[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2018222069A1 - Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата - Google Patents

Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата Download PDF

Info

Publication number
WO2018222069A1
WO2018222069A1 PCT/RU2017/000386 RU2017000386W WO2018222069A1 WO 2018222069 A1 WO2018222069 A1 WO 2018222069A1 RU 2017000386 W RU2017000386 W RU 2017000386W WO 2018222069 A1 WO2018222069 A1 WO 2018222069A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
prostate cancer
urine
integrin alpha
fragment
integrin
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000386
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Марина Юрьевна ЗЕМСКОВА
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Простагност"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Простагност" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Простагност"
Priority to PCT/RU2017/000386 priority Critical patent/WO2018222069A1/ru
Priority to EP17911553.0A priority patent/EP3633376A4/en
Priority to EA201992217A priority patent/EA201992217A1/ru
Publication of WO2018222069A1 publication Critical patent/WO2018222069A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • Protein marker for the diagnosis of prostate cancer a method for measuring the amount of marker and an algorithm for interpreting the result
  • the invention relates to the field of biology and medicine, namely to oncology, and can be used to diagnose prostate cancer.
  • prostate cancer prostate cancer, prostate cancer
  • PCa is the second / third most common cause of death for men over 40 years of age.
  • early diagnosis is the most important factor in the fight against PCa.
  • the first is non-invasive, fast, lightweight, implemented on standard equipment for the clinical laboratory, which can be used for routine / serial analyzes during clinical examination, population screening, monitoring of risk groups, monitoring relapses, monitoring progress of the disease, monitoring of therapy, etc .; the second is the method necessary for the final differential analysis, for which the only most important parameter is accuracy close to 100%.
  • patent US7897356B2 discloses a method for diagnosing prostate cancer by identifying a biosignal on exosomes, including capture and isolation of exosomes using conventional surface exosome proteins CD63, CD9 or CD81, and then a qualitative and quantitative analysis of the level of specific prostate cancer markers PSMA, PCSA, EpCam, B7NZ (CD276).
  • Also known is a method and kit for quantifying and determining exosomes for the diagnosis of prostate cancer and prostatic hyperplasia (US20130196355A1), based on an enzyme-linked immunosorbent assay using anti-P * aL5 as a capture antibody to isolate all exosomes, from which exosomes are subsequently isolated using anti-PSA detecting antibodies and compare the level of such exosomes with a reference.
  • a biomarker suitable for non-invasive, fast, implemented on standard clinical laboratory equipment for the diagnosis of prostate cancer was not found; and secondly, the isolation of exosomes necessary for the implementation of the above methods is a very non-trivial task, unsolvable for most clinical laboratories.
  • the objective and technical result of the invention is to find a new diagnostic marker for prostate cancer (PCa), which allows for non-invasive diagnosis of the disease, as well as the development on its basis of a simple, sensitive, reliable, method for diagnosing PCa that can be used in a standard clinical laboratory of clinical or outpatient medical institutions.
  • PCa prostate cancer
  • integrin alpha V or its fragment can be used as a biomarker by identifying them both as separate subunits and as part of integrin heterodimers, such as ⁇ 1, ⁇ 3, ⁇ 5, ⁇ 6 and / or ⁇ .
  • the problem is also solved by implementing a method for diagnosing prostate cancer, including the identification of integrin alpha V or a fragment thereof in the patient's whole urine. Moreover, when integrin alpha V or its fragment is detected in whole urine in an amount of 20 ng / ml, the absence of prostate cancer is diagnosed.
  • additional clinical, laboratory, and / or instrumental examination methods are performed if the amount of integrin alpha V or a fragment thereof found in the patient’s urine is 20 ng / ml or less.
  • the problem is also solved by developing a kit for diagnosing prostate cancer in the patient’s whole urine, which includes at least one antibody or its functional fragment specific for integrin alpha V or its fragment and not cross-specific to other urine peptides.
  • the kit is a test system for conducting an enzyme-linked immunosorbent assay.
  • Figure 1 The results of measurements of integrin alpha V in the morning urine of men older than 50 years: n is the number of measurements. The horizontal line is 20 ng / ml biomarker.
  • prostate cancer stands for prostate cancer
  • BPH benign prostate formations (adenoma, prostatitis)
  • norm describes samples obtained from individuals older than 50 years without prostate gland pathologies.
  • whole urine refers to urine samples that have not undergone any treatment, or samples obtained after centrifugation, filtration or other procedures that allow the soluble components of the urine to be separated from the insoluble fraction.
  • marker or “biomarker”, unless otherwise indicated, in the present description is meant integrin alpha V (identification number UniProtKB P06756-1) and its isoform (P06756-2; P06756-3).
  • Integrin alpha V (other names - aV, CD51, MSK8, vitronectin receptor a (VNRa)) is a membrane protein, a glycoprotein from the superfamily of integrins, a product of the ITGaV gene located on the 2nd chromosome at position 2q31-q32.
  • antibody refers to an entire immunoglobulin or fragment thereof, for example, type Fab or (Fab ') 2 , which retains antigen-binding activity.
  • This can be a naturally occurring antibody or an antibody obtained by immunization (including, for example, a chimeric antibody or a humanized antibody) or a recombinant antibody constructed using genetic engineering methods.
  • an antibody or its fragment means an antibody that specifically binds to integrin alpha V or its fragment and is not cross-specific to other urine proteins (peptides, fragments thereof), i.e. an antibody that has a (significantly) greater affinity for integrin alpha V or its fragment than for other urine proteins (peptides, fragments thereof).
  • Antibodies that can be obtained from suppliers can be used in the diagnostic kit of the present invention. Or, these antibodies can be obtained by the above or other methods.
  • Integrin alpha V (HGNC: 6150: Entrez Gene: 3685: Ensembl: ENSG00000138448: OMIM: 193210: UniProtKB: P06756) - membrane protein, glycoprotein from the superfamily integrins, a product of the ITGaV gene located on the 2nd chromosome at position 2q31-q32. Integrin alpha V consists of 1,048 amino acids. The mature integrin alpha V molecule is a 1018 amino acid glycoprotein (see SEQ NO: 1), the molecular weight of the protein part is 116.0 kDa.
  • Integrin alpha V forms a heterodimeric complex with integrins beta-1, beta-3, beta-5, beta-6, or beta-8.
  • Integrins with alpha V are receptors for a number of ligands, recognizing the sequence arginine-glycine-aspartate (R-G-D). Integrins with alpha V are involved in many processes of embryo development, in angiogenesis and osteoporosis.
  • kits for diagnosing prostate cancer include antibodies against integrin alpha V or fragments thereof, which can be detected both as separate subunits and as part of heterodimers, such as heterodimeric complexes with integrins beta-1, beta-3, beta-5, beta-6 and / or beta 8. According to the invention, any antibodies or fragments thereof specifically binding to integrin alpha V and not cross-specific to other urine peptides can be used.
  • Such antibodies may include, but are not limited to, any anti-integrin alpha V antibodies / fragments of the prior art (e.g., Polyclonal Antibody to Integrin Alpha V (ITGaV) http://www.elabscience.com/Manual/Antibody / ENZENT2365.pdf, http://cloud-clone.com/products/PAB282Hu01.html, http://www.genetex.com/ lntegrin-alpha-5- antibodv-C-term-GTX81964.html. Monoclonal Antibody to Integrin Alpha V (ITGaV) http://www.abcam.com/integrin-alpha-5-antibodv-epr7854-ab150361.html,
  • the diagnostic kit includes at least one antibody / antibody fragment that specifically binds to integrin alpha V (for example, either immobilized on a support, either in lyophilized form or as an aqueous solution) and one or more reagents useful for conducting diagnostic analysis.
  • the kit may include the substrates and cofactors required for the enzyme (for example, a precursor substrate that provides a detectable chromophore or fluorophore).
  • other additives may be included in the kit, such as stabilizers, buffers (e.g., blocking buffer or lysis buffer) and the like.
  • an anti-integrin alpha V antibody included in a diagnostic kit is immobilized on a solid surface, or a solid surface (for example, a glass slide or plastic die, or diagnostic strip, etc.) on which the antibody can be immobilized is included in the kit.
  • the relative amounts of different reagents can vary widely to provide concentrations of reagents in the solution, which significantly optimize the sensitivity of the analysis.
  • the antibody and one or more than one reagent can be provided (individually or together) in the form of dry powders, usually lyophilized, including excipients, which upon dissolution will give a reagent solution having a suitable concentration.
  • a prostate cancer diagnostic kit can be an arbitrary design test system, for example, diagnostic strips, an array, a chip, etc., or a reagent kit designed for use in manual or automated analysis, or with a partially / fully automatic / robotic analyzer; the reagent kit may also include a device, for example, a plate, with immobilized antibodies, allowing for solid-phase ELISA or any other analysis with a sensitivity of at least 0.2 ng / ml.
  • any clinical, laboratory, and / or instrumental examination methods known in the art are additionally performed.
  • the original biomarker integrin alpha V is detected in the whole or any fraction of the patient’s urine, including but not limited to exosomes.
  • the integrin alpha V biomarker can be used in the diagnosis of prostate cancer in combination with any other biomarkers that improve the quality (reliability, accuracy and / or other) of prostate cancer diagnosis.
  • biomarkers include, but are not limited to, such as, for example, prostate-specific antigen, RSAZ, TMPRSS2: ERG, PSCA (prostate stem cell antigen), AMCAR and / or others.
  • Diagnosis of prostate cancer according to the invention can be carried out by any analysis method capable of determining the integrin alpha V content in the patient's urine in the range from 0 to 100 ng / ml.
  • the diagnosis was carried out as follows.
  • a urine sample was clarified by centrifugation for 15 min at a speed of 2,000 rpm (filtration through membranes with a pore size of 0.22-0.45 nm or any other available method can be used to separate the soluble fraction of urine proteins from an insoluble precipitate);
  • Urine can be stored at +4 ° C for a day and 2-3 weeks at -18 ° C.
  • the invention can also be used to monitor the effectiveness of treatment for prostate cancer by conducting repeated tests to determine the level of integrin alpha V in the patient's whole urine in the process, as well as after treatment.
  • Figure 1 shows the experimental results of measuring the level of integrin alpha V in the morning urine of healthy people, patients with benign tumors and patients with prostate cancer, obtained by the above method.
  • the graph of Figure 2 shows the probability distribution curves of the values for three data sets and the mathematical expectations of the corresponding measurements (vertical lines).
  • the mathematical expectations of the biomarker level in healthy people and patients with benign tumors (between 24 ng / ml and 32 ng / ml) differ significantly from the mathematical expectations of the biomarker level in patients with prostate cancer ( ⁇ 4 ng / ml). Processing was carried out under the assumption of a Gaussian distribution of the source data.
  • the level of integrin alpha V in the urine above 20 ng / ml indicates the absence of prostate cancer (100%), while the patient may be healthy or have prostate hyperplasia (prostatitis / adenoma). Integrin alpha V level of 20 ng / ml or less requires additional analysis, for example, by taking a puncture and histological analysis.
  • integrin alpha V can be used as a new biomarker for the diagnosis of prostate cancer, and its determination in urine can be used to conduct non-invasive diagnosis of prostate cancer, as well as to develop on its basis a simple, sensitive, reliable, applicable in standard clinical laboratory clinical or outpatient medical institutions for the diagnosis of prostate cancer.
  • the proposed diagnostic method can be used to examine the population, monitor risk groups, monitor relapses, monitor the progress of the disease, monitor therapy.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно, к онкологии, и может быть использовано для диагностики рака предстательной железы (РПЖ). Для этого используют новый маркер РПЖ, выявляемый в цельной моче пациента, представляющий собой интегрин альфа V или его фрагмент. Предлагается также способ диагностики РПЖ, включающий выявление в цельной моче пациента интегрина альфа V и набор для проведения диагностики, включающий по меньшей мере одно антитело, специфичное к интегрину альфа V, или его функциональный фрагмент. Изобретение позволяет осуществлять неинвазивную диагностику РПЖ с использованием простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях стандартной клинической лаборатории клинических или поликлинических медицинских учреждений.

Description

Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата
Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно, к онкологии, и может быть использовано для диагностики рака предстательной железы.
Уровень техники
После рака кожи рак простаты (рак предстательной железы, РПЖ) - наиболее часто диагностируемая форма рака. Во многих странах РПЖ является второй/ третьей по распространенности причин смерти мужчин в возрасте после 40 лет. В настоящее время считается, что важнейшим фактором борьбы с РПЖ является ранняя диагностика.
Традиционным и наиболее распространенным методом выявления РПЖ является тест на ПСА (простатспецифический антиген, prostate specific antigen PSA) в сыворотке крови (Stamey Т.А. et al. Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of the prostate // N Engl J Med. 1987 Oct 8; 317(15):909-16). Однако за 30 лет клинической практики накопился большой объем статистических данных, свидетельствующих о низкой специфичности ПСА как онкомаркера, что проявляется в виде значительного числа ложноположительных результатов. Поэтому внимание многих исследователей сосредоточено на поиске новых онкомаркеров.
Востребованными в медицинской практике могут быть два разных метода диагностики РПЖ: первый - неинвазивный, быстрый, легкий, реализуемый на стандартном для клинической лаборатории оборудовании, который может использоваться для рутинных / серийных анализов при диспансеризации, обследовании населения, мониторинге групп риска, мониторинге рецидивов, мониторинге хода болезни, мониторинге терапии и др.; второй - метод, необходимый для окончательного дифференциального анализа, для которого единственным важнейшим параметром является близкая к 100% точность.
В настоящее время активно исследуется ряд биомаркеров рака простаты (например РСАЗ, TMPRSS2:ERG, PSCA (prostate stem cell antigen), AMCAR), которые определяются неинвазивными методиками за счет измерения их количства в моче (см., например, Коо К.М. et al. Colorimetric TMPRSS2-ERG Gene Fusion Detection in Prostate Cancer Urinary Samples via Recombinase Polymerase Amplification // Theranostics., 2016 Jun 15;6(9): 1415-24; Deras I.L. et al., PCA3: a molecular urine assay for predicting prostate biopsy outcome // J Urol. 2008 Apr; 179(4): 1587-92). Однако это маркеры требуют для своего обнаружения использования достаточно дорогостоящих методов, основанных на полимеразной цепной реакции и/или иммуногистохимическом исследовании, и эти анализы сложно произвести в рамках стандартной клинической лаборатории. В последнее время активно исследуется возможность диагностики РПЖ по биомаркерам экзосом мочи. Так, например, патент US7897356B2 раскрывает способ диагностики РПЖ путем идентификации биосигнала на экзосомах, включающий захват и выделение экзосом с использованием обычных поверхностных белков экзосом CD63, CD9 или CD81 , а затем качественный и количественный анализ уровня специфических для РПЖ маркеров PSMA, PCSA, EpCam, В7НЗ (CD276). Также известен способ и набор для количественной оценки и определения экзосом для диагностики рака предстательной железы и гиперплазии предстательной железы (US20130196355A1), основанный на иммуноферментном анализе с использованием анти-Р*аЬ5 в качестве улавливающего антитела для выделения всех экзосом, из которых в последующем выделяют экзосомы с помощью анти-PSA детектирущего антитела и сравнивают уровень таких экзосом с эталонным. Однако, во-первых, биомаркер, подходящий для неинвазивной, быстрой, реализуемой на стандартном для клинической лаборатории оборудовании диагностики РПЖ, так и не был найден; а во-вторых, выделение экзосом, необходимое для реализации вышеупомянутых способов, - весьма нетривиальная задача, нерешаемая для большинства клинических лабораторий.
Таким образом, несмотря на существующие исследования по диагностике РПЖ, медицинская практика диспансеризации населения, а также задачи мониторинга групп риска, хода болезни, ее терапии и рецидивов нуждаются в рутинном методе анализа РПЖ, реализуемом на стандартном оборудовании.
Раскрытие изобретения
Задачей и техническим результатом изобретения является нахождение нового диагностического маркера рака предстательной железы (РПЖ), позволяющего осуществлять неинвазивную диагностику заболевания, а также разработка на его основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях стандартной клинической лаборатории клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики РПЖ.
Поставленная задача решается за счет применения для диагностики РПЖ нового биомаркера, представляющего собой интегрин альфа V или его фрагмент, выявляемого в цельной моче пациента. Согласно изобретению, интегрин альфа V или его фрагмент могут быть использованы в качестве биомаркера путем их выявления как в виде отдельных субъединиц, так и в составе гетеродимеров интегринов, таких как ανβ1 , ανβ3, ανβ5, ανβ6 и/или ανβδ.
Задача также решается при осуществлении способа диагностики РПЖ, включающего выявление в цельной моче пациента интегрина альфа V или его фрагмента. При этом, при обнаружении интегрина альфа V или его фрагмента в цельной моче в количестве от 20 нг/мл диагностируют отсутствие рака предстательной железы.
В некоторых вариантах изобретения при осуществлении способа диагностики РПЖ проводят дополнительные клинические, лабораторные и/или инструментальные обследования.
В некоторых частных вариантах осуществления изобретения дополнительные клинические, лабораторные и/или инструментальные методы обследования проводят, если количество интегрина альфа V или его фрагмента, обнаруженного в моче пациента, составляет 20 нг/мл или менее этого уровня.
Также задача решается путем разработки набора для проведения диагностики рака предстательной железы в цельной моче пациента, который включает по меньшей мере одно антитело или его функциональный фрагмент, специфичное к интегрину альфа V или его фрагменту и не обладающее кросспецифичностью к другим пептидам мочи.
В некоторых вариантах изобретения набор представляет собой тест-систему для проведения твердофазного иммуноферментного анализа.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1 Результаты измерений интегрина альфа V в утренней моче мужчин старше 50 лет: п - число измерений. Горизонтальная линия - 20 нг/мл биомаркера.
Фиг 2. Результаты математической обработки данных, приведенных на Фиг.1 По оси X - концентрация интегрина альфа V, нг/мл,
По оси Y - вероятность обнаружения интегрина альфа V в моче различных групп обследуемых. Вертикальные линии - математические ожидания.
Термины и определения
В настоящем описании термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Термин РПЖ расшифровывается как рак предстательной железы, ДГПЖ - подразумевает доброкачественные образования простаты (аденома, простатит) и термин норма описывает образцы, полученные от индивидуумов старше 50 лет без патологий предстательной железы.
Под термином «цельная моча» подразумеваются образцы мочи как не подвергавшиеся никакой обработке, так и образцы, полученные после центрифугирования, фильтрации или других процедур, позволяющих отделить растворимые компоненты мочи от нерастворимой фракции. Под «маркером» или «биомаркером», если не указано иное, в настоящем описании подразумевается интегрин альфа V (идентификационный номер UniProtKB Р06756-1) и его изоформы (Р06756-2; Р06756-3). ). Интегрин альфа V (другие названия - aV, CD51 , MSK8, vitronectin receptor a (VNRa)) - мембранный белок, гликопротеин из надсемейства интегринов, продукт гена ITGaV, находящегося на 2-й хромосоме в положении 2q31-q32.
Используемый здесь термин «антитело» касается целого иммуноглобулина или его фрагмента, например, типа Fab или (Fab')2, сохраняющего антигенсвязывающую активность. Это может быть встречающееся в природе антитело или антитело, полученное путем иммунизации (в том числе, например, химерное антитело или гуманизированное антитело) или рекомбинантное антитело, построенное с помощью методов генной инженерии.
В настоящем описании под антителом или его фрагментом подразумевается антитело, специфически связывающиеся с интегрином альфа V или его фрагментом и не обладающее кросспецифичностью к другим белкам (пептидам, их фрагментам) мочи, т.е. такое антитело, которое обладает (значительно) большей аффинностью к интегрину альфа V или его фрагменту, чем к другим белкам (пептидам, их фрагментам) мочи.
В диагностическом наборе по настоящему изобретению могут быть использованы антитела, которые можно получить от поставщиков. Или же эти антитела могут быть получены упомянутыми выше или иными способами.
Без дальнейшего уточнения предполагается, что на основе приведенного выше описания квалифицированный в данной области специалист способен применить настоящее изобретение во всей его полноте. Приведенные далее варианты являются только иллюстративными. Они никаким образом не ограничивают раскрытие настоящего изобретения. Все цитируемые публикации включены в виде ссылок.
Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученными в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется графическими материалами.
Нижеследующие примеры приведены в целях иллюстрирования способа согласно настоящему изобретению и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Подробное раскрытие изобретения
Интегрин альфа V (HGNC: 6150: Entrez Gene: 3685: Ensembl: ENSG00000138448: OMIM: 193210: UniProtKB: P06756) - мембранный белок, гликопротеин из надсемейства интегринов, продукт гена ITGaV, находящегося на 2-й хромосоме в положении 2q31-q32. Интегрин альфа V состоит из 1048 аминокислот. Зрелая молекула интегрина альфа V представляет собой гликопротеин длиной 1018 аминокислот (см. SEQ NO: 1), молекулярная масса белковой части— 116,0 кДа.
Зрелая молекула интегрина альфа V образует гетеродимерный комплекс с интегринами бета-1 , бета-3, бета-5, бета-6 или бета-8. Интегрины с альфа V являются рецепторами для ряда лигандов, распознавая последовательность аргинин-глицин- аспартат (R-G-D). Интегрины с альфа V участвуют во многих процессах развития эмбриона, в ангиогенезе и остеопорозе.
В ходе проведенных исследований неожиданно было обнаружено, что количественное содержание интегрина альфа V в цельной моче коррелирует с заболеванием раком предстательной железы, что позволило использовать его в качестве биомаркера для диагностики РПЖ, а также позволило разработать на основе нового биомаркера новый метод диагностики РПЖ. Количественное определение интегрина альфа V в цельной моче позволяет осуществлять неинвазивную диагностику заболевания, а простая методика проведения анализа позволяет использовать предлагаемый метод в условиях стандартной клинической лаборатории клинических или поликлинических медицинских учреждений.
Изобретением также охватываются наборы для проведения диагностики РПЖ по изобретению. Такие наборы включают антитела против интегрина альфа V или его фрагментов, которые могут быть выявлены как в виде отдельных субъединиц, так и в составе гетеродимеров, таких как гетеродимерные комплексы с интегринами бета-1 , бета-3, бета-5, бета-6 и/или бета-8. Согласно изобретению, могут быть использованы любые антитела или их фрагменты, специфически связывающиеся с интегрином альфа V и не обладающее кросспецифичностью к другим пептидам мочи. К таким антителам могут относиться, но не ограничиваются ими, как любые известные из уровня техники антитела/фрагменты антител против интегрина альфа V (например, Polyclonal Antibody to Integrin Alpha V (ITGaV) http://www.elabscience.com/Manual/Antibody/ ENZENT2365.pdf , http://cloud-clone.com/products/PAB282Hu01.html, http://www.genetex.com/ lntegrin-alpha-5- antibodv-C-term-GTX81964.html. Monoclonal Antibody to Integrin Alpha V (ITGaV) http://www.abcam.com/integrin-alpha-5-antibodv-epr7854-ab150361.html,
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/mabt207?lang=en&region=RU, http://cloud- clone.com/products/MAB282Hu22.html, http://www.antibodies-online.com/abstract/lntegrin +alpha+V+(ITGAV)+Antibody/), так и новые, не известные ранее антитела/фрагменты антител, в том числе антитела (фрагменты антител), модифицированные с целью повышения их аффинности известными способами, которые могут быть получены с использованием известных методов, таких как метод иммунизации (в том числе это могут быть, например, химерные антитела или гуманизированные антитела) или метод получения рекомбинантных антител, построенных с помощью методов генной инженерии.
Диагностический набор включает в себя по меньше мере одно антитело/фрагмент антитела, специфически связывающееся с интегрином альфа V (например, либо иммобилизованное на подложке, либо в лиофилизированной форме, либо в виде водного раствора) и один или более чем один реагент, полезный для проведения диагностического анализа. Когда антитело против интегрина альфа V мечено ферментом, набор может включать субстраты и кофакторы, требующиеся для данного фермента (например, субстрат-предшественник, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, в набор могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или буфер для лизиса) и тому подобное. В определенных воплощениях антитело против интегрина альфа V, включенное в диагностический набор, иммобилизовано на твердой поверхности, или твердая поверхность (например, предметное стекло или пластиковая плашка, или диагностическая полоска и др.), на которой можно иммобилизовать антитело, включена в набор. Относительные количества разных реагентов могут широко варьировать для обеспечения концентраций реагентов в растворе, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В конкретном воплощении антитело и один или более чем один реагент могут быть предоставлены (по отдельности или совместно) в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включающих эксципиенты, которые при растворении будут давать раствор реагента, имеющий подходящую концентрацию.
В некоторых вариантах набор для диагностики РПЖ может представлять собой тест-систему произвольной конструкции, например, диагностические полоски, массив, чип и пр. или набор реагентов, предназначенный для использования при ручном или автоматизированном анализе, или с частично/ полностью автоматическим/ роботизированным анализатором; набор реагентов также может включать приспособление, например плашку, с иммобилизованными антителами, позволяющую провести твердофазный ИФА или любой другой анализ с чувствительностью не менее 0.2 нг /мл.
В некоторых вариантах изобретения при осуществлении способа диагностики РПЖ дополнительно проводят любые известные из уровня техники клинические, лабораторные и/или инструментальные методы обследования.
Оригинальный биомаркер интегрин альфа V детектируется в цельной или любой фракции мочи пациента, включая экзосомы, но не ограничиваясь ими.
В некоторых вариантах воплощения изобретения биомаркер интегрин альфа V может быть использован в диагностике РПЖ в комбинации с любыми другими биомаркерами, повышающими качество (достоверность, точность и/или др.) диагностики РПЖ. К таким биомаркерам относятся, но не ограничиваются ими, такие как, например, простатспецифический антиген, РСАЗ, TMPRSS2:ERG, PSCA (prostate stem cell antigen), AMCAR и/или другие.
Примеры воплощения изобретения
Диагностика РПЖ по изобретению может быть проведена любым методом анализа, способным определить содержание интегрина альфа V в моче пациента в диапазоне от 0 до 100 нг/мл. В нашем конкретном случае диагностика осуществлялась следующим образом.
У обследуемого брали 30 (можно до 50) мл первой порции утренней мочи.
Для проведения измерения уровня интегрина альфа V в моче использовали следующие процедуры:
- образец мочи осветляли центрифугированием 15 мин при скорости 2 000 оборотов в мин (можно использовать фильтрацию через мембраны с размером пор 0.22- 0.45 нм или любой другой доступный метод, позволяющий отделить растворимую фракцию белков мочи от нерастворимого осадка);
- содержание интегрина альфа V определяли в конкретном случае методом ИФА, используя коммерчески доступный «SEB282Hu 96 Tests. Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For Integrin Alpha V (ITGaV)» фирмы Cloud-Clone Corp. (http://cloud- clone.com/products/SEB282Hu.html), строго следуя инструкции (http://cloud- clone.com/manual/ELISA-Kit-for-lnteqrin-Alpha-V-(ITGaV)-SEB282Hu.pdf).
Для этого:
- 25 мкл. мочи вносили в лунку 96-луночной плашки с иммобилизованными антителами;
- инкубировали 1.5 часа при 37°С;
- жидкость удаляли и добавляли 100 мкл. детектирующего реагента А;
- инкубировали 1.5 часа при 37°С;
- жидкость удаляли, и лунка промывалась 3 раза промывающим раствором. После каждого промывания жидкость тщательно удалялась вытряхиванием на фильтровальную бумагу;
- добавляли 100 мкл. детектирующего реагента В;
- плашка инкубировалась 0.5 часа при 37°С;
- жидкость удалялась, и лунка промывалась 5 раз промывающим раствором. После каждого промывания жидкость тщательно удалялась вытряхиванием на фильтровальную бумагу;
- добавляли 90 мкл. субстрата ТМБ;
- инкубировали 20 мин. при 37°С; - добавляли 50 мкл. стоп-реагента
- результат измерялся немедленно фотометрически при 450 нм. Для определения уровня ITGAV в каждом экспериментальном образце мочи согласно инструкции производителя использовали калибровочную кривую полученную в результате измерения различных разведений чистого (гомогенного) белка.
При этом повышение точности анализа и воспроизводимости результатов возможно двумя путями:
- за счет контроля процесса сбора мочи: нужно именно 30-50 мл первой порции утренней мочи;
- собирая 30-50 мл первой порции мочи после массажа простаты.
Моча может храниться при +4 °С в течение суток и 2-3 недели - при -18 °С.
В некоторых случаях также бывает целесообразным повторное проведение анализа. Изобретение также может быть использовано для контроля эффективности лечения РПЖ путем проведения повторных анализов с целью выявления уровня интегрина альфа V в цельной моче пациента в процессе, а также после завершения лечения.
На Фиг.1 показаны экспериментальные результаты измерений уровня интегрина альфа V в утренней моче здоровых людей, пациентов с доброкачественными образованиями и больных с РПЖ, полученные по вышеописанной методике.
На графике Фиг.2 показаны кривые вероятности распределения значений для трех наборов данных и математические ожидания соответствующих измерений (вертикальные линии). Как следует из графика, математические ожидания уровня биомаркера у здоровых людей и пациентов с доброкачественными образованиями (между 24 нг/мл и 32 нг/мл) существенно отличаются от математического ожидания уровня биомаркера у больных с РПЖ (~4 нг/мл). Обработка была проведена в предположении гауссова распределения исходных данных.
Как следует из полученных данных, уровень интегрина альфа V в моче выше 20 нг/мл свидетельствует об отсутствии РПЖ (100%), при этом пациент может быть здоров или иметь гиперплазию простаты (простатит / аденому). Уровень интегрина альфа V 20 нг/мл и менее требует дополнительного анализа, например, посредством взятия пункции и гистологического анализа.
Приведенные данные свидетельствуют, что интегрин альфа V может быть использован в качестве нового биомаркера для диагностики РПЖ, а его определение в моче может быть использовано для проведения неинвазивной диагностики РПЖ, а также для разработки на его основе простого, чувствительного, надежного, применимого в условиях стандартной клинической лаборатории клинических или поликлинических медицинских учреждений способа диагностики РПЖ. Предлагаемый способ диагностики может быть использован для обследования населения, мониторинга групп риска, мониторинга рецидивов, мониторинга хода болезни, мониторинга терапии.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

Формула изобретения
1. Применение интегрина альфа V или его фрагмента в качестве маркера, выявляемого в цельной моче, для диагностики рака предстательной железы.
2. Способ диагностики рака предстательной железы, включающий выявление в цельной моче пациента интегрина альфа V или его фрагмента.
3. Способ по п.2, в котором интегрин альфа V или его фрагмент выявляют в моче в виде отдельных субъединиц или в составе гетеродимеров интегринов ανβ1 , ανβ3, ανβ5, ανβ6 и/или ανβ8.
4. Способ по любому из п. п.2 или 3, в котором диагностируют отсутствие рака предстательной железы при обнаружении интегрина альфа V или его фрагмента в моче в количестве более 20 нг/мл.
5. Способ по п.2, включающий дополнительные клинические, лабораторные и/или инструментальные методы обследования.,
6. Способ по п.5, в котором дополнительные клинические, лабораторные и/или инструментальные методы обследования проводят, если количество интегрина альфа V, обнаруженного в моче пациента, составляет не более 20 нг/мл.
7. Набор для проведения диагностики рака предстательной железы в цельной моче пациента, включающий по меньшей мере одно антитело или его функциональный фрагмент, специфичное к интегрину альфа V или его фрагменту.
8. Набор по п.7, представляющий собой тест-систему для проведения твердофазного иммуноферментного анализа.
10
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2017/000386 2017-06-02 2017-06-02 Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата WO2018222069A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000386 WO2018222069A1 (ru) 2017-06-02 2017-06-02 Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата
EP17911553.0A EP3633376A4 (en) 2017-06-02 2017-06-02 MARKER PROTEIN FOR PROSTATE CANCER DIAGNOSIS, METHOD OF MEASURING THE QUANTITY OF MARKER PROTEIN AND ALGORITHM FOR INTERPRETING THE RESULT
EA201992217A EA201992217A1 (ru) 2017-06-02 2017-06-02 Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000386 WO2018222069A1 (ru) 2017-06-02 2017-06-02 Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018222069A1 true WO2018222069A1 (ru) 2018-12-06

Family

ID=64454845

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000386 WO2018222069A1 (ru) 2017-06-02 2017-06-02 Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3633376A4 (ru)
EA (1) EA201992217A1 (ru)
WO (1) WO2018222069A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113287013A (zh) * 2019-01-04 2021-08-20 国立大学法人京都大学 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7897356B2 (en) 2008-11-12 2011-03-01 Caris Life Sciences Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
US20130196355A1 (en) 2008-01-25 2013-08-01 Hansabiomed Ou Method and a kit to quantify and qualify exosomes for diagnosis of prostate cancer and prostate hyperplasia
US20140296096A1 (en) * 2013-03-27 2014-10-02 Oslo Universitetssykehus Hf Prostate cancer markers and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130196355A1 (en) 2008-01-25 2013-08-01 Hansabiomed Ou Method and a kit to quantify and qualify exosomes for diagnosis of prostate cancer and prostate hyperplasia
US7897356B2 (en) 2008-11-12 2011-03-01 Caris Life Sciences Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
US20140296096A1 (en) * 2013-03-27 2014-10-02 Oslo Universitetssykehus Hf Prostate cancer markers and uses thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"UniProtKB", Database accession no. P06756-1
DERAS I. L. ET AL.: "PCA3: a molecular urine assay for predicting biopsy outcome", J UROL., vol. 179, no. 4, April 2008 (2008-04-01), pages 1587 - 92, XP022618579, DOI: 10.1016/j.juro.2007.11.038
KOO K. M. ET AL.: "Colorimetric TMPRSS2-ERG Gene Fusion Detection in Prostate Cancer Urinary Samples via Recombinase Polymerase Amplification", THERANOSTICS, vol. 6, no. 9, 15 June 2016 (2016-06-15), pages 1415 - 24
See also references of EP3633376A4 *
STAMEY TAYANG NHAY ARMCNEAL JEFREIHA FSREDWINE E: "Prostate-specific antigen as a serum marker for adenocarcinoma of the prostate", N ENGL J MED., vol. 317, no. 15, 8 October 1987 (1987-10-08), pages 909 - 16
ZHANG S. ET AL.: "A Cystine Knot Peptide Targeting Integrin alphanubeta6 for Photoacoustic and Fluorescence Imaging of Tumors in Living Subjects", J NUC MED., vol. 57, no. 10, 2016, pages 1629 - 1634, XP055558124 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113287013A (zh) * 2019-01-04 2021-08-20 国立大学法人京都大学 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法
CN113287013B (zh) * 2019-01-04 2025-04-15 国立大学法人京都大学 溃疡性大肠炎以及原发性硬化性胆管炎的检查方法

Also Published As

Publication number Publication date
EA201992217A1 (ru) 2020-04-01
EP3633376A1 (en) 2020-04-08
EP3633376A4 (en) 2020-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6096813B2 (ja) 乳癌診断用マルチバイオマーカーセット、その検出方法、及びそれに対する抗体を含む乳癌診断キット
CN108956968B (zh) 用于诊断增殖性紊乱的试剂盒的制备
WO2012154722A1 (en) Predictive biomarkers for prostate cancer
CN107110848B (zh) 以脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因作为指标使用的动脉硬化及癌的检测方法
AU2018402956B2 (en) Renal cancer detection method and test drug
CN112334487B (zh) 用于诊断和治疗癌症的组合物和方法
WO2018222069A1 (ru) Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата
EP4163634A1 (en) Method and reagent for detecting pancreatic cancers
EA045060B1 (ru) Белковый маркер для диагностики рака предстательной железы, способ измерения количества маркера и алгоритм интерпретации результата
US20120225441A1 (en) Protein markers for detecting liver cancer and method for identifying the markers thereof
JP2013063978A (ja) 抗ヒトｌａｔ１モノクローナル抗体及び前立腺がんの悪性度判定キット
US20210011020A1 (en) Integrin alpha v as a protein marker for diagnosing prostate cancer
AU2017346940B2 (en) Prognostic method and kits useful in said method
US20130095483A1 (en) Predictive biomarkers for breast cancer
JP2024066398A (ja) がんの検査方法、試薬、キット及び装置
CN115151821A (zh) 卵巢恶性肿瘤的检测方法和检测试剂

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17911553

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017911553

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017911553

Country of ref document: EP

Effective date: 20200102