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WO2018181515A1 - 新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物 - Google Patents

新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物 Download PDF

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WO2018181515A1
WO2018181515A1 PCT/JP2018/012845 JP2018012845W WO2018181515A1 WO 2018181515 A1 WO2018181515 A1 WO 2018181515A1 JP 2018012845 W JP2018012845 W JP 2018012845W WO 2018181515 A1 WO2018181515 A1 WO 2018181515A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
glucose
steviol
glycoside
seq
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/012845
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一考 岩城
宮川 克郎
栄一郎 小埜
正良 平井
美佐 落合
浩二 長尾
聡一郎 浦井
健宏 渡辺
紘樹 藤川
Original Assignee
サントリーホールディングス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by サントリーホールディングス株式会社 filed Critical サントリーホールディングス株式会社
Priority to JP2019510000A priority Critical patent/JP6789382B2/ja
Priority to SG11201908370V priority patent/SG11201908370VA/en
Priority to NZ758479A priority patent/NZ758479A/en
Priority to ES18774610T priority patent/ES2942429T3/es
Priority to AU2018243332A priority patent/AU2018243332B2/en
Priority to EP18774610.2A priority patent/EP3611179B1/en
Priority to BR112019020304-4A priority patent/BR112019020304B1/pt
Priority to CN201880021489.7A priority patent/CN110621686A/zh
Priority to US16/498,034 priority patent/US11873521B2/en
Publication of WO2018181515A1 publication Critical patent/WO2018181515A1/ja

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/30Artificial sweetening agents
    • A23L27/33Artificial sweetening agents containing sugars or derivatives
    • A23L27/36Terpene glycosides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L2/00Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
    • A23L2/52Adding ingredients
    • A23L2/60Sweeteners
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07HSUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20Carbocyclic rings
    • C07H15/24Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/256Polyterpene radicals
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16Yeasts; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85Saccharomyces
    • C12R2001/865Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to a novel steviol glycoside, a method for producing the same, and a sweetener composition containing the same.
  • the present invention further relates to foods and drinks, plants and extracts thereof, and flavor enhancers containing the novel steviol glycosides.
  • Stevia rebaudiana leaves contain a secondary metabolite called steviol, a diterpenoid, and steviol glycosides are about 300 times sweeter than sugar, making them calories. It is used in the food industry as a sweetener. Obesity has been developed internationally as a serious social problem, and the demand for calorie-free sweeteners is increasing day by day from the viewpoint of promoting health and reducing medical costs.
  • Stevia's main steviol glycoside is finally modified with a sugar to a glycoside called Rebaudioside A (Reb.A) with four sugars ( Figure 1).
  • Stevioloside the steviol trisaccharide glycoside, which is the precursor, is the most quantitatively, and these two are the central substances of Stevia's sweetness.
  • Stevioside has the highest content in stevia leaves and is known to exhibit sweetness about 250 to 300 times that of sugar.
  • Reb.A is a steviol tetrasaccharide glycoside with high sweetness (350 to 450 times that of sugar) and good taste, and these are attracting attention as calorie-less sweeteners.
  • glycosides that are considered to be reaction intermediates and analogs with different types of sugars are known.
  • Rebaudioside sugars of Reb.A are glucose, but among them, rebaudioside C (Reb.C) in which rhamnose is added instead of glucose at the 2nd position of glucose at the 13th position, Rebaudioside F (Reb.F) with xylose added at the position is known.
  • Rebaudioside C Reb.C
  • Rebaudioside F Reb.F
  • Reb.A where all four glycoside sugars are glucose, has a good taste so far, it is said that Stevia plants with higher Reb.A content than wild type Stevia plants will be obtained by breeding etc. Attempts have been made (for example, Patent Document 1).
  • some stevia varieties that have undergone breed improvement may contain trace amounts of steviol glycosides whose structure has not yet been specified. It may have a characteristic flavor.
  • research on steviol glycosides in which glucose is further added to Reb.A and varieties containing the same have been progressed, but varieties containing many steviol glycosides containing rhamnose such as Reb.C
  • an object of the present invention is to determine the structure of a trace amount of novel steviol glycosides that affect the taste quality and grasp the taste quality characteristics.
  • a further object of the present invention is to provide a novel steviol glycoside, a process for producing the same, and a sweetener composition containing the same.
  • the present inventors have succeeded in determining the structure of a small amount of a novel steviol glycoside that affects taste quality.
  • the present invention is based on the above findings.
  • a small amount of novel steviol glycosides that affect taste quality can be provided. Furthermore, according to this invention, the manufacturing method of a novel steviol glycoside, the sweetener composition containing the novel steviol glycoside, food-drinks, a plant, its extract, and a flavor enhancer can be provided.
  • FIG. 3 is a diagram showing a selected ion chromatogram of sample 1 with m / z 1095.4. It is a figure which shows the selected ion chromatogram of m / z
  • (A) is a view showing a 1 H-NMR spectrum (800 MHz, Pyr-d5) of Compound 15, and
  • (b) is a view showing a 13 C-NMR spectrum (200 MHz, Pyr-d5) of Compound 15.
  • (A) is a diagram showing the 1 H- 1 H cozy spectrum of the compound 15 (800MHz, Pyr-d5) , a diagram showing a (b) the HSQC spectrum of compound 15 (800MHz, Pyr-d5) .
  • (A) is a view showing the HMBC spectrum (800 MHz, Pyr-d5) of Compound 15, and (b) is a view showing the TOCSY spectrum (800 MHz, Pyr-d5) of Compound 15.
  • FIG. 5 shows a NOESY spectrum (800 MHz, Pyr-d5) of Compound 15.
  • (A) is a diagram showing a 1 H-NMR spectrum (800 MHz, Pyr-d5) of Compound 17, and (b) is a diagram showing a 13 C-NMR spectrum (200 MHz, Pyr-d5) of Compound 17.
  • (A) is a diagram showing the 1 H- 1 H cozy spectrum (800MHz, Pyr-d5) of Compound 17 is a diagram showing a (b) the HSQC spectrum of compound 17 (800MHz, Pyr-d5) .
  • (A) is a figure which shows the HMBC spectrum (800MHz, (Pyr-d5)) of the compound 17
  • (b) is a figure which shows the TOCSY spectrum (800MHz, (Pyr-d5)) of the compound 17.
  • FIG. 5 shows a NOESY spectrum (800 MHz, Pyr-d5) of Compound 17. It is a figure which shows the extraction ion chromatogram of novel steviol glycoside 1 (stevia leaf extract) and a chemically synthesized product ( ⁇ form of compound 15). It is a figure which shows the MS / MS and MS3 fragmentation mass spectrum of novel steviol glycoside 1 (stevia leaf extract) and a chemically synthesized product ( ⁇ form of compound 15). It is a figure which shows the extraction ion chromatogram of novel steviol glycoside 2 (stevia leaf extract) and a chemically synthesized product ( ⁇ form of compound 17).
  • rebaudioside In this specification, “rebaudioside”, “rebaudioside” and “Reb.” Have the same meaning, and all mean “rebaudioside”. Similarly, in the present specification, “zulcoside” has the same meaning as “zulcoside”, and both mean “dulcoside”.
  • novel steviol glycosides The present inventors have identified for the first time the structure of a trace amount of a novel steviol glycoside that affects taste quality.
  • the novel steviol glycoside of the present invention (hereinafter also referred to as “the glycoside of the present invention”) has the formula (1): (Where R represents the formula (2) or the formula (3): Represents the sugar chain of glc represents glucose and rha represents rhamnose) Or a derivative, salt, or hydrate thereof.
  • the glycoside of the present invention has a sugar chain containing two molecules of glucose and one molecule of rhamnose at position 13 of steviol, and one molecule of glucose and one molecule of rhamnose or 2 at position 19. It has a sugar chain that contains a molecule of glucose and a molecule of rhamnose.
  • glc represents glucose and rha represents rhamnose.
  • glc may be ⁇ -glucose or ⁇ -glucose, and rha may be ⁇ -rhamnose or ⁇ -rhamnose.
  • glc may be ⁇ -glucose and ⁇ -glucose, and rha may be ⁇ -rhamnose and ⁇ -rhamnose.
  • Glc-1- indicates that the carbon atom at the 1-position of glucose is glycosidically bonded to steviol
  • glc (1-3) -glc-1- indicates “glc-1-”.
  • glycoside A examples include glycosides having structures represented by formulas (11) and (12).
  • Glycoside A represented by the formula (11) has a ⁇ -glucoside bond to the 19th carboxyl group of steviol
  • the glycoside A represented by the formula (12) is a 19th carboxyl group of steviol.
  • Glucose has an ⁇ -glucoside bond.
  • glycoside B examples include glycosides having structures represented by formula (13) and formula (14).
  • Glycoside B represented by the formula (13) has a ⁇ -glucoside bond to the 19th carboxyl group of steviol
  • the glycoside B represented by the formula (14) is a 19th carboxyl group of steviol.
  • Glucose has an ⁇ -glucoside bond.
  • the glycoside of the present invention includes isomers such as ⁇ -form and ⁇ -form as described above. Therefore, the glycoside of the present invention may be only ⁇ -form, ⁇ -form alone, or a mixture of ⁇ -form and ⁇ -form.
  • the ⁇ -form ratio is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, further preferably 95% or more, and more preferably 99% or more. Particularly preferred.
  • the ⁇ and ⁇ isomers are isolated by using known methods such as high performance liquid chromatography (High Performance Liquid Chromatography: HPLC) and ultra high performance liquid chromatography (Ultra (High) PerformancePerLiquid chromatography: UPLC). -It can be purified.
  • the glycoside of the present invention may be not only a compound represented by the formula (1) but also a derivative, salt or hydrate thereof.
  • the “derivative” means a compound formed by a structural change of a small part in the compound, for example, a compound in which a part of the hydroxyl group is substituted with another substituent. To do.
  • a part of the hydroxyl group contained in the compound is selected from hydrogen, halogen, alkyl group, alkenyl group, alkynyl group, aryl group, amino group, cyano group and the like. And a compound substituted with a substituent.
  • a salt of a compound of formula (1) means a physiologically acceptable salt of a compound of formula (1), such as a sodium salt.
  • the “hydrate of the compound of the formula (1)” means a compound in which a water molecule is added to the compound of the formula (1).
  • the glycoside of the present invention is not particularly limited, but may be a plant-derived product, a chemical synthesis product, or a biosynthesis product. For example, it may be isolated and purified from a plant body rich in Reb.C, but may be obtained by chemical synthesis or biosynthesis. The detail of the manufacturing method of the glycoside of this invention is mentioned later in this specification.
  • the glycoside of the present invention has a sweetness higher than that of sugar (sucrose), has an early sweetness rise, and has a taste that is as good as sugar. It can affect taste quality just by being included. Therefore, the glycoside of the present invention can be used as a novel sweetener.
  • glycoside A is selected from glycoside A or glycoside B.
  • Glycoside B has a sweetness higher than that of sugar (sucrose), has a fast onset of sweetness, has a good sweetness after-sugaring, and has high water solubility. Therefore, it can be suitably used for various uses as a sweetener as described later.
  • Glycoside A is less sweet than Glycoside B, but has a higher sweetness than sugar (sucrose) and has a fast onset of sweetness. .
  • Glycoside A can also be suitably used as a sweetener in the same manner as Glycoside B, but has a lower water solubility than Glycoside B, so that it is a lactic acid bacteria beverage, suspension-loaded beverage, and turbidity. It can be particularly preferably used for beverages having Moreover, it can be used suitably also for sweetness adjustments, such as a pharmaceutical.
  • the low water solubility makes it possible to enhance the throat irritation while suppressing the bitter taste felt on the tongue, which is advantageous for improving the drinking quality of the beverage.
  • sweetener composition comprising a novel steviol glycoside
  • a sweetener composition comprising a compound represented by formula (1), or a derivative, salt or hydrate thereof (hereinafter referred to as Also referred to as “sweetener composition of the present invention”).
  • the sweetener composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains a compound represented by the formula (1) or a derivative, salt or hydrate thereof, and a compound represented by the formula (1) or a derivative thereof.
  • a composition containing an extract containing a salt or hydrate is not particularly limited as long as it contains a compound represented by the formula (1) or a derivative, salt or hydrate thereof.
  • the amount of the glycoside of the present invention contained in the sweetener composition of the present invention is not particularly limited.
  • the sweetener composition of the present invention is preferably a composition comprising the glycoside of the present invention in an amount at least 0.01% greater than the amount present in wild-type stevia or stevia extract.
  • the glycoside of the present invention was first detected from varieties rich in Reb.C, and was not contained or contained in wild type stevia or its extract. Even if it is the amount below the detection limit value.
  • the sweetener composition of the present invention may further contain other steviol glycosides.
  • the sweetener composition of the present invention comprises, in addition to the glycoside of the present invention, rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, Rebaudio Side F, Rebaudio Side I, Rebaudio Side J, Rebaudio Side K, Rebaudio Side N, Rebaudio Side M, Rebaudio Side O, Rebaudio Side Q, Rebau
  • steviol glycosides selected from the group consisting of Dioside R, Dulcoside A, Dulcoside C, Rubusoside, Steviol, Steviol Monoside, Steviolbioside and Stevioside may be further included.
  • “zulcoside C” refers to a compound having the following structure.
  • the composition ratio of the glycoside of the present invention to other steviol glycosides is preferably 0.01: 9.99 to 6: 4 by mass ratio.
  • the sweetener composition of the present invention may further contain a general sweetener.
  • Such common sweeteners include fructose, sugar, fructose glucose liquid sugar, glucose, maltose, sucrose, high fructose liquid sugar, sugar alcohol, oligosaccharides, honey, sugarcane juice (brown molasses), starch syrup, Natural sweeteners such as Rahan fruit powder, Rahan fruit extract, licorice powder, licorice extract, Somatococcus danieri seed powder, Somatococcus danieri seed extract, and artificial sweeteners such as acesulfame potassium, sucralose, neotame, aspartame, saccharin Etc.
  • natural sweeteners are preferably used from the viewpoints of refreshing, ease of drinking, natural taste, and imparting an appropriate richness, and fructose, glucose, maltose, sucrose, and sugar are particularly preferably used. Only one kind of these sweetening ingredients may be used, or a plurality of kinds may be used.
  • a food / beverage product comprising the compound represented by formula (1), or a derivative, salt or hydrate thereof (hereinafter referred to as “the food / beverage product of the present invention”).
  • the food or drink of the present invention is not particularly limited as long as it contains a compound represented by formula (1), or a derivative, salt, or hydrate thereof, and a compound represented by formula (1), or a derivative or salt thereof.
  • the food / beverage products containing the extract containing a hydrate, and a sweetener composition may be sufficient.
  • the food and drink means beverages and foods. Accordingly, in one embodiment, the present invention provides a novel beverage or food and provides a method for producing the beverage or food.
  • the amount of the glycoside of the present invention contained in the food / beverage product of the present invention varies depending on the specific food / beverage product, but is preferably about 0.0004% to 0.8%, preferably 0.04% to 0.00%. 4% is particularly preferable. By setting the content within this range, there is an advantage that post-drawing can be suppressed.
  • the food and drink of the present invention may further contain other steviol glycosides.
  • the sweetener composition of the present invention comprises, in addition to the glycoside of the present invention, rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, Rebaudio Side F, Rebaudio Side I, Rebaudio Side J, Rebaudio Side K, Rebaudio Side N, Rebaudio Side M, Rebaudio Side O, Rebaudio Side Q, Rebau
  • One or more steviol glycosides selected from the group consisting of Dioside R, Dulcoside A, Dulcoside C, Rubusoside, Steviol, Steviol Monoside, Steviolbioside and Stevioside may be further included.
  • the composition ratio of the glycoside of the present invention to other steviol glycosides is preferably 0.01: 9.99 to 6: 4 by mass ratio.
  • the food and drink of the present invention may further contain a general sweetener.
  • Such common sweeteners include fructose, sugar, fructose glucose liquid sugar, glucose, maltose, sucrose, high fructose liquid sugar, sugar alcohol, oligosaccharides, honey, sugarcane juice (brown molasses), starch syrup, Natural sweeteners such as Rahan fruit powder, Rahan fruit extract, licorice powder, licorice extract, Somatococcus danieri seed powder, Somatococcus danieri seed extract, and artificial sweeteners such as acesulfame potassium, sucralose, neotame, aspartame, saccharin Etc.
  • natural sweeteners are preferably used from the viewpoints of refreshing, ease of drinking, natural taste, and imparting an appropriate richness, and fructose, glucose, maltose, sucrose, and sugar are particularly preferably used. Only one kind of these sweetening ingredients may be used, or a plurality of kinds may be used.
  • Examples of the food of the present invention are not particularly limited, but foods include confectionery, bread making, flour, noodles, rice, agricultural and forestry processed foods, livestock processed products, processed fishery products, milk -Dairy products, oils and fats, processed oils and fats, seasonings or other food materials.
  • beverage of the present invention are not particularly limited, but carbonated beverages, non-carbonated beverages, alcoholic beverages, non-alcoholic beverages, beer-taste beverages such as beer and non-alcoholic beer, coffee beverages, tea beverages, Examples include cocoa beverages, nutritional beverages, and functional beverages.
  • the beverage of the present invention may be prepared as a packaged beverage that has been sterilized by heating and packed in a container.
  • the container is not particularly limited, and examples thereof include a PET bottle, an aluminum can, a steel can, a paper pack, a chilled cup, and a bottle.
  • heat sterilization the kind is not specifically limited, For example, it can carry out using normal techniques, such as UHT sterilization and retort sterilization.
  • the temperature of the heat sterilization step is not particularly limited, but is, for example, 65 to 130 ° C., preferably 85 to 120 ° C. and 10 to 40 minutes. However, if a sterilization value equivalent to the above conditions is obtained, sterilization at a suitable temperature for several seconds, for example, 5 to 30 seconds is not problematic.
  • a plant containing a novel steviol glycoside and an extract thereof are provided.
  • the food / beverage products Preferably a drink containing the plant body of this invention or the extract of a plant body is provided.
  • the amount of the glycoside of the present invention contained in the plant of the present invention is not particularly limited, but is preferably 0.001% to 1.000%, and more preferably 0.01% to 0.80%.
  • the plant of the present invention is preferably a plant containing the glycoside of the present invention in a higher content by 0.1% or more than that of the wild type Stevia species.
  • the steviol glycoside of the present invention is not contained at all in the wild-type stevia, or even if it is contained, the amount is below the detection limit value.
  • “Contains a glycoside of the present invention at a content of 0.01% or more higher than that of wild type stevia species” means a unit amount of an extract obtained from fresh leaves (non-dried leaves) of a wild type stevia plant (for example, 10 ml) ), The same unit amount of the extract obtained from fresh leaves (non-dried leaves) of the plant body of the present invention (the wild type stevia) This means that the amount (concentration) of the glycoside of the present invention contained in the same amount as the extract obtained from the leaves of the plant body is 0.01% or more.
  • the plant body of the present invention is 0.02% or more, 0.03% or more, 0.04% or more, 0.05% or more, 0.07% or more, 0.09% or more, 0.10% or more of the glycoside of the present invention compared to the wild type stevia species. 0.15% or higher, 0.20% or higher, 0.40% or higher, 0.60% or higher, 0.80% or higher, 1.0% or higher, 1.50% or higher, 2.00% or higher, 4.00% or higher, 6.00% or higher, 8.00% or higher, 10.00% or higher May be included.
  • the ratio of the glycoside of the present invention to the total steviol glycoside is 0.01% or more” is present in the extract obtained from fresh leaves (non-dried leaves) of the stevia plant of the present invention. It means that the glycoside of the present invention is present at a ratio of 0.01% or more with respect to the total amount of steviol glycoside.
  • the total steviol glycoside does not include unknown steviol glycosides, nor does it include steviol glycosides that are present below the detection limit.
  • the total steviol glycoside is rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudio.
  • the content of the glycoside of the present invention in the plant of the present invention is as described above, but when the dried leaf is obtained from the plant of the present invention, the glycoside of the present invention relative to the weight of the dried leaf.
  • the dry leaves of the plant body of the present invention means that the fresh water content of the plant body of the present invention is dried, so that the water content is 10 wt% or less, 7 wt% or less, 5 wt% or less, 4 wt% or less, 3
  • the weight is reduced to not more than wt%, not more than 2 wt%, not more than 1 wt%.
  • the moisture content of the dried leaves of the plant of the present invention is 3 to 4% by weight.
  • Examples of the plant body of the present invention include, for example, a plant body containing a large amount of Reb.C.
  • the steviol glycoside of the present invention is not contained at all in the wild-type stevia, or even if it is contained, the amount is below the detection limit value.
  • the present inventors have found that the steviol glycosides of the present invention are contained more in plants containing a large amount of Reb.C. Therefore, novel steviol glycosides and extracts thereof include plants and extracts thereof that are rich in such Reb.C.
  • Such a plant containing a large amount of Reb.C is not particularly limited.
  • examples include recombinant stevia plants and plants having a rebaudioside C ratio of 40% or more in the total steviol glycosides (hereinafter also referred to as “high Reb.C plants”).
  • Such a high Reb.C plant is, for example, a high rebaudioside C-containing non-genetically modified stevia plant containing 20% or more of rebaudioside C in comparison with the wild type stevia species. And the plant body whose ratio of rebaudioside C to the total steviol glycoside is 40% or more is mentioned.
  • the high Reb.C plant is a species derived from a wild Stevia plant, and has a gene that has been mutated so that rebaudioside C is high.
  • the mutation of the gene is not particularly limited, and examples thereof include those that occur under natural conditions, those that occur by non-genetic recombination techniques, and those that occur by genetic recombination.
  • High Reb.C plants can be screened, for example, by detecting a gene polymorphism from the tissue of the plant.
  • “screening” means identifying a high Reb.C plant body and other plant bodies and selecting a high Reb.C plant body.
  • the high Reb.C plant can also be obtained by a screening method comprising the step of identifying a polymorphism in which the 60th base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 is mutated from wild type A to T in the genome of the test plant. Can be screened.
  • the plant body of the present invention includes not only the whole plant body but also a plant organ (eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.), plant tissue (eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, fence-like shape) Tissue, spongy tissue, etc.) or various forms of plant cells (eg, suspension culture cells), protoplasts, leaf sections, callus, and the like.
  • a plant organ eg, leaf, petal, stem, root, seed, etc.
  • plant tissue eg, epidermis, phloem, soft tissue, xylem, vascular bundle, fence-like shape
  • Tissue eg, spongy tissue, etc.
  • various forms of plant cells eg, suspension culture cells
  • protoplasts eg, leaf sections, callus, and the like.
  • the plant body of the present invention may include a tissue culture or a plant culture cell. It is because a plant body can be regenerated by culturing such tissue culture or plant culture cells.
  • tissue culture or plant culture cells of the plant of the present invention include embryos, meristem cells, pollen, leaves, roots, root tips, petals, protoplasts, leaf sections, and callus. It is not limited.
  • the plant extract of the present invention can be obtained by reacting the fresh or dried leaves of the plant of the present invention with an appropriate solvent (an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone). It can.
  • an appropriate solvent an aqueous solvent such as water or an organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • the plant extract of the present invention preferably contains the glycoside of the present invention in a content higher by 0.01% or more than the wild type stevia species, and the ratio of the glycoside of the present invention to the total steviol glycosides Is 0.01% or more.
  • “contains the glycoside of the present invention in a content higher by 0.01% or more than the wild type Stevia species” is as described above.
  • “the ratio of the glycoside of the present invention to the total steviol glycoside is 0.01% or more” is as described above.
  • Flavor modifier containing a novel steviol glycoside The novel steviol glycoside of the present invention is considered to have an influence on the flavor of the stevia extract, although only a trace amount is contained in the stevia extract. . Although not being bound by theory, it is considered that the flavor of food and drink can be adjusted by adding a small amount of the steviol glycoside of the present invention. Therefore, according to one aspect of the present invention, there is provided a flavor adjusting agent comprising a compound represented by the above formula (1) or a derivative, salt or hydrate thereof.
  • the “flavor modifier” refers to a substance that, when added to a food or drink, adjusts the flavor of the food or drink.
  • the flavor adjusting agent of the present invention when added to a food or drink, the flavor of the food or drink itself can be adjusted without the consumer recognizing the taste of the flavor adjuster itself.
  • the steviol glycoside of the present invention has a feature that sweetness is better after that of conventional steviol glycosides, so that it is used as a flavor regulator to adjust the sweetness of food and drink. be able to.
  • the flavor enhancer of the present invention preferably contains one or more other sweeteners in addition to the compound represented by the above formula (1) or a derivative, salt or hydrate thereof.
  • Such sweeteners include rebaudioside A, rebaudioside B, rebaudioside C, rebaudioside D, rebaudioside E, rebaudioside F, rebaudioside I, Rebaudioside J, Rebaudioside K, Rebaudioside N, Rebaudioside M, Rebaudioside O, Rebaudioside Q, Rebaudioside R, Zulcoside A, Zulcoside C, Rubusoside,
  • One or more steviol glycosides selected from the group consisting of steviol, steviolmonoside, steviolbioside and stevioside, fructose, sugar, fructose glucose liquid sugar, glucose, maltose, sucrose, high fructose liquid sugar, sugar alcohol , Oligosaccharides, honey, sugar cane juice (brown molasses), chickenpox, r
  • the steviol glycoside of the present invention is produced by (A) isolation / purification from a plant body, (B) chemical synthesis, or (C) biosynthesis. be able to. Each will be described below.
  • the novel steviol glycoside can be isolated and purified from the plant body.
  • the novel steviol glycoside is extracted in the form of an extract by reacting the fresh or dried leaves of the plant of the present invention with an appropriate solvent (aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone). can do.
  • an appropriate solvent aqueous solvent such as water or organic solvent such as alcohol, ether and acetone.
  • ethyl acetate and other organic solvents water gradient, high-performance liquid chromatography (High Performance Liquid Chromatography: HPLC), ultra-high performance liquid chromatography (Ultra (High) Performance)
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Ultra (High) Performance Ultra-high performance liquid chromatography
  • UPLC Liquid Chromatography
  • novel steviol glycoside content in the plant body can be measured by the method described in WO2016 / 090460 or the method described in Examples described later. Specifically, it can be measured by sampling fresh leaves from the plant of the present invention and performing LC-MS / MS.
  • Steviol glycosides have a structure in which various sugar canes (glucose, rhamnose, xylose, etc.) are added to steviol of aglycone in various bond forms (bonding position and solid). Therefore, the target steviol glycoside can be obtained through various synthetic routes depending on the starting material selected. However, it is understood by those skilled in the art of the present invention that the time and yield for obtaining the target compound vary greatly depending on the synthesis route.
  • the present inventors have now known a novel method for producing the steviol glycoside of the present invention with high selectivity and high yield by a specific synthetic route.
  • the method for producing steviol glycosides according to the present invention when chemical synthesis of steviol glycosides is performed, as shown in Scheme 1, steviol glycosides are divided into “steviol glycosides” and “sugar hemiacetal bodies”. And proceed with synthesis.
  • Steviol glycoside can be prepared by deriving from existing natural products (rebaudioside, zulcoside, stevioside, steviolbioside, rubusoside, etc.).
  • sugar hemiacetal bodies can be prepared from existing natural products, or can be prepared by chemical synthesis. The present inventors have found that when steviol glycoside and sugar hemiacetal are condensed using Mitsunobu reaction, the desired steviol glycoside can be obtained with good yield and extremely high ⁇ selectivity.
  • a method for producing a compound represented by the formula (1) (A) The following formula (4): (Where glc represents glucose and rha represents rhamnose) From the rebaudioside C shown by the following formula (5): (Wherein p-glc represents glucose in which at least one hydroxyl group is protected with a protecting group, and p-rha represents rhamnose in which at least one hydroxyl group is protected with a protecting group.) From the step of preparing intermediate 1 represented by formula (B) and glucopyranoside derivative (6): Or an intermediate 2 represented by formula (7): (Wherein p-glc represents glucose in which at least one hydroxyl group is protected with a protecting group, and p-rha represents rhamnose in which at least one hydroxyl group is protected with a protecting group) A step of preparing an intermediate 3 represented by: (C) The intermediate 1 and the intermediate 2 or 3 are reacted in the presence of a phosphine
  • examples of the protecting group include an acyl protecting group, a trisubstituted silyl group, an acetal protecting group, and an ether protecting group.
  • Preferable examples include trisubstituted silyl groups (such as trimethylsilyl group, triethylsilyl group, and t-butyldimethylsilyl group) or acyl protecting groups (such as acetyl group and benzoyl group).
  • Steviol glycoside can be obtained, for example, according to the following scheme 2 using naturally occurring rebaudioside C (zulcoside B) as a raw material.
  • rebaudioside® C is dissolved in a solvent such as methanol and water, a strong base such as sodium hydroxide is added, and the mixture is refluxed at 60 ° C. to 120 ° C. for 2 hours or longer.
  • a strong base such as sodium hydroxide
  • the glucose molecule is eliminated from the position, and the compound 2 is obtained.
  • the solvent may be evaporated after neutralizing the reaction solution with a cation exchange resin or the like.
  • Compound 2 can be obtained by further dissolving compound 2 in a solvent such as pyridine and protecting the hydroxyl group contained in compound 2 by adding acetic anhydride or the like.
  • Step 2a Synthesis of the disaccharide hemiacetal body (Step 2a) is shown in Scheme 3, and synthesis of the trisaccharide hemiacetal body (Step 2b) is shown in Scheme 4.
  • compound 6 is dissolved in a solvent such as ethanol or THF, a catalyst such as palladium hydroxide is added at room temperature, and the reaction is completed by stirring at room temperature for 2 hours or more in a hydrogen atmosphere, and then the catalyst is filtered off.
  • a solvent such as pyridine
  • acetic anhydride is added at room temperature, and the mixture is stirred at room temperature for 12 to 36 hours. Thereafter, the solution is concentrated under reduced pressure, acetonitrile and water are added, an oxidizing agent such as cerium ammonium nitrate is added, and the mixture is stirred for 5 minutes to 2 hours to obtain compound 8 (intermediate 2).
  • compound 6 is dissolved in a solvent such as ethanol or THF, a catalyst such as palladium hydroxide is added at room temperature, and the reaction is completed by stirring at room temperature for 2 hours or more in a hydrogen atmosphere, and then the catalyst is filtered off.
  • a solvent such as ethanol or THF
  • a catalyst such as palladium hydroxide
  • the reaction is completed by stirring at room temperature for 2 hours or more in a hydrogen atmosphere, and then the catalyst is filtered off.
  • Compound 9 is obtained by dissolving compound 7 in acetonitrile, adding benzaldehyde dimethyl acetal at room temperature, and stirring for 2 hours or more.
  • Steps 1 and 2 Second, by reacting the disaccharide hemiacetal or trisaccharide hemiacetal obtained in Steps 1 and 2 (2a or 2b) with steviol glycoside by Mitsunobu reaction, the 19-position carboxyl group of steviol is reacted with disaccharide.
  • a glycoside in which a hemiacetal body or a trisaccharide hemiacetal body is selectively bound can be obtained.
  • these compounds are dissolved in 1,4-dioxane, phosphine reagents such as tributylphosphine or triphenylphosphine, and azo compounds such as 1,1'-Azobis (N, N'-dimethylformamide) (TMAD).
  • the steviol glycoside of the present invention introduces a polynucleotide encoding a predetermined protein into host cells derived from bacteria, plants, insects, mammals other than humans, etc., and steviol or steviol glycosides.
  • Glucose, UDP-glucose and / or UDP-rhamnose can also be produced as a substrate.
  • the substrates steviol, steviol glycoside, UDP-glucose, and UDP-rhamnose may be given or biosynthesized in cells.
  • Examples of the predetermined protein include stevia-derived UGT85C2 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 2), UGT74G1 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 4), UGT91D2 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 6), UGT76G1 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 8).
  • UDP-rhamnose synthase AtRHM2 (amino acid sequence is SEQ ID NO: 10) derived from Arabidopsis thaliana, but are not limited thereto as long as they have equivalent activities.
  • the above protein is an enzyme derived from Arabidopsis thaliana or stevia, and is expected to have a high activity even in an environment outside plant cells such as Arabidopsis thaliana or stevia (for example, extracellular, in host cells other than stevia).
  • a polynucleotide encoding the above protein for example, UGT85C2 gene is SEQ ID NO: 1, UGT74G1 gene is SEQ ID NO: 3, UGT91D2 gene is SEQ ID NO: 5, UGT76G1 gene is SEQ ID NO: 7, and AtRHM2 gene is SEQ ID NO: 9). Introduced into host cells derived from bacteria, fungi, plants, insects, mammals other than humans, etc.
  • the substrate steviol, steviol glycosides, UDP-glucose, UDP-rhamnose to give the compounds of the present invention.
  • the compound of the present invention can be produced by expressing the protein in a host cell and providing an appropriate substrate.
  • a method for producing the novel steviol glycoside of the present invention wherein a non-human transformant introduced with at least one of the following polynucleotides (a) to (g) is used: A method characterized by this is provided.
  • A a polynucleotide encoding a protein having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having an activity of adding glucose to the hydroxyl group at position 13 of steviol glycoside
  • b A polynucleotide encoding a protein having 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and having an activity of adding glucose to a carboxylic acid at position 19 of a steviol glycoside
  • c A polynucleotide encoding a protein having 90% or more identity to the amino acid sequence of 6 and having an activity of adding rhamnose to glucose bound at position 13 of steviol glycosides in a 1 ⁇ 2 bond
  • d It has 90% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and is a 1 ⁇ 3 bond at the 3rd position of glucose at the 13th position of steviol glycoside.
  • a polynucleotide encoding a protein having an activity of adding glucose via a 1 ⁇ 3 bond (g) having at least 90% identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 and from UDP-glucose to UDP- Polynucleotide encoding a protein having activity to generate rhamnose
  • 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more independently of the base sequence of each SEQ ID NO described in the above (a) to (g), 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, Polynucleotides having a sequence identity of 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more may be used.
  • amino acid sequence has a sequence identity of 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, or 99.9% or more, and is described in (a) to (g) above.
  • a protein having a predetermined activity may be used.
  • the polynucleotide encoding the protein is preferably introduced into the host in a state of being inserted into an appropriate expression vector.
  • the polynucleotides may be individually inserted into separate vectors.
  • Suitable expression vectors are usually (I) a promoter capable of transcription in a host cell; (Ii) a polynucleotide of the present invention linked to the promoter; and (iii) an expression cassette comprising, as a component, a signal that functions in a host cell for transcription termination and polyadenylation of an RNA molecule. .
  • the method for producing an expression vector includes, but is not limited to, a method using a plasmid, phage or cosmid, or a DNA molecule having a necessary component.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and a vector that can be expressed in the host cell can be appropriately selected. That is, according to the type of the host cell, a promoter sequence is appropriately selected in order to reliably express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like is used as an expression vector. Good.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, promoter, terminator and / or origin of replication) depending on the type of host to be introduced.
  • Conventional promoters for example, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.
  • yeast promoters include glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, PH05 promoter,
  • the promoter for filamentous fungi include amylase and trpC.
  • promoters for expressing a target gene in plant cells include cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter, rd29A gene promoter, rbcS promoter, and enhancer sequences of the cauliflower mosaic virus 35S RNA promoter derived from Agrobacterium. And the mac-1 promoter added to the 5 'side of the mannopine synthase promoter sequence.
  • animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • promoters that are inducibly activated by external stimuli include mouse mammary tumor virus (MMTV) promoter, tetracycline responsive promoter, metallothionein promoter, heat shock protein promoter, and the like.
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • auxotrophic markers LEU2, URA3, HIS3, TRP1, ura5, niaD
  • drug resistance markers hygromycin, zeocin
  • geneticin resistance gene G418r
  • copper resistance gene CUP1
  • cerulenin resistance gene fas2m, PDR4
  • Minoru Ogura et al., Biochemistry, vol. 64, p. 660, 1992; Hussain et al., Gene, vol. 101, p. 149, 1991 can be used.
  • a host cell transformation method As a host cell transformation method, a commonly known method can be used. For example, electroporation method (Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, p. 4655-4661, 2000), particle delivery method (JP 2005-287403), sphero Plast method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978), lithium acetate method (J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983), Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A) Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual)), but is not limited thereto.
  • electroporation method Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., Vol. 66, p. 4655-4661, 2000
  • particle delivery method JP 2005-287403
  • sphero Plast method Proc. Natl. Aca
  • non-human transformant By culturing the non-human transformant thus obtained, it is possible to cause the non-human transformant to produce steviol glycosides.
  • a non-human transformant is preferably yeast.
  • sample 1 is a high Reb.C plant having a polymorphism in which the 60th nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 is mutated from A to T in the genome.
  • the polymorphism had a statistical correlation with the phenotype of high Reb.C concentration. It became clear.
  • test solution was prepared by weighing 10.0 mg of each dried stevia leaf that had been lyophilized into a glass vial, adding 1.0 ⁇ mL of water / methanol (1/1 vol / vol) as an extraction solvent, and then ultrasonically washing.
  • a steviol glycoside extract was obtained from stevia leaves by irradiating ultrasonic waves at a set temperature of 25 ° C. for 20 minutes with a vessel (AS ONE, AS52GTU). Further, for use in HPLC-MS, it was diluted 10-fold with water / methanol and filtered through a filter (Nacalai Tesque, Cosmonis filter S (solvent system)) having a pore size of 0.45 ⁇ m.
  • LC mobile phase mobile phase A is 0.2% acetic acid-containing milli-Q water
  • mobile phase B is methanol
  • the binary gradient is kept constant at 10% mobile phase B concentration for 0 ⁇ 5 minutes, then for 15 minutes.
  • the mobile phase B concentration was changed from 10% to 70%, and the B concentration was further changed from 70% to 100% in 5 minutes.
  • the mobile phase B concentration was maintained at 100% for 5 minutes.
  • the flow rate of the mobile phase was 0.4 ⁇ mL / min, and 5 ⁇ L of stevia leaf extract that had been diluted and filtered was injected.
  • MS was a triple quadrupole mass spectrometer LCMS-8030 (Shimadzu Corporation) equipped with an electrospray ionization (ESI) ion source.
  • the mass spectrometry measurement was performed in a negative ion measurement mode and a selected ion monitoring (SIM) mode in which measurement is performed by selecting an m / z value.
  • the m / z value to be selected is the m / z value calculated based on the molecular weight of steviol glycosides in which D-glucopyranosyl (Glc), L-rhamnopyranosyl (Rha), and xylopyranosyl (Xyl) are composed of sugar chains. Selected.
  • m / z 641.2 (Glc (2)), 773.2 (Glc (2), Xyl (1)), 787.2 (Glc (2), Rha (1)), 803.2 (Glc (3)), 935.3 ( Glc (3), (Xyl (1)), 949.3 (Glc (3), Rha (1)), 965.3 (Glc (4)), 1095.4 (Glc (3), Rha (2)), 1097.4 (Glc (4) ), Xyl (1)), 1111.4 (Glc (4), Rha (1)), 1127.4 (Glc (5)), 1257.5 (Glc (4), Rha (2)), 1259.5 (Glc (5), Xyl (1)), 1273.5 (Glc (5), Rha (1)), 1289.5 (Glc (6)), 1435.6 (Glc (6), Rha (1)) were selected.
  • Figure 2 shows the selected ion chromatogram of sample 1 (EM3-4) m / z 1095.4.
  • sample 1 EM3-4
  • m / z 1095.4 modified sugar chain of steviol glycosides contains 3 glucose (Glc) and 2 rhamnose (Rha)
  • Glc glucose
  • Rha 2 rhamnose
  • the peak of Rt228.73 shown in FIG. 2 is an unknown substance.
  • the peak value of Rt 28.73 min from the sample 3 in which the content of rebaudioside C is lower than that of rebaudioside A and the sugar chain elongation is lower than the other samples was below the detection limit.
  • Fig. 3 shows the selected ion chromatogram of sample 1 (EM3-4) for m / z 1257.5.
  • EM3-4 modified sugar chain of steviol glycosides
  • Rha 2 rhamnose
  • HPLC-ESI-HRMS high-performance liquid chromatography-electrospray ionization accurate mass spectrometry
  • the HPLC instrument configuration uses a Prominence LC-20AD (Shimadzu Corporation) for the liquid-feed unit LC pump, and a separation column.
  • SM-C18 (4.6 x 250 mm) (manufactured by Intact) was used.
  • LC mobile phase 0.2% acetic acid-containing milliQ water is used as mobile phase A, methanol is used as mobile phase B, and the binary gradient is constant at a mobile phase B concentration of 10% for 0-5 minutes. Thereafter, the mobile phase B concentration was changed from 10% to 70% in 15 minutes, and the B concentration was changed from 70% to 100% in 5 minutes.
  • the mobile phase B concentration was maintained at 100% for 5 minutes.
  • the flow rate of the mobile phase was 0.4 mL / min, and 20 ⁇ L of stevia leaf extract filtered after dilution was injected.
  • Orbitrap Elite MS manufactured by Thermo Fisher Scientific
  • the mass spectrometry measurement was performed in a negative ion measurement mode, in the range of m / z 150-2000, with a setting resolution of 60,000.
  • MS / MS measurement was performed in the CID mode in which the target m / z 1095.4 or 1257.5 was selected and fragmentation was performed by collision with an inert gas.
  • the target ion of MS 3 was the strongest ion in the MS / MS spectrum. Irradiation of energy required for fragmentation was performed at 35, which is a collision energy standard specific to the device.
  • FIG. 4 shows MS / MS and MS 3 fragmented mass spectra of novel steviol glycoside 1 (corresponding to m / z 1095.4, Rt: 28.73). From the MS / MS spectrum of the novel steviol glycoside, a peak was detected as a main peak at m / z 787.38 corresponding to elimination of 1 Glc and 1 Rha. From this result, it is understood that the number of sugar chains ester-bonded to the 19th carbon is one Glc and one Rha. In order to obtain further structural information, an MS 3 spectrum was obtained that fragmented the main peak m / z 787.4 obtained by MS / MS.
  • FIG. 5 shows MS / MS and MS 3 fragmented mass spectra of novel steviol glycoside 2 (corresponding to m / z 1257.5, Rt: 28.50). From the MS / MS spectrum of the novel steviol glycoside, a peak was detected as a main peak at m / z 787.38 corresponding to elimination of 2 Glc and 1 Rha. This result shows that the number of sugar chains ester-bonded to the 19th carbon is 2 Glc and 1 Rha. In order to obtain further structural information, an MS 3 spectrum was obtained that fragmented the main peak m / z 787.4 obtained by MS / MS.
  • rebaudioside C (compound 1), a known natural product, was purchased from Ark Pharm, and the ester bond at the 19th position of steviol was alkali-hydrolyzed, and then the hydroxyl group of the sugar chain was acetyl (Ac).
  • Steviol glycoside was obtained by protecting with a group.
  • disaccharide hemiacetals a disaccharide skeleton is formed by the condensation reaction of an appropriately protected glucose acceptor (compound 4) and rhamnose donor (compound 5), and the protecting group at the 1-position of the reducing end is deprotected. Thus, a disaccharide hemiacetal body was obtained.
  • disaccharide hemiacetal As shown in Scheme 9, disaccharide hemiacetal (compound 8) was synthesized by 4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine- ⁇ -D-glucopyranoside (compound) purchased from Tokyo Kasei. 4) Dissolve (3.0 g, 6.46 mmol), compound 5 (3.3 g, 7.10 mmol) and molecular sieves 4 ⁇ (6.0 g) in dichloromethane (136 mL), and add trifluoromethanesulfonic acid (114 ⁇ L, 1.29 mmol) at room temperature. And stirred at room temperature for 18 hours.
  • Steviol glycoside was obtained by protecting with a group.
  • a disaccharide acceptor (Compound 9) was synthesized from a condensation reaction of a suitably protected glucose acceptor (Compound 4) and a rhamnose donor (Compound 5), and the glucose donor (Compound 10) and As a result of the condensation reaction, a trisaccharide skeleton was obtained.
  • the protecting group at the reducing terminal 1-position of the obtained trisaccharide was deprotected to obtain a trisaccharide hemiacetal body.
  • Stevia leaf cDNA was obtained by extracting total RNA from Stevia leaves using the RNeasy Plant Mini kit (QIAGEN), and 0.5 ⁇ g of the RNA was subjected to reverse transcription (RT) reaction with Random Oligo-dT primer.
  • the PCR reaction solution (50 ⁇ l) was composed of 1 ⁇ l of stevia leaf-derived cDNA, 1 ⁇ KOD plus buffer (TOYOBO), 0.2 mM dNTPs, each primer 0.4 pmol / ⁇ l, 1 mM MgSO 4 , 1 U heat-resistant KOD plus polymerase.
  • the PCR reaction was carried out at 95 ° C. for 5 minutes, and then amplified at 30 ° C. for 0.5 minutes, at 50 ° C. for 0.5 minute, and at 68 ° C. for 2 minutes for a total of 30 cycles of amplification.
  • Each PCR product was electrophoresed on a 0.8% agarose gel and stained with ethidium bromide.
  • a combination of SrUGT85C2 using UGT85C2 as a template, SrUGT91D2 using UGT91D2 as a template, SrUGT74G1 using UGT74G1 as a template, SrUGT76G1 using UGT76G1 as a template, AtAHM2 as a template and primer combination of AtAHM2 and heat-resistant KOD DNA polymerase And restriction enzyme sites were added to both ends of each ORF.
  • the obtained DNA fragment was subcloned using the Zero Blunt-TOPO PCR Cloning Kit (Invitrogen), and sequenced by the primer walking method using a synthetic oligonucleotide primer using DNA®Sequencer® model 3100 (Applied® Biosystems). It was confirmed that each UGT gene was cloned.
  • Transformation of yeast Saccharomyces cerevisiae YPH499 strain (ura3-52 lys2-801 amber ade2-101 ochre trp1- ⁇ 63 his3- ⁇ 200 leu2- ⁇ 1 a) was used as a host, and the plasmids shown in Table 2 were introduced by the lithium acetate method.
  • a strain that grows on SC-Trp & Ura & His agar medium (6.7 g of Yeast nitrogen baase without amino acids, glucose 20 g, amino acid mixed powder-Trp & Ura & His 1.3 g, Bacto agar 20 g per liter) was selected.
  • the amino acid mix powder-Trp & Ura & His is adenine sulfate 2.5 g, L-arginine hydrochloride 1.2 g, L-aspartic acid 6.0 g, L-glutamic acid 6.0 g, L-leucine 3.6 g, L-lysine 1.8 g, L- It was prepared by mixing 1.2 g of methionine, 3.0 g of L-phenylalanine, 22.5 g of L-serine, 12 g of L-threonine, 1.8 g of L-tyrosine, and 9.0 g of L-valine.
  • each transformant was inoculated into 10 ml of SC-Trp & Ura & His liquid medium (excluding Bacto agar of SC-Trp & Ura & His agar medium) and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day.
  • 1 ml of the pre-culture solution is inoculated into 10 ml of SG-Trp & Ura & His liquid medium (6.7 g of Yeast nitrogen baase without amino acids, 20 g of galactose, 1.3 g of amino acid mix powder-Trp & Ura & His per liter) And cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days.
  • SG-Trp & Ura & His liquid medium 6.7 g of Yeast nitrogen baase without amino acids, 20 g of galactose, 1.3 g of amino acid mix powder-Trp & Ura & His per liter
  • the bacterial cells were collected from the culture solution, and total RNA was purified using RNeasy Mini Mini Kit.
  • RNA 1 ⁇ g of total RNA was taken, and cDNA was synthesized using Superscript II reverse transcriptase (Thermo Fisher Scientific) and random hexamer as primers.
  • steviol glycosides Culture was performed under the same conditions as in the above examples, except that 0.5 ⁇ g or 2 ⁇ g of steviol (ChromaDex Inc.) was added to 1 ml of the medium in the liquid medium for main culture. After completion of the culture, the culture solution was separated into a supernatant and cells by centrifugation. The culture supernatant is washed with acetonitrile, applied to a Sep-Pak C18 column equilibrated with water, washed with 20% acetonitrile, eluted with 80% acetonitrile, dried and dissolved in a small amount of 80% acetonitrile. A glycoside sample was prepared. This glycoside sample was subjected to the following analysis.
  • the evaluation was performed by selecting a sucrose-added sample having a sweetness intensity equivalent to that of the sample to which the new steviol glycoside was added, and 5 persons trained in the sweetener sensuality became panelists. Sensory evaluation was performed. As a result, it was found that the prepared sample to which the novel glycoside 2 was added had sweetness equivalent to that of the Brix1 sucrose-added sample. Therefore, it was found that the novel steviol glycoside has a sweetness of 14.7 with respect to sucrose. The new steviol glycoside 1 was not sufficiently dissolved in water, so an accurate sweetness level could not be obtained. However, as described later, it was confirmed that the new steviol glycoside 1 also has sweetness.
  • the obtained beverage samples were subjected to sensory evaluation using the indicators of sweetness rise, sweetness after-effect, sweetness total amount, miscellaneous taste, and miscellaneous after-effect.
  • the miscellaneous taste means unfavorable flavors other than sweet taste such as astringency, including bitter taste in the present specification.
  • Persons who were trained in the sensuality of sweeteners (7 persons: Suntory Foods International Co., Ltd.) were evaluated as panelists, and the evaluation criteria were as follows. Very weak (-3), weak (-2), slightly weak (-1), normal (0), slightly strong (+1), strong (+2), and very strong (+3).
  • the results are shown in FIG.
  • the score shown in the figure is an average value of scores by seven panelists.
  • Compound 17 having the same structure as novel steviol glycoside 2 was found to be Reb. A and Reb.
  • Reb. It was found to have a total sweetness comparable to D.
  • novel steviol glycosides 1 and 2 both have sweetness and are useful as sweeteners. It can also be seen that all glycosides are characterized by a weak undesired flavor such as bitterness. In addition, about the compound 17, it had the flavor similar to the mixture of (alpha) body and (beta) body used for sweetness degree evaluation.

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Abstract

本発明は、Reb.C(ズルコサイドBともいう)を多く含む品種から検出される、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を決定し、その味質特性を把握することを目的とする。本発明によれば、式(1):で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物が提供される。

Description

新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物
 本発明は、新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物に関する。本発明はさらに、新規ステビオール配糖体を含む飲食品、植物およびその抽出物、ならびに風味増強剤にも関する。
 キク科ステビア(Stevia rebaudiana)の葉にはジテルペノイドの一種であるステビオール(Steviol)とよばれる二次代謝産物が含まれており、ステビオール配糖体は砂糖の約300倍もの甘味を呈することからカロリーレスの甘味料として食品産業に利用されている。肥満が深刻な社会問題として国際的に発展しており、健康増進および医療費削減の観点からもカロリーレスの甘味料の要望は日々大きくなっている。現在では人工的に合成されたアミノ酸誘導体のアスパルテーム(Aspartame)やアセスルファムカリウム(Acesulfame Potassium)が人工甘味料として利用されているが、ステビオール配糖体のように天然に存在するカロリーレス甘味料はより安全で消費者理解(Public Acceptance)が得られやすいと期待される。
 ステビアの主要なステビオール配糖体は最終的には4つの糖が付いたレバウディオサイドA (Rebaudioside A; Reb.A)と呼ばれる配糖体にまで糖で修飾される(図1)。その前駆体であるステビオール3糖配糖体のステビオシド(Stevioside)が量的に最も多く、これら2つがステビアの甘味の中心的な物質である。ステビオシドは、ステビア葉で最も含有量が多く、砂糖の250~300倍程の甘味を呈することが知られている。Reb.Aは、甘味が高く(砂糖の350~450倍)、且つ味質が良いとされるステビオール4糖配糖体であり、これらはカロリーレス甘味料として注目されている。これら以外に反応中間体と思われる配糖体や糖の種類が異なる類縁体の存在が知られている。例えば、Reb.Aの4つの配糖体糖はすべてグルコースであるが、このうち13位のグルコースの2位にグルコースではなくラムノースが付加されたレバウディオサイドC(Reb.C)や、同位置にキシロースが付加されたレバウディオサイドF(Reb.F)が知られている。
 これまで4つの配糖体糖がすべてグルコースであるReb.Aの味質が良好であるとして、野生型のステビア植物よりもReb.Aの含有量の多いステビア植物を品種改良等によって得ようという試みがなされている(例えば、特許文献1)。
特許第3436317号公報
 一方で、品種改良を行ったステビア品種の中には、未だ構造が特定されていないステビオール配糖体が微量含まれている場合があり、その微量のステビオール配糖体の存在によってステビア抽出物に特徴的な風味が付与されている可能性がある。また、これまで、Reb.Aにさらにグルコースを付加させたステビオール配糖体およびそれを含む品種の研究は進んでいるが、Reb.Cのようにラムノースを含むステビオール配糖体を多く含む品種や、それに含まれるステビオール配糖体については現時点においてあまり研究が行われていない。
 したがって、本発明の目的は、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を決定し、その味質特性を把握することにある。また、本発明の更なる目的は、新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物を提供することにある。
 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を遂行した結果、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を決定することに成功した。本発明は、上記知見に基づくものである。
 本発明によれば、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体を提供することができる。さらに本発明によれば、新規ステビオール配糖体の製造方法、ならびに新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物、飲食品、植物およびその抽出物、ならびに風味増強剤を提供することができる。
ステビオール配糖体の構造と名称を示す図である。 サンプル1のm/z 1095.4の選択イオンクロマトグラムを示す図である。 サンプル1のm/z 1257.5の選択イオンクロマトグラムを示す図である。 新規ステビオール配糖体1のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。 新規ステビオール配糖体2のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。 (a)は化合物15の1H-NMRスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、(b)は化合物15の13C-NMRスペクトル(200MHz, Pyr-d5)を示す図である。 (a)は化合物15の1H-1H cosyスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、(b)は化合物15のHSQCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。 (a)は化合物15のHMBCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、(b)は化合物15のTOCSYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。 化合物15のNOESYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。 (a)は化合物17の1H-NMRスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、(b)は化合物17の13C-NMRスペクトル(200MHz, Pyr-d5)を示す図である。 (a)は化合物17の1H-1H cosyスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、(b)は化合物17のHSQCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。 (a)は化合物17のHMBCスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図であり、(b)は化合物17のTOCSYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。 化合物17のNOESYスペクトル(800MHz, Pyr-d5)を示す図である。 新規ステビオール配糖体1(ステビア葉抽出物)と化学合成品(化合物15のβ体)の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。 新規ステビオール配糖体1(ステビア葉抽出物)と化学合成品(化合物15のβ体)のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。 新規ステビオール配糖体2(ステビア葉抽出物)と化学合成品(化合物17のβ体)の抽出イオンクロマトグラムを示す図である。 新規ステビオール配糖体2(ステビア葉抽出物)と化学合成品(化合物17のβ体)のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す図である。 生合成により得られたサンプルのm/z 1095.4の選択イオンクロマトグラム示す図である。 生合成により得られたサンプルのm/z 1257.5の選択イオンクロマトグラム示す図である。 新規ステビオール配糖体とレバウディオサイドAおよびレバウディオサイドDとを比較した官能評価の結果を示す図である。
 以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
 本明細書において、「レバウディオサイド」、「レバウディオシド」および「Reb.」は同じ意味を表すものであり、いずれも「rebaudioside」を意味するものである。同様に、本明細書において、「ズルコサイド」は「ズルコシド」と同じ意味を表すものであり、いずれも「dulcoside」を意味するものである。
1. 新規ステビオール配糖体
 本発明者らは、味質に影響を与える微量の新規ステビオール配糖体の構造を初めて特定した。本発明の新規ステビオール配糖体(以下、「本発明の配糖体」ともいう)は、式(1):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 
(式中、
 Rは、式(2)または式(3):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 
の糖鎖を表し、
 glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す)
で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物である。
 本発明の配糖体は、上記のとおり、ステビオールの第13位に2分子のグルコースと1分子のラムノースを含む糖鎖を有し、第19位に1分子のグルコースと1分子のラムノースまたは2分子のグルコースと1分子のラムノースを含む糖鎖を有している。
 また、上記のとおり、glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す。本明細書において、glcはα-グルコースまたはβ-グルコースであってよく、rhaはα-ラムノースまたはβ-ラムノースであってよい。あるいは本明細書において、glcはα-グルコースおよびβ-グルコースであってよく、rhaはα-ラムノースおよびβ-ラムノースであってよい。そして、「glc-1-」はグルコースの1位の炭素原子がステビオールとグリコシド結合していることを示し、「glc(1-3)-glc-1-」は「glc-1-」で示されるグルコースの3位の炭素原子に更なるグルコースの1位の炭素原子がグリコシド結合していることを示す。また、「rha(1-2)-glc-1-」は「glc-1-」で示されるグルコースの2位の炭素原子にラムノースの1位の炭素原子がグリコシド結合していることを示す。
 本明細書において、式(1)で示される化合物のうち、Rが式(2)の糖鎖を有するものを「配糖体A」とし、Rが式(3)の糖鎖を有するものを「配糖体B」とする。
 配糖体Aとしては例えば、式(11)および式(12)で示される構造を有する配糖体が含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 
 式(11)で示される配糖体Aは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、式(12)で示される配糖体Aは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがαグルコシド結合している。
 配糖体Bとしては例えば、式(13)および式(14)で示される構造を有する配糖体が含まれる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 
 式(13)で示される配糖体Bは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがβグルコシド結合しており、式(14)で示される配糖体Bは、ステビオールの19位のカルボキシル基にグルコースがαグルコシド結合している。
 本発明の配糖体には上記のようにα体やβ体等の異性体も包含される。したがって、本発明の配糖体はα体のみ、β体のみ、またはα体とβ体の混合物のいずれであってもよい。本発明の配糖体は、β体の割合が、80%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがさらに好ましく、99%以上であることが特に好ましい。なお、α体とβ体は高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra (High)Performance Liquid chromatography:UPLC) 等の公知の方法を用いることにより、単離・精製することができる。
 本発明の配糖体は、式(1)で示される化合物だけではなく、その誘導体、塩、若しくは水和物であってもよい。本明細書において、「誘導体」とは、化合物中の小部分の構造上の変化があってできる化合物をいい、例えば、水酸基の一部が他の置換基に置換されているような化合物を意味する。したがって、式(1)で示される化合物の誘導体としては、該化合物に含まれる水酸基の一部が、水素、ハロゲン、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アミノ基、シアノ基などから選択される置換基で置換された化合物を含む。本明細書において、「式(1)の化合物の塩」とは式(1)の化合物の生理学的に許容可能な塩、例えばナトリウム塩、を意味する。また、本明細書について「式(1)の化合物の水和物」とは、式(1)の化合物に水分子が付加された化合物を意味する。
 本発明の配糖体は、特に限定されないが、植物由来物、化学合成物、または生合成物であってもよい。例えば、Reb.Cを多く含む植物体から単離、精製してもよいが、化学合成や生合成によって得てもよい。本発明の配糖体の製造方法の詳細については本明細書において後述する。
 本発明の配糖体は、砂糖(ショ糖)よりも高い甘味を有し、かつ、甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に良いという味質を有し、飲食品等に少量含まれるだけで味質に影響を与えることができる。したがって、本発明の配糖体は新規な甘味料として使用することができる。
 本発明の好ましい態様の配糖体は、配糖体Aまたは配糖体Bから選択される。配糖体Bは砂糖(ショ糖)よりも高い甘味を有し、かつ、甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に甘味後引きが良く、水溶性も高い。したがって後述のように甘味料として様々な用途に好適に使用することができる。配糖体Aは配糖体Bよりも甘味は弱いものの、砂糖(ショ糖)よりも高い甘味を有し、かつ、甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に甘味後引きが良い。配糖体Aも配糖体Bと同様に甘味料として様々な用途に好適に使用することができるが、配糖体Bよりも水溶性が低いため、乳酸菌飲料、懸濁荷重飲料、および濁りを有する飲料に特に好適に使用することができる。また、医薬品等の甘味調整にも好適に使用することができる。理論に拘束されるものではないが、水溶性が低いことで、舌で感じられる苦味を抑えつつ、のどでの刺激感を高めることができ、飲料の飲みごたえ向上に有利である。
2. 新規ステビオール配糖体を含む甘味料組成物
 本発明の一態様によれば、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む甘味料組成物(以下、「本発明の甘味料組成物」ともいう)が提供される。本発明の甘味料組成物は、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物を含む組成物であってもよい。
 本発明の甘味料組成物に含まれる本発明の配糖体の量は、特に限定されない。
 あるいは、本発明の甘味料組成物は、野生型のステビアまたはステビア抽出物に存在する量よりも少なくとも0.01%多い量の本発明の配糖体を含む組成物であることが好ましい。なお、上記のとおり、本発明の配糖体はReb.Cを多く含む品種から初めて検出されたものであり、野生型のステビアまたはその抽出物には、全く含まれていないか、含まれていたとしても検出限界値以下の量である。
 本発明の甘味料組成物は、さらに他のステビオール配糖体を含んでいてもよい。例えば、本発明の甘味料組成物は、本発明の配糖体に加え、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE,レバウディオサイドF、レバウディオサイドI、レバウディオサイドJ、レバウディオサイドK、レバウディオサイドN、レバウディオサイドM、レバウディオサイドO、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドR、ズルコサイドA、ズルコサイドC、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含んでいてもよい。なお、本明細書において「ズルコサイドC」とは、下記の構造を有する化合物をいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 
 他のステビオール配糖体が含まれる場合、本発明の配糖体と他のステビオール配糖体との組成比は、質量比で0.01:9.99~6:4が好ましい。
 本発明の甘味料組成物は、さらに一般的な甘味料を含んでいてもよい。そのような一般的な甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液(黒糖蜜)、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。
3.新規ステビオール配糖体を含む飲食品
 本発明の一態様によれば、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む飲食品(以下、「本発明の飲食品」ともいう)が提供される。本発明の飲食品は、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含んでいれば特に限定されず、式(1)で示される化合物、またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む抽出物や甘味料組成物を含む飲食品であってもよい。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な飲料又は食品を提供し、また、当該飲料又は食品の製造方法を提供する。
 本発明の飲食品に含まれる本発明の配糖体の量は、具体的な飲食品によって異なるが、おおむね0.0004%~0.8%であるのが好ましく、0.04%~0.4%であることが特に好ましい。含有量をこの範囲とすることで後引きを抑えることができるという利点がある。
 本発明の飲食品は、さらに他のステビオール配糖体を含んでいてもよい。例えば、本発明の甘味料組成物は、本発明の配糖体に加え、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE,レバウディオサイドF、レバウディオサイドI、レバウディオサイドJ、レバウディオサイドK、レバウディオサイドN、レバウディオサイドM、レバウディオサイドO、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドR、ズルコサイドA、ズルコサイドC、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含んでいてもよい。
 他のステビオール配糖体が含まれる場合、本発明の配糖体と他のステビオール配糖体との組成比は、質量比で0.01:9.99~6:4が好ましい。
 本発明の飲食品は、さらに一般的な甘味料を含んでいてもよい。そのような一般的な甘味料としては、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液(黒糖蜜)、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。中でもすっきりさ、飲みやすさ、自然な味わい、適度なコク味の付与の観点から、天然甘味料を用いることが好ましく、特に、果糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、砂糖が好適に用いられる。これら甘味成分は一種類のみ用いてもよく、また複数種類を用いてもよい。
 本発明の食品の例としては、特に限定されるものではないが、食品としては、製菓、製パン類、穀粉、麺類、飯類、農産・林産加工食品、畜産加工品、水産加工品、乳・乳製品、油脂・油脂加工品、調味料またはその他の食品素材等が挙げられる。
 本発明の飲料の例としては、特に限定されるものではないが、例えば炭酸飲料、非炭酸飲料、アルコール飲料、非アルコール飲料、ビールやノンアルコールビール等のビールテイスト飲料、コーヒー飲料、茶飲料、ココア飲料、栄養飲料、機能性飲料などが挙げられる。
  本発明の飲料は、加熱殺菌をされ、容器に詰められた状態の容器詰飲料として調製してもよい。容器としては、特に限定されず、例えば、PETボトル、アルミ缶、スチール缶、紙パック、チルドカップ、瓶などを挙げることができる。加熱殺菌を行う場合、その種類は特に限定されず、例えばUHT殺菌及びレトルト殺菌等の通常の手法を用いて行うことができる。加熱殺菌工程の温度は特に限定されないが、例えば65~130℃、好ましくは85~120℃で、10~40分である。ただし、上記の条件と同等の殺菌価が得られれば適当な温度で数秒、例えば5~30秒での殺菌でも問題はない。
4.新規ステビオール配糖体を含む植物及びその抽出物
 本発明の一態様によれば、新規ステビオール配糖体を含む植物体およびその抽出物が提供される。また本発明の他の一態様によれば、本発明の植物体または植物体の抽出物を含む、飲食品、好ましくは飲料、が提供される。本発明の植物体に含まれる本発明の配糖体の量は、特に限定されないが、0.001%~1.000%であるのが好ましく、0.01%~0.80%であることがより好ましい。
 本発明の植物体は、野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0. 01%以上高い含量で含む植物体であることが好ましい。上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、野生型のステビアには、全く含まれていないか、含まれていたとしても検出限界値以下の量である。
 「野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.01%以上高い含量で含む」とは、野生型ステビア植物体の新鮮葉(非乾燥葉)から得られた抽出液の単位量(例えば10ml)あたりに含まれる本発明の配糖体の量を基準(濃度)とした場合、本発明の植物体の新鮮葉(非乾燥葉)から得られた抽出液の同一単位量(前記野生型ステビア植物体の葉から得られた抽出液と同一量)あたりに含まれる本発明の配糖体の量(濃度)が0.01%以上高いことを意味する。ここで、本発明の植物体は、野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.02%以上、0.03%以上、0.04%以上、0.05%以上、0.07%以上、0.09%以上、0.10%以上、0.15%以上、0.20%以上、0.40%以上、0.60%以上、0.80%以上、1.0%以上、1.50%以上、2.00%以上、4.00%以上、6.00%以上、8.00%以上、10.00%以上高い含量で含んでいてもよい。
 また、「総ステビオール配糖体に占める本発明の配糖体の割合が0.01%以上である」とは本発明のステビア植物体の新鮮葉(非乾燥葉)から得られた抽出液に存在する総ステビオール配糖体量に対して本発明の配糖体が0.01%以上の比率で存在することを意味する。ここで、総ステビオール配糖体とは、未知のステビオール配糖体を含むものではなく、また検出限界未満で存在するステビオール配糖体も含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE,レバウディオサイドF、レバウディオサイドI、レバウディオサイドJ、レバウディオサイドK、レバウディオサイドN、レバウディオサイドM、レバウディオサイドO、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドR、ズルコサイドA、ズルコサイドC、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる。
 本発明の植物体に占める本発明の配糖体の含有量は以上のとおりであるが、本発明の植物体から乾燥葉を得た場合、当該乾燥葉の重量に対し本発明の配糖体は0.01重量%以上、0.02重量%以上、0.03重量%以上、0.04重量%以上、0.05重量%以上、0.07重量%以上、0.10重量%以上、0.15重量%以上、0.20重量%以上、0.30重量%以上、0.50重量%以上、0.60重量%以上、0.80重量%以上、1.00重量%以上、2.00重量%以上、4.00重量%以上、6.00重量%以上、8.00重量%以上、10.00重量%以上の量で存在していてもよい。
 ここで本発明の植物体の乾燥葉とは、本発明の植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を10重量%以下、7重量%以下、5重量%以下、4重量%以下、3重量%以下、2重量%以下、1重量%以下にまで減らしたものをいう。好ましくは、本発明の植物体の乾燥葉の含水量は3~4重量%である。
 本発明の植物体の例としては、例えば、Reb.Cを多く含む植物体が挙げられる。上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、野生型のステビアには、全く含まれていないか、含まれていたとしても検出限界値以下の量である。一方で、本発明者らは本発明のステビオール配糖体が、Reb.Cを多く含む植物体により多く含まれていることを知得した。したがって、新規ステビオール配糖体およびその抽出物には、このようなReb.Cを多く含む植物体およびその抽出物が含まれる。
 そのようなReb.Cを多く含む植物体としては、特に限定されないが、例えば、野生型ステビア種と比べレバウディオサイドCを20%以上高い含量で含む高レバウディオサイドC含有型非遺伝子組み換えステビア植物体であって、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウディオサイドCの割合が40%以上である植物体(以下、「高Reb.C植物体」ともいう)が挙げられる。
 そのような高Reb.C植物体としては、例えば、野生型ステビア種と比べレバウディオサイドCを20%以上高い含量で含む高レバウディオサイドC含有型非遺伝子組み換えステビア植物体であって、かつ総ステビオール配糖体に占めるレバウディオサイドCの割合が40%以上である植物体が挙げられる。
 高Reb.C植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であり、レバウディオサイドCが高くなるように遺伝子に変異が生じたものである。また、当該遺伝子の変異は、特に限定されるものではないが、例えば、天然条件下で生じるか、非遺伝子組換え的手法により生じるものか、あるいは遺伝子組み換えによって生じるものが挙げられる。
 高Reb.C植物体は、例えば、当該植物体の組織から遺伝子多型を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、高Reb.C植物体とそれ以外の植物体とを識別し、高Reb.C植物体を選択することを意味する。
 高Reb.C植物体は、被験植物のゲノムに配列番号11に示す塩基配列の第60番目の塩基配列が野生型のAからTに変異した多型を同定する工程を含む、スクリーニング方法によってもスクリーニングすることができる。
 本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官(例えば葉、花弁、茎、根、種子など)、植物組織(例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など)あるいは種々の形態の植物細胞(例えば、懸濁培養細胞)、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。
 また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片およびカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
 本発明の植物体の抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒(水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒)を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はWO2016/090460に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
 本発明の植物体の抽出物は、好ましくは、野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.01%以上高い含量で含み、かつ総ステビオール配糖体に占める本発明の配糖体の割合が0.01%以上である。ここで、「野生型ステビア種と比べ本発明の配糖体を0.01%以上高い含量で含む」とは前述のとおりである。また、「総ステビオール配糖体に占める本発明の配糖体の割合が0.01%以上である」とは前述のとおりである。
5.新規ステビオール配糖体を含む風味調整剤
 本発明の新規ステビオール配糖体は、ステビア抽出物の中に微量しか含まれていないものの、該ステビア抽出物の風味に影響を与えているものと考えられる。理論に拘束されるものではないが、本発明のステビオール配糖体を少量添加することで、飲食品の風味を調整できるものと考えられる。したがって、本発明の一態様によれば、上記式(1)で示される化合物またはその誘導体、塩、もしくは水和物を含む風味調整剤が提供される。
 本明細書において、「風味調整剤」とは、飲食品に添加された場合に、その飲食品の風味を調整する物質のことをいう。本発明の風味調整剤は、好ましくは、飲食品に添加された際に、風味調整剤自体の味を消費者が認識することなく、その飲食品自体の風味を調整することができる。例えば、本発明のステビオール配糖体は、従来のステビオール配糖体に比べて甘味の後引きが良いという特徴を有するため、風味調整剤として使用することで飲食品の甘味の後引きを調整することができる。
 本発明の風味増強剤は、上記式(1)で示される化合物またはその誘導体、塩、もしくは水和物に加え、一種以上の他の甘味料を含んでいることが好ましい。そのような甘味料としては、レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE,レバウディオサイドF、レバウディオサイドI、レバウディオサイドJ、レバウディオサイドK、レバウディオサイドN、レバウディオサイドM、レバウディオサイドO、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドR、ズルコサイドA、ズルコサイドC、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体や、果糖、砂糖、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖、麦芽糖、ショ糖、高果糖液糖、糖アルコール、オリゴ糖、はちみつ、サトウキビ搾汁液(黒糖蜜)、水飴、羅漢果末、羅漢果抽出物、甘草末、甘草抽出物、ソーマトコッカスダニエリ種子末、ソーマトコッカスダニエリ種子抽出物などの天然甘味料や、アセスルファムカリウム、スクラロース、ネオテーム、アスパルテーム、サッカリンなどの人工甘味料などが挙げられる。
6.新規ステビオール配糖体の製造方法
 上述のとおり、本発明のステビオール配糖体は、(A)植物体からの単離・精製、(B)化学合成、または(C)生合成によって製造することができる。それぞれについて以下に説明する。
(A)植物体からの単離・精製
 本発明の植物体は本発明の新規ステビオール配糖体を含むものであるため、該植物体から新規ステビオール配糖体を単離・精製することができる。新規ステビオール配糖体は、本発明の植物体の新鮮葉または乾燥葉に適切な溶媒(水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒)を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はWO2016/090460に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
 さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒:水の勾配、高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)、超高性能液体クロマトグラフィー (Ultra (High)Performance Liquid chromatography:UPLC) 等の公知の方法を用いることにより新規ステビオール配糖体を単離・精製することができる。
 植物体中の新規ステビオール配糖体含有量は、WO2016/090460に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明の植物体から新鮮葉をサンプリングし、LC-MS/MSを行うことにより測定することができる。
(2)化学合成
 本発明のステビオール配糖体の化学合成による製造方法について、以下に詳細に説明する。
 ステビオール配糖体は、アグリコンのステビオールに各種の糖 (グルコース、ラムノース、キシロースなど) が、様々な結合様式 (結合位置や立体) で付加した構造を有する。したがって、選択する出発原料によって、様々な合成経路を経て目的とするステビオール配糖体を得ることができる。しかし、合成経路によって目的とする化合物を得るための時間や収率などが大きく変わってくることは、本発明の技術分野における当業者が理解しているものである。
 本発明者らは、今般、特定の合成経路によって、本発明のステビオール配糖体を高選択性、かつ、高収率で得られる新規な製造方法を知得した。本発明のステビオール配糖体の製造方法では、ステビオール配糖体の化学合成を行う際、スキーム1に示したように、ステビオール配糖体を「ステビオールグリコシド」と「糖ヘミアセタール体」に分割して合成を進める。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 
  ステビオールグリコシドは、既存の天然物 (レバウディオサイド、ズルコサイド、ステビオサイド、ステビオールビオサイド、ルブソサイドなど) から誘導することで調製することができる。一方、糖ヘミアセタール体は、既存の天然物から調製するか、あるいは化学合成によって調製することができる。本発明者らは、ステビオールグリコシドと糖ヘミアセタール体を、光延反応を用いて縮合すると、良好な収率かつ極めて高いβ選択性で、目的のステビオール配糖体が得られる事を知得した。
 本発明の一態様によれば、式(1)で示される化合物の製造方法であって、
(A)下記式(4):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
 
(式中、glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す)
で示されるレバウディオサイドCから、下記式(5):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 
(式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す。)
で示される中間体1を調製する工程と
(B)グルコピラノシド誘導体から式(6):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 
で示される中間体2、または式(7):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 
(式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
で示される中間体3を調製する工程と、
(C)前記中間体1と、前記中間体2または3とを、ホスフィン試薬及びアゾ化合物の存在下で反応させ、下記式(8):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 
(式中、
 Rは、式(9)または式(10):
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
 
の糖鎖を表し、
 p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
で示される中間体4を得る工程を含む、方法が提供される。
 本明細書において、保護基としては、アシル系保護基、3置換されたシリル基、アセタール系保護基、エーテル系保護基などが挙げられる。好ましくは3置換されたシリル基(トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、およびt-ブチルジメチルシリル基など)またはアシル系保護基(アセチル基、およびベンゾイル基など)が挙げられる。
 以下に本発明のステビオール配糖体の製造方法の具体的な一態様を示すが、本発明の配糖体の製造方法がこの態様に限定されるものではない。
(A)第1工程(ステビオールグリコシドの合成)
 ステビオールグリコシドは、例えば、天然に存在するレバウディオサイドC(ズルコサイドB)を原料として、下記スキーム2に従って得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 
 まず、レバウディオサイド Cをメタノールなどの溶媒と水に溶解し、水酸化ナトリウムなどの強塩基を加え、60℃~120℃で2時間以上還流することで、レバウディオサイド Cの第19位からグルコース分子が脱離し、上記化合物2が得られる。その際、反応液を陽イオン交換樹脂等で中和した上で溶媒を蒸発させてもよい。
 化合物2はさらにピリジン等の溶媒に溶解し、無水酢酸などを加えて化合物2に含まれる水酸基を保護することで化合物3(中間体1)を得ることができる。
(B)第2工程(2糖または3糖ヘミアセタールの合成)
 2糖ヘミアセタールと3糖ヘミアセタールは、例えば、市販されているグルコピラノシド誘導体を原料として得ることができる。2糖ヘミアセタール体の合成(第2a工程)をスキーム3に示し、3糖ヘミアセタール体の合成(第2b工程)をスキーム4に示す。
 2糖ヘミアセタール体の合成(第2a工程)を示すスキーム3は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 
 まず、4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine-β-D-glucopyranoside (化合物4)、化合物5、およびモレキュラーシーブス(MS)をジクロロメタン等の溶媒に溶解し、トリフルオロメタンスルホン酸 (酸触媒)を加え、25℃~80℃にて2時間以上撹拌することで、化合物6が得られる。
 次いで化合物6をエタノールやTHF等の溶媒に溶解させ、水酸化パラジウム等の触媒を室温で加え、水素雰囲気下、室温で2時間以上撹拌して反応を完了させた後、触媒を濾別することで化合物7が得られる。化合物7をピリジン等の溶媒に溶解し、無水酢酸を室温で加え、室温で12~36時間撹拌する。その後、溶液を減圧濃縮し、アセトニトリルと水を加え、セリウムアンモニウムナイトレイト等の酸化剤を加えて5分~2時間撹拌することで、化合物8(中間体2)が得られる。
 3糖ヘミアセタール体の合成(第2b工程)を示すスキーム4は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 
 まず、4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine-β-D-glucopyranoside (化合物4)、化合物5、およびモレキュラーシーブス(MS)をジクロロメタン等の溶媒に溶解し、トリフルオロメタンスルホン酸 (酸触媒)を加え、25℃~80℃にて2時間以上撹拌することで、化合物6が得られる。
 次いで化合物6をエタノールやTHF等の溶媒に溶解させ、水酸化パラジウム等の触媒を室温で加え、水素雰囲気下、室温で2時間以上撹拌して反応を完了させた後、触媒を濾別することで化合物7が得られる。化合物7をアセトニトリルに溶解させ、ベンズアルデヒドジメチルアセタールを室温で加えて2時間以上撹拌することで化合物9が得られる。
 化合物9、化合物10、およびモレキュラーシーブス(MS)をジクロロメタン等の溶媒に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸を室温で加えて、0度にて3~9時間撹拌することで化合物11が得られる。得られた化合物11をエタノールやTHF等の溶媒に溶解させ、水酸化パラジウム等の触媒を室温で加え、水素雰囲気下、室温で2時間以上撹拌して反応を完了させた後、ピリジン等の溶媒に溶解し、無水酢酸を室温で加え、室温で12~36時間撹拌することで化合物12が得られる。その後、溶液を減圧濃縮し、アセトニトリルと水を加え、セリウムアンモニウムナイトレイト等の酸化剤を加えて5分~2時間撹拌することで、化合物13(中間体3)が得られる。
(C)第3工程(式(1)で示される化合物の合成)
 式(1)で示される化合物の合成は、例えば、上記工程1および2(2aまたは2b)から得られた化合物3(中間体1)および化合物8または13(中間体2または3)を用いて、下記スキーム5または6に従って得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 
 まず、工程1および2(2aまたは2b)で得られた2糖ヘミアセタール体または3糖ヘミアセタール体とステビオールグリコシドとを、光延反応によって反応させることで、ステビオールの19位のカルボキシル基に2糖ヘミアセタール体または3糖ヘミアセタール体が選択的に結合した配糖体を得ることができる。具体的には、これらの化合物を1,4-ジオキサンに溶解させ、トリブチルホスフィンあるいはトリフェニルホスフィン等のホスフィン試薬、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) 等のアゾ化合物を室温で加え、50℃~80℃で2時間以上撹拌することで化合物14または16が得られる。最後に、化合物14または16の保護基を脱保護することにより、式(1)で示される化合物(配糖体AまたはB)が得られる。
(3)生合成
 本発明のステビオール配糖体は、所定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、細菌、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して、ステビオールやステビオール配糖体、UDP-グルコースおよび/またはUDP-ラムノースを基質として生成することもできる。基質であるステビオール、ステビオール配糖体、UDP-グルコース、UDP-ラムノースは、与えてもよいし、細胞内で生合成させてもよい。所定のタンパク質の例としては、ステビア由来のUGT85C2(アミノ酸配列は配列番号2)、UGT74G1(アミノ酸配列は配列番号4)、UGT91D2(アミノ酸配列は配列番号6)、UGT76G1(アミノ酸配列は配列番号8)、及びシロイヌナズナ由来のUDP-ラムノース合成酵素AtRHM2(アミノ酸配列は配列番号10)、が挙げられるが同等の活性を有するものであればこれに限定されない。
 上記タンパク質は、シロイヌナズナまたはステビアに由来する酵素であり、シロイヌナズナやステビアといった植物細胞外の環境(例えば、細胞外、ステビア以外の宿主細胞内)においても高い活性を有することが期待される。この場合、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチド(例えば、UGT85C2遺伝子は配列番号1、UGT74G1遺伝子は配列番号3、UGT91D2遺伝子は配列番号5、UGT76G1遺伝子は配列番号7、及びAtRHM2遺伝子は配列番号9)を、細菌、真菌類、植物、昆虫、ヒトを除く哺乳動物などに由来する宿主細胞に導入して本発明のタンパク質を発現させ、基質であるステビオール、ステビオール配糖体、UDP-グルコース、UDP-ラムノースを与えることにより本発明の化合物を生成することができる。あるいは、宿主によっては、上記タンパク質を宿主細胞内で発現させ、適切な基質を与えることにより本発明の化合物を生成することもできる。
 本発明の一態様によれば、本発明の新規ステビオール配糖体を製造する方法であって、下記の(a)~(g)の少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いることを特徴とする方法が提供される。
(a)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(b)配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(c)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(e)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(f)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(g)配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、UDP-グルコースからUDP-ラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
 本発明の好ましい態様によれば、上記(a)~(g)に記載された各配列番号の塩基配列に対して、独立に、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、又は99.9%以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを用いてもよい。
 本発明の他の好ましい態様によれば、上記(a)~(g)に記載された各配列番号のアミノ酸配列に対して、独立に、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99.1%以上、99.2%以上、99.3%以上、99.4%以上、99.5%以上、99.6%以上、99.7%以上、99.8%以上、又は99.9%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ上記(a)~(g)に記載された所定の活性を有するタンパク質を用いてもよい。
 上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な発現ベクターに挿入された状態で宿主に導入される。上記ポリヌクレオチドは、個々に別のベクターに挿入されてもよい。
 適切な発現ベクターは、通常、
(i)宿主細胞内で転写可能なプロモーター;
(ii)該プロモーターに結合した、本発明のポリヌクレオチド;および
(iii)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、宿主細胞内で機能するシグナルを構成要素として含む発現カセット
 を含むように構成される。
 発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージまたはコスミドなどを用いる方法、あるいは必要な構成要素を有するDNA分子が挙げられるが特に限定されない。
 ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明のポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
 本発明の発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域(例えば、プロモーター、ターミネーターおよび/または複製起点等)を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター(例えば、trcプロモーター、tacプロモーター、lacプロモーター等)が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、PH05プロモーター、GAL1/10プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、trpC等が挙げられる。また、植物細胞内で目的遺伝子を発現させるためのプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーター、rd29A遺伝子プロモーター、rbcSプロモーター、前記カリフラワーモザイクウィルスの35S RNAプロモーターのエンハンサー配列をアグロバクテリウム由来のマンノピン合成酵素プロモーター配列の5’側に付加したmac-1プロモーター等が挙げられる。動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター(例えば、SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター等)が挙げられる。外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターの例としては、mouse mammary tumor virus(MMTV)プロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター、メタロチオネインプロモーター及びヒートショックプロテインプロモーター等が挙げられる。
 発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、栄養要求性マーカー(LEU2、URA3、HIS3、TRP1、ura5、niaD)、薬剤耐性マーカー(ハイグロマイシン、ゼオシン)、ジェネチシン耐性遺伝子(G418r)、銅耐性遺伝子(CUP1)(Marin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA,vol. 81,p.337,1984)、セルレニン耐性遺伝子(fas2m, PDR4)(それぞれ、猪腰淳嗣ら,生化学,vol.64,p.660,1992;Hussain et al.,Gene,vol.101,p.149,1991)などが利用可能である。
 宿主細胞の形質転換方法としては一般に用いられる公知の方法が利用できる。例えば、エレクトロポレーション法(Mackenxie, D. A. et al., Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, p. 4655-4661, 2000)、パーティクルデリバリー法(特開2005-287403)、スフェロプラスト法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 75, p. 1929, 1978)、酢酸リチウム法(J. Bacteriology, vol. 153, p. 163, 1983)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition : A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manualなどに記載の方法)で実施可能であるが、これらに限定されない。
 その他、一般的な分子生物学的な手法に関しては、"Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001"、"Methods in Yeast Genetics、A laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor, NY)"等を参照することができる。
 このようにして得られた非ヒト形質転換体を培養することにより、非ヒト形質転換体にステビオール配糖体を生産させることが可能である。このような非ヒト形質転換体は、好ましくは酵母である。また、非ヒト形質転換体の培養は、ステビオールを含む培地で行うことが好ましい。蓄積されたステビオール配糖体を抽出・精製することにより、本発明のステビオール配糖体を得ることができる。
[新規ステビオール配糖体の単離]
 サントリーグローバルイノベーションセンター株式会社(SIC)で開発した、4系統の新規ステビア植物体(サンプル1(EM3-4)、サンプル2(EM2-27-8)、サンプル3(EM2-27-15)、およびサンプル4(EM2-11))の葉から得られた抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分離-質量分析(MS)を行い、D-グルコピラノシル(Glc)、L-ラムノピラノシル(Rha)、キシロピラノシル(Xyl)が糖鎖で構成されたステビオール配糖体の分子量をもとに、ステビア植物体に含有されるステビオール配糖体のスクリーニング分析を行った。ここで、サンプル1はゲノムに配列番号11に示す塩基配列の第60番目の塩基配列が野生型のAからTに変異した多型を有する高Reb.C植物体である。なお、高Reb.C濃度の表現型と配列番号11の多型との相関関係について統計解析を行ったところ、当該多型は高Reb.C濃度の表現型と統計学上の相関関係を有することが明らかになった。
 検液の調製方法は、凍結乾燥処理を行ったステビア乾燥葉それぞれ10.0  mgをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒として水/メタノール(1/1 vol/vol) を1.0 mL添加し、その後超音波洗浄器(AS ONE, AS52GTU)にて20分間、25°Cの設定温度にて超音波を照射し、ステビア葉からステビオール配糖体の抽出液を得た。さらにHPLC-MSに供するために、水/メタノールで10倍希釈を行い、細孔サイズ0.45 μmのフィルター(ナカライテスク、コスモナイスフィルターS(溶媒系))にてろ過を行った。
 HPLC - MSのHPLCは、送液ユニットLCポンプにはNexera LC-30AD(島津製作所)、分離カラムにはSM-C18 (4.6 x 250 mm)(インタクト社製)を用いた。LC移動相の送液は、移動相Aは0.2%酢酸含有ミリQ水、移動相Bはメタノールを用い、バイナリーグラジエント勾配を0 - 5分間は移動相B濃度10%で一定にし、その後15分間で移動相B濃度を10%から70%まで変化させ、さらに5分間でB濃度を70%から100%まで変化させ、最後に5分間移動相B濃度を100%に維持して終了した。移動相の流速は0.4 mL/分で行い、希釈後フィルターろ過されたステビア葉抽出液は5 μL注入した。
 MSは、エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオン源を取り付けた三連四重極型質量分析計LCMS-8030 (島津製作所)を用いた。質量分析測定は、負イオン測定モード、m/z値を選択して測定を行う選択イオンモニタリング(SIM)モードで測定を行った。選択するm/z値は、D-グルコピラノシル(Glc),L-ラムノピラノシル(Rha),キシロピラノシル(Xyl)が糖鎖に構成されたステビオール配糖体の分子量をもとに計算したm/z値を選択した。したがって、m/z = 641.2 (Glc(2)), 773.2 (Glc (2), Xyl (1)), 787.2 (Glc (2), Rha (1)), 803.2 (Glc (3)), 935.3 (Glc (3), Xyl (1)), 949.3 (Glc (3), Rha (1)), 965.3 (Glc (4)), 1095.4 (Glc (3), Rha (2)), 1097.4 (Glc (4), Xyl (1)), 1111.4 (Glc (4), Rha (1)), 1127.4 (Glc (5)), 1257.5 (Glc (4), Rha (2)), 1259.5 (Glc (5), Xyl (1)), 1273.5 (Glc (5), Rha (1)), 1289.5 (Glc (6)), 1435.6 (Glc (6), Rha (1))を選択した。さらに、入手可能な高純度試薬、レバウディオサイド A、B、D、F、 M、N、O、ステビオサイド、ズルコサイドA、 Bの測定も同条件にて行うことにより、HPLCの負イオンm/z値、保持時間の確認を行った。検出された主なステビオール配糖体のピーク面積値(任意の単位:arbitrary unit)を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
 図2にサンプル1(EM3-4)のm/z 1095.4の選択イオンクロマトグラムを示す。ステビオール配糖体の修飾されている糖鎖が3個のグルコース(Glc)と2個のラムノース(Rha)を含むステビオール配糖体(m/z 1095.4)の選択イオンクロマトグラム中にこれまでに報告の無い分子量を持つピークが観測された。つまり、図2に示される、Rt 28.73分のピークについては未知の物質である。レバウディオサイドCの含有率がレバウディオサイド Aと比べて低く、かつ糖鎖の伸長も他のサンプルよりも低いサンプル3からは Rt 28.73分のピーク値は検出限界以下であった。
 図3にサンプル1(EM3-4)のm/z 1257.5の選択イオンクロマトグラムを示す。ステビオール配糖体の修飾されている糖鎖が4個のグルコース(Glc)と2個のラムノース(Rha)を含むステビオール配糖体(m/z 1257.5)の選択イオンクロマトグラム中にこれまでに報告の無い分子量を持つピークが観測された。つまり、図3に示される、Rt 28.50分のピークについては未知の物質である。レバウディオサイドCの含有率がレバウディオサイド Aと比べて低く、かつ糖鎖の伸長も他のサンプルよりも低いサンプル4からは Rt 28.50分のピーク値は検出限界以下であった。
[新規ステビオール配糖体の構造解析]
 本発明において、レバウディオサイドC高含有率品種から検出された新規ステビオール配糖体1および2の構造解析は次の手順で行った。
 (i)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)- 高分解能質量分析(MS)およびMS/MS、3段階までのイオンの断片化(MS3断片化)のフラグメント化解析による構造推定、
 (ii)化学反応による推定ステビオール配糖体標準品の化学合成、
 (iii)化学合成標準品のHPLC- 高分解能MSおよびMS3断片化の保持時間と断片化パターンの一致による構造確認
 上記(i)~(iii)の工程のそれぞれについて、以下に詳細に説明する。
(i)高速液体クロマトグラフィー(HPLC)- 高分解能質量分析(MS)およびMS/MS,3段階までのイオンの断片化(MS3断片化)のフラグメント化解析による構造推定
 検液の調製は、凍結乾燥処理を行ったステビア乾燥葉それぞれ10.0mgをガラスバイアルに秤量し、抽出溶媒として水/メタノール(1/1 vol/vol) を1.0 mL添加し、その後超音波洗浄器(AS ONE, AS52GTU)にて20分間、25°Cの設定温度にて超音波を照射し、ステビア葉からステビオール配糖体の抽出液を得た。さらにHPLC-MSに供するために、水/メタノールで10倍希釈を行い、細孔サイズ0.45 μmのフィルター(ナカライテスク、コスモナイスフィルターS(溶媒系))にてろ過を行った。
 高速液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化精密質量分析(HPLC-ESI-HRMS)の機器構成において、HPLCの機器構成は、送液ユニットLCポンプにはProminence LC-20AD(島津製作所)を用い、分離カラムにはSM-C18 (4.6 x 250 mm)(インタクト社製)を用いた。LC移動相の送液は、移動相Aとしては0.2% 酢酸含有ミリQ水を用い、移動相Bとしてはメタノールを用い、バイナリーグラジエント勾配を0 - 5分間は移動相B濃度10%で一定とし、その後15分間で移動相B濃度を10%から70%まで変化させ、さらに5分間でB濃度を70%から100%まで変化させた。最後に5分間、移動相B濃度を100%に維持して終了した。移動相の流速は0.4 mL/分で行い、希釈後フィルターろ過されたステビア葉抽出液は20 μL注入した。質量分析部は、ESIイオン源を取り付けたOrbitrap Elite MS (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。質量分析測定は、負イオン測定モード、m/z 150 - 2000の範囲、設定分解能60,000で測定を行った。MS/MS測定は、ターゲットのm/z 1095.4または1257.5を選択し、不活性ガスとの衝突によって断片化を行うCIDモードで行った。MS3のターゲットイオンはMS/MSスペクトルで最も強度の強いイオンとした。断片化に必要なエネルギーの照射は装置固有の衝突エネルギー基準である35で行った。
 新規ステビオール配糖体1および2の断片化パターンを理解するために構造既知である標品レバウディオサイド Aおよび D、MのMS/MSおよびMS3断片化パターン解析を行った。その結果、新規ステビオール配糖体のMS/MSでは19位にエステル結合している糖鎖の全てが脱離したピークのイオン強度が最も強く現れるデータが得られた。この結果は19位の炭素にエステル結合しており、糖鎖の分子量の合計を示している。
 図4に新規ステビオール配糖体1(m/z 1095.4, Rt:28.73に相当する)のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す。新規ステビオール配糖体のMS/MSスペクトルからはGlc 1個分とRha1個分の脱離に相当するm/z 787.38にピークが主ピークとして検出された。この結果から19位の炭素にエステル結合している糖鎖数がGlc 1個分とRha1個であることが分かる。さらに構造情報を得るために、MS/MSで得られた主ピークm/z 787.4を断片化するMS3スペクトルを取得した。その結果、レバウディオサイド CのMS3スペクトル (949.4 → 787.4 → )と同様のピークパターンを持つスペクトルが得られた。このことから、13位に結合した糖鎖は、レバウディオサイド Cと同じであると推測出来る。推定される構造を図4中に示す。
 図5に新規ステビオール配糖体2(m/z 1257.5, Rt:28.50に相当する)のMS/MSおよびMS3断片化マススペクトルを示す。新規ステビオール配糖体のMS/MSスペクトルからはGlc 2個分とRha1個分の脱離に相当するm/z 787.38にピークが主ピークとして検出された。この結果から19位の炭素にエステル結合している糖鎖数がGlc 2個分とRha1個であることが分かる。さらに構造情報を得るために、MS/MSで得られた主ピークm/z 787.4を断片化するMS3スペクトルを取得した。その結果、レバウディオサイド CのMS3スペクトル (949.4 → 787.4 → )と同様のピークパターンを持つスペクトルが得られた。このことから、13位に結合した糖鎖は、レバウディオサイド Cと同じであると推測出来る。推定される構造を図5中に示す。
(ii)化学反応による推定ステビオール配糖体標準品の化学合成
[新規ステビオール配糖体1の合成]
(1)合成経路の概要
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 
 スキーム7に示したように、新規ステビオール配糖体1 (化合物15) の合成では、ステビオールグリコシド (化合物3) と2糖ヘミアセタール体 (化合物8) を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体 1(化合物15) の骨格を得る事とした。ステビオールグリコシドの合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドC (化合物1) をArk Pharm社から購入し、ステビオール19位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖の水酸基をアセチル (Ac) 基で保護することで、ステビオールグリコシドを得た。2糖ヘミアセタール体 の合成では、適切に保護されたグルコースアクセプター (化合物4) とラムノースドナー (化合物5) の縮合反応によって、2糖骨格を作り、還元末端1位の保護基を脱保護することで、2糖ヘミアセタール体を得た。得られたステビオールグリコシドと2糖ヘミアセタール体を、光延反応で縮合したところ、75% (α/β= 1/20) と良好な収率且つ高いβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体1(15) を得た。
 次に、各合成工程について説明する。
(2)ステビオールグリコシドの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 
 スキーム8に示したように、ステビオールグリコシド (化合物3) の合成では、Ark Pharm社から購入したレバウディオサイドC (化合物1) (1.0g、1.05 mmol) を、メタノール (10mL) と水 (10mL) に溶解させ、4 mol/L水酸化ナトリウム (2.6mL、10.5mmol) を室温で加え、100 ℃にて20時間還流した。反応終了をTLC (クロロホルム/メタノール/水 = 5/4/0.1、Rf値 = 0.9) で確認後、反応液を陽イオン交換樹脂Dowex MAC-3水素フォーム (SIGMA-ALDRICH社) で中和 (pH 7) し、樹脂を濾別後、減圧濃縮して得られたシラップを真空ポンプで18時間乾燥させ、化合物2 (828mg、quant.)を得た。
 化合物2 (828mg、1.05mmol) をピリジン (20mL) に溶解させ、無水酢酸 (5mL) を室温で加え、室温にて48時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1、Rf値 = 0.5) にて確認後、飽和の炭酸水素ナトリウム水溶液 (5 mL) を加え、反応液を減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1) にて化合物3 (1.1 g、92%) を得た。
[化合物3] 
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.81 (m, 2H), 0.83-1.45 (complex, 19H), 1.39-1.91 (complex, 24H), 1.91-2.35 (s, 30H), 3.58 (m, 1H), 3.71-3.81 (complex, 4H), 3.95-4.12 (complex, 7H), 4.34-4.46 (complex, 3H), 4.56-4.66 (complex, 4H), 4.69-4.92 (complex, 7H), 5.05-5.14 (complex, 5H), 5.23-5.38 (complex, 6H), 5.45 (s, 1H); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 15.9, 17.3, 19.1, 20.5, 20.7, 20.8, 20.9, 21.1, 21.5, 21.7, 29.1, 37.8, 38.0, 39.5, 40.7, 41.4, 42.2, 43.8, 48.4, 53.8, 56.8, 61.6, 63.0, 65.5, 66.8, 68.0, 68.6, 69.3, 69.6, 69.8, 70.5, 70.9, 71.6, 71.9, 72.4, 72.8, 73.9, 74.9, 81.3, 87.3, 96.6, 96.8, 99.2, 99.4, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9, 151.9, 168.9, 169.2, 169.5, 169.6, 169.8, 170.1, 170.2, 170.3, 170.6, 170.9, 176.8, 183.4. 
(3)2糖ヘミアセタール体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 
 スキーム9に示したように、2糖ヘミアセタール体 (化合物8) の合成では、東京化成から購入した4-Methoxyphenyl 3-O-Benzyl-4,6-O-benzylidine-β-D-glucopyranoside (化合物4) (3.0g、6.46mmol) と化合物5 (3.3g、7.10mmol)、モレキュラーシーブス4Å (6.0g) をジクロロメタン(136mL) に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸 (114μL、1.29mmol) を室温で加え、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/2、Rf値 = 0.5) にて確認後、トリエチルアミン (100μL) で中和 (pH 8) し、モレキュラーシーブス4Åを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液(酢酸エチル/ヘキサン = 1/1.5) にて化合物6 (3.9g、81%) を得た。
[化合物6]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.18 (d, J = 6.4 Hz, 3H, H-6 of Rha), 1.96 (s, 3H, OAc), 1.98 (s, 3H, OAc), 2.07 (s, 3H, OAc), 3.51 (m, 1H, H-5), 3.73-3.81 (complex, 5H, H-4, H-6, OMe), 3.83-3.96 (complex, 2H, H-2, H-3), 4.28 (m, 1H, H-5 of Rha), 4.36 (m, 1H, H-6’), 4.70 (d, 1H, CH2Ph), 4.95 (d, 1H, CH2Ph), 4.99 (d, J = 7.2 Hz, 1H, H-1), 5.03 (t, 1H, H-4 of Rha), 5.20 (dd, 1H, H-3 of Rha), 5.32 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.34 (m, 1H, H-2 of Rha), 5.57 (s, 1H, CHPh), 6.90 (dd, 4H, OMePh), 7.21-7.49 (complex, 10H, Ph); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.2, 17.4, 20.8, 20.9, 21.0, 22.8, 31.7, 55.8, 66.2, 66.7, 68.8, 69.4, 69.5, 71.0, 75.2, 76.7, 77.5, 81.7, 81.8, 98.4, 100.8, 101.4, 114.8, 118.3, 126.1, 127.9, 128.4, 128.5×2, 129.2, 137.2, 137.9, 150.8, 155.7, 169.9, 170.1, 170.2.
 化合物6 (3.9g、5.29mmol) をエタノール (27mL) とTHF (27mL) に溶解させ、水酸化パラジウム (2.0g) を室温で加え、水素雰囲気下、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (クロロホルム/メタノール = 10/1、Rf値 = 0.2) にて確認後、水酸化パラジウムを濾別し、濾液を減圧濃縮した化合物7 (2.9g、quant.)を得た。
 化合物7 (1.1g, 1.97mmol) をピリジン (20mL)に溶解させ、無水酢酸 (740μL、7.88mmol) を室温で加え、室温にて24時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/1, Rf値 = 0.6) にて確認後、トルエン (30mL) を加えた共沸を3回繰り返した。その後、減圧濃縮して得られたシラップをアセトリトリル (14mL) と水 (7.0mL) に溶解し、セリウムアンモニウムナイトレイト (3.2g、5.91mmol) を室温で加え、室温にて30分攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1.5/1, Rf値 = 0.5) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (酢酸エチル / ヘキサン = 1 / 1) および (トルエン/酢酸エチル = 3/1) にて化合物8 (721mg、66%、3 steps) を得た。
[化合物8]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.16-1.19 (complex, 4.5H, H-6α of Rha, H-6β of Rha), 1.97-2.34 (complex, 27 H, OAc), 3.58 (t, 0.5H, H-2β), 3.72-3.75 (complex, 1.5H, H-2α, H-5β), 4.00 (m, 1H, H-4α of Rha), 4.05-4.16 (complex, 1.5H), 4.21-4.27 (complex, 3H), 4.76 (d, J = 7.6 Hz, 0.5H, H-1β), 4.86 (s, 1H, H-1α of Rha), 4.91 (s, 0.5H, H-1β of Rha), 4.98-5.08 (complex, 4.6H), 5.23-5.26 (complex, 2H), 5.34 (d, J = 3.2 Hz, 1H, H-1α), 5.48 (t, 1H, H-3α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 17.2, 17.5, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×2, 21.0, 21.6, 62.1, 62.2, 67.2, 67.3, 67.5, 68.5, 68.6, 68.7, 70.0, 70.4, 71.0, 74.2, 77.4, 77.9, 79.3, 92.0, 75.7, 98.4, 99.2, 125.4, 128.3, 129.1, 137.9, 169.8, 169.9×2, 170.0, 170.1×2, 170.2, 170.4, 170.9×2.
(4)化合物15の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 
 スキーム10に示したように、化合物15の合成では、化合物8(291mg、0.503mmol)と化合物3(391mg、0.335mmol) を1,4-ジオキサン (17mL) に溶解させ、トリブチルホスフィン (252 μL、1.01 mmol)、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) (173 mg、1.01 mmol) を室温で加え、60℃にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1.5/1) にて化合物14 (435mg、75%、α/β= 1/20) を得た。
[化合物14]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.50-1.18 (complex, 7H), 1.15 (d, 3H, H-6 of Rham), 1.24 (s, 3H), 1.40-2.32 (complex, 70H), 3.60 (m, 1H), 3.73 (m, 2H), 3.82-4.28 (complex, 10H), 4.40-4.48 (complex, 2H), 4.63 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.75-4.88 (complex, 3H), 4.98 (s, 1H), 5.01-5.18 (complex, 8H), 5.24-5.31 (complex, 4H), 5.32 (s, 1H), 5.71 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1β), 6.31 (d, J = 3.0 Hz, 0.05H, H-1α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.6, 17.4, 17.6, 20.5, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×3, 21.6, 29.0, 39.5, 42.5, 44.1, 53.8, 57.9, 61.7, 66.6, 67.4, 68.0, 68.3, 68.5, 68.7, 69.7, 69.8, 70.8, 71.1, 71.4, 71.9×2, 72.4, 72.9, 74.2, 75.1, 86.6, 92.2, 96.4, 96.9, 97.7, 99.3, 125.4, 128.3, 129.1, 152.9, 169.0, 169.5, 169.8×2, 169.9, 170.0, 170.1, 170.2×2, 170.3, 170.5, 170.6, 170.9×2, 174.6.
 化合物14 (435mg、0.252mmol) をメタノール (2.0mL)、THF (2.0mL) に溶解させ、ナトリウムメトキサイド (0.5M in MeOH) (0.5mL、0.252mmol) を室温で加え、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (クロロホルム/メタノール/水 = 5/4/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、減圧濃縮して得られたシラップをゲルろ過カラム(GE Healthcare、Sephadex LH-20、エタノール)に供し、化合物15 (220mg、80%、α/β= 1/20)を得た。その後、分取HPLC(C18 YMC HPLCカラム、20mM 酢酸アンモニウム水溶液/90%アセトニトリル・10%水 = 70/30 ~ 10/90、45分)で、化合物15のβ体を単離し、凍結乾燥を行った。化合物15の核磁気共鳴(NMR)法による構造解析データを図6~9に示す。
 
[化合物15(β体)]
1H-NMR (pyridine-d5, 800 MHz) δ 0.68 (m, 1H), 0.86 (m, 1H), 0.98 (m, 1H), 1.11-1.15 (complex, 4H), 1.24 (m, 2H), 1.39 (m, 2H), 1.49 (s, 3H), 1.62 (m, 3H), 1.71 (d, 3H), 1.75 (d, 3H), 1.88 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 2.00 (m, 2H), 2.11 (m, 2H), 2.19 (m, 2H), 2.46 (m, 1H), 2.66 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.97-4.10 (complex, 5H), 4.17-4.42 (complex, 11H), 4.49 (m, 1H), 4.51-4.59 (complex, 3H), 4.73 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.87 (m, 1H), 4.98 (d, J = 8.0 Hz,1H), 5.08 (s, 1H), 5.10 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 5.66 (s, 1H), 6.26 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 6.41 (s, 1H), 6.47 (s, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 200 MHz) δ 17.1, 19.2×2, 20.1, 20.9, 22.3, 29.6, 37.9, 38.2, 39.9, 40.9, 41.9, 42.8, 43.7, 44.5, 48.4, 54.1, 58.3, 62.3, 62.4, 62.5, 69.8×2, 70.2, 71.2, 71.6, 72.4, 72.5, 72.6, 74.0, 74.1, 75.2, 76.4, 76.8, 77.4, 78.5, 78.8, 79.0, 79.5, 86.9, 89.8, 94.0, 98.4, 101.8, 101.9, 104.4, 105.3, 154.5, 176.2.
 
[α]= -46.3°(c 0.05, MeOH)
MALDI-TOF-MS m/z found [M + Na]+1119.5, C50H80O26calcd for [M + Na]+1119.5.
[新規ステビオール配糖体2の合成]
(1)合成経路の概要
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
 
 スキーム11に示したように、新規ステビオール配糖体2(化合物17)の合成では、ステビオールグリコシド (化合物3) と3糖ヘミアセタール体 (化合物13) を、光延反応で縮合することで、新規ステビオール配糖体2の骨格を得る事とした。ステビオールグリコシド  の合成では、既知の天然物であるレバウディオサイドC (化合物1) をArk Pharm社から購入し、ステビオール19位のエステル結合をアルカリ加水分解後、糖鎖の水酸基をアセチル (Ac) 基で保護することで、ステビオールグリコシドを得た。3糖ヘミアセタール体の合成では、適切に保護されたグルコースアクセプター (化合物4) とラムノースドナー (化合物5) の縮合反応から2糖アクセプター(化合物9)を合成し、グルコースドナー(化合物10)との縮合反応によって、3糖骨格とした。得られた3糖の還元末端1位の保護基を脱保護することで、3糖ヘミアセタール体を得た。ステビオールグリコシドと3糖ヘミアセタール体を、光延反応で縮合したところ、44% (α/β= 1/10) と良好な収率且つ高いβ選択性で反応が進行した。得られた化合物の保護基を脱保護することで、新規ステビオール配糖体2を得た。
 次に、各合成工程について説明する。
(2)ステビオールグリコシドの合成
 ステビオールグリコシドの合成は、「新規ステビオール配糖体1の合成」の場合と同様の方法で行った。
(3)3糖ヘミアセタール体の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
 
 スキーム12に示したように、「新規ステビオール配糖体1の合成」の場合と同様の方法で化合物6および化合物7を得た。
 化合物7 (1.7g, 3.04mmol) をアセトニトリル (30mL)に溶解させ、ベンズアルデヒドジメチルアセタール (681μL、4.57mmol) を室温で加え、室温にて2時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/1, Rf値 = 0.7) にて確認した。トリエチルアミン (2mL) で中和(pH 8) 後、減圧濃縮し、化合物9 (2.0g) を得た。
化合物9 (2.0g、3.04mmol) と化合物10 (1.6g、3.34mmol)、モレキュラーシーブス4Å (4.0g) をジクロロメタン(64mL) に溶解させ、トリフルオロメタンスルホン酸 (114μL、1.29mmol) を室温で加え、0度にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、トリエチルアミン (100μL) で中和 (pH 8) し、モレキュラーシーブス4Åを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液(酢酸エチル/ヘキサン = 1/2) にて化合物11 (650mg、22%、3 steps) を得た。
[化合物11]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.16 (d, J = 6.0 Hz, 1H, H-6 of Rha), 1.94-2.19 (complex, 21H, OAc), 3.43-3.52 (complex, 2H), 3.62-3.81 (complex, 5H, OMe), 3.96-4.04 (complex, 2H), 4.07-4.18 (complex, 3H), 4.28-4.35 (complex, 2H), 4.86 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.94-4.98 (complex, 2H, H-1), 5.01-5.11 (complex, 2H), 5.16-5.21 (complex, 2H), 5.28 (s, 2H, H-1 of Rha), 5.52 (s, 1H, PhCH), 6.90 (dd, 4H, PhOMe), 7.31-7.49 (complex, 5H, Ph); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 14.3, 17.3, 20.4, 20.7, 20.9×3, 21.0, 21.1, 55.8, 60.5, 62.0, 66.3, 66.9, 68.3, 68.7, 69.3, 69.4, 70.7, 71.6, 71.9, 72.9, 78.9, 81.0, 97.7, 99.3, 100.7, 101.6, 114.8, 118.4, 126.2, 128.4, 129.4, 137.1, 150.7, 155.8, 169.4, 169.5, 170.0, 170.2, 170.4, 170.5, 170.8, 171.2.
 化合物11 (627mg、0.642mmol) をエタノール (3mL) とTHF (3mL) に溶解させ、水酸化パラジウム (1.0g) を室温で加え、水素雰囲気下、室温にて2時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1、Rf値 = 0.2) にて確認後、水酸化パラジウムを濾別し、濾液を減圧濃縮した。その後、ピリジン (6.4mL)に溶解させ、無水酢酸 (182μL、1.93mmol) を室温で加え、室温にて18時間攪拌した。反応終了をTLC (酢酸エチル/ヘキサン = 2/1, Rf値 = 0.7) にて確認後、トルエン (20mL) を加えた共沸を3回繰り返した。その後、減圧濃縮して得られたシラップをアセトリトリル (4mL) と水 (2mL) に溶解し、セリウムアンモニウムナイトレイト (1.0g、1.87mmol) を室温で加え、室温にて30分攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1, Rf値 = 0.3) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1/1)にて化合物13 (468mg、84%、3 steps) を得た。
[化合物13]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 1.18 (d, J = 6.4 Hz, 1H, H-6 of Rha), 1.93-2.19 (complex, 27H, OAc), 3.60 (t, 1.6H, H-2β), 3.68 (m, 1.2H, H-5β), 3.78 (m, 1.4H, H-5’β), 3.97 (t, 1H, H-3β), 4.03 (dd, 1H, H-6’β), 4.15 (m, 2.3H, H-6β,H-6β), 4.22 (m, 1.2H, H-5β of Rha), 4.43 (dd, 1.2H, H-6’β), 4.67 (d, J = 7.6 Hz, 1H, H-1β), 4.77 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1’β), 4.82-4.91 (complex, 2.4H, H-4β, H-2’β), 5.06-5.14 (complex, 2.3H, H-4’β, H-4β of Rha), 5.16 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.26-5.33 (complex, 2.4H, H-3’β, H-3β of Rha), 5.39 (m, 1.1H, H-2β of Rha); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 17.3, 17.5, 20.6, 20.7×2, 20.8×3, 20.9×2, 21.6, 29.8, 31.1, 61.7, 61.8, 62.4, 67.4, 67.6, 67.9, 68.0, 68.1×2, 68.3, 68.8×2, 69.5, 69.9, 70.6×2, 71.5, 71.8, 71.9, 72.1, 72.3, 72.8, 73.0, 75.5, 79.9, 80.1, 80.5, 91.9, 95.8, 98.1, 98.9, 99.6, 99.8, 125.4, 128.4, 129.2, 169.1, 169.4, 169.5, 169.6, 169.7, 170.0×3, 170.1, 170.4, 170.5×2, 170.7.
(4)化合物17の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 
 スキーム13に示したように、化合物17の合成では、化合物13 (468mg、0.540mmol)と化合物3(420mg、0.360mmol) を1,4-ジオキサン (18mL) に溶解させ、トリブチルホスフィン (270μL、1.08mmol)、1,1’-Azobis (N,N’-dimethylformamide) (TMAD) (186mg、1.08mmol) を室温で加え、60℃にて6時間攪拌した。反応終了をTLC (トルエン/酢酸エチル = 1/1、Rf値 = 0.4) にて確認後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥した。硫酸マグネシウムを濾別し、減圧濃縮して得られたシラップをシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供し、溶出液 (トルエン/酢酸エチル = 1.5/1) および (トルエン/アセトン = 3/1)にて化合物16(320mg、44%、α/β= 1/10) を得た。
[化合物16]
1H-NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 0.45-1.18 (complex, 8H), 1.28 (d, 3H, H-6 of Rham), 1.40-1.81 (complex, 20H), 1.81-2.35 (complex, 54H, OAc), 3.60 (m, 1.2H), 3.71-3.78 (complex, 3H), 3.81-3.91 (complex, 2.4H), 3.98-4.20 (complex, 10H), 4.40-4.50 (complex, 3.4H), 4.62 (d, J = 8.0 Hz, 1.1H, H-1), 4.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1), 4.75-4.91 (complex, 7H), 4.96-5.12 (complex, 7H), 5.17 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.21-5.31 (complex, 6H), 5.32 (s, 1H, H-1 of Rha), 5.38 (t, 1.1H), 5.60 (d, J = 8.0 Hz, 1H, H-1β), 6.22 (d, J = 3.0 Hz, 0.1H, H-1α); 13C-NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 16.7, 17.5, 20.5, 20.7×2, 20.8×2, 20.9×2, 21.0, 21.6, 29.0, 39.6, 42.5, 44.0, 53.9, 58.1, 61.7, 66.7, 67.6, 68.0, 68.1, 68.3, 68.5, 69.8, 70.2, 70.7, 71.2, 71.4, 71.8, 71.9, 72.2, 72.4, 72.8, 72.9, 75.2, 80.3, 81.4, 86.6, 92.2, 96.4, 96.9, 99.3, 99.8, 125.4, 128.4, 129. 2, 138.0, 152.9, 169.0, 169.3, 169.5×2, 169.6×2, 169.8, 170.1×3, 170.2, 170.5, 170.6, 170.9×2, 174.7.
 化合物16 (300mg、0.149mmol) をメタノール (2.0mL)、THF (2.0mL) に溶解させ、ナトリウムメトキサイド (0.5 M in MeOH) (0.3mL、0.149mmol) を室温で加え、室温にて3時間攪拌した。反応終了をTLC (クロロホルム / メタノール/水 = 5/4/1、Rf値 = 0.5) にて確認後、減圧濃縮して得られたシラップをゲルろ過カラム(GE Healthcare、Sephadex LH-20、エタノール)に供し、化合物17 (188mg、96%、α/β= 1/10)を得た。その後、分取HPLC(C18 YMC HPLCカラム、20mM 酢酸アンモニウム水溶液/90%アセトニトリル・10%水 = 70/30 ~ 10/90、45分)で、化合物17のβ体を単離し、凍結乾燥を行った。化合物17の核磁気共鳴(NMR)法による構造解析データを図10~13に示す。
[化合物17(β体)] 
1H-NMR (pyridine-d5, 800 MHz) δ 0.67 (m, 1H), 0.86 (m, 1H), 0.96 (m, 1H), 1.07 (m, 1H), 1.14 (s, 3H), 1.26 (m, 1H), 1.36 (m, 1H), 1.41 (m, 1H), 1.48 (s, 3H), 1.61 (m, 3H), 1.70 (m, 6H), 1.87-2.21 (complex, 11H), 2.46 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 3.63 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.95-4.09 (complex, 8H), 4.14-4.31 (complex, 14H), 4.33 (m, 1H), 4.45 (m, 2H), 4.55 (m, 3H), 4.78 (m, 1H), 4.82 (m, 1H), 4.86 (m, 1H), 4.98 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.05-5.11 (complex, 3H), 5.66 (s, 1H), 6.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.24 (s, 1H), 6.46 (s, 1H); 13C-NMR (pyridine-d5, 200 MHz) δ 17.0, 19.2, 20.1, 20.9, 22.3, 29.6, 37.8, 38.3, 39.9, 40.8, 41.9, 42.7, 43.7, 44.5, 48.4, 54.2, 58.4, 61.9, 62.4, 62.5, 69.1, 69.8×2, 70.5, 71.6, 71.7, 72.3, 72.4, 72.5×2, 73.9, 74.1, 75.2, 76.4, 76.5, 77.5, 78.3, 78.4, 78.5, 78.8×2, 86.9, 88.8, 89.8, 93.8, 98.4, 101.8, 101.9, 104.4, 104.5, 105.3, 154.4, 176.0.
 
[α]= -44.5°(c 0.1, MeOH)
MALDI-TOF-MS m/z found [M + Na]+1281.4, C56H90O31calcd for [M + Na]+1281.5.
(iii)化学合成標準品のHPLC- 高分解能MS/MSおよびMS3断片化の保持時間と断片化パターンの一致による構造決定
 (i)と同条件で、HPLC- 高分解能MS/MSおよびMS3断片化による新規ステビオール配糖体1の化学合成品(化合物15のβ体)とステビア葉抽出液の比較を行った結果、保持時間29.1分のピークで化学合成品とステビア葉抽出液からのピークが検出された(図14)。また、それぞれのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトル(図15)も一致した。この結果から、植物体の抽出液から得られた新規ステビオール配糖体1は化合物15のβ体と同じ構造を有することが確認された。
 さらに、(i)と同条件で、HPLC- 高分解能MS/MSおよびMS3断片化による新規ステビオール配糖体2の化学合成品(化合物17のβ体)とステビア葉抽出液の比較を行った結果、保持時間28.9分のピークで化学合成品とステビア葉抽出液からのピークが検出された(図16)。また、それぞれのMS/MSおよびMS3断片化マススペクトル(図17)も一致した。この結果から、植物体の抽出液から得られた新規ステビオール配糖体2は化合物17のβ体と同じ構造を有することが確認された。
[新規ステビオール配糖体の生合成]
 酵母において、ステビオールから新規ステビオール配糖体を生成させた。まず、ステビア由来の配糖化酵素遺伝子UGT85C2、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1の4種と、シロイヌナズナ由来UDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2を同時に発現させる酵母を育種した。
 本実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、Molecular Cloning(Sambrookら, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 2001)に記載の方法に従った。
 ステビア由来の4つの配糖化酵素遺伝子をクローニングするために、下記のプライマーセットを合成し、ステビア葉から調製したcDNAを鋳型にPCRを行った。
 
UGT85C2遺伝子増幅用プライマーセット
 CACC-NdeI-SrUGT85C2-Fw(下線部NdeI認識部位):
   5’-CACCCATATGGATGCAATGGCTACAACTGAGAA-3’(配列番号12)
 
 BglII-SrUGT85C2-Rv(下線部BglII認識部位):
   5’-AGATCTCTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTT-3’(配列番号13)
 
UGT91D2遺伝子増幅用プライマーセット
SrUGT91D2-pET15b-FW
5’-TGCCGCGCGGCAGCCATATGTACAACGTTACTTATCATC-3’(配列番号35)
 
SrUGT91D2-pET15b-RV
5’-GTTAGCAGCCGGATCCTTAACTCTCATGATCGATGGCAA-3’(配列番号36)
 
UGT74G1遺伝子増幅用プライマーセット
 CACC-NdeI-SrUGT74G1-Fw(下線部NdeI認識部位): 
   5’-CACCCATATGGCGGAACAACAAAAGATCAAGAAAT-3’ (配列番号14)
 
 BamHI-SrUGT74G1-Rv(下線部BamHI認識部位):
   5’-GGATCCTTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATT-3’ (配列番号15)
 
UGT76G1遺伝子増幅用プライマーセット
 CACC-NdeI-SrUGT76G1-Fw(下線部NdeI認識部位): 
   5’-CACCCATATGGAAAATAAAACGGAGACCA-3’ (配列番号16)
 
 BamHI-SrUGT76G1-Rv(下線部BamHI認識部位):
   5’-GGATCCTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTA-3’ (配列番号17)
 
 ステビア葉cDNAについてはステビア葉からRNeasy Plant Miniキット(QIAGEN)を用いて総RNAを抽出し、そのうち0.5μgをRandom Oligo-dTプライマーで逆転写(RT)反応することによって得た。
 PCR反応液(50μl)は、ステビア葉由来cDNA 1μl、1×KOD plus buffer(TOYOBO)、0.2mM dNTPs、プライマー各0.4pmol/μl、1mM MgSO4, 1U 耐熱性 KOD plus polymeraseからなる組成とした。PCR反応は、95℃で5分間反応させた後、94℃で0.5分間、50℃で0.5分間、68℃で2分間の反応を計30サイクルの増幅を行った。各PCR産物を0.8%アガロースゲルによる電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した結果、それぞれの鋳型DNAから推定された約1.4kbのサイズに増幅バンドが得られた。
 このPCR産物はpENTR-TOPO Directionalベクター(Invitrogen)に製造業者が推奨する方法でサブクローニングした。DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子、すなわちUGT85C2、UGT91D2、UGT74G1、UGT76G1の全てのUGT遺伝子がクローニングできたことを確認した。
酵母用発現ベクターの構築
 これらのUGT遺伝子、およびシロイヌナズナ由来のUDP-ラムノース合成酵素遺伝子AtRHM2(J Biol Chem 2007 Oka et. al)を酵母発現ベクターに組み込むために下記のプライマーセットを設計した。
 
SrUGT85C2セット
 Bgl2-UGT85C2-F(下線部BglII認識部位):
   5’-ACAGATCTATGGATGCAATGGCTACAACTGAGA-3’ (配列番号18)
 Sal-UGT85C2-R(下線部SalI認識部位):
   5’-TAGTCGACTAGTTTCTTGCTAGCACGGTGATTTC-3’ (配列番号19)
 
SrUGT91D2セット
 NotI-UGT91DIL3-F(下線部NotI認識部位):
   5’-AAGCGGCCGCATGTACAACGTTACTTATCATCAAAATTCAAA-3’ (配列番号20)
 Pac-UGT91D1L3-R(下線部PacI認識部位):
   5’-CGTTAATTAACTCTCATGATCGATGGCAACC-3’ (配列番号21)
 
SrUGT74G1セット
 Not-UGT74G1-F(下線部NotI認識部位):
   5’-AAGCGGCCGCATGGCGGAACAACAAAAGATCAAG-3’ (配列番号22)
 Pac-UGT74G1-R(下線部PacI認識部位):
   5’-CGTTAATTAAGCCTTAATTAGCTCACTTACAAATTCG-3’ (配列番号23)
 
SrUGT76G1セット
 Bam-UGT76G1-F(下線部BamHI認識部位):
   5’-AAGGATCCATGGAAAATAAAACGGAGACCACCG-3’ (配列番号24)
 Sal-UGT76G1-R(下線部SalI認識部位):
   5’-GCGTCGACTTACAACGATGAAATGTAAGAAACTAGAGACTCTAA-3’ (配列番号25)
 
AtRHM2セット
Bam-AtRHM2-F(下線部BamHI認識部位):
  5’-GGATCCATGGATGATACTACGTATAAGCCAAAG-3’ (配列番号26)
Xho-AtRHM2-R(下線部XhoI認識部位):
   5’-CTCGAGTTAGGTTCTCTTGTTTGGTTCAAAGA-3’ (配列番号27)
 
 UGT85C2を鋳型としてSrUGT85C2セット、UGT91D2を鋳型としてSrUGT91D2セット、UGT74G1を鋳型としてSrUGT74G1セット、UGT76G1を鋳型としてSrUGT76G1セット、AtAHM2を鋳型としてAtAHM2セットの鋳型とプライマーの組み合わせで、耐熱性KOD DNAポリメラーゼ(東洋紡)を用いて、PCRにより増幅し、それぞれのORFの両端に制限酵素サイトを付加した。得られたDNA断片を、ゼロBlunt-TOPO PCRクローニングキット(インビトロジェン)を用いてサブクローニングし、DNA Sequencer model 3100(Applied Biosystems)を用い、合成オリゴヌクレオチドプライマーによるプライマーウォーキング法によって配列を決定し、目的のUGT遺伝子がそれぞれクローン化されていることを確認した。
 pESC酵母発現システム(ストラタジーン)を用いて、上記遺伝子を酵母で発現させるために、次の発現ベクターを構築した。
(1)プラスミドpESC-URA-UGT56の構築
 UGT85C2を制限酵素BglIIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-URA(ストラタジーン)を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切断したものと連結して、プラスミドpESC-URA-UGT-5を得た。このプラスミドpESC-URA-UGT-5を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT91D2を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切り出したものを連結し、pESC-URA-UGT56を得た。
(2)プラスミドpESC-HIS-UGT78の構築
 UGT76G1を制限酵素BamHIと制限酵素SalIで切り出し、ベクターpESC-HIS(ストラタジーン)を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-HIS-UGT-8を得た。このプラスミドpESC-HIS-UGT-8を制限酵素NotIと制限酵素PacIで切断したものと、UGT74G1をNotIとPacIで切り出したものを連結し、pESC-HIS-UGT78を得た。
(3)プラスミドpESC-TRP-AtRHM2の構築
AtAHM2を制限酵素BamHIと制限酵素XhoIで切り出し、ベクターpESC-TRP(ストラタジーン)を同じ制限酵素で切断したものを連結し、プラスミドpESC-TRP-AtAHM2を得た。
酵母の形質転換
 Saccharomyces cerevisiae YPH499株(ura3-52 lys2-801amberade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1  a)を宿主として、酢酸リチウム法で、表2のプラスミドを導入した。形質転換株として、SC-Trp&Ura&His寒天培地(1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、グルコース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g、Bacto agar 20g)で生育するものを選抜した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
 
 なお、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&Hisは、アデニン硫酸塩 2.5g、L-アルギニン塩酸塩 1.2g、L-アスパラギン酸 6.0g、L-グルタミン酸 6.0g、L-ロイシン3.6g、L-リジン 1.8g、L-メチオニン 1.2g、L-フェニルアラニン 3.0g、L-セリン 22.5g、L-スレオニン12g、L-チロシン 1.8g、L-バリン 9.0gを混ぜて調製した。
導入遺伝子の発現誘導と発現解析
 得られた形質転換株を以下の通り培養した。
 まず、前培養としてSC-Trp&Ura&His液体培地(SC- Trp&Ura&His寒天培地のBacto agarを除く)10 mlに、それぞれの形質転換株を植菌し、30℃で1日間振とう培養した。次に、本培養として前培養液のうち、1 mlを10 mlのSG-Trp&Ura&His液体培地(1Lあたり、Yeast nitrogen baase without amino acids 6.7g、ガラクトース 20g、アミノ酸ミックスパウダー-Trp&Ura&His 1.3g)に植菌し、30℃で2日間振とう培養した。
 形質転換株で導入した遺伝子が発現したかどうかを確認するため、培養液から菌体を集め、RNeasy Mini Kitを用いて、トータルRNAを精製した。
 トータルRNA 1μgをとり、スーパースクリプトII逆転写酵素(サーモフィッシャーサイエンティフィック)、ランダムヘキサマーをプライマーとして、cDNAを合成した。
 導入遺伝子の発現を確認するために、以下のプライマーを作製した。
UGT85C2発現確認用
 UGT85C2-r1:
   5’-CAAGTCCCCAACCAAATTCCGT-3’ (配列番号28)
 
UGT91D2発現確認用
 UGT91D1L3-r1:
   5’-CACGAACCCGTCTGGCAACTC-3’ (配列番号29)
 
UGT74G1発現確認用
 UGT74G1-r1:
   5’-CCCGTGTGATTTCTTCCACTTGTTC-3’ (配列番号30)
 
UGT76G1発現確認用
 UGT76G1-r1:
   5’-CAAGAACCCATCTGGCAACGG-3’ (配列番号31)
 
AtAHM2 発現確認用
AtAHM2-r1
   5’-GCTTTGTCACCAGAATCACCATT-3’ (配列番号32)
 
GAL10p領域 (プロモーター領域)
 PGAL10-f3:
   5’-GATTATTAAACTTCTTTGCGTCCATCCA-3’ (配列番号33)
 
GAL1p領域(プロモーター領域)
 PGAL1-f3:
   5’-CCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACC-3’ (配列番号34)
 各導入遺伝子が発現していることは、以下のプライマーの組み合わせで、先に合成したcDNAを鋳型として、ExTaq(タカラバイオ)を用いてPCRを行い、その産物をアガロースゲル電気泳動により確認した。
 
UGT85C2:UGT85C2-r1(配列番号28)とPGAL1-f3(配列番号34)
UGT91D2またはUGT91D2L3:UGT91D1L3-r1(配列番号29)とPGAL10-f3(配列番号33)
UGT74G1:UGT74G1-r1(配列番号30)とPGAL1-f3(配列番号34)
UGT76G1:UGT76G1-r1(配列番号31)とPGAL10-f3(配列番号33)
AtAHM2:AtAHM2-r1(配列番号32)とPGAL10-f3(配列番号33)
 
 これにより、形質転換株で、導入した遺伝子が発現していることが確認できた。
新規ステビオール配糖体の生産
 培養は、本培養用の液体培地に培地1 mlあたり0.5μgまたは2μgのステビオール(ChromaDex Inc.)を添加した以外は、上記実施例と同様の条件で行った。培養終了後、培養液を遠心分離により、上清と菌体に分離した。培養上清を、アセトニトリルで洗浄後、水で平衡化したSep-Pak C18カラムに供し、20% アセトニトリルで洗浄後、80%アセトニトリルで溶出し、乾固後、少量の80% アセトニトリルに溶解して配糖体サンプルを調製した。この配糖体サンプルを以下の分析に供した。
LC-MSによる分析
 LC-MSによる分析は、「新規ステビオール配糖体の単離」についての実施例に記載のとおり分析した。
 結果を図18および19に示した。A-5678株で新規ステビオール配糖体1および2が生成していることが確認できた。この結果は、上記の化学合成によって得られたステビオール配糖体と一致していた。
新規ステビオール配糖体の甘味度評価
 新規ステビオール配糖体の甘味度を評価するため、Brix0.5から3まで0.5刻となるようショ糖を純水に添加したサンプルを調製した。新規ステビオール配糖体2と同じ構造を有する化合物17を1,700ppmとなるように純水に添加してサンプルを調製した。ここで、化合物17中に含まれるα体とβ体との比率(α:β、モル比)は1:10であった。
 評価は新規ステビオール配糖体を添加されたサンプルと同等の甘味強度を持つショ糖添加サンプルを選択することによって行われ、甘味料の官能に関して訓練を受けた者(5名)がパネラーとなって官能評価を行った。その結果、新規配糖体2を添加した調製サンプルがBrix1のショ糖添加サンプルと同等の甘味を持つことがわかった。したがって、本新規ステビオール配糖体はショ糖に対し14.7の甘味度を持つことがわかった。新規ステビオール配糖体1については、水に十分に溶解しなかったため正確な甘味度は得られなかったが、後述のとおり、新規ステビオール配糖体1も甘味を有することが確認された。
新規ステビオール配糖体(化合物17)の官能評価
 各種ステビオール配糖体の味質の評価を行うため、図20に示した添加量となるようにReb.Aと、Reb.Dと、新規ステビオール配糖体2と同じ構造を有する化合物17とをそれぞれ純水に添加して、飲料サンプルを調製した。飲料サンプルは全て、甘味度をReb.Aについては300、Reb.Dについては250、新規配糖体2(化合物17)については14.7として、ショ糖(スクロース)換算のBrixが最終的に2となるように調整した。
 得られた飲料サンプルについて、甘味立ち上がり、甘味の後引き、甘味総量、雑味、および雑味の後引きの指標で官能評価を行った。なお、雑味とは本明細書において苦味を含む、渋味など甘味以外の好ましくない香味を意味する。甘味料の官能に関して訓練を受けた者(7名:サントリー食品インターナショナル株式会社)がパネラーとなって評価を行い、評価基準は次の通りとした。とても弱い(-3)、弱い(-2)、やや弱い(-1)、普通(0)、やや強い(+1)、強い(+2)、およびとても強い(+3)。結果を図20に示す。図中に示す評点は7名のパネラーによる評点の平均値である。
 官能評価の結果、新規ステビオール配糖体2と同じ構造を有する化合物17は従来の甘味料であるReb.AやReb.Dよりも甘味の立ち上がりが早く、後引きは砂糖と同程度に良かった。また、Reb.Dと同程度の甘味総量を有することが分かった。
新規ステビオール配糖体(化合物15および17)の粉体の香味評価
 新規ステビオール配糖体1および2それぞれの粉体における香味を評価した。具体的には、化学合成によって得られた化合物15(新規ステビオール配糖体1に対応)と化合物17(新規ステビオール配糖体2に対応)を高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography:HPLC)を用いてβ体のみを単離し、粉体状としたものについて香味を評価した。甘味料の官能に関して訓練を受けた者(3名:サントリー食品インターナショナル株式会社)がパネラーとなって評価を行った。結果を表3に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
 
 上記の結果から、新規ステビオール配糖体1および2はいずれも甘味を有しており、甘味料として有用であることが分かる。またいずれの配糖体も、苦味のような望ましくない香味が弱いという特徴があることが分かる。なお、化合物17については、甘味度評価に用いたα体とβ体の混合物と類似した香味を有していた。

Claims (16)

  1.  式(1):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     
    (式中、
     Rは、式(2)または式(3):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     
    の糖鎖を表し、
     glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す)
    で示される化合物、またはその塩、もしくは水和物。
  2.  植物由来物、化学合成物、または生合成物である、請求項1に記載の化合物。
  3.  請求項1または2に記載の化合物を含む、飲食品。
  4.  請求項1または2に記載の化合物を含む、甘味料組成物。
  5.  レバウディオサイドA、レバウディオサイドB、レバウディオサイドC、レバウディオサイドD、レバウディオサイドE,レバウディオサイドF、レバウディオサイドI、レバウディオサイドJ、レバウディオサイドK、レバウディオサイドN、レバウディオサイドM、レバウディオサイドO、レバウディオサイドQ、レバウディオサイドR、ズルコサイドA、ズルコサイドC、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシドおよびステビオシドからなる群から選択される一種以上のステビオール配糖体をさらに含む、請求項4に記載の甘味料組成物。
  6.  請求項4または5に記載の甘味料組成物を含む飲食品。
  7.  飲料である、請求項6に記載の飲食品。
  8.  請求項1に記載の化合物を含む植物体。
  9.  請求項8に記載の植物体の、請求項1に記載の化合物を含む抽出物。
  10.  請求項8に記載の植物体または請求項9に記載の植物体の抽出物を含む飲食品。
  11.  飲料である請求項10に記載の飲食品。
  12.  請求項1に記載の化合物の製造方法であって、
    (A)下記式(4):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     
    (式中、glcはグルコースを表し、rhaはラムノースを表す)
    で示されるレバウディオサイドCから、下記式(5):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     
    (式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す。)
     
    で示される中間体1を調製する工程と
     
    (B)グルコピラノシド誘導体から式(6):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     
    で示される中間体2、または式(7):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     
    (式中、p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
    で示される中間体3を調製する工程と、
    (C)前記中間体1と、前記中間体2または3とを、ホスフィン試薬およびアゾ化合物の存在下で反応させ、下記式(8):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     
    (式中、
     Rは、式(9)または式(10):
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
     
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     
    の糖鎖を表し、
     p-glcは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているグルコースを表し、p-rhaは少なくとも一つのヒドロキシル基が保護基で保護されているラムノースを表す)
    で示される中間体4を得る工程を含む、方法。
  13.  請求項1または2に記載の化合物の甘味料としての使用。
  14.  請求項1に記載の化合物の製造方法であって、下記(a)~(g): 
    (a)配列番号2のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位の水酸基にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (b)配列番号4のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のカルボン酸にグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (c)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位に結合したグルコースに1→2結合でラムノースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (d)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の13位のグルコースの3位に1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (e)配列番号6のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→2結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
    (f)配列番号8のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、ステビオール配糖体の19位のグルコースに、1→3結合でグルコースを付加する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;および
    (g)配列番号10のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有し、かつ、UDP-グルコースからUDP-ラムノースを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
    の少なくとも1つのポリヌクレオチドを導入した非ヒト形質転換体を用いることを特徴とする方法。
  15.  前記非ヒト形質転換体が酵母である、請求項14に記載の方法。
  16.  ステビオールを含む培地で前記非ヒト形質転換体の培養を行うことを特徴とする、請求項14又は15に記載の方法。
     
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020138365A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 サントリーホールディングス株式会社 チラミン低含有ステビア植物
WO2020218382A1 (ja) * 2019-04-26 2020-10-29 サントリーホールディングス株式会社 Glp-1分泌促進剤
WO2021020516A1 (ja) 2019-07-31 2021-02-04 サントリーホールディングス株式会社 新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物
WO2021020517A1 (ja) 2019-07-31 2021-02-04 サントリーホールディングス株式会社 新規ステビオール配糖体を含む植物体
WO2021029338A1 (ja) 2019-08-09 2021-02-18 サントリーホールディングス株式会社 泡保持性を有する飲料および飲料における泡保持性を改善する方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017388705B2 (en) 2016-12-27 2024-03-14 Suntory Holdings Limited High rebaudioside C-content stevia plant
WO2021252814A1 (en) * 2020-06-11 2021-12-16 Corn Products Development, Inc. Production and uses of oligosaccharides and steviol glycosides

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3436317B2 (ja) 1993-11-24 2003-08-11 大日本インキ化学工業株式会社 ステビア甘味料の製造方法
JP2005287403A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Suntory Ltd 脂質生産菌の育種方法およびその利用
WO2010038911A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. New steviol glycoside
WO2016090460A1 (en) 2014-12-08 2016-06-16 Qibin Wang High rebaudioside-c plant varietal and compositions extracted therefrom with high rebaudioside-c and total steviol glycoside content

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4361697A (en) * 1981-05-21 1982-11-30 F. K. Suzuki International, Inc. Extraction, separation and recovery of diterpene glycosides from Stevia rebaudiana plants
US4612942A (en) * 1984-03-08 1986-09-23 Stevia Company, Inc. Flavor enhancing and modifying materials
JPH10271928A (ja) 1997-01-30 1998-10-13 Morita Kagaku Kogyo Kk ステビア・レバウディアナ・ベルトニーに属する新植物
WO2009149577A1 (en) 2008-06-13 2009-12-17 Givaudan Sa Methods of identifying modulators of the bitter taste receptor tas2r44
PL2482676T3 (pl) 2009-06-16 2015-03-31 Epc Beijing Natural Products Co Ltd Zmniejszanie lub eliminowanie posmaku w słodziku przy użyciu rebaudiozydu D
CN105671108A (zh) * 2010-06-02 2016-06-15 沃维公司 甜菊糖苷的重组生产
CN105283464B (zh) 2013-03-15 2018-02-13 可口可乐公司 甜菊醇糖苷、其组合物以及其纯化
CA2939784C (en) 2014-02-18 2023-01-24 Mcneil Nutritionals, Llc Process for separation, isolation and characterization of steviol glycosides
US10612065B2 (en) 2015-05-29 2020-04-07 Cargill, Incorporated Heat treatment to produce glycosides

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3436317B2 (ja) 1993-11-24 2003-08-11 大日本インキ化学工業株式会社 ステビア甘味料の製造方法
JP2005287403A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Suntory Ltd 脂質生産菌の育種方法およびその利用
WO2010038911A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Morita Kagaku Kogyo Co., Ltd. New steviol glycoside
WO2016090460A1 (en) 2014-12-08 2016-06-16 Qibin Wang High rebaudioside-c plant varietal and compositions extracted therefrom with high rebaudioside-c and total steviol glycoside content

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Methods in yeast genetics", 2000, A COLD SPRING HARBOR LABORATORY COURSE MANUAL
"Methods in Yeast Genetics, A laboratory manual", COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
BRANDLE, J. ET AL.: "Genetic control of rebaudioside A and C concentration in leaves of the sweet herb, Stevia rebaudiana", CAN. J. PLANT SCI., vol. 79, 1999, pages 85 - 92, XP000872153 *
CEUNEN, S. ET AL.: "Steviol glycosides: chemical diversity, metabolism, and function", JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS, vol. 76, 2013, pages 1201 - 1228, XP002769526 *
GARDANA, C. ET AL.: "Evaluation of steviol and its glycosides in Stevia rebaudiana leaves and commercial sweetener by ultra-high-performance liquid chromatography-mass spectrometry", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 1217, no. 9, 2010, pages 1463 - 1470, XP026885937 *
HUSSAIN ET AL., GENE, vol. 101, 1991, pages 149
J. BACTERIOLOGY, vol. 153, 1983, pages 163
JUNJI INOKOSHI ET AL., JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, vol. 64, 1992, pages 660
MACKENXIE, D. A. ET AL., APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 66, 2000, pages 4655 - 4661
MARIN ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 81, 1984, pages 337
OHTA, M. ET AL.: "Characterization of novel steviol glycosides from leaves of Stevia rebaudiana Morita", APPL. GLYCOSCI., vol. 57, no. 3, 2010, pages 199 - 209, XP055121080 *
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 75, 1978, pages 1929
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", vol. 3, 2001, COLD SPRING HARBOUR LABORATORY PRESS
See also references of EP3611179A4
STARRATT, A. N. ET AL.: "Rebaudioside F, a di terpene glycoside from Stevia rebaudiana", PHYTOCHEMISTRY, vol. 59, no. 4, 2002, pages 367 - 370, XP004335033 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020138365A1 (ja) * 2018-12-28 2020-07-02 サントリーホールディングス株式会社 チラミン低含有ステビア植物
JPWO2020138365A1 (ja) * 2018-12-28 2021-11-04 サントリーホールディングス株式会社 チラミン低含有ステビア植物
WO2020218382A1 (ja) * 2019-04-26 2020-10-29 サントリーホールディングス株式会社 Glp-1分泌促進剤
WO2021020516A1 (ja) 2019-07-31 2021-02-04 サントリーホールディングス株式会社 新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物
WO2021020517A1 (ja) 2019-07-31 2021-02-04 サントリーホールディングス株式会社 新規ステビオール配糖体を含む植物体
JPWO2021020516A1 (ja) * 2019-07-31 2021-10-28 サントリーホールディングス株式会社 新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物
JP7002703B2 (ja) 2019-07-31 2022-02-04 サントリーホールディングス株式会社 新規ステビオール配糖体およびその製造方法、ならびにそれを含む甘味料組成物
AU2020320849B2 (en) * 2019-07-31 2023-11-16 Suntory Holdings Limited Novel steviol glycoside, method for producing same, and sweetener composition containing same
WO2021029338A1 (ja) 2019-08-09 2021-02-18 サントリーホールディングス株式会社 泡保持性を有する飲料および飲料における泡保持性を改善する方法

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