.
  • post-translational modification include deletion of lysine at the C-terminal of the heavy chain by carboxypeptidase, modification of pyroglutamic acid at the N-terminals of the heavy and light chains by pyroglutamylation of glutamine or glutamic acid, glycosylation, oxidation, deamidation It is known that such various post-translational modifications occur in various antibodies (Liu H et al., J Phar Sci. 2008, Vol. 97 No. 7, p. 2426). -2447).
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention also includes a post-translationally modified anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof.
  • Examples of the post-translationally modified anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention include anti-human Fn14 that has undergone pyroglutamylation at the N-terminus of the heavy chain variable region and / or lysine deletion at the C-terminus of the heavy chain.
  • An antibody or an antigen-binding fragment thereof may be mentioned.
  • the anti-human Fn14 antibody of the present invention consists of a heavy chain variable region consisting of amino acid numbers 1 to 125 of SEQ ID NO: 2 and an amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 114 of SEQ ID NO: 4.
  • An antibody or an antigen-binding fragment thereof produced by post-translational modification of an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof containing a light chain variable region.
  • the post-translational modification is pyroglutamylation at the N-terminus of the heavy chain variable region and / or lysine deletion at the C-terminus of the heavy chain.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 125 of SEQ ID NO: 2, wherein amino acid number 1 of SEQ ID NO: 2.
  • an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof which comprises a heavy chain variable region in which glutamine is modified to pyroglutamic acid, and a light chain variable region consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 114 of SEQ ID NO: 4.
  • the anti-human Fn14 antibody of the present invention is a post-translational modification of an anti-human Fn14 antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Anti-human Fn14 antibody, wherein the post-translational modification is P-glutamylation at the N-terminus of the heavy chain and / or lysine deletion at the C-terminus of the heavy chain.
  • the anti-human Fn14 antibody of the present invention is a heavy chain consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 454 of SEQ ID NO: 2, wherein glutamine of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 2 is modified to pyroglutamic acid. It is an anti-human Fn14 antibody containing a heavy chain and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the antigen binding fragment of the invention is scFv, Fab, Fab ', or F (ab') 2 .
  • Those skilled in the art can also prepare a fusion of the antibody or the antigen-binding fragment thereof with another peptide or protein, or a modified product to which a modifying agent is bonded, based on the present invention.
  • These forms of antibodies or antigen-binding fragments thereof are also included in the antibody of the present invention.
  • Other peptides and proteins used for fusion are not particularly limited as long as the fusion binds to Fn14, and examples thereof include human serum albumin, various tag peptides, artificial helix motif peptides, maltose binding proteins, glutathione S transferases, various toxins, Other examples include peptides or proteins that can promote multimerization.
  • the modifying agent used for modification is not particularly limited as long as the modified product binds to Fn14, and examples thereof include polyethylene glycol, sugar chains, phospholipids, liposomes, and low-molecular compounds.
  • the modifier used to modify the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is polyethylene glycol.
  • the "anti-human Fn14 antibody” in the present specification means an antibody that binds to human Fn14. Whether or not it binds to human Fn14 can be confirmed using a known binding activity measurement method. Examples of the method for measuring the binding activity include methods such as Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • human Fn14 protein is immobilized on an ELISA plate, a test antibody is added thereto and reacted, and then an anti-IgG antibody labeled with an enzyme such as horseradish peroxidase (HRP) is used. React with the secondary antibody of.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the binding of the secondary antibody is measured by an activity measurement using a reagent for detecting the activity (eg, in the case of HRP labeling, TMB Microwell Peroxidase Substrate (Kirkegaard & Perry Laboratories, 50-76-03)). It is possible to confirm whether or not the test antibody binds to human Fn14 by identifying As a specific evaluation method, the method described in Example 6 below can be used.
  • the anti-human Fn14 antibody of the present invention includes an antibody that binds to human Fn14 as well as an antibody that binds to Fn14 derived from another animal (for example, mouse Fn14) as long as it is an antibody that binds to human Fn14.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be prepared by a method known in the art based on the sequence information of the heavy chain and the light chain of the antibody of the present invention disclosed herein, It can be easily made by those skilled in the art.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is not particularly limited, and for example, the method for producing the anti-human Fn14 antibody of the present invention described below and the anti-human Fn14 antibody produced by the method are described below. It can be manufactured according to the method described in.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention is further purified, if necessary, and then formulated according to a conventional method to produce inflammatory diseases such as excessive angiogenesis, weight loss, muscle wasting, and cachexia. It can be used for the prevention or treatment of the wasting disease.
  • the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain variable region is included.
  • the polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has a heavy amino acid sequence consisting of amino acid numbers 1 to 125 of SEQ ID NO: 2. It is a polynucleotide containing a base sequence encoding a chain variable region.
  • Examples of the polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region shown in the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 125 of SEQ ID NO: 2 include, for example, those containing the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 375 of SEQ ID NO: 1. Nucleotides.
  • the polynucleotide containing the base sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody of the present invention is a polynucleotide containing the base sequence encoding the heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Is.
  • Examples of the polynucleotide containing the base sequence encoding the heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 include the polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide comprising the nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention has a light amino acid sequence consisting of amino acid numbers 1 to 114 of SEQ ID NO: 4. It is a polynucleotide containing a base sequence encoding a chain variable region.
  • the polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding the light chain variable region consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 114 of SEQ ID NO: 4 is, for example, the polynucleotide containing the nucleotide sequence of nucleotide numbers 1 to 342 of SEQ ID NO: 3. Is mentioned.
  • the polynucleotide containing the base sequence encoding the light chain variable region of the anti-human Fn14 antibody of the present invention is a polynucleotide containing the base sequence encoding the light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. Is.
  • Examples of the polynucleotide containing the base sequence encoding the light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 include the polynucleotide containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide of the present invention can be easily prepared by those skilled in the art based on its nucleotide sequence and using a method known in the art.
  • the polynucleotide of the present invention can be synthesized using a gene synthesis method known in the art.
  • a gene synthesizing method various methods known to those skilled in the art such as the antibody gene synthesizing method described in WO90 / 07861 can be used.
  • the expression vector of the present invention includes a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and / or an anti-human Fn14 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • An expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding a light chain variable region is included.
  • the expression vector of the present invention includes an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention, and a light chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention.
  • An expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence of the present invention, or a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the antibody An expression vector may be mentioned.
  • Examples of the expression vector used for expressing the polynucleotide of the present invention include various host cells such as eukaryotic cells (eg, animal cells, insect cells, plant cells, yeast) and / or prokaryotic cells (eg, Escherichia coli).
  • eukaryotic cells eg, animal cells, insect cells, plant cells, yeast
  • prokaryotic cells eg, Escherichia coli
  • a polynucleotide comprising a base sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof and / or a base encoding the light chain variable region of the anti-human Fn14 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof.
  • variable region gene fragment may be introduced into an expression vector having a human Ig constant region gene such as AG- ⁇ 1 or AG- ⁇ (see, for example, WO94 / 20632) in advance to express the antibody gene.
  • the expression vector of the present invention may include a promoter operably linked to the polynucleotide of the present invention.
  • the promoter for expressing the polynucleotide of the present invention in animal cells include virus-derived promoters such as CMV, RSV and SV40, actin promoter, EF (elongation factor) 1 ⁇ promoter, heat shock promoter and the like.
  • the promoter for expression in bacteria include trp promoter, lac promoter, ⁇ PL promoter, tac promoter and the like.
  • promoters for expression in yeast include GAL1 promoter, GAL10 promoter, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like.
  • the expression vector of the present invention may contain a start codon and a stop codon.
  • the expression vector of the present invention comprises the enhancer sequence, the 5'-side and 3'-side untranslated regions of the gene encoding the antibody of the present invention or the heavy chain variable region or the light chain variable region thereof, a secretory signal sequence, and splicing. It may contain a junction, a polyadenylation site, a replicable unit, or the like.
  • the expression vector of the present invention may contain a start codon, a stop codon, a terminator region, and a replication-competent unit.
  • the expression vector of the present invention may contain a selectable marker usually used depending on the purpose (eg, tetracycline resistance gene, ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, neomycin resistance gene, dihydrofolate reductase gene). ..
  • the transformed host cell of the present invention includes a polynucleotide containing a base sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention, and a polynucleotide containing a base sequence encoding the light chain of the antibody.
  • the transformed host cell of the present invention includes a host cell transformed with the expression vector of the present invention selected from the group consisting of (a) to (d) below. .. (A) a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and a nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the antibody or its antigen-binding fragment, A host cell transformed with an expression vector comprising a polynucleotide comprising; (B) An expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and the light chain variable region of the antibody or its antigen-binding fragment A host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence (C)
  • the transformed host cell of the present invention includes a host cell transformed with the expression vector of the present invention selected from the group consisting of (e) to (h) below.
  • E A host transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention and a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the antibody cell;
  • F An expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention, and an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the light chain of the antibody.
  • Transformed host cells (G) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention; and (h) encoding a light chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention.
  • the host cell to be transformed is not particularly limited as long as it is compatible with the expression vector used and can be transformed with the expression vector to express the antibody.
  • Examples of the host cell to be transformed include various cells (eg, animal cells (eg, CHO-K1SV cells)) and insect cells such as natural cells or artificially established cells usually used in the technical field of the present invention. (For example, Sf9), bacteria (Escherichia, etc.), yeasts (Saccharomyces, Pichia, etc.), and the like, for example, CHO cells (CHO-K1SV cells, CHO-DG44 cells, etc.), 293 cells, NS0. Cultured cells such as cells can be used.
  • the method for transforming a host cell is not particularly limited, but, for example, the calcium phosphate method, electroporation method or the like can be used.
  • the method for producing an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof according to the present invention includes culturing a host cell selected from the group consisting of (A) to (C) below to prepare an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof. And a method for producing an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof is included.
  • A a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and a nucleotide sequence encoding the light chain variable region of the antibody or its antigen-binding fragment
  • B An expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and the light chain variable region of the antibody or its antigen-binding fragment
  • C a polynucleotide containing the nucleotide sequence encoding the heavy chain variable region of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding
  • the method of producing an anti-human Fn14 antibody of the present invention comprises a step of culturing a host cell selected from the group consisting of (D) to (F) below to express the anti-human Fn14 antibody: And a method of producing an anti-human Fn14 antibody.
  • a transformed host cell and (F) a host cell transformed with an expression vector containing a polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding the heavy chain of the anti-human Fn14 antibody of the present invention, and the light chain of the antibody.
  • the method for producing the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention includes the step of culturing the transformed host cell of the present invention to express the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof. It is not particularly limited.
  • the host cells used in the method include the host cells of (A) and (D) described above.
  • Culturing of the transformed host cell can be performed by a known method. Culture conditions such as temperature, pH of the medium, and culture time are appropriately selected.
  • the host cells are animal cells
  • examples of the medium include MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum (Eagle H, Science. 1959, Vol. 130 No. 3373, p. 432-437), DMEM. Medium (Dulbecco R and Freeman G, Virology. 1959, Vol. 8, p. 396-397), RPMI1640 medium (Moore GE et al., J Am Med Assoc. 1967, Vol. 199, p. 519), 199 medium. (Morgan JF et al., Proc Soc Exp Biol Med. 1950, Vol.
  • the pH of the medium is preferably about 6 to 8, and the culture is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 336 hours with aeration and stirring if necessary.
  • the host cells are insect cells
  • Grace's medium containing fetal bovine serum Smith GE et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1985, Vol. 82, p. 8404
  • the pH of the medium is preferably about 5 to 8. Culturing is usually carried out at about 20 to 40 ° C. for about 15 to 100 hours with aeration and stirring if necessary.
  • a liquid medium containing a nutrient source is suitable as the medium.
  • the nutrient medium preferably contains a carbon source, an inorganic nitrogen source, or an organic nitrogen source necessary for the growth of the transformed host cell.
  • the carbon source include glucose, dextran, soluble starch, sucrose and the like
  • examples of the inorganic or organic nitrogen source include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract. , Soybean meal, potato extract and the like.
  • nutrients eg, inorganic salts (eg, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, etc.
  • antibiotics eg, tetracycline, neomycin, ampicillin, kanamycin, etc.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • examples of preferable medium include LB medium, M9 medium (Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, Vol. 3, A2.2) and the like. Culturing is usually carried out at about 14 to 39 ° C. for about 3 to 24 hours with aeration and stirring if necessary.
  • Burkholder's minimum medium (Bostian KA et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1980, Vol. 77, p. 4504-4508) can be used as the medium. Culturing is usually carried out at about 20 to 35 ° C. for about 14 to 144 hours with aeration and stirring if necessary.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention can be expressed by the culture as described above.
  • the method of producing the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention comprises the step of culturing the transformed host cell of the present invention and expressing the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof, further comprising: , A step of recovering, for example, isolating or purifying the anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof from the transformed host cell and / or culture supernatant.
  • the isolation or purification method include a method utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, a method utilizing difference in molecular weight such as dialysis, ultrafiltration and gel filtration, ion exchange chromatography, and hydroxylapatite chromatography.
  • the antibody accumulated in the culture supernatant can be purified by various kinds of chromatography, for example, column chromatography using a protein A column or a protein G column.
  • the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention also includes the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof produced by the method for producing the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutical composition containing the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by a commonly used method using an excipient usually used in the art, that is, a pharmaceutical excipient, a pharmaceutical carrier and the like.
  • Examples of dosage forms of these pharmaceutical compositions include parenteral agents such as injections and infusions, which can be administered by intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration and the like. Upon formulation, excipients, carriers, additives, etc. depending on these dosage forms can be used within a pharmaceutically acceptable range.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a plurality of anti-human Fn14 antibodies of the present invention or antigen-binding fragments thereof.
  • the present invention also includes an antibody or an antigen-binding fragment thereof that has not been post-translationally modified, and a pharmaceutical composition containing the antibody or an antigen-binding fragment thereof that is produced by post-translational modification of the antibody or an antigen-binding fragment thereof. ..
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof also includes the pharmaceutical composition described below.
  • Anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof comprising a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 125 of SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 114 of SEQ ID NO: 4
  • a pharmaceutical composition containing an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof which is an antibody or an antigen-binding fragment thereof produced by post-translational modification of the antibody or the antigen-binding fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a heavy chain C-terminal lysine deleted antibody, an N-terminal post-translationally modified antibody or an antigen-binding fragment thereof, a heavy chain C-terminal lysine deleted and an N-terminal post-translational modification. And / or a pharmaceutical composition comprising a heavy chain C-terminal lysine and no N-terminal post-translational modification.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing an anti-human Fn14 antibody also includes a pharmaceutical composition containing two or more anti-human Fn14 antibodies of the following (5) to (8).
  • An anti-human Fn14 antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 454 of SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • An anti-human Fn14 antibody comprising: (7) A heavy chain consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 454 of SEQ ID NO: 2, wherein the glutamine of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 2 is modified with pyroglutamic acid and the amino acid shown in SEQ ID NO: 4 An anti-human Fn14 antibody comprising a light chain consisting of a sequence. (8) An anti-human Fn14 antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing an anti-human Fn14 antibody or an antigen-binding fragment thereof also includes the pharmaceutical composition described below.
  • An anti-human Fn14 antibody comprising a heavy chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, a heavy chain consisting of the amino acid sequences of amino acid numbers 1 to 454 of SEQ ID NO: 2.
  • An anti-human Fn14 antibody comprising a heavy chain in which glutamine of amino acid number 1 of SEQ ID NO: 2 is modified with pyroglutamic acid and a light chain consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and a pharmaceutically acceptable excipient.
  • a pharmaceutical composition comprising a dosage form.
  • the amount of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention to be added in the above-mentioned formulation varies depending on the degree and age of the patient's symptoms, the dosage form of the formulation used, the antibody binding titer, etc. It can be used so as to be about 0.001 mg / kg to 100 mg / kg at the time of administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a prophylactic or therapeutic agent for diseases in which active human Fn14 is involved in pathological condition formation, for example, cachexia of cancer.
  • the present invention includes a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer cachexia, which comprises the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the present invention also includes a method for treating or preventing cancer cachexia, which comprises the step of administering a therapeutically effective amount of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the present invention also includes the anti-human Fn14 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof for use in preventing or treating cancer cachexia.
  • the present invention includes the use of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer cachexia.
  • the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or cancer cachexia, which comprises the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and is used in combination with an anti-cancer agent.
  • a pharmaceutical composition comprising the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention, and is used in combination with an anti-cancer agent.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer or cancer cachexia, which comprises the step of administering an effective amount of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention and an anti-cancer agent.
  • the present invention provides the anti-human Fn14 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof, which is used in combination with an anti-cancer agent for use in the prevention or treatment of cancer or cancer cachexia.
  • the present invention is the use of the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention in the manufacture of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer or cachexia, wherein the pharmaceutical composition is an anticancer agent. To be used in combination with.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or cancer cachexia, which comprises an anticancer agent, and is used in combination with the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • a pharmaceutical composition provides an anticancer agent for use in the prevention or treatment of cancer or cachexia, which is used in combination with the anti-human Fn14 antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the present invention relates to the use of an anti-cancer agent in the manufacture of a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or cachexia, which comprises the anti-human Fn14 antibody of the present invention or an antigen-binding fragment thereof. To be used in combination with.
  • the anticancer agent used in the present invention is gemcitabine.
  • Example 1 Acquisition of human and mouse Fn14-Fc fusion protein
  • the present inventors have prepared human Fn14-human Fc fusion protein and mouse Fn14-mouse Fc fusion protein for use as antigens for obtaining anti-Fn14 antibody and materials used in screening tests.
  • the human Fn14-human Fc fusion protein contains the C-terminal of the extracellular partial sequence of the human Fn14 sequence (amino acids 1 to 79 of NCBI accession number: NP_057723.1) and the human Fc region (NCBI accession number: P01857).
  • a fusion protein in which the N-terminals of the 106th to 330th amino acids of 1 are linked by a peptide linker (SEQ ID NO: 9).
  • the mouse Fn14-mouse Fc fusion protein connects the C-terminal of the extracellular partial sequence of the mouse Fn14 sequence (amino acids 1 to 75 of NCBI accession number: AAF07882.1) to the N-terminal of the mouse Fc region.
  • the gene encoding the extracellular partial sequence of the mouse Fn14 sequence is located between the hEF1-HTLV promoter region and the mIgG2B-Fc region of pFUSE-mIgG2B-Fc1 (InvivoGen, pfuse-mg2bfc1). It is a fusion protein that was incorporated into the multi-cloning site using the restriction enzymes EcoRI and EcoRV and expressed.
  • Expression vectors were prepared by incorporating the above-mentioned gene encoding the fusion protein into GS vector pEE12.4 (Lonza) and introduced into CHO-K1SV cells (Lonza). From the culture supernatant of the CHO-K1SV cells, a human Fn14-human Fc fusion protein and a mouse Fn14-mouse Fc fusion protein were purified according to a standard method.
  • Example 2 Human monoclonal antibody development technology “Velosimune” (VelocImmune antibody technology: Regeneron (US Pat. No. 6,596,541)) An antibody was prepared using a mouse.
  • the antibody obtained by the Velosimune technique is an antibody having a variable region of a human antibody and a constant region of a mouse antibody (also referred to as a chimeric antibody).
  • a human Fn14 protein obtained by cleaving / removing the human Fc region from Fab FRICATOR (Sigma, 77661) from the human Fn14-human Fc fusion protein prepared in Example 1 was used in Verosimune mouse together with an adjuvant that induces an immune reaction. I was immunized.
  • lymphocytes collected from the lymph nodes of immunized mice were cell-fused with mouse-derived myeloma cells SP2 / 0-Ag14 (ATCC: CRL-1581) to prepare hybridomas, which were then cloned.
  • a hybridoma producing an antibody that binds to human Fn14 and suppresses the activation of NFkB by Tweak stimulation (hereinafter, referred to as "Tweak-induced NFkB activation" in Examples below) is selected, and the antibody is selected from the culture supernatant.
  • Tweak-induced NFkB activation Tweak stimulation
  • Example 3 NFkB activation assay
  • a reporter assay Specifically, HEK293 cells (ATCC, CRL-1573) stably transfected with a luciferase reporter vector pGL4.32 (Promega, E8491) having an NFkB transcription response element incorporated therein (hereinafter referred to as NFkB / HEK293 cells). was prepared and used for evaluation.
  • NFkB / HEK293 cells were suspended in 1.25 ⁇ 10 5 cells / mL with DMEM (Sigma, D6429) containing 10% fetal bovine serum, and seeded in a clear bottom white 96-well plate (Corning, 3610) at 80 ⁇ L per well. After culturing in a CO 2 incubator set at 37 ° C. and 5% CO 2 for 2 hours, the purified antibody obtained in Example 2 was diluted in 12 steps with a final concentration of 1 ng / mL to 300 ⁇ g / mL at a 3-fold common ratio. After the series was prepared in the above medium, 20 ⁇ L was added per well. After overnight culture at 37 ° C. and 5% CO 2 , NFkB activation was quantified by measuring the luciferase expression level using a luciferase assay reagent ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega).
  • an anti-human Fn14 antibody that did not induce NFkB activation, that is, did not show agonist activity was selected and named 4-1.
  • Example 4 Preparation of fully human antibody and mouse antibody
  • genes encoding the antibody heavy and light chains were cloned and sequenced. After sequencing the antibody, a gene encoding a signal sequence (Wittle N et al., Protein Engineering. 1987, Vol. 1 No. 6, p.
  • the human ⁇ chain constant region genes (consisting of the nucleotide sequences from the nucleotide numbers 343 to 660 in SEQ ID NO: 3) were ligated to each other, and this light chain gene was inserted into GS vector pEE12.4. These GS vectors were digested with NotI-HF and PvuI-HF by restriction enzymes, and ligated using DNA Ligation Kit ⁇ Mighty Mix> (TaKaRa, 6023) to insert both heavy and light chain genes. The GS vector was constructed. From the culture supernatant of CHO-K1SV cells transfected with this vector, an antibody was purified by a conventional method to obtain a fully human antibody 4-1 and named 4-1h.
  • the prepared heavy chain base of 4-1h is SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence encoded by it is SEQ ID NO: 2, the base sequence of the light chain is SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence encoded thereby is sequenced. Number 4 is shown respectively.
  • the variable region of the heavy chain shown in SEQ ID NO: 2 consists of the amino acid sequence from amino acid number 1 to 125 of SEQ ID NO: 2, and the variable region of the light chain shown in SEQ ID NO: 4 has amino acid numbers of SEQ ID NO: 4. It consists of the 1st to 114th amino acid sequences.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region of 4-1h consist of the 31st to 35th, 50th to 65th, and 98th to 114th amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, respectively.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region of 4-1h consist of the amino acid sequences of 24th to 40th, 56th to 62nd, and 95th to 103rd of SEQ ID NO: 4, respectively.
  • 4-1h mouse antibody (hereinafter referred to as 4-1m) was prepared in order to reduce the immunogenicity risk.
  • the framework regions (FR) of the light chain and heavy chain of 4-1h were partially replaced with the FRs of other mouse antibodies to prepare a nucleotide sequence encoding the variable region of 4-1m.
  • 4-1m was obtained using the same method as the above 4-1h vector construction, antibody expression and purification.
  • a gene encoding a mouse Ig ⁇ 2a constant region gene having a D265A amino acid mutation in the heavy chain constant region (consisting of the base sequence from base number 376 to 1365 of SEQ ID NO: 5) is used as the constant region of the light chain.
  • the mouse ⁇ chain constant region gene (consisting of the nucleotide sequence from nucleotide number 343 to nucleotide number 660 of SEQ ID NO: 7) was used.
  • the prepared heavy chain of 4-1m is represented by SEQ ID NO: 5, the amino acid sequence encoded by it is SEQ ID NO: 6, the nucleotide sequence of the light chain is represented by SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence encoded thereby is sequenced. Number 8 is shown respectively.
  • the variable region of the heavy chain shown in SEQ ID NO: 6 consists of the amino acid sequence from amino acid number 1 to 125 of SEQ ID NO: 6, and the variable region of the light chain shown in SEQ ID NO: 8 is amino acid number of SEQ ID NO: 8. It consists of the 1st to 114th amino acid sequences.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the heavy chain variable region of 4-1m consist of the 31st to 35th, 50th to 65th, and 98th to 114th amino acid sequences of SEQ ID NO: 6, respectively.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 of the light chain variable region of 4-1m consist of the amino acid sequences of 24 to 40, 56 to 62, and 95 to 103 of SEQ ID NO: 8, respectively.
  • Example 6 Human and mouse Fn14 binding ELISA of fully human antibody and mouse antibody
  • the binding activity of 4-1h and 4-1m obtained in Example 4 to the Fn14 protein was evaluated.
  • the human Fn14-human Fc fusion protein and mouse Fn14-mouse Fc fusion protein obtained in Example 1 were diluted to 1 ⁇ g / mL with phosphate buffered saline (PBS), and a Maxisorp 384-well transparent plate (Nunc, 15 ⁇ L per well was added to 464718) and incubated overnight at 4 ° C. to immobilize.
  • PBS phosphate buffered saline
  • TBS-T Tris-buffered saline
  • PBS containing 20% Blocking One Nacalai Tesque, Inc. 03953-95
  • TBS-T containing 5% Blocking One (hereinafter, referred to as a diluent) was used in a maximum concentration of 30 ⁇ g / mL in 12 steps and a 4-fold common ratio.
  • a dilution series was prepared by dilution, and 20 ⁇ L was added per well. After incubating at room temperature for 1 hour, the cells were washed with TBS-T.
  • a horseradish peroxidase-labeled anti-human kappa light chain antibody (SouthernBiotech, 2060-05) diluted 4,000-fold with 4-1 h was used as a secondary antibody, and a hose diluted 4,000-fold with 4,000 m with a diluent.
  • Radical peroxidase-labeled anti-mouse kappa light chain antibody (SouthernBiotech, 1050-05) was added in an amount of 20 ⁇ L per well.
  • Example 7 Tweak-induced NFkB activation inhibition assay of fully human antibody
  • the NFkB / HEK293 cells prepared in Example 3 were suspended in 1.25 ⁇ 10 5 cells / mL with DMEM containing 10% fetal bovine serum, and seeded in a clear bottom white 96-well plate at 80 ⁇ L per well. After overnight culturing at 37 ° C. and 5% CO 2, with respect to 4-1h obtained in Example 4, 11-step dilution series with a final concentration of 0.1 ng / mL to 10 ⁇ g / mL at a 3-fold common ratio was performed. After preparation in medium, 10 ⁇ L was added per well. After culturing at 37 ° C.
  • Tweak (Peprotech, 310-06) was added to a final concentration of 100 ng / mL.
  • NFkB activation was quantified according to the method of Example 3.
  • a group to which only the medium containing no antibody was added was set as a control group, the Tweak added group was set to 0% inhibition, the Tweak non-added group was set to 100% inhibition, and the concentration of the antibody to be inhibited by 50% by 4-parameter logistic curve fitting ( The IC 50 value) was calculated.
  • Each antibody was tested in duplicate and the IC 50 values of 3 trials were geometrically averaged to calculate 95% confidence intervals (Table 2).
  • mouse anti-human Fn14 antibody CRCBT-06-002 was used as a comparative antibody.
  • Example 8 IL-8 production assay of fully human antibody
  • the functional activity of 4-1h obtained in Example 4 was evaluated by an in vitro IL-8 production assay.
  • A375 cells (ATCC, CRL-1619) were suspended in DMEM containing 10% fetal bovine serum at 5 ⁇ 10 4 cells / mL, and seeded in a 96-well flat bottom plate (IWAKI, 3860-096) at 100 ⁇ L per well. After overnight culture at 37 ° C. and 5% CO 2 , the cells were washed with PBS.
  • Example 4 For 4-1h obtained in Example 4, a 10-fold dilution series with a final concentration of 1 ng / mL to 100 ⁇ g / mL was prepared in the above medium and added to the cells. After culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 overnight in the presence (evaluation of antagonist activity) or absence (evaluation of agonist activity) of Tweak at a final concentration of 5 ng / mL, the culture supernatant was collected, and IL in the culture supernatant was collected. The -8 concentration was measured using a Human IL-8 / CXCL8 Quantine ELISA kit (R & D, D8000C). Final volumes in the antagonist and agonist activity evaluations were 65 ⁇ L / well and 100 ⁇ L / well, respectively. In this test, CRCBT-06-002 was used as a comparative antibody, and each antibody was tested in duplicate.
  • CRCBT-06-002 is a partial antagonist antibody having an agonistic action
  • 4-1h is a complete antagonist antibody having an extremely weak agonistic action on human Fn14.
  • Table 3 Inhibitory activity of 4-1h and CRCBT-06-002 on IL-8 production by Tweak stimulation.
  • mice bearing the mouse colon cancer cell line C26 are one of the representative cancer cachexia models showing weight loss and muscle mass characteristic of cachexia (Aulino).
  • P et al., BMC Cancer 2010, Vol. 10 363, p. 1-15 (Bonetto A et al., J Vis Exp. 2016, Nov. 30 117, p. 1-21).
  • BD Matrigel Matrix Basement membrane Phenol-red Free (BD, 356237) was used to inject 10 6 cells / 100 ⁇ L of C26 cells (National Cancer Institute) into a male CD2F1 mouse (Charles River, Japan 100 ⁇ L).
  • C26 tumor-bearing mice were prepared, and after confirming that the weight of C26 tumor-bearing mice began to decrease, antibody administration was started.
  • 4-1m diluted with PBS was subcutaneously administered at 3 mg / kg (administration volume: 10 mL / kg) to C26 tumor-bearing mice.
  • the isotype control antibody was administered to the control group in the same manner.
  • a mouse IgG2a antibody against KLH keyhole limpet hemocyanin
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • the grip strength was measured using a small animal grip strength measurement device (Melquest, GPM-100B). After measuring the body weight on the 37th day, the weight of the extracted tibialis anterior muscle was measured as the muscle mass. For each index measured on the 36th and 37th days, a significant difference between the 4-1m administration group and the control group was determined using Student's t-test. In any case, the case of p ⁇ 0.05 was regarded as significant, and when there was a significant difference, a mark (*) was described in the graph (** in the graph indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01. Shown).
  • Fig. 3 shows the changes in body weight measured continuously until the 37th day.
  • the body weight of the control group continued to decrease after the start of administration, but the body weight loss was suppressed in the 4-1m administration group, and a significant increase in body weight was observed in the 4-1m administration group on day 37 compared with the control group.
  • P 0.0019
  • 4-1m is effective for cachexia and may be effective for therapeutic administration after weight loss is observed.
  • Example 10 Effect on survival time in cachexia model of mouse
  • C26 tumor-bearing mice were prepared in the same manner as in Example 9. The administration was started with 5 mice in each group at the timing when the weight of C26 cancer-bearing mice started to decrease. Specifically, from 22 to 70 days after the cell injection, 0.3 mg / kg of 4-1m diluted with PBS was administered 3 times a week, and thereafter on 71, 76, 78, 83 and 85 days. (Dose volume 10 mL / kg) was subcutaneously administered. The same isotype control antibody as in Example 9 was administered to the control group in the same manner as in 4-1m.
  • a log-rank test was performed when comparing differences in survival curves between groups, and a case of p ⁇ 0.05 was considered significant.
  • the median survival time was 41 days, 57 days, and 55 days in the control group, the 4-1m administration group, and the gemcitabine administration group, respectively.
  • the median survival time of the 4-1m administration group combined with gemcitabine was 83 days, and a significant difference was observed in the survival curve of the 4-1m alone administration group or the gemcitabine alone administration group.
  • the effect of 4-1m administration on the tumor volume was not observed (FIG. 7).
  • the above results indicate that 4-1m prolongs the survival period without affecting the tumor size, and that it may be more effective in improving the survival rate when used in combination with an anticancer drug such as gemcitabine. It was
  • the anti-human Fn14 antibody of the present invention is useful for preventing or treating various diseases in which human Fn14 is involved in the pathological condition formation. Further, the polynucleotide, expression vector, transformed host cell and method for producing an antibody of the present invention are expected to be useful for producing the anti-human Fn14 antibody.
  • the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1, 5 and 3, 7 in the sequence listing are the base sequences of the heavy chain and the light chain of the anti-human Fn14 antibody, respectively, and are represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and
  • the amino acid sequence represented by 8 is the heavy and light chain amino acid sequences encoded by SEQ ID NOs: 1, 3, 5 and 7, respectively.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a peptide linker sequence connecting human Fn14 protein and human Fc region protein.

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Abstract

【課題】　ヒトＦｎ１４に結合して、ヒトＦｎ１４を介する作用を阻害することによりがん悪液質を予防又は治療する抗ヒトＦｎ１４抗体を提供することにある。 【解決手段】　本発明者らは、抗ヒトＦｎ１４抗体について検討し、配列番号２のアミノ酸配列からなる重鎖、及び配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体を提供した。

Description

抗ヒトＦｎ１４抗体
　本発明は、抗ヒトＦｎ１４抗体に関する。
　悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）は基礎疾患に関連して生ずる複合的代謝異常の症候群であり、脂肪量の減少の有無に関わらず筋肉量の減少を特徴とする疾患である。臨床症状として成人では体重減少、小児では成長障害がみられる（非特許文献１）。進行性がん患者では約８０％に悪液質が認められ、がん悪液質と称される。悪液質は、治療抵抗性によって患者の予後や生活の質（Ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｌｉｆｅ；ＱＯＬ）を低下させるだけでなく、死亡率の上昇に関連している。しかしながら、悪液質に対して効果的な治療薬は存在していない。悪液質の発生機序は不明な点が多いが、近年、悪液質は種々のサイトカインを介する全身の炎症状態として捉えられるようになっている（非特許文献２）。
　線維芽細胞増殖因子誘導性１４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ　１４；Ｆｎ１４）（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａとも称する）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーの一員である。また、Ｆｎ１４は、ＴＮＦ様アポトーシス弱誘導因子（ＴＮＦ－ｌｉｋｅ　ｗｅａｋ　ｉｎｄｕｃｅｒ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；Ｔｗｅａｋ）と結合し、Ｔｗｅａｋ受容体としても知られている。Ｔｗｅａｋ依存的又は非依存的なＦｎ１４の活性化は、ＮＦｋＢシグナル伝達経路を活性化し、細胞の増殖、移動、分化、及び、アポトーシス、並びに血管新生、組織損傷、再生に関与する炎症を制御することが知られている（非特許文献３）。
　がんとの関連としては、種々の固形がんにおいてＦｎ１４が過剰発現していること（非特許文献４）、及びＦｎ１４が腫瘍の進行や転移に関与していることが報告されている（非特許文献５）。また、マウスがん悪液質モデルにおいては抗Ｆｎ１４抗体が悪液質の症状の改善に有効であり、その作用は腫瘍におけるＦｎ１４阻害によることが報告されている（非特許文献６）。
　一方で、Ｆｎ１４の活性化は炎症性サイトカインの産生を惹起し、炎症状態を悪化させる可能性がある。ヒトＦｎ１４に対するアゴニスト抗体として、臨床開発が進められているＥｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ（特許文献１）が報告されているが、Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂは第Ｉ相臨床試験において肝毒性が報告されており（非特許文献７）、Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ処置により惹起された炎症による可能性が示唆されている（非特許文献８）。
　ヒトＦｎ１４に結合してアンタゴニスト活性を有し、かつ、特定の条件下においてアゴニスト活性を有さない抗体としては、マウスモノクローナル抗体ＣＲＣＢＴ－０６－００２が報告されている（特許文献２）。ＣＲＣＢＴ－０６－００２は、ヒト悪性黒色腫由来細胞株Ａ３７５細胞でのＴｗｅａｋ刺激によるＩＬ－８産生を阻害するアンタゴニスト活性、及び、マウスがん悪液質モデルにおける有効性が報告されている。しかし、Ｔｗｅａｋ非存在下でＡ３７５細胞からのＩＬ－８産生を誘導するアゴニスト活性は残存している（特許文献２）。
　アゴニスト活性を有さず、望ましくない副作用を回避することができる、抗Ｆｎ１４アンタゴニスト抗体は知られていない。
国際公開第２００９／０２０９３３号 国際公開第２０１３／０２６０９９号
Ｅｖａｎｓ　ＷＪ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｌｉｎ　Ｎｕｔｒ.２００８、Ｖｏｌ．２７、ｐ．７９３－７９９ Ｂａｒａｃｏｓ　ＶＥ　ｅｔ　ａｌ．、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｄｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒｓ．２０１８、Ｖｏｌ．４　Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ　１７１０５、ｐ．１－１８ Ｗｉｎｋｌｅｓ　ＪＡ、Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖ．２００８、Ｖｏｌ．７、ｐ．４１１－４２５ Ｃｕｌｐ　ＰＡ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２０１０、Ｖｏｌ．１６、ｐ．４９７－５０８ Ｈｕ　Ｇ　ｅｔ　ａｌ．、Ｔｕｍｏｒ　Ｂｉｏｌ．２０１７、Ｖｏｌ．３９　Ｊｕｎｅ、ｐ．１－９ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ＡＪ　ｅｔ　ａｌ．、Ｃｅｌｌ．２０１５、Ｖｏｌ．１６２、ｐ．１３６５－１３７８ Ｌａｍ　ＥＴ　ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒ.２０１８、Ｖｏｌ．１７、ｐ．２１５－２２１ Ｃｈｏｉ　Ｄ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｍ　J　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌ．２０１７、Ｖｏｌ．１２、ｐ．１８－３８
　本発明の課題は、高いアンタゴニスト活性を保持しつつ、従来の抗体よりもアゴニスト活性を低減した、安全性に優れた抗ヒトＦｎ１４抗体を提供することにある。
　本発明者らは、抗ヒトＦｎ１４抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から４０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５６から６２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９５から１０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体を作製した（実施例２～４）。この抗体が、ヒトＦｎ１４に結合し（実施例６）、Ｔｗｅａｋ刺激によるＮＦｋＢの活性化及びＩＬ－８の産生を阻害すること（実施例７及び８）、並びにＴｗｅａｋ非存在下においてＩＬ－８産生を誘導しないこと（実施例８）を見出した。これらの結果、アンタゴニスト活性を有しつつ、アゴニスト活性を有さない抗ヒトＦｎ１４抗体を提供し、本発明を完成した。さらには、上記抗体をマウス化した（実施例４）抗体が、マウスがん悪液質モデルにおいて、体重及び筋量の減少を抑制すること（実施例９）、並びにゲムシタビンと抗体との併用下で、抗体単独投与又はゲムシタビン単独投与に比べて生存期間を延長すること（実施例１０）を見出した。
　本発明によれば、例えば、以下の発明が提供される。
［１］
　配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から４０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５６から６２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９５から１０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２］
　以下の（１）及び（２）から選択される、［１］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント：
（１）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント；並びに
（２）上記（１）の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメント。
［３］
　配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［２］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
［４］
　翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、［２］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
［５］
　配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、［２］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
［６］
　以下の（３）及び（４）から選択される、［２］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体：
（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体；並びに
（４）上記（３）の抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＦｎ１４抗体。
［７］
　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［６］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体。
［８］
　翻訳後修飾が、重鎖Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、［６］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体。
［９］
　配列番号２のアミノ酸番号１から４５４までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、［８］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体。
［１０］
　一本鎖可変領域フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である、［１］～［５］のいずれかに記載の抗原結合フラグメント。
［１１］
　［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１２］
　［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
［１３］
　［１１］及び／又は［１２］に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
［１４］
　以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ａ）［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；
（ｃ）［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１５］
　以下の（ｅ）～（ｈ）からなる群より選択される、宿主細胞：
（ｅ）［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｆ）［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；
（ｇ）［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｈ）［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１６］
　以下の（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法：
（Ａ）［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（Ｂ）［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；並びに
（Ｃ）［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１７］
　以下の（Ｄ）～（Ｆ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＦｎ１４抗体を生産する方法：
（Ｄ）［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（Ｅ）［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；並びに
（Ｆ）［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトＦｎ１４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
［１８］
　［１６］に記載の方法で生産された抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
［１９］
　［１７］に記載の方法で生産された抗ヒトＦｎ１４抗体。
［２０］
　［１］～［１０］、［１８］、及び［１９］のいずれかに記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［２１］
　［３］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント、［５］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［２２］
　［７］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体、［９］に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［２３］
　がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物である、［２０］～［２２］のいずれかに記載の医薬組成物。
［２４］
　［１］～［１０］、［１８］、及び［１９］のいずれかに記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、がん悪液質を予防又は治療する方法。
［２５］
　がん悪液質の予防又は治療に使用するための、［１］～［１０］、［１８］、及び［１９］のいずれかに記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
［２６］
　がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物の製造における、［１］～［１０］、［１８］、及び［１９］のいずれかに記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
［２７］
　［１］～［１０］、［１８］、及び［１９］のいずれかに記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、かつ抗がん剤と併用されるものである、医薬組成物。
［２８］
　抗がん剤を含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、［１］～［１０］、［１８］、及び［１９］のいずれかに記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントと併用されるものである、医薬組成物。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体は、ヒトＦｎ１４に対するアゴニスト活性を示さずに、Ｔｗｅａｋ刺激によるヒトＦｎ１４の活性化を阻害することによって、炎症抑制作用を有するものであり、がん悪液質の予防又は治療剤として使用できる可能性がある。
Ａ３７５細胞におけるＴｗｅａｋ刺激による炎症性サイトカインＩＬ－８産生に対する抗ヒトＦｎ１４抗体の阻害効果を示す。縦軸は阻害率（％）、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。 Ａ３７５細胞における抗ヒトＦｎ１４抗体刺激誘導によるＩＬ－８の分泌作用を示す。縦軸はＩＬ－８濃度（ｐｇ／ｍＬ）、横軸は抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。 マウス結腸癌細胞株Ｃ２６細胞をマウスに移植することによって惹起される体重減少に対するマウス化抗ヒトＦｎ１４抗体４－１ｍの阻害作用を示す。縦軸は体重（ｇ）を、横軸はがん細胞注入後の経過日数を示す。 マウス結腸癌細胞株Ｃ２６細胞をマウスに移植することによって惹起される筋量減少に対するマウス化抗ヒトＦｎ１４抗体４－１ｍの阻害作用を示す。縦軸は前脛骨筋の重量（ｍｇ）を示す。 マウス結腸癌細胞株Ｃ２６細胞をマウスに移植することによって惹起される筋機能低下に対するマウス化抗ヒトＦｎ１４抗体４－１ｍの阻害作用を示す。縦軸は握力（ｇ）を示す。 マウス結腸癌細胞株Ｃ２６細胞を移植したマウスの生存期間に対するマウス化抗ヒトＦｎ１４抗体４－１ｍのゲムシタビンとの併用効果を示す。縦軸は生存率（％）を、横軸はがん細胞注入後の経過日数を示す。 マウス結腸癌細胞株Ｃ２６細胞をマウスに移植することによって形成される腫瘍の体積に対するマウス化抗ヒトＦｎ１４抗体４－１ｍのゲムシタビンとの併用効果を示す。縦軸は腫瘍体積（ｍｍ3）を、横軸はがん細胞注入後の経過日数を示す。
　以下に、本発明について詳述する。
　抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万～７万の重鎖と２万～３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ－Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万～１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
　鎖内Ｓ－Ｓ結合は、重鎖に四つ（Ｉｇμ、Ｉｇεには五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００～１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＬと表される）。
　抗体の抗原結合部位はＶＨ及びＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種Ｆｃ受容体発現細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよばれている。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
　抗体のＶＨ及びＶＬを含む各種抗原結合フラグメントも抗原結合活性を有し、このような代表的な抗原結合フラグメントとして、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2が挙げられる。ｓｃＦｖは、リンカーで連結されたＶＨとＶＬから構成される、一価の抗体フラグメントであり、Ｆａｂは、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’は、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ－Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ－Ｓ結合で結合した二価の抗体フラグメントである。
＜本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体＞
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントには、以下の特徴を有する抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。
　配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに配列番号４のアミノ酸番号２４から４０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５６から６２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９５から１０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
　1つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントである。
　1つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記の特徴を有し、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含む。定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４、軽鎖としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得る。1つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントは、重鎖定常領域としてヒトＩｇγ１定常領域、軽鎖定常領域としてヒトＩｇκ定常領域を含む。
　本明細書中で使用される抗体の定常領域におけるアミノ酸変異導入に関する残基番号については、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ　Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）に従う。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａとは、ヒトＩｇγ１定常領域におけるＫａｂａｔらのＥＵインデックスに従うアミノ酸２３４位及び２３５位のロイシンのアラニンでの置換である。Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域としては、例えば、配列番号２のアミノ酸番号１２６から４５５までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇγ１定常領域が挙げられる。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体である。
　抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、カルボキシペプチダーゼによる重鎖Ｃ末端のリジンの欠失、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｌｉｕ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ　Ｐｈａｒ　Ｓｃｉ．２００８、Ｖｏｌ．９７　Ｎｏ．７、ｐ．２４２６－２４４７）。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントには、翻訳後修飾を受けた抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。翻訳後修飾を受けた本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの例としては、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失を受けた抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化又はＣ末端リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ｌｙｕｂａｒｓｋａｙａ　Ｙ　ｅｔ　ａｌ．、Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ.２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４－３９）。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体は、配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである。また、１つの実施形態において当該翻訳後修飾は、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントある。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＦｎ１４抗体の翻訳後修飾により生じた抗体であり、翻訳後修飾が、重鎖Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、抗ヒトＦｎ１４抗体である。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体は、配列番号２のアミノ酸番号１から４５４までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖、及び、配列番号４のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体である。
　１つの実施形態において、本発明の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である。
　当業者であれば、本発明に基づいて、抗体又はその抗原結合フラグメントと他のペプチドや蛋白質との融合体を作製することや、修飾剤を結合させた修飾体を作製することも可能であり、これらの形態の抗体又はその抗原結合フラグメントも本発明の抗体に含まれる。融合に用いられる他のペプチドや蛋白質は、融合体がＦｎ１４に結合する限り特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。修飾に用いられる修飾剤は、修飾体がＦｎ１４に結合する限り特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
　１つの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントの修飾に用いられる修飾剤はポリエチレングリコールである。
　本明細書における「抗ヒトＦｎ１４抗体」とは、ヒトＦｎ１４に結合する抗体を意味する。ヒトＦｎ１４に結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡを用いる場合は、例えば、ヒトＦｎ１４蛋白質をＥＬＩＳＡプレートに固相化し、これに対して被験抗体を添加して反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させる。反応後、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、５０－７６－０３））等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定することで、被験抗体がヒトＦｎ１４に結合するか否かを確認することができる。具体的な評価方法としては、後記実施例６に記載されるような方法を用いることができる。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体には、ヒトＦｎ１４に結合する抗体であれば、ヒトＦｎ１４への結合に加え、他の動物由来のＦｎ１４（例えば、マウスＦｎ１４）にも結合する抗体も含まれる。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＦｎ１４抗体＞に記載の方法に従い製造することができる。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントは、必要によりさらに精製された後、定法に従って製剤化され、過剰な血管新生等の炎症性疾患、体重喪失、筋肉消耗、及び、悪液質等の消耗性疾患の予防又は治療に用いることができる。
＜本発明のポリヌクレオチド＞
　本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
　配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基番号１から３７５までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
　配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基番号１から３４２までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
　配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
＜本発明の発現ベクター＞
　本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
　1つの実施形態において、本発明の発現ベクターとしては、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、例えば、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４を使用することができる。また、ＡＧ－γ１やＡＧ－κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する発現ベクターに可変領域遺伝子断片を導入して抗体遺伝子を発現することもできる。
　本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。
　宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
　本発明の形質転換された宿主細胞としては、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞が挙げられる。
　１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｂ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
　１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ｅ）～（ｈ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ｅ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｆ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；
（ｇ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｈ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
　形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、例えば、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞等）、２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を使用することができる。
　宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。
＜本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＦｎ１４抗体＞
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法には、以下の（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法が含まれる。
（Ａ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（Ｂ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；並びに
（Ｃ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
　１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体を生産する方法には、以下の（Ｄ）～（Ｆ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＦｎ１４抗体を生産する方法が含まれる。
（Ｄ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（Ｅ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；並びに
（Ｆ）本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。１つの実施形態において、該方法で使用される宿主細胞としては、前述の（Ａ）及び（Ｄ）の宿主細胞が挙げられる。
　形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５～２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅ　Ｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ.１９５９、Ｖｏｌ．１３０　Ｎｏ．３３７３、ｐ．４３２－４３７）、ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　Ｒ　ａｎｄ　Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｇ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ.１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６－３９７）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｍｏｏｒｅ　ＧＥ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ　Ａｍ　Ｍｅｄ　Ａｓｓｏｃ．１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ　ＪＦ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｓｏｃ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ　Ｍｅｄ．１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１－８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６～８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０～４０℃で約１５～３３６時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｓｍｉｔｈ　ＧＥ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは約５～８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０～４０℃で約１５～１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源又は有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類など）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）を含んでいてもよい。培地のｐＨは約５～８であるのが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、好ましい培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｌｏ．、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２００１、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４～３９℃で約３～２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｂｏｓｔｉａｎ　ＫＡ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０４－４５０８）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０～３５℃で約１４～１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させることができる。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞及び/又は培養上清から抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを回収、例えば単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。例えば、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントには、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法で生産された抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。
＜本発明の医薬組成物＞
　本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、及び筋肉内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
　本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
　１つの実施形態において、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
　配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物。
　本発明の医薬組成物には、重鎖Ｃ末端リジンの欠失抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を受けた抗体又はその抗原結合フラグメント、重鎖Ｃ末端リジンを欠失しＮ末端翻訳後修飾を受けた抗体、及び／又は重鎖Ｃ末端リジンを有しＮ末端翻訳後修飾を受けていない抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
　１つの実施形態において、抗ヒトＦｎ１４抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記（５）～（８）のうち２種以上の抗ヒトＦｎ１４抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（５）配列番号２のアミノ酸番号１から４５４までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体。
（６）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体。
（７）配列番号２のアミノ酸番号１から４５４までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体。
（８）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体。
　１つの実施形態において、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＦｎ１４抗体、配列番号２のアミノ酸番号１から４５４までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＦｎ１４抗体、並びに、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
　上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、投与時に０．００１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ程度となるように用いることができる。
　本発明の医薬組成物は、活性型ヒトＦｎ１４が病態形成に関与する疾患、例えば、がん悪液質の予防又は治療剤として用いることができる。
　本発明には、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、がん悪液質を治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、がん悪液質の予防又は治療に使用するための、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。さらに、本発明には、がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物製造における、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの使用が含まれる。
　本発明は、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、かつ抗がん剤と併用されるものである、医薬組成物を提供する。本発明は、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント及び抗がん剤の有効量を投与する工程を包含する、がん又はがん悪液質の予防又は治療する方法を提供する。本発明は、がん又はがん悪液質の予防又は治療に使用するための、抗がん剤と併用されるものである、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本発明は、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物製造における、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの使用であって、該医薬組成物が抗がん剤と併用されるものである、使用を提供する。
　また、本発明は、抗がん剤を含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、かつ本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントと併用されるものである、医薬組成物を提供する。本発明は、がん又はがん悪液質の予防又は治療に使用するための、本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントと併用されるものである、抗がん剤を提供する。本発明は、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物製造における、抗がん剤の使用であって、該医薬組成物が本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントと併用されるものである、使用を提供する。
　１つの実施形態において、本発明において使用される抗がん剤は、ゲムシタビンである。
　本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
　市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。
（実施例１：ヒト及びマウスＦｎ１４－Ｆｃ融合タンパク質の取得）
　本発明者らは、抗Ｆｎ１４抗体を取得するための抗原及びスクリーニング試験に用いる材料として使用するため、ヒトＦｎ１４－ヒトＦｃ融合タンパク質及びマウスＦｎ１４－マウスＦｃ融合タンパク質を作製した。ヒトＦｎ１４－ヒトＦｃ融合タンパク質は、ヒトＦｎ１４配列の細胞外部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０５７７２３．１の１番目から７９番目のアミノ酸）のＣ末端と、ヒトＦｃ領域（ＮＣＢＩアクセッション番号：Ｐ０１８５７．１の１０６番目から３３０番目のアミノ酸）のＮ末端をペプチドリンカー（配列番号９）で連結した融合タンパク質である。また、マウスＦｎ１４－マウスＦｃ融合タンパク質は、マウスＦｎ１４配列の細胞外部分配列（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ０７８８２．１の１番目から７５番目のアミノ酸）のＣ末端と、マウスＦｃ領域のＮ末端を連結した融合タンパク質であり、具体的にはマウスＦｎ１４配列の細胞外部分配列をコードする遺伝子をｐＦＵＳＥ－ｍＩｇＧ２Ｂ－Ｆｃ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、ｐｆｕｓｅ－ｍｇ２ｂｆｃ１）のｈＥＦ１－ＨＴＬＶプロモーター領域とｍＩｇＧ２Ｂ－Ｆｃ領域の間のマルチクローニングサイトに制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶを用いて組み込み、発現させた融合タンパク質である。ＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）に前述の融合タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にそれぞれ導入した。当該ＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞の培養上清から、定法に従い、ヒトＦｎ１４－ヒトＦｃ融合タンパク質及びマウスＦｎ１４－マウスＦｃ融合タンパク質をそれぞれ精製した。
（実施例２：抗ヒトＦｎ１４抗体の取得）
　ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗体を作製した。ベロシミューン技術により得られた抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（キメラ抗体とも称する）である。ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、実施例１で作製したヒトＦｎ１４－ヒトＦｃ融合タンパク質からＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（Ｓｉｇｍａ社、７７６６１）を用いてヒトＦｃ領域を切断・除去したヒトＦｎ１４タンパク質を免疫した。定法に従い、免疫したマウスのリンパ節から採取したリンパ球を、マウス由来ミエローマ細胞ＳＰ２／０－Ａｇ１４（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ－１５８１）と細胞融合することでハイブリドーマを作製し、モノクローン化した。ヒトＦｎ１４に結合し、かつ、Ｔｗｅａｋ刺激によるＮＦｋＢの活性化（以下、後記実施例において、「Ｔｗｅａｋ誘導ＮＦｋＢ活性化」と称する）を抑制する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、培養上清から抗体を精製した。
（実施例３：ＮＦｋＢ活性化アッセイ）
　実施例２で見出した抗体のヒトＦｎ１４に対するアゴニスト作用を評価するために、Ｔｗｅａｋ非存在下での抗体のＮＦｋＢ活性化に対する作用を、レポーターアッセイで評価した。具体的には、ＮＦｋＢ転写応答配列が組み込まれたルシフェラーゼレポーターベクターｐＧＬ４．３２（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｅ８４９１）を安定的に導入したＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３）（以下、ＮＦｋＢ／ＨＥＫ２９３細胞と称する）を作製し、評価に用いた。
　ＮＦｋＢ／ＨＥＫ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社、Ｄ６４２９）で１．２５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、クリアボトム白色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３６１０）に１ウェルあたり８０μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ2に設定したＣＯ2インキュベーターで２時間培養後、実施例２で得た精製抗体について、最終濃度１ｎｇ／ｍＬから３００μｇ／ｍＬまでの約３倍公比で１２段階の希釈系列を上記の培地で作製した後、１ウェルあたり２０μＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養した後、ルシフェラーゼ測定試薬ＯＮＥ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、ルシフェラーゼ発現量を測定することにより、ＮＦｋＢ活性化を定量化した。
　その結果、ＮＦｋＢ活性化を誘導しなかった、すなわちアゴニスト活性を示さなかった抗ヒトＦｎ１４抗体を選別し、４－１と命名した。
（実施例４：完全ヒト型抗体及びマウス化抗体の作製）
　実施例３で選別した抗体を産生するハイブリドーマから、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定した。抗体の配列決定後、重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｗｉｔｔｌｅ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１９８７、Ｖｏｌ．１　Ｎｏ．６、ｐ．４９９－５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａのアミノ酸変異を有するヒトＩｇγ１定常領域遺伝子（配列番号１の塩基番号３７６番目から１３６５番目までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ社）に挿入した。また軽鎖可変領域遺伝子の５’側にはシグナル配列（Ｗｉｔｔｌｅ　Ｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．１９８７、Ｖｏｌ．１　Ｎｏ．６、ｐ．４９９－５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（配列番号３の塩基番号３４３番目から６６０番目までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。これらのＧＳベクターをＮｏｔＩ－ＨＦとＰｖｕＩ－ＨＦで制限酵素切断し、ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ＜Ｍｉｇｈｔｙ　Ｍｉｘ＞（ＴａＫａＲａ社、６０２３）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。このベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ－Ｋ１ＳＶ細胞の培養上清から、定法に従い抗体を精製して４－１の完全ヒト型抗体を取得し、４－１ｈと命名した。
　作製した４－１ｈの重鎖の塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、軽鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。配列番号２に示される重鎖の可変領域は、配列番号２のアミノ酸番号１番目から１２５番目までのアミノ酸配列からなり、配列番号４に示される軽鎖の可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号１番目から１１４番目までのアミノ酸配列からなる。４－１ｈの重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２の３１～３５番目、５０～６５番目、及び９８～１１４番目のアミノ酸配列からなる。４－１ｈの軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４の２４～４０番目、５６～６２番目、及び９５～１０３番目のアミノ酸配列からなる。
　抗ヒトＦｎ１４抗体をマウスｉｎ　ｖｉｖｏ試験で評価する際に、免疫原性リスクを減弱させるために、４－１ｈのマウス化抗体（以下、４－１ｍと称する）を作製した。４－１ｈの軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）を部分的に他のマウス抗体のＦＲと置き換えて、４－１ｍの可変領域をコードする塩基配列を作製した。
　上述の４－１ｈのベクター構築、抗体の発現及び精製と同様の方法を用いて、４－１ｍを取得した。但し、重鎖の定常領域にはＤ２６５Ａアミノ酸変異を有するマウスＩｇγ２ａ定常領域遺伝子（配列番号５の塩基番号３７６番目から１３６５番目までの塩基配列からなる）をコードする遺伝子を、軽鎖の定常領域にはマウスκ鎖の定常領域遺伝子（配列番号７の塩基番号３４３番目から６６０番目までの塩基配列からなる）を用いた。
　作製した４－１ｍの重鎖の塩基配列を配列番号５に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号６に、軽鎖の塩基配列を配列番号７に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。配列番号６に示される重鎖の可変領域は、配列番号６のアミノ酸番号１番目から１２５番目までのアミノ酸配列からなり、配列番号８に示される軽鎖の可変領域は、配列番号８のアミノ酸番号１番目から１１４番目までのアミノ酸配列からなる。４－１ｍの重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号６の３１～３５番目、５０～６５番目、及び９８～１１４番目のアミノ酸配列からなる。４－１ｍの軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８の２４～４０番目、５６～６２番目、及び９５～１０３番目のアミノ酸配列からなる。
（実施例５：完全ヒト型抗体のアミノ酸修飾分析）
　精製した４－１ｈのアミノ酸修飾分析をした結果、精製抗体の大部分において、重鎖Ｎ末端のピログルタミル化及びＣ末端のリジン欠失が生じていた。
（実施例６：完全ヒト型抗体及びマウス化抗体のヒト及びマウスＦｎ１４結合ＥＬＩＳＡ）
　実施例４で取得した４－１ｈ及び４－１ｍの、Ｆｎ１４タンパク質に対する結合活性を評価した。実施例１で取得したヒトＦｎ１４－ヒトＦｃ融合タンパク質及びマウスＦｎ１４－マウスＦｃ融合タンパク質をリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）にて１μｇ／ｍＬに希釈し、マキシソープ３８４ウェル透明プレート（Ｎｕｎｃ社、４６４７１８）に１ウェルあたり１５μＬ添加し、一晩４℃でインキュベートすることで、固相化した。翌日固相液を除き、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で洗浄した。２０％のＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（ナカライテスク社、０３９５３－９５）を含むＰＢＳを１ウェルあたり５０μＬ添加し、室温で１時間静置した後、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。実施例４で取得した４－１ｈ又は４－１ｍを、５％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅを含むＴＢＳ－Ｔ（以下、希釈液と称する）を用いて、最高濃度３０μｇ／ｍＬから１２段階、４倍公比の希釈により、希釈系列を作製し、１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ－Ｔで洗浄した。２次抗体として、４－１ｈには希釈液で５０００倍希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗ヒトカッパー軽鎖抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、２０６０－０５）を、４－１ｍには希釈液で４０００倍希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウスカッパー軽鎖抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社、１０５０－０５）を、１ウェルあたり２０μＬ添加した。室温で１時間インキュベートした後、ＴＢＳ－Ｔで洗浄し、ＴＭＢ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、５０－７６－０３）を添加して４－１ｈ評価時は３分間、４－１ｍ評価時は５分間静置した後、２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｐａｒａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社）で測定した。デュプリケートで試験を行い、ＥＣ50値を４－パラメーターロジスティック曲線当てはめにより算出した。
　この結果、実施例４で作製した４－１ｈ及び４－１ｍが、ヒトＦｎ１４及びマウスＦｎ１４に対して結合活性を有することが確認された（表１）。
表１：４－１ｈ及び４－１ｍのヒト及びマウスＦｎ１４に対する結合活性
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（実施例７：完全ヒト型抗体のＴｗｅａｋ誘導ＮＦｋＢ活性化阻害アッセイ）
　実施例４で取得した４－１ｈのＦｎ１４に対するアンタゴニスト活性を評価するために、Ｔｗｅａｋ誘導ＮＦｋＢ活性化阻害作用をレポーターアッセイで評価した。
　実施例３で作製したＮＦｋＢ／ＨＥＫ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで１．２５ｘ１０5ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、クリアボトム白色９６ウェルプレートに１ウェルあたり８０μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養後、実施例４で得た４－１ｈについて、最終濃度０．１ｎｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬまでの約３倍公比で１１段階の希釈系列を前記培地で作製した後、１ウェルあたり１０μＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ2で３０分培養後、Ｔｗｅａｋ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、３１０－０６）を最終濃度１００ｎｇ／ｍＬとなるよう１０μＬ添加した。３７℃、５％ＣＯ2で５時間培養した後、実施例３の方法に従いＮＦｋＢ活性化を定量化した。抗体を含まない培地のみを添加した群をコントロール群として設定し、Ｔｗｅａｋ添加群を０％阻害、Ｔｗｅａｋ非添加群を１００％阻害として、４－パラメーターロジスティック曲線当てはめにより５０％阻害する抗体の濃度（ＩＣ50値）を算出した。各抗体についてデュプリケートで実験し、３試行のＩＣ50値を幾何平均し、９５％信頼区間を算出した（表２）。本試験では、比較抗体として、マウス抗ヒトＦｎ１４抗体ＣＲＣＢＴ－０６－００２（特許文献２）を用いた。
　その結果、４－１ｈはＣＲＣＢＴ－０６－００２よりも強いアンタゴニスト活性を有することが明らかとなった。
表２：４－１ｈのＴｗｅａｋ誘導ＮＦｋＢ活性化に対する阻害活性
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例８：完全ヒト型抗体のＩＬ－８産生アッセイ）
　実施例４で取得した４－１ｈの機能的活性をｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ＩＬ－８産生アッセイで評価した。Ａ３７５細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１６１９）を１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭで５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ｍＬに懸濁し、９６ウェル平底プレート（ＩＷＡＫＩ、３８６０－０９６）に１ウェルあたり１００μＬ播種した。３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養後、ＰＢＳで洗浄した。実施例４で取得した４－１ｈについて、最終濃度１ｎｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬまでの１０倍希釈系列を前記培地で作製し、細胞に添加した。最終濃度５ｎｇ／ｍＬのＴｗｅａｋ存在下（アンタゴニスト活性評価）又は非存在下（アゴニスト活性評価）、３７℃、５％ＣＯ2で一晩培養後、培養上清を回収し、培養上清中のＩＬ－８濃度をＨｕｍａｎ　ＩＬ－８／ＣＸＣＬ８　Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ　ＥＬＩＳＡ　ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ社、Ｄ８０００Ｃ）を用いて測定した。アンタゴニスト活性及びアゴニスト活性評価における最終容量は、それぞれ６５μＬ／ウェル及び１００μＬ／ウェルで実験した。本試験では、比較抗体として、ＣＲＣＢＴ－０６－００２を用い、各抗体についてデュプリケートで実験した。
　アンタゴニスト活性評価においては、抗体を含まない培地のみを添加した群をコントロール群として設定し、Ｔｗｅａｋ添加群を０％阻害、Ｔｗｅａｋ非添加群を１００％阻害として、阻害率を算出した。４回のそれぞれの実験における最大阻害率の算術平均±標準誤差を表３に示す（表３）。アンタゴニスト活性のグラフを図１に、アゴニスト活性のグラフを図２に示す。
　表３及び図１で示すように、Ｔｗｅａｋ刺激によるＩＬ－８産生に対し、４－１ｈはほぼ完全な阻害活性を示すのに対し、ＣＲＣＢＴ－０６－００２は部分的な阻害活性しか示さないことが明らかとなった。また、図２に示すように、ＣＲＣＢＴ－０６－００２はＴｗｅａｋ非存在下において抗体単独でＩＬ－８産生を誘導したのに対し、本発明の４－１ｈはＩＬ－８産生をほとんど誘導しなかった。
　以上より、ＣＲＣＢＴ－０６－００２はアゴニスト作用を有する部分的アンタゴニスト抗体であるのに対し、４－１ｈはヒトＦｎ１４に対するアゴニスト作用が極めて弱い完全アンタゴニスト抗体であることが明らかとなった。
表３：４－１ｈ及びＣＲＣＢＴ－０６－００２のＴｗｅａｋ刺激によるＩＬ－８産生に対する阻害活性
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例９：マウスがん悪液質モデルにおける作用）
　マウス結腸癌細胞株Ｃ２６（ＣＯＬＯＮ　２６）を担癌したマウスは、悪液質の特徴である体重減少及び筋量の低下を示す、代表的ながん悪液質モデルの一つである（Ａｕｌｉｎｏ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ．、ＢＭＣ　Ｃａｎｃｅｒ．２０１０、Ｖｏｌ．１０　３６３、ｐ．１－１５）（Ｂｏｎｅｔｔｏ　Ａ　ｅｔ　ａｌ．、Ｊ　Ｖｉｓ　Ｅｘｐ．２０１６、Ｎｏｖ．３０　１１７、ｐ．１－２１）。
　ＢＤ　Ｍａｔｒｉｇｅｌ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂａｓｅｍｅｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｈｅｎｏｌ－ｒｅｄ　Ｆｒｅｅ（ＢＤ、３５６２３７）を用いて１０6ｃｅｌｌｓ／１００μＬに懸濁したＣ２６細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、雄性ＣＤ２Ｆ１マウス（日本チャールス・リバー社）の皮下に１００μＬ注入することによりＣ２６担癌マウスを作製し、Ｃ２６担癌マウスの体重が減少し始めたのを確認した後に、抗体投与を開始した。具体的には、細胞注入後２５、２８、３０、３２及び３５日目にＣ２６担癌マウスにＰＢＳによって希釈した４－１ｍを３ｍｇ／ｋｇ（投与容量１０ｍＬ／ｋｇ）で皮下投与した。対照群にはアイソタイプコントロール抗体を同様の方法で投与した。アイソタイプコントロール抗体として、生体内に存在しない抗原であるＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に対するマウスＩｇＧ２ａ抗体を定法に従い取得して用いた。投与は各群１５匹で開始し、実験終了日である３７日目までに４－１ｍ投与群は２匹、対照群は７匹死亡した。
　実験終了前日（３６日目）に、小動物握力測定装置（メルクエスト社、ＧＰＭ－１００Ｂ）を用いて握力を測定した。３７日目に体重を測定後、摘出した前脛骨筋の重量を筋量として測定した。３６及び３７日目に測定した各指標について、４－１ｍ投与群及び対照群との間の有意差をＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて判定した。いずれの場合にもｐ＜０．０５の場合を有意とし、有意差がある場合グラフ中に印（＊）を記載した（グラフ中の＊＊はｐ＜０．０１で有意差があることを示す）。
　３７日目まで継時的に測定した体重の変化を図３に示す。対照群では投与開始後も体重の減少が進行したが、４－１ｍ投与群では体重減少が抑制され、３７日目では対照群に比較して４－１ｍ投与群で有意な体重増加が認められた（ｐ＝０．００１９）。また、筋量も、４－１ｍ投与群で有意な増加が認められた（図４、ｐ＝０．０００９）。さらに、４－１ｍ投与群では握力も有意に増加しており（図５、ｐ＝０．０００３）、筋量だけでなく筋機能に対しても改善効果を示した。
　以上の結果から、４－１ｍは悪液質に対して有効であり、また、体重減少が認められた後の治療的投与でも有効である可能性が示唆された。
（実施例１０：マウスがん悪液質モデルにおける生存期間に対する作用）
　実施例９と同様にＣ２６担癌マウスを作製した。Ｃ２６担癌マウスの体重が減少に転じるタイミングから各群５匹で投与を開始した。具体的には、細胞注入後２２日目から７０日目までは１週間に３回、その後７１、７６、７８、８３及び８５日目に、ＰＢＳによって希釈した４－１ｍを０．３ｍｇ／ｋｇ（投与容量１０ｍＬ／ｋｇ）で皮下投与した。対照群には実施例９と同一のアイソタイプコントロール抗体を、４－１ｍと同様の方法で投与した。ゲムシタビン投与群は、ＰＢＳによって希釈したゲムシタビン（商品名：ジェムザール、イーライリリー・アンド・カンパニー）を１０ｍｇ／ｋｇ（投与容量１０ｍＬ／ｋｇ）で皮下投与した。ゲムシタビン併用４－１ｍ投与群は、４－１ｍとゲムシタビンの両方を同日に投与した。腫瘍の長径及び短径を、ノギス（アズワン、ＶＣ０１－１５０）を用いて継時的に測定し、以下の式に従って腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）／２
　マウスの生存率をカプラン・マイヤー生存率曲線で図６に示す。群間の生存曲線における違いを比較する場合はログランク検定を行い、ｐ＜０．０５の場合を有意とした。生存期間中央値は対照群、４－１ｍ投与群及びゲムシタビン投与群でそれぞれ４１日、５７日及び５５日であった。ゲムシタビン併用４－１ｍ投与群の生存期間中央値は８３日であり、４－１ｍ単独又はゲムシタビン単独投与群の生存曲線に対し有意差が認められた。
　一方、抗体単独及びゲムシタビン併用のどちらの場合においても、４－１ｍ投与による腫瘍体積への影響は認められなかった（図７）。
　以上の結果から、４－１ｍは腫瘍サイズに影響を及ぼさずに生存期間を延長し、ゲムシタビンのような抗がん剤と併用することで、生存率の向上により有効である可能性が示された。
　本発明の抗ヒトＦｎ１４抗体は、ヒトＦｎ１４が病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞及び抗体を生産する方法は、前記抗ヒトＦｎ１４抗体を生産するのに有用であると期待される。
　以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号１、５及び３、７で表される塩基配列は、それぞれ抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖及び軽鎖の塩基配列であり、配列番号２、４、６、及び８で表されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１、３、５及び７によりコードされる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である。配列番号９で表されるアミノ酸配列は、ヒトＦｎ１４タンパク質、及び、ヒトＦｃ領域タンパク質を繋ぐペプチドリンカー配列である。

Claims (28)

  1. 　配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９８から１１４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から４０までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５６から６２までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号９５から１０３までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
  2. 　以下の（１）及び（２）から選択される、請求項１に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント：
    （１）配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント；並びに
    （２）上記（１）の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメント。
  3. 　配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
  4. 　翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、請求項２に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
  5. 　配列番号２のアミノ酸番号１から１２５までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域、及び、配列番号４のアミノ酸番号１から１１４までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、請求項２に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
  6. 　以下の（３）及び（４）から選択される、請求項２に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体：
    （３）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＦｎ１４抗体；並びに
    （４）上記（３）の抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＦｎ１４抗体。
  7. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項６に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体。
  8. 　翻訳後修飾が、重鎖Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、請求項６に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体。
  9. 　配列番号２のアミノ酸番号１から４５４までのアミノ酸配列からなる重鎖であって、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖、及び、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項８に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体。
  10. 　一本鎖可変領域フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原結合フラグメント。
  11. 　請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
  12. 　請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
  13. 　請求項１１及び／又は請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  14. 　以下の（ａ）～（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞：
    （ａ）請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｂ）請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；
    （ｃ）請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
    （ｄ）請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  15. 　以下の（ｅ）～（ｈ）からなる群より選択される、宿主細胞：
    （ｅ）請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （ｆ）請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；
    （ｇ）請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
    （ｈ）請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  16. 　以下の（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法：
    （Ａ）請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （Ｂ）請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；並びに
    （Ｃ）請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  17. 　以下の（Ｄ）～（Ｆ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＦｎ１４抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＦｎ１４抗体を生産する方法：
    （Ｄ）請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
    （Ｅ）請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、で形質転換された宿主細胞；並びに
    （Ｆ）請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトＦｎ１４抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  18. 　請求項１６に記載の方法で生産された抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
  19. 　請求項１７に記載の方法で生産された抗ヒトＦｎ１４抗体。
  20. 　請求項１～１０、１８、及び１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  21. 　請求項３に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項５に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  22. 　請求項７に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体、請求項９に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  23. 　がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物である、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
  24. 　請求項１～１０、１８、及び１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、がん悪液質を予防又は治療する方法。
  25. 　がん悪液質の予防又は治療に使用するための、請求項１～１０、１８、及び１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメント。
  26. 　がん悪液質の予防又は治療用医薬組成物の製造における、請求項１～１０、１８、及び１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
  27. 　請求項１～１０、１８、及び１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、かつ抗がん剤と併用されるものである、医薬組成物。
  28. 　抗がん剤を含む、がん又はがん悪液質の予防又は治療用医薬組成物であって、請求項１～１０、１８、及び１９のいずれか１項に記載の抗ヒトＦｎ１４抗体又はその抗原結合フラグメントと併用されるものである、医薬組成物。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022153997A1 (ja) * 2021-01-13 2022-07-21 アステラス製薬株式会社 ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ及びＦｎ１４に結合する多重特異性抗体
WO2023062848A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Astellas Pharma Inc. Pharmaceutical composition comprising anti-human fnl4 antibody or antigen-binding fragment thereof for preventing or treating cancer

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
WO1994020632A1 (en) 1993-03-11 1994-09-15 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic R Esearch Insitute Anti-hiv monoclonal antibody
JP2003517829A (ja) * 1999-12-20 2003-06-03 イミュネックス・コーポレーション Ｔｗｅａｋ受容体
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP2008531746A (ja) * 2005-03-07 2008-08-14 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｔｗｅａｋ及びｆｎ１４活性を調節するための方法及び組成物
WO2009020933A2 (en) 2007-08-03 2009-02-12 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-tweak receptor antibodies
JP2011523414A (ja) * 2008-05-15 2011-08-11 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 抗ｆｎ１４抗体、およびその使用
WO2013026099A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Transbio Ltd Fn14 binding proteins and uses thereof
JP2014510079A (ja) * 2011-03-10 2014-04-24 オメロス コーポレーション ｅｘｖｉｖｏにおける加速された抗体進化による抗ＦＮ１４モノクローナル抗体の生成
JP2016521715A (ja) * 2013-06-14 2016-07-25 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 抗ｔｗｅａｋｒ抗体およびその使用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102441163A (zh) * 2005-05-27 2012-05-09 比奥根艾迪克Ma公司 结合tweak的抗体
US8093006B2 (en) * 2009-04-02 2012-01-10 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human tweak and uses thereof
JP2016000003A (ja) * 2013-04-19 2016-01-07 アステラス製薬株式会社 新規抗ヒトｔｗｅａｋ抗体
WO2015006508A2 (en) * 2013-07-09 2015-01-15 The Translational Genomics Research Institute Compositions and methods of screening for compounds that modulate activity at a tweak binding site on a crd of fn14

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007861A1 (en) 1988-12-28 1990-07-26 Protein Design Labs, Inc. CHIMERIC IMMUNOGLOBULINS SPECIFIC FOR p55 TAC PROTEIN OF THE IL-2 RECEPTOR
WO1994020632A1 (en) 1993-03-11 1994-09-15 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic R Esearch Insitute Anti-hiv monoclonal antibody
JP2003517829A (ja) * 1999-12-20 2003-06-03 イミュネックス・コーポレーション Ｔｗｅａｋ受容体
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP2008531746A (ja) * 2005-03-07 2008-08-14 ジェネンテック・インコーポレーテッド Ｔｗｅａｋ及びｆｎ１４活性を調節するための方法及び組成物
WO2009020933A2 (en) 2007-08-03 2009-02-12 Facet Biotech Corporation Therapeutic use of anti-tweak receptor antibodies
JP2010535713A (ja) * 2007-08-03 2010-11-25 ファセット バイオテック コーポレイション 抗ｔｗｅａｋ受容体抗体の治療上の使用
JP2011523414A (ja) * 2008-05-15 2011-08-11 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 抗ｆｎ１４抗体、およびその使用
JP2014510079A (ja) * 2011-03-10 2014-04-24 オメロス コーポレーション ｅｘｖｉｖｏにおける加速された抗体進化による抗ＦＮ１４モノクローナル抗体の生成
WO2013026099A1 (en) 2011-08-23 2013-02-28 Transbio Ltd Fn14 binding proteins and uses thereof
JP2014529597A (ja) * 2011-08-23 2014-11-13 トランスバイオ リミテッド Ｆｎ１４結合性タンパク質及びその使用
JP2016521715A (ja) * 2013-06-14 2016-07-25 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 抗ｔｗｅａｋｒ抗体およびその使用

Non-Patent Citations (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Mol. Clo.", vol. 3, 2001, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
"NCBI", Database accession no. NP_057223.1
AULINO P ET AL., BCM CANCER, vol. 10, no. 363, 2010, pages 1 - 15
BARACOS VE ET AL., NAT REV DIS PRIMERS, vol. 4, 2018, pages 1 - 18
BONETTO A ET AL., J VIS EXP., vol. 117, 30 November 2016 (2016-11-30), pages 1 - 21
BOSTIAN KA ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 77, 1980, pages 4504 - 4508
CHOI D ET AL., AM J PHARMACOL TOXICOL., vol. 12, 2017, pages 18 - 38
CULP PA ET AL., CLIN CANCER RES., vol. 16, 2010, pages 497 - 508
DULBECCO RFREEMAN G, VIROLOGY, vol. 8, 1959, pages 396 - 397
EAGLE H, SCIENCE, vol. 130, no. 3373, 1959, pages 432 - 437
EVANS WJ ET AL., CLIN NUTR., vol. 27, 2008, pages 793 - 799
HU G ET AL., TUMOR BIOL., vol. 39, June 2017 (2017-06-01), pages 1 - 9
JOHNSTON AJ ET AL., CELL, vol. 162, 2015, pages 1365 - 1378
KABAT ET AL.: "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1991, UNITED STATES PUBLIC HEALTH SERVICE, NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH
LAM ET ET AL., MOL CANCER THER., vol. 17, 2018, pages 215 - 221
LIU H ET AL., J PHAR SCI., vol. 97, no. 7, 2008, pages 2426 - 2447
LYUBARSKAYA Y ET AL., ANAL BIOCHEM., vol. 348, 2006, pages 24 - 39
MOORE GE ET AL., JAM MED ASSOC., vol. 199, 1967, pages 519
MORGAN JF ET AL., PROC SOC EXP BIOL MED., vol. 73, 1950, pages 1 - 8
SALZMANN, S. ET AL.: "Fibroblast Growth Factor Inducible (Fnl4)-specific Antibodies Concomitantly Display Signaling Pathway-specific Agonistic and Antagonistic Activity", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 288, no. 19, 2013, pages 13455 - 13466, XP002729800, DOI: 10.1074/jbc.M112.435917 *
See also references of EP3875114A4
SMITH GE ET AL., PROC NATL ACAD SCI USA., vol. 82, 1985, pages 8404
WINKLES JA, NAT REV DRUG DISCOV., vol. 7, 2008, pages 411 - 425
WITTLE N ET AL., PROTEIN ENGINEERING, vol. 1, no. 6, 1987, pages 499 - 505

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022153997A1 (ja) * 2021-01-13 2022-07-21 アステラス製薬株式会社 ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ及びＦｎ１４に結合する多重特異性抗体
KR20230131207A (ko) 2021-01-13 2023-09-12 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 ActRIIA, ActRIIB 및 Fn14에 결합하는 다중 특이성항체
WO2023062848A1 (en) * 2021-10-14 2023-04-20 Astellas Pharma Inc. Pharmaceutical composition comprising anti-human fnl4 antibody or antigen-binding fragment thereof for preventing or treating cancer

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