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WO2018166468A1 - IgG样长效免疫融合蛋白及其应用 - Google Patents

IgG样长效免疫融合蛋白及其应用 Download PDF

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WO2018166468A1
WO2018166468A1 PCT/CN2018/078951 CN2018078951W WO2018166468A1 WO 2018166468 A1 WO2018166468 A1 WO 2018166468A1 CN 2018078951 W CN2018078951 W CN 2018078951W WO 2018166468 A1 WO2018166468 A1 WO 2018166468A1
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WO
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sequence
amino acid
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molecule
acid sequence
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Application number
PCT/CN2018/078951
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Inventor
胡品良
何芸
邹敬
洪伟东
宋凌云
杨泽荣
Original Assignee
北京比洋生物技术有限公司
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Publication date
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • Constructing mutants by constructing mutants to extend the half-life of the protein commonly used methods are: 1. Increase the degree of glycosylation of protein drugs, so as to form a protective effect on the surface of protein drugs, hinder the degradation of protein drugs by proteases, and increase protein stability. At the same time, the molecular weight of the protein drug is increased, and glomerular filtration is reduced.
  • Drugs that have been successfully developed and marketed include recombinant human EPO mutants (Aranesp from Amgen) and recombinant human insulin mutants (Lantus from Aventis).
  • Aranesp uses site-directed mutagenesis to increase the number of N-linked oligosaccharides from 3 to 5, increasing the molecular weight from 30 kDa to 50 kDa, and extending the half-life from 4-13 h to an average of 49 h. 2.
  • the time to release the free drug is prolonged by forming a sustained release microprecipitate.
  • Lantus is a mutant of recombinant human insulin expressed from E. coli K12 strain, which mutates Asp to Gly at the 21st position of the human insulin A chain; and adds two Arg at the 30th position of the B-chain carbon end.
  • the isoelectric point PI of insulin changed from the original pH 4.0 to pH 6.7.
  • PEGylation modified PEGylation ie polyethylene (PEG) covalently modified protein.
  • PEGylated protein drugs mainly reduce the molecular weight of proteins, reduce the filtration of drugs from the renal tubules, and PEG can act as a barrier to block the antigenic determinants on the surface of protein molecules, reduce immunogenicity, reduce the clearance rate in vivo, and the barrier function of PEG can also protect proteins. It is not easily hydrolyzed by proteases. These characteristics of PEGylation are beneficial to prolong the half-life of protein drugs.
  • PEGylated protein drugs such as PEGylated asparaginase (Enzon's Oncaspar), PEGylated IFN ⁇ 2b (Schering's PEGIntron), PEGylated IFN ⁇ 2a (Roche's Pegasys) and PEGylated G - CSF (Neulasta of Amgen).
  • Serum albumin fusion human serum, albumin is a single-chain aglycosylated globular protein with 585 amino acid residues, molecular weight 65kDa, most therapeutic proteins and peptides generally have a short half-life. HSA has a serum half-life of up to 19 days. The results of clinical trials showed that the average half-life of Albuferon ⁇ (HSA/IFN ⁇ fusion protein) was 148 hours, which was longer than the average half-life of Pegasys (80-140 hours) and the average half-life of PEGIntron 40 hours (22-60 hours).
  • Albutropin is a protein expressed by fusion of the HSA gene and the recombinant human growth hormone (rHGH) gene. In monkeys, subcutaneous injection of albutropin (0.3 mg/kg) and HGH (0.3 mg/kg) resulted in a 6-fold increase in half-life and a 8-fold slower clearance.
  • a fusion protein prepared by human Fc The fusion protein prepared by albumin fusion protein and Fc mainly enhances the biological half-life of the drug through two mechanisms, one is to increase the molecular weight of the drug, so that it is not easily filtered by the renal tubule; the other is through the neonatal Fc Binding of the neonatal Fc receptor (FcRn) protects the target protein from clearance in the blood (Rath T, Baker K, Dumont JA, et al. Crit Rev Biotechnol. 2015 Jun; 35(2): 235-54).
  • FcRn neonatal Fc Binding of the neonatal Fc receptor
  • the FcRn receptor encoded by the fcgrt gene, also known as the Brambell receptor, is an MHC class I-like receptor molecule that forms a heterodimer with a non-covalent bond with ⁇ 2 m microglobulin.
  • the binding of the FcRn receptor to albumin and immunoglobulin is strictly pH dependent, and FcRn does not bind to albumin and immunoglobulin under physiological conditions (pH 7.4).
  • albumin and immunoglobulin are endocytosed into the cells through the pinocytosis pathway, in acidic lysosomes (pH 6.0-6.5), the affinity of FcRn with albumin and immunoglobulin is increased to form a complex, FcRn protection.
  • Albumin and immunoglobulin are not degraded and release albumin and immunoglobulin out of the cell through the membranous circulation.
  • the binding of albumin and immunoglobulin to FcRn protects them from being metabolized, extending their biological half-life.
  • the present invention designs an IgG-like immunological fusion protein, which can effectively prolong the biological half-life of the protein drug (effector molecule), which is far better than the similar Fc immunofusion protein.
  • Heavy chain class may be an IgG1, IgG2 and IgG4, the heavy chain comprises a constant region (C H 1, C H 2 and C H 3).
  • the amino acid sequence of the linker peptide may be selected from any one of the following: AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1); AKTTPKLEEGEFSEARV (SEQ ID NO: 2); AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3); SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4); SAKTTP (SEQ ID NO: 5); RADAAP (sequence) 6); RADAAPTVS (sequence 7); RADAAAAGGPGS (sequence 8); RADAAAA (sequence 9); SAKTTPKLEEGEFSEARV (sequence 10); ADAAP (sequence 11); DAAPTVSIFPP (sequence 12); TVAAP (sequence 13); TVAAPSVFIFPP (sequence 14) ;QPKAAP (sequence 15); QPKAAPSVTLFPP (sequence 16); AKTTPP (sequence 17); AKTTPPSVTPLAP (se
  • Mode 1 The effector molecule is respectively linked to the two heavy chains of the constant region of the IgG antibody and the N-terminus of the two light chains by the linker peptide; the molecular formula is named: (EL) 2 (EH) 2 , E is Effector molecule. E- represents an N-terminal linkage, L is a light chain, and H is a heavy chain.
  • Mode 4 The effector molecule is linked to the C-terminus of two light chains of the IgG antibody constant region through the linker peptide, and no heavy chain is attached; the molecular formula is named: (LE) 2 H 2 , and E is an effector molecule.
  • -E represents a C-terminal linkage, L is a light chain, and H is a heavy chain.
  • Mode 5 The effector molecule is linked to the N-terminus of two heavy chains of the IgG antibody constant region through the linker peptide, and no light chain is attached; the molecular formula is named: L 2 (EH) 2 , and E is an effector molecule.
  • E- represents an N-terminal linkage, L is a light chain, and H is a heavy chain.
  • Mode 6 The effector molecule is linked to the N-terminus of the two heavy chains of the IgG antibody constant region and the C-terminus of the two light chains by the linker peptide, respectively.
  • the molecular formula is named: (LE) 2 (EH) 2 , E is an effector molecule, -E represents a C-terminal linkage, E- represents an N-terminal linkage, L is a light chain, and H is a heavy chain.
  • Mode 8 The effector molecule is respectively linked to the N-terminus and the two heavy-chain C-termini of two light chains of the IgG antibody constant region by the linker peptide; the molecular formula is named: (EL) 2 (HE) 2 , E is an effector molecule, -E represents a C-terminal linkage, E- represents an N-terminal linkage, L is a light chain, and H is a heavy chain.
  • FIG. 1 See Figure 1 for a schematic diagram of the structure of the IgG-like immunological fusion protein formed by the above eight ligation methods.
  • the targeting molecule for treating the autoimmune disease may be specifically selected from any one of the following: Tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ), IL-1, IL-4, IL-5, IL-8, Molecules such as IL-13, IL-17, IL-23, CD80, CD86, CD2, CD110, CD257, and B lymphocyte stimulator (BLyS); mainly by inhibiting inflammatory mediators or by impeding lymphocyte surface receptors Somatic molecules inhibit the activation of lymphocytes.
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor
  • IL-1 IL-1
  • IL-4 IL-5
  • IL-8 Molecules
  • Molecules such as IL-13, IL-17, IL-23, CD80, CD86, CD2, CD110, CD257, and B lymphocyte stimulator (BLyS)
  • B lymphocyte stimulator mainly by inhibiting inflammatory mediators or by impeding lymphocyte surface receptors Somatic molecules inhibit the activation of lymphocytes.
  • the target molecule for tumor treatment may be specifically selected from any one of the following: vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), Fas ligand (FasL), growth differentiation factor 2 (Growth) Differentiation molecules 2, GDF-2), Wnt, Bone morphogenetic protein 11, BMP-11, and activin A (Activin A); mainly by inhibiting tumor angiogenesis and promoting tumor cell apoptosis, Inhibition of tumor cell growth and metastasis to achieve the purpose of treating tumors.
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor A
  • Fas ligand Fas ligand
  • GDF-2 growth differentiation factor 2
  • Wnt Wnt
  • Bone morphogenetic protein 11 Bone morphogenetic protein 11
  • activin A activin A
  • the targeting molecule of the endocrine therapy may specifically be a molecule such as a growth hormone receptor (GHR) or a parathyroid hormone receptor (Parathyroid Hormone receptor). It exerts physiological effects through growth hormone and parathyroid hormone and its analogues for the treatment of diseases such as short stature, burns, and osteoporosis.
  • GHR growth hormone receptor
  • Paraathyroid Hormone receptor parathyroid Hormone receptor
  • the disease may be various diseases such as diabetes, autoimmune diseases, tumors or endocrine-related diseases.
  • the BY19.3L coding gene was ligated to the glutamine synthetase high-efficiency expression vector with double expression cassette by XhoI-EcoRI double digestion (see Patent Application No.: 201410441296.0); the BY19.3H coding gene was cloned by XbaI-SaII, respectively.
  • the glutamine synthetase high-efficiency expression vector (the recombinant expression vector was verified and verified by sequencing) to the double expression cassette of the BY19.3L-encoded light chain gene, and the expressed IgG-like fusion protein was named BY19.3, and the molecular formula L 2 (HE) 2 .
  • the high-expressing cells obtained in step 1 were cultured in serum-free CD OptiCHO, and the culture supernatant was collected at a cell viability of about 60%.
  • the HiTrap MabSelect SuRe 1 ml column (GE Healthcare Life Sciences product, Cat. No: 11-0034-93) was equilibrated with a pH 7.4 PBS solution at 10 bed volumes at a flow rate of 0.5 ml/min; the culture supernatant was filtered with a 0.45 ⁇ m filter. Filtration was carried out at a flow rate of 0.5 ml/min.
  • GLP-1R GLP-1R
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor
  • VEGF-B TNF- ⁇
  • All products of Yishen Shenzhou were diluted to a concentration of 10 ⁇ g/ml, and covalently immobilized on carboxymethyl glucoside via primary amine by amino coupling.
  • Sugar-coated CM5 chip General Electric product
  • fixed buffer 10 mM sodium acetate (pH 5.0) fixed amount of 1000 RU.
  • Regeneration solution glycine buffer with a pH of 1.5-2.0; injection time: 30 s; flow rate: 30 ⁇ l/min.
  • PBST (formulation: 0.005% by volume of Tween 20 in PBS) is Running buffer; using Kinetic Analysis Wizard mode; Dulaglutide, BY23.2, BY25 and BY19.3 are diluted to 600, 300, 150, respectively. Concentration gradients of 75, 37.5 and 18.75 nM; injection time: 2 min, dissociation time: 5 min, flow rate: 30 ⁇ l/min.
  • Type II diabetes model db/db mice (Changzhou Cavans Experimental Animal Co., Ltd.), measured basal blood glucose after fasting for 3 hours, and blood glucose concentration greater than 10 mmol/L into groups; with a few points 2 groups, each group 6 Only mice.

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Abstract

公开了一种IgG样长效免疫融合蛋白及其应用，所述IgG样长效免疫融合蛋白由效应分子和IgG抗体恒定区组成，所述效应分子通过连接肽与所述IgG抗体恒定区相连；所述效应分子为能在体内发挥生理学功能的蛋白；所述IgG抗体恒定区为IgG抗体去除两个重链可变区和两个轻链可变区后的结构。

Description

IgG样长效免疫融合蛋白及其应用 技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及一种IgG样长效免疫融合蛋白及其应用。
背景技术
重组蛋白药物是生物技术药物中很重要的一类，临床上一般通过静脉和皮下注射给药。经静脉和皮下注射后常伴有蛋白质降解，导致活性降低，生物利用度低；分子量较小者(小于60kD)甚至可以通过肾小球过滤到尿中，因而要达到需要的血药浓度和治疗效果需要反复给药，有的需要一天注射2-3次，不仅给患者带来不便，降低患者顺应性，从而影响疗效。因此临床上需要研制长效的重组蛋白药物。目前延长蛋白药物半衰期的方法主要有：
构建突变体通过构建突变体延长蛋白药物半衰期，常用方法有：1、增加蛋白药物的糖基化程度，使在蛋白药物表面形成保护，，阻碍了蛋白酶对蛋白药物的降解作用，增加蛋白质稳定性，同时使蛋白药物分子量增大，减少了肾小球滤过。已经研制成功并上市的药物如重组人EPO突变体(Amgen公司的Aranesp)和重组人胰岛素的突变体(Aventis公司的Lantus)。Aranesp采用定点突变技术，N连接的寡糖链从原来的3条增加到5条，从而使分子量从原来的30kDa增加到50kDa，半衰期由原来的4-13h延长到平均49h。2、通过形成缓释的微沉淀物，使释放游离型药物的时间延长。Lantus是从大肠杆菌K12株表达的重组人胰岛素的突变体，在人胰岛素A链第21个位点将Asp突变成Gly；在B链碳端最后第30个位点加两个Arg，使胰岛素等电点PI由原来的pH4.0变为pH6.7。这种突变使其在酸性环境下为完全澄清溶液，一旦注入皮下组织(pH值提高)则因为等电点特性，变成不溶的微沉淀物，可持续释放，与重组人胰岛素皮下注射后4-8h的持续时间相比，体内浓度相对恒定24小时以上。
PEG化修饰PEG化(PEGylation)，即聚乙二醇(polyethylene,PEG)共价修饰蛋白质。PEG化蛋白药物主要通过增加蛋白质的分子量，降低药物从肾小管过滤，并且PEG可以作为屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇，减少免疫原性，减少体内清除率，PEG的屏障作用还可以保护蛋白质不易被蛋白酶水解，PEG化的这些特点均有利于延长蛋白药物的半衰期。目前已上市的PEG化的蛋白药物如PEG化的天冬酰胺酶(Enzon公司的Oncaspar)、PEG化的IFNα2b(Schering公司的PEGIntron)、PEG化的IFNα2a(Roche公司的Pegasys)和PEG化的G-CSF(Amgen公司的Neulasta)。
血清白蛋白融合人血清，白蛋白(human serum albumin,HSA)是有585个氨基酸残基的单链无糖基化的球形蛋白质，分子量65kDa，大多数治疗用的蛋白和多肽半衰期一般较短，而HSA有将近长达19天的血清半衰期。临床试验结果表明，Albuferonα(HSA/IFNα融合蛋白)平均半衰期148小时，比Pegasys平均半衰期80小时(50-140小时)和PEGIntron平均半衰期40小时(22-60小时) 更长。Albutropin是由HSA基因和重组人生长激素(rHGH)基因融合表达的蛋白。在猴子中，皮下注射albutropin(0.3mg/kg)和HGH(0.3mg/kg)相比，半衰期延长6倍，清除率慢8倍。
人Fc制备的融合蛋白。白蛋白融合蛋白和Fc制备的融合蛋白的主要通过二种机制提高药物在体内的生物半衰期，一个是增加其分子量的大小，使其不易被肾小管过滤出去；另一个是通过与新生儿Fc受体(neonatal Fc receptor,FcRn)的结合保护目标蛋白不轻易在血中清除(Rath T,Baker K,Dumont JA,et al.Crit Rev Biotechnol.2015Jun；35(2):235-54)。FcRn受体由fcgrt基因编码，也被称为Brambell受体，是通过非共价键与β 2m微球蛋白形成异源二聚体的MHC I类样的受体分子。FcRn受体与白蛋白和免疫球蛋白的结合有严格的pH依赖性，FcRn在生理条件下(pH7.4)不与白蛋白和免疫球蛋白结合。但当白蛋白和免疫球蛋白通过胞饮途径内吞到细胞内，在酸性的溶酶体内(pH6.0-6.5)，FcRn与白蛋白和免疫球蛋白的亲和力提高，形成复合物，FcRn保护白蛋白和免疫球蛋白不被降解，并通过膜质循环，将白蛋白和免疫球蛋白再次释放到胞外。白蛋白和免疫球蛋白与FcRn结合可保护它们被代谢掉，延长二者的生物半衰期。目前，上市的白蛋白和免疫球蛋白产品有abatacept、aflibercept、belatacept、conbercept(四川康弘)、dulaglutide、etanercept和albutrepenonacog alfa等，其中etanercept和aflibercept为重磅炸弹级药物，2016年etanercept全球销售额达88.74亿美元，afl ibercept达50亿美元，conbercept(四川康弘)在中国销售额有望突破5亿人民币。然而，这些Fc免疫融合蛋白具有一个普遍的缺点，那就是生物半衰期较短。
发明公开
为了有效解决现有延长蛋白药物生物半衰期方法的不足，本发明设计了IgG样免疫融合蛋白，其可以有效延长蛋白药物(效应分子)的生物半衰期，远远好于同类的Fc免疫融合蛋白。
本发明所提供的IgG样免疫融合蛋白，具体是由效应分子和IgG抗体恒定区组成，所述效应分子通过连接肽与所述IgG抗体恒定区相连；所述效应分子为能在体内发挥生理学功能的蛋白；所述IgG抗体恒定区为IgG抗体去除两个重链可变区和两个轻链可变区后的结构。
即，所述IgG样免疫融合蛋白，与免疫球蛋白一样，是一类由两条轻链和两条重链组成的四肽链结构，重链之间和重、轻链之间由二硫键连接，其构象与英文大写字母Y形状类似。
轻链型别可为κ和λ型，包含轻链的恒定区(C L)。
重链类别可为IgG1，IgG2和IgG4，包含重链的恒定区(C H1、C H2和C H3)。
其中，所述连接肽的氨基酸序列可选自如下中任一：AKTTPKLEEGEFSEAR(序列1)；AKTTPKLEEGEFSEARV(序列2)；AKTTPKLGG(序列3)；SAKTTPKLGG(序列4)；SAKTTP(序列5)；RADAAP(序列6)；RADAAPTVS(序列7)；RADAAAAGGPGS (序列8)；RADAAAA(序列9)；SAKTTPKLEEGEFSEARV(序列10)；ADAAP(序列11)；DAAPTVSIFPP(序列12)；TVAAP(序列13)；TVAAPSVFIFPP(序列14)；QPKAAP(序列15)；QPKAAPSVTLFPP(序列16)；AKTTPP(序列17)；AKTTPPSVTPLAP(序列18)；AKTTAP(序列19)；AKTTAPSVYPLAP(序列20)；ASTKGP(序列21)；ASTKGPSVFPLAP(序列22)；GGGGSGGGGSGGGGS(序列23)；GENKVEYAPALMALS(序列24)；GPAKELTPLKEAKVS(序列25)；GHEAAAVMQVQYPAS(序列26)。
所述效应分子通过所述连接肽以下述8种方式中的任一种与所述IgG抗体恒定区相连：
方式1：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链和两条轻链的N端；分子式命名为：(E-L) 2(E-H) 2，E为效应分子。E-代表N端连接，L为轻链，H为重链。
方式2：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的C端，不连接轻链；分子式命名为：L 2(H-E) 2，E为效应分子，-E代表C端连接，L为轻链，H为重链。
方式3：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的N端，不连接重链；分子式命名为：(E-L) 2H 2，E为效应分子，E-代表N端连接，L为轻链，H为重链。
方式4：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的C端，不连接重链；分子式命名为：(L-E) 2H 2，E为效应分子，-E代表C端连接，L为轻链，H为重链。
方式5：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的N端，不连接轻链；分子式命名为：L 2(E-H) 2，E为效应分子，E-代表N端连接，L为轻链，H为重链。
方式6：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的N端和两条轻链的C端。分子式命名为：(L-E) 2(E-H) 2，E为效应分子，-E代表C端连接，E-代表N端连接，L为轻链，H为重链。
方式7：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链和两条轻链的C端；分子式命名为：(L-E) 2(H-E) 2，E为效应分子，-E代表C端连接，L为轻链，H为重链。
方式8：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的N端和两条重链C端；分子式命名为：(E-L) 2(H-E) 2，E为效应分子，-E代表C端连接，E-代表N端连接，L为轻链，H为重链。
以上8种连接方式所形成的IgG样免疫融合蛋白的结构示意图具体参见图1。
所述效应分子作用的靶向分子可为糖尿病治疗的靶向分子、自身免疫性疾病治疗的靶向分子、肿瘤治疗的靶向分子或内分泌治疗的靶向分子。
其中，所述糖尿病治疗的靶向分子具体可为胰高血糖素样肽1受体(glucagon-likepeptide 1receptor,GLP-1R)或成纤维细胞生长因子受体 (Fibroblast growth factor receptor,FGFR)等分子；
所述自身免疫性疾病治疗的靶向分子具体可选自如下任一种：肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、IL-17、IL-23、CD80、CD86、CD2、CD110、CD257和B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS)等分子；主要通过抑制炎性介质或通过阻碍淋巴细胞表面受体分子抑制淋巴细胞的激活。
所述肿瘤治疗的靶向分子具体可选自如下任一种：血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)、Fas配体(fas ligand,FasL)、生长分化因子2(Growth differentiation factor 2,GDF-2)、Wnt、骨形态发生蛋白11(Bone morphogenetic protein 11,BMP-11)和激活素A(Activin A)等分子；主要通过抑制肿瘤血管生成、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长和转移等达到治疗肿瘤之目的。
所述内分泌治疗的靶向分子具体可为生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)或甲状旁腺激素受体(Parathyroid Hormone receptor)等分子。通过生长激素和甲状旁腺激素及其类似物发挥生理作用，用于治疗矮小症、烧伤、和骨质疏松症等疾病。
相应的，作用于糖尿病治疗靶向分子胰高血糖素样蛋白1受体(GLP-1R)的所述效应分子为GLP-1或其类似物，其氨基酸序列为序列表中序列27或序列28或者是表1中的通式；作用于糖尿病治疗靶向分子成纤维细胞生长因子受体(FGFR)的所述效应分子为成纤维细胞生长因子21(FGF21)，其氨基酸序列具体为序列表中序列29。具体如表1所示。
表1 作用于糖尿病治疗靶向分子的效应分子的氨基酸残基序列
Figure PCTCN2018078951-appb-000001
注：GLP-1类似物的通式中，X aa8是Gly、Ser、Val或Ala；X aa9是Glu、Asp或Gln；X aa18是Ser或Lys；X aa19是Tyr或Asn；X aa22是Glu、Ala、Lys、Gly、Arg或Asp；X aa23是Gln或Lys；X aa26是Lys或Arg；X aa29是Ile或Val；X aa34是Lys或Arg；X aa36是Arg或Gly。
作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子TNF-α的所述效应分子为肿瘤坏死 因子受体1(TNFR1)或肿瘤坏死因子受体2(TNFR2)；所述TNFR1的氨基酸序列具体为序列表中序列30或序列31；所述TNFR2的氨基酸序列具体为序列表中序列32或序列33；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD80和CD86的所述效应分子为细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)；所述CTLA-4的氨基酸序列具体为序列表中序列34或序列35；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD2的所述效应分子为CD58(LFA-3)；所述CD58(LFA-3)的氨基酸序列具体为序列表中序列36；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子B淋巴细胞刺激因子(BLyS)的所述效应分子为穿膜蛋白活化物(Transmembrane Activator And Caml Interactor，TACI)；所述TACI的氨基酸序列具体为序列表中序列37；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD257的所述效应分子为CD268；所述CD268的氨基酸序列具体为序列表中序列38；作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD110的所述效应分子为免疫球蛋白重链恒定区γ1(immunoglobulin heavy constant gamma 1，IGHG1)；所述IGHG1的氨基酸序列具体为序列表中序列39。具体如表2所示。
表2 作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子的效应分子的氨基酸残基序列
Figure PCTCN2018078951-appb-000002
Figure PCTCN2018078951-appb-000003
作用于肿瘤治疗的靶向分子VEGF-A的所述效应分子为VEGFR-1或VEGFR1-D2/VEGFR2-D3(即表示VEGFR-1的功能区Ⅱ(D2)和VEGFR2的功能区Ⅲ(D3))或VEGFR1-D2/VEGFR2-D3-D4(即表示VEGFR-1的功能区Ⅱ(D2)和VEGFR2的功能区Ⅲ(D3)和VEGFR2的功能区Ⅳ(D4))；所述VEGFR-1的氨基酸序列具体为序列表中序列40；所述VEGFR1-D2/VEGFR2-D3的氨基酸序列具体为序列表中序列序列41；所述VEGFR1-D2/VEGFR2-D3-D4的氨基酸序列具体为序列表中序列序列42；作用于肿瘤治疗的靶向分子FasL的所述效应分子为CD95；所述CD95的氨基酸序列具体为序列表中序列43；作用于肿瘤治疗的靶向分子生长分化因子2(Growth differentiation factor 2,GDF-2)的所述效应分子为激活素A受体样激酶1(Activin Receptor-Like Kinase 1，ALK-1)；所述ALK-1的氨基酸序列具体为序列表中序列44；作用于肿瘤治疗的靶向分子Wnt的所述效应分子为Frizzled-8；所述Frizzled-8的氨基酸序列具体为序列表中序列45；作用于肿瘤治疗的靶向分子骨形态发生蛋白11(bone morphogenetic protein，BMP-11)的所述效应分子为激活素A受体IIB型(activin A receptor type IIB，ACVR2B)；所述ACVR2B的氨基酸序列具体为序列表中序列46或序列47；作用于肿瘤治疗的靶向分子激活素A的所述效应分子为激活素A受体IIA型(activin A receptor type 2A,ACVR2A)；所述ACVR2A的氨基酸序列具体为序列表中序列48。具体如表3所示。
表3 作用于肿瘤治疗的靶向分子的效应分子的氨基酸残基序列
Figure PCTCN2018078951-appb-000004
Figure PCTCN2018078951-appb-000005
作用于内分泌治疗的靶向分子生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)的所述效应分子为生长激素；所述生长激素的氨基酸序列具体为序列表中序列49；作用于内分泌治疗的靶向分子甲状旁腺激素受体(Parathyroid Hormone receptor)的所述效应分子为甲状旁腺激素或其类似物；所述甲状旁腺激素或其类似物的氨基酸序列具体为序列表中序列50或序列51。具体如表4所示。
表4 作用于内分泌治疗的靶向分子的效应分子的氨基酸残基序列
Figure PCTCN2018078951-appb-000006
Figure PCTCN2018078951-appb-000007
在本发明的实施例中，所述IgG样免疫融合蛋白具体为如下任一：
(1)命名为BY23.2：所述BY23.2的轻链的氨基酸序列如序列表中序列58所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列60所示；
(2)命名为BY23.1：所述BY23.1的轻链的氨基酸序列如序列表中序列54所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列56所示；
(3)命名为BY23.3：所述BY23.3的轻链的氨基酸序列如序列表中序列54所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列62所示；
(4)命名为BY23.4：所述BY23.4的轻链的氨基酸序列如序列表中序列64所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列62所示；
(5)命名为BY23.5：所述BY23.5的轻链的氨基酸序列如序列表中序列58所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列56所示；
(6)命名为BY23.6：所述BY23.6的轻链的氨基酸序列如序列表中序列64所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列60所示；
(7)命名为BY23.7：所述BY23.7的轻链的氨基酸序列如序列表中序列64所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列56所示；
(8)命名为BY23.8：所述BY23.8的轻链的氨基酸序列如序列表中序列54所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列60所示；
(9)命名为BY25：所述BY25的轻链的氨基酸序列如序列表中序列70所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列72所示；
(10)命名为BY4.5：所述BY4.5的轻链的氨基酸序列如序列表中序列74所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列76所示；
(11)命名为BY3.4：所述BY3.4的轻链的氨基酸序列如序列表中序列78所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列80所示。
进一步地，所述IgG样免疫融合蛋白可按照包括如下步骤的方法制备获得：将所述轻链的编码基因插入到具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体的酶切位点XhoI和EcoRI之间，得到中间载体；然后再将所述重链的编码基因插入到所述中间载体的酶切位点XbaI和SaII之间，得到重组表达载体；所述重组表达载体表达出的蛋白即为所述IgG样免疫融合蛋白。其中，所述具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体具体参见申请号为201410441296.0的中国专利。
更加具体地，所述BY23.2的轻链的编码基因为序列表中序列59所示DNA分子；所述BY23.2的重链的编码基因为序列表中序列61所示DNA分子。所述BY23.1的轻链的编码基因为序列表中序列55所示DNA分子；所述BY23.1的重链的编码基因为序列表中序列57所示DNA分子。所述BY23.3的轻链的编码基因为序列表中序列55所示DNA分子；所述BY23.3的重链的编码基因为序列表 中序列63所示DNA分子。所述BY23.4的轻链的编码基因为序列表中序列65所示DNA分子；所述BY23.4的重链的编码基因为序列表中序列63所示DNA分子。所述BY23.5的轻链的编码基因为序列表中序列59所示DNA分子；所述BY23.5的重链的编码基因为序列表中序列57所示DNA分子。所述BY23.6的轻链的编码基因为序列表中序列65所示DNA分子；所述BY23.6的重链的编码基因为序列表中序列61所示DNA分子。所述BY23.7的轻链的编码基因为序列表中序列65所示DNA分子；所述BY23.7的重链的编码基因为序列表中序列57所示DNA分子。所述BY23.8的轻链的编码基因为序列表中序列55所示DNA分子；所述BY23.8的重链的编码基因为序列表中序列61所示DNA分子。所述BY25的轻链的编码基因为序列表中序列71所示DNA分子；所述BY25的重链的编码基因为序列表中序列73所示DNA分子。所述BY4.5的轻链的编码基因为序列表中序列75所示DNA分子；所述BY4.5的重链的编码基因为序列表中序列77所示DNA分子。所述BY3.4的轻链的编码基因为序列表中序列79所示DNA分子；所述BY3.4的重链的编码基因为序列表中序列81所示DNA分子。
以上所述IgG样免疫融合蛋白的制备方法也属于本发明的保护范围。
所述IgG样免疫融合蛋白在疾病治疗中的应用也属于本发明的保护范围。
所述IgG样免疫融合蛋白在制备用于疾病治疗的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种治疗疾病的方法。该方法可包括如下步骤：利用所述IgG样免疫融合蛋白治疗疾病。
本发明还要求保护一种用于治疗疾病的药物。该药物的活性成分为所述IgG样免疫融合蛋白。
其中，所述疾病可为糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤或内分泌相关疾病等多种疾病。
附图说明
图1为7种连接方式所形成的IgG样免疫融合蛋白的结构示意图。
图2为实施例4中实验组和对照组小鼠的血糖随时间变化图。纵坐标为血糖值，单位为mmol/L。
实施发明的最佳方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、谷氨酰胺合成酶高效表达载体的构建
一、糖尿病相关IgG样免疫融合蛋白编码基因的克隆和表达载体的构建
1、Dulaglutide编码基因的合成及表达载体构建
Dulaglutide(Trulicity)是一种美国食品药品监督管理局(FDA)批准的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，也是一种用于帮助血糖水平正常化的免疫融合蛋白，其结构为GLP-1-Fc，属于现有典型Fc免疫融合蛋白。
根据International Nonproprietary Name(INN)数据库中和专利中有关Dulaglutide的氨基酸残基序列“HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGGG GGGSGGGGSGGGGSAESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG(序列52)”委托上海捷瑞生物工程有限公司合成将Dulaglutide的编码基因“CACGGAGAGGGCACATTCACTTCCGACGTGTCTAGTTACTTGGAGGAACAGGCAGCTAAAGAGTTTATCGCATGGCTCGTCAAGGGTGGGGGCGGCGGCGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCAGTGGAGGCGGCGGAAGCGCTGAGTCCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCTTGCCCTGCCCCTGAGgccgccGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGCACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGCGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTACCGCGTGGTGTCCGTGCTGACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCCGCCTGACCGTGGACAAGTCCCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTGGGCTAA(序列53)”，经XhoI-EcoRI双酶切克隆至双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(具体参见专利申请号：201410441296.0)。并经测序验证重组载体构建正确。
2、GLP-1类似物IgG样融合蛋白编码基因的合成及表达载体构建
根据选择的GLP-1类似物的效应分子氨基酸残基序列，优化其编码序列，并分别与人IgG的轻链恒定区和重链恒定区的编码基因连接，分别构建(E-L) 2(E-H) 2、L 2(H-E) 2、(E-L) 2H 2、(L-E) 2H 2、L 2(E-H) 2、(L-E) 2(E-H) 2和(L-E) 2(H-E) 2七种分子结构IgG样融合蛋白。八种分子式表达载体的构建见如下表5。表6列举了几种GLP-1类似物IgG样融合蛋白的氨基酸残基和编码序列。
表5 八种分子式表达载体的构建
分子式 编码基因组合方式 蛋白名称
(E-L) 2(E-H) 2 BY23.1L+BY23.1H BY23.1
L 2(H-E) 2 BY23.2L+BY23.2H BY23.2
(E-L) 2H 2 BY23.1L+BY23.3H BY23.3
(L-E) 2H 2 BY23.4L+BY23.3H BY23.4
L 2(E-H) 2 BY23.2L+BY23.1H BY23.5
(L-E) 2(H-E) 2 BY23.4L+BY23.2H BY23.6
(L-E) 2(E-H) 2 BY23.4L+BY23.1H BY23.7
(E-L) 2(H-E) 2 BY23.1L+BY23.2H BY23.8
表6 几种GLP-1类似物IgG样融合蛋白的氨基酸残基和编码序列：
Figure PCTCN2018078951-appb-000008
Figure PCTCN2018078951-appb-000009
Figure PCTCN2018078951-appb-000010
Figure PCTCN2018078951-appb-000011
通过XhoI-EcoRI双酶切分别将BY23.1L、BY23.2L和BY23.4L编码基因连接至具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(具体参见专利申请号：201410441296.0)；通过表5的组合通过XbaI-SaII分别将BY23.1H、BY23.2H和BY23.3H编码基因分别克隆至已连接对应编码轻链基因的双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(各重组表达载体经测序验证正确后备用)，所表达的IgG样融合蛋白分别命名为BY23.1、BY23.2、BY23.3、BY23.4、BY23.5、BY23.6、BY23.7和BY23.8。
二、自身免疫性疾病相关IgG样免疫融合蛋白编码基因的克隆和表达载体的构建
炎性介质TNF-α为三聚体，在通过TNFR1和TNFR2结合而发挥生理功能。TNFR1和TNFR2与TNF-α的亲和性较高，可达nM级别。TNFR1和TNFR2与TNF-α结合的功能区均位于两受体N端的4个富含半胱氨酸区。将其设计成为IgG样免疫融合蛋白可以在体内结合游离的TNF-α，达到治疗之目的。其效应分子氨基酸残基序列及编码基因见如下表7。
表7 自身免疫性疾病治疗相关IgG样融合蛋白的氨基酸残基和编码序列
Figure PCTCN2018078951-appb-000012
Figure PCTCN2018078951-appb-000013
通过XhoI-EcoRI双酶切将BY19.3L编码基因连接至具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(具体参见专利申请号：201410441296.0)；通过XbaI-SaII分别将BY19.3H编码基因克隆至已连接BY19.3L编码轻链基因的双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(重组表达载体经测序验证正确后备用)，所表达的IgG样融合蛋白命名为BY19.3，分子式L 2(H-E) 2。
三、肿瘤治疗相关IgG样免疫融合蛋白编码基因的克隆和表达载体的构建
VEGF-A与其受体VEGFR1和VEGFR2均有较高亲和性，VEGFR均属于酪氨酸激酶受体超家族，在胞外段有7个免疫球蛋白样功能区(immunoglobulin-like domains)，其中第1-3个Ig样区和VEGF结合有关。将VEGFR1胞外第2功能结构域和VEGFR2胞外的第3功能结构域编码基因连接，构建成成为IgG样免疫融合蛋白可以在体内结合游离的VEGF-A和VEGF-B，抑制肿瘤血管的生成，从而达到治疗肿瘤之目的。其效应分子氨基酸残基序列及编码基因见如下表8。
表8 肿瘤治疗相关IgG样融合蛋白的氨基酸残基和编码序列
Figure PCTCN2018078951-appb-000014
Figure PCTCN2018078951-appb-000015
Figure PCTCN2018078951-appb-000016
通过XhoI-EcoRI双酶切将BY25L编码基因连接至具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(具体参见专利申请号：201410441296.0)；通过XbaI-SaII分别将BY25H编码基因克隆至已连接BY25L编码轻链基因的双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(重组载体测序验证正确后备用)，所表达的IgG样融合蛋白命名为BY25，分子式L 2(E-H) 2。
四、内分泌疾病相关IgG样免疫融合蛋白编码基因的克隆和表达载体的构建
生长激素通过与生长激素受体结合发挥生理作用，患矮小症缺乏生长激素，为治疗矮小症每天需注射重组生长激素一次，给矮小症患儿造成巨大的痛苦，在治疗期间会出现减少注射次数，甚至放弃治疗。长效生长激素的使用可以提高患儿治疗的顺应性和治疗效果。其效应分子氨基酸残基序列及编码基因见如下表9。
表9 内分泌疾病治疗相关IgG样融合蛋白的氨基酸残基和编码序列
Figure PCTCN2018078951-appb-000017
Figure PCTCN2018078951-appb-000018
Figure PCTCN2018078951-appb-000019
通过XhoI-EcoRI双酶切将BY4.5L和BY3.4L编码基因连接至具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(具体参见专利申请号：201410441296.0)；通过XbaI-SaII分别将BY4.5H和BY3.4H编码基因克隆至已连接BY4.5L和BY3.4L编码轻链基因的双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体(重组载体测序验证正确后备用)，所表达的IgG样融合蛋白命名为BY4.5和BY3.4，分子式分别为(E-L) 2H 2和(E-L) 2(E-H) 2。
实施例2、IgG样免疫融合蛋白表达细胞的筛选、表达及纯化
一、IgG样免疫融合蛋白表达细胞的筛选
1、CHO-K1细胞(ATCC，货号：CCL-61)在10％D-FBS，4mM谷氨酰胺的CD OptiCHO(Invitrogen产品，货号：12681)中适应并贴壁生长。
2、24小时后，按Lipofectin 2000(Invitrogen货号：11668-019)操作说明，将实施例1构建的重组载体转染细胞，于10cm培养皿中进行：用无血清无抗生素的IMDM培养基洗2次，每次加入IMDM 100μl/孔。取实施例1构建好的表达质粒与IMDM培养基混均，取Lipofectin 2000与IMDM培养基混均。静置5分钟后，将两者混匀。室温静置15分钟后，将Lipofectin 2000 CD和表达质粒混合物加入培养有CHO-K1细胞的10cm培养皿。
3、5小时后，换成完全培养基(10％透析血清，4mM谷氨酰胺的CD OptiCHO)。
4、转染24小时后胰酶消化转染细胞，按3-8×10 3/孔的细胞密度铺96孔培养板，并用含L-蛋氨酸砜亚胺(L-Methionine sulfoximine，MSX，Sigma产品，货号：M5379)25μM的CD OptiCHO培养基进行筛选。
5、大约2周后有细胞克隆长出，取50μl样品双抗体夹心法ELISA方法检测培养液中蛋白含量，筛选出目的蛋白表达量相对较高克隆。
二、IgG样免疫融合蛋白的表达和纯化
将步骤一获得高表达细胞置无血清的CD OptiCHO中培养，细胞活率在60％左右收集培养上清。用pH 7.4的PBS溶液平衡HiTrap MabSelect SuRe 1ml柱(GE Healthcare Life Sciences产品,Cat.No：11-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min；培养上清液用0.45μm滤膜过滤上样，流速为0.5ml/min。用pH 7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min；用100mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰，目的蛋白存在于洗脱峰中。
实施例3、Biacore 3000检测IgG样免疫融合蛋白与其靶标的亲和力
一、实验方法
1、固定
分别将GLP-1R、VEGF-A、VEGF-B和TNF-α(均为义翘神州产品)稀释至浓度10μg/ml，采用氨基偶联的方法经由伯胺共价固定在羧甲基葡聚糖包被的CM5芯片(通用电气产品)，固定缓冲液10mM醋酸钠(pH5.0)，固定量为1000RU。
2、再生条件
再生液：pH为1.5-2.0的甘氨酸缓冲液；进样时间：30s；流速：30μl/min。
3、动力学分析
PBST(配方：PBS中含有0.005％体积百分含量的吐温20)为Running buffer；使用Kinetic Analysis Wizard模式；将Dulaglutide、BY23.2、BY25和BY19.3分别稀释为的600、300、150、75、37.5和18.75nM的浓度梯度；进样时间： 2min，解离时间：5min，流速：30μl/min。
二、实验结果
拟和软件：BIAevaluation 4.1 software。
Biacore方法检测Dulaglutide、BY23.2、BY25和BY19与各自的靶标的亲和力结果，具体如表10所示。
表10 Dulaglutide、BY23.2、BY25和BY19与各自的靶标的亲和力结果
Figure PCTCN2018078951-appb-000020
从表10中Dulaglutide和BY23.2的结果可以看出，同样是针对GLP-1R靶标，两者所体现出来的亲和力(KD)是基本一致的。可见，与传统的Fc免疫融合蛋白相比，本发明的IgG样免疫融合蛋白仍然保留了较强的亲和力。
实施例4、IgG样免疫融合蛋白内活性检测
一、GPL-1的IgG样免疫融合蛋白体内活性检测
1、实验方法
(1)Ⅱ型糖尿病模型db/db小鼠(常州卡文斯实验动物有限公司)，禁食3h后测基础血糖，将血糖浓度大于10mmol/L入组；随几分2组，每组6只小鼠。
(2)按0.8mg/kg的量BY23.2(γ 4，L 2(H-E) 2)皮下注射免疫融合蛋白，对照组为等体积缓冲液。
(3)分别在0小时、1小时、1天、2天、3天、4天、6天、8天、10天、12天和14天取小鼠尾血，测血糖(测血糖前小鼠禁食，不禁水3小时)。
2、实验结果
与对照组相比较，实验组BY23.2(γ 4，L2(H-E)2)皮下注射1小时内血糖快速下降到10mmol/L以下，10天内基本维持血糖的稳定，到10天依然有显著的降糖效应。具体如图2所示。
二、生长激素IgG样免疫融合蛋白体内活性检测
1、实验方法
委托苏州西山中科药物研究开发有限公司完成。
SD大鼠，雌雄各半，3～4周龄，戊巴比妥钠(浓度15mg/mL)45mg/kg腹腔注射麻醉(给药容积3mL/kg)，麻醉后固定于立体定向垂体切除仪(Stoelting,USA)，门齿平面低于耳间线1mm，参考体重一深度和体重一角度相关曲线选择 进针深度和角度，调整两侧耳杆角度为19°，取16G安全型带加药壶静脉留置针芯(1.7×50mm)经右侧中空耳杆针尖斜面向上进针，待针尖刚至外耳道处，用圆规测量垂体部位与针尖的直线距离,以此距离为尺度，开始进针至有落空感时，轻轻旋转针尖180°，用吸引器抽吸至粉红色垂体组织吸出并检查。手术后记录每只动物的体重和尾长(从尾末端到肛门的距离)。
手术完毕，术后3天内，每日单次皮下注射青霉素(40×10 4IU/ml)0.1ml/只，并让动物自由饮用5％葡萄糖水(装入给水瓶中)；自由饮水和进食。
术后3周，测量每只存活动物的体重，取术后2～3周体重变化小于手术前±10％去垂体大鼠为合格去垂体模型动物，并按体重随机均衡分为模型对照组(生理盐水)和BY4.5(γ 4，(E-L) 2H 2)组(低剂量组0.45mg/kg，高剂量组1.8mg/kg)，人生长激素国际活性标准品(中国食品药品检定研究院，4.5IU(1.5mg)/支)组(低剂量组0.133mg/kg、高剂量组0.533mg/kg)，每组8只。标准品组每日一次，连续6天，BY4.5组6天注射2次，每3天1次。
第10天处死动物并刨取后两腿胫骨，剥离肌肉等组织(必要时实验结束后可进行尸检，切开蝶鞍区，肉眼检查有无垂体残留，剔除有垂体残存的动物)，从胫骨近心端顶部中间沿矢状面切开，置10％福尔马林中，水洗10min后，置丙酮中脱蛋白10min，水洗3min，2％硝酸银中染色2min，水洗后置水中强光照射至变棕黑色，10％硫代硫酸钠固定30s，置80％乙醇中保存供测量用，测量时沿刨面切1mm左右薄片置生物显微镜下(×100)测量胫骨骨骺板宽度(每鼠两腿胫骨测量10个数值取其平均值)。
2、实验结果
实验结果按“生物检定统计法”(《中国药典》附录ⅪⅤ)中的量反应平行线测定随机设计法列表的格式整理，按量反应平行线测定(2.2)法随机设计处理结果，并进行效价计算。
最终计算结果如下表11所示。IgG样免疫融合蛋白在体内仍然保持了很好的生物学活性。
表11 BY4.5的理论估计效价以及实际计算效价
供试品 理论估计效价 实际计算效价(IU/mg)
BY4.5 1.24IU/mg 1.08
实施例5、GLP-1类似物IgG样免疫融合蛋白食蟹猴体内生物半衰期测定
一、实验方法
(1)分组：实验分2组Dulaglutide和BY23.2(γ 4，L 2(H-E) 2)，每组3只健康食蟹猴。
(2)动物给药：试验采用单一剂量、单次皮下注射给药。根据分子量大小，保证给药的量(摩尔数)一致，Dulaglutide给药量为0.52mg/0.2ml/kg，BY23.2(γ 4，L 2(H-E) 2)，给药量为0.72mg/0.2ml/kg。
(3)样本采集：药前(0h)、给药后0.5、1、6h，1、2、3、5、7、10、14、17、21、24、28天。上或下肢静脉采集全血约0.5ml。
(4)样本处理：取血后放入预加5μl肝素钠(6250IU/ml)的1.5ml离心管中(取血前，含有肝素钠的离心管于2～8℃或冰浴保存)，手动颠倒至少3次混匀，置于碎冰中，2h内完成离心分离血浆，离心条件为：2400g，4℃，10min，血浆储存于-70℃以下，避免反复冻融。
(5)血药浓度测定：以Abcam公司的抗GLP-1抗体4F3为一抗(货号：ab23472)，以中杉金桥的辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体(货号：ZB-2304)为二抗，建立的ELISA方法测定血浆药物浓度，以供试品为标准品，制备标准曲线。
(6)数据采集及统计分析：用酶标仪自带软件计算各样本中含量。进而计算药物半衰期(T1/2)，即药物在血浆中最高浓度降低一半所需的时间。
二、实验结果
Dulaglutide(Fc免疫融合蛋白)的T1/2为62.1±5.8h，BY23.2(γ 4，L 2(H-E) 2)的T1/2为179±9.46h，BY23.2在食蟹猴体内生物半衰期远远超过Dulaglutide，是Dulaglutide的3倍多。
综合以上各实施例的实验结果，可见：本发明所提供的IgG样免疫融合蛋白，其在保证了与靶向分子具有较高亲和力以及具有较好体内活性的前提下，可以有效延长蛋白药物(效应分子)的生物半衰期，远远好于于同类的Fc免疫融合蛋白。本发明所提供的这种IgG样长效免疫融合蛋白可用于糖尿病、肿瘤、自身免疫性疾病和内分泌等多种疾病的治疗。
工业应用
本发明所提供的IgG样免疫融合蛋白，其在保证了与靶向分子具有较高亲和力以及具有较好体内活性的前提下，可以有效延长蛋白药物(效应分子)的生物半衰期，远远好于于同类的Fc免疫融合蛋白。本发明所提供的这种IgG样长效免疫融合蛋白可用于糖尿病、肿瘤、自身免疫性疾病和内分泌等多种疾病的治疗。

Claims (18)

  1. IgG样免疫融合蛋白，由效应分子和IgG抗体恒定区组成，所述效应分子通过连接肽与所述IgG抗体恒定区相连；
    所述效应分子为能在体内发挥生理学功能的蛋白；
    所述IgG抗体恒定区为IgG抗体去除两个重链可变区和两个轻链可变区后的结构。
  2. 根据权利要求1所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述IgG抗体的轻链的型别为κ型或λ型。
  3. 根据权利要求1或2所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述IgG抗体的重链的类别为IgG1、IgG2或IgG4。
  4. 根据权利要求1-3中任一所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述连接肽的氨基酸序列选自序列表中序列1至序列26中任一。
  5. 根据权利要求1-4中任一所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述效应分子通过所述连接肽以下述八种方式中的任一种与所述IgG抗体恒定区相连：
    方式1：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链和两条轻链的N端；
    方式2：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的C端，不连接轻链；
    方式3：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的N端，不连接重链；
    方式4：所述效应分子通过所述连接肽连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的C端，不连接重链；
    方式5：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的N端，不连接轻链；
    方式6：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链的N端和两条轻链的C端；
    方式7：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条重链和两条轻链的C端；
    方式8：所述效应分子通过所述连接肽分别连接于所述IgG抗体恒定区的两条轻链的N端和两条重链C端。
  6. 根据权利要求1-5中任一所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述效应分子作用的靶向分子为糖尿病治疗的靶向分子、自身免疫性疾病治疗的靶向分子、肿瘤治疗的靶向分子或内分泌治疗的靶向分子。
  7. 根据权利要求6所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述糖尿病治疗的靶向分子为胰高血糖素样肽1受体、成纤维细胞生长因子受体或其他靶 向分子；
    所述自身免疫性疾病治疗的靶向分子选自如下任一种：肿瘤坏死因子α、IL-1、IL-4、IL-5、IL-8、IL-13、IL-17、IL-23、CD80、CD86、CD2、CD110、CD257、B淋巴细胞刺激因子，以及其他靶向分子；
    所述肿瘤治疗的靶向分子选自如下任一种：血管内皮生长因子A、Fas配体、生长分化因子2、Wnt、骨形态发生蛋白11、激活素A，以及其他靶向分子；
    所述内分泌治疗的靶向分子为生长激素受体或甲状旁腺激素受体。
  8. 根据权利要求7所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：作用于糖尿病治疗靶向分子胰高血糖素样蛋白1受体的所述效应分子为GLP-1或GLP-1类似物；
    作用于糖尿病治疗靶向分子成纤维细胞生长因子受体的所述效应分子为成纤维细胞生长因子21；
    作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子肿瘤坏死因子α的所述效应分子为肿瘤坏死因子受体1或肿瘤坏死因子受体2；
    作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD80和CD86的所述效应分子为细胞毒T淋巴细胞相关抗原4；
    作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD2的所述效应分子为CD58；
    作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子B淋巴细胞刺激因子的所述效应分子为穿膜蛋白活化物；
    作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD257的所述效应分子为CD268；
    作用于自身免疫性疾病治疗的靶向分子CD110的所述效应分子为免疫球蛋白重链恒定区γ1；
    作用于肿瘤治疗的靶向分子血管内皮生长因子A的所述效应分子为VEGFR-1或VEGFR1-D2/VEGFR2-D3或VEGFR1-D2/VEGFR2-D3-D4；
    作用于肿瘤治疗的靶向分子Fas配体的所述效应分子为CD95；
    作用于肿瘤治疗的靶向分子生长分化因子2的所述效应分子为激活素A受体样激酶1；
    作用于肿瘤治疗的靶向分子Wnt的所述效应分子为Frizzled-8；
    作用于肿瘤治疗的靶向分子骨形态发生蛋白11的所述效应分子为激活素A受体IIB型；
    作用于肿瘤治疗的靶向分子激活素A的所述效应分子为激活素A受体IIA型；
    作用于内分泌治疗的靶向分子生长激素受体的所述效应分子为生长激素；
    作用于内分泌治疗的靶向分子甲状旁腺激素受体的所述效应分子为甲状旁腺激素或其类似物。
  9. 根据权利要求8所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述GLP-1的氨基酸序列为序列表中序列27或序列28；所述GLP-1类似物的如下通式： H-X aa8-X aa9-G-T-F-T-S-D-V-S-X aa18-X aa19-L-E-X aa22-X aa23-A-A-X aa26-E-F-X aa29-A-W-L-V-X aa34-G-X aa36；其中，X aa8是Gly、Ser、Val或Ala；X aa9是Glu、Asp或Gln；X aa18是Ser或Lys；X aa19是Tyr或Asn；X aa22是Glu、Ala、Lys、Gly、Arg或Asp；X aa23是Gln或Lys；X aa26是Lys或Arg；X aa29是Ile或Val；X aa34是Lys或Arg；X aa36是Arg或Gly；
    所述成纤维细胞生长因子21的氨基酸序列为序列表中序列29；
    所述肿瘤坏死因子受体1的氨基酸序列为序列表中序列30或序列31；所述肿瘤坏死因子受体2的氨基酸序列为序列表中序列32或序列33；
    所述细胞毒T淋巴细胞相关抗原4的氨基酸序列为序列表中序列34或序列35；
    所述CD58的氨基酸序列为序列表中序列36；
    所述穿膜蛋白活化物的氨基酸序列为序列表中序列37；
    所述CD268的氨基酸序列为序列表中序列38；
    所述免疫球蛋白重链恒定区γ1的氨基酸序列为序列表中序列39；
    所述VEGFR-1的氨基酸序列为序列表中序列40；所述VEGFR1-D2/VEGFR2-D3的氨基酸序列为序列表中序列41；所述VEGFR1-D2/VEGFR2-D3-D4氨基酸序列为序列表中序列42；
    所述CD95的氨基酸序列为序列表中序列43；
    所述激活素A受体样激酶1的氨基酸序列为序列表中序列44；
    所述Frizzled-8的氨基酸序列为序列表中序列45；
    所述激活素A受体IIB型的氨基酸序列为序列表中序列46或序列47；
    所述激活素A受体IIA型的氨基酸序列为序列表中序列48；
    所述生长激素的氨基酸序列为序列表中序列49；
    所述甲状旁腺激素或其类似物的氨基酸序列为序列表中序列50或序列51。
  10. 根据权利要求1-9中任一所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述IgG样免疫融合蛋白为如下任一：
    (1)命名为BY23.2：所述BY23.2的轻链的氨基酸序列如序列表中序列58所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列60所示；
    (2)命名为BY23.1：所述BY23.1的轻链的氨基酸序列如序列表中序列54所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列56所示；
    (3)命名为BY23.3：所述BY23.3的轻链的氨基酸序列如序列表中序列54所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列62所示；
    (4)命名为BY23.4：所述BY23.4的轻链的氨基酸序列如序列表中序列64所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列62所示；
    (5)命名为BY23.5：所述BY23.5的轻链的氨基酸序列如序列表中序列58所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列56所示；
    (6)命名为BY23.6：所述BY23.6的轻链的氨基酸序列如序列表中序列64 所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列60所示；
    (7)命名为BY23.7：所述BY23.7的轻链的氨基酸序列如序列表中序列64所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列56所示；
    (8)命名为BY23.8：所述BY23.8的轻链的氨基酸序列如序列表中序列54所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列60所示；
    (9)命名为BY25：所述BY25的轻链的氨基酸序列如序列表中序列70所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列72所示；
    (10)命名为BY4.5：所述BY4.5的轻链的氨基酸序列如序列表中序列74所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列76所示；
    (11)命名为BY3.4：所述BY3.4的轻链的氨基酸序列如序列表中序列78所示，重链的氨基酸序列如序列表中序列80所示。
  11. 根据权利要求10所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述IgG样免疫融合蛋白是按照包括如下步骤的方法制备获得的：将所述轻链的编码基因插入到具有双表达盒的谷氨酰胺合成酶高效表达载体的酶切位点XhoI和EcoRI之间，得到中间载体；然后再将所述重链的编码基因插入到所述中间载体的酶切位点XbaI和SaII之间，得到重组表达载体；所述重组表达载体表达出的蛋白即为所述IgG样免疫融合蛋白。
  12. 根据权利要求11所述的IgG样免疫融合蛋白，其特征在于：所述BY23.2的轻链的编码基因为序列表中序列59所示DNA分子；所述BY23.2的重链的编码基因为序列表中序列61所示DNA分子；
    所述BY23.1的轻链的编码基因为序列表中序列55所示DNA分子；所述BY23.1的重链的编码基因为序列表中序列57所示DNA分子；
    所述BY23.3的轻链的编码基因为序列表中序列55所示DNA分子；所述BY23.3的重链的编码基因为序列表中序列63所示DNA分子；
    所述BY23.4的轻链的编码基因为序列表中序列65所示DNA分子；所述BY23.4的重链的编码基因为序列表中序列63所示DNA分子；
    所述BY23.5的轻链的编码基因为序列表中序列59所示DNA分子；所述BY23.5的重链的编码基因为序列表中序列57所示DNA分子；
    所述BY23.6的轻链的编码基因为序列表中序列65所示DNA分子；所述BY23.6的重链的编码基因为序列表中序列61所示DNA分子；
    所述BY23.7的轻链的编码基因为序列表中序列65所示DNA分子；所述BY23.7的重链的编码基因为序列表中序列57所示DNA分子；
    所述BY23.8的轻链的编码基因为序列表中序列55所示DNA分子；所述BY23.8的重链的编码基因为序列表中序列61所示DNA分子；
    所述BY25的轻链的编码基因为序列表中序列71所示DNA分子；所述BY25的重链的编码基因为序列表中序列73所示DNA分子；
    所述BY4.5的轻链的编码基因为序列表中序列75所示DNA分子；所述BY4.5 的重链的编码基因为序列表中序列77所示DNA分子；
    所述BY3.4的轻链的编码基因为序列表中序列79所示DNA分子；所述BY3.4的重链的编码基因为序列表中序列81所示DNA分子。
  13. 制备权利要求11或12中所述的IgG样免疫融合蛋白的方法，包括权利要求11或12中所述的步骤。
  14. 权利要求1-12中任一所述的IgG样免疫融合蛋白在疾病治疗中的应用。
  15. 权利要求1-12中任一所述的IgG样免疫融合蛋白在制备用于疾病治疗的药物中的应用。
  16. 一种治疗疾病的方法，包括如下步骤：利用权利要求1-12中任一所述的IgG样免疫融合蛋白治疗疾病。
  17. 一种用于治疗疾病的药物，其活性成分为权利要求1-12中任一所述的IgG样免疫融合蛋白。
  18. 根据权利要求14或15所述的应用或权利要求16所述的方法或权利要求17所述的药物，其特征在于：所述疾病为糖尿病、自身免疫性疾病、肿瘤或内分泌相关疾病。
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