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WO2018124617A1 - 세균 메타게놈 분석을 통한 폐암 진단 방법 - Google Patents

세균 메타게놈 분석을 통한 폐암 진단 방법 Download PDF

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Publication number
WO2018124617A1
WO2018124617A1 PCT/KR2017/015173 KR2017015173W WO2018124617A1 WO 2018124617 A1 WO2018124617 A1 WO 2018124617A1 KR 2017015173 W KR2017015173 W KR 2017015173W WO 2018124617 A1 WO2018124617 A1 WO 2018124617A1
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WO
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derived
lung cancer
bacteria
comparing
decrease
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/015173
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English (en)
French (fr)
Inventor
김윤근
전성규
Original Assignee
주식회사 엠디헬스케어
주식회사이언메딕스
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Publication date
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Priority to CN201780080645.2A priority patent/CN110382715B/zh
Priority to EP17888390.6A priority patent/EP3561069B1/en
Priority to JP2019534797A priority patent/JP6914551B2/ja
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Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing lung cancer through bacterial metagenomic analysis, and more specifically, to diagnose lung cancer by performing bacterial metagenomic analysis using a sample derived from a subject, analyzing the increase or decrease in the content of specific bacterial-derived extracellular vesicles. It is about how to.
  • Lung cancer is a malignant tumor originating from the lungs, and despite the advances in modern medicine, it is one of the leading cancer deaths in Korea with a 5-year survival rate of less than 50%.
  • Lung cancer is classified into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer according to the tissue type, and the small cell lung cancer has distinctive features that are distinguished from other types of lung cancer in terms of treatment and prognosis.
  • the results of histological examination are very important in determining the treatment policy.
  • Lung cancer has symptoms such as coughing, hemoptysis, chest pain, and dyspnea, but is often advanced by the time the symptoms appear, and there are often no symptoms even when they are in progress, and only 5-15% of patients with lung cancer have symptoms. In the absence of this condition, most patients will be diagnosed with lung cancer after symptoms appear. To date, there is no known screening method to detect lung cancer early before symptoms appear, and studies on early lung cancer screening using computed tomography (CT) of the chest area have been actively conducted. It has not been proven. Therefore, it is urgent to develop a method for early diagnosis of lung cancer and to improve treatment efficiency. Therefore, it is very important to differentiate the methods of early diagnosis and treatment by making it possible to predict the onset of lung cancer in advance. Research and technology development are required.
  • CT computed tomography
  • Microbiota refers to a microbial community including bacteria, archaea and eukarya that exist in a given settlement.Intestinal microbiota is an important role in human physiology. It is known to have a great effect on human health and disease through interaction with human cells.
  • the symbiotic bacteria secrete nanometer-sized vesicles to exchange information about genes and proteins in other cells.
  • the mucous membrane forms a physical protective film that particles larger than 200 nanometers (nm) in size can't pass through, so that the symbiotic bacteria cannot pass through the mucosa, but bacterial-derived vesicles are usually less than 100 nanometers in size. It freely speaks to the mucous membrane and is absorbed by our body.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • Metagenomics also called environmental genomics, is an analysis of the metagenomic data obtained from samples taken from the environment.
  • metagenomics was collectively referred to as the total genome of all microbial communities in the natural environment in which microbes exist.
  • First used by Jo bottlesman (Handelsman et al., 1998 Chem. Biol. 5, R245-249).
  • the next generation sequencing (NGS) platform enables the bacterial sequencing to be sequenced. Analyze
  • NGS next generation sequencing
  • the present inventors In order to diagnose the cause of lung cancer, the present inventors extracted a gene from bacteria-derived extracellular vesicles from blood, a sample derived from a subject, and performed a metagenome analysis on it, and as a result, it may act as a cause of lung cancer. Bacterial-derived extracellular vesicles were identified, which completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosing lung cancer through metagenome analysis of extracellular vesicles derived from bacteria.
  • the present invention provides a method for providing information for diagnosing lung cancer, comprising the following steps:
  • the present invention provides a lung cancer diagnostic method comprising the following steps:
  • the present invention also provides a method for predicting lung cancer risk, comprising the following steps:
  • lung cancer is compared to increase or decrease the content of one or more phylum bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Acidobacteria, and Chloroflexi compared to the sample derived from normal in step (c) It may be to diagnose.
  • lung cancer is compared by increasing or decreasing the content of one or more class bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Thermomicrobia, and Solibacteres, in comparison to a sample derived from a normal person in step (c). It may be to diagnose.
  • Turicbacterales, Rickettsiales, Alteromonadales, RF32, Thermales, JG30-KF-CM45, I025, Solibacterales, and Aeromonadales compared to the sample derived from normal in step (c) It may be to diagnose lung cancer by comparing the increase or decrease in the content of the above-order bacteria-derived extracellular vesicles.
  • Turicibacteraceae, Clostridiaceae, S24-7, Rhizobiaceae, mitochondria, F16, Gordoniaceae, Rhodospirillaceae, Thermaceae, Shewanellaceae, Ellin6075, Rs-045, and Aeromonadaceae Lung cancer may be diagnosed by comparing the increase or decrease in the content of one or more family bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of:
  • Chromohalobacter, Geobacillus, Proteus, Megamonas, Moraxella, Alloiococcus, Turicibacter, SMB53, Veillonella, Peptoniphilus, Comamonas, Hymenobacter, Citrobacter, Novosphingobium, Gordonia, Lung cancer may be diagnosed by comparing the increase or decrease in the content of one or more genus bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Aerococcus, Thermus, Shewanella, and Achromobacter.
  • the amount of one or more order bacterial-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Bacillales, Rickettsiales, and I025 is increased compared to the sample derived from chronic obstructive pulmonary disease in step (c). It may be to compare lung cancer to diagnose lung cancer.
  • the step (c) of the at least one family bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Staphylococcaceae, Nocardiaceae, and Rs-045 compared to the sample derived from chronic obstructive pulmonary disease By comparing the increase and decrease in content may be to diagnose lung cancer.
  • Lung cancer may be diagnosed by comparing the increase or decrease of the bacterial-derived extracellular vesicles.
  • Bacteroidia, Bacilli, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, Alphaproteobacteria, Fusobacteriia, TM7-3, Deinococci, Verrucomicrobiae, Saprospirae, Chloroplast, Cytophagia, Fimacidobacteria, compared to asthma-derived samples in step (c) Lung cancer may be diagnosed by comparing the increase or decrease of the content of one or more class bacteria-derived extracellular vesicles selected from the group consisting of Thermomicrobia, Thermoleophilia, and Solibacteres.
  • Helicobacteraceae Bacteroidaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bifidobacteriaceae, Barnesiellaceae, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Enterobacteriaceae, Porphyromonadaceae, Gemellpanto, Trichiaceae, Weeksellaceae , Moraxellaceae, Caulobacteraceae, Erythrobacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Neisseriaceae, Sphingobacteriaceae, Deinococcaceae, Aerococcaceae, Bartonellaceae, Micrococcaceae, Flavobacteriaceae, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae, Dietziaceae, Rhodocyclaceae, Xanthomonadaceae, Geodermatophilaceae, Actinomycetaceae, Methylobacteriaceae, Pse
  • the subject sample may be blood.
  • the blood may be whole blood, serum, plasma, or blood monocytes.
  • Extracellular vesicles secreted by the bacteria present in the environment can be absorbed directly into the body and directly affect cancer development, lung cancer is difficult to diagnose early because symptoms are difficult to effectively treat, the human-derived sample according to the present invention
  • the risk group of lung cancer can be diagnosed and predicted early and appropriate management can be delayed or prevented. Early diagnosis can reduce the incidence of lung cancer and increase the therapeutic effect.
  • metagenome analysis predicts causative factors in patients diagnosed with lung cancer, thereby avoiding exposure to causative factors and improving lung cancer progression or preventing recurrence.
  • Figure 1 is for evaluating the distribution of bacteria-derived extracellular vesicles in the body
  • Figure 1a after the administration of oral intestinal bacteria (Bacteria) and bacteria-derived vesicles (EV) in the mouth hourly (0, 5min, 3h, 6h, and 12h) is a photograph taken of their distribution
  • Figure 1b is 12 hours after the oral administration of intestinal bacteria (Bacteria) and bacteria-derived extracellular vesicles (EV) to the blood and various organs (heart, Lung, liver, kidney, spleen, adipose tissue, and muscles), and the photographs of the distribution of the bacterial and extracellular vesicles.
  • Figure 2 shows the distribution of bacteria-derived vesicles from lung cancer patients and normal blood, and the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) of significant diagnostic performance at the phylum level by performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 3 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the class level by separating the bacteria-derived vesicles from lung cancer patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • Figure 4 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the order (neck) level after separation of bacteria-derived vesicles in lung cancer patients and normal blood.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 5 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the family level by separating the bacteria-derived vesicles from lung cancer patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 6 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the genus level by separating bacteria-derived vesicles from lung cancer patients and normal blood, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 9 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) of significant diagnostic performance at the genus level by separating bacteria-derived vesicles in the blood of lung cancer patients and COPD patients, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • 11 is a result showing the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the class level by separating bacteria-derived vesicles in the blood of lung cancer and asthma patients, and performing a metagenome analysis.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • FIG. 13 shows the distribution of bacteria-derived vesicles (EVs) with significant diagnostic performance at the family level after separation of bacteria-derived vesicles from blood of lung cancer patients and asthma patients.
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • EVs bacteria-derived vesicles
  • the present invention relates to a method for diagnosing lung cancer through bacterial metagenome analysis.
  • the present inventors extracted a gene from a bacterial-derived extracellular vesicle using a sample derived from a subject, and performed a metagenome analysis on it, and a causative factor of lung cancer.
  • Bacterial-derived extracellular vesicles that can act as
  • the present invention comprises the steps of (a) extracting DNA from the extracellular vesicles isolated from the subject sample; (b) performing PCR using the primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 on the extracted DNA; And (c) comparing the increase or decrease in the content of the bacterial-derived extracellular vesicles with the normal-derived sample, a chronic obstructive pulmonary disease-derived sample, or an asthma-derived sample by sequencing the PCR product, for diagnosing lung cancer.
  • the term "diagnosis of lung cancer” refers to determining whether lung cancer is likely to develop, whether lung cancer is relatively high, or whether lung cancer has already occurred.
  • the method of the present invention can be used to prevent or delay the onset of the disease through special and appropriate management as a patient at high risk of developing lung cancer for any particular patient.
  • the methods of the present invention can be used clinically to determine treatment by early diagnosis of lung cancer and selecting the most appropriate treatment regimen.
  • the lung cancer diagnosis of the present invention has the advantage of simultaneously predicting lung cancer of various subspecies such as adenocarcinoma, small cell carcinoma, and squamous cell carcinoma.
  • metagenome used in the present invention, also referred to as “metagenome”, refers to the total of the genome including all viruses, bacteria, fungi, etc. in an isolated area such as soil, animal intestine, It is mainly used as a concept of genome explaining the identification of many microorganisms at once using sequencer to analyze microorganisms which are not cultured.
  • metagenome does not refer to one species of genome or genome, but refers to a kind of mixed dielectric as the genome of all species of one environmental unit. This is a term from the point of view of defining a species in the course of the evolution of biology in terms of functional species as well as various species that interact with each other to create a complete species.
  • rapid sequencing is used to analyze all DNA and RNA, regardless of species, to identify all species in one environment, and to identify interactions and metabolism.
  • metagenome analysis was preferably performed using bacterial-derived extracellular vesicles isolated from serum.
  • the subject sample may be blood, and the blood may preferably be whole blood, serum, plasma, or blood monocytes, but is not limited thereto.
  • metagenome analysis was performed on bacteria-derived extracellular vesicles in the blood of normal and lung cancer patients, including phylum, class, order, family, and genus. Each genus level was analyzed to identify bacterial vesicles that could actually cause lung cancer.
  • the result of analyzing the bacteria-derived metagenome at the genus level Chromohalobacter, Geobacillus, Proteus, Megamonas, Moraxella, Alloiococcus, Turicibacter, SMB53, Veillonella, Peptoniphilus, Comamonas, Hymenobacter, Citrobacter, Novosphingobium Bacteria-derived vesicles of the genus, Gordonia, Aerococcus, Thermus, Shewanella, and Achromobacter showed significant differences between lung cancer patients and normal individuals (see Example 4).
  • a metagenome analysis of extracellular vesicles derived from bacteria in blood of patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and lung cancer was performed.
  • Bacterial-derived vesicles were identified that could actually cause lung cancer in COPD patients by analyzing them at the,, order, family, and genus levels, respectively.
  • bacteria-derived metagenomes were analyzed at the genus level.
  • alloiococcus, Moraxella, Staphylococcus, Brevundimonas, Enhydrobacter, Comamonas, and Rhodococcus bacteria-derived vesicles were noted between lung cancer patients and COPD patients. There was one difference (see Example 5).
  • the metagenome analysis of extracellular vesicles derived from bacteria in the blood of asthma patients and lung cancer patients was performed, including phylum, class, order, family, Analyzes at the genus and genus levels, respectively, identified bacterial vesicles that can actually cause lung cancer in asthma patients.
  • the bacterium-derived metagenome at the gate level Bacteroidetes, Cyanobacteria, TM7, Fusobacteria, Thermi, Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, and Chloroflexi door bacteria-derived vesicles from lung cancer patients
  • Bacteroidetes Bacteroidetes
  • Cyanobacteria TM7
  • Fusobacteria Thermi
  • Verrucomicrobia Verrucomicrobia
  • Armatimonadetes Acidobacteria
  • Gemmatimonadetes Gemmatimonadetes
  • Chloroflexi door bacteria-derived vesicles from lung cancer patients
  • the bacterium-derived metagenome was analyzed at a river level, and as a result, Bacteroidia, Bacilli, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, Alphaproteobacteria, Fusobacteriia, TM7-3, Deinococci, Verrucomicrobiae, Saprospirae, Chloroplast, Cytophagia, Fimbriimonadia , Chloracidobacteria, Thermomicrobia, Thermoleophilia, and Solibacteres-derived vesicles showed significant differences between lung cancer patients and asthma patients (see Example 6).
  • the bacterial-derived metagenome was analyzed at the neck level. , Xanthomonadales, Fusobacteriales, Actinomycetales, Sphingomonadales, Verrucomicrobiales, Saprospirales, Rhizobiales, Bacillales, Streptophyta, Cytophagales, Thermales, Fimbriimonadales, CW040, Rickettsiales, RB41, Alteromonadales, JG30, K025-K025F-CMdale There was a significant difference between lung cancer and asthma patients (see Example 6).
  • the bacterial-derived metagenome was analyzed at an excessive level, and Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bifidobacteriaceae, Barnesiellaceae, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Enterobacteriaceae, Porphyromonadaceae, Gemellnobacteriaceaceae, Weeksellaceae , Leptotrichiaceae, Moraxellaceae, Caulobacteraceae, Erythrobacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Neisseriaceae, Sphingobacteriaceae, Deinococcaceae, Aerococcaceae, Bartonellaceae, Micrococcaceae, Flavobacteriaceae, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae, Dietziaceae, Rhodocyclaceae, Xanthomo
  • the present invention through the results of the above embodiment, by performing a metagenome analysis on the extracellular vesicles derived from bacteria from the blood, bacteria significantly changed in lung cancer patients compared to normal, COPD patients, and asthma patients Derived vesicles were identified, and metagenome analysis confirmed that lung cancer can be diagnosed by analyzing the increase and decrease of the content of bacterial-derived vesicles at each level.
  • the fluorescently labeled 50 ⁇ g of bacteria and bacteria-derived vesicles were administered in the same manner as above 12 hours.
  • Blood, Heart, Lung, Liver, Kidney, Spleen, Adipose tissue, and Muscle were extracted from mice.
  • the intestinal bacteria (Bacteria) were not absorbed into each organ, whereas the intestinal bacteria-derived extracellular vesicles (EV) were detected in the tissues, as shown in FIG. And distribution in liver, kidney, spleen, adipose tissue, and muscle.
  • the blood was first placed in a 10 ml tube and centrifuged (3,500 ⁇ g, 10 min, 4 ° C.) to settle the suspended solids to recover only the supernatant and then transferred to a new 10 ml tube. After removing the bacteria and foreign substances from the recovered supernatant using a 0.22 ⁇ m filter, transfer to centripreigugal filters (50 kD) and centrifuged at 1500 xg, 4 °C for 15 minutes to discard the material smaller than 50 kD and 10 ml Concentrated until.
  • centripreigugal filters 50 kD
  • PCR was performed using the 16S rDNA primer shown in Table 1 to amplify the gene and perform sequencing (Illumina MiSeq sequencer). Output the result as a Standard Flowgram Format (SFF) file, convert the SFF file into a sequence file (.fasta) and a nucleotide quality score file using GS FLX software (v2.9), check the credit rating of the lead, and window (20 bps) The part with the average base call accuracy of less than 99% (Phred score ⁇ 20) was removed.
  • SFF Standard Flowgram Format
  • the Operational Taxonomy Unit performed UCLUST and USEARCH for clustering according to sequence similarity. Specifically, the clustering is based on 94% genus, 90% family, 85% order, 80% class, and 75% sequence similarity. OTU's door, river, neck, family and genus level classifications were performed, and bacteria with greater than 97% sequence similarity were analyzed using BLASTN and GreenGenes' 16S DNA sequence database (108,453 sequences) (QIIME).
  • Example 3 By the method of Example 3, the vesicles were isolated from the blood of 318 lung cancer patients and 234 normal people with age and sex matched with metagenome sequencing. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • Example 3 By the method of Example 3, vesicles were isolated from the blood of 319 patients with lung cancer and 208 patients with COPD, and then metagenome sequencing was performed. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • Example 6 Lung Cancer Diagnosis Model Based on Bacterial-Derived Vesicle Metagenome Analysis Isolated from Blood of Asthma and Lung Cancer Patients
  • Example 3 By the method of Example 3, vesicles were isolated from the blood of 308 lung cancer patients and 277 asthma patients, and then metagenome sequencing was performed. In the development of the diagnostic model, the strains whose p-value between the two groups is 0.05 or less and more than two times different between the two groups are selected in the t-test. under curve), sensitivity, and specificity.
  • asthma Lung cancer t-test Training set Test set Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity c__Bacteroidia 0.1736 0.0514 0.0661 0.0380 0.0000 0.38 0.97 0.89 0.94 0.95 0.88 0.94 c__Bacilli 0.0611 0.0408 0.1404 0.0728 0.0000 2.30 0.92 0.81 0.91 0.91 0.85 0.91 c__Flavobacteriia 0.0018 0.0066 0.0055 0.0088 0.0000 3.07 0.86 0.62 0.86 0.80 0.72 0.86 c__Sphingobacteriia 0.0004 0.0011 0.0014 0.0042 0.0000 3.74 0.81 0.62 0.85 0.76 0.66 0.85 c___Alphaproteobacteria 0.0163 0.0323 0.0700 0.0453 0.0000 4.29 0.95 0.82 0.91 0.92 0.85 0.91 c__Fusobacteriia 0.0009 0.0029 0.0047 0.00
  • asthma Lung cancer t-test Training set Test set Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity o__YS2 0.0007 0.0014 0.0001 0.0009 0.0000 0.16 0.81 0.64 0.86 0.81 0.66 0.75 o__Turicibacterales 0.0017 0.0053 0.0004 0.0017 0.0009 0.25 0.80 0.62 0.86 0.77 0.65 0.74 o__Bifidobacteriales 0.0627 0.0335 0.0164 0.0144 0.0000 0.26 0.95 0.85 0.95 0.92 0.82 0.88 o__Bacteroidales 0.1736 0.0514 0.0661 0.0380 0.0000 0.38 0.97 0.89 0.94 0.95 0.88 0.92 o__Enterobacteriales 0.2091 0.0878 0.0983 0.0629 0.0000 0.47 0.91 0.78 0.91 0.91 0.81 0.85 o__Rhodobacterales 0.0034 0.0237 0.0080 0.0125 0.0092 2.
  • asthma Lung cancer t-test Training set Test set Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity g__Trabulsiella 0.0007 0.0012 0.0000 0.0002 0.0000 0.04 0.92 0.75 0.92 0.91 0.82 0.89 g__Enterobacter 0.0016 0.0013 0.0002 0.0018 0.0000 0.11 0.93 0.77 0.93 0.91 0.79 0.87 g__Veillonella 0.0243 0.0248 0.0035 0.0054 0.0000 0.14 0.94 0.82 0.91 0.93 0.84 0.87 g__Bifidobacterium 0.0623 0.0336 0.0123 0.0120 0.0000 0.20 0.96 0.87 0.96 0.95 0.82 0.92 g___Lachnospira 0.0037 0.0130 0.0008 0.0022 0.0013 0.23 0.86 0.67 0.87 0.82 0.72 0.78 g___Comamonas 0.0031 0.0091 0.0007 0.0023 0.0002 0.23 0.
  • Predicting the risk of developing lung cancer through metagenomic analysis of bacteria or bacteria-derived extracellular parcels using a human-derived sample according to the present invention early diagnosis and prediction of risk groups of lung cancer are delayed or developed through appropriate management. It can prevent the disease and early diagnosis even after the disease, which can lower the incidence of lung cancer and increase the therapeutic effect.
  • metagenome analysis predicts causative factors in patients diagnosed with lung cancer, thereby avoiding exposure to causative factors and improving lung cancer progression or preventing recurrence.

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Abstract

본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 폐암을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다. 환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 폐암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 유래 세포밖　소포에 존재하는 유전자에 대하여 메타게놈 분석을 통해 폐암 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 폐암의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 폐암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다.

Description

세균 메타게놈 분석을 통한 폐암 진단 방법
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 폐암을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 메타게놈 분석을 수행하여 특정 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 분석함으로써 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.
폐암은 폐에서 기원한 악성 종양으로, 현대의학의 발전에도 불구하고 5년 생존율이 50%도 되지 않는 국내 사망원인 1위로 꼽히는 암이다. 폐암은 조직형에 따라 크게 소세포폐암(small cell lung cancer)과 비소세포폐암(non-small cell lung cancer)으로 구분되며, 상기 소세포폐암은 치료법과 예후 면에서 다른 종류의 폐암과 확연히 구분되는 특징을 가지기 때문에 폐암은 조직학적 검사의 결과가 치료방침의 결정에 매우 중요하다.
폐암은 기침, 객혈, 흉통, 및 호흡곤란 등의 증상을 나타내나, 증상이 나타날 때쯤이면 이미 진행되는 경우가 많고, 진행 중이더라도 증상이 없는 경우가 흔히 나타나며, 폐암 환자의 5~15%만이 증상이 없을 때에 진단을 받게 되며 대부분은 증상이 나타난 뒤에 폐암으로 진단받게 된다. 현재까지 증상이 나타나기 전에 폐암을 조기에 발견할 수 있는 공인된 선별검사 방법이 없는 실정이며, 가슴 부위의 전산화 단층촬영(CT)을 이용한 폐암 조기 검진에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으나, 아직 유효성이 입증되지 못하였다. 따라서 폐암을 조기에 진단하여 치료 효율을 높일 수 있는 방법의 개발이 시급한 실정이며, 이에 앞서 폐암의 발병 여부를 미리 예측 가능하게 함으로써 조기진단 및 치료에 대한 대응방법을 차별화하는 것은 매우 중요하므로, 이에 대한 연구 및 기술개발이 요구된다.
한편, 인체에 공생하는 미생물은 100조에 이르러 인간 세포보다 10배 많으며, 미생물의 유전자수는 인간 유전자수의 100배가 넘는 것으로 알려지고 있다. 미생물총(microbiota 혹은 microbiome)은 주어진 거주지에 존재하는 세균(bacteria), 고세균(archaea), 진핵생물(eukarya)을 포함한 미생물 군집(microbial community)을 말하고, 장내 미생물총은 사람의 생리현상에 중요한 역할을 하며, 인체 세포와 상호작용을 통해 인간의 건강과 질병에 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 우리 몸에 공생하는 세균은 다른 세포로의 유전자, 단백질 등의 정보를 교환하기 위하여 나노미터 크기의 소포(vesicle)를 분비한다. 점막은 200 나노미터(nm) 크기 이상의 입자는 통과할 수 없는 물리적인 방어막을 형성하여 점막에 공생하는 세균인 경우에는 점막을 통과하지 못하지만, 세균 유래 소포는 크기가 대개 100 나노미터 크기 이하라서 비교적 자유롭게 점막을 통화하여 우리 몸에 흡수된다.
폐암의 발생과 관련해선 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)이 중요한 위험인자이고, 임상연구에서는 흡연과 상관없이 만성폐쇄성폐질환 자체가 폐암 발생의 중요한 위험인자라는 사실이 보고되었다. 또한 최근 비흡연자에서 폐암 발생이 증가한다는 사실은 폐암 발생에 흡연 이외에도 폐암 발생을 유발하는 원인인자가 존재함을 시사한다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있으며, 미생물이 존재하는 자연환경에서의 모든 미생물 군집의 총 게놈(genome)을 통칭하는 의미로 1998년 Jo Handelsman에 의해서 처음 사용되었다(Handelsman et al., 1998 Chem. Biol. 5, R245-249). 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 차세대 염기서열분석 (next generation sequencing, NGS) 플랫폼을 통하여 세균의 염기서열을 분석한다. 그러나 폐암 발병에 있어서, 혈액 등의 인체 유래물에서 세균 유래 소포에 존재하는 메타게놈 분석을 통해 폐암의 원인인자를 동정하고 폐암을 예측하는 방법에 대해서는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 폐암의 원인인자를 기반으로 진단하기 위하여, 피검체 유래 샘플인 혈액에서 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 그 결과 폐암의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 통해 폐암을 진단하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플, 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플, 또는 천식환자 유래 샘플과, 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
그리고, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 폐암 진단방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플, 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플, 또는 천식환자 유래 샘플과, 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 폐암 발병 위험도 예측방법을 제공한다 :
(a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플, 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플, 또는 천식환자 유래 샘플과, 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계.
본 발명의 일구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Acidobacteria, 및 Chloroflexi로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Thermomicrobia, 및 Solibacteres로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Turicibacterales, Rickettsiales, Alteromonadales, RF32, Thermales, JG30-KF-CM45, I025, Solibacterales, 및 Aeromonadales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Turicibacteraceae, Clostridiaceae, S24-7, Rhizobiaceae, mitochondria, F16, Gordoniaceae, Rhodospirillaceae, Thermaceae, Shewanellaceae, Ellin6075, Rs-045, 및 Aeromonadaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Chromohalobacter, Geobacillus, Proteus, Megamonas, Moraxella, Alloiococcus, Turicibacter, SMB53, Veillonella, Peptoniphilus, Comamonas, Hymenobacter, Citrobacter, Novosphingobium, Gordonia, Aerococcus, Thermus, Shewanella, 및 Achromobacter로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Bacillales, Rickettsiales, 및 I025로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Staphylococcaceae, Nocardiaceae, 및 Rs-045로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Alloiococcus, Moraxella, Staphylococcus, Brevundimonas, Enhydrobacter, Comamonas, 및 Rhodococcus로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Bacteroidetes, Cyanobacteria, TM7, Fusobacteria, Thermi, Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, 및 Chloroflexi로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Bacteroidia, Bacilli, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, Alphaproteobacteria, Fusobacteriia, TM7-3, Deinococci, Verrucomicrobiae, Saprospirae, Chloroplast, Cytophagia, Fimbriimonadia, Chloracidobacteria, Thermomicrobia, Thermoleophilia, 및 Solibacteres로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 YS2, Turicibacterales, Bifidobacteriales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Rhodobacterales, Gemellales, Flavobacteriales, Caulobacterales, Neisseriales, Sphingobacteriales, Deinococcales, Pseudomonadales, Rhodocyclales, Xanthomonadales, Fusobacteriales, Actinomycetales, Sphingomonadales, Verrucomicrobiales, Saprospirales, Rhizobiales, Bacillales, Streptophyta, Cytophagales, Thermales, Fimbriimonadales, CW040, Rickettsiales, RB41, Alteromonadales, JG30-KF-CM45, I025, Aeromonadales, 및 Solibacterales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bifidobacteriaceae, Barnesiellaceae, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Enterobacteriaceae, Porphyromonadaceae, Gemellaceae, Weeksellaceae, Carnobacteriaceae, Leptotrichiaceae, Moraxellaceae, Caulobacteraceae, Erythrobacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Neisseriaceae, Sphingobacteriaceae, Deinococcaceae, Aerococcaceae, Bartonellaceae, Micrococcaceae, Flavobacteriaceae, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae, Dietziaceae, Rhodocyclaceae, Xanthomonadaceae, Geodermatophilaceae, Actinomycetaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Corynebacteriaceae, Staphylococcaceae, Nocardioidaceae, Verrucomicrobiaceae, Sphingomonadaceae, Mycobacteriaceae, Tissierellaceae, Chitinophagaceae, Intrasporangiaceae, Propionibacteriaceae, Aurantimonadaceae, Planococcaceae, Fusobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae, Nocardiaceae, Dermabacteraceae, Bacillaceae, Thermaceae, Ellin6075, Brevibacteriaceae, Microbacteriaceae, Rhodospirillaceae, Cytophagaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Chromatiaceae, Rhizobiaceae, Gordoniaceae, mitochondria, Pseudonocardiaceae, Exiguobacteraceae, Shewanellaceae, F16, Rs-045, 및 Aeromonadaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Trabulsiella, Enterobacter, Veillonella, Bifidobacterium, Lachnospira, Comamonas, Bacteroides, Turicibacter, Sutterella, Klebsiella, SMB53, Roseburia, Dialister, Ruminococcus, Parabacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Eubacterium, Dorea, Enhydrobacter, Granulicatella, Chryseobacterium, Porphyromonas, Coprococcus, Peptoniphilus, Microbispora, Deinococcus, Acinetobacter, Aerococcus, Actinomyces, Brevundimonas, Blastomonas, Citrobacter, Lactobacillus, Stenotrophomonas, Corynebacterium, Pseudomonas, Lautropia, Akkermansia, Staphylococcus, Bacillus, Sphingobacterium, Anaerococcus, Neisseria, Leptotrichia, Mycobacterium, Kocuria, Methylobacterium, Propionibacterium, Hymenobacter, Sphingomonas, Fusobacterium, Brachybacterium, Rhodococcus, Micrococcus, Kaistobacter, Finegoldia, Rubellimicrobium, Brevibacterium, Agrobacterium, Dietzia, Fimbriimonas, Flavobacterium, Dermacoccus, Skermanella, Novosphingobium, Gordonia, Rheinheimera, Achromobacter, Hydrogenophilus, Thermus, Exiguobacterium, Shewanella, Ralstonia, 및 Alkanindiges로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하여 폐암을 진단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 피검체 샘플은 혈액일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있다.
환경에 존재하는 세균에서 분비되는 세포밖 소포는 체내에 흡수되어 암 발생에 직접적인 영향을 미칠 수 있으며, 폐암은 증상이 나타나기 전 조기진단이 어려워 효율적인 치료가 어려운 실정이므로, 본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 또는 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 폐암 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 폐암의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 폐암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 폐암으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자를 예측하여, 원인인자에 대한 노출을 피함으로써 폐암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.
도 1은 체내에서 세균 유래 세포밖 소포의 분포양상을 평가하기 위한 것으로, 도 1a는 마우스에 장내 세균(Bacteria) 및 세균 유래 소포(EV)를 구강으로 투여한 후 시간별(0, 5min, 3h, 6h, 및 12h)로 이들의 분포양상을 촬영한 사진이고, 도 1b는 마우스에 장내 세균(Bacteria) 및 세균 유래 세포밖 소포(EV)를 구강으로 투여하고 12시간 후 혈액 및 다양한 장기(심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육)를 적출하여 상기 세균 및 세포밖 소포의 분포양상을 촬영한 사진이다.
도 2는 폐암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 3은 폐암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 4는 폐암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 5는 폐암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 6은 폐암환자 및 정상인 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 7은 폐암환자 및 COPD환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 8은 폐암환자 및 COPD환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 9는 폐암환자 및 COPD환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 10은 폐암환자 및 천식환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 문(phylum) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 11은 폐암환자 및 천식환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 강(class) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 12는 폐암환자 및 천식환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 목(order) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 13은 폐암환자 및 천식환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 과(family) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
도 14는 폐암환자 및 천식환자 혈액에서 세균 유래 소포를 분리한 후, 메타게놈 분석을 수행하여 속(genus) 수준에서 진단적 성능이 유의한 세균 유래 소포(EVs)의 분포를 나타낸 결과이다.
본 발명은 세균 메타게놈 분석을 통해 폐암을 진단하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명자들은 피검체 유래 샘플을 이용해 세균 유래 세포밖 소포로부터 유전자를 추출하고 이에 대하여 메타게놈 분석을 수행하였으며, 폐암의 원인인자로 작용할 수 있는 세균 유래 세포밖 소포를 동정하였다.
이에, 본 발명은 (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계; (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플, 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플, 또는 천식환자 유래 샘플과, 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "폐암 진단" 이란 환자에 대하여 폐암이 발병할 가능성이 있는지, 폐암이 발병할 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 폐암이 이미 발병하였는지 여부를 판별하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법은 임의의 특정 환자에 대한 폐암 발병 위험도가 높은 환자로써 특별하고 적절한 관리를 통하여 발병 시기를 늦추거나 발병하지 않도록 하는데 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 폐암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료방식을 선택함으로써 치료를 결정하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 폐암 진단은, 선암(adenocarcinoma), 소세포폐암(small cell carcinoma), 및 편평상피암(squamous cell carcinoma)과 같은 다양한 아종의 폐암을 동시에 예측할 수 있는 장점을 가지는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "메타게놈(metagenome)"이란 "군유전체"라고도 하며, 흙, 동물의 장 등 고립된 지역 내의 모든 바이러스, 세균, 곰팡이 등을 포함하는 유전체의 총합을 의미하는 것으로, 주로 배양이 되지 않는 미생물을 분석하기 위해서 서열분석기를 사용하여 한꺼번에 많은 미생물을 동정하는 것을 설명하는 유전체의 개념으로 쓰인다. 특히, 메타게놈은 한 종의 게놈 또는 유전체를 말하는 것이 아니라, 한 환경단위의 모든 종의 유전체로서 일종의 혼합유전체를 말한다. 이는 오믹스적으로 생물학이 발전하는 과정에서 한 종을 정의할 때 기능적으로 기존의 한 종뿐만 아니라, 다양한 종이 서로 상호작용하여 완전한 종을 만든다는 관점에서 나온 용어이다. 기술적으로는 빠른 서열분석법을 이용해서, 종에 관계없이 모든 DNA, RNA를 분석하여, 한 환경 내에서의 모든 종을 동정하고, 상호작용, 대사작용을 규명하는 기법의 대상이다. 본 발명에서는 바람직하게 혈청에서 분리한 세균 유래 세포밖　소포를 이용하여 메타게놈 분석을 실시하였다.
본 발명에 있어서, 상기 피검체 샘플은 혈액 일 수 있고, 상기 혈액은 바람직하게 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서는 정상인과 폐암환자의 혈액 내 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 폐암 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Acidobacteria, 및 Chloroflexi 문 세균 유래 소포가 폐암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Thermomicrobia, 및 Solibacteres 강 세균 유래 소포가 폐암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Turicibacterales, Rickettsiales, Alteromonadales, RF32, Thermales, JG30-KF-CM45, I025, Solibacterales, 및 Aeromonadales 목 세균 유래 소포가 폐암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Turicibacteraceae, Clostridiaceae, S24-7, Rhizobiaceae, mitochondria, F16, Gordoniaceae, Rhodospirillaceae, Thermaceae, Shewanellaceae, Ellin6075, Rs-045, 및 Aeromonadaceae 과 세균 유래 소포가 폐암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Chromohalobacter, Geobacillus, Proteus, Megamonas, Moraxella, Alloiococcus, Turicibacter, SMB53, Veillonella, Peptoniphilus, Comamonas, Hymenobacter, Citrobacter, Novosphingobium, Gordonia, Aerococcus, Thermus, Shewanella, 및 Achromobacter 속 세균 유래 소포가 폐암환자와 정상인 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 만성폐쇄성폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)환자와 폐암환자의 혈액 내 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 COPD환자에서 폐암 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, Bacillales, Rickettsiales, 및 I025 목 세균 유래 소포가 폐암환자와 COPD환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Staphylococcaceae, Nocardiaceae, 및 Rs-045 과 세균 유래 소포가 폐암환자와 COPD환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Alloiococcus, Moraxella, Staphylococcus, Brevundimonas, Enhydrobacter, Comamonas, 및 Rhodococcus 속 세균 유래 소포가 폐암환자와 COPD환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 천식환자와 폐암환자의 혈액 내 세균 유래 세포밖 소포에 대한 메타게놈 분석을 실시하였으며, 문(phylum), 강(class), 목(order), 과(family), 및 속(genus) 수준에서 각각 분석하여 실제로 천식환자에서 폐암 발생의 원인으로 작용할 수 있는 세균 유래 소포를 동정하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 문 수준에서 분석한 결과, Bacteroidetes, Cyanobacteria, TM7, Fusobacteria, Thermi, Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, 및 Chloroflexi 문 세균 유래 소포가 폐암환자와 천식환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 강 수준에서 분석한 결과, Bacteroidia, Bacilli, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, Alphaproteobacteria, Fusobacteriia, TM7-3, Deinococci, Verrucomicrobiae, Saprospirae, Chloroplast, Cytophagia, Fimbriimonadia, Chloracidobacteria, Thermomicrobia, Thermoleophilia, 및 Solibacteres 강 세균 유래 소포가 폐암환자와 천식환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 목 수준에서 분석한 결과, YS2, Turicibacterales, Bifidobacteriales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Rhodobacterales, Gemellales, Flavobacteriales, Caulobacterales, Neisseriales, Sphingobacteriales, Deinococcales, Pseudomonadales, Rhodocyclales, Xanthomonadales, Fusobacteriales, Actinomycetales, Sphingomonadales, Verrucomicrobiales, Saprospirales, Rhizobiales, Bacillales, Streptophyta, Cytophagales, Thermales, Fimbriimonadales, CW040, Rickettsiales, RB41, Alteromonadales, JG30-KF-CM45, I025, Aeromonadales, 및 Solibacterales 목 세균 유래 소포가 폐암환자와 천식환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 과 수준에서 분석한 결과, Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bifidobacteriaceae, Barnesiellaceae, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Enterobacteriaceae, Porphyromonadaceae, Gemellaceae, Weeksellaceae, Carnobacteriaceae, Leptotrichiaceae, Moraxellaceae, Caulobacteraceae, Erythrobacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Neisseriaceae, Sphingobacteriaceae, Deinococcaceae, Aerococcaceae, Bartonellaceae, Micrococcaceae, Flavobacteriaceae, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae, Dietziaceae, Rhodocyclaceae, Xanthomonadaceae, Geodermatophilaceae, Actinomycetaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Corynebacteriaceae, Staphylococcaceae, Nocardioidaceae, Verrucomicrobiaceae, Sphingomonadaceae, Mycobacteriaceae, Tissierellaceae, Chitinophagaceae, Intrasporangiaceae, Propionibacteriaceae, Aurantimonadaceae, Planococcaceae, Fusobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae, Nocardiaceae, Dermabacteraceae, Bacillaceae, Thermaceae, Ellin6075, Brevibacteriaceae, Microbacteriaceae, Rhodospirillaceae, Cytophagaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Chromatiaceae, Rhizobiaceae, Gordoniaceae, mitochondria, Pseudonocardiaceae, Exiguobacteraceae, Shewanellaceae, F16, Rs-045, 및 Aeromonadaceae 과 세균 유래 소포가 폐암환자와 천식환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 세균 유래 메타게놈을 속 수준에서 분석한 결과, Trabulsiella, Enterobacter, Veillonella, Bifidobacterium, Lachnospira, Comamonas, Bacteroides, Turicibacter, Sutterella, Klebsiella, SMB53, Roseburia, Dialister, Ruminococcus, Parabacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Eubacterium, Dorea, Enhydrobacter, Granulicatella, Chryseobacterium, Porphyromonas, Coprococcus, Peptoniphilus, Microbispora, Deinococcus, Acinetobacter, Aerococcus, Actinomyces, Brevundimonas, Blastomonas, Citrobacter, Lactobacillus, Stenotrophomonas, Corynebacterium, Pseudomonas, Lautropia, Akkermansia, Staphylococcus, Bacillus, Sphingobacterium, Anaerococcus, Neisseria, Leptotrichia, Mycobacterium, Kocuria, Methylobacterium, Propionibacterium, Hymenobacter, Sphingomonas, Fusobacterium, Brachybacterium, Rhodococcus, Micrococcus, Kaistobacter, Finegoldia, Rubellimicrobium, Brevibacterium, Agrobacterium, Dietzia, Fimbriimonas, Flavobacterium, Dermacoccus, Skermanella, Novosphingobium, Gordonia, Rheinheimera, Achromobacter, Hydrogenophilus, Thermus, Exiguobacterium, Shewanella, Ralstonia, 및 Alkanindiges 속 세균 유래 소포가 폐암환자와 천식환자 사이에 유의한 차이가 있었다(실시예 6 참조).
본 발명은 상기와 같은 실시예 결과를 통해, 혈액으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포에 대하여 메타게놈 분석을 실시함으로써 정상인, COPD환자, 및 천식환자와 비교하여 폐암환자에서 함량이 유의하게 변화한 세균 유래 소포들을 동정하였으며, 메타게놈 분석을 통해 상기 각 수준에서 세균 유래 소포들의 함량 증감을 분석함으로써 폐암을 진단할 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 장내 세균 및 세균 유래 소포의 체내 흡수, 분포, 및 배설 양상 분석
장내 세균과 세균 유래 소포가 위장관을 통해 전신적으로 흡수되는 지를 평가하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 마우스의 위장에 형광으로 표지한 장내세균과 장내 세균 유래 소포를 각각 50 μg의 용량으로 위장관으로 투여하고 0분, 5분, 3시간, 6시간, 12시간 후에 형광을 측정하였다. 마우스 전체 이미지를 관찰한 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 세균(Bacteria)인 경우에는 전신적으로 흡수되지 않았지만, 세균 유래 소포(EV)인 경우에는, 투여 후 5분에 전신적으로 흡수되었고, 투여 3시간 후에는 방광에 형광이 진하게 관찰되어, 소포가 비뇨기계로 배설됨을 알 수 있었다. 또한, 소포는 투여 12시간까지 체내에 존재함을 알 수 있었다.
장내세균과 장내 세균유래 소포가 전신적으로 흡수된 후, 여러 장기로 침윤된 양상을 평가하기 위하여, 형광으로 표지한 50 μg의 세균과 세균유래 소포를 상기의 방법과 같이 투여한 다음 12시간째에 마우스로부터 혈액(Blood), 심장(Heart), 폐(Lung), 간(Liver), 신장(Kidney), 비장(Spleen), 지방조직(Adipose tissue), 및 근육(Muscle)을 적출하였다. 상기 적출한 조직들에서 형광을 관찰한 결과, 도1b에 나타낸 바와 같이, 상기 장내 세균(Bacteria)은 각 장기에 흡수되지 않은 반면, 상기 장내 세균 유래 세포밖 소포(EV)는 혈액, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 지방조직, 및 근육에 분포하는 것을 확인하였다.
실시예 2. 혈액으로부터 소포 분리 및 DNA 추출
혈액으로부터 소포를 분리하고 DNA를 추출하기 위해, 먼저 10 ㎖ 튜브에 혈액을 넣고 원심분리(3,500 x g, 10min, 4℃)를 실시하여 부유물을 가라앉혀 상등액만을 회수한 후 새로운 10 ㎖ 튜브에 옮겼다. 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 상기 회수한 상등액으로부터 세균 및 이물질을 제거한 후, 센트리프랩튜브(centripreigugal filters 50 kD)에 옮기고 1500 x g, 4℃에서 15분간 원심분리하여 50 kD 보다 작은 물질은 버리고 10 ㎖까지 농축 시켰다. 다시 한 번 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 박테리아 및 이물질을 제거한 후, Type 90ti 로터로 150,000 x g, 4℃에서 3시간 동안 초고속원심분리방법을 사용하여 상등액을 버리고 덩어리진 pellet을 생리식염수(PBS)로 녹여 소포를 수득하였다.
상기 방법에 따라 혈액으로부터 분리한 소포 100 ㎕를 100℃에서 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 한 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 다음으로 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 x g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액 만을 모은 후 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 이후 상기 추출된 DNA에 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 하기 표 1에 나타낸 16s rDNA primer로 PCR을 수행하여 상기 추출된 유전자에 세균 유래 유전자가 존재하는 것을 확인하였다.
primer 서열 서열번호
16S rDNA 16S_V3_F 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3' 1
16S_V4_R 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3 2
실시예 3. 혈액 내 소포에서 추출한 DNA를 이용한 메타게놈 분석
상기 실시예 2의 방법으로 유전자를 추출한 후, 상기 표1에 나타낸 16S rDNA 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 유전자를 증폭시키고 시퀀싱(Illumina MiSeq sequencer)을 수행하였다. 결과를 Standard Flowgram Format(SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software(v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일(.fasta)과 nucleotide quality score 파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window(20 bps) 평균 base call accuracy가 99% 미만(Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였으며(Sickle version 1.33), 결과 분석을 위해 Operational Taxonomy Unit(OTU)은 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하였다. 구체적으로 속(genus)은 94%, 과(family)는 90%, 목(order)은 85%, 강(class)은 80%, 문(phylum)은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OTU의 문, 강, 목, 과, 속 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S DNA 시퀀스 데이터베이스(108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도 갖는 박테리아를 분석하였다(QIIME).
실시예 4. 정상인과 폐암환자 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 폐암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 폐암환자 318명과 나이와 성별을 매칭한 정상인 234명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Acidobacteria, 및 Chloroflexi 문 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 2 및 도 2 참조).
　 정상인 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
p__Acidobacteria 0.0010 0.0034 0.0029 0.0084 0.0002 2.92 0.73 0.79 0.53 0.71 0.76 0.55
p__Chloroflexi 0.0007 0.0030 0.0022 0.0047 0.0000 3.03 0.72 0.78 0.54 0.76 0.74 0.61
혈액 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Thermomicrobia, 및 Solibacteres 강 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 3 및 도 3 참조).
　 정상인 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
c__Thermomicrobia 0.0004 0.0014 0.0012 0.0033 0.0000 3.38 0.72 0.77 0.54 0.74 0.75 0.64
c__Solibacteres 0.0002 0.0018 0.0013 0.0051 0.0005 5.43 0.73 0.81 0.55 0.71 0.76 0.53
혈액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Turicibacterales, Rickettsiales, Alteromonadales, RF32, Thermales, JG30-KF-CM45, I025, Solibacterales, 및 Aeromonadales 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 4 및 도 4 참조).
　 정상인 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
o__Turicibacterales 0.0017 0.0033 0.0004 0.0017 0.0000 0.25 0.76 0.75 0.63 0.74 0.69 0.70
o__Rickettsiales 0.0014 0.0053 0.0034 0.0089 0.0006 2.36 0.70 0.75 0.54 0.72 0.71 0.58
o__Alteromonadales 0.0008 0.0023 0.0022 0.0081 0.0032 2.71 0.70 0.76 0.56 0.72 0.69 0.59
o__RF32 0.0002 0.0008 0.0005 0.0021 0.0082 3.07 0.70 0.77 0.56 0.72 0.70 0.57
o__Thermales 0.0006 0.0022 0.0017 0.0039 0.0000 3.10 0.71 0.78 0.56 0.75 0.76 0.59
o__JG30-KF-CM45 0.0003 0.0014 0.0011 0.0033 0.0000 3.49 0.72 0.78 0.55 0.74 0.75 0.64
o__I025 0.0004 0.0021 0.0019 0.0059 0.0000 4.36 0.73 0.81 0.56 0.72 0.73 0.55
o__Solibacterales 0.0002 0.0018 0.0013 0.0051 0.0005 5.43 0.73 0.81 0.55 0.71 0.76 0.53
o__Aeromonadales 0.0007 0.0029 0.0056 0.0320 0.0077 7.88 0.71 0.79 0.55 0.72 0.72 0.55
혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Turicibacteraceae, Clostridiaceae, S24-7, Rhizobiaceae, mitochondria, F16, Gordoniaceae, Rhodospirillaceae, Thermaceae, Shewanellaceae, Ellin6075, Rs-045, 및 Aeromonadaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 5 및 도 5 참조).
　 정상인 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
f__Turicibacteraceae 0.0017 0.0033 0.0004 0.0017 0.0000 0.25 0.76 0.75 0.63 0.74 0.69 0.70
f__Clostridiaceae 0.0191 0.0450 0.0059 0.0078 0.0000 0.31 0.73 0.75 0.59 0.76 0.71 0.64
f__S24-7 0.0046 0.0119 0.0020 0.0040 0.0000 0.44 0.69 0.75 0.55 0.71 0.69 0.59
f__Rhizobiaceae 0.0058 0.0082 0.0118 0.0150 0.0000 2.02 0.72 0.77 0.52 0.77 0.75 0.63
f__mitochondria 0.0013 0.0053 0.0027 0.0081 0.0065 2.12 0.69 0.75 0.56 0.72 0.69 0.59
f__F16 0.0007 0.0032 0.0016 0.0040 0.0012 2.23 0.71 0.78 0.56 0.72 0.72 0.55
f__Gordoniaceae 0.0005 0.0024 0.0013 0.0048 0.0048 2.63 0.70 0.78 0.56 0.73 0.71 0.59
f__Rhodospirillaceae 0.0006 0.0022 0.0015 0.0062 0.0088 2.70 0.70 0.77 0.58 0.71 0.69 0.58
f__Thermaceae 0.0006 0.0022 0.0017 0.0039 0.0000 3.10 0.71 0.78 0.56 0.75 0.76 0.59
f__Shewanellaceae 0.0003 0.0012 0.0009 0.0040 0.0093 3.30 0.70 0.76 0.56 0.72 0.70 0.58
f__Ellin6075 0.0001 0.0009 0.0005 0.0018 0.0020 3.73 0.71 0.77 0.56 0.73 0.71 0.57
f__Rs-045 0.0004 0.0021 0.0017 0.0058 0.0001 4.22 0.72 0.81 0.54 0.72 0.73 0.55
f__Aeromonadaceae 0.0007 0.0029 0.0056 0.0320 0.0075 8.15 0.71 0.79 0.55 0.72 0.72 0.55
혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Chromohalobacter, Geobacillus, Proteus, Megamonas, Moraxella, Alloiococcus, Turicibacter, SMB53, Veillonella, Peptoniphilus, Comamonas, Hymenobacter, Citrobacter, Novosphingobium, Gordonia, Aerococcus, Thermus, Shewanella, 및 Achromobacter 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 6 및 도 6 참조).
　 정상인 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
g__Chromohalobacter 0.0014 0.0075 0.0000 0.0000 0.0001 0.00 0.72 0.72 0.63 0.75 0.69 0.69
g__Geobacillus 0.0018 0.0062 0.0001 0.0006 0.0000 0.06 0.70 0.74 0.59 0.71 0.66 0.66
g__Proteus 0.0079 0.0231 0.0010 0.0025 0.0000 0.13 0.76 0.76 0.62 0.75 0.69 0.69
g__Megamonas 0.0021 0.0097 0.0003 0.0014 0.0001 0.14 0.71 0.76 0.60 0.71 0.65 0.66
g__Moraxella 0.0018 0.0109 0.0003 0.0018 0.0055 0.15 0.70 0.76 0.57 0.71 0.65 0.63
g__Alloiococcus 0.0009 0.0041 0.0002 0.0008 0.0001 0.17 0.71 0.75 0.59 0.71 0.67 0.66
g__Turicibacter 0.0017 0.0033 0.0004 0.0017 0.0000 0.25 0.76 0.75 0.63 0.74 0.69 0.70
g__SMB53 0.0028 0.0078 0.0007 0.0015 0.0000 0.26 0.72 0.75 0.59 0.74 0.68 0.70
g__Veillonella 0.0086 0.0155 0.0035 0.0054 0.0000 0.41 0.71 0.74 0.59 0.74 0.70 0.65
g__Peptoniphilus 0.0009 0.0036 0.0004 0.0013 0.0034 0.41 0.70 0.76 0.56 0.71 0.66 0.63
g__Comamonas 0.0016 0.0038 0.0007 0.0023 0.0001 0.45 0.71 0.75 0.58 0.71 0.68 0.67
g__Hymenobacter 0.0003 0.0010 0.0006 0.0021 0.0095 2.26 0.70 0.76 0.56 0.71 0.69 0.57
g__Citrobacter 0.0093 0.0146 0.0218 0.0220 0.0000 2.33 0.74 0.81 0.54 0.81 0.85 0.61
g__Novosphingobium 0.0007 0.0027 0.0019 0.0043 0.0001 2.58 0.73 0.81 0.53 0.73 0.75 0.66
g__Gordonia 0.0005 0.0024 0.0013 0.0048 0.0047 2.64 0.70 0.78 0.56 0.73 0.71 0.59
g__Aerococcus 0.0008 0.0025 0.0022 0.0075 0.0013 2.86 0.71 0.79 0.54 0.70 0.72 0.55
g__Thermus 0.0006 0.0022 0.0017 0.0038 0.0000 3.02 0.71 0.78 0.56 0.74 0.76 0.58
g__Shewanella 0.0003 0.0012 0.0009 0.0040 0.0093 3.30 0.70 0.76 0.56 0.72 0.70 0.58
g__Achromobacter 0.0002 0.0011 0.0006 0.0028 0.0060 3.56 0.70 0.76 0.56 0.72 0.70 0.56
실시예 5. COPD환자와 폐암환자 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 폐암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 폐암환자 319명과 COPD환자 208명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, Bacillales, Rickettsiales, 및 I025 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 7 및 도 7 참조).
　 COPD 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
o__Bacillales 0.0903 0.0740 0.0394 0.0509 0.0000 0.44 0.82 0.50 0.89 0.83 0.46 0.85
o__Rickettsiales 0.0015 0.0027 0.0034 0.0089 0.0007 2.18 0.58 0.00 0.99 0.60 0.00 1.00
o__I025 0.0004 0.0012 0.0019 0.0059 0.0000 5.33 0.60 0.05 0.95 0.65 0.05 0.97
혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Staphylococcaceae, Nocardiaceae, 및 Rs-045 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 8 및 도 8 참조).
　 COPD 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
f__Staphylococcaceae 0.0700 0.0711 0.0242 0.0437 0.0000 0.35 0.85 0.53 0.94 0.84 0.52 0.86
f__Nocardiaceae 0.0020 0.0028 0.0048 0.0103 0.0000 2.35 0.61 0.19 0.80 0.61 0.18 0.83
f__Rs-045 0.0003 0.0011 0.0017 0.0058 0.0000 5.49 0.60 0.06 0.95 0.64 0.07 0.95
혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Alloiococcus, Moraxella, Staphylococcus, Brevundimonas, Enhydrobacter, Comamonas, 및 Rhodococcus 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 9 및 도 9 참조).
　 COPD 폐암 t-test Training Set Testing Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
g__Alloiococcus 0.0011 0.0037 0.0002 0.0008 0.0003 0.14 0.61 0.13 0.97 0.64 0.16 0.96
g__Moraxella 0.0019 0.0054 0.0003 0.0018 0.0001 0.15 0.64 0.14 0.98 0.63 0.13 0.98
g__Staphylococcus 0.0694 0.0711 0.0233 0.0435 0.0000 0.34 0.85 0.53 0.92 0.84 0.52 0.86
g__Brevundimonas 0.0031 0.0050 0.0012 0.0034 0.0000 0.40 0.66 0.19 0.93 0.71 0.20 0.95
g__Enhydrobacter 0.0525 0.0478 0.0236 0.0293 0.0000 0.45 0.77 0.35 0.92 0.79 0.39 0.88
g__Comamonas 0.0015 0.0026 0.0007 0.0023 0.0003 0.47 0.70 0.18 0.95 0.63 0.18 0.91
g__Rhodococcus 0.0020 0.0028 0.0047 0.0102 0.0000 2.31 0.61 0.19 0.80 0.61 0.18 0.83
실시예 6. 천식환자와 폐암환자 혈액에서 분리한 세균유래 소포 메타게놈 분석 기반 폐암 진단모형
상기 실시예 3의 방법으로, 폐암환자 308명과 천식환자 277명의 혈액에서 소포를 분리한 후 메타게놈 시퀀싱을 수행하였다. 진단모형 개발은 먼저 t-test에서 두 군 사이의 p값이 0.05 이하이고, 두 군 사이에 2배 이상 차이가 나는 균주를 선정하고 난 후, logistic regression analysis 방법으로 진단적 성능 지표인 AUC(area under curve), 민감도, 및 특이도를 산출하였다.
혈액 내 세균유래 소포를 문(phylum) 수준에서 분석한 결과, Bacteroidetes, Cyanobacteria, TM7, Fusobacteria, Thermi, Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, 및 Chloroflexi 문 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 10 및 도 10 참조).
　 천식 폐암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold Auc sensitivity specificity Auc sensitivity specificity
p__Bacteroidetes 0.1762 0.0499 0.0757 0.0370 0.0000 0.43 0.97 0.88 0.93 0.96 0.90 0.91
p__Cyanobacteria 0.0043 0.0119 0.0189 0.0319 0.0000 4.39 0.89 0.70 0.86 0.85 0.75 0.80
p__TM7 0.0010 0.0029 0.0051 0.0080 0.0000 4.98 0.87 0.65 0.90 0.78 0.69 0.74
p__Fusobacteria 0.0009 0.0029 0.0047 0.0095 0.0000 5.04 0.85 0.63 0.89 0.84 0.68 0.84
p__[Thermi] 0.0006 0.0019 0.0031 0.0065 0.0000 5.25 0.83 0.62 0.88 0.80 0.65 0.82
p__Verrucomicrobia 0.0053 0.0060 0.0277 0.0236 0.0000 5.25 0.91 0.79 0.82 0.87 0.78 0.77
p__Armatimonadetes 0.0001 0.0004 0.0009 0.0051 0.0046 8.82 0.81 0.62 0.87 0.76 0.65 0.78
p__Acidobacteria 0.0003 0.0011 0.0029 0.0084 0.0000 8.85 0.83 0.62 0.89 0.82 0.63 0.80
p__Gemmatimonadetes 0.0001 0.0002 0.0005 0.0019 0.0000 10.04 0.80 0.62 0.86 0.77 0.66 0.77
p__Chloroflexi 0.0001 0.0003 0.0022 0.0047 0.0000 22.41 0.84 0.62 0.91 0.87 0.63 0.89
혈액 내 세균유래 소포를 강(class) 수준에서 분석한 결과, Bacteroidia, Bacilli, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, Alphaproteobacteria, Fusobacteriia, TM7-3, Deinococci, Verrucomicrobiae, Saprospirae, Chloroplast, Cytophagia, Fimbriimonadia, Chloracidobacteria, Thermomicrobia, Thermoleophilia, 및 Solibacteres 강 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 11 및 도 11 참조).
　 천식 폐암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
c__Bacteroidia 0.1736 0.0514 0.0661 0.0380 0.0000 0.38 0.97 0.89 0.94 0.95 0.88 0.94
c__Bacilli 0.0611 0.0408 0.1404 0.0728 0.0000 2.30 0.92 0.81 0.91 0.91 0.85 0.91
c__Flavobacteriia 0.0018 0.0066 0.0055 0.0088 0.0000 3.07 0.86 0.62 0.86 0.80 0.72 0.86
c__Sphingobacteriia 0.0004 0.0011 0.0014 0.0042 0.0000 3.74 0.81 0.62 0.85 0.76 0.66 0.85
c__Alphaproteobacteria 0.0163 0.0323 0.0700 0.0453 0.0000 4.29 0.95 0.82 0.91 0.92 0.85 0.91
c__Fusobacteriia 0.0009 0.0029 0.0047 0.0095 0.0000 5.04 0.85 0.63 0.89 0.84 0.68 0.89
c__TM7-3 0.0009 0.0027 0.0048 0.0079 0.0000 5.19 0.87 0.66 0.90 0.77 0.68 0.90
c__Deinococci 0.0006 0.0019 0.0031 0.0065 0.0000 5.25 0.83 0.62 0.88 0.80 0.65 0.88
c__Verrucomicrobiae 0.0052 0.0060 0.0274 0.0235 0.0000 5.29 0.91 0.79 0.83 0.87 0.76 0.83
c__[Saprospirae] 0.0002 0.0006 0.0010 0.0034 0.0000 5.34 0.81 0.63 0.88 0.77 0.63 0.88
c__Chloroplast 0.0027 0.0049 0.0169 0.0315 0.0000 6.22 0.89 0.68 0.87 0.86 0.75 0.87
c__Cytophagia 0.0002 0.0008 0.0014 0.0040 0.0000 6.73 0.82 0.62 0.86 0.77 0.68 0.86
c__[Fimbriimonadia] 0.0001 0.0004 0.0009 0.0051 0.0046 8.81 0.81 0.62 0.87 0.76 0.65 0.87
c__[Chloracidobacteria] 0.0001 0.0005 0.0010 0.0052 0.0015 11.88 0.81 0.62 0.90 0.76 0.65 0.90
c__Thermomicrobia 0.0000 0.0002 0.0012 0.0033 0.0000 26.04 0.82 0.62 0.89 0.84 0.63 0.89
c__Thermoleophilia 0.0000 0.0002 0.0010 0.0064 0.0069 28.53 0.80 0.62 0.87 0.77 0.66 0.87
c__Solibacteres 0.0000 0.0002 0.0013 0.0051 0.0000 41.68 0.81 0.61 0.87 0.82 0.66 0.87
혈액 내 세균유래 소포를 목(order) 수준에서 분석한 결과, YS2, Turicibacterales, Bifidobacteriales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Rhodobacterales, Gemellales, Flavobacteriales, Caulobacterales, Neisseriales, Sphingobacteriales, Deinococcales, Pseudomonadales, Rhodocyclales, Xanthomonadales, Fusobacteriales, Actinomycetales, Sphingomonadales, Verrucomicrobiales, Saprospirales, Rhizobiales, Bacillales, Streptophyta, Cytophagales, Thermales, Fimbriimonadales, CW040, Rickettsiales, RB41, Alteromonadales, JG30-KF-CM45, I025, Aeromonadales, 및 Solibacterales 목 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 12 및 도 12 참조).
　 천식 폐암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
o__YS2 0.0007 0.0014 0.0001 0.0009 0.0000 0.16 0.81 0.64 0.86 0.81 0.66 0.75
o__Turicibacterales 0.0017 0.0053 0.0004 0.0017 0.0009 0.25 0.80 0.62 0.86 0.77 0.65 0.74
o__Bifidobacteriales 0.0627 0.0335 0.0164 0.0144 0.0000 0.26 0.95 0.85 0.95 0.92 0.82 0.88
o__Bacteroidales 0.1736 0.0514 0.0661 0.0380 0.0000 0.38 0.97 0.89 0.94 0.95 0.88 0.92
o__Enterobacteriales 0.2091 0.0878 0.0983 0.0629 0.0000 0.47 0.91 0.78 0.91 0.91 0.81 0.85
o__Rhodobacterales 0.0034 0.0237 0.0080 0.0125 0.0092 2.36 0.80 0.62 0.86 0.77 0.68 0.74
o__Gemellales 0.0004 0.0032 0.0012 0.0032 0.0089 2.64 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.75
o__Flavobacteriales 0.0018 0.0066 0.0055 0.0088 0.0000 3.07 0.86 0.62 0.86 0.80 0.72 0.82
o__Caulobacterales 0.0015 0.0030 0.0050 0.0072 0.0000 3.31 0.85 0.61 0.89 0.80 0.71 0.77
o__Neisseriales 0.0016 0.0064 0.0058 0.0119 0.0000 3.61 0.82 0.62 0.87 0.80 0.69 0.76
o__Sphingobacteriales 0.0004 0.0011 0.0014 0.0042 0.0000 3.74 0.81 0.62 0.85 0.76 0.66 0.74
o__Deinococcales 0.0004 0.0013 0.0014 0.0053 0.0010 3.89 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.75
o__Pseudomonadales 0.0335 0.0496 0.1334 0.0791 0.0000 3.98 0.96 0.87 0.92 0.93 0.87 0.86
o__Rhodocyclales 0.0003 0.0009 0.0012 0.0045 0.0006 4.31 0.80 0.62 0.86 0.75 0.65 0.75
o__Xanthomonadales 0.0006 0.0012 0.0025 0.0059 0.0000 4.47 0.81 0.62 0.88 0.77 0.68 0.76
o__Fusobacteriales 0.0009 0.0029 0.0047 0.0095 0.0000 5.04 0.85 0.63 0.89 0.84 0.68 0.84
o__Actinomycetales 0.0160 0.0218 0.0813 0.0458 0.0000 5.07 0.97 0.90 0.92 0.96 0.88 0.88
o__Sphingomonadales 0.0049 0.0082 0.0261 0.0254 0.0000 5.27 0.91 0.74 0.88 0.91 0.79 0.80
o__Verrucomicrobiales 0.0052 0.0060 0.0274 0.0235 0.0000 5.29 0.91 0.79 0.83 0.87 0.76 0.77
o__[Saprospirales] 0.0002 0.0006 0.0010 0.0034 0.0000 5.34 0.81 0.63 0.88 0.77 0.63 0.73
o__Rhizobiales 0.0043 0.0057 0.0237 0.0202 0.0000 5.54 0.93 0.80 0.87 0.90 0.84 0.85
o__Bacillales 0.0071 0.0085 0.0394 0.0509 0.0000 5.57 0.94 0.84 0.88 0.92 0.82 0.85
o__Streptophyta 0.0027 0.0048 0.0165 0.0314 0.0000 6.23 0.89 0.68 0.88 0.86 0.75 0.82
o__Cytophagales 0.0002 0.0008 0.0014 0.0040 0.0000 6.73 0.82 0.62 0.86 0.77 0.68 0.78
o__Thermales 0.0002 0.0014 0.0017 0.0039 0.0000 7.32 0.83 0.60 0.89 0.79 0.66 0.79
o__[Fimbriimonadales] 0.0001 0.0004 0.0009 0.0051 0.0046 8.81 0.81 0.62 0.87 0.76 0.65 0.78
o__CW040 0.0002 0.0009 0.0016 0.0040 0.0000 9.42 0.84 0.62 0.88 0.76 0.66 0.75
o__Rickettsiales 0.0003 0.0011 0.0034 0.0089 0.0000 12.76 0.86 0.61 0.90 0.76 0.62 0.74
o__RB41 0.0001 0.0005 0.0010 0.0052 0.0016 12.88 0.81 0.62 0.89 0.76 0.65 0.76
o__Alteromonadales 0.0002 0.0007 0.0022 0.0081 0.0000 13.64 0.82 0.62 0.86 0.79 0.66 0.78
o__JG30-KF-CM45 0.0000 0.0002 0.0011 0.0033 0.0000 24.15 0.82 0.62 0.89 0.84 0.63 0.84
o__I025 0.0001 0.0005 0.0019 0.0059 0.0000 27.72 0.83 0.62 0.88 0.79 0.66 0.78
o__Aeromonadales 0.0002 0.0007 0.0056 0.0320 0.0030 34.45 0.82 0.62 0.87 0.78 0.68 0.74
o__Solibacterales 0.0000 0.0002 0.0013 0.0051 0.0000 41.68 0.81 0.61 0.87 0.82 0.66 0.82
혈액 내 세균유래 소포를 과(family) 수준에서 분석한 결과, Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bifidobacteriaceae, Barnesiellaceae, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Enterobacteriaceae, Porphyromonadaceae, Gemellaceae, Weeksellaceae, Carnobacteriaceae, Leptotrichiaceae, Moraxellaceae, Caulobacteraceae, Erythrobacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Neisseriaceae, Sphingobacteriaceae, Deinococcaceae, Aerococcaceae, Bartonellaceae, Micrococcaceae, Flavobacteriaceae, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae, Dietziaceae, Rhodocyclaceae, Xanthomonadaceae, Geodermatophilaceae, Actinomycetaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Corynebacteriaceae, Staphylococcaceae, Nocardioidaceae, Verrucomicrobiaceae, Sphingomonadaceae, Mycobacteriaceae, Tissierellaceae, Chitinophagaceae, Intrasporangiaceae, Propionibacteriaceae, Aurantimonadaceae, Planococcaceae, Fusobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae, Nocardiaceae, Dermabacteraceae, Bacillaceae, Thermaceae, Ellin6075, Brevibacteriaceae, Microbacteriaceae, Rhodospirillaceae, Cytophagaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Chromatiaceae, Rhizobiaceae, Gordoniaceae, mitochondria, Pseudonocardiaceae, Exiguobacteraceae, Shewanellaceae, F16, Rs-045, 및 Aeromonadaceae 과 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 13 및 도 13 참조).
　 천식 폐암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
f__Helicobacteraceae 0.0005 0.0022 0.0000 0.0002 0.0024 0.05 0.79 0.64 0.86 0.77 0.68 0.75
f__Bacteroidaceae 0.1140 0.0469 0.0276 0.0212 0.0000 0.24 0.97 0.89 0.95 0.96 0.91 0.91
f__Turicibacteraceae 0.0017 0.0053 0.0004 0.0017 0.0009 0.25 0.80 0.62 0.86 0.77 0.65 0.74
f__Veillonellaceae 0.0375 0.0288 0.0094 0.0093 0.0000 0.25 0.94 0.79 0.91 0.93 0.82 0.88
f__Bifidobacteriaceae 0.0627 0.0335 0.0164 0.0144 0.0000 0.26 0.95 0.85 0.95 0.92 0.82 0.88
f__[Barnesiellaceae] 0.0024 0.0050 0.0008 0.0025 0.0000 0.32 0.80 0.64 0.85 0.79 0.65 0.77
f__Rikenellaceae 0.0070 0.0087 0.0025 0.0050 0.0000 0.36 0.83 0.68 0.84 0.81 0.68 0.79
f__Clostridiaceae 0.0151 0.0143 0.0059 0.0078 0.0000 0.39 0.82 0.66 0.86 0.81 0.69 0.82
f__[Odoribacteraceae] 0.0021 0.0029 0.0009 0.0022 0.0000 0.43 0.80 0.67 0.86 0.78 0.65 0.75
f__Enterobacteriaceae 0.2091 0.0878 0.0983 0.0629 0.0000 0.47 0.91 0.78 0.91 0.91 0.81 0.85
f__Porphyromonadaceae 0.0145 0.0090 0.0069 0.0105 0.0000 0.47 0.85 0.68 0.85 0.83 0.72 0.80
f__Gemellaceae 0.0004 0.0032 0.0012 0.0032 0.0093 2.65 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.75
f__[Weeksellaceae] 0.0013 0.0061 0.0036 0.0072 0.0001 2.68 0.82 0.61 0.89 0.78 0.66 0.80
f__Carnobacteriaceae 0.0003 0.0012 0.0010 0.0029 0.0002 3.14 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.77
f__Leptotrichiaceae 0.0004 0.0011 0.0012 0.0029 0.0000 3.23 0.81 0.62 0.89 0.77 0.62 0.79
f__Moraxellaceae 0.0175 0.0451 0.0567 0.0481 0.0000 3.25 0.90 0.68 0.89 0.86 0.74 0.82
f__Caulobacteraceae 0.0015 0.0030 0.0050 0.0072 0.0000 3.31 0.85 0.61 0.89 0.80 0.71 0.77
f__Erythrobacteraceae 0.0003 0.0028 0.0010 0.0045 0.0235 3.36 0.79 0.62 0.86 0.75 0.66 0.74
f__Hyphomicrobiaceae 0.0001 0.0006 0.0004 0.0015 0.0020 3.36 0.79 0.62 0.87 0.76 0.65 0.74
f__Neisseriaceae 0.0016 0.0064 0.0058 0.0119 0.0000 3.61 0.82 0.62 0.87 0.80 0.69 0.76
f__Sphingobacteriaceae 0.0003 0.0010 0.0013 0.0041 0.0000 3.91 0.80 0.61 0.86 0.76 0.65 0.74
f__Deinococcaceae 0.0003 0.0013 0.0014 0.0053 0.0012 4.00 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.75
f__Aerococcaceae 0.0017 0.0042 0.0067 0.0107 0.0000 4.02 0.84 0.63 0.87 0.83 0.72 0.79
f__Bartonellaceae 0.0002 0.0007 0.0009 0.0033 0.0004 4.06 0.80 0.62 0.87 0.76 0.65 0.74
f__Micrococcaceae 0.0045 0.0143 0.0183 0.0172 0.0000 4.07 0.91 0.65 0.89 0.87 0.76 0.79
f__Flavobacteriaceae 0.0005 0.0022 0.0019 0.0049 0.0000 4.15 0.83 0.61 0.87 0.78 0.68 0.77
f__Burkholderiaceae 0.0004 0.0010 0.0017 0.0064 0.0005 4.16 0.79 0.62 0.86 0.77 0.66 0.76
f__Lactobacillaceae 0.0108 0.0141 0.0454 0.0454 0.0000 4.21 0.91 0.80 0.86 0.89 0.85 0.82
f__Dietziaceae 0.0003 0.0008 0.0011 0.0049 0.0031 4.25 0.79 0.62 0.87 0.76 0.66 0.76
f__Rhodocyclaceae 0.0003 0.0009 0.0012 0.0045 0.0006 4.31 0.80 0.62 0.86 0.75 0.65 0.75
f__Xanthomonadaceae 0.0005 0.0012 0.0023 0.0058 0.0000 4.36 0.81 0.62 0.88 0.77 0.66 0.76
f__Geodermatophilaceae 0.0003 0.0012 0.0012 0.0034 0.0000 4.44 0.80 0.61 0.86 0.79 0.65 0.77
f__Actinomycetaceae 0.0008 0.0038 0.0035 0.0060 0.0000 4.46 0.83 0.62 0.89 0.82 0.65 0.79
f__Methylobacteriaceae 0.0015 0.0034 0.0066 0.0083 0.0000 4.49 0.86 0.64 0.86 0.81 0.69 0.74
f__Pseudomonadaceae 0.0160 0.0154 0.0765 0.0531 0.0000 4.77 0.97 0.91 0.95 0.95 0.93 0.88
f__Corynebacteriaceae 0.0048 0.0055 0.0238 0.0241 0.0000 4.95 0.91 0.79 0.85 0.90 0.84 0.80
f__Staphylococcaceae 0.0047 0.0068 0.0242 0.0437 0.0000 5.15 0.90 0.73 0.87 0.90 0.75 0.84
f__Nocardioidaceae 0.0003 0.0008 0.0017 0.0046 0.0000 5.16 0.81 0.61 0.85 0.77 0.68 0.74
f__Verrucomicrobiaceae 0.0052 0.0060 0.0274 0.0235 0.0000 5.29 0.91 0.79 0.83 0.87 0.76 0.77
f__Sphingomonadaceae 0.0046 0.0070 0.0249 0.0245 0.0000 5.39 0.91 0.74 0.87 0.91 0.81 0.82
f__Mycobacteriaceae 0.0002 0.0009 0.0012 0.0054 0.0023 5.60 0.79 0.62 0.87 0.77 0.63 0.76
f__[Tissierellaceae] 0.0006 0.0016 0.0033 0.0069 0.0000 5.62 0.83 0.60 0.88 0.80 0.65 0.82
f__Chitinophagaceae 0.0002 0.0006 0.0010 0.0034 0.0000 5.63 0.81 0.63 0.88 0.76 0.63 0.73
f__Intrasporangiaceae 0.0006 0.0013 0.0034 0.0065 0.0000 5.74 0.84 0.62 0.86 0.80 0.71 0.76
f__Propionibacteriaceae 0.0021 0.0031 0.0126 0.0117 0.0000 5.85 0.91 0.75 0.87 0.93 0.79 0.86
f__Aurantimonadaceae 0.0001 0.0003 0.0005 0.0020 0.0016 6.06 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.74
f__Planococcaceae 0.0007 0.0013 0.0045 0.0108 0.0000 6.20 0.87 0.64 0.85 0.83 0.66 0.83
f__Fusobacteriaceae 0.0006 0.0026 0.0035 0.0090 0.0000 6.21 0.83 0.62 0.88 0.83 0.68 0.85
f__Bradyrhizobiaceae 0.0003 0.0008 0.0020 0.0054 0.0000 6.25 0.82 0.60 0.86 0.77 0.65 0.77
f__Nocardiaceae 0.0008 0.0019 0.0048 0.0103 0.0000 6.32 0.86 0.65 0.87 0.82 0.74 0.82
f__Dermabacteraceae 0.0002 0.0005 0.0010 0.0030 0.0000 6.38 0.80 0.61 0.88 0.77 0.65 0.76
f__Bacillaceae 0.0013 0.0020 0.0085 0.0149 0.0000 6.44 0.88 0.64 0.88 0.82 0.72 0.75
f__Thermaceae 0.0002 0.0014 0.0017 0.0039 0.0000 7.32 0.83 0.60 0.89 0.79 0.66 0.79
f__Ellin6075 0.0001 0.0004 0.0005 0.0018 0.0001 7.54 0.80 0.62 0.89 0.76 0.65 0.77
f__Brevibacteriaceae 0.0002 0.0006 0.0015 0.0061 0.0002 7.65 0.81 0.62 0.89 0.77 0.66 0.76
f__Microbacteriaceae 0.0002 0.0008 0.0013 0.0038 0.0000 7.69 0.82 0.62 0.86 0.79 0.68 0.77
f__Rhodospirillaceae 0.0002 0.0011 0.0015 0.0062 0.0002 7.94 0.79 0.62 0.87 0.77 0.66 0.76
f__Cytophagaceae 0.0002 0.0005 0.0013 0.0040 0.0000 8.57 0.82 0.61 0.87 0.77 0.63 0.78
f__[Fimbriimonadaceae] 0.0001 0.0004 0.0009 0.0051 0.0048 8.78 0.81 0.62 0.87 0.76 0.65 0.78
f__Dermacoccaceae 0.0002 0.0005 0.0019 0.0048 0.0000 9.05 0.83 0.63 0.88 0.80 0.69 0.78
f__[Chromatiaceae] 0.0001 0.0006 0.0011 0.0062 0.0056 9.57 0.80 0.62 0.87 0.75 0.66 0.74
f__Rhizobiaceae 0.0012 0.0025 0.0118 0.0150 0.0000 9.97 0.92 0.76 0.88 0.90 0.76 0.83
f__Gordoniaceae 0.0001 0.0005 0.0013 0.0048 0.0000 10.20 0.80 0.62 0.85 0.77 0.65 0.76
f__mitochondria 0.0003 0.0011 0.0027 0.0081 0.0000 10.41 0.84 0.60 0.89 0.75 0.60 0.74
f__Pseudonocardiaceae 0.0001 0.0002 0.0006 0.0025 0.0001 11.72 0.80 0.63 0.86 0.76 0.63 0.75
f__[Exiguobacteraceae] 0.0000 0.0002 0.0006 0.0033 0.0048 23.39 0.80 0.62 0.86 0.77 0.65 0.79
f__Shewanellaceae 0.0000 0.0004 0.0009 0.0040 0.0003 24.54 0.80 0.62 0.86 0.77 0.66 0.77
f__F16 0.0001 0.0005 0.0016 0.0040 0.0000 24.68 0.85 0.63 0.88 0.78 0.68 0.74
f__Rs-045 0.0001 0.0005 0.0017 0.0058 0.0000 26.38 0.83 0.62 0.90 0.78 0.65 0.78
f__Aeromonadaceae 0.0002 0.0007 0.0056 0.0320 0.0030 34.42 0.82 0.62 0.87 0.78 0.68 0.74
혈액 내 세균유래 소포를 속(genus) 수준에서 분석한 결과, Trabulsiella, Enterobacter, Veillonella, Bifidobacterium, Lachnospira, Comamonas, Bacteroides, Turicibacter, Sutterella, Klebsiella, SMB53, Roseburia, Dialister, Ruminococcus, Parabacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Eubacterium, Dorea, Enhydrobacter, Granulicatella, Chryseobacterium, Porphyromonas, Coprococcus, Peptoniphilus, Microbispora, Deinococcus, Acinetobacter, Aerococcus, Actinomyces, Brevundimonas, Blastomonas, Citrobacter, Lactobacillus, Stenotrophomonas, Corynebacterium, Pseudomonas, Lautropia, Akkermansia, Staphylococcus, Bacillus, Sphingobacterium, Anaerococcus, Neisseria, Leptotrichia, Mycobacterium, Kocuria, Methylobacterium, Propionibacterium, Hymenobacter, Sphingomonas, Fusobacterium, Brachybacterium, Rhodococcus, Micrococcus, Kaistobacter, Finegoldia, Rubellimicrobium, Brevibacterium, Agrobacterium, Dietzia, Fimbriimonas, Flavobacterium, Dermacoccus, Skermanella, Novosphingobium, Gordonia, Rheinheimera, Achromobacter, Hydrogenophilus, Thermus, Exiguobacterium, Shewanella, Ralstonia, 및 Alkanindiges 속 세균에서 하나 이상의 바이오마커로 진단모형을 개발하였을 때, 폐암에 대한 진단적 성능이 유의하게 나타났다 (표 14 및 도 14 참조).
　 천식 폐암 t-test Training Set Test Set
Taxon Mean SD Mean SD p-value fold AUC sensitivity specificity AUC sensitivity specificity
g__Trabulsiella 0.0007 0.0012 0.0000 0.0002 0.0000 0.04 0.92 0.75 0.92 0.91 0.82 0.89
g__Enterobacter 0.0016 0.0013 0.0002 0.0018 0.0000 0.11 0.93 0.77 0.93 0.91 0.79 0.87
g__Veillonella 0.0243 0.0248 0.0035 0.0054 0.0000 0.14 0.94 0.82 0.91 0.93 0.84 0.87
g__Bifidobacterium 0.0623 0.0336 0.0123 0.0120 0.0000 0.20 0.96 0.87 0.96 0.95 0.82 0.92
g__Lachnospira 0.0037 0.0130 0.0008 0.0022 0.0013 0.23 0.86 0.67 0.87 0.82 0.72 0.78
g__Comamonas 0.0031 0.0091 0.0007 0.0023 0.0002 0.23 0.81 0.63 0.86 0.80 0.69 0.78
g__Bacteroides 0.1140 0.0469 0.0276 0.0212 0.0000 0.24 0.97 0.89 0.95 0.96 0.91 0.91
g__Turicibacter 0.0017 0.0053 0.0004 0.0017 0.0009 0.25 0.80 0.62 0.86 0.77 0.65 0.74
g__Sutterella 0.0014 0.0029 0.0004 0.0013 0.0000 0.27 0.80 0.66 0.84 0.77 0.62 0.77
g__Klebsiella 0.0018 0.0012 0.0006 0.0020 0.0000 0.31 0.90 0.72 0.87 0.88 0.79 0.79
g__SMB53 0.0023 0.0033 0.0007 0.0015 0.0000 0.32 0.81 0.63 0.86 0.78 0.69 0.74
g__Roseburia 0.0021 0.0029 0.0007 0.0031 0.0000 0.33 0.80 0.64 0.86 0.78 0.65 0.76
g__Dialister 0.0090 0.0077 0.0033 0.0047 0.0000 0.37 0.86 0.67 0.87 0.86 0.76 0.78
g__Ruminococcus 0.0163 0.0112 0.0062 0.0102 0.0000 0.38 0.89 0.72 0.88 0.84 0.76 0.78
g__Parabacteroides 0.0138 0.0086 0.0055 0.0099 0.0000 0.40 0.87 0.70 0.87 0.86 0.75 0.86
g__Butyricimonas 0.0012 0.0019 0.0005 0.0016 0.0000 0.42 0.80 0.64 0.85 0.78 0.63 0.74
g__Odoribacter 0.0009 0.0017 0.0004 0.0015 0.0008 0.46 0.80 0.64 0.87 0.76 0.65 0.76
g__[Eubacterium] 0.0007 0.0013 0.0015 0.0028 0.0000 2.09 0.81 0.61 0.87 0.76 0.63 0.76
g__Dorea 0.0017 0.0072 0.0037 0.0061 0.0009 2.18 0.82 0.61 0.87 0.79 0.69 0.78
g__Enhydrobacter 0.0093 0.0425 0.0236 0.0293 0.0000 2.54 0.84 0.62 0.86 0.78 0.68 0.75
g__Granulicatella 0.0003 0.0011 0.0007 0.0024 0.0051 2.58 0.79 0.62 0.86 0.75 0.66 0.76
g__Chryseobacterium 0.0007 0.0025 0.0019 0.0042 0.0000 2.74 0.80 0.62 0.88 0.77 0.66 0.76
g__Porphyromonas 0.0005 0.0036 0.0013 0.0033 0.0065 2.78 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.75
g__Coprococcus 0.0047 0.0050 0.0141 0.0146 0.0000 2.97 0.85 0.64 0.89 0.82 0.71 0.79
g__Peptoniphilus 0.0001 0.0005 0.0004 0.0013 0.0012 3.17 0.79 0.61 0.86 0.76 0.66 0.76
g__Microbispora 0.0002 0.0006 0.0006 0.0024 0.0042 3.57 0.79 0.62 0.86 0.75 0.65 0.75
g__Deinococcus 0.0003 0.0013 0.0013 0.0052 0.0020 3.81 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.75
g__Acinetobacter 0.0076 0.0128 0.0310 0.0278 0.0000 4.09 0.91 0.78 0.84 0.89 0.78 0.85
g__Aerococcus 0.0005 0.0020 0.0022 0.0075 0.0002 4.10 0.79 0.62 0.86 0.77 0.66 0.77
g__Actinomyces 0.0008 0.0038 0.0032 0.0057 0.0000 4.12 0.82 0.62 0.89 0.81 0.65 0.78
g__Brevundimonas 0.0003 0.0008 0.0012 0.0034 0.0000 4.24 0.80 0.61 0.87 0.78 0.66 0.76
g__Blastomonas 0.0002 0.0016 0.0007 0.0024 0.0022 4.33 0.80 0.62 0.86 0.77 0.66 0.76
g__Citrobacter 0.0050 0.0041 0.0218 0.0220 0.0000 4.34 0.87 0.65 0.87 0.85 0.75 0.79
g__Lactobacillus 0.0101 0.0140 0.0444 0.0454 0.0000 4.39 0.91 0.79 0.85 0.89 0.85 0.79
g__Stenotrophomonas 0.0001 0.0005 0.0005 0.0019 0.0005 4.58 0.79 0.62 0.86 0.75 0.65 0.77
g__Corynebacterium 0.0048 0.0055 0.0238 0.0241 0.0000 4.95 0.91 0.79 0.85 0.90 0.84 0.80
g__Pseudomonas 0.0144 0.0145 0.0734 0.0506 0.0000 5.11 0.97 0.91 0.95 0.96 0.93 0.88
g__Lautropia 0.0002 0.0005 0.0013 0.0060 0.0027 5.15 0.79 0.62 0.86 0.77 0.66 0.75
g__Akkermansia 0.0052 0.0060 0.0273 0.0236 0.0000 5.27 0.91 0.78 0.82 0.87 0.78 0.77
g__Staphylococcus 0.0044 0.0062 0.0233 0.0435 0.0000 5.29 0.90 0.72 0.89 0.90 0.76 0.83
g__Bacillus 0.0008 0.0016 0.0042 0.0108 0.0000 5.34 0.84 0.62 0.89 0.78 0.66 0.80
g__Sphingobacterium 0.0001 0.0006 0.0005 0.0019 0.0011 5.39 0.79 0.61 0.86 0.76 0.66 0.75
g__Anaerococcus 0.0003 0.0013 0.0014 0.0041 0.0000 5.39 0.80 0.62 0.86 0.77 0.63 0.78
g__Neisseria 0.0008 0.0026 0.0041 0.0102 0.0000 5.46 0.83 0.62 0.87 0.80 0.68 0.78
g__Leptotrichia 0.0001 0.0005 0.0006 0.0021 0.0000 5.54 0.80 0.62 0.87 0.76 0.65 0.78
g__Mycobacterium 0.0002 0.0009 0.0012 0.0054 0.0023 5.60 0.79 0.62 0.87 0.77 0.63 0.76
g__Kocuria 0.0004 0.0014 0.0025 0.0058 0.0000 5.66 0.83 0.62 0.88 0.80 0.68 0.82
g__Methylobacterium 0.0007 0.0020 0.0040 0.0068 0.0000 5.70 0.84 0.62 0.86 0.79 0.69 0.78
g__Propionibacterium 0.0021 0.0031 0.0125 0.0117 0.0000 5.84 0.91 0.75 0.87 0.93 0.79 0.85
g__Hymenobacter 0.0001 0.0004 0.0006 0.0021 0.0001 5.97 0.80 0.60 0.86 0.75 0.66 0.75
g__Sphingomonas 0.0025 0.0040 0.0151 0.0166 0.0000 5.99 0.90 0.68 0.90 0.89 0.81 0.78
g__Fusobacterium 0.0006 0.0026 0.0035 0.0090 0.0000 6.21 0.83 0.62 0.88 0.83 0.68 0.85
g__Brachybacterium 0.0001 0.0005 0.0009 0.0030 0.0000 6.22 0.80 0.62 0.87 0.76 0.66 0.75
g__Rhodococcus 0.0008 0.0019 0.0047 0.0102 0.0000 6.25 0.86 0.65 0.87 0.81 0.74 0.80
g__Micrococcus 0.0010 0.0017 0.0063 0.0098 0.0000 6.46 0.86 0.64 0.88 0.81 0.74 0.74
g__Kaistobacter 0.0002 0.0010 0.0016 0.0055 0.0000 6.46 0.81 0.61 0.88 0.76 0.65 0.74
g__Finegoldia 0.0001 0.0006 0.0008 0.0035 0.0003 7.22 0.80 0.62 0.87 0.77 0.65 0.76
g__Rubellimicrobium 0.0001 0.0007 0.0007 0.0040 0.0074 7.31 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.74
g__Brevibacterium 0.0002 0.0006 0.0015 0.0061 0.0002 7.65 0.81 0.62 0.89 0.77 0.66 0.76
g__Agrobacterium 0.0002 0.0007 0.0015 0.0036 0.0000 7.73 0.82 0.63 0.88 0.79 0.65 0.78
g__Dietzia 0.0001 0.0006 0.0010 0.0048 0.0017 8.13 0.80 0.63 0.87 0.76 0.66 0.76
g__Fimbriimonas 0.0001 0.0004 0.0009 0.0050 0.0060 8.88 0.81 0.62 0.87 0.76 0.65 0.78
g__Flavobacterium 0.0001 0.0005 0.0012 0.0040 0.0000 8.98 0.82 0.61 0.86 0.77 0.68 0.76
g__Dermacoccus 0.0002 0.0005 0.0019 0.0048 0.0000 9.05 0.83 0.63 0.88 0.80 0.69 0.78
g__Skermanella 0.0001 0.0009 0.0012 0.0058 0.0020 9.54 0.79 0.62 0.87 0.77 0.66 0.76
g__Novosphingobium 0.0002 0.0009 0.0019 0.0043 0.0000 9.63 0.83 0.62 0.86 0.80 0.66 0.79
g__Gordonia 0.0001 0.0005 0.0013 0.0048 0.0000 10.20 0.80 0.62 0.85 0.77 0.65 0.76
g__Rheinheimera 0.0001 0.0005 0.0010 0.0062 0.0075 11.51 0.79 0.63 0.87 0.76 0.66 0.74
g__Achromobacter 0.0001 0.0004 0.0006 0.0028 0.0003 12.39 0.81 0.62 0.88 0.75 0.63 0.76
g__Hydrogenophilus 0.0001 0.0007 0.0009 0.0041 0.0011 12.54 0.79 0.62 0.86 0.76 0.66 0.75
g__Thermus 0.0001 0.0007 0.0017 0.0038 0.0000 16.82 0.83 0.61 0.88 0.80 0.66 0.79
g__Exiguobacterium 0.0000 0.0002 0.0006 0.0033 0.0049 23.75 0.80 0.62 0.86 0.77 0.65 0.79
g__Shewanella 0.0000 0.0004 0.0009 0.0040 0.0003 24.61 0.80 0.62 0.86 0.77 0.66 0.77
g__Ralstonia 0.0000 0.0001 0.0010 0.0033 0.0000 28.31 0.82 0.62 0.88 0.80 0.66 0.79
g__Alkanindiges 0.0000 0.0001 0.0005 0.0034 0.0095 40.34 0.80 0.62 0.86 0.74 0.66 0.74
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 인체 유래 샘플을 이용한 세균 또는 세균 유래 세포밖　소포의 메타게놈 분석을 통해 폐암 발병의 위험도를 미리 예측함으로써 폐암의 위험군을 조기에 진단 및 예측하여 적절한 관리를 통해 발병 시기를 늦추거나 발병을 예방할 수 있으며, 발병 후에도 조기진단 할 수 있어 폐암의 발병률을 낮추고 치료효과를 높일 수 있다. 또한, 폐암으로 진단받은 환자에서 메타게놈 분석을 통해 원인인자를 예측하여, 원인인자에 대한 노출을 피함으로써 폐암의 경과를 좋게 하거나, 재발을 막을 수 있다.

Claims (32)

  1. (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플, 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플, 또는 천식환자 유래 샘플과, 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단을 위한 정보제공방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Acidobacteria, 및 Chloroflexi로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Thermomicrobia, 및 Solibacteres로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Turicibacterales, Rickettsiales, Alteromonadales, RF32, Thermales, JG30-KF-CM45, I025, Solibacterales, 및 Aeromonadales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Turicibacteraceae, Clostridiaceae, S24-7, Rhizobiaceae, mitochondria, F16, Gordoniaceae, Rhodospirillaceae, Thermaceae, Shewanellaceae, Ellin6075, Rs-045, 및 Aeromonadaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Chromohalobacter, Geobacillus, Proteus, Megamonas, Moraxella, Alloiococcus, Turicibacter, SMB53, Veillonella, Peptoniphilus, Comamonas, Hymenobacter, Citrobacter, Novosphingobium, Gordonia, Aerococcus, Thermus, Shewanella, 및 Achromobacter로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Bacillales, Rickettsiales, 및 I025로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Staphylococcaceae, Nocardiaceae, 및 Rs-045로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Alloiococcus, Moraxella, Staphylococcus, Brevundimonas, Enhydrobacter, Comamonas, 및 Rhodococcus로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Bacteroidetes, Cyanobacteria, TM7, Fusobacteria, Thermi, Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, 및 Chloroflexi로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Bacteroidia, Bacilli, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, Alphaproteobacteria, Fusobacteriia, TM7-3, Deinococci, Verrucomicrobiae, Saprospirae, Chloroplast, Cytophagia, Fimbriimonadia, Chloracidobacteria, Thermomicrobia, Thermoleophilia, 및 Solibacteres로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 YS2, Turicibacterales, Bifidobacteriales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Rhodobacterales, Gemellales, Flavobacteriales, Caulobacterales, Neisseriales, Sphingobacteriales, Deinococcales, Pseudomonadales, Rhodocyclales, Xanthomonadales, Fusobacteriales, Actinomycetales, Sphingomonadales, Verrucomicrobiales, Saprospirales, Rhizobiales, Bacillales, Streptophyta, Cytophagales, Thermales, Fimbriimonadales, CW040, Rickettsiales, RB41, Alteromonadales, JG30-KF-CM45, I025, Aeromonadales, 및 Solibacterales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bifidobacteriaceae, Barnesiellaceae, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Enterobacteriaceae, Porphyromonadaceae, Gemellaceae, Weeksellaceae, Carnobacteriaceae, Leptotrichiaceae, Moraxellaceae, Caulobacteraceae, Erythrobacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Neisseriaceae, Sphingobacteriaceae, Deinococcaceae, Aerococcaceae, Bartonellaceae, Micrococcaceae, Flavobacteriaceae, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae, Dietziaceae, Rhodocyclaceae, Xanthomonadaceae, Geodermatophilaceae, Actinomycetaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Corynebacteriaceae, Staphylococcaceae, Nocardioidaceae, Verrucomicrobiaceae, Sphingomonadaceae, Mycobacteriaceae, Tissierellaceae, Chitinophagaceae, Intrasporangiaceae, Propionibacteriaceae, Aurantimonadaceae, Planococcaceae, Fusobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae, Nocardiaceae, Dermabacteraceae, Bacillaceae, Thermaceae, Ellin6075, Brevibacteriaceae, Microbacteriaceae, Rhodospirillaceae, Cytophagaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Chromatiaceae, Rhizobiaceae, Gordoniaceae, mitochondria, Pseudonocardiaceae, Exiguobacteraceae, Shewanellaceae, F16, Rs-045, 및 Aeromonadaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Trabulsiella, Enterobacter, Veillonella, Bifidobacterium, Lachnospira, Comamonas, Bacteroides, Turicibacter, Sutterella, Klebsiella, SMB53, Roseburia, Dialister, Ruminococcus, Parabacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Eubacterium, Dorea, Enhydrobacter, Granulicatella, Chryseobacterium, Porphyromonas, Coprococcus, Peptoniphilus, Microbispora, Deinococcus, Acinetobacter, Aerococcus, Actinomyces, Brevundimonas, Blastomonas, Citrobacter, Lactobacillus, Stenotrophomonas, Corynebacterium, Pseudomonas, Lautropia, Akkermansia, Staphylococcus, Bacillus, Sphingobacterium, Anaerococcus, Neisseria, Leptotrichia, Mycobacterium, Kocuria, Methylobacterium, Propionibacterium, Hymenobacter, Sphingomonas, Fusobacterium, Brachybacterium, Rhodococcus, Micrococcus, Kaistobacter, Finegoldia, Rubellimicrobium, Brevibacterium, Agrobacterium, Dietzia, Fimbriimonas, Flavobacterium, Dermacoccus, Skermanella, Novosphingobium, Gordonia, Rheinheimera, Achromobacter, Hydrogenophilus, Thermus, Exiguobacterium, Shewanella, Ralstonia, 및 Alkanindiges로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  17. (a) 피검체 샘플에서 분리한 세포밖 소포로부터 DNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 DNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 정상인 유래 샘플, 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플, 또는 천식환자 유래 샘플과 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 단계를 포함하는, 폐암 진단방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Acidobacteria, 및 Chloroflexi로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Thermomicrobia, 및 Solibacteres로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Turicibacterales, Rickettsiales, Alteromonadales, RF32, Thermales, JG30-KF-CM45, I025, Solibacterales, 및 Aeromonadales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  21. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Turicibacteraceae, Clostridiaceae, S24-7, Rhizobiaceae, mitochondria, F16, Gordoniaceae, Rhodospirillaceae, Thermaceae, Shewanellaceae, Ellin6075, Rs-045, 및 Aeromonadaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 정상인 유래 샘플과 비교하여 Chromohalobacter, Geobacillus, Proteus, Megamonas, Moraxella, Alloiococcus, Turicibacter, SMB53, Veillonella, Peptoniphilus, Comamonas, Hymenobacter, Citrobacter, Novosphingobium, Gordonia, Aerococcus, Thermus, Shewanella, 및 Achromobacter로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  23. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Bacillales, Rickettsiales, 및 I025로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  24. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Staphylococcaceae, Nocardiaceae, 및 Rs-045로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  25. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 만성폐쇄성폐질환자 유래 샘플과 비교하여 Alloiococcus, Moraxella, Staphylococcus, Brevundimonas, Enhydrobacter, Comamonas, 및 Rhodococcus로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  26. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Bacteroidetes, Cyanobacteria, TM7, Fusobacteria, Thermi, Verrucomicrobia, Armatimonadetes, Acidobacteria, Gemmatimonadetes, 및 Chloroflexi로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 문(phylum) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  27. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Bacteroidia, Bacilli, Flavobacteriia, Sphingobacteriia, Alphaproteobacteria, Fusobacteriia, TM7-3, Deinococci, Verrucomicrobiae, Saprospirae, Chloroplast, Cytophagia, Fimbriimonadia, Chloracidobacteria, Thermomicrobia, Thermoleophilia, 및 Solibacteres로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 강(class) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  28. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 YS2, Turicibacterales, Bifidobacteriales, Bacteroidales, Enterobacteriales, Rhodobacterales, Gemellales, Flavobacteriales, Caulobacterales, Neisseriales, Sphingobacteriales, Deinococcales, Pseudomonadales, Rhodocyclales, Xanthomonadales, Fusobacteriales, Actinomycetales, Sphingomonadales, Verrucomicrobiales, Saprospirales, Rhizobiales, Bacillales, Streptophyta, Cytophagales, Thermales, Fimbriimonadales, CW040, Rickettsiales, RB41, Alteromonadales, JG30-KF-CM45, I025, Aeromonadales, 및 Solibacterales로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 목(order) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  29. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Bifidobacteriaceae, Barnesiellaceae, Rikenellaceae, Clostridiaceae, Odoribacteraceae, Enterobacteriaceae, Porphyromonadaceae, Gemellaceae, Weeksellaceae, Carnobacteriaceae, Leptotrichiaceae, Moraxellaceae, Caulobacteraceae, Erythrobacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Neisseriaceae, Sphingobacteriaceae, Deinococcaceae, Aerococcaceae, Bartonellaceae, Micrococcaceae, Flavobacteriaceae, Burkholderiaceae, Lactobacillaceae, Dietziaceae, Rhodocyclaceae, Xanthomonadaceae, Geodermatophilaceae, Actinomycetaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Corynebacteriaceae, Staphylococcaceae, Nocardioidaceae, Verrucomicrobiaceae, Sphingomonadaceae, Mycobacteriaceae, Tissierellaceae, Chitinophagaceae, Intrasporangiaceae, Propionibacteriaceae, Aurantimonadaceae, Planococcaceae, Fusobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae, Nocardiaceae, Dermabacteraceae, Bacillaceae, Thermaceae, Ellin6075, Brevibacteriaceae, Microbacteriaceae, Rhodospirillaceae, Cytophagaceae, Fimbriimonadaceae, Dermacoccaceae, Chromatiaceae, Rhizobiaceae, Gordoniaceae, mitochondria, Pseudonocardiaceae, Exiguobacteraceae, Shewanellaceae, F16, Rs-045, 및 Aeromonadaceae로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 과(family) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  30. 제17항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 천식환자 유래 샘플과 비교하여 Trabulsiella, Enterobacter, Veillonella, Bifidobacterium, Lachnospira, Comamonas, Bacteroides, Turicibacter, Sutterella, Klebsiella, SMB53, Roseburia, Dialister, Ruminococcus, Parabacteroides, Butyricimonas, Odoribacter, Eubacterium, Dorea, Enhydrobacter, Granulicatella, Chryseobacterium, Porphyromonas, Coprococcus, Peptoniphilus, Microbispora, Deinococcus, Acinetobacter, Aerococcus, Actinomyces, Brevundimonas, Blastomonas, Citrobacter, Lactobacillus, Stenotrophomonas, Corynebacterium, Pseudomonas, Lautropia, Akkermansia, Staphylococcus, Bacillus, Sphingobacterium, Anaerococcus, Neisseria, Leptotrichia, Mycobacterium, Kocuria, Methylobacterium, Propionibacterium, Hymenobacter, Sphingomonas, Fusobacterium, Brachybacterium, Rhodococcus, Micrococcus, Kaistobacter, Finegoldia, Rubellimicrobium, Brevibacterium, Agrobacterium, Dietzia, Fimbriimonas, Flavobacterium, Dermacoccus, Skermanella, Novosphingobium, Gordonia, Rheinheimera, Achromobacter, Hydrogenophilus, Thermus, Exiguobacterium, Shewanella, Ralstonia, 및 Alkanindiges로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 속(genus) 세균 유래 세포밖 소포의 함량 증감을 비교하는 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  31. 제17항에 있어서,
    상기 피검체 샘플은 혈액인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 혈액은 전혈, 혈청, 혈장, 또는 혈액 단핵구인 것을 특징으로 하는, 폐암 진단방법.
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