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WO2019138956A1 - 細胞培養方法及び装置 - Google Patents

細胞培養方法及び装置 Download PDF

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Publication number
WO2019138956A1
WO2019138956A1 PCT/JP2019/000011 JP2019000011W WO2019138956A1 WO 2019138956 A1 WO2019138956 A1 WO 2019138956A1 JP 2019000011 W JP2019000011 W JP 2019000011W WO 2019138956 A1 WO2019138956 A1 WO 2019138956A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell culture
cells
recesses
recess
cell
Prior art date
Application number
PCT/JP2019/000011
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
亮 末永
真稀 光石
Original Assignee
東洋製罐グループホールディングス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 東洋製罐グループホールディングス株式会社 filed Critical 東洋製罐グループホールディングス株式会社
Priority to EP19738819.2A priority Critical patent/EP3739037A4/en
Priority to US16/960,816 priority patent/US20200354662A1/en
Priority to CN201980006389.1A priority patent/CN111511898B/zh
Publication of WO2019138956A1 publication Critical patent/WO2019138956A1/ja

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    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
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    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
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    • C12M27/16—Vibrating; Shaking; Tilting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture method and apparatus, and more particularly to a cell culture method and apparatus using a cell culture bag provided with a plurality of recesses.
  • the cell culture bag comprises, for example, a bag body made of a plastic film whose periphery is sealed, and a port attached to the bag body.
  • Patent Document 1 describes a cell culture bag in which movement of cells in the cell culture bag is suppressed by providing a plurality of recesses on the bottom of the bag body.
  • spheroid culture in order to form spheroids (cell aggregates of cells) of uniform and appropriate size in each recess, one spheroid is formed in each recess and culture of one spheroid per recess is completed. It is required to maintain up to
  • the inner surface of the cell culture bag is subjected to a low cell adhesion treatment that makes it difficult to attach the cells, and the cells are collected at the bottom center of the crown of the cell culture bag.
  • a low cell adhesion treatment for example, a treatment of coating a phospholipid polymer, a polyvinyl alcohol derivative, a surfactant or a protein such as albumin to inhibit adsorption of a cell adhesion protein on the surface of a plastic film, etc. It can be mentioned.
  • cells and spheroids may adhere to the inner surface of the recess due to various factors such as uneven treatment and adhesion of cultured cells.
  • cells C seeded in each recess 4 of the cell culture bag 1 containing the medium S may be adhered to a plurality of locations on the inner surface of the recess 4 by the cell adhesion protein.
  • the cell adhesion protein since each cell C forms a spheroid starting from the position where it adheres, a plurality of small spheroids are formed in one recess 4. Then, since the spheroid adhered to the inner surface of the recess 4 does not move, the spheroids can not adhere to each other to form one spheroid.
  • the spheroid may adhere to the inner surface of the recess.
  • the medium component is easily depleted and the metabolite is easily accumulated, so that the efficiency of inducing proliferation / differentiation of cells of the whole spheroid decreases. Therefore, in the spheroid culture, in order to improve the proliferation and differentiation induction efficiency of the cells, the spheroid adhering to the inner surface of the recess is periodically exfoliated (for example, at the time of medium exchange) to change the adhesion position of the spheroid. Is required.
  • cells are adhered to the inner surface of the well (for example, cells immediately after seeding, or spheroids are formed by pipetting the medium in the well (recessed area) with a pipette. Cells) can be detached. Specifically, insert the pipette tip into the well, gently suck up the medium while not sucking cells, and then vigorously inject the sucked medium into the well to cause the medium to spout the medium, and detach the cells by the spout can do.
  • the medium S is strongly injected from the port 3 to generate a water flow of the medium S in the cell culture bag 1.
  • the cells C precipitated in the recess 4 and the detached cells C move to another recess 4, and the cell concentration in each recess 4 It will be uneven.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and in performing cell culture using a cell culture bag in which a plurality of recesses are formed, the movement of cells between recesses is prevented while the inner surface of the recesses is formed. It is an object of the present invention to provide a cell culture method and apparatus capable of improving the efficiency of inducing proliferation and differentiation of cells or cell aggregates by detaching adherent cells or cell aggregates.
  • a cell culture method comprises: a bag body constituted of upper and lower films having peripheral portions sealed; and a port attached to the bag body, wherein the lower film is provided with a plurality of recesses.
  • a cell culture method using a culture bag comprising the steps of: discharging the medium contained in the bag body from the port and closing the plurality of recesses with the upper surface film; and the plurality of recesses closed And exfoliating the cells or the clumps of cells adhering to the inner surface of the recess by physically stimulating the recess from the outside of the cell culture bag in part or all of the recesses. It is characterized by
  • the cell culture device comprises a bag main body composed of upper and lower surface films whose peripheral portions are sealed, and a port attached to the bag main body, and a plurality of concave portions are formed in the lower surface film.
  • the cell culture bag is characterized by comprising: peeling means for giving physical stimulation to the recess from the outside of the cell culture bag.
  • the cell culture method and apparatus of the present invention when performing cell culture using a cell culture bag in which a plurality of recesses are formed, the cell is adhered to the inner surface of the recess while preventing movement of cells between the recesses.
  • the cell or cell aggregate can be detached to improve the proliferation / differentiation induction efficiency of the cell or cell aggregate.
  • the recess when adhering to multiple places on the inner surface of the recess of the cell culture bag, the recess can be closed to give physical stimulation to the recess, thereby preventing the movement of cells between the recesses while preventing the cells from moving. It is possible to exfoliate and assemble at one place to efficiently form one cell aggregate (spheroid) in one recess and to improve the efficiency of inducing proliferation and differentiation of cells. Furthermore, for example, when the cell aggregate adheres to the inner surface of the recess of the cell culture bag, the recess is closed to physically prevent the movement of the cell aggregate by applying a physical stimulus to the recess. However, the cell aggregate can be exfoliated to change the adhesion site of the cell aggregate, and the proliferation / differentiation induction efficiency of the cell aggregate can be improved.
  • (A) shows the top view which shows the outline of the cell culture bag used by embodiment of this invention
  • (b) shows the side view which shows the outline of the cell culture bag used by embodiment of this invention
  • (C) shows the bottom view which shows the outline of the cell culture bag used by embodiment of this invention.
  • (A) is a cross-sectional schematic view of the cell culture device according to the first embodiment of the present invention, showing a state where the pressing member is raised
  • (b) is a cell culture device according to the first embodiment of the present invention It is a cross-sectional schematic view and shows a state where the pressing member is lowered.
  • (A) shows the cross-sectional schematic diagram which shows the state in the cell culture in 1st Embodiment of this invention
  • (b) is a cross-sectional schematic diagram of the cell culture bag which shows the occlusion process in 1st Embodiment of this invention It is. It is a cross-sectional schematic diagram of the cell culture bag explaining explaining the exfoliation process in a 1st embodiment of the present invention.
  • (A) is a photograph showing the inside of one recess in which cells were seeded, showing the inside of the recess 48 hours after seeding
  • (b) is a photograph showing the inside of one recess in which the cells were seeded
  • (C) is a photograph showing the inside of one recess in which cells were seeded, showing the inside of the recess after the closing step
  • (d) shows the inside of the recess immediately after the peeling step
  • (d) is a cell where the cells were seeded 1 It is a photograph which shows the inside of two recessed parts, and shows the inside of the recessed part 15 hours after a peeling process.
  • FIG. 7 is a cross-sectional schematic view of the cell culture bag to be described which explains the peeling step of the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a schematic cross-sectional view of a cell culture bag for explaining a cell culture method according to a fifth embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a cross-sectional schematic view of the cell culture bag showing a state in which the cells are adhered to a plurality of locations on the inner surface of the recess of the cell culture bag.
  • A shows the cross-sectional schematic diagram of the cell culture bag which shows the state which the spheroid exfoliated from the recessed part in a cell culture bag
  • (b) is the state which the spheroid exfoliated within the cell culture bag moved between the recessed parts
  • FIG. 6 shows a schematic cross-sectional view of a cell culture bag showing
  • the cell culture bag 1 shown in FIGS. 1 (a) to 1 (c) comprises a bag body 2 composed of an upper surface film 21 and a lower surface film 22 in which the peripheral portion 20 is heat sealed. And a port 3 attached.
  • the size of the bag body 2 is not particularly limited, but preferably 50 to 500 mm long and 50 to 500 mm wide, for example.
  • the flow path of a tube or the like connected to the port 3 and the closing means such as a pinch or a valve for closing the flow path are omitted.
  • the lower surface film 22 is formed with a plurality of recesses 4 each serving as a cell culture portion.
  • the recess 4 suppresses the movement of cells in the bag body 2 so that cells in culture can stay in one recess 4, so that the opening diameter (diameter) D is 0.3 to 10 mm, the depth d Is preferably 0.1 mm or more.
  • the recess 4 may have the same opening diameter in all the recesses 4 or may include two or more recesses having different opening diameters.
  • the lower film 22 may be divided into a plurality of regions, and the opening diameter of the recess 4 may be made different for each region.
  • the recess 4 in order to facilitate the collection of cells at the bottom of the recess 4, has a spherical shape, as shown in FIG. 1 (b).
  • the shape of the recessed part 4 is not limited to this.
  • the recess 4 may have a bowl-like (conical) recessed shape.
  • the ratio d / D of the depth d to the diameter D of the recess 4 is preferably 0.05 to 1.
  • the arrangement of the recesses 4 is preferably staggered as shown in FIG. 1 (c) so that the area occupied by the recesses 4 in the lower surface film 22 is as large as possible, but if necessary, in a grid It may be arranged.
  • the upper film 21 is formed of a substantially flat top surface portion 21a covering the upper side of the whole of the plurality of recesses 4 and an inclined portion 21b formed around the top surface portion 21a. It has a bulging shape which has been bulging in the configured terrace shape. Thereby, even when the bag body 2 is filled with the culture medium, deformation that lifts the peripheral portion of the lower film 22 is suppressed, as compared with a flat pouch-like container in which two plastic films are overlapped and the peripheral portion is sealed. Ru.
  • the upper surface film 21 and the lower surface film 22 forming the bag body 2 are formed of a plastic film having gas permeability.
  • the gas permeability of this plastic film is such that the permeability of oxygen measured at a test temperature of 37 ° C. according to the gas permeability test method of JIS K 7126 is 5000 mL / (m 2 ⁇ day ⁇ atm) or more Is preferred.
  • plastic film forming the bag body 2 examples include polyethylene, polypropylene, ethylene-vinyl acetate copolymer, polyester, silicone elastomer, polystyrene elastomer, tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer (FEP) And thermoplastic resins such as These may be used as a single layer, or may be used by laminating materials of the same or different types, but in view of heat fusion property when heat sealing the peripheral portion, it has a layer that functions as a sealant layer Is preferred.
  • FEP tetrafluoroethylene-hexafluoropropylene copolymer
  • thermoplastic resins such as These may be used as a single layer, or may be used by laminating materials of the same or different types, but in view of heat fusion property when heat sealing the peripheral portion, it has a layer that functions as a sealant layer Is preferred.
  • the thickness of the plastic film forming the bag body 2 is an appropriate shape so that the upper surface film 21 maintains its bulging shape while having flexibility, and the lower surface film 22 maintains the shape of the recess 4. It is preferably 30 to 200 ⁇ m, which has a retention property.
  • the port 3 is formed of a tubular member through which a medium, cells, etc. can flow, and can be formed of, for example, a thermoplastic resin such as polyethylene, polypropylene, vinyl chloride, polystyrene elastomer, or FEP.
  • a thermoplastic resin such as polyethylene, polypropylene, vinyl chloride, polystyrene elastomer, or FEP.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view of the cell culture device 100 according to the first embodiment, FIG. 2 (a) shows a state in which the pressing member is lifted, and FIG. 2 (b) shows a state in which the pressing member is lowered.
  • the cell culture apparatus 100 according to the present embodiment supports the frame 5 on which the cell culture bag 1 is placed, the pressing member 6 having the bottom surface 6a for pressing the top surface portion 21a of the top film 21, and the pressing member 6 And a support mechanism 7.
  • FIG. 1 shows a state in which the pressing member is lifted
  • FIG. 2 (b) shows a state in which the pressing member is lowered.
  • the cell culture apparatus 100 supports the frame 5 on which the cell culture bag 1 is placed, the pressing member 6 having the bottom surface 6a for pressing the top surface portion 21a of the top film 21, and the pressing member 6 And a support mechanism 7.
  • FIG. 1 shows a state in which the pressing member is lifted
  • FIG. 2 (b) shows a state in which the pressing member is lowered.
  • a pump as a liquid feeding means for injecting and discharging the medium from the port 3 of the cell culture bag 1 and a peeling means for peeling the spheroid from the concave portion 4 of the cell culture bag 1 are omitted.
  • the peristaltic pump connected to the port 3 via the tube is mentioned, for example.
  • a liquid feeding means is not limited to a pump, For example, a syringe may be sufficient.
  • the gantry 5 has a mounting surface 5a on which the cell culture bag 1 is mounted horizontally.
  • An opening 5 b is formed on the mounting surface 5 a so as to receive each of the plurality of recesses 4 formed in the lower surface film 22 of the cell culture bag 1.
  • the mounting surface 5a supports the lower surface film 22 in a noncontact manner in the recess 4, crushing and deformation of the recess 4 are avoided and the flow of cells in the recess 4 is prevented, and further, from the lower surface film 22. Gas permeability is enhanced.
  • the shape which receives each of the some recessed part 4 is not limited to an opening part, For example, a recessed part may be sufficient and it may be wire mesh shape.
  • the pressing member 6 is a plate-like member having a substantially rectangular planar shape fitted to the top surface portion 21a of the cell culture bag 1, and has a flat bottom surface 6a.
  • the support mechanism 7 includes a frame 71 provided on the gantry 5, a guide pin 72 extending upward from four corners of the upper surface of the pressing member 6 and vertically movably penetrating the frame 71, and the pressing member 6 downward. It comprises an urging means 73 for urging.
  • the biasing means 73 is composed of a magnet 73 disposed on the upper surface of the pressing member 6 and the frame 71 with the same pole facing each other.
  • the pressing member 6 moves up and down according to the height of the upper film 21 by the repulsive force acting between the permanent magnets 73.
  • the biasing means 73 is not limited to a permanent magnet. Further, the biasing means 73 may be omitted, and the pressing member 6 may be moved up and down according to the height of the upper surface film 21 by the weight of the pressing member 6.
  • FIGS. 3 and 4 the support mechanism 7 is not shown in the cell culture apparatus shown in FIG. 2.
  • the formed spheroid C is accommodated in each recess 4 at a uniform cell concentration.
  • the medium S stored in the bag body 2 is discharged from the port 3 by a pump (not shown), whereby the plurality of concave portions 4 are all closed by the upper surface film 21. Be done. Since the upper surface film 21 is pressed by the flat bottom surface 6 a of the pressing member 6, the upper surface film 21 becomes flat, and the upper surface film 21 reliably blocks each of the plurality of concave portions 4. Thereby, since spheroid C is confined in each crevice 4, the outflow from each crevice 4 of spheroid C is prevented in the following exfoliation process.
  • each recess 4 may be sealed or may not be sealed. In the case where the plurality of recesses 4 are not sealed, it is sufficient that the plurality of recesses 4 be closed to such an extent that the outflow of cells from the recesses 4 can be prevented.
  • the spheroid C is peeled from the inner surface of the concave portion 4 in a part or all of the plurality of concave portions 4 closed.
  • vibration or oscillation may be applied to the recess 4 of some or all of the plurality of recesses.
  • vibration or rocking may be given to the whole cell culture apparatus 100, or a physical force of vibration or rocking may be applied to the lower film 22 forming the recess 4.
  • the vibration or oscillation applied to the recess 4 is also transmitted to the spheroid C adhered to the inner surface of the recess 4, and the spheroid C peels off from the inner surface of the recess 4.
  • the vibrator (vibrator) 8 attached to the mount 5 of the cell culture apparatus shown in FIG. 4 may be used as means for giving vibration or rocking, or the rocking apparatus may be used.
  • the vibrator may be brought into direct contact with the recess 4 to directly apply vibration to the recess 4.
  • vibration or oscillation may be selectively applied to some of the recesses 4.
  • the vibration and rocking may be reciprocating motion, or may be rotational motion by a tester mixer, for example.
  • FIG. 5 shows a photograph showing the inside of one recess 4 in which cells are seeded in the present embodiment.
  • Ajinomoto Co. medium (StemFit (registered trademark)
  • undifferentiated iPS cells (cell line 1231A3) were seeded at 3 ⁇ 10 4 cells per well (well).
  • FIG. 5 (a) shows a recess 48 hours after seeding.
  • the seeded cells adhere to not only the center of the bottom of the recess but also all over the inner surface of the recess to form a spheroid.
  • the spheroid adhered to the inner surface around the recess is not clear because it is far from the focal plane of the photograph.
  • FIG. 5 (b) shows the recess after the closing step.
  • a peristaltic pump was used as a liquid transfer means, and the culture medium was discharged from port 3 at a liquid transfer rate of 1.0 ml / min until the top film 21 blocked each recess 4.
  • FIG.5 (c) shows the recessed part immediately after a peeling process.
  • the mount 5 was vibrated by the vibrator 8.
  • a large number of small spheroids separated from the inner peripheral surface of the recess 4 are gathered at the bottom center of the recess.
  • the test tube mixer 8 which is the vibrator 8 was used as the peeling means.
  • each recess 4 of the cell culture bag 1 was physically stimulated from the outside by pressing the test tube mixer 8 against the lower surface of the mount 5 of the cell culture apparatus 100 for 1 minute.
  • a horizontal vibration type Taitek's present mixer 6076881 with a vibration speed of about 2800 rpm was used.
  • FIG.5 (d) shows the recessed part 15 hours after a peeling process. After the peeling step, the medium was injected into the bag body 2 and the culture was resumed. As shown in the figure, one spheroid is formed in the center of the bottom of the recess 4.
  • the spheroids are separated from the inner surface and are gathered at one place while preventing the movement of the spheroid between the recesses 4. Thereby, it is possible to efficiently form one spheroid in one recess 4 and to improve the proliferation and differentiation induction efficiency of the spheroid.
  • the recess 4 is closed again to give a physical stimulus to the recess 4.
  • the spheroid can be exfoliated from the inner surface to change the adhesion site of the spheroid while preventing the movement of the spheroid between the depressions 4 to improve the proliferation / differentiation induction efficiency of the spheroid.
  • the cell culture bag 1 in the peeling step, is shown in FIG. 1 while the respective recess 4 is closed instead of giving a physical stimulus to the recess from the outside. You may make it incline every 100.
  • the inclination angle with respect to the horizontal of the cell culture bag 1 is not specifically limited, For example, you may make it incline to 90 degree.
  • the cell culture bag 1 is shown in FIG. 1 while the respective recesses 4 are closed, instead of applying physical stimulation to the recesses from the outside. It may be turned upside down and inclined at every 100.
  • the spheroid C adhered to the inner surface of the recess 4 is separated by gravity by a simple operation of inverting and / or tilting the culture bag 100, and each recess 4 has an upper surface. Because the film 21 is occluded, migration of detached cells or spheroids C to other recesses 4 is avoided.
  • the present embodiment is suitable for the case where cells and aggregates adhering to the inside of the recess 4 of the cell culture bag 1 are detached only by inverting and / or tilting the cell culture bag 1.
  • the cell culture bag 1 may be turned upside down and / or tilted manually by hand, or may be turned upside down and / or tilted by a mechanism such as a robot arm. Further, in the peeling step of the first embodiment described above, the cell culture bag 1 may be turned upside down and / or inclined as in the present embodiment. Further, also in the peeling step of the third and fourth embodiments described later, the cell culture bag 100 may be turned upside down and / or inclined as in the present embodiment.
  • the push-up member 9 is moved up and down by an actuator (not shown) in an opening 5 b formed in the mounting surface 5 a of the gantry 5.
  • the bottom of the convexly curved crown spherical recess 4 is pushed up by the push-up member 9, and the expansion reverses so as to be curved upward.
  • the spheroid C adhered to the inner surface of the recess 4 is peeled off.
  • the recess 4 remains inverted to the upper side, for example, after the culture medium is injected into the bag body 2 next, the bag body 2 is pressed by the pressing member 6 or the like to raise the internal pressure of the bag body 2 By this, it is possible to restore the shape of the convexly curved coronal spherical shape to the original lower side. Also, for example, the shape of the recess 4 can be recovered also by suctioning the recess 4 inverted upward to the lower side.
  • FIG. 7 shows an example in which the push-up member 9 pushes up all the recesses 4 at the same time
  • the push-up member may selectively push up some of the recesses 4.
  • one push-up member 9 may push up the recess 4 one by one sequentially.
  • the actuator (not shown) may be configured not only to move the push-up member 9 up and down, but also to move the push-up member horizontally to sequentially position it below the desired recess 4.
  • a physical stimulus is given to the recess 4 and the spheroid C adhering to the inner surface of the recess 4 is peeled off. May be
  • the adhesion position of the spheroid C can be changed in the concave portion 4 while preventing the movement between the concave 4 portions of the spheroid C. Thereby, the culture and differentiation induction efficiency of cells can be improved.
  • FIG. 1 The structure of the cell culture device of the present embodiment can be the same as that of the second embodiment.
  • unnecessary spheroids C1 are selectively peeled and eliminated.
  • the spheroid C1 in a part of concave portions among the plurality of closed concave portions 4 is selectively peeled. Also in this embodiment, the same peeling means as in the first embodiment is used.
  • the medium is injected from the port 3 into the bag body 2 by the pump, whereby the closing of the recess 4 by the upper surface film 21 is released.
  • the peeled spheroid C1 becomes ready to flow out of the recess 4.
  • the medium in the bag body 2 is discharged from the port 3 by the pump, whereby the spheroid C1 selectively peeled is discharged together with the medium S.
  • unnecessary spheroids C1 can be selectively peeled and removed.
  • the unnecessary spheroids C1 are selectively peeled and removed, while the spheroids C of the other recesses 4 not selected are not ejected from the port 3 because they are adhered to the inner surfaces of the respective recesses 4 respectively.
  • the unnecessary spheroid C1 is selected, but the selected spheroid is not limited to the unnecessary one, and may be selected as an extraction sample, for example.
  • the spheroids in two or more recessed parts 4 can also be selectively peeled off.
  • the structure of the cell culture device of the present embodiment can be the same as that of the fourth embodiment.
  • the cell culture bag 1 in the discharging step described in the fourth embodiment, the cell culture bag 1 is turned upside down, and the cell culture bag 1 is inclined such that the port 3 is located below the plurality of recesses 4. Then, the selectively detached spheroid C1 is discharged together with the medium S from the port 3 to the outside of the bag body 2.
  • the spheroid C1 may be discharged together with the culture medium S from the port 3 to the outside of the bag body 2 in a state where the cell culture bag 1 is turned upside down without tilting.
  • this embodiment is suitable in the case where cells and aggregates adhering to the inside of the recess 4 of the cell culture bag 1 are not peeled off by merely inverting the cell culture bag 1 up and down.
  • the operation of vertically inverting and / or tilting the cell culture bag 1 may be performed in the discharging step or may be performed at a stage prior to the discharging step.
  • the spheroid C1 is selectively exfoliated in the exfoliation step, and the spheroid C1 moves to the outside of the recess 4 and is easily discharged from the port 3. Furthermore, if the cell culture bag 1 is inclined such that the port 3 is located below the plurality of recesses 4, the peeled nest feroid C 1 can be more easily discharged from the port 3.
  • the present invention can be used as a technique for efficiently culturing various cells.

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Abstract

本発明は、複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用して細胞培養を行うにあたり、細胞の凹部間の移動を防止しつつ、凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離させて、細胞又は細胞の凝集塊の増殖・分化誘導効率を向上させる細胞培養装置を提供する。本発明は、周辺部をシールした上面フィルム（２１）及び下面フィルム（２２）から構成されたバッグ本体（２）と、バッグ本体（２）に取り付けられたポート（３）とを備え、下面フィルム（２２）に複数の凹部（４）が形成された細胞培養バッグ（１）を使用する細胞培養方法であって、バッグ本体（２）に収容された培地（Ｓ）をポート（３）から排出して、上面フィルム（２１）で複数の凹部（４）を閉塞する閉塞工程と、閉塞された複数の凹部（４）の一部又は全部の凹部（４）において、当該凹部（４）の内面に接着しているスフェロイドを剥離する剥離工程とを有する。

Description

細胞培養方法及び装置
　本発明は、細胞培養方法及び装置に係り、より詳細には、複数の凹部を設けた細胞培養バッグを使用する細胞培養方法及び装置に関する。
　近年、医薬品の生産や、遺伝子治療、再生医療、免疫療法などの分野において、細胞（組織、微生物、ウイルスなどを含む）を人工的な環境下で効率良く大量に培養・分化誘導することが求められている。
　そのような細胞培養においては、コンタミネーションのリスクを回避するため、閉鎖系の細胞培養バッグが使用されることがある。細胞培養バッグは、例えば、周辺部をシールしたプラスチックフィルムで構成されたバッグ本体と、バッグ本体に取り付けられたポートとから構成されている。特許文献１には、バッグ本体の底面に複数の凹部を設けることにより、細胞培養バッグ内での細胞の移動を抑制した細胞培養バッグが記載されている。
　ところで、細胞培養においては、一般に、細胞の増殖に伴い培地中の細胞濃度が高くなり過ぎると、増殖に必要な培地成分の枯渇や、細胞自身の代謝産物の蓄積などにより細胞の成長が阻害されて細胞の増殖効率が低下し、一方、培地中の細胞濃度が低過ぎても、細胞の増殖・分化誘導の効率が低下する。このため、細胞の培養・分化誘導効率を向上させるためには、細胞濃度を適正な範囲に維持する必要がある。
　複数の凹部を設けた細胞培養バッグを使用してスフェロイド培養を行う場合においても、各凹部で細胞濃度を適正な範囲に維持する必要があり、そのため、各凹部の細胞数が均一になるように、各凹部に細胞が播種される。
　さらに、かかるスフェロイド培養では、各凹部で均一で適切な大きさのスフェロイド（細胞の凝集塊）を形成させるため、各凹部にスフェロイドを１つずつ形成させ、１つの凹部につき１つのスフェロイドを培養終了まで維持することが求められる。
　１つの凹部に１つのスフェロイドを形成するためには、細胞培養バッグの内面に、細胞を接着し難くする細胞低接着処理を施して、細胞を細胞培養バッグの冠球状の凹部の底部中央に集めることが好ましい。細胞低接着処理としては、例えば、リン脂質ポリマー、ポリビニルアルコール誘導体、界面活性剤又はアルブミンのようなタンパク質などをコーティングしてプラスチックフィルムの表面に細胞接着性タンパクが吸着するのを阻害する処理などが挙げられる。
特開２００９－１１２６０号公報
　ところが、細胞培養バッグに細胞低接着処理を施していても、処理むらや培養細胞の接着力等の種々の要因により、細胞やスフェロイドが凹部の内面に接着することがある。例えば、図１０に示すように、培地Ｓを収容した細胞培養バッグ１の各凹部４に播種した細胞Ｃが、細胞接着性タンパクにより凹部４の内面の複数箇所に接着してしまうことがある。その場合、各細胞Ｃは、接着した位置を起点としてそれぞれスフェロイドを形成するため、１つの凹部４に小さな複数のスフェロイドが形成されてしまう。そして、凹部４の内面に接着しているスフェロイドは移動しないため、スフェロイドどうしが接着して１つのスフェロイドを形成することができない。
　このため、各凹部にスフェロイドを１つずつ形成するためには、凹部内面の複数箇所に接着している細胞を剥離させ、凹部内の１カ所（例えば、底部中央）に集める必要がある。
　また、各凹部にスフェロイドが１つずつ形成されている場合であっても、スフェロイドが凹部の内面に接着することがある。スフェロイドのうち凹部内面に接着した部分では、培地成分が枯渇しやすく、かつ代謝産物が蓄積しやすいため、スフェロイド全体の細胞の増殖・分化誘導効率が低下してしまう。
　このため、スフェロイド培養においては、細胞の増殖・分化誘導効率を向上させるために、凹部内面に接着しているスフェロイドを定期的に（例えば、培地交換時に）剥離させ、スフェロイドの接着位置を変えることが求められる。
　従来のウエルプレートを使用した細胞培養であれば、ピペットでウエル（凹部）内の培地に噴流を起こすことによって、ウエルの内面に接着している細胞（例えば、播種直後の細胞、又はスフェロイドを形成している細胞）を剥離することができる。具体的には、ウエルにピペット先端を挿入し、細胞を吸わないようにしながら培地を静かに吸い上げ、次いで、吸い上げた培地を勢い良くウエルに注入して培地に噴流を起こし、噴流によって細胞を剥離することができる。
　しかしながら、細胞培養バッグを使用した細胞培養においては、閉鎖系を維持したまま、細胞培養バッグ内の凹部にピペットを挿入することが困難である。
　なお、細胞培養バッグを使用した細胞培養において図１１（ａ）に示すように、ポート３から培地Ｓを強く注入して細胞培養バッグ１内に培地Ｓの水流を発生させ、凹部４の内壁に接着している細胞Ｃを剥離させる方法が考えられる。
　しかし、この方法では、図１１（ｂ）に示すように、凹部４内に沈殿していた細胞Ｃや剥離した細胞Ｃが他の凹部４へ移動してしまい、各凹部４内の細胞濃度が不均一となってしまう。特に、１つの凹部４に多くの細胞Ｃが入ると、やがて大き過ぎる塊Ｃ’となり、細胞の増殖・分化誘導効率が低下してしまう。
　本発明は、上記の事情に鑑みなされたものであり、複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用して細胞培養を行うにあたり、細胞の凹部間の移動を防止しつつ、凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離させて、細胞又は細胞の凝集塊の増殖・分化誘導効率を向上させることができる細胞培養方法及び装置の提供を目的としている。
　本発明に係る細胞培養方法は、周辺部をシールした上面及び下面フィルムから構成されたバッグ本体と、前記バッグ本体に取り付けられたポートとを備え、前記下面フィルムに複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用する細胞培養方法であって、前記バッグ本体に収容された培地を前記ポートから排出して、前記上面フィルムで前記複数の凹部を閉塞する閉塞工程と、閉塞された前記複数の凹部の一部又は全部の凹部において、前記細胞培養バッグの外部から前記凹部に物理的な刺激を与えて、当該凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離する剥離工程とを有することを特徴としている。
　また、本発明に係る細胞培養装置は、周辺部をシールした上面及び下面フィルムから構成されたバッグ本体と、前記バッグ本体に取り付けられたポートとを備え、前記下面フィルムに複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用する細胞培養装置であって、前記細胞培養バッグが載置される載置面を有する架台と、前記上面フィルムが前記複数の凹部を閉塞するまで、前記バッグ本体に収容された培地を前記ポートから排出する送液手段と、閉塞された前記複数の凹部の一部又は全部の凹部において、当該凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離するために、前記細胞培養バッグの外部から当該凹部に物理的な刺激を与える剥離手段とを備えることを特徴としている。
　本発明の細胞培養方法及び装置によれば、複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用して細胞培養を行うにあたり、細胞の凹部間の移動を防止しつつ、凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離させて、細胞又は細胞の凝集塊の増殖・分化誘導効率を向上させることができる。
　例えば、細胞培養バッグの凹部の内面の複数箇所に接着している場合において、凹部を閉塞して、凹部に物理的な刺激を与えることによって、細胞の凹部間の移動を防止しつつ、細胞を剥離させて一箇所に集合させて、１つの凹部に１つの細胞凝集塊（スフェロイド）を効率良く形成させ、細胞の増殖・分化誘導効率を向上させることができる。
　さらに、例えば、細胞培養バッグの凹部の内面に細胞凝集塊が接着している場合において、凹部を閉塞して、凹部に物理的な刺激を与えることによって、細胞凝集塊の凹部間の移動を防止しつつ、細胞凝集塊を剥離させて細胞凝集塊の接着部位を変え、細胞凝集塊の増殖・分化誘導効率を向上させることができる。
（ａ）は、本発明の実施形態で使用する細胞培養バッグの概略を示す平面図を示し、（ｂ）は、本発明の実施形態で使用する細胞培養バッグの概略を示す側面図を示し、（ｃ）は、本発明の実施形態で使用する細胞培養バッグの概略を示す下面図を示す。 （ａ）は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養装置の断面模式図あり、押圧部材が上がった状態を示し、（ｂ）は、本発明の第１実施形態に係る細胞培養装置の断面模式図あり、押圧部材が下がった状態を示す。 （ａ）は、本発明の第１実施形態における細胞培養中の状態を示す断面模式図を示し、（ｂ）は、本発明の第１実施形態における閉塞工程を示す細胞培養バッグの断面模式図である。 本発明の第１実施形態における剥離工程を説明する説明する細胞培養バッグの断面模式図である。 （ａ）は、細胞が播種された１つの凹部内を示す写真であり、播種から４８時間後の凹部内を示し、（ｂ）は、細胞が播種された１つの凹部内を示す写真であり、閉塞工程後の凹部内を示し、（ｃ）は、細胞が播種された１つの凹部内を示す写真であり、剥離工程直後の凹部内を示し、（ｄ）は、細胞が播種された１つの凹部内を示す写真であり、剥離工程から１５時間後の凹部内を示す。 （ａ）は、本発明の第２実施形態を説明する説明する細胞培養バッグの断面模式図であり、上下反転させた細胞培養バッグを示し、（ｂ）は、本発明の第２実施形態を説明する説明する細胞培養バッグの断面模式図であり、傾斜させた細胞培養バッグを示し、（ｃ）は、本発明の第２実施形態を説明する説明する細胞培養バッグの断面模式図であり、上下反転させ、かつ傾斜させた細胞培養バッグを示す。 図７は、本発明の第３実施形態の剥離工程を説明する説明する細胞培養バッグの断面模式図である。 （ａ）は、本発明の第４実施形態に係る細胞培養方法を説明する細胞培養バッグの断面模式図であり、剥離工程を示し、（ｂ）は、本発明の第４実施形態に係る細胞培養方法を説明する細胞培養バッグの断面模式図であり、解除工程を示し、（ｃ）は、本発明の第４実施形態に係る細胞培養方法を説明する細胞培養バッグの断面模式図であり、排出工程を示す。 図９は、本発明の第５実施形態に係る細胞培養方法を説明する細胞培養バッグの断面模式図である。 図１０は、細胞培養バッグの凹部の内面の複数箇所に細胞が接着した状態を示す細胞培養バッグの断面模式図である。 （ａ）は、細胞培養バッグ内の凹部からスフェロイドが剥離された状態を示す細胞培養バッグの断面模式図を示し、（ｂ）は、細胞培養バッグ内で剥離したスフェロイドが凹部間を移動した状態を示す細胞培養バッグの断面模式図を示す。
　以下、本発明の好ましい実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
（細胞培養バッグ）
　まず、本実施形態に係る細胞培養装置の説明に先立ち、図１を参照して、本実施形態で使用する細胞培養バッグを説明する。図１（ａ）～図１（ｃ）に示す細胞培養バッグ１は、重ね合わせて周辺部２０をヒートシールした上面フィルム２１及び下面フィルム２２から構成されたバッグ本体２と、このバッグ本体２に取り付けられたポート３とを備えている。バッグ本体２の大きさは特に限定されないが、例えば、縦５０～５００ｍｍ、横５０～５００ｍｍとするのが好ましい。
　なお、図１を含む各図において、ポート３に接続されたチューブ等の流路、及び、流路を閉塞するピンチ又はバルブ等の閉塞手段の図示を省略する。
　下面フィルム２２には、図１（ｃ）に示すように、各々が細胞培養部となる複数の凹部４が形成されている。凹部４は、バッグ本体２内における細胞の移動を抑止して、培養中の細胞が一つの凹部４に留まるようにするために、開口径（直径）Ｄが０．３～１０ｍｍ、深さｄが０．１ｍｍ以上であるのが好ましい。凹部４はまた、全ての凹部４で同一開口径としてもよいし、開口径が異なる二種以上の凹部を含んでもよい。例えば、下面フィルム２２を複数の領域に分割して、それぞれの領域ごとに凹部４の開口径を異ならせてもよい。
　また、細胞培養バッグ１では、凹部４の底部に細胞が集まり易くするため、図１（ｂ）に示すように、凹部４は球冠状の形状を有している。なお、凹部４の形状は、これに限定されない。例えば、凹部４は、擂り鉢状（円錐状）に窪んだ形状を有していてもよい。凹部４の底部に細胞が集まり易くするには、凹部４の直径Ｄに対する深さｄの比ｄ／Ｄを０．０５～１とするのが好ましい。
　また、凹部４の配列は、図１（ｃ）に示すように千鳥状として、下面フィルム２２に占める凹部４の占有面積ができるだけ大きくなるようにするのが好ましいが、必要に応じて格子状に配列してもよい。
　上面フィルム２１は、図１（ｂ）に示すように、複数の凹部４全体の上方を覆う実質的に平坦な天面部分２１ａと、天面部分２１ａの周囲に形成された傾斜部分２１ｂとから構成された台地状に膨出した膨出形状を有する。これにより、二枚のプラスチックフィルムを重ねて周辺部をシールしただけの平パウチ状の容器と比較して、バッグ本体２を培地で満たしても、下面フィルム２２の周辺部が持ち上がる変形が抑制される。
　バッグ本体２を形成する上面フィルム２１及び下面フィルム２２は、ガス透過性を有するプラスチックフィルムで形成される。このプラスチックフィルムのガス透過性は、ＪＩＳ　Ｋ　７１２６のガス透過度試験方法に準拠して、試験温度３７℃で測定した酸素の透過度が、５０００ｍＬ／（ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ）以上であるのが好ましい。
　バッグ本体２を形成するプラスチックフィルムに用いる材料としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリエステル、シリコーン系エラストマー、ポリスチレン系エラストマー、テトラフルオロエチレン－ヘキサフルオロプロピレン共重合体（ＦＥＰ）などの熱可塑性樹脂が挙げられる。これらは単層で用いても、同種又は異種の材料を積層して用いてもよいが、周辺部をヒートシールする際の熱融着性を考慮すると、シーラント層として機能する層を有しているのが好ましい。
　また、上面フィルム２１が可撓性を有しながらも膨出形状を保ち、かつ、下面フィルム２２が凹部４の形状を保つように、バッグ本体２を形成するプラスチックフィルムの厚みは、適度の形状保持性を有する３０～２００μｍであるのが好ましい。
　ポート３は、培地や細胞などが流通可能な管状の部材からなり、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩化ビニル、ポリスチレン系エラストマー、ＦＥＰなどの熱可塑性樹脂で成形することができる。
（第１実施形態）
　次に、図２及び図３を参照して、本発明の実施形態に係る細胞培養方法及び装置を説明する。図２は、第１実施形態に係る細胞培養装置１００の断面模式図あり、図２（ａ）は押圧部材が上がった状態を示し、図２（ｂ）は押圧部材が下がった状態を示す。
　本実施形態の細胞培養装置１００は、細胞培養バッグ１が載置される架台５と、上面フィルム２１のうち天面部分２１ａ分を押圧する底面６ａを有する押圧部材６と、押圧部材６を支持する支持機構７とを備えている。
　なお、図２では、細胞培養バッグ１のポート３から培地の注入、排出を行う送液手段としてのポンプ、細胞培養バッグ１の凹部４からスフェロイドを剥離する剥離手段の図示を省略する。なお、ポンプとしては、例えば、ポート３にチューブを介して接続したペリスタポンプが挙げられる。
　なお、送液手段は、ポンプに限定されず、例えば、シリンジであってもよい。
　架台５は、細胞培養バッグ１が水平に載置される載置面５ａを有する。この載置面５ａには、細胞培養バッグ１の下面フィルム２２に形成された複数の凹部４の各々を受け入れる形状として、開口部５ｂが形成されている。これにより、載置面５ａが下面フィルム２２を凹部４に非接触で支持するので、凹部４の潰れ、変形が回避されて凹部４内の細胞の流出が防止され、さらに、下面フィルム２２からのガス透過性が高まる。
　なお、複数の凹部４の各々を受け入れる形状は、開口部に限定されず、例えば、凹部であってもよいし、金網状であってもよい。
　押圧部材６は、細胞培養バッグ１の天面部分２１ａに合わせた略長方形の平面形状を有する板状部材であり、平坦な底面６ａを有している。
　支持機構７は、架台５上に設けたフレーム７１と、押圧部材６の上面の四隅から上方に延びてフレーム７１を上下動可能に貫通しているガイドピン７２と、押圧部材６を下方へ付勢する付勢手段７３とから構成されている。付勢手段７３は、押圧部材６の上面と、フレーム７１とに互いに同極側を対向させて配置した磁石７３で構成されている。永久磁石７３同士の間に働く斥力により、押圧部材６は、上面フィルム２１の高さに従って上下に移動する。
　なお、付勢手段７３は、永久磁石に限定されない。また、付勢手段７３を省略し、押圧部材６の自重により、押圧部材６を上面フィルム２１の高さに従って上下に移動させてもよい。
　次に、図３及び図４を参照して、本実施形態の細胞培養方法を説明する。なお、図３及び図４では、図２に示した細胞培養装置のうち、支持機構７の図示を省略する。
　図３（ａ）に示すように、細胞培養中、形成されたスフェロイドＣは、各凹部４に均一な細胞濃度で収容されている。
　図３（ｂ）に示すように、閉塞工程では、ポンプ（図示せず）でバッグ本体２に収容された培地Ｓをポート３から排出することによって、上面フィルム２１で複数の凹部４が全て閉塞される。上面フィルム２１を押圧部材６の平坦な底面６ａで押圧しているため、上面フィルム２１が平坦となり、上面フィルム２１で複数の凹部４の各々が確実に閉塞される。これにより、各凹部４内にそれぞれスフェロイドＣが閉じ込められるので、次の剥離工程において、スフェロイドＣの各凹部４からの流出が防止される。
　なお、上面フィルム２１による複数の凹部４の閉塞にあたっては、各凹部４を密閉してもよいし、密閉しなくてもよい。複数の凹部４が密閉されない場合には、細胞の凹部４からの流出が阻止できる程度に、複数の凹部４が塞がれていればよい。
　次に、図４に示すように、剥離工程では、閉塞された複数の凹部４の一部又は全部において、当該凹部４の内面からスフェロイドＣを剥離する。
　剥離工程では、複数の凹部のうちの一部又は全部の凹部４に振動又は揺動を与えるとよい。その場合、細胞培養装置１００全体に、振動又は揺動を与えてもよいし、凹部４を形成している下面フィルム２２に、振動又は揺動の物理的な力を加えてもよい。凹部４に加えられた振動又は揺動は、凹部４の内面に接着したスフェロイドＣにも伝わり、スフェロイドＣが、凹部４内面から剥離する。
　なお、振動又は揺動を与える手段として、図４に示した、細胞培養装置の架台５に取り付けられた振動子（バイブレータ）８を用いてもよいし、揺動装置を利用してもよい。また、凹部４に振動子を直接接触させて、凹部４に振動を直接加えてもよい。また、一部の凹部４に、選択的に振動又は揺動を加えてもよい。
　また、振動及び揺動は、往復運動でもよいし、例えば試験官ミキサーによる回転運動でもよい。
　ここで、図５に、本実施形態において、細胞が播種された１つの凹部４内を示す写真を示す。ここでは、味の素株式会社製の培地（ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標））を使用し、未分化ｉＰＳ細胞（細胞株１２３１Ａ３）を、１つの凹部（ウエル）あたり３×１０４個播種した。
　図５（ａ）は、播種から４８時間後の凹部を示す。同図に示すように、播種された細胞は、凹部の底部中央だけでなく、凹部の内面の至る所に接着してスフェロイドを形成している。なお、同図では、凹部の周囲内面に接着しているスフェロイドは、写真の焦点面から離れているため、明瞭に現れていない。
　図５（ｂ）は、閉塞工程後の凹部を示す。凹部４を閉塞しただけでは、まだ、スフェロイドは内面の各所に接着したままである。
　閉塞工程では、送液手段としてペリスタポンプを使用し、１．０ｍｌ／分の送液速度で、上面フィルム２１が各凹部４を閉塞するまで培地をポート３から排出した。
　図５（ｃ）は、剥離工程直後の凹部を示す。振動子８により架台５を振動させた。同図に示すように、凹部４の周囲内面から剥離した多数の小さなスフェロイドが、凹部の底部中央に集まっている。
　剥離工程では、剥離手段として振動子８である試験管ミキサー８を使用した。そして、図４に示したように、試験管ミキサー８を細胞培養装置１００の架台５の下面に１分間押し当てることによって、細胞培養バッグ１の各凹部４に外部から物理的な刺激を与えた。試験官ミキサー８としては、振動速度：約２８００回転／分、水平振動式のタイテック社製のプレゼントミキサー６０７６８８１を使用した。
　図５（ｄ）は、剥離工程から１５時間後の凹部を示す。剥離工程後、バッグ本体２内に培地を注入し、培養を再開した。同図に示すように、凹部４の底部中央に１つのスフェロイドが形成されている。
　このように、本実施形態によれば、スフェロイドの凹部４間の移動を防止しつつ、スフェロイドを内面から剥離させて一箇所に集合させる。これにより、１つの凹部４に１つのスフェロイドを効率良く形成させてスフェロイドの増殖・分化誘導効率を向上させることができる。
　さらに、1つの凹部４に１つのスフェロイドが形成されていても、凹部４の内面にスフェロイドが接着している場合には、再度凹部４を閉塞して、凹部４に物理的な刺激を与えることによって、スフェロイドの凹部４間の移動を防止しつつ、スフェロイドを内面から剥離させてスフェロイドの接着部位を変え、スフェロイドの増殖・分化誘導効率を向上させることができる。
（第２実施形態）
　次に、図６を参照して、本発明の第２実施形態を説明する。同図では、第1実施形態と同一構成部分の図示を一部省略する。
　本実施形態では、第１実施形態で説明した閉塞工程後、剥離工程において、細胞培養バッグの凹部４に外部から物理的な刺激を与える代わりに、図６（ａ）に示すように、各凹部４を閉塞したまま、細胞培養バッグ１を図１に示した細胞培養装置１００ごと上下反転させる。
　また、図６（ｂ）に示すように、剥離工程において、凹部に外部から物理的な刺激を与える代わりに、各凹部４を閉塞したまま、細胞培養バッグ１を図１に示した細胞培養装置１００ごと傾斜させてもよい。なお、細胞培養バッグ１の水平に対する傾斜角度は、特に限定されず、例えば、９０度まで傾斜させてもよい。
　さらに、図６（ｃ）に示すように、剥離工程において、凹部に外部から物理的な刺激を与える代わりに、各凹部４を閉塞したまま、細胞培養バッグ１を図１に示した細胞培養装置１００ごと上下反転させ、かつ傾斜させてもよい。
　このように、本実施形態では、培養バッグ１００を上下反転及び／又は傾斜させるという簡単な操作によって、凹部４の内面に接着していたスフェロイドＣが、重力により剥離するまた、各凹部４が上面フィルム２１で閉塞されているため、剥離した細胞又はスフェロイドＣが他の凹部４へ移動することが回避される。
　また、本実施形態は、細胞培養バッグ１の凹部４の内側に接着している細胞及び凝集塊が細胞培養バッグ１を上下反転及び／又は傾斜させただけで剥離する場合に好適である。
　なお、細胞培養バッグ１は、人手で上下反転及び／又は傾斜させてもよいし、ロボットアーム等の機構により上下反転及び／又は傾斜させてもよい。
　また、上述した第１実施形態の剥離工程において、更に本実施形態のように細胞培養バッグ１を上下反転及び／又は傾斜させてもよい。また、後述の第３及び４実施形態の剥離工程においても、更に本実施形態のように細胞培養バッグ１００を上下反転及び／又は傾斜させてもよい。
（第３実施形態）
　次に、図７を参照して、本発明の第３実施形態を説明する。同図では、第1実施形態と同一構成部分の図示を一部省略する。
　本実施形態では、第１実施形態で説明した閉塞工程後、剥離工程において、細胞培養バッグの凹部４に振動又は揺動を与える代わりに、複数の凹部４の下方にそれぞれ配置された突上げ部材９によって各凹部を下方から突き上げることによって、各凹部４に物理的な刺激を与える。
　突上げ部材９は、架台５の載置面５ａに形成された開口部５ｂ内をアクチュエータ（図示せず）によって上下動する。下側に凸状に湾曲した冠球状の凹部４の底部は、突上げ部材９によって突き上げられ、上側に凸状に湾曲するように膨らみが反転する。凹部４を突き上げることによって、凹部４の内面に接着したスフェロイドＣが剥離する。
　凹部４が上側に反転したままとなった場合には、例えば、次に培地をバッグ本体２内に注入した後に、押圧部材６等でバッグ本体２を押圧してバッグ本体２の内圧を上昇させることによって、元の下側に凸状に湾曲した冠球状の形状を回復させることができる。また、例えば、上側に反転した凹部４を下側から吸引することによっても、凹部４の形状を回復させることができる。
　なお、図７では、突上げ部材９が全部の凹部４を同時に突き上げた例を示したが、突上げ部材は一部の凹部４を選択的に突き上げてもよい。
　また、１つの突上げ部材９が、凹部４を１つずつ順次に突き上げてもよい。その場合、アクチュエータ（図示せず）は、突上げ部材９を上下動させるだけでなく、突上げ部材を水平方向移動させて所望の凹部４の下方に順次に位置決めするように構成するとよい。
　また、凹部４を突き上げ部材９で突き上げるとともに、細胞培養バッグ１に振動又は揺動を加えることによって、凹部４に物理的な刺激を与え、凹部４の内面に接着しているスフェロイドＣを剥離してもよい。
　このように、細胞培養バッグ１を使用した細胞培養であっても、スフェロイドＣの凹４部間の移動を防止しつつ、凹部４内でスフェロイドＣの接着位置を変えることができる。これにより、細胞の培養・分化誘導効率を向上させることができる。
（第４実施形態）
　次に、図８を参照して、本発明の第４実施形態の細胞培養方法及び装置を説明する。
　本実施形態の細胞培養装置の構造は、第２実施形態のものと同じにすることができる。本実施形態では、第１実施形態で説明した閉塞工程後、不要なスフェロイドＣ１を選択的に剥離して排除する。
　図８（ａ）に示すように、剥離工程では、閉塞された複数の凹部４のうち、一部の凹部内のスフェロイドＣ１を選択的に剥離する。本実施形態においても、第１実施形態と同じ剥離手段を用いる。
　次に、図８（ｂ）に示すように、解除工程では、ポンプでポート３からバッグ本体２内に培地を注入することによって、上面フィルム２１による凹部４の閉塞が解除される。凹部４の閉塞が解除された結果、剥離したスフェロイドＣ１は、当該凹部４の外部へ流出可能な状態となる。
　次に、図８（ｃ）に示すように、排出工程では、ポンプでポート３からバッグ本体２内の培地を排出することによって、選択的に剥離したスフェロイドＣ１が、培地Ｓと共に排出される。このようにして、不要なスフェロイドＣ１が選択的に剥離して除去することができる。
　不要なスフェロイドＣ１が選択的に剥離、除去される一方、選択されなかった他の凹部４のスフェロイドＣは、各凹部４内面にそれぞれ接着しているため、ポート３から排出されない。
　なお、本実施形態では、不要なスフェロイドＣ１を選択したが、選択されるスフェロイドは不要なものに限定されず、例えば、抽出サンプルとして選択してもよい。また、２つ以上の凹部４内のスフェロイドを選択的に剥離することもできる。
（第５実施形態）
　次に、図９を参照して、本発明の第５実施形態を説明する。
　本実施形態の細胞培養装置の構造は、第４実施形態のものと同じにすることができる。
　本実施形態では、第４実施形態で説明した排出工程において、細胞培養バッグ１を上下反転させ、かつ、ポート３が複数の凹部４よりも下方に位置するように、細胞培養バッグ１を傾斜させた状態で、選択的に剥離したスフェロイドＣ１を、培地Ｓと共にポート３からバッグ本体２の外部へ排出する。
　なお、細胞培養バッグ１を傾斜させずに上下反転だけさせた状態で、剥離されスフェロイドＣ１を、培地Ｓと共にポート３からバッグ本体２の外部へ排出してもよい。
　また、本実施形態は、細胞培養バッグ１の凹部４の内側に接着している細胞及び凝集塊が細胞培養バッグ１を上下反転させただけでは剥離しない場合に好適である。
　また、細胞培養バッグ１の上下反転及び／又は傾斜させる操作は、排出工程において実施してもよいし、排出工程よりも前段階で実施してもよい。
　このように、細胞培養バッグ１を上下反転させることにより、剥離工程で選択的に剥離されスフェロイドＣ１が凹部４の外部へ移動し、ポート３から容易に排出される。さらに、細胞培養バッグ１を、ポート３が複数の凹部４よりも下方に位置するように傾斜させれば、剥離した巣フェロイドＣ１をポート３からより容易に排出することができる。
　以上、本発明について、好ましい実施形態を示して説明したが、本発明は、前述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の範囲で種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。前述した実施形態では、棒状の突上げ部材を使用したが、突上げ部材の形状はこれに限定されない。また、上述した実施形態では、押圧部材で上面フィルムを押圧した例を説明したが、本発明では押圧部材を省略してもよい。
　また、上述した実施形態では、細胞培養バッグの凹部の内面に接着したスフェロイドを剥離する例を説明したが、本発明は、スフェロイドを形成していない細胞を細胞培養バッグの凹部の内面から剥離する場合にも適用することができる。
　本発明は、種々の細胞を効率良く培養する技術として利用できる。
　この明細書に記載の文献及び本願のパリ優先の基礎となる日本出願明細書の内容を全てここに援用する。
　１　細胞培養バッグ
　２　バッグ本体
　２０　周辺部
　２１　上面フィルム
　２１ａ　天面部分
　２１ｂ　傾斜部分
　２２　下面フィルム
　３　ポート
　４　凹部（ウエル）
　５　架台
　５ａ　載置面
　５ｂ　開口部
　６　押圧部材
　６ａ　底面
　７　支持機構
　７１　フレーム
　７２　ガイドピン
　７３　付勢手段（磁石）
　８　振動子（試験管ミキサー）
　９　突上げ部材
　１００　細胞培養装置
　Ｃ，Ｃ’，Ｃ１　細胞又は細胞の凝集塊（スフェロイド）
　Ｓ　培地

 

Claims (15)

  1. 　周辺部をシールした上面及び下面フィルムから構成されたバッグ本体と、前記バッグ本体に取り付けられたポートとを備え、前記下面フィルムに複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用する細胞培養方法であって、
    　前記バッグ本体に収容された培地を前記ポートから排出して、前記上面フィルムで前記複数の凹部を閉塞する閉塞工程と、
    　閉塞された前記複数の凹部の一部又は全部の凹部において、当該凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離する剥離工程と
    を有することを特徴とする、細胞培養方法。
  2. 　前記剥離工程において、閉塞された前記複数の凹部の一部又は全部の凹部において、前記細胞培養バッグの外部から前記凹部に物理的な刺激を与えて、当該凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離する
    ことを特徴とする、請求項１記載の細胞培養方法。
  3. 　前記剥離工程において、前記複数の凹部のうちの一部又は全部の凹部に振動又は揺動を与える
    ことを特徴とする、請求項２記載の細胞培養方法。
  4. 　前記剥離工程において、前記複数の凹部のうちの一部又は全部の凹部を外側から突く
    ことを特徴とする、請求項２又は３記載の細胞培養方法。
  5. 　前記剥離工程において、前記複数の凹部を閉塞したまま、前記細胞培養バッグを上下反転及び／又は傾斜させる
    ことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  6. 　前記剥離工程において、前記複数の凹部の一部の凹部内の細胞又は細胞の凝集塊を選択的に剥離し、
    　前記剥離工程に続いて、
    　前記ポートから前記バッグ本体内に培地を注入して、前記上面フィルムによる前記複数の凹部の閉塞を解除する解除工程と、
    　前記剥離工程において選択的に剥離した細胞又は細胞の凝集塊を、培地と共に前記ポートから前記バッグ本体の外部へ排出する排出工程と
    を有することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  7. 　前記排出工程において、前記細胞培養バッグを上下反転させた状態で、前記選択的に剥離した細胞又は細胞の凝集塊を、培地と共に前記ポートから前記バッグ本体の外部へ排出する
    ことを特徴とする、請求項６記載の細胞培養方法。
  8. 　前記排出工程において、前記ポートが前記複数の凹部よりも下方に位置するように、前記細胞培養バッグを傾斜させた状態で、前記選択的に剥離した細胞又は細胞の凝集塊を、培地と共に前記ポートから前記バッグ本体の外部へ排出する
    ことを特徴とする、請求項７記載の細胞培養方法。
  9. 　前記閉塞工程において、押圧部材で、前記上面フィルムを上方から押圧する
    ことを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
  10. 　周辺部をシールした上面及び下面フィルムから構成されたバッグ本体と、前記バッグ本体に取り付けられたポートとを備え、前記下面フィルムに複数の凹部が形成された細胞培養バッグを使用する細胞培養装置であって、
    　前記細胞培養バッグが載置される載置面を有する架台と、
    　前記上面フィルムで前記複数の凹部が閉塞されまで、前記バッグ本体に収容された培地を前記ポートから排出する送液手段と、
    　閉塞された前記複数の凹部の一部又は全部の凹部において、当該凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離する剥離手段と
    を備えることを特徴とする、細胞培養装置。
  11. 　前記剥離手段は、閉塞された前記複数の凹部の一部又は全部の凹部において、当該凹部の内面に接着している細胞又は細胞の凝集塊を剥離させるために、前記細胞培養バッグの外部から当該凹部に物理的な刺激を与える
    ことを特徴とする、請求項１０記載の細胞培養装置。
  12. 　前記剥離手段は、前記複数の凹部のうちの一部又は全部の凹部に振動又は揺動を与える
    ことを特徴とする、請求項１０又は１１記載の細胞培養装置。
  13. 　前記剥離手段は、前記複数の凹部のうちの一部又は全部の凹部を下方から突き上げる突上げ部材と、
    　前記突上げ部材を上下動させるアクチュエータと
    を備え、
    　前記架台の前記載置面に、前記突上げ部材が上下動可能な開口部が形成されている
    ことを特徴とする、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  14. 　前記剥離手段は、前記複数の凹部のうちの一部の凹部の内面に接着した細胞を選択的に剥離し、
    　前記送液手段は、前記ポートから前記バッグ本体内に培地を注入して、前記上面フィルムによる前記複数の凹部の閉塞を解除し、次いで、前記剥離手段により選択的に剥離された細胞又は細胞の凝集塊を培地と共に前記ポートから前記バッグ本体の外部へ排出する
    ことを特徴とする、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
  15. 　前記細胞培養バッグの前記上面フィルムを上方から押圧する押圧部材を更に備える
    ことを特徴とする、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の細胞培養装置。

     
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