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WO2018168907A1 - 検体の展開を制御し得る、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片 - Google Patents

検体の展開を制御し得る、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片 Download PDF

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WO2018168907A1
WO2018168907A1 PCT/JP2018/009901 JP2018009901W WO2018168907A1 WO 2018168907 A1 WO2018168907 A1 WO 2018168907A1 JP 2018009901 W JP2018009901 W JP 2018009901W WO 2018168907 A1 WO2018168907 A1 WO 2018168907A1
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WO
WIPO (PCT)
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region
reagent
impregnated
nitrite
test piece
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/009901
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English (en)
French (fr)
Inventor
加藤　大介
志野 村松
友洋 服部
Original Assignee
デンカ生研株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by デンカ生研株式会社 filed Critical デンカ生研株式会社
Priority to MYPI2019005318A priority Critical patent/MY193496A/en
Priority to US16/492,427 priority patent/US11906513B2/en
Priority to KR1020197028533A priority patent/KR102267571B1/ko
Priority to CN201880018270.1A priority patent/CN110418964B/zh
Priority to EP18768581.3A priority patent/EP3598132B1/en
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    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Definitions

  • the present invention relates to an immunochromatographic test strip for extracting and measuring a sugar chain antigen, which can be subjected to a nitrous acid extraction treatment of a sugar chain antigen on an immunochromatographic test strip.
  • Rapid diagnostic drugs based on the general immunochromatography method can be measured quickly and easily by suspending a specimen in a specimen suspension and supplying the suspension to an immunochromatographic test piece.
  • Patent Document 1 For example, by adding sodium nitrite and a neutralizing reagent to the immunochromatographic test piece in advance, the nitrous acid extraction treatment is performed on the immunochromatographic test piece only by floating the sample in an acidic solution such as acetic acid and supplying it to the immunochromatographic test piece. A method has been reported (Patent Document 1).
  • the sample is mixed with an acidic solution such as acetic acid by previously adding the nitrite and the neutralizing reagent to the immunochromatographic test strip.
  • an acidic solution such as acetic acid
  • a method of performing nitrite extraction treatment on an immunochromatographic test piece by simply floating it on the immunochromatographic test piece or adding an acidic reagent and a neutralizing reagent to the immunochromatographic test piece in advance, and floating the specimen in nitrite
  • antigens of group A ⁇ -streptococci are extracted by nitrite generated by mixing a nitrite solution and an acidic solution, but a pad impregnated with a dry acid reagent is used.
  • the sample moved from the pad impregnated with the acidic reagent to the pad impregnated with the next neutralizing reagent in a short time, the mixing time of nitrite and acidic reagent was short, and sufficient extraction was not performed.
  • the neutralizing reagent is impregnated from the pad impregnated with the acidic reagent after the sample is added.
  • the neutralizing reagent impregnates the acidic reagent.
  • the distance between the acidic reagent and the neutralizing reagent can be physically increased to ensure long-term storage stability. Conceivable.
  • the amount of the specimen sample required to be spread on the immunochromatographic test piece increases by the length. As the amount of sample required for testing increases, more nitrite solution is needed to mix the sample into tubes. In this case, the sample collected in the sample collection swab is diluted, resulting in a decrease in performance (sensitivity).
  • the above-mentioned problem is a problem that can also occur when an immunochromatographic test piece is impregnated with nitrite instead of an acidic reagent.
  • the present invention provides a method or immunochromatography for controlling the treatment speed with an acidic reagent, nitrite and neutralizing reagent by controlling the speed and direction of specimen development on an immunochromatographic test piece.
  • the purpose is to provide a specimen.
  • the present inventors diligently studied a method for controlling the development of the specimen on the immunochromatographic test piece and appropriately controlling the treatment with the acidic reagent, nitrite and neutralizing reagent.
  • a PET sheet is provided so that the width of the contact surface between the pad impregnated with the acidic reagent or nitrite and the pad impregnated with the neutralizing reagent is minimized, and the nitrite is sandwiched between the two pads.
  • the impregnated pad and the pad impregnated with the neutralizing reagent are partially in contact with each other, so that the sample does not immediately move to the pad impregnated with the neutralizing reagent, and the specimen is further removed from the pad impregnated with the neutralizing reagent. It has been found that by making the structure difficult to flow back to a pad impregnated with an acidic reagent or nitrite, a sufficient antigen extraction time can be obtained, and as a result, detection sensitivity can be improved.
  • the resin sheet was sandwiched between the pad impregnated with the acidic reagent or nitrite and the pad impregnated with the neutralizing reagent so that both pads were not in contact with each other or were slightly in contact with each other.
  • An immunochromatographic test piece was produced and the present invention was completed.
  • the present invention is as follows. [1] a sample pad to which a sample mixed with nitrite or an acidic solution is added, a labeled region containing a labeled antibody labeled with an antibody against a sugar chain antigen, and a detection region on which the antibody against the sugar chain antigen is immobilized, An immunochromatographic test piece for measuring a sugar chain antigen by forming an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex in a detection region, and having a region impregnated with a neutralizing reagent upstream of the labeled body region, Further, when using a specimen mixed with nitrite upstream of the area impregnated with the neutralizing reagent, it has an area impregnated with a solid acidic reagent, and impregnating nitrite when using a specimen mixed with an acidic solution.
  • An immunochromatographic test piece for extracting and measuring a sugar chain antigen in a sample having a region A resin sheet was sandwiched between the area impregnated with the solid acidic reagent or nitrite and the area impregnated with the neutralizing reagent so as to suppress the movement of the reagent between the two areas or the movement of the sample solution.
  • Immunochromatographic specimen [2] The immunochromatographic test piece according to [1], wherein a region impregnated with a solid acidic reagent or nitrite is present on the sample pad.
  • the sugar chain antigen is a sugar chain antigen of a protozoan, fungus, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia or virus.
  • [9] A method for measuring a sugar chain antigen in a specimen by an immunochromatography method using the immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [8], When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a solid acidic reagent, the sample is mixed with a nitrite solution. When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a nitrite, the sample is mixed with an acidic solution, and the immunochromatographic test is performed.
  • sugar chain antigen is extracted from the specimen by the action of nitrous acid generated by the reaction of nitrite and solid acidic reagent, and impregnated with neutralizing reagent
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is neutralized
  • an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex is formed.
  • the immunochromatography method controls the speed and direction of specimen development on the immunochromatographic test strip, and uses an acidic reagent, nitrite, and neutralizing reagent.
  • the present invention relates to an immunochromatographic test piece that simplifies the nitrous acid extraction treatment of a sugar chain antigen on an immunochromatographic test piece, and enables rapid and accurate measurement of the sugar chain antigen as a substance to be detected.
  • An immunochromatographic test strip is added with a support having a detection region on which an antibody (antibody 1) for capturing a substance to be detected (antigen, etc.) is immobilized, a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2), and a sample.
  • an antibody for capturing a substance to be detected (antigen, etc.)
  • a labeled region having a movable labeled antibody (antibody 2)
  • the immunochromatographic test piece of the present invention may be contained in a storage container, and the storage container can prevent deterioration due to, for example, ultraviolet rays or moisture in the air. Further, when using a sample sample having a contamination property or an infectivity property, it is possible to prevent the tester who performs the assay from the containment vessel from being contaminated or infected.
  • a sample sample having a contamination property or an infectivity property it is possible to prevent the tester who performs the assay from the containment vessel from being contaminated or infected.
  • an appropriately sized resin case may be used as a storage container, and the apparatus of the present invention may be stored in the case.
  • the surface of the test piece on which the antigen or antibody is immobilized may be covered with a resin film or the like (PET sheet).
  • PET sheet resin film or the like
  • the number of detection regions and the type of labeled antibody included in the labeled body region are not limited to one, and two or more antigens can be tested in the same test by using antibodies corresponding to a plurality of substances to be detected. It can be measured with a piece.
  • the support is a material having the ability to immobilize an antibody for capturing a substance (antigen) to be detected, and has a performance that does not prevent the liquid from passing in the horizontal direction.
  • it is a porous thin film (membrane) having a capillary action, and is a material capable of transporting a liquid and components dispersed therein by absorption.
  • the material forming the support is not particularly limited, and examples thereof include cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, polyvinylidene difluoride (PVDF), glass fiber, nylon, and polyketone. Of these, a thin film or membrane using nitrocellulose is more preferred. A membrane on which an antibody is immobilized is called an antibody-immobilized membrane.
  • the labeled body region is composed of a porous base material containing a labeled antibody, and the material of the base material can be a commonly used glass fiber (glass fiber), non-woven fabric, or the like.
  • the substrate is preferably in the form of a pad having a thickness of about 0.3 mm to 0.6 mm in order to impregnate a large amount of labeled antibody.
  • the porous substrate impregnated with the labeled antibody and dried is also referred to as a dry pad.
  • enzymes such as alkaline phosphatase and horseradish peroxidase, metal colloids such as gold colloid, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, and colored latex particles are often used.
  • metal colloids such as gold colloid, silica particles, cellulose particles, colored polystyrene particles, and colored latex particles
  • coloring occurs due to aggregation of these labeling reagents, and this coloring is measured.
  • the particles on which the antibody is immobilized are called antibody-immobilized particles.
  • the detection region refers to a partial region of the support on which an antibody that captures a substance to be detected (antigen) is immobilized.
  • the detection region is provided with at least one region on which an antibody for capturing an antigen is immobilized.
  • the detection region may be included in the support, and the antibody may be immobilized on the support.
  • the sample pad is a part for adding a specimen and is a porous material.
  • the sample pad is the most upstream site of the immunochromatographic test strip.
  • As the material generally used filter paper, glass fiber, nonwoven fabric, and the like can be used.
  • it is preferably a pad shape having a thickness of about 0.3 mm to 1 mm. Samples include samples prepared using samples, such as samples obtained by floating samples in other solutions.
  • the absorption band is a member for absorbing components that are supplied to the support and are not involved in the reaction in the detection region.
  • As the material filter paper, sponge, etc. having high water retention composed of general natural polymer compounds, synthetic polymer compounds, etc. can be used, but those having high water absorption are preferable for promoting the development of the specimen. .
  • the backing sheet is a member for affixing and fixing all the above-mentioned materials, that is, the support, the sample pad, the marker region, the absorption band, etc. with a partial overlap.
  • the backing sheet is not necessarily required as long as these materials are arranged and fixed at an optimal interval, but it is generally preferable to use the backing sheet for convenience in manufacturing or use.
  • the immunochromatographic test piece of the present invention may further have a control display region (member).
  • the control display area is a site indicating that the test has been performed correctly.
  • the control display area exists downstream of the detection area, and when the specimen sample passes through the detection area and reaches the control display area, a signal is emitted by coloring or the like.
  • a substance that binds to the antibody to which the labeling carrier is bound may be immobilized, or a reagent such as a pH indicator that changes color when the sample arrives is immobilized. Also good.
  • the antibody to which the labeling carrier is bound is a mouse monoclonal antibody, an anti-mouse IgG antibody may be used.
  • the size of the immunochromatographic test piece is not limited, but is, for example, about several centimeters to several tens of centimeters in length and several millimeters to several centimeters in length.
  • the specimen passes through a porous flow path formed by a series of connections such as a sample pad, a labeled body region, a support, a detection region, and an absorption band. Therefore, in this embodiment, all of these become the specimen movement area.
  • a porous flow path formed by a series of connections such as a sample pad, a labeled body region, a support, a detection region, and an absorption band. Therefore, in this embodiment, all of these become the specimen movement area.
  • the specimen does not permeate the inside of the material and passes through the interface.
  • the specimen movement region defined in this specification does not matter whether the specimen is inside or the interface.
  • the sugar chain antigen is extracted by treating a specimen containing the sugar chain antigen with nitrous acid.
  • Nitrous acid can be generated by mixing a nitrite such as sodium nitrite with an acid, and a specimen containing a sugar chain antigen may be treated with the nitrous acid thus generated.
  • the extracted antigen is bound to the antibody immobilized on the immunochromatographic test strip by an antigen-antibody reaction. At this time, if an acid remains in the reaction system, the reaction system becomes acidic and the antigen-antibody reaction is inhibited. Therefore, it is necessary to neutralize the acid in the reaction system.
  • the following methods can be mentioned as methods for extracting and measuring the sugar chain antigen.
  • extraction and neutralization of sugar chain antigens with nitrous acid is performed on an immunochromatographic test piece.
  • an acidic reagent or nitrite may be contained on the immunochromatographic test strip.
  • the immunochromatographic test strip may be impregnated with a neutralizing reagent.
  • a specimen and an acidic solution are mixed in advance and added to a sample pad of an immunochromatographic test piece impregnated with nitrite and a neutralizing reagent.
  • the mixed solution reaches the region impregnated with nitrite, the nitrite and acid react to generate nitrous acid, and the sugar chain antigen in the specimen is extracted.
  • the extract of the sugar chain antigen is neutralized in the region impregnated with the neutralizing reagent on the immunochromatographic test piece, and the sugar chain antigen is bound to the antibody immobilized on the immunochromatographic test piece and can be detected.
  • a specimen and a nitrite solution are mixed in advance and added to a sample pad of an immunochromatographic test piece impregnated with an acidic reagent and a neutralizing reagent.
  • the mixed solution reaches the region impregnated with the acidic reagent, nitrite and acid react to generate nitrous acid, and the sugar chain antigen in the specimen is extracted.
  • the extract of the sugar chain antigen is neutralized in the region impregnated with the neutralizing reagent on the immunochromatographic test piece, and the sugar chain antigen is bound to the antibody immobilized on the immunochromatographic test piece and can be detected.
  • the sample pad is located upstream of the labeled region (upstream of the specimen flow and on the side where the sample pad is present), that is, the sample pad.
  • An immunochromatographic test piece in which a solid acidic reagent or nitrite is impregnated or in which a sample pad is impregnated with nitrite can be used in the method (A).
  • the immunochromatographic test piece in which the acidic reagent is impregnated in the sample pad can be used in the method (B).
  • a solid acidic reagent is used as the acidic reagent.
  • the solid acidic reagent or nitrite may be impregnated in a sample pad, or impregnated in a solid acidic reagent impregnated porous material impregnated in a pad made of a porous material such as a nonwoven fabric different from the sample pad.
  • the material or nitrite-impregnated porous material may be placed between the sample pad and the label area, ie upstream of the label area.
  • the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite and the sample pad or the label region may or may not be in contact.
  • the region impregnated with the reagent is also referred to as a pad impregnated with the reagent.
  • the neutralizing reagent is disposed downstream of the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite.
  • the neutralizing reagent may be impregnated into the support, or the resulting neutralized reagent-impregnated porous material is impregnated into a solid acidic solution by impregnating a pad made of a porous material such as a nonwoven fabric other than the support. You may arrange
  • it has a region impregnated with a neutralizing reagent upstream of the labeled region, and further has a region impregnated with a solid acidic reagent or nitrite upstream of the region impregnated with the neutralizing reagent.
  • the region impregnated with the neutralizing reagent and the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite or the labeled region may or may not be in contact.
  • the material of the porous material used in the region to be impregnated with the neutralizing reagent is a woven fabric having a basis weight of 10 to 400 g / m 2 and a thickness of 0.1 to 2.0 mm, and has a water absorption per 1 cm / m 2. 10 ⁇ 100 ⁇ l / cm 2 , water absorption speed is 1.0 ⁇ 5.0 ⁇ l / sec, and 1cm / m 2 is wetted with the membrane in contact with the membrane and left to stand for 5 minutes.
  • the liquid spreading area after standing for 5 minutes is 20 mm 2 or less, that is, it has high water absorption and water retention (liquid retention ) And a porous material having three characteristics of low or long-term liquid release.
  • Specific examples include filter paper made of cellulose cotton fiber and glass filter paper made of glass fiber. Examples of such filter paper include No. 26-3 of Toyo Filter Paper Co., Ltd.
  • the volume of the filter paper to be used is large, and an acidic solution that arrives later than the sample from the upstream can be sufficiently retained.
  • the “weight per unit area” of the porous material used in the region impregnated with the neutralizing reagent is 10 to 400 g / m 2 .
  • the “basis weight” refers to weight per unit area (1 m 2) per cloth.
  • the basis weight can be appropriately changed depending on the amount and composition of the neutralizing reagent impregnated in the pad. When the basis weight is 30 g / m 2 or less, the porosity is high, and when impregnated with a neutralizing reagent, it becomes easy to tear off, and handling during immunochromatography is difficult, so the basis weight is preferably 50 g / m 2 or more.
  • the porosity is low and it depends on the composition of the neutralizing reagent, but the sample does not penetrate the material smoothly and cannot be mixed with the neutralizing reagent, so it is 300 g / m 2 or less. It is preferable.
  • the most preferred basis weight is 250 to 270 g / m 2 .
  • the “thickness” of the porous material used in the region impregnated with the neutralizing reagent is preferably 0.1 to 2.0 mm, but the thickness can be appropriately changed depending on the amount and composition of the neutralizing reagent impregnated into the pad. .
  • the thickness is 0.4 mm or less, it is easy to tear when impregnated with a neutralizing reagent, and handling at the time of immunochromatography production becomes difficult. Therefore, the preferred thickness is 0.4 to 0.8 mm, and the amount that can be impregnated with the neutralizing reagent is In view of easy adjustment and ease of handling during immunochromatography production, about 0.6 mm is more preferable.
  • water soluble water absorption amount per 1 cm / m 2 is 10 ⁇ 100 ⁇ l / cm 2, and the water absorption speed is preferably from 1.0 ⁇ 5.0 ⁇ l / sec.
  • the amount of water absorbed and the speed of water absorption was prepared by preparing a 200 ⁇ l colored solution (1% Tween20 + Red No. 102) in one cell of a 96-well EIA plate and pasting a 5 ⁇ 60mm material on the backing sheet. Place the piece and immerse it in the solution as the lower end of the test piece, measure the time until the solution reaches the upper end of the test piece, and after the solution reaches the upper end, immediately remove the test piece and remain in the cell Measure the amount of liquid to be used.
  • the amount of water absorption is the amount of liquid obtained by subtracting the amount of liquid remaining in the cell from 200 ⁇ l and dividing it by the area of 1 cm 2 of the material.
  • the water absorption speed is determined by the amount of water absorption / time taken to reach the upper end.
  • a material having a large water absorption amount and a slow water absorption speed is preferable.
  • the water absorption is preferably 30 ⁇ l / cm 2 or more.
  • the water absorption speed of the material of the porous material used in the region impregnated with the neutralizing reagent affects the time for extracting the sugar chain antigen in the specimen and the time for neutralizing the test solution after extraction.
  • the time for extracting the sugar chain antigen can be adjusted to some extent by the material or composition of the solid acidic reagent, but since it is not complete, the water absorption speed of the material used in the region impregnated with the neutralizing reagent is It is an important factor for extraction and neutralization of sufficient carbohydrate antigens.
  • the water absorption speed is preferably 1.0 to 5.0 ⁇ l / sec, and a more preferable water absorption speed is 2.0 ⁇ l / sec or less.
  • Water retention is a 1 cm / m 2 fragment of the porous material used in the area to be impregnated with the neutralizing reagent, placed on the membrane, 70 ⁇ l of the solution (1% Tween20 + Red No. 102) is added thereto, It is obtained by measuring the weight before and after standing for 5 minutes.
  • the amount of water retention varies depending on the composition of the solution to be added (surfactant and protein amount), but the amount of water retention when tested with a 1% Tween 20 solution is preferably 10-100 ⁇ l / cm 2 , more A preferable water holding amount is 15 ⁇ l / cm 2 or more.
  • Releasability refers to placing a 1 cm / m 2 piece of the porous material used in the region to be impregnated with the neutralizing reagent on the membrane, adding 70 ⁇ l of the solution (1% Tween20 + red No. 102) to it, Measure by calculating the area of the liquid spread on the membrane after 5 minutes of standing. Area will vary with the composition of the added solution (surfactant or protein content), the area when tested at 1% Tween20 solution, 30 mm 2 or less, more preferably release is 20 mm 2 or less.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a sample pad to which a sample mixed with nitrite or an acidic solution is added, a labeled region containing a labeled antibody labeled with an antibody against a sugar chain antigen, and a detection region on which the antibody against the sugar chain antigen is immobilized
  • An immunochromatographic test piece for measuring a sugar chain antigen by forming an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex in a detection region, and having a region impregnated with a neutralizing reagent upstream of the labeled body region, Further, when using a specimen mixed with nitrite upstream of the area impregnated with the neutralizing reagent, it has an area impregnated with a solid acidic reagent, and impregnating nitrite when using a specimen mixed with an acidic solution.
  • An immunochromatographic test piece for extracting and measuring a sugar chain antigen in a sample having a region
  • the material of the region impregnated with the neutralizing reagent is a filter paper or glass filter paper having three properties of high absorbability, high water retention, low release or continuous release
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is sufficiently neutralized by the high water absorption and the high water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent, and the release property of the region impregnated with the neutralizing reagent is low or
  • An immunochromatographic test strip that suppresses non-specific reactions by suppressing the remaining acidic solution from reaching the detection region due to sustained release, or by continuously developing a sufficiently neutralized test solution in the detection region .
  • An immunochromatographic test piece for extracting and measuring a sugar chain antigen in a sample having a region An immunochromatographic test piece in which a material in a region impregnated with a neutralizing reagent is a woven fabric having a basis weight of 10 to 400 g / m 2 and a thickness of 0.1 to 2.0 mm.
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is sufficiently neutralized due to the high water absorption and water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent, and the release property of the region impregnated with the neutralizing reagent
  • the immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [3], wherein the non-specific reaction is suppressed by accumulating a sufficient neutralizing ability even when the acidic solution remaining due to the persistence reaches the detection region.
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is sufficiently neutralized due to the high water absorption and water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent, and the release property of the region impregnated with the neutralizing reagent
  • the low acidity prevents the remaining acidic solution from reaching the detection region, suppresses non-specific reactions when negative, and prevents line color development after the determination time when positive [1] to [ 4]
  • the immunochromatographic test piece [6] The immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [5], wherein the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite is present on the sample pad or the pad on which the labeled region is applied.
  • the neutralizing reagent is trishydroxylmethylaminomethane or sodium hydroxide.
  • the sugar chain antigen is a sugar chain antigen of a protozoan, fungus, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, or virus.
  • [10] A method for measuring a sugar chain antigen in a specimen by an immunochromatography method using the immunochromatographic test piece according to any one of [1] to [9], When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a solid acidic reagent, the sample is mixed with a nitrite solution. When the immunochromatographic test piece has a region impregnated with a nitrite, the sample is mixed with an acidic solution, and the immunochromatographic test is performed.
  • sugar chain antigen is extracted from the specimen by the action of nitrous acid generated by the reaction of nitrite and solid acidic reagent, and impregnated with neutralizing reagent
  • the acidic solution containing the sugar chain antigen is neutralized
  • an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex is formed.
  • the sugar chain antigen is clarified by the high water absorption and water retention of the region impregnated with the neutralizing reagent.
  • Test solution in which the acidic solution is sufficiently neutralized and the remaining acidic solution is prevented from reaching the detection region due to low release or sustained release of the region impregnated with the neutralizing reagent, or is sufficiently neutralized A method of measuring a sugar chain antigen in a sample by suppressing non-specific reaction by continuously adding to the detection region.
  • a region impregnated with a solid acidic reagent is called a solid acidic reagent region
  • a region impregnated with nitrite is called a nitrite region
  • a region impregnated with a neutralizing reagent is a neutralizing reagent region or basic reagent region.
  • An immunochromatographic test strip having a solid acidic reagent region or nitrite region and a neutralizing reagent region is a sample pad from the upstream on the support, a solid acidic reagent region or nitrite region, a neutralizing reagent region, a labeled region, and a detection. It has a region and an absorption band, and the solid acidic reagent region or nitrite region may be on the sample pad.
  • the sample pad, solid acidic reagent region or nitrite region, neutralizing reagent region, labeling region, detection region, and absorption band may or may not be in contact with each other.
  • the solid acidic reagent used in the present invention is solid at normal temperature and does not volatilize at high temperature.
  • Preferred examples of the solid acidic reagent used in the present invention include malonic acid, malic acid, maleic acid, citric acid, and tartaric acid.
  • an acid with a high valence such as citric acid can be used for extraction in a smaller amount.
  • the acid dissociation constant is smaller. For example, maleic acid and tartaric acid are efficient.
  • a reagent that is not colored on the immunochromatographic test piece specifically, a reagent that is white in a dry state or difficult to be colored by drying heat or oxidation is preferable.
  • nitrite used in the present invention examples include sodium nitrite and potassium nitrite.
  • the amount of the solid acidic reagent or nitrite used in the present invention is not particularly limited, but is usually about 0.01 ⁇ g to 1 mg per test piece of the immunochromatographic test piece, preferably Is about 0.1 ⁇ g to 0.1 mg. However, it is preferable to select an optimal amount that is effective depending on the type of solid acidic reagent or nitrite used, the composition of the sample suspension, the amount added, and the like.
  • the solid acidic reagent or nitrite is dissolved once, applied and dried.
  • the neutralizing reagent used in the present invention is solid at normal temperature and does not volatilize at high temperature.
  • Preferred neutralizing reagents used in the present invention include Tris base (Trishydroxylmethylaminomethane), sodium hydroxide, dipotassium hydrogen phosphate, trisodium citrate, and Good buffer having a buffer capacity in the alkaline region. it can.
  • the amount of the neutralizing reagent used in the present invention is not particularly limited, but is usually about 0.01 ⁇ g to 1 mg, preferably 0.1 ⁇ g to 1 ⁇ g per test strip. About 0.1mg. However, it is preferable to select an optimal amount that is effective depending on the type of neutralizing reagent to be used, the composition of the sample suspension, the amount added, and the like.
  • the neutralizing reagent is dissolved once, the solution is applied to the porous material, and then dried.
  • FIG. 1 is a diagram showing a preferred form of a typical immunochromatographic test piece.
  • the immunochromatographic test piece shown in FIG. 1 is an immunochromatographic test piece impregnated with a solid acidic reagent and a neutralizing reagent, but may be impregnated with nitrite instead of the solid acidic reagent. And an immunochromatographic test piece impregnated with a neutralizing reagent.
  • a person skilled in the art can appropriately design and manufacture an immunochromatographic test piece impregnated with nitrite and a neutralizing reagent.
  • the immunochromatographic test piece is not limited to that shown in FIG. In FIG. 1, 1 is a support body, 2 is a labeled body region, 3 is a detection region, 7 is an absorption band, and 8 is a backing sheet.
  • FIG. 1A is a top view
  • FIG. 1B is a cut cross-sectional view
  • the solid acidic reagent region 5 and / or the neutralizing reagent region 6 exist upstream of the label region 2 and are superposed, thereby forming a continuous lateral flow channel.
  • the solid acidic reagent region 5 also serves as a sample pad. That is, a solid acidic reagent region is present on the sample pad.
  • the solid acidic reagent region and the neutralizing reagent region are provided in the form of two separate porous materials (pads), they may be referred to as a two-pad test piece.
  • An additional sample pad may be present upstream of the solid acidic reagent region.
  • the liquid passes between the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region.
  • a sheet that is not allowed to be sandwiched is provided. By providing the sheet, the following three effects can be achieved.
  • (A) It is possible to suppress the movement of the reagent in two adjacent areas when storing the test piece. As a result, it is possible to prevent a reaction caused by contact between the solid acidic reagent or nitrite and the neutralizing reagent. As a result, the stability of the reagent can be improved.
  • the material of the sheet provided between the solid acidic reagent region or the nitrite region and the neutralizing reagent region is not limited as long as the material does not allow liquid to pass through.
  • a resin sheet such as a PET (polyethylene terephthalate) sheet or a polyethylene sheet Can be used.
  • the resin sheet is also called a resin film.
  • the sheet may be provided so that the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region are partially in contact with each other.
  • the length of the overlapping portion of the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region is preferably as short as possible, for example, 5 mm or less, preferably 3 mm or less, more preferably 2 mm or less.
  • the sheet may be provided such that the solid acidic reagent region or nitrite region and the neutralizing reagent region do not contact each other, and a pad impregnated with the acidic reagent or nitrite covers the PET sheet.
  • the neutralization region is completely covered with the sheet, and the solid acidic reagent region or the nitrous acid region may be provided on the sheet.
  • the liquid in the solid acidic reagent region or the nitrous acid region does not move directly to the neutralization region, but reaches the neutralization reagent region after flowing on the sheet.
  • the sheet may be provided only between the solid acidic reagent region or the nitrite region and the neutralizing reagent region.
  • the solid acidic reagent region or nitrous acid region is a sample other than the solid acidic reagent region or nitrous acid region.
  • attach it so that it covers the neutralization reagent area other than the sample pad, the label area, the support, the detection area, and the absorption band, and place the solid acidic reagent area or nitrite area above the neutralization reagent area. What is necessary is just to affix on the upper part of the affixed top laminate sheet. 2 and 3 show the structure of such an immunochromatographic test piece.
  • the usage method of the test piece of this invention is described.
  • the following method of use is a method in which a sample is mixed with a nitrite solution and measured using an immunochromatographic test piece impregnated with a solid acidic reagent and a neutralizing reagent. And a method of measuring using an immunochromatographic test piece impregnated with a neutralizing reagent can also be performed with reference to the explanation of the following method of use.
  • the measurement is started by contacting and mixing the specimen or the specimen prepared using the specimen with the nitrite solution, suspending the specimen in the nitrite solution, and adding the specimen to the solid acidic reagent region 5 that also serves as the sample pad.
  • the At this time 5 to 100 ⁇ L of the sample and 0.01 to 2 mL of 0.1 M to 8 M nitrite are mixed, and 5 to 200 ⁇ L may be supplied to the solid acidic reagent region 5 that also serves as a sample pad.
  • nitrites include sodium nitrite and potassium nitrite.
  • a specimen containing a sugar chain antigen, which is a substance to be detected, provided to the solid acidic reagent region 5 also serving as the sample pad is developed into the solid acidic reagent region 5 and neutralizing reagent region 6 also serving as the sample pad by capillary action. .
  • a top laminate sheet which is a PET sheet, exists between the solid acidic reagent region 5 and the neutralizing reagent region 6. For this reason, the flow of the sample from the solid acidic reagent region 5 to the neutralizing reagent region 6 is suppressed, and the sample once entering the neutralizing reagent region 6 is prevented from flowing back to the solid acidic reagent region 5. Can do.
  • the specimen is sequentially developed in the horizontal direction to the label body region 2, the support 1, and the absorption band 7.
  • the nitrite mixed in the sample and the solid acidic reagent on the solid acidic reagent region 5 react to generate free nitrous acid. Is extracted.
  • the extracted sugar chain antigen moves to the neutralizing reagent region 6 together with the acidic developing solution, and the pH of the acidic developing solution containing the sugar chain antigen is neutralized in the neutralizing reagent region 6 and adjusted to the neutral region. .
  • the sugar chain antigen develops and moves further downstream under neutral conditions.
  • the labeled body region 2 the labeled antibody is released into the liquid and developed on the support 1 as the specimen sample is developed.
  • the sugar chain antigen When a sugar chain antigen is present in the specimen sample, the sugar chain antigen is specifically captured by the capture antibody in the detection region 3 of the support 1, and the sugar chain antigen forms a complex by a specific reaction with the labeled antibody. To do. As a result, an antibody sandwich via the sugar chain antigen is established in the detection region 3, and the labeled antibody-sugar chain antigen complex can be measured in the detection region 3.
  • the sugar chain antigen in the sample is extracted on the immunochromatographic test strip, the sugar chain antigen in the sample is extracted in advance before the measurement using the immunochromatographic test strip.
  • the sugar chain antigen in the sample can be measured in one step.
  • a biological sample to be a specimen is not particularly limited, and examples thereof include body fluids such as serum, plasma, blood, urine, feces, saliva, tissue fluid, spinal fluid, wiping fluid, and the like, or dilutions thereof.
  • the substance to be detected is a sugar chain antigen that can be measured by an immunoassay, that is, an assay utilizing an antigen-antibody reaction.
  • an immunoassay that is, an assay utilizing an antigen-antibody reaction.
  • the antigen include polysaccharides that are sugar chain antigens present on the cell walls of bacteria extracted by nitrite extraction treatment. Protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, viruses and the like containing these substances can also be measured.
  • the subject's biological sample contains sugar chain antigens derived from protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, virus, etc.
  • sugar chain antigens derived from protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, virus, etc.
  • a sugar chain antigen it can be determined that the subject is suffering from an infection caused by protozoa, fungi, bacteria, mycoplasma, rickettsia, chlamydia, viruses, and the like.
  • group A ⁇ -hemolytic streptococci Streptococcus pyogenes
  • Escherichia coli Legionella, Campylobacter, etc.
  • the method of the present invention is not limited to the case where an immunochromatographic test piece is impregnated with an acidic reagent and a basic reagent, but a plurality of reagents on the immunochromatographic test piece, that is, two to n different reagents having different effects, It can also be used when impregnating with a reagent to avoid the reaction.
  • the immunochromatography device of the present invention can have a wide addition port.
  • a conventional immunochromatographic device (Quick Navi TM -Strep A, containing an immunochromatographic test piece having a vertical length of 5 to 9 cm, preferably 7 cm, and a horizontal length of 0.3 to 0.7 cm, preferably 0.5 cm.
  • the addition port of Denka Seiken is provided as a substantially rectangular addition port having a size of about 3.5 mm x about 5.5 mm (19.25 mm 2 ), but the immunochromatography device of the present invention for storing an immunochromatographic test piece of the same size addition port is provided as a substantially rectangular addition port having a size of about 3.5 mm ⁇ about 11mm (38.5mm 2).
  • a 3-5 mm x 8-15 mm (24-75 mm 2 ) Is an immunochromatography device having a wide addition port, and can exhibit the effects of the immunochromatography device of the present invention.
  • the long side of the addition port is a side parallel to the long side of the chromatography test piece, that is, a side along the flow direction of the specimen sample solution.
  • the length of the long side of the addition port is called the addition port length, and the length of the short side is sometimes called the addition port width.
  • the above example is a case of a substantially rectangular addition port, but the shape of the addition port may be triangular or circular.
  • the size of the addition port of the immunochromatography device of the present invention is expressed in terms of area, it is 24 to 75 mm 2 , preferably 35 to 75 mm 2 .
  • the sample processing capacity is weak because the area where the sample solution is in contact with the region impregnated with the sample processing reagent is weak, and the immunochromatographic test is performed. Since the sample processing was performed while the pieces were gradually developed, there was a difference in concentration of the sample processing reagent between the sample solution developed first and the sample solution developed later. Therefore, the sample processing could not be performed reliably.
  • the addition port of the immunochromatography device of the present invention is widely provided, a region where a large amount of sample sample solution is impregnated with the sample treatment reagent on the immunochromatography in a short time, that is, a region impregnated with the solid acidic reagent Or it can supply to the area
  • the specimen sample solution that can be supplied at one time is 10 ⁇ L to 200 ⁇ L.
  • the immunochromatography device of the present invention is configured such that there is no gap between the addition port and the sample pad located therebelow so that the sample does not escape from the addition port.
  • the immunochromatography device of the present invention has a wide addition port, and a large amount of specimen sample solution is supplied at a time. Further, the edge portion which is the outline of the addition port has a certain height (1 to 5 mm), and the supplied sample material solution is temporarily stored in the addition port.
  • the immunochromatography device of the present invention supports the sample pad by a backing sheet having an outer size equal to or larger than the outer size of the addition port so that the sample does not escape from the addition port. Since a force that presses the sample pad against the addition port works by the backing sheet and there is no gap between the addition port and the sample pad, it is possible to prevent escape of the sample solution.
  • the portion where the thickness of the sample pad is thin easily forms a gap with the addition port, and the sample solution is likely to escape.
  • the thin portion of the sample bat has a high pedestal of the container of the device, and the thick portion has a low pedestal so that there is a gap between the addition port and the pad even when there is a difference in the thickness of the pad. Since it can be configured so that there is no escape, it is possible to prevent escape of the sample solution.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a sample pad to which a sample mixed with nitrite or an acidic solution is added, a labeled region containing a labeled antibody labeled with an antibody against a sugar chain antigen, and a detection region on which the antibody against the sugar chain antigen is immobilized
  • An immunochromatographic test piece for measuring a sugar chain antigen by forming an antibody-sugar chain antigen-labeled antibody complex in a detection region, and having a region impregnated with a neutralizing reagent upstream of the labeled body region, Further, when using a specimen mixed with nitrite upstream of the area impregnated with the neutralizing reagent, it has an area impregnated with a solid acidic reagent, and impregnating nitrite when using a specimen mixed with an acidic solution.
  • An immunochromatographic test strip for extracting and measuring sugar chain antigens in a specimen and a container for storing the specimen, and having an specimen addition port on the sample pad of the test specimen
  • a Mato device (i) Holding the added sample sample solution and supplying the sample sample solution to the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite in a short time allows extraction of sugar chain antigens with nitrite and the solid acidic reagent. Has a wide sample addition port to promote, (ii) There is no gap between the addition port and the sample pad so that the sample does not escape from the addition port. Immunochromatographic device.
  • the solid acid reagent or nitrite on the immunochromatographic test piece, or the pad impregnated with the neutralizing reagent is made of a highly hydrophobic material, and the development time of the sample solution is slowed, so that nitrite and solid.
  • the highly hydrophobic material is selected from the group consisting of polyethylene, polyester, polystyrene, polypropylene, rayon and nylon.
  • Pads impregnated with solid acidic reagent or nitrite or neutralizing reagent on the immunochromatographic test piece are made of a material with high hydrophilicity. By slowing down the development time of the sample solution, nitrite and solid The immunochromatographic device according to [1] or [2], which promotes extraction of a sugar chain antigen with an acidic reagent. [6] The immunochromatographic device according to [5], wherein the highly hydrophilic material is a thick filter paper.
  • the immunochromatographic device By adding a surfactant to a pad impregnated with solid acidic reagent or nitrite or neutralizing reagent on an immunochromatographic test piece, and adjusting the development time of the sample solution, nitrite and solid acidic
  • the immunochromatographic device according to any one of [1] to [6], which facilitates extraction of a sugar chain antigen with a reagent.
  • the surfactant is selected from the group consisting of polyoxyethylene octyl phenyl ether, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene alkyl ether, sodium cholate, deoxycholic acid, sodium lauryl sulfate and sodium dodecylbenzene sulfonate.
  • the immunochromatographic device according to [7].
  • [9] By adding a polymer compound having an immobilizing action to a pad impregnated with a solid acidic reagent or nitrite or a neutralizing reagent on an immunochromatographic test piece, and adjusting the development time of the specimen sample solution, The immunochromatographic device according to any one of [1] to [8], which promotes extraction of a sugar chain antigen with nitrate and a solid acidic reagent.
  • the immunochromatographic device wherein the polymer compound having an immobilizing action is PVA or PLL.
  • the immunochromatographic device according to any one of [1] to [10], wherein the region impregnated with the solid acidic reagent or nitrite is present on the sample pad or the pad coated with the labeling region.
  • the solid acidic reagent is selected from the group consisting of malonic acid, malic acid, maleic acid, citric acid and tartaric acid.
  • the neutralizing reagent is trishydroxylmethylaminomethane or sodium hydroxide.
  • the immunochromatographic device according to any one of [1] to [13], wherein the sugar chain antigen is a protozoan, fungal, bacterial, mycoplasma, rickettsia, chlamydia or viral sugar chain antigen.
  • sugar chain antigen is extracted from the specimen by the action of nitrous acid generated by the reaction of nitrite and solid acidic reagent, and impregnated with neutralizing reagent In the region, the acidic solution containing the sugar chain antigen is neutralized,
  • Example of immunochromatographic test piece for group A streptococcus measurement Nitrite (liquid reagent) 2.0M sodium nitrite, 1% Tween20 Solid acid reagent (impregnated in immunochromatographic test strip) 1.0M organic acid (tartaric acid), 0.2% TritonX100 Neutralizing reagent (impregnated immunochromatographic test piece) 3.0M Tris HCl (pH 9.0), 1.5% TritonX100
  • Anti-Streptococcus pyogenes antibody was diluted with purified water to 1.0 mg / mL, and colored polystyrene particles were added to this to 0.1%. After stirring, carbodiimide was added. Add to 1% and stir further. The supernatant was removed by centrifugation and resuspended in 50 mM Tris (pH 9.0) and 3% BSA to obtain a 0.04% anti-Streptococcus pyogenes antibody-bound colored polystyrene particle suspension. This particle is referred to as “antibody-immobilized particle” in this example.
  • a 10 mm wide glass fiber (C.Pad) coated with antibody-bound latex was pasted on the upstream side of the membrane with a 2 mm overlap with the membrane.
  • the neutralizing reagent impregnated pad was affixed so that the overlap of the pad impregnated with C.Pad and the neutralizing reagent was 4 mm.
  • a top laminate sheet (60 mm), which is a PET sheet, was attached to the top of the immunochromatographic test piece.
  • the pad impregnated with the solid acidic reagent is impregnated with the pad laminated with the neutral acidic reagent and the pad laminated with the solid acidic reagent between the pad and the neutralizing reagent.
  • the pad was attached to the upstream (lower end) of the immunochromatographic test piece so that the pad made contacted.
  • FIG. 3 shows a schematic diagram together with the distance (mm) between the parts.
  • the pad impregnated with the solid acidic reagent and the pad impregnated with the neutralizing reagent are separated from each other without contact even in a portion where the top laminate is not present. As shown, both pads are actually touching where there is no top laminate.
  • An immunochromatographic test piece in which a PET sheet was not sandwiched between a region impregnated with a solid acidic reagent and a region impregnated with a neutralizing reagent was used as a conventional immunochromatographic test piece.
  • Table 1 shows the color intensity when judged for 5 minutes.
  • “Over” in Table 1 is a test piece in which a top laminate is pasted by a conventional method, and shows a test result using a test piece having a top laminate on top of a pad impregnated with a solid acidic reagent.
  • the top laminate is not covered with the entire surface of the pad impregnated with the solid acidic reagent, but is covered with a portion of about 3 mm downstream of the pad.
  • “In between” in Table 1 is a test piece of the present invention, and a top laminate is pasted between a pad impregnated with a solid acidic reagent and a pad impregnated with a neutralizing reagent.
  • the contact surface directly touched by the pad impregnated with the solid acidic reagent and the pad impregnated with the neutralizing reagent is 2 mm.
  • the infection of group A ⁇ -hemolytic streptococci can be detected with high sensitivity using the immunochromatography device of the present invention.

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Abstract

本発明は、イムノクロマト試験片上での検体の展開のスピードや方向を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を適切に制御する方法又はイムノクロマト試験片を提供することを目的とする。　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域の間に、両領域間の試薬の移動又は検体溶液の移動を抑制するように、樹脂製シートを挟み込ませた、イムノクロマト試験片。

Description

検体の展開を制御し得る、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片
　本発明は、イムノクロマト試験片上で糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をすることが可能な、糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片に関する。
　イムノクロマト法を原理とする迅速診断薬の多くは、ウイルス又は細菌感染症を迅速・簡便に測定し、治療方針を決定する一つの手段として広く使用されている。
　一般的なイムノクロマト法を原理とする迅速診断薬は、検体を検体浮遊液に浮遊させた後、その浮遊液をイムノクロマト試験片に供給することで迅速・簡便に測定できる。
　Ａ群β溶血性レンサ球菌（Ａ群β溶連菌）、口腔内レンサ球菌等ストレプトコッカス属に属する微生物を検出するためには糖鎖抗原を抽出し、糖鎖抗原を測定する必要がある。
　例えば、イムノクロマト試験片に予め亜硝酸ナトリウムと中和試薬を含ませることにより、検体を酢酸等の酸性溶液に浮遊してイムノクロマト試験片に供給する操作のみで亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行う方法が報告されている（特許文献１）。
　また、イムノクロマト試験片に予め酸性試薬と中和試薬を含ませておき、検体を亜硝酸塩に浮遊してイムノクロマト試験片に供給する方法もある。
　イムノクロマト法においては、イムノクロマト試験片におけるクロマト展開スピードを制御する必要があることがあり、デバイス形状で制御するもの、貼り合わせ位置で制御するもの、使う素材（不織布などのマテリアル）で制御するもの、試薬で制御するもの等のイムノクロマト法が報告されている（特許文献２及び３）。また、ラミネートに使用するPETシートで流速を速めるようにコントロールする方法が報告されている（特許文献４）。
国際公開WO2005/121794号公報 特開2005-331471号公報 特開2005-331463号公報 特開2016-102790号公報
　イムノクロマト試験片を用いてＡ群β溶血性レンサ球菌（Ａ群β溶連菌）等を検出する方法として、イムノクロマト試験片に予め亜硝酸塩と中和試薬を含ませることにより、検体を酢酸等の酸性溶液に浮遊してイムノクロマト試験片に供給する操作のみで亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行う方法やイムノクロマト試験片に予め酸性試薬と中和試薬を含ませておき、検体を亜硝酸塩に浮遊してイムノクロマト試験片に供給する操作のみで亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行う方法があった。これらの方法で用いるイムノクロマト試験片において乾燥状態の酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬（塩基性試薬）を含浸させたパッドを接触させて貼り合わせた状態で長期保存すると、両試薬どうしが少しずつ反応してしまい、それぞれの活性が低下してしまうという問題があった。
　また、Ａ群β溶連菌の検出では亜硝酸塩溶液と酸性溶液を混合することで発生させる亜硝酸によりＡ群β溶連菌の抗原の抽出が行われるが、乾燥状態の酸性試薬を含浸させたパッドを用いた場合、酸性試薬を含浸させたパッドから短時間で、次の中和試薬を含浸させたパッドへ検体が移動してしまい、亜硝酸塩と酸性試薬の混合時間が短く、十分な抽出が行われずに、必要な感度性能が得られないという問題があった。
　また、乾燥状態の酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドを貼り合わせた形態を有するイムノクロマト試験片では、検体試料添加後に酸性試薬を含浸させたパッドから中和試薬を含浸させたパッドに検体の一部が移動することにより、一旦酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドの両方が濡れた状態になると、中和試薬が酸性試薬を含浸させたパッドの方向に逆流し、酸性試薬の活性を低下させることで亜硝酸処理による抗原の抽出が効率よく実施されず、感度低下につながるリスクもあった。
　これらの問題を防ごうとして、酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドの重なり部分を小さくし過ぎると（1mm以下）、製造面での制御が困難で、２つのパッドを重ねるときの少しのズレで重なる部分が無くなってしまうおそれがあり、この場合、試料が流れなくなったり、流れが遅すぎたりしてしまうという問題があった。
　また、酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドを長くすることにより、物理的に酸性試薬と中和試薬の間の距離を大きくし、長期保存安定性を担保することも考えられる。しかしながら、長くした分だけ、イムノクロマト試験片に展開するのに必要な検体試料量が増える。テストに必要な試料量が増えると、チューブに小分した検体に混合するための亜硝酸塩溶液がより多く必要になる。この場合、検体採取用スワブに採取された検体が希釈されてしまい、結果的に性能（感度）が低下してしまう。
　また、1枚の長いパッドに、酸性試薬と中和試薬を広がって混合しないように塗布・乾燥させ、それぞれの試薬の乾燥させた部分が接しないようにすることも考えられる。しかしながら、長期保存中に空気中の湿度により乾燥させた試薬が溶解し広がり、酸性試薬と中和試薬が接することで中和反応が起こり、結果的に亜硝酸処理の効率を損なうという問題がある。
　上記の問題は、イムノクロマト試験片上に酸性試薬の代りに、亜硝酸塩を含浸させた場合にも起こり得る問題である。
　本発明は、上記の種々の問題を解消するために、イムノクロマト試験片上での検体の展開のスピードや方向を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を適切に制御する方法又はイムノクロマト試験片を提供することを目的とする。
　本発明者らは、イムノクロマト試験片上での検体の展開を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を適切に制御する方法について鋭意検討を行った。
　その結果、酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドの間にPET（ポリエチレンテレフタレート）シート等の樹脂製シートを挟み込んで、酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドが接触する幅を極力減らすこと（2mm以下）により、両試薬のパッドの長期保存安定性を向上させることを見出した。
　さらに、PETシートを酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドの接触面の幅が最小限になるよう両パッドの重なりの間に挟み込むように設け、亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドが部分的に接触するようにし、試料が直ぐに中和試薬を含浸させたパッドへ移動せず、さらに検体が中和試薬を含浸させたパッドから酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させたパッドへ逆流しにくい構造にすることにより、検体の抗原の抽出時間を充分に得ることができ、その結果検出感度を向上させることができることを見出した。
　これらの知見に基づき、酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドの間に、両パッドが接触しないか、あるいはわずかに接触するように樹脂製シートを挟み込ませたイムノクロマト試験片を作製し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、
　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域の間に、両領域間の試薬の移動又は検体溶液の移動を抑制するように、樹脂製シートを挟み込ませた、イムノクロマト試験片。
[２]　サンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在する、[１]のイムノクロマト試験片。
[３]　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域が部分的に接触するように、樹脂製シートを挟み込ませた、[１]又は[２]のイムノクロマト試験片。
[４]　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域が接触しないように、樹脂製シートを挟み込ませた、[１]又は[２]のイムノクロマト試験片。
[５]　イムノクロマト試験片上の最上流にサンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在し、サンプルパッド以外の領域が樹脂製シートで覆われ、中和試薬を含浸させた領域の上部の樹脂製シートの上部に、固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたサンプルパッドが存在する、[２]～[４]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[６]　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、[１]～[５]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[７]　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[１]～[６]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[８]　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[１]～[７]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[９]　[１]～[８]のいずれかのイムノクロマト試験片を用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
　イムノクロマト試験片が固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマト試験片が亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加することを含み、
　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、イムノクロマト試験片上での検体の展開のスピードや方向を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を制御して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-049213号の開示内容を包含する。
　酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドの間に、両パッドが接触しないか、あるいはわずかに接触するように樹脂製シートを挟み込ませることにより、乾燥状態の酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドを貼り合わせた状態での保存安定性を向上させることができる。さらに、検体が酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドから中和試薬を含浸させたパッドに移動する時間を長くし、あるいは、検体が中和試薬を含浸させたパッドから酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドに逆流しないようにすることができ、その結果、亜硝酸による抗原の抽出を効率的に行うことで感度の向上効果が得られる。
固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片（２枚パッド試験片）の構造を模式的に示す図である。 PETシートが固形状酸性試薬領域と中和試薬領域の間に貼付された、固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片の構造を模式的に示す図である。 PETシートが固形状酸性試薬領域と中和試薬領域の間に貼付された、固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片の構造を模式的に示す図であり、各パーツ間の距離を示した図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、糖鎖抗原の亜硝酸抽出処理をイムノクロマト試験片上で行えるように簡便化し、被検出物質である糖鎖抗原を迅速かつ正確に測定することを可能にするイムノクロマト試験片に係る。
　イムノクロマト試験片は、被検出物質（抗原等）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を添加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシート等を具備する。
　本発明のイムノクロマト試験片は、格納容器内に収められていてもよく、該格納容器により、例えば紫外線や空気中の湿気による劣化を防ぐことができる。また、汚染性、感染性の有る検体試料を用いる場合、格納容器によりアッセイを行う試験者が汚染又は感染するのを防止することができる。例えば適当な大きさの樹脂製ケースを格納容器として用い、該ケース中に本発明の装置を収納すればよい。また、抗原又は抗体を固定化した試験片の表面を樹脂製フィルム等（PETシート）で覆ってもよい。格納容器とその中に納められた試験片を、一体としてイムノクロマトデバイスという場合がある。
　なお、検出領域の数及び標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１つに限られるものではなく、複数の被検出物質に対応する抗体を用いることで、２つ以上の抗原を同一の試験片にて測定することができる。
　支持体は、被検出物質（抗原）を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）であり、液体及びそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜又はメンブレンとしたものがより好ましい。抗体を固定化したメンブレンを抗体固定化メンブレンと呼ぶ。
　標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維（グラスファイバー）や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm～0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。標識抗体を含浸させ乾燥させた多孔性基材を乾燥パッドとも呼ぶ。
　標識抗体の標識には、アルカリフォスファターゼや西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素、金コロイドのような金属コロイド、シリカ粒子、セルロース粒子、着色ポリスチレン粒子及び着色ラテックス粒子等が用いられることが多い。金属コロイド粒子、着色ポリスチレン粒子や着色ラテックス粒子等の着色粒子を用いる場合には、これらの標識試薬が凝集することによって着色が生じるので、この着色を測定する。抗体を固定化した粒子を抗体固定化粒子と呼ぶ。
　検出領域は、被検出物質（抗原）を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、抗原を捕捉するための抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設ける。検出領域は支持体に含まれていればよく、支持体上に抗体を固定化すればよい。
　サンプルパッドは、検体を添加するための部位であり、多孔性材料である。サンプルパッドはイムノクロマト試験片の最も上流にある部位である。該材料には一般的に用いられる濾紙、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm～1mm程度のパッド状であることが好ましい。検体には、検体を他の溶液に浮遊して得られる試料等、検体を用いて調製された試料も含む。
　吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高い濾紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。
　バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯等が、部分的な重なりをもって貼付・固定されるための部材である。バッキングシートは、これらの材料が最適な間隔で配置・固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いた方が好ましい。
　本発明のイムノクロマト試験片には、さらに対照表示領域(部材）が存在していてもよい。対照表示領域は試験が正確に実施されたことを示す部位である。例えば、対照表示領域は、検出領域の下流に存在し、検体試料が検出領域を通過し、対照表示領域に到達したときに着色等によりシグナルを発する。対照表示領域には、標識担体を結合させた抗体に結合する物質を固相化しておいてもよいし、検体が到達したときに色が変化するpHインジケーター等の試薬を固相化しておいてもよい。標識担体を結合させた抗体がマウスモノクローナル抗体の場合、抗マウスIgG抗体を用いればよい。
　イムノクロマト試験片の大きさは限定されないが、例えば、縦の長さ数cm～十数cm、横の長さ数mm～数cm程度である。
　上記の形態の試験片において、検体は、サンプルパッド、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯等の一連の接続により形成された多孔性流路を通過する。よって本形態においては、これら全てが検体移動領域となる。各構成材料の材質や形態によって、検体が材料内部を浸透せず界面を通行する形態もありうるが、本明細書で定義する検体移動領域は材料の内部か界面かを問わないため、該形態の試験片も本明細書の範囲に含まれる。
　本発明のイムノクロマト試験片を用いて検体中の糖鎖抗原を測定する場合、最初に検体中の糖鎖抗原を抽出する必要がある。糖鎖抗原の抽出は、糖鎖抗原を含む検体を亜硝酸で処理することにより行う。亜硝酸は亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩を酸と混合することにより発生させることができ、このようにして発生させた亜硝酸で糖鎖抗原を含む検体を処理すればよい。抽出した抗原はイムノクロマト試験片上に固相化した抗体に抗原抗体反応により結合されるが、この際、反応系に酸が残っていると反応系は酸性になり、抗原抗体反応が阻害される。そこで、反応系の酸を中和する必要がある。
　本発明において、亜硝酸塩と酸を混合し亜硝酸を発生させて、該亜硝酸により検体中の糖鎖抗原を抽出して、酸を中和した上で、イムノクロマト試験片上に固相化した抗体に糖鎖抗原を結合させ、糖鎖抗原を測定する方法において、糖鎖抗原を抽出して測定する方法として以下の方法が挙げられる。いずれの方法においても、亜硝酸による糖鎖抗原の抽出と中和はイムノクロマト試験片上で行う。亜硝酸による糖鎖抗原の抽出をイムノクロマト試験片上で行うためには、イムノクロマト試験片上に酸性試薬又は亜硝酸塩を含ませておけばよい。中和をイムノクロマト試験片上で行うためには、イムノクロマト試験片上に中和試薬を含浸させておけばよい。
（Ａ）　予め検体と酸性溶液を混合し、亜硝酸塩と中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加する。混合液が亜硝酸塩を含浸させた領域に達すると亜硝酸塩と酸が反応し、亜硝酸が発生し、検体中の糖鎖抗原が抽出される。糖鎖抗原の抽出液はイムノクロマト試験片上の中和試薬を含浸させた領域で中和され、糖鎖抗原はイムノクロマト試験片上に固相化した抗体に結合し、検出できる。該方法において、用いる酸性溶液としては、酢酸、塩酸、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
（Ｂ）　予め検体と亜硝酸塩溶液を混合し、酸性試薬と中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加する。混合液が酸性試薬を含浸させた領域に達すると亜硝酸塩と酸が反応し、亜硝酸が発生し、検体中の糖鎖抗原が抽出される。糖鎖抗原の抽出液はイムノクロマト試験片上の中和試薬を含浸させた領域で中和され、糖鎖抗原はイムノクロマト試験片上に固相化した抗体に結合し、検出できる。
　上記の（Ａ）又は（Ｂ）の方法を行うための本発明のイムノクロマト試験片では、標識体領域よりも上流（検体の流れの上流でありサンプルパッドが存在する側）に、すなわち、サンプルパッド内に固形状酸性試薬又は亜硝酸塩が含浸されているか、あるいは、サンプルパッド内に亜硝酸塩が含浸されているイムノクロマト試験片は上記（Ａ）の方法に用いることができる。また、サンプルパッド内に酸性試薬が含浸されているイムノクロマト試験片は上記（Ｂ）の方法に用いることができる。なお、酸性試薬としては、固形状酸性試薬が用いられる。これらの方法により、被検試料中の被検出物質を被検試料の試験に供される量によらず、正確に、特異的に測定することが可能になる。
　前記固形状酸性試薬又は亜硝酸塩は、サンプルパッドに含浸させてもよいし、サンプルパッドとは別の不織布等の多孔性材料からなるパッドに含浸させて、得られた固形状酸性試薬含浸多孔性材料又は亜硝酸塩含浸多孔性材料を、サンプルパッドと標識体領域との間、すなわち標識体領域の上流側に配置してもよい。ここで、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域とサンプルパッド又は標識体領域は接触していても、いなくてもよい。　　　
　本発明において、試薬を含浸させた領域を試薬を含浸させたパッドともいう。
　前記中和試薬は、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させる領域よりも下流に配置する。中和試薬は、支持体に含浸させてもよいし、支持体とは別の不織布等の多孔性材料からなるパッドに含浸させて、得られた中和試薬含浸多孔性材料を、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域と標識体領域との間に配置してもよい。すなわち、標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域を有する。
　ここで、中和試薬を含浸させた領域と固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域又は標識体領域は接触していても、いなくてもよい。
　中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材としては、目付が10～400g/m2であり、かつ、厚みが0.1～2.0mmの織物であり、1cm/m2あたりの吸水量が10～100μl/cm2で、かつ吸水スピードが1.0～5.0μl/secであり、さらに1cm/m2の断片を濡れた状態でメンブレンに接触させ5分間静置後の保水量が10～100μl/cm2であり、好ましくは1cm/m2の断片を濡れた状態でメンブレンに接触させ5分間静置後の液の広がり面積が20mm2以下、つまり吸水力が高く、保水性（液体の保持力）が高く、さらに液体の放出性が低い又は持続するという特性の３つを有する多孔性材料が挙げられる。具体的には、セルロースの綿繊維でできた濾紙やガラス繊維でできたガラス濾紙等が挙げられる。このような濾紙として、例えば、東洋濾紙株式会社のNo.26-3が挙げられる。また、用いる濾紙の容積は大きく、上流から検体よりも遅れて到達する酸性溶液を十分に保持することができる。このような多孔性材料を用いることにより、亜硝酸塩と酸性試薬との反応で発生した亜硝酸で糖鎖抗原を抽出した検体を十分に中和することができる量の中和試薬を含浸させることができる。また、該パッドは大量の液体を吸収保持することができ、放出性が持続するため、イムノクロマト試験片の上流に残る亜硝酸を含む液が判定時間以降に展開した際にも十分な中和能力を有することができ、酸性溶液が抗体を固相化した検出領域に達するのを抑えることができる結果、非特異反応を抑制し、非特異反応を生じることがなく糖鎖抗原を検出することができる。一方、吸水力が高く、保水性が高く、放出性が低いガラス濾紙の場合、具体的には、東洋濾紙株式会社のGS-25が挙げられるが、吸水力が高いため、より多くの中和試薬を含浸でき、保水性が高く、放水性が低いため、酸性溶液が固相化した検出領域に達することを防ぐ。この結果、陰性の場合には非特異反応を抑制し、陽性の場合には判定時間以降のライン発色を防止することができる。
　中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の「目付」は10～400g/m2である。ここで、「目付」とは、布等の単位面積(1m2)当たりの重量をいう。目付は該パッドに含浸せる中和試薬の量や組成により適宜変えることができる。目付が30g/m2以下だと空隙率が高く、中和試薬を含浸した際にちぎれやすくなり、イムノクロマト製造時の取扱いが難しくなることから、好ましくは目付50g/m2以上であり、目付が300g/m2以上の場合には、空隙率が低く、中和試薬の組成にもよるが、検体がスムーズに素材に浸透せず、中和試薬と混合できないため、300g/m2以下であることが好ましい。最も好ましい目付は250～270g/m2である。
　また、中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の「厚み」は0.1～2.0mmが良いが、厚みは、該パッドに含浸せる中和試薬の量や組成により適宜変えることができる。厚みが0.4mm以下の場合、中和試薬を含浸した際にちぎれやすくなり、イムノクロマト製造時の取扱いが難しくなることから、好ましい厚みとしては、0.4～0.8mm、中和試薬を含浸させられる量が調節しやすく、かつ、イムノクロマト製造時のハンドリングのしやすさを考慮すると、0.6mm程度がより好ましい。
　「吸水性」は1cm/m2あたりの吸水量が10～100μl/cm2で、かつ吸水スピードが1.0～5.0μl/secのものが好ましい。吸水量と吸水スピードは、96穴のＥＩＡプレートの1セルに200μlの色づけした溶液（1％Tween20+赤色102号）を用意し、そこに5×60mmの大きさの素材をバッキングシートに貼付した試験片を入れ、溶液に浸漬させた方を試験片の下端とし、試験片の上端に溶液が達するまでの時間を測定し、さらに溶液が上端に達した後、直ちに試験片を取り出し、セルに残存する液量を測定する。吸水量は、200μlからセルに残った液量を差し引き、素材の1cm2面積あたりで割った液量であり、吸水スピードは、吸水量/上端到達までにかかった時間で求められる。中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材としては、吸水量が多く、吸水スピードが遅めの素材が好ましい。固形状酸性試薬の濃度と含水量にもよるが、吸水量が30μl/cm2以下の場合、イムノクロマト試験片として必要な中和試薬が含浸しきれない場合も考えられるため、具体的には、吸水量が30μl/cm2以上であることが好ましい。中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の吸水スピードは、検体中の糖鎖抗原が抽出される時間および抽出後の試験液が中和される時間に影響する。糖鎖抗原を抽出する時間は、固形状酸性試薬の素材もしくは組成で調節することがある程度までは可能であるが、完全でないため、中和試薬を含浸させる領域に使用する素材の吸水スピードは、十分な糖鎖抗原の抽出および中和に重要な要素となる。具体的には、吸水スピードは1.0～5.0μl/secが好ましく、より好ましい吸水スピードは、2.0μl/sec以下である。
　「保水性」は、中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の1cm/m2の断片をメンブレン上に置き、そこに70μlの溶液（1％Tween20+赤色102号）を添加し、5分間静置前後の重量を測定することで得られる。保水性の液量は、添加する溶液の組成（界面活性剤やタンパク量）によって変化するが、1%Tween20溶液で試験した場合の保水量が10～100μl/cm2であることが好ましく、より好ましい保水量は15μl/cm2以上である。
　「放出性」は、中和試薬を含浸させる領域に用いる多孔性材料の素材の1cm/m2の断片をメンブレン上に置き、そこに70μlの溶液（1％Tween20+赤色102号）を添加し、5分間静置後にメンブレン上に広がった液の面積を求めることで測定する。面積は、添加する溶液の組成（界面活性剤やタンパク量）によって変化するが、1%Tween20溶液で試験した場合の面積が、30mm2以下、より好ましい放出性は20mm2以下である。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[１]　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、
　中和試薬を含浸させた領域の素材が吸収性が高く、保水性が高く、かつ放出性の低い若しくは放出性が継続するという3つの特性を持つ濾紙又はガラス濾紙であり、
　中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の低さ又は放出性の持続により残った酸性溶液が検出領域に達するのを抑えるか、或いは十分に中和された試験液が継続的に検出領域に展開し続けることにより非特異反応を抑制する、イムノクロマト試験片。
［２］　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、
中和試薬を含浸させた領域の素材が目付が10～400g/m2であり、かつ、厚みが0.1～2.0mmの織物であるイムノクロマト試験片。
［３］　前記織物の1cm/m2あたりの吸水量が10～100μl/cm2で、かつ吸水スピードが1.0～5.0μl/secであり、さらに1cm/m2の断片を濡れた状態で検出領域に接触させ5分間静置後の保水量が10～100μl/cm2であり、1cm/m2の断片を濡れた状態でメンブレンに接触させ5分間静置後の液の広がり面積が20mm2以下である、[１]又は[２]に記載のイムノクロマト試験片。
[４]　中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の持続力により残った酸性溶液が検出領域に達する際にも十分な中和能力を蓄えることにより非特異反応を抑制する、[１]～[３]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[５]　中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の低さにより、残った酸性溶液が検出領域に達することを抑制し、陰性の場合には非特異反応を抑制し、陽性の場合には判定時間以降のライン発色を防止する、[１]～[４]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[６]　固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域が、サンプルパッド上若しくは標識体領域が塗布されたパッド上に存在する、[１]～[５]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[７]　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、[１]～[６]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[８]　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[１]～[７]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[９]　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[１]～[８]のいずれかのイムノクロマト試験片。
[１０]　[１]～[９]のいずれかのイムノクロマト試験片を用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
　イムノクロマト試験片が固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマト試験片が亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加することを含み、
　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、中和試薬を含浸させた領域の吸水性の高さ及び保水性の高さにより前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が十分中和され、中和試薬を含浸させた領域の放出性の低さ或いは放出性の持続により残った酸性溶液が検出領域に達するのを抑える或いは十分に中和された試験液を継続的に検出領域に添加し続けることにより非特異反応を抑制して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
　固形状酸性試薬を含浸させた領域を固形状酸性試薬領域と呼び、亜硝酸塩を含浸させた領域を亜硝酸塩領域と呼び、中和試薬を含浸させた領域を中和試薬領域又は塩基性試薬領域と呼ぶ。
　固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域を有するイムノクロマト試験片は、支持体上に上流からサンプルパッド、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域、中和試薬領域、標識体領域、検出領域及び吸収帯を有し、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域はサンプルパッド上にあってもよい。また、サンプルパッド、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域、中和試薬領域、標識体領域、検出領域及び吸収帯は、隣合う領域どうしで接触していても、いなくてもよい。
　本発明で用いられる固形状酸性試薬は常温において固形状のものであり、高温において揮発しないものである。
　本発明に用いられる好ましい固形状酸性試薬としては、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸、酒石酸を挙げることができる。
　また、本発明で用いられる好ましい固形状酸性試薬としては、例えばクエン酸のような価数の多い酸を用いればより少ない量で抽出できる。また同じ価数ならより酸解離定数が小さい、例えばマレイン酸、酒石酸は効率が良い。
　また、本発明で用いられる好ましい固形状酸性試薬としては、イムノクロマト試験片上で着色されないような試薬、具体的には乾燥状態で白色又は乾燥熱や酸化で着色されにくい試薬が好ましい。
　本発明で用いられる亜硝酸塩としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等が挙げられる。
　本発明に用いられる固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の使用量、すなわちイムノクロマト試験片に含浸させる量は、特に限定されないが、通常、イムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μg～1mg程度であり、好ましくは0.1μg～0.1mg程度である。もっとも、使用する固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の種類、検体浮遊液の組成や添加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
　固形状酸性試薬又は亜硝酸塩をサンプルパッド又は多孔性材料に含浸させるには、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を一度溶解させて塗布し乾燥させる。
　本発明に用いられる中和試薬は常温において固形状のものであり、高温において揮発しないものである。
　本発明に用いられる好ましい中和試薬としては、トリス塩基（トリスヒドロキシルメチルアミノメタン）、水酸化ナトリウム、リン酸水素二カリウム、クエン酸三ナトリウム、アルカリ領域に緩衝能を持つグッドバッファーを挙げることができる。
　本発明に用いられる中和試薬の使用量、すなわちイムノクロマト試験片に含浸させる量は、特に限定されないが、通常、イムノクロマト試験片の一試験片あたり0.01μg～1mg程度であり、好ましくは0.1μg～0.1mg程度である。もっとも、使用する中和試薬の種類、検体浮遊液の組成や添加量などにより効果が得られる最適な量を選択することが好ましい。
　中和試薬を多孔性材料に含浸させるには、中和試薬を一度溶解させて、溶液を多孔性材料に塗布し、その後乾燥させればよい。
　図１は、典型的なイムノクロマト試験片の好ましい１形態を示した図である。図１に示すイムノクロマト試験片は、固形状酸性試薬及び中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片であるが、固形状酸性試薬の代りに亜硝酸塩を含浸させてもよく、この場合は、亜硝酸塩及び中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片となる。当業者ならば、亜硝酸塩及び中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片を適宜設計し製造することができる。なお、イムノクロマト試験片は、図１に示すものに限定されるものではない。図１中、１が支持体、２が標識体領域、３が検出領域、７が吸収帯、８がバッキングシートを指している。
　図１Ａが上面図、図１Ｂが切断断面図である。図１の例では、標識体領域２の上流に固形状酸性試薬領域５及び／又は中和試薬領域６が存在し、これらが重ね合わされており、これにより連続したラテラルフローの流路が形成されている。図１に示す試験片においては、固形状酸性試薬領域５がサンプルパッドを兼ねている。すなわち、固形状酸性試薬領域がサンプルパッド上に存在する。この試験片においては、固形状酸性試薬領域及び中和試薬領域が別々の２枚の多孔性材料（パッド）状に設けられているので、２枚パッド試験片と呼ぶことがある。固形状酸性試薬領域の上流にさらにサンプルパッドが存在してもよい。
　本発明においては、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域が重なりあって接触している場合に、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の間に液体を通過させないシートを挟み込むように設ける。シートを設けることにより、以下の３つの効果を奏することができる。
（Ａ）　試験片の保存時に隣接する２つの領域における試薬の移動を抑制することができる。この結果、固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩と中和試薬の接触による反応を防止することができる。この結果、試薬の安定性を向上させることができる。
（Ｂ）　また、亜硝酸塩又は酸性試薬と混合した検体を添加したときに、検体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に到達し、その後すぐに中和試薬領域に移動してしまうことによる不十分な糖鎖抗原の抽出を防止することできる。すなわち、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域から中和試薬領域へ検体を含む液体が移動する速度を低下させ、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に検体を含む液体が留まる時間を長くし、その結果、糖鎖抗原を十分に抽出し、測定感度を高める。
（Ｃ）　さらに、亜硝酸塩又は酸性試薬と混合した検体を添加したときに、検体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に到達し、その後すぐに中和試薬領域に移動してしまい、移動した検体を含む液体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に逆流し、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の活性を低下させ、抽出効率が低下するのを防止することができる。すなわち、一旦中和試薬領域に到達した検体を含む液体が固形状酸性試薬領域又は亜硝酸塩領域に逆流するのを防止し、固形状酸性試薬又は亜硝酸塩の活性の低下を防止し、亜硝酸による糖鎖抗原の抽出処理を効率よく進ませ、測定感度を高める。
　固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の間に設けるシートの素材は液体を通過させない素材である限り限定されず、例えば、PET（ポリエチレンテレフタレート）シート、ポリエチレンシート等の樹脂製シートを用いることができる。樹脂製シートは樹脂製フィルムともいう。
　シートは、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域が部分的に接触して重なるように設けてもよい。この場合、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の重なる部分の長さは、極力短くすることが好ましく、例えば、５mm以下、好ましくは３mm以下、さらに好ましくは２mm以下である。
　また、シートを固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域が接触しないように設け、酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたパッドがPETシート上に覆い被さる形状にしてもよい。この場合、中和領域がシートにより完全に覆われ、そのシート上に固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域を設ければよい。この場合、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域内の液体は、直接中和領域に移動することはなく、シート上を流れた後に中和試薬領域に達する。
　シートは、例えば、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域と中和試薬領域の間にのみ設ければよい。一方、イムノクロマト試験片の上側を覆うように樹脂製シートをトップラミネートシートとして貼付するときに、トップラミネートシートを固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域以外、固形状酸性試薬領域又は亜硝酸領域がサンプルパッドを兼ねる場合はサンプルパッド以外の中和試薬領域、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯を覆うように貼付し、固形状酸性試薬領域若しくは亜硝酸塩領域を中和試薬部分の上部に貼付したトップラミネートシートの上部に貼付すればよい。図２及び図３にこのようなイムノクロマト試験片の構造を示す。
　図２及び図３の形態に基づき、本発明の試験片の使用方法について述べる。以下の使用方法は、検体を亜硝酸溶液と混合し、固形状酸性試薬と中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片を用いて測定する方法であるが、検体を酸性溶液と混合し、亜硝酸塩と中和試薬を含浸させたイムノクロマト試験片を用いて測定する方法も以下の使用方法の説明を参考にして行うことができる。
　測定は、検体又は検体を用いて調製された試料を亜硝酸塩溶液と接触混合させ、検体を亜硝酸塩溶液に浮遊させ、サンプルパッドを兼ねる固形状酸性試薬領域５に添加して供することにより開始される。この際、検体5～100μLと0.1M～8Mの亜硝酸塩0.01～2mLを混合し、5～200μLをサンプルバッドを兼ねる固形状酸性試薬領域５に供すればよい。亜硝酸塩として、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等が挙げられる。
　サンプルパッドを兼ねる固形状酸性試薬領域５に供された被検出物質である糖鎖抗原を含む検体は毛管作用によって、サンプルパッドを兼ねる固形状酸性試薬領域５及び中和試薬領域６へ展開される。この際、固形状酸性試薬領域５と中和試薬領域６の間には、PETシートであるトップラミネートシートが存在する。このため、固形状酸性試薬領域５から中和試薬領域６への検体の流れは抑制され、かつ、一旦中和試薬領域６に入った検体が固形状酸性試薬領域５に逆流するのを妨げることができる。次いで、検体は標識体領域２、支持体１、吸収帯７へと順次、水平方向に展開される。固形状酸性試薬領域５において、検体に混合した亜硝酸塩と固形状酸性試薬領域５上の固形状酸性試薬が反応し、遊離の亜硝酸が発生し、その亜硝酸の作用によって検体から糖鎖抗原が抽出される。抽出された糖鎖抗原は酸性の展開溶液と共に中和試薬領域６に展開移動し、中和試薬領域６で糖鎖抗原を含む酸性の展開溶液のpHが中和され中性域に調整される。その結果、糖鎖抗原は中性条件下においてさらに下流に展開移動する。標識体領域２では検体試料の展開と共に標識抗体が液中に放出され支持体１へと展開される。検体試料中に糖鎖抗原が存在する場合において、支持体１の検出領域３では捕捉抗体により糖鎖抗原が特異的に捕捉され、なおかつ糖鎖抗原は標識抗体とも特異的反応により複合体を形成する。これにより検出領域３では糖鎖抗原を介した抗体のサンドイッチが成立し、標識抗体－糖鎖抗原複合物を検出領域３にて測定することができる。
　本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法によれば、検体中の糖鎖抗原の抽出はイムノクロマト試験片上で行われるため、イムノクロマト試験片を用いた測定の前にあらかじめ検体中の糖鎖抗原を抽出する必要はなく、１ステップで検体中の糖鎖抗原を測定することができる。
　本発明の方法において、検体となる生体試料は、特に限定されないが、血清、血漿、血液、尿、便、唾液、組織液、髄液、拭い液等の体液等又はその希釈物が挙げられる。
　本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法において、測定対象となる被検出物質はイムノアッセイ、すなわち抗原抗体反応を利用したアッセイで測定し得る糖鎖抗原である。抗原としては亜硝酸抽出処理によって抽出される細菌の細胞壁に存在する糖鎖抗原である多糖体等が挙げられる。これらの物質を含む原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等も測定し得る。本発明のイムノクロマト試験片を用いた方法により、被験体の生体試料中に原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等に由来する糖鎖抗原が含まれているか否かを確認することができ、糖鎖抗原が含まれている場合、被験体は原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア、ウイルス等による感染症に罹患していると判断することができる。例えば、Ａ群β溶血性レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、大腸菌、レジオネラ、カンピロバクター等の感染の有無を検出することができる。
　本発明の方法は、イムノクロマト試験片に、酸性試薬と塩基性試薬を含浸させる場合に限らず、イムノクロマト試験片上に複数個、すなわち２個からn個の効果の異なる試薬であって、保存中の反応を避けるべき試薬を含浸させる際にも利用することができる。
　また、本発明のイムノクロマトデバイスは添加口が広く設けることもできる。
　例えば、縦の長さが5～9cm、好ましくは7cm、横の長さが0.3～0.7cm、好ましくは0.5cmのイムノクロマト試験片を格納した従来のイムノクロマトデバイス（クイックナビ（商標）-Strep A、デンカ生研）の添加口は約3.5mm×約5.5mm(19.25mm2)のサイズを有する略矩形の添加口として設けられているが、同じサイズのイムノクロマト試験片を格納する本発明のイムノクロマトデバイスの添加口は約3.5mm×約11mm(38.5mm2)のサイズを有する略矩形の添加口として設けられている。イムノクロマトデバイス及びその中に格納されるイムノクロマト試験片の大きさは概ね類似サイズになるので、長さが横3cm、縦9cmのイムノクロマトデバイスにおいて略矩形で3～5mm×8～15mm(24～75mm2)の添加口を有するイムノクロマトデバイスは添加口が広いイムノクロマトデバイスであり、本発明のイムノクロマトデバイスの効果を奏し得る。添加口の長い辺は、クロマトグラフィー試験片の長い辺と平行な辺であり、すなわち検体試料溶液の流れ方向に沿った辺である。添加口の長い辺の長さを添加口長といい、短い辺の長さを添加口幅ということがある。上記の例は、略矩形の添加口の場合であるが、添加口の形状は、三角形でも円形でもよい。本発明のイムノクロマトデバイスの添加口の大きさを面積で表した場合、24～75mm2、好ましくは35～75mm2である。
　従来のイムノクロマト法において、イムノクロマト試験片上に設けた検体処理試薬で検体処理を行う際は、試料溶液が検体処理試薬を含浸した領域に接している面積が少ないため検体処理能力が弱く、なおかつイムノクロマト試験片を徐々に展開しながら検体処理が行われていたことから、最初に展開した試料溶液と後から展開した試料溶液には検体処理試薬の濃度差が起きていた。従って、検体処理確実に行うことができなかった。
　本発明のイムノクロマトデバイスの添加口は広く設けられていることから、一度に大量の検体試料溶液を短時間でイムノクロマト上の検体処理試薬を含浸させた領域、すなわち固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸を含浸させた領域に供給することができる。この結果、イムノクロマト試験片上における糖鎖抗原の抽出を促進することができる。一度に供給することができる検体試料溶液は、10μL～200μLである。
　その結果、時間差による検体処理試薬の濃度差が起きないことから、イムノクロマト上の検体処理を促進し確実に効率よく行うことができる。
　本発明のイムノクロマトデバイスにおいては、添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口とその下に位置するサンプルパッドの間に隙間が無いよう構成されている。
　本発明のイムノクロマトデバイスは添加口が広く設けられており、一度に大量の検体試料溶液が供給される。また、添加口の外郭である縁部分には一定の高さ（1～5mm）があり、供給された検体資料溶液は添加口内に一旦貯まる。
　その結果、検体試料溶液の全液がイムノクロマト試験片に吸収されるまで時間が掛かることから、試料溶液がイムノクロマト試験片に吸収されずにイムノクロマト試験片外に逃げこぼれることがあった。
　本発明のイムノクロマトのデバイスは、サンプルパッドを支えるバッキングシートを添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口の外郭サイズと同等かそれより大きい外郭サイズのバッキングシートでサンプルパッドを支持することで、バッキングシートによりサンプルパッドを添加口に押さえつけるような力が働き、添加口とサンプルパッドの間に隙間が無いよう構成できることから、試料溶液の逃げ漏れを防ぐことができる。
　また、サンプルパッドの厚みに差がある場合は、サンプルパッドの厚みが薄い箇所は添加口との隙間ができやすく、試料溶液の逃げ漏れが発生しやすい。
　本発明においては、サンプルバットの薄い箇所はデバイスの容器の台座は高く、厚い箇所は台座を低く設計することで、パッドの厚みに差がある場合においても、添加口とパッドの間に隙間が無いよう構成できることから、試料溶液の逃げ漏れを防ぐことができる。
　この結果、この結果、イムノクロマト試験片上における糖鎖抗原の抽出を効率よくすることができる。
　すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
[１]　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片と該試験片を格納する容器よりなる、試験片のサンプルパッドに検体添加口を有するイムノクロマトデバイスであって、
(i)　添加した検体試料溶液を保持し検体試料溶液を前記固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域に短時間で供給することにより亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進するための広い検体添加口を有し、
(ii)　添加口から試料が逃げこぼれないよう、添加口とサンプルパッドの間に隙間がない、
イムノクロマトデバイス。
[２]　イムノクロマトデバイスの検体添加口が24～75mm2のサイズを有する、[１]のイムノクロマトデバイス。
[３]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドが疎水性の高い素材からなり、検体試料溶液の展開時間を遅くすることにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]又は[２]のイムノクロマトデバイス。
[４]　疎水性の高い素材が、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、レーヨン及びナイロンからなる群から選択される、[３]のイムノクロマトデバイス。
[５]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドが親水度の高い素材からなり、検体試料溶液の展開時間を遅くすることにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]又は[２]のイムノクロマトデバイス。
[６]　親水度の高い素材が厚みのある濾紙である、[５]のイムノクロマトデバイス。
[７]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドに界面活性剤を添加し、検体試料溶液の展開時間を調節することにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]～[６]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[８]　界面活性剤が、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸、ラウリル硫酸ナトリウム及びドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群から選択される、[７]のイムノクロマトデバイス。
[９]　イムノクロマト試験片上の固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩、あるいは中和試薬を含浸させたパッドに固定化作用のある高分子化合物を添加し、検体試料溶液の展開時間を調節することにより、亜硝酸塩と固形状酸性試薬による糖鎖抗原の抽出を促進する、[１]～[８]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１０]　固定化作用のある高分子化合物がPVA又はPLLである、[９]のイムノクロマトデバイス。
[１１]　固形状酸性試薬又は亜硝酸塩を含浸させた領域が、サンプルパッド上もしくは、標識体領域が塗布されたパッド上に存在する、[１]～[１０]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１２]　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、[１]～[１１]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１３]　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、[１]～[１２]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１４]　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、[１]～[１３]のいずれかのイムノクロマトデバイス。
[１５]　[１]～[１４]のいずれかのイムノクロマトデバイスを用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
　イムノクロマトデバイスが固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマトデバイスが亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマトデバイスのサンプルパッドに添加することを含み、
　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、糖鎖抗原の抽出を促進して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　以下の実施例において、％は、特に断らない場合はw/v％を示す。
A群溶連菌連鎖球菌測定イムノクロマト試験片の例
亜硝酸塩（液状試薬）　2.0M亜硝酸ナトリウム、1% Tween20
固形状酸性試薬(イムノクロマト試験片に含浸)　1.0M 有機酸（酒石酸）、0.2%　TritonX100
中和試薬（イムノクロマト試験片に含浸）　3.0M　Tris HCｌ（pH9.0）、1.5% TritonX100
１．抗Streptococcus pyogenes（Ａ群β溶血性レンサ球菌）抗体のニトロセルロースメンブレン（支持体）への固定化
　抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液及び抗ウサギIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗Streptococcus pyogenes抗体、吸収帯側に抗ウサギIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを45℃、30分間乾燥させ、抗Streptococcus pyogenes抗体固定化メンブレンを得た。このメンブレンを本実施例において、「抗体固定化メンブレン」と呼ぶ。
２．抗Streptococcus pyogenes抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
　抗Streptococcus pyogenes抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、0.04％抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子浮遊液を得た。この粒子を、本実施例において、「抗体固定化粒子」と呼ぶ。
３．抗Streptococcus pyogenes抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
　２で作製した抗体固定化粒子浮遊液を不織布に所定量を塗布し、45℃、30分間乾燥させた。得られた不織布を、本実施例において、「乾燥パッド」と呼ぶ。
４．中和試薬（塩基性試薬）の塗布
　上記の中和試薬（塩基性試薬）を30μL/cmで濾紙(東洋濾紙；No.26-3)に塗布した。
５．固形状酸性試薬含浸不織布の作製
　上記の固形状酸性試薬を13μL/cmで不織布(ユニチカ；エルベス(Elves))に塗布した。塗布後に直ちに45℃、１時間、乾燥して、固形状酸性試薬含浸不織布を得た。
６．Streptococcus pyogenes検出用イムノクロマト試験片の作製
　ストリップのバッキングシートに、まずメンブレン（支持体）（30mm幅）を下流から20mmの部分に貼付した。
　メンブレンの下流に、液を吸収させるための吸収帯を貼付した。
　メンブレンの上流にメンブレンとの間に2mmの重なりをもたせて、抗体結合ラテックスが塗布された10mm幅のグラスファイバー（C.Pad）を貼付した。
　C.Padと中和試薬を含浸させたパッドの重なりが4mmとなるよう、中和試薬含浸パッドを貼付した。
　イムノクロマト試験片の上部にあわせて、PETシートであるトップラミネートシート(60mm)を貼付した。
　最後に、固形状酸性試薬を含浸させたパッドを、中和試薬を含浸させたパッドの上に間にトップラミネートシートが介在し、なおかつ固形状酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドが接触するように、イムノクロマト試験片の上流（下端）にあわせて貼付した。
　このようにして作製したイムノクロマト試験片の構造を図２に示す。また、図３に模式図を各パーツ間の距離（mm)と共に示す。なお、図２及び図３において、固形状酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドは、両パッドの間にトップラミネートが存在しない部位でも接触せずに離れているように表されるが、実際には、トップラミネートがない部分で両パッドは接触している。
　固形状酸性試薬を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域の間に、PETシートを挟み込ませないイムノクロマト試験片を、従来技術のイムノクロマト試験片として用いた。
　結果を表１に示す。表１は５分判定時の発色強度を示す。
　表１の「Over」は、従来通りの方法でトップラミネートを貼付けた試験片であり、固形状酸性試薬を含浸させたパッドの上部にトップラミネートがある試験片を用いた試験結果を示す。ただし、固形状酸性試薬を含浸させたパッドの全面にトップラミネートが被さっているのではなく、該パッドの下流部の3mm程度の部分に被さっている。
　表１の「In between」は、本発明の試験片であり、固形状酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドの間にトップラミネートを貼り付けている。固形状酸性試薬を含浸させたパッドと中和試薬を含浸させたパッドが直接触れる接触面は2mmである。
　表１に示すように、本発明の試験片を用いて試験した場合（「in between」）の方が、１～２管感度が高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１　支持体（検出領域を含む）
　２　標識体領域
　３　検出領域
　５　固形状酸性試薬領域（サンプルパッド）
　６　中和試薬領域
　７　吸収帯
　８　バッキングシート
　９　トップラミネートシート
　本発明のイムノクロマトデバイスを用いてＡ群β溶血性レンサ球菌の感染を高感度で検出することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　亜硝酸塩又は酸性溶液と混合した検体を添加するサンプルパッド、糖鎖抗原に対する抗体を標識した標識抗体を含む標識体領域及び前記糖鎖抗原に対する抗体を固相化した検出領域を含み、検出領域において抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体を形成させ、糖鎖抗原を測定するイムノクロマト試験片であって、前記標識体領域の上流に中和試薬を含浸させた領域を有し、さらに該中和試薬を含浸させた領域の上流に、亜硝酸塩と混合した検体を用いるときには固形状酸性試薬を含浸させた領域を有し、酸性溶液と混合した検体を用いるときには亜硝酸塩を含浸させた領域を有する、検体中の糖鎖抗原を抽出し測定するためのイムノクロマト試験片であって、
    　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域の間に、両領域間の試薬の移動又は検体溶液の移動を抑制するように、樹脂製シートを挟み込ませた、イムノクロマト試験片。
  2. 　サンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在する、請求項１記載のイムノクロマト試験片。
  3. 　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域が部分的に接触するように、樹脂製シートを挟み込ませた、請求項１又は２に記載のイムノクロマト試験片。
  4. 　固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域と中和試薬を含浸させた領域が接触しないように、樹脂製シートを挟み込ませた、請求項１又は２に記載のイムノクロマト試験片。
  5. 　イムノクロマト試験片上の最上流にサンプルパッド上に固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させた領域が存在し、サンプルパッド以外の領域が樹脂製シートで覆われ、中和試薬を含浸させた領域の上部の樹脂製シートの上部に、固形状酸性試薬若しくは亜硝酸塩を含浸させたサンプルパッドが存在する、請求項２～４のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
  6. 　固形状酸性試薬が、マロン酸、リンゴ酸、マレイン酸、クエン酸及び酒石酸からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
  7. 　中和試薬が、トリスヒドロキシルメチルアミノメタン又は水酸化ナトリウムである、請求項１～６のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
  8. 　糖鎖抗原が、原生動物、真菌、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、クラミジア又はウイルスの糖鎖抗原である、請求項１～７のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載のイムノクロマト試験片を用いてイムノクロマト法により検体中の糖鎖抗原を測定する方法であって、
    　イムノクロマト試験片が固形状酸性試薬を含浸させた領域を有するときには検体を亜硝酸溶液と混合し、イムノクロマト試験片が亜硝酸塩を含浸させた領域を有するときには検体を酸性溶液と混合し、前記イムノクロマト試験片のサンプルパッドに添加することを含み、
    　固形状酸性試薬を含浸させた領域又は亜硝酸塩を含浸させた領域において、亜硝酸塩と固形状酸性試薬の反応により発生した亜硝酸の作用により検体から糖鎖抗原が抽出され、　中和試薬を含浸させた領域において、前記糖鎖抗原を含む酸性溶液が中和され、
    　検出領域において、抗体-糖鎖抗原-標識抗体の複合体が形成される、イムノクロマト法により、イムノクロマト試験片上での検体の展開のスピードや方向を制御し、酸性試薬と亜硝酸塩と中和試薬による処理を制御して、検体中の糖鎖抗原を測定する方法。
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