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WO2017122789A1 - てんかん治療のためのアデノ随伴ウイルスビリオン - Google Patents

てんかん治療のためのアデノ随伴ウイルスビリオン Download PDF

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Publication number
WO2017122789A1
WO2017122789A1 PCT/JP2017/001048 JP2017001048W WO2017122789A1 WO 2017122789 A1 WO2017122789 A1 WO 2017122789A1 JP 2017001048 W JP2017001048 W JP 2017001048W WO 2017122789 A1 WO2017122789 A1 WO 2017122789A1
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WO
WIPO (PCT)
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protein
amino acid
sequence
promoter
associated virus
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/001048
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English (en)
French (fr)
Inventor
慎一 村松
恵司 小黒
久仁子 島崎
Original Assignee
学校法人自治医科大学
株式会社遺伝子治療研究所
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Filing date
Publication date
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Priority to EP17738541.6A priority patent/EP3403675B1/en
Priority to US16/069,370 priority patent/US20190022251A1/en
Priority to JP2017561186A priority patent/JP6924441B2/ja
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    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
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    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to recombinant adeno-associated virus (rAAV) virions for neurological diseases. More specifically, the present invention relates to epilepsy, schizophrenia, autism spectrum disorder, mental retardation, anxiety, depression, migraine headache, fear compulsive symptoms, drug dependence, Angelman's syndrome, dyskinesia, dystonia, Alzheimer's disease
  • the present invention relates to rAAV for the treatment of neuropsychiatric diseases such as diseases, developmental disorders (attention deficit hyperactivity disorder, Asperger syndrome).
  • Epilepsy is a partial seizure that occurs in a part of the body or a generalized seizure that occurs as a whole body convulsions due to the abnormal excitation spreading to the whole cortex as a result of the occurrence of aberrant excitation of brain neurons in a relatively limited area. Such as clonic seizures).
  • General seizures cause loss of consciousness. It is a disease that does not cause cramps, and may cause unconsciousness only or abnormal mental symptoms (such as psychomotor seizures).
  • the current general therapeutic means mainly consists of drug treatment with antiepileptic drugs (phenytoin, carbamazepine, valproic acid etc.), surgical treatment is performed for intractable ones.
  • epilepsy cases are intractable diseases whose seizures are not suppressed even by drug treatment.
  • surgical treatment such as temporal lobe resection may be effective, but excision of the hippocampus on both sides causes memory loss, so if the seizure focal point is in both hippocampus, surgery It does not become adaptation.
  • about 100,000 intractable epilepsy patients of unknown seizure focus such as childhood epilepsy encephalopathy (West syndrome etc.) are expected to exist in Japan, and there is no curative treatment for such patients.
  • rAAV genetically modified adeno-associated virus
  • Non-patent Document 1 directly administers overexpression of NLGN2 by directly administering to the hippocampus a rAAV vector that expresses neuroligin 2 (NLGN2), which is a synaptic localization protein of neurons.
  • NLGN2 neuroligin 2
  • the results show that it has produced changes in social behavior and inhibitory synaptic transmission, but has not been described with respect to the treatment of specific diseases.
  • Moe 'et al. Non-patent Document 2
  • epilepsy treatment is performed using a rAAV vector expressing neuropeptide Y to alleviate the epileptic condition.
  • Non-patent document 3 epilepsy symptoms are alleviated as a result of directly administering to the hippocampus a rAAV vector that expresses antisense of neuroligin 1 (NLGN1), which is a synaptic localization protein of neurons. It is shown that it was done.
  • NLGN1 neuroligin 1
  • the present inventors prepared a recombinant adeno-associated virus vector containing a polynucleotide encoding neuroligin 2, which is a protein that improves the ability of inhibitory synaps to suppress the stimulation.
  • the present invention was completed by finding that administration of this vector to a living body ameliorates the symptoms of epilepsy.
  • the present application provides a recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector shown below, a pharmaceutical composition containing the same, etc. for treatment of a disease related to a nerve cell such as epilepsy described below.
  • rAAV adeno-associated virus
  • a pharmaceutical composition containing the same, etc. for treatment of a disease related to a nerve cell such as epilepsy described below.
  • rAAV adeno-associated virus
  • the above polynucleotide encodes a neuroligin 2 protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 or an amino acid sequence having about 90% or more identity to these sequences and binding to neurexin
  • the recombinant adeno-associated virus vector is a protein having a mutated amino acid sequence in which tyrosine at position 445 in the amino acid sequence of wild type AAV1 capsid protein is substituted with phenylalanine, 445 in the amino acid sequence of wild type AAV2 capsid protein Including a protein having a mutated amino acid sequence in which tyrosine at the position is replaced with phenylalanine, or a protein having a mutated amino acid sequence in which tyrosine at position 446 in the amino acid sequence of wild type AAV9 capsid protein is replaced by phenylalanine
  • the adeno-associated virus recombinant vector according to any one of [1] to [3].
  • the polynucleotide is synapsin I promoter sequence, myelin basic protein promoter sequence, neuron specific enolase promoter sequence, calcium / calmodulin dependent protein kinase II (CMKII) promoter sequence, tubulin ⁇ I promoter sequence, platelet derived growth Factor ⁇ chain promoter sequence, glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell specific promoter), glial fibrillary acidic protein (hGfa2) promoter sequence, and glutamate receptor delta 2 promoter (cerebellar Purkinje cell)
  • Associated viral vector [6] The polynucleotide according to any one of [1] to [5], wherein the polynucleotide comprises an inverted terminal repeat (ITR) selected from the group consisting of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV8, and AAV9. Recombinant Adeno-Associated Virus Vector. [7] The recombinant adeno-associated virus vector according to any one of [1] to [6], wherein the polynucleotide further comprises a polynucleotide for suppressing excitatory synaptic excitation. [8] A pharmaceutical composition comprising the recombinant adeno-associated virus recombinant vector according to any one of [1] to [7].
  • ITR inverted terminal repeat
  • Gene therapy for enhancing the function of the synaptic suppression system according to the present invention is useful as a treatment for epilepsy.
  • the composition of the present invention can be expected to be effective also for intractable epilepsy patients whose seizure focus is unknown such as childhood epilepsy encephalopathy (West syndrome etc.).
  • FIG. 1 a shows the results of confirmation of expression of recombinant neuroligin 2 protein in mice administered vascularized rAAV by FLAG antibody staining of tissue sections.
  • FIG. 1 b shows the results of detection of expression of recombinant neuroligin 2 in mice receiving control.
  • the horizontal axis represents epileptic seizure frequency in mice treated with 3 types of intracardiac administration (vascular administration type rAAV expressing NLGN2, vascular administration type rAAV expressing GFP protein, and intracardiac administration of saline). The results measured at the indicated age are shown. The result of the seizure time of the mouse
  • mouth which administered said 3 types of intracardiac administration is shown. It shows the tabulated result of seizure time ⁇ seizure intensity shown in FIGS. 3 and 4.
  • mouth which administered said 3 types of said administration in each week is shown.
  • Fig. 7 shows the results of measuring the seizure frequency of epilepsy in a mouse (Fig.
  • epilepsy schizophrenia, autism spectrum disorder, mental retardation, anxiety, depression, migraine headache, fear compulsory, including a polynucleotide encoding a protein that improves the inhibitory synaptic excitatory function in vivo
  • a recombinant adeno-associated virus vector for the treatment of a disease selected from the group consisting of symptoms, drug addiction, Angelman's syndrome, dyskinesia, dystonia, Alzheimer's disease, developmental disorders (attention deficit hyperactivity disorder, Asperger syndrome) Provided.
  • a synapse refers to a junction between a synaptic small head in which an axon terminal or the like of a nerve cell is swollen and a target neuron or muscle cell.
  • synapses include excitatory synapses that transmit excitation and inhibitory synapses that suppress transmission of excitation.
  • most synapses are chemical synapses (slow signaling) mediated by chemical transmission.
  • Another type is the electrical synapse, which shows a quick response in time, but is less likely to be found in the central nervous system of mature mammals.
  • amino acids such as glutamate, aspartate, cysteic acid, homocystenone etc. function as transmitters, and excitatory postsynaptic potential (EPSP) is generated, and the potential exceeds the threshold. And transmission of excitement (impulse) is performed.
  • amino acids such as ⁇ -aminobutyric acid (GABA), glycine, taurine, alanine, cystathionine, serine, etc. function as transmitters to generate inhibitory postsynaptic potential (IPSP). It is believed that it suppresses or makes it difficult to generate postsynaptic neuron impulses.
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • IPSP inhibitory postsynaptic potential
  • fast EPSP In EPSP and IPSP, one showing fast time lapse (within 100 milliseconds of full lapse) (fast EPSP or fast IPSP) and one showing slow slow time lapse lasting several tens of seconds to several tens of minutes (slow EPSP or slow IPSP) And exist.
  • fast IPSP GABA related to the GABA A receptor (Cl ⁇ ) channel and glycine related to the glycine receptor (Cl ⁇ ) channel act, and as a transmitter of slow IPSP, GABA B through GABA B receptor or GABA B It is known that acetylcholine and catecholamines act.
  • Proteins that enhance excitatory inhibitory function of inhibitory synapses include neuroligin 2 and neurexin involved in stabilization of synapse, GABA receptor, glutamine decarboxylase (GAD) involved in GABA biosynthesis, and glycine transport These include Na + channel protein and Cl 2 - channel protein, neuropeptide Y, the scaffold protein gephyrin, StranstK3 which is a transmembrane protein involved in inhibitory synapse formation, and PTPRD as a receptor-type tyrosine phosphatase which binds to SLITRK3.
  • the polynucleotide contained in the vector of the present invention preferably contains a nucleotide sequence (SEQ ID NO: 2, 4 or 6) encoding a neuroligin 2 protein as a protein for improving the excitatory inhibitory function of inhibitory synapse.
  • Neurorigin refers to a family of membrane proteins present in the postsynaptic membrane, generally divided into neuroligins 1-4. Each of these neuroligins specifically binds to the cell adhesion factor neurexin (Nurexin: NRXN) protein of the presynaptic membrane to connect the presynaptic terminal and the postsynaptic terminal.
  • Neurorigin 1 is localized to excitatory synapses and is thought to mediate excitatory synaptic transmission.
  • neuroligin 2 is localized to inhibitory synapses and is thought to mediate inhibitory synaptic transmission.
  • neuroligin 3 is expressed in both the excitatory synapse and inhibitory synapse, in the heart, the pancreas and the like, and neuroligin 4 is expressed in the heart, the liver and the like.
  • Neurexin proteins which are binding partners of neuroligin, are generally divided into neurexin 1 ⁇ -3 ⁇ and 1 ⁇ -3 ⁇ .
  • the ⁇ form and the ⁇ form are long protein and short protein, respectively, which are produced by the action of different promoters from the same gene.
  • Neuroligin 2 used in the present invention functionally binds to neurexin 1 ⁇ .
  • amino acid sequence of neuroligin 2 protein used in the present invention known ones can be used. Such amino acid sequences include, for example, Genbank Accession Nos. AAM 46111 (human), EDL 12455 (mouse), EDMO 4903 (rat). Other available animal species include, for example, those derived from mammals such as monkeys, dogs, pigs, cows and horses. The amino acid sequences of human, mouse and rat neuroligin 2 proteins are described in SEQ ID NOs: 2, 4 and 6, respectively.
  • the neuroligin 2 protein used in the present invention is about 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, with respect to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 , 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9 Included are proteins that have an amino acid sequence with% or more identity and are capable of binding to neurexin 1 ⁇ protein under physiological conditions. Generally, the larger the value, the better.
  • the amino acid sequences of human and mouse neuroligin 2 are at least 98% identical, and the amino acid sequences of human and rat neuroligin 2 are at least 91% identical.
  • that the mutant protein and the original protein function to the same degree means, for example, a specific activity of about 0.01 to 100, preferably about 0.5 to 20, more preferably Means that it is within the range of about 0.5 to 2, but is not limited thereto.
  • the neuroligin 2 protein used in the present invention has one or more amino acids deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 or the amino acid sequence having the above identity. Included are proteins which contain an amino acid sequence and which are capable of binding to the neurexin 1 ⁇ protein under physiological conditions. Two or more of the above amino acid deletions, substitutions, insertions and additions may occur simultaneously. Examples of such a protein include, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 39, 1 to 38, 1 to 37, and 1 to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • Examples of mutually replaceable amino acid residues in the protein (polypeptide) of the present invention are shown below.
  • Amino acid residues included in the same group can be mutually substituted.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine;
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid;
  • group C asparagine, glutamine;
  • group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid;
  • group E Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; F
  • Neuroligin proteins in which amino acid residues are substituted can be produced according to methods known to those skilled in the art, such as ordinary genetic engineering techniques. For such gene manipulation procedures, see, for example, Molecular Cloning 3rd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997, etc. Can.
  • preferred polynucleotides to be used in the present invention are, for example, one or more (for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 30, 1) or the like in the polynucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3 or 5. -25 pieces, 1-20 pieces, 1-15 pieces, 1-10 pieces, 1-9 pieces (1-several pieces), 1-8 pieces, 1-7 pieces, 1-6 pieces, 1-5 pieces, A polynucleotide having deletion, substitution, insertion and / or addition of 1 to 4, 1 to 3, 1 to 2, 1 etc.
  • nucleotides wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 Or a protein which is capable of binding to neurexin 1 ⁇ and containing an amino acid sequence in which one or more of the above amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 Containing polynucleotides. Combinations of two or more of these deletions, substitutions, insertions and additions may be included simultaneously. Generally, the smaller the number of deletions, substitutions, insertions and / or additions of the above nucleotides, the better.
  • a preferred polynucleotide in the present invention is, for example, a polynucleotide hybridizable under stringent hybridization conditions to SEQ ID NO: 7, 9 or 11 or a complementary sequence thereof, which comprises SEQ ID NO: 2, 4 or 6 Or a polynucleotide encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or more of the above amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4 or 6 It contains a polynucleotide encoding a certain protein.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method according thereto, such as a method described in Molecular Cloning (Molecular Cloning 3rd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001). Moreover, when using a commercially available library, it can carry out according to the method as described in the instruction manual etc. which are provided by the manufacturer.
  • stringent conditions may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions and high stringency conditions.
  • “Low stringency conditions” are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C.
  • “moderately stringent conditions” are, for example, 5x SSC, 5x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 42 ° C.
  • “Highly stringent conditions” are, for example, 5 ⁇ SSC, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that DNAs having high homology can be efficiently obtained as the temperature is raised. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art should appropriately select these factors. Similar stringency can be achieved with
  • the hybridizable polynucleotide may be, for example, 70% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, 9 or 11, as calculated using homology search software such as FASTA, BLAST, etc. using default parameters. 80% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 95% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2%
  • the polynucleotides having the same identity of 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% or more, 99.9% or more can be mentioned. Generally, the larger the value of the homology, the better.
  • the target diseases of the present invention relates to epilepsy, schizophrenia, autism spectrum disorder, mental retardation, anxiety, depression, migraine headache, fear compulsive symptoms, drug dependence, Angelman's syndrome, dyskinesia, dystonia, Alzheimer's disease
  • the present invention provides rAAV vectors that are useful for the treatment of diseases selected from the group consisting of diseases, developmental disorders (attention deficit hyperactivity disorder, Asperger syndrome), especially epilepsy.
  • Epilepsy refers to the occurrence of excessive synchronous firing activity of cerebral neurons, and causes the same type of clinical seizure (systemic tonic-clonic seizure, absence seizure, auditory seizure, part of the limb) in the same individual. It refers to a pathological condition in which tonic seizures repeat).
  • the classification of clinical seizures is partial seizure (simple partial seizure, complex partial seizure), general seizure (absent seizure, myoclonic seizure, tonic-clonic seizure, weakness) Attacks), classified into unclassifiable attacks.
  • classification of epilepsy, epilepsy syndrome and related seizure disorders includes localization relatedness (age related, symptomatic, latent classification), generality (spontaneous, latent) It is divided into causal or symptomatic, symptomatic subclasses), those in which focal or generality can not be determined, and special syndromes (such as thermal cramps).
  • West syndrome mainly characterized by short-time proflex seizures beginning in infancy around 1 year old
  • West syndrome or sputum spasm
  • the disease forms a series in which momentary tonic seizures occur, which fork and bow over the upper body and head.
  • the etiology of the West syndrome is diverse, and congenital malformations such as congenital brain malformations, tuberous sclerosis, and congenital metabolic abnormalities such as vitamin B6 deficiency are known.
  • the rAAV vectors of the invention may have a therapeutic effect on West syndrome.
  • Recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV) Vector of the Present Invention As a vector for delivering a gene used for synaptic function control to neural cells, it is also possible by peripheral administration described in WO 2012/057363.
  • a recombinant adeno-associated virus vector (also referred to herein as a vascular administration vector) capable of efficient gene delivery to neural cells, or those described in WO 2008/124724 and the like can be used.
  • the rAAV vector of the present invention can pass through the blood-brain barrier of a living body and is therefore delivered to the brain via the blood-brain barrier, such as by peripheral administration to a patient, nerves such as the patient's brain and spinal cord It is possible to introduce a target therapeutic gene into a system cell. It can also be administered intrathecally or directly to the target site in the brain.
  • the rAAV vector of the present invention is preferably derived from natural adeno-associated virus type 1 (AAV1), type 2 (AAV2), type 3 (AAV3), type 4 (AAV4), type 5 (AAV5), type 6 (AAV6) And 7 (AAV7, 8 (AAV8), 9 (AAV9), etc.
  • AAV1 natural adeno-associated virus type 1
  • AAV2 type 2
  • AAV3 AAV3
  • AAV4 type 5
  • AAV6 AAV6
  • AAV9 AAV9
  • AAV9 AAAV 9
  • types 2, 3, 5 and 9 are of human origin, in the context of the present invention, particularly capsid proteins (VP1 derived from AAV1, AAV2 or AAV 9).
  • AAV1 and AAV9 are preferably human-derived AAVs. Infection efficiency of the nerve cells have been reported to be relatively high (Taymans, et al, Hum Gene Ther 18:. 195-206, such as 2007).
  • the capsid protein contained in the rAAV vector used in the present invention preferably has at least one tyrosine such as phenylalanine or the like as compared to the wild-type amino acid sequence as described in WO 2012/057363 or WO 2008/124724 etc.
  • a mutant protein having an amino acid sequence substituted for the amino acid of For example, an amino acid sequence in which the tyrosine at position 445 in the amino acid sequence of wild type AAV1 capsid protein is substituted with phenylalanine (SEQ ID NO: 9), and a tyrosine at position 444 in the amino acid sequence of wild type AAV2 capsid protein is substituted with phenylalanine Amino acid sequence (SEQ ID NO: 10) or a mutant protein having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 11) in which the tyrosine residue at position 446 in the amino acid sequence of wild type AAV9 capsid protein is substituted with phenylalanine residue (SEQ ID NO: 11) WO 2012/057363, WO 2008/124724).
  • capsid proteins have the function of forming capsomers either alone or together with other capsid protein members (eg, VP2, VP3 etc).
  • capsid protein members eg, VP2, VP3 etc.
  • a polynucleotide containing a therapeutic gene or the like to be delivered to neural cells is packaged in the capsomer.
  • neural cells as gene transfer targets include at least neurons contained in the central nervous system such as the brain and spinal cord, and further include glial cells, microglia, astrocytes, oligodendrocytes, It may also include ventricular ependymal cells, cerebral vascular endothelial cells and the like.
  • the percentage of neurons among the neural cells to be transfected is preferably 70% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7% or more, 99.8% The above is 99.9% or more, or 100%.
  • the Rep protein used in the present invention has a function of recognizing an ITR sequence and performing genome replication depending on the sequence, a function of recruiting and packaging a wild-type AAV genome (or rAAV genome) into a viral vector, It may have the same number of amino acid sequence identity as described above as long as it has the same function as that of the present invention such as the function to form the rAAV vector, and deletion of the same number of amino acid residues as described above , Substitution, insertion and / or addition. Functionally similar ranges include those described in the above description of specific activity. In the present invention, preferably, known AAV3-derived Rep proteins are used.
  • the polynucleotide encoding the Rep protein used in the present invention has a function of recognizing an ITR sequence and performing genome replication depending on that sequence, and recruiting a wild-type AAV genome (or rAAV genome) into a viral vector It may have the same number of identities as above, as long as it encodes a Rep protein having the same degree of known functions, such as the function to package and the function to form the rAAV vector of the present invention, It may include deletions, substitutions, insertions and / or additions of as many nucleotides. Functionally similar ranges include those described in the above description of specific activity.
  • a rep gene derived from AAV3 or AAV2 is used.
  • the capsid protein VP1 or the like (VP1, VP2 and / or VP3) encoded in the internal region of the wild-type AAV genome as described above, and the Rep protein It is incorporated in and used.
  • the capsid proteins (VP1, VP2 and / or VP3) used in the present invention, and the Rep protein may be incorporated into one, two, three or more plasmids, as required.
  • one or more of these capsid and Rep proteins may be included in the AAV genome.
  • capsid proteins (VP1, VP2 and / or VP3) and Rep proteins are all encoded by one polynucleotide and provided as an AAV helper plasmid.
  • the polynucleotide (ie, polynucleotide) packaged in the rAAV vector of the present invention is an internal region (ie, rep gene and cap) located between the ITRs located 5 'and 3' of the wild type genome.
  • the polynucleotide of one or both of the genes can be prepared by replacing it with a gene cassette including a polynucleotide encoding a protein of interest (therapeutic gene), a promoter sequence for transcribing the polynucleotide, and the like.
  • the ITRs located 5 'and 3' are located at the 5 'and 3' ends of the AAV genome, respectively.
  • the rAAV genome of the present invention has ITRs located at the 5 'end and 3' end including 5 'ITRs and 3' ITRs contained in the genome of AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV8 or AAV9. .
  • the ITR contained in the rAAV genome of the present invention may be reversed in the 5 'and 3' direction, since the ITR portion has a flip-flop structure in which complementary sequences are easily exchanged.
  • the length of the polynucleotide replaced with the internal region ie, the therapeutic gene
  • the rAAV genome of the present invention is preferably about the same as 5 kb in which the full length is wild type, for example, about 2 to 6 kb, preferably about 4 to 6 kb.
  • the length of the therapeutic gene to be incorporated into the rAAV genome of the present invention is preferably the length of the transcriptional regulatory region including the promoter, polyadenylation, etc. (for example, assuming about 1 to 1.5 kb).
  • the length is about 0.01 to 3.7 kb, more preferably about 0.01 to 2.5 kb, still more preferably about 0.01 to 2 kb, but not limited thereto.
  • a polynucleotide packaged in a recombinant adeno-associated virus vector may take several days to express a therapeutic protein of interest if it is single stranded.
  • the therapeutic gene to be introduced may be designed to be a self-complementary sc (self-complementary) type to show an effect in a shorter period of time. Specific details are described in, for example, Foust KD, et al. (Nat Biotechnol. 2009 Jan; 27 (1): 59-65).
  • the polynucleotide packaged in the rAAV vector of the present invention may be non-sc or sc.
  • the rAAV vector of the invention preferably comprises a polynucleotide comprising a neural cell specific promoter sequence and a therapeutic gene operably linked to the promoter sequence (ie such a poly Nucleotides are packaged).
  • a promoter sequence used in the present invention a promoter sequence specific to neural cells is derived from, for example, neural cells, glial cells, oligodendrocytes, cerebral vascular endothelial cells, microglia, ventricular epithelial cells, etc. Although it is not limited to these.
  • promoter sequences include synapsin I promoter sequence, myelin basic protein promoter sequence, neuron specific enolase promoter sequence, glial fibrillary acidic protein promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebrate Purkinje cell specific promoter And glutamic acid receptor delta 2 promoter (cerebellar Purkinje cell specific promoter) sequences, glial fibrillary acidic protein (hGfa2) promoter sequences, and glutamate decarboxylase (GAD65 / GAD67) promoter sequences, but not limited thereto.
  • promoter sequences such as calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CMKII) promoter sequence, tubulin ⁇ I promoter sequence, and platelet-derived growth factor ⁇ chain promoter sequence can also be used.
  • CMKII calcium / calmodulin-dependent protein kinase II
  • tubulin ⁇ I promoter sequence tubulin ⁇ I promoter sequence
  • platelet-derived growth factor ⁇ chain promoter sequence can also be used.
  • the above promoter sequences may be used alone or in combination of any two or more. It may also be a commonly used strong promoter sequence such as CMV promoter or CAG promoter.
  • promoter sequences in the present invention include synapsin I promoter sequence, myelin basic protein promoter sequence, L7 promoter sequence (cerebellar Purkinje cell specific promoter), glutamate receptor delta 2 promoter (cerebellar Purkinje cell specific promoter) Be Furthermore, it may contain known sequences such as enhancer sequences for assisting in transcription of mRNA, translation into protein, etc., Kozak sequences, appropriate polyadenylation signal sequences and the like.
  • the therapeutic gene of interest to be integrated into the rAAV genome of the present invention is delivered to neural cells with high efficiency and integrated into the cell's genome.
  • the number of nerves is about 10 times or more, about 20 times or more, about 30 times or more, about 40 times or more or about 50 times or more than that when using conventional rAAV vectors It is possible to introduce a gene into cells.
  • the number of gene-introduced neural cells can be determined, for example, by preparing an rAAV vector packaging an rAAV vector genome incorporating any marker gene, and then administering this rAAV vector to a test animal to prepare the rAAV vector genome It can be measured by counting the number of neural cells expressing the integrated marker gene (or marker protein).
  • Known marker genes can be selected. Examples of such marker genes include LacZ gene, green fluorescent protein (GFP) gene, luminescent protein gene (such as firefly luciferase) and the like.
  • Other means or additional means to improve the inhibitory synaptic excitatory function of other therapeutic genes eg, means to enhance expression of neurexin 1 alpha, a binding partner of neuroligin 2, cells of neuroligin 2 Means to improve internal signaling can be expected.
  • means for reducing the function of excitatory synapse for example, suppressing the expression of a protein related to the action of excitatory synapse, specifically by antisense of neuroligin 1 Measures to reduce neuroligin 1 (Fang et al., Mol. Neurobiol. 2014 Nov.) and the like may also be useful.
  • the rAAV vector of the present invention may express different proteins for synaptic function control, and such different proteins include, for example, neutralizing antibodies (antigens to proteins and receptors present on synaptic membranes). And binding sites, Fab, Fab2, single chain antibodies (scFv) and the like. Examples of these antibody classes include IgG, IgM, IgA, IgD, or IgE.
  • therapeutic genes incorporated into the rAAV genome of the present invention for functional suppression of excitatory synapses may be targeted internalizing agents such as antisense molecules, ribozymes, interfering RNAs (iRNAs), microRNAs (miRNAs) It may be a polynucleotide for changing (eg, disrupting, reducing) the function of a sex gene, or a polynucleotide for changing (eg, reducing) the expression level of an endogenous protein.
  • iRNAs interfering RNAs
  • miRNAs microRNAs
  • the length of the antisense nucleic acid is 10 bases or more, 15 bases or more, 20 bases or more, and 100 bases or more And more preferably 500 bases or more.
  • the length of the antisense nucleic acid used is less than 5 kb, preferably less than 2.5 kb.
  • a ribozyme By using a ribozyme, the mRNA of a target protein can be specifically cleaved to suppress the expression of that protein.
  • various known documents can be referred to (for example, FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986, etc.).
  • RNAi is a phenomenon in which the expression of both the introduced foreign gene and the target endogenous gene is suppressed when a double stranded RNA having a sequence identical or similar to the target gene sequence is introduced into the cell.
  • Point to Examples of RNA used herein include double-stranded RNA that causes RNA interference of 21 to 25 bases in length, such as dsRNA (double strand RNA), siRNA (small interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), or miRNA. (microRNA).
  • RNA can also be locally delivered to a desired site by a delivery system such as liposome, or can be locally expressed using a vector that produces the double stranded RNA.
  • dsRNA, siRNA, shRNA or miRNA double-stranded RNA
  • methods for using, etc. are known from many documents (Japanese Patent Application 2002-516062; US Publication No. 2002 / 086356A; Nature Genetics, 24 (2), 180-183, 2000 Feb. et al.).
  • the polynucleotide contained in the vector of the present invention can be mediated by known internal ribosome entry site (IRES) sequences.
  • ITR internal ribosome entry site
  • the rAAV genome of the present invention is non-sc, it is possible to select a wider range of promoters and target genes, and it is also possible to use multiple target genes.
  • the total length of the polynucleotide packaged in the rAAV vector of the present invention is preferably about 5 kb or less (about 4.7 kb or less excluding the ITR region).
  • rAAV vector of the present invention for example, (a) first polynucleotide encoding a capsid protein (generally, AAV helper plasmid And (b) transfecting the cultured cells with a second polynucleotide (containing a therapeutic gene of interest) packaged within the rAAV vector of the present invention.
  • the preparation method of the present invention further comprises (c) transfecting a cultured cell with a plasmid encoding an adenovirus-derived factor called an adenovirus (AdV) helper plasmid, or infecting the cultured cell with adenovirus.
  • AdV adenovirus
  • the method may further comprise the steps of culturing the above-mentioned transfected cultured cells, and collecting the recombinant adeno-associated virus vector from the culture supernatant.
  • baculoviruses respectively containing the polynucleotides of the above (a) and (b) are prepared, and infected with insect cells such as Sf9 Also includes methods of production. Such methods are already known and are also utilized in the examples herein.
  • the nucleotide encoding the capsid protein of the present invention in the first polynucleotide (a) is preferably operably linked to a known promoter sequence operable in cultured cells.
  • a promoter sequence for example, cytomegalovirus (CMV) promoter, EF-1 ⁇ promoter, SV40 promoter and the like can be used appropriately.
  • CMV cytomegalovirus
  • EF-1 ⁇ promoter EF-1 ⁇ promoter
  • SV40 promoter SV40 promoter
  • known enhancer sequences, Kozak sequences, poly A addition signal sequences and the like may be suitably included.
  • the second polynucleotide (b) contains a therapeutic gene at a position operable with a neural cell specific promoter. Furthermore, known enhancer sequences, Kozak sequences, poly A addition signal sequences and the like may be suitably included.
  • This first polynucleotide may further comprise, downstream of the neural cell specific promoter sequence, a cloning site cleavable by various known restriction enzymes. More preferred is a multicloning site comprising multiple restriction enzyme recognition sites.
  • Those skilled in the art can incorporate the therapeutic gene of interest downstream of the neural cell specific promoter according to known genetic engineering procedures. For such gene manipulation procedures, see, for example, Molecular Cloning (Molecular Cloning 3rd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001).
  • a helper virus plasmid eg, adenovirus, herpes virus or vaccinia
  • the preparation method of the present invention further comprises the step of introducing an adenovirus (AdV) helper plasmid.
  • AdV adenovirus
  • the AdV helper is derived from the same species of virus as the cultured cells.
  • human AdV-derived helper virus vectors can be used.
  • AdV helper vectors commercially available ones (for example, AAV Helper-Free System of Agilent Technologies (Catalog No. 240071)) can be used.
  • rAAV vector of the present invention methods for transfecting the above-mentioned one or more types of plasmids into cultured cells can be carried out using various known methods such as calcium phosphate method, lipofection method, electroporation method, etc. it can. Such methods are described, for example, in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997.
  • compositions Comprising the rAAV Vectors of the Present Invention
  • the rAAV vectors of the present invention are useful for the treatment of neurological diseases, in particular, diseases associated with protein dysfunction at synapses (eg, schizophrenia, autism spectrum disorders, etc.) It can contain a gene.
  • An rAAV vector containing these genes can be administered, for example, in a blood vessel, passed through the blood-brain barrier, and integrated into nerve cells of the brain, spinal cord, and retina.
  • RAAV vectors containing such therapeutic genes are included in the pharmaceutical composition of the present invention.
  • a therapeutic gene for example, a polynucleotide encoding an antibody as described above, neurotrophic factor (NGF), growth factor (HGF), acidic fiber growth factor (aFGF), miRNA or the like can be selected.
  • NGF neurotrophic factor
  • HGF growth factor
  • aFGF acidic fiber growth factor
  • miRNA miRNA
  • the active ingredients of the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated singly or in combination, but may be formulated with a pharmaceutically acceptable carrier or a pharmaceutical additive to be provided as a formulation. it can.
  • the active ingredient of the present invention can be contained, for example, in an amount of 0.1 to 99.9% by weight in the preparation.
  • Pharmaceutically acceptable carriers or additives include, for example, excipients, disintegrants, disintegrants, binders, lubricants, coatings, dyes, diluents, solubilizers, solubilizers, etc. Agents, pH adjusters, stabilizers and the like can be used.
  • excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate and calcium carbonate, starch, disintegrating agents such as alginic acid, granulating binders such as polyvinyl pyrrolidone, lubricants, etc. are commonly used in the relevant field. It can be used with an excipient.
  • the active ingredient is used in combination with various sweeteners or flavoring agents, coloring agents or dyes, and, if necessary, also with emulsifying and / or suspending agents.
  • various sweeteners or flavoring agents, coloring agents or dyes and, if necessary, also with emulsifying and / or suspending agents.
  • preparations suitable for oral administration include, for example, powders, tablets, capsules, fine granules, granules, solutions or syrups and the like.
  • preparations suitable for parenteral administration include injections, intrathecal fluid, suppositories and the like.
  • parenteral administration a solution of the active ingredient of the present invention in either sesame oil or peanut oil or in an aqueous propylene glycol solution can be used.
  • the aqueous solution should be suitably buffered (preferably at a pH of 8 or more) as necessary, and the liquid diluent first rendered isotonic.
  • physiological saline can be used.
  • the prepared aqueous solutions are suitable for intravenous injection, while the oily solutions are suitable for intraarticular, intramuscular and subcutaneous injection.
  • the sterile preparation of all these solutions can be readily accomplished with standard pharmaceutical techniques well known to those skilled in the art.
  • the active ingredient of the present invention can also be administered topically, such as skin. In this case, it is desirable to administer topically in the form of a cream, jelly, paste, ointment according to standard pharmaceutical practice.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, and an appropriate dosage is selected according to various conditions such as the type of disease, patient's age and symptoms, administration route, purpose of treatment, presence or absence of concomitant drug. It is possible.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example but not limited to, 1 to 5000 mg, preferably 10 to 1000 mg, per day for an adult (for example, 60 kg of body weight). These daily doses may be administered in two to four divided doses.
  • vg vector genome
  • the rAAVs of the invention are capable of crossing the blood-brain barrier of a living body (including the uncompleted fetal and neonatal blood-brain barriers, and the established adult blood-brain barrier). Peripheral administration to an adult and a fetus or a neonate allows gene delivery of the rAAV of the present invention to neural cells such as the brain and spinal cord. Furthermore, rAAV vectors used in the present invention can target neural cells contained in adult brain, spinal cord and the like by peripheral administration.
  • peripheral administration includes intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, intracardiac administration, intramuscular administration, umbilical cord intravascular administration (for example, in the case of fetal administration), etc.
  • administration methods fluidly connected to the brain such as intrathecal administration
  • the rAAV vectors of the invention can be locally administered to a target site in the brain such as the hippocampus.
  • a simpler means of administration can be provided as compared to intracerebral administration.
  • kits for producing the rAAV of the present invention can include, for example, (a) a first polynucleotide for expressing a capsid protein VP1 or the like, and (b) a second polynucleotide packaged in a rAAV vector.
  • the first polynucleotide comprises a polynucleotide encoding an amino acid of SEQ ID NO :.
  • the second polynucleotide may or may not include the therapeutic gene of interest, but preferably may include various restriction enzyme cleavage sites for incorporating such therapeutic gene of interest. .
  • kits for producing a rAAV vector of the invention can further comprise any of the configurations described herein (eg, AdV helpers, etc.).
  • the kits of the invention may also further comprise instructions describing a protocol for making rAAV vectors using the kits of the invention.
  • the rAAV vector according to the present invention can also be used in combination with existing chemotherapeutic agents.
  • chemotherapeutic agents include phenytoin, carbamazepine, valproic acid, topiramate, lamotrigine, lufinamide, phenobarbital, diazepam, clonazepam, etosuccimide, zonisamide, gabapentin, levetiracetam, midazolam, clobazam, propofol.
  • chemotherapeutic agents include phenytoin, carbamazepine, valproic acid, topiramate, lamotrigine, lufinamide, phenobarbital, diazepam, clonazepam, etosuccimide, zonisamide, gabapentin, levetiracetam, midazolam, clobazam, propofol.
  • it can be expected to greatly reduce the dose of the
  • the therapeutic effects of the rAAV vectors of the invention for the measurement of therapeutic effects are determined using known means to determine that arousal is suppressed.
  • known means for example, analysis of behavioral level, analysis of pharmacokinetics of a labeled transmitter (such as GABA), measurement of excitatory postsynaptic potential or inhibitory postsynaptic potential, epilepsy induction by drugs or electrical stimulation Examples include, but are not limited to, measurement of threshold change, electroencephalogram, optical topography, positron emission tomography (PET), and the like. . 11.
  • the meanings of the terms used in the present specification for the terms in the present specification are as follows. In the present specification, terms that are not particularly described are intended to indicate the range to which the term that is ordinarily understood by those skilled in the art means.
  • viral vector As used herein, unless stated otherwise, the terms “viral vector”, “viral virion”, “viral particle” are used interchangeably.
  • neural system refers to an organ system comprised of neural tissue.
  • neural cells include at least nerve cells contained in the central nervous system such as the brain and spinal cord, and further include glial cells, microglia, astrocytes, It may also contain oligodendrocytes, ependymal cells, cerebrovascular endothelial cells and the like.
  • nucleic acid As used herein, the term “polynucleotide” is used interchangeably with “nucleic acid”, “gene” or “nucleic acid molecule” and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • nucleotide sequence is used interchangeably with “nucleic acid sequence” or “base sequence” and is the sequence of deoxyribonucleotides (abbreviated A, G, C and T) It is shown as.
  • a polynucleotide or a fragment thereof comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 means a polynucleotide or a fragment thereof comprising a sequence represented by each deoxynucleotide A, G, C and / or T of SEQ ID NO: 1 Be done.
  • the "virus genome” and the “polynucleotide” according to the invention may each be present in the form of DNA (eg cDNA or genomic DNA) but may optionally be in the form of RNA (eg mRNA).
  • the viral genomes and polynucleotides used herein may each be double stranded or single stranded DNA. In the case of single stranded DNA or RNA, it may be the coding strand (also known as the sense strand) or the non-coding strand (also known as the antisense strand).
  • polypeptide As used herein, “protein” and “polypeptide” are used interchangeably and are intended to be polymers of amino acids.
  • the polypeptide used in the present specification has the N-terminus (amino terminus) at the left end and the C-terminus (carboxy terminus) at the right end according to the peptide label convention.
  • the partial peptide of the polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the partial peptide of the present invention) is a partial peptide of the above-mentioned polypeptide of the present invention, preferably, the above-mentioned poly of the present invention It has the same properties as the peptide.
  • the term "plasmid” refers to various known genetic elements such as, for example, plasmids, phages, transposons, cosmids, chromosomes and the like. Plasmids can replicate in a particular host and transfer gene sequences between cells.
  • the plasmid contains various known nucleotides (DNA, RNA, PNA and a mixture thereof), and may be single-stranded or double-stranded, but preferably double-stranded.
  • the term "rAAV vector plasmid” is intended to include the duplex formed by the rAAV vector genome and its complement unless otherwise stated.
  • the plasmids used in the present invention may be linear or circular.
  • the term "packaging” refers to events including preparation of single-stranded viral genome, assembly of coat protein (capsid), and encapsidation of viral genome and the like.
  • the appropriate plasmid vector usually multiple plasmids
  • the recombinant viral particles ie, viral virions, viral vectors
  • rAAV intravascular-administered adeno-associated virus
  • rAAV Recombinant Adeno-Associated Virus
  • the vector used in this example introduces the tyrosine mutation (Y446 ⁇ F) into the capsid of AAV9 released previously (AAV9 capsid, AVR3 ITR) ) Has the Synapsin I promoter (WO 2012/057363).
  • rAAV vector expressing Neuroligin 2 with FLAG tag (DDDDK) sequence linked to N-terminus was prepared (AAV9 / 3-Syn1-FLAG (DDDDK) -NL2) , Was administered to the subject animals.
  • mice (6 weeks old, male, 22-32 g body weight) were used.
  • Seizure intensity 1 point no seizure 2 points: raise tail or shake body only 3 points: clear seizure but keep posture without falling 4 points: violent seizure, can not keep posture, falls sideways It scored as.
  • Duration of seizure 1 point no seizure 2 points: 1-10 seconds 3 points: 11-20 seconds 4 points: 21-30 seconds 5 points: 31-60 seconds 6 points: 61 seconds- It scored as.
  • the incidence rate, mean seizure time, mean seizure intensity, mean seizure time ⁇ intensity of each group were evaluated weekly
  • Electrodes were attached to both ears at 5 (before vector administration), 12, 18 and 22 weeks of age, and the following parameters were used for electrical stimulation (Neuron SQ Neuropack S1: duration: 1 ms , interval: 50 ms, 10 train, strength: up to 50 mA every 5 mA to 5 mA) to induce epileptic seizure and measure the seizure threshold. If a seizure was not induced at 50 mA, the seizure threshold was evaluated as 60 mA. The topical administration group was performed at 5, 12 and 22 weeks of age only.
  • ⁇ rAAV9-GFP expression and cell identification A 40 ⁇ m sagittal section was prepared with a freezing microtome, and GFP expression in each part of the brain was confirmed with a fluorescence microscope. For identification of cells expressing GFP, double staining with the following markers was performed. Neuronal cells; NeuN or MAP2, glial cells; GFAP, inhibitory interneurons; Parvalbumin
  • ⁇ rAAV9-NL2 expression and cell identification As in the case of GFP confirmation, a 40 ⁇ m sagittal section was prepared, and the transgene NL2 expression was confirmed by FLAG (DDDDK) antibody staining.
  • the FLAG antibody was purchased from Abcam Co., Ltd., and expression was confirmed by fluorescence microscopy by image processing using a secondary antibody with Alexafluor 488.
  • Hippocampal slice preparations were used to measure changes in intracellular Ca 2+ influx at ischemic load by fluorescence change of rhod 2-AM (DOJINDO catalog number: R002). Intracellular Ca 2+ influx that occurs in the hippocampus due to ischemic load was significantly elevated in the CA3 region compared to DDY mice in the EL mice, suggesting vulnerability of the inhibitory system in the CA3 region.
  • the expression in the EL hippocampus of the intercalated cells which are the excitation inhibitory system was examined histologically by immunostaining with a parvalbumin antibody (catalog number: LS-C39101).
  • rAAV vector expressing a gene of a suppression system synapse related molecule is prepared, the vector is administered to EL by stereotactic hippocampal injection and intravascular injection, and histologically by staining using a FLAG antibody.
  • the distribution in the brain was observed (Fig. 1a, 1b).
  • FLAG-tagged NLGN2 was widely expressed in neurons of hippocampus and cerebral cortex by intravascular administration of the vector of the present invention, it could be confirmed that gene delivery by rAAV was good.
  • the expression of the target gene was observed in hippocampal neurons in the hippocampus injection group and in all brain neurons including the hippocampus in the intravascular administration group (results not shown).
  • the NLGN 2 administration group sometimes showed significant differences in seizure frequency, but there was no significant difference in the overall effects (FIGS. 7 to 11).
  • significant differences were found in the portions marked with “*” and “**” in the figure.
  • the intracardiac administration group tended to be more effective in suppressing epilepsy in all of the seizure frequency, seizure time and seizure intensity.
  • the target molecule was delivered to neurons throughout the brain by the intravascular administration type AAV vector.
  • the potential of non-invasive epilepsy gene therapy which is more useful as a therapeutic method, does not change the threshold of electrical stimulation while suppressing the epileptic seizure with the excitatory action of this molecule.
  • rAAV vector of the present invention By using the rAAV vector of the present invention, it can be expected to treat (reduce, ameliorate, repair, etc.) genetic defects (including innate and acquired ones) in neural cells.
  • SEQ ID NO: 1 human neuroligin 2 nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 2 human neuroligin 2 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 3 mouse neuroligin 2 nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 4 mouse neuroligin 2 amino acid sequence
  • SEQ ID NO 5 rat neuroligin 2 nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 6 rat neuroligin 2 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 7 nucleotide sequence of Flag tagged mouse neuroligin 2
  • SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of Flag tagged mouse neuroligin 2
  • SEQ ID NO: 9 amino acid of AAV1 capsid protein Y445F variant
  • SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of AAV2 capsid protein Y444F variant
  • SEQ ID NO: 11 Amino acid sequence of AAV 9 capsid protein Y446F variant

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Abstract

てんかん等の神経性疾患に対する新規な遺伝子治療手段を提供する。本発明は、生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質、好ましくはニューロリギン２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、てんかん等の神経性疾患の治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクター、これを含む医薬組成物などが提供する。また、この組換えベクターを持ちいたてんかん等の疾患治療方法も提供される。

Description

てんかん治療のためのアデノ随伴ウイルスビリオン
　本発明は、神経性疾患のための遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンに関する。より具体的には、本発明は、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害（注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群）などの神経精神疾患の治療のためのrAAVに関する。
　てんかんは、脳神経細胞の異常興奮が比較的限定された部位に生じた結果、体の一部にけいれんが起こる部分発作、またはその異常興奮が全皮質に波及するために全身けいれん生じる全般発作（強直間代発作など）に分類される。全般発作では意識消失が生じる。けいれんは起こさず、意識障害のみまたは異常な精神症状（精神運動発作など）を起こすこともある疾患である。現在の一般的な治療手段としては、抗てんかん薬（フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸など）による薬物療法が主体となるが、難治のものについては外科的治療が行われている。
　てんかんの症例のうち約３０％は、薬物治療によっても発作が抑制されない難治性疾患である。内側側頭葉てんかんでは、側頭葉切除術などの外科治療が有効な場合があるが、両側の海馬を切除すると記銘力低下を生じるため、発作焦点が両側海馬にあるような場合、手術適応にならない。また、小児てんかん性脳症（West症候群など）などの発作焦点の不明な難治性てんかん患者は、日本で約10万人存在すると見込まれ、このような患者には根治的治療法がない。
　このような難治性のてんかんに対して、神経細胞を対象とする遺伝子治療により各疾患を治療する方法も検討されている。神経細胞を対象として治療用遺伝子を送達するための手段（ベクター）として、遺伝子組換えされたアデノ随伴ウイルス（rAAV）を用いる手段が公知である。そのようなrAAVとしては、例えば、国際公開公報2012/057363、2008/124724、2003/093479などに記載のものが挙げられる。
　シナプス関連タンパク質を対象として神経細胞の活動を調整する手段が研究されている。例えば、Kohl, Cらの文献（非特許文献１）には、神経細胞のシナプス局在タンパク質であるニューロリギン２（NLGN2）を発現するrAAVベクターを海馬に直接投与して、NLGN2の過剰発現を行った結果、社会的行動の変化及び抑制性シナプス伝達を生じたことが示されているが、具体的な疾患の治療に関しては説明されていない。Moe’らの文献（非特許文献２）には、ニューロペプチドYを発現するrAAVベクターを用いててんかん治療を行って、てんかん症状が緩和されたことが示されている。また、Fangらの文献（非特許文献３）には、神経細胞のシナプス局在タンパク質であるニューロリギン１（NLGN1）のアンチセンスを発現するrAAVベクターを海馬に直接投与した結果、てんかん症状が緩和されたことが示されている。
国際公開公報2012/057363 国際公開公報2008/124724 国際公開公報2003/093479
Kohl, C.ら、PLOS ONE, 2013 Feb., vol. 8, e56871 Moe’, F.M.ら、JASPER’S BASIC MECHANISMS OF THE EPILEPSY, 2012, Kullmann, D.M.ら、Nature Reviews Neurology、2014, vol. 10, page 300-304 Fangら、Mol. Neurobiol. 2014 Nov.27[Epub]
　てんかんを遺伝子導入によって治療するための新規の医薬が求められている。さらに、副作用が少ない、より平易な投与が可能であるなど、実際の投薬において有利であることが望ましい。
　本願発明者らは、てんかんの遺伝子治療を目指して鋭意努力した結果、抑制性シナプスの興奮抑制能を向上させるタンパク質であるニューロリギン２をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターを調製して、このベクターを生体に投与するとてんかん症状が改善することを見出して、本願発明を完成させた。
　すなわち、本出願は、以下の記載される、てんかん等の神経細胞に関する疾患の治療のための、以下に示す組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクター、それを含む医薬組成物などを提供する。
［１］　生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害（注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群）からなる群より選択される疾患の治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［２］　前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列、またはこれら配列と約９０％以上の同一性を有してニューレキシンと結合するアミノ酸配列を含むニューロリギン２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、［１］に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［３］　前記疾患がてんかんである、［１］又は［２］に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［４］　前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸配列中446位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス組換えベクター。
［５]　前記ポリヌクレオチドが、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター配列、L7プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD65/GAD67）プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、［１］～［４］のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［６］　前記ポリヌクレオチドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8、およびAAV9からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ITR）を含む、［１］～［５］のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［７］　前記ポリヌクレオチドが、興奮性シナプスの興奮を抑制するためのポリヌクレオチドをさらに含む、［１］～［６］のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
［８］　［１］～［７］のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス組換えベクターを含む、医薬組成物。
［９］　脳内投与されるための、［８］に記載の医薬組成物。
［１０]　髄腔内投与されるための、［８］に記載の医薬組成物。
［１１］　末梢投与されるための、［８］に記載の医薬組成物。
［１２］　神経精神疾患に係る化学療法剤と併用するための、［８］～［１１］のいずれかに記載の医薬組成物。
［１３］　生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターを生体に投与することを含む、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害（注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群）からなる群より選択される疾患の治療方法。
［１４］化学療法と併用される、［１３］に記載の治療方法
　本願発明に係るシナプス抑制系の機能増強を遺伝子治療によって行うことは、てんかんの治療法として有用である。小児てんかん性脳症（West症候群など）などの発作焦点の不明な難治性てんかん患者に対しても、本願発明の組成物は有効であることが期待できる。
図１ａは、血管投与型rAAVを投与したマウスにおける組換えニューロリギン２タンパク質の発現を、組織切片に対するFLAG抗体染色によって確認した結果を示す。図１ｂは、コントロールを投与したマウスにおける組換えニューロリギン２の発現を検出した結果を示す。 ３種の心腔内投与（NLGN2を発現する血管投与型rAAV、GFPタンパク質を発現する血管投与型rAAV、および生理食塩水の心腔内投与）を行ったマウスのてんかん発作頻度を、横軸に記載される週齢において測定した結果を示す。 上記３種の心腔内投与を行ったマウスの発作時間の結果を示す。 上記３種の心腔内投与を行ったマウスの発作強度の結果を示す。 図３及び図４に記載される結果の発作時間×発作強度の集計結果を示す。 上記３種の投与を行ったマウスを各週齢において電気刺激した際の閾値の結果を示す。 NLGN2を発現する血管投与型rAAV、GFPタンパク質を発現する血管投与型rAAV、および生理食塩水を海馬に局所投与したマウス（図７ａ）、ならびにNLGN2を発現する血管投与型rAAV及びGFPタンパク質を発現する血管投与型rAAVを心腔内投与したマウス（図７ｂ）のてんかんの発作頻度を、横軸に記載される週齢において測定した結果を示す。 図７のマウスについて発作時間を測定した結果を示す。 図７のマウスについて発作強度を測定した結果を示す。 図７のマウスについて発作時間×発作強度を集計した結果を示す。 図７のマウスについて、各週齢において測定した電気刺激の閾値を示す。
　本出願において、生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害（注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群）からなる群より選択される疾患の治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクターが提供される。
１．興奮性シナプス及び抑制性シナプスにおける興奮制御について
　本出願において、シナプスとは、神経細胞の軸索終末等が膨らんだシナプス小頭部と、その標的のニューロンまたは筋細胞との接合部を指す。生体において、シナプスには、興奮を伝達する興奮性シナプスと、興奮の伝達を抑制する抑制性シナプスとが存在する。また、大部分のシナプスは、化学物質の伝達によって媒介される化学シナプス（信号伝達が遅い）である。もう１つの型は、時間的に速い応答を示す電気シナプスであるが、成熟哺乳類の中枢神経では余り見られない。
　興奮性シナプスにおいて、グルタミン酸、アスパラギン酸、システン酸、ホモシステンサン等のアミノ酸などが伝達物質として機能して、興奮性シナプス後電位（excitatory postsynaptic potential: EPSP）が発生し、その電位が閾値を超えると興奮（インパルス）の伝達が行われる。一方、抑制性シナプスにおいて、γ－アミノ酪酸（GABA）、グリシン、タウリン、アラニン、シスタチオニン、セリン等のアミノ酸などが伝達物質として機能して、抑制性シナプス後電位（inhibitory postsynaptic potential: IPSP）が発生し、シナプス後ニューロンのインパルスを抑制するか、発生しにくくすると考えられている。EPSPやIPSPには、速い時間経過（全経過100ミリ秒以内）を示すもの（fast EPSPまたはfast IPSP）と、数10秒から数10分続く遅い遅い時間経過を示すもの（slow EPSPまたはslow IPSP）とが存在する。ここで、速いIPSPでは、GABAA受容体（Cl-）チャネルに関するGABAやグリシン受容体（Cl-）チャネルに関するグリシンが作用し、遅いIPSPの伝達物質としては、GABAB受容体を介するGABABやアセチルコリンやカテコールアミンが作用することが知られている。
　抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質としては、シナプスの安定化に関与するニューロリギン２及びニューレキシン、GABA受容体、GABA生合成に関与するグルタミン脱炭酸酵素（GAD）、グリシン輸送に関与するNa+チャネルタンパク質及びCl-チャネルタンパク質、ニューロペプチドＹ、足場タンパク質のゲフィリン、膜貫通蛋白質で抑制性シナプス形成に関与するSLITRK3、SLITRK3と結合する受容体型チロシンホスファターゼのPTPRDが挙げられる。本発明のベクターが含むポリヌクレオチドは、抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質として、好ましくはニューロリギン２タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号２、４又は６）を含む。
　ニューロリギン（NLGN）とは、シナプス後膜に存在する膜タンパク質ファミリーをいい、一般にはニューロリギン１～４に分けられる。これらニューロリギンは各々、シナプス前膜の細胞接着因子ニューレキシン（Neurexin：NRXN)タンパク質と特異的に結合してシナプス前末端とシナプス後部とを繋いでいる。ニューロリギン１は興奮性シナプスに局在しており、興奮性シナプス伝達を媒介していると考えられている。一方、ニューロリギン２は、抑制性シナプスに局在しており、抑制性シナプス伝達を媒介していると考えられている。また、ニューロリギン３は興奮性シナプスと抑制性シナプスとの両方、心臓、膵臓等に発現しており、ニューロリギン４は心臓、肝臓等に発現している。
　ニューロリギンの結合パートナーであるニューレキシンタンパク質は、一般にはニューレキシン１α～３α及び１β～３βに分けられる。ここで、α体とβ体とは、同じ遺伝子から異なるプロモーターの作用によって生じるそれぞれ長鎖タンパク質と短鎖タンパク質である。本願発明において用いるニューロリギン２はニューレキシン１αと機能的に結合する。
　本願発明において用いられるニューロリギン２タンパク質のアミノ酸配列としては、公知のものが利用できる。このようなアミノ酸配列としては、例えば、Genbankアクセッション番号AAM46111（ヒト）、EDL12455（マウス）、EDMO4903（ラット）が挙げられる。他に利用可能な動物種としては、例えば、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウマなどの哺乳動物由来のものが挙げられる。ヒト、マウス及びラットのニューロリギン２タンパク質のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２、４及び６に記載される。
　また、本願発明において用いられるニューロリギン２タンパク質は、配列番号２、４又は６アミノ酸配列に対して、約90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ生理条件下でニューレキシン１αタンパク質と結合可能であるタンパク質が含まれる。上記数値は一般的に大きい程好ましい。なお、ヒトとマウスのニューロリギン２のアミノ酸配列は98％以上同一であり、ヒトとラットのニューロリギン２のアミノ酸配列は91％以上同一である。本発明において、変異タンパク質と元のタンパク質とが同程度に機能する（例えば、同程度の結合能を示す）とは、例えば、比活性が約0.01～100、好ましくは約0.5～20、より好ましくは約0.5～2である範囲内であることを意味するが、これらに限定されない。
　さらに、本願発明において用いられるニューロリギン２タンパク質は、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列または上記同一性を有するアミノ酸配列において、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含み、かつ生理条件下でニューレキシン１αタンパク質と結合可能であるタンパク質が含まれる。上記のアミノ酸の欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このようなタンパク質としては、例えば、配列番号２、４又は６のアミノ酸配列に、例えば、1～50個、1～40個、1～39個、1～38個、1～37個、1～36個、1～35個、1～34個、1～33個、1～32個、1～31個、1～30個、1～29個、1～28個、1～27個、1～26個、1～25個、1～24個、1～23個、1～22個、1～21個、1～20個、1～19個、1～18個、1～17個、1～16個、1～15個、1～14個、1～13個、1～12個、1～11個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個または１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ生理条件下でニューレキシンαタンパク質と結合可能なタンパク質が挙げられる。タンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。
　本発明のタンパク質（ポリペプチド）において相互に置換可能なアミノ酸残基の例を以下に示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸；　C群：アスパラギン、グルタミン；　D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸；　E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン；　F群：セリン、スレオニン、ホモセリン；　G群：フェニルアラニン、チロシン。アミノ酸残基が置換されたニューロリギンタンパク質は、通常の遺伝子操作技術など、当業者に公知の方法に従って作製することができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などを参照することができる。
　また、本願発明に用いられる好ましいポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１、３または５のポリヌクレオチド配列において、１個以上（例えば、1～50個、1～40個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、1～10個、1～9個（1～数個）、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、1～2個、1個など）のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を有するポリヌクレオチドであって、配列番号２、４または６のアミノ酸配列を含むタンパク質、あるいは配列番号２、４または６のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みニューレキシン１αと結合可能であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。これら欠失、置換、挿入及び付加のうち２種以上の組合わせを同時に含んでもよい。上記ヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的に小さい程好ましい。また、本願発明において好ましいポリヌクレオチドは、例えば、配列番号：７、９もしくは１１またはその相補配列にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドであって、配列番号２、４または６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、あるいは配列番号２、４または６のアミノ酸配列において上記の１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を含みニューレキシンと結合可能であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
　ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、製造業者により提供される使用説明書などに記載の方法に従って行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するDNAが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：７、９又は１１のヌクレオチド配列と、例えば、70%以上、80%以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。
　アミノ酸配列やポリヌクレオチド配列の同一性または相同性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268,1990； Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873, 1993）を用いて決定できる。BLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al: J Mol Biol 215: 403,1990）。BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTXを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
２．本発明の対象疾患について
　本願発明は、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害（注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群）からなる群より選択される疾患、とりわけてんかんの治療に有用であるrAAVベクターを提供するものである。
　てんかんとは、大脳の神経細胞の過剰な同期的発射活動が起こることによって、同一個人の中では同じ型の臨床発作(全身強直－間代発作、欠神発作、幻聴発作、四肢の一部の強直発作など)が繰り返す病態を指す。1981年の国際抗てんかん連盟 International Leaque Against Epilepsy(ILAE)の分類では、臨床発作は部分発作(単純部分発作、複雑部分発作)、全般発作(欠神発作、ミオクロニー発作、強直－間代発作、脱力発作)、分類不能発作に区分されている。また、1989年のILAEの「てんかん、てんかん症候群、および関連発作性疾患の分類」では、局在関連性(年齢関連性、症候性、潜因性に下位分類)、全般性(特発性、潜因性あるいは症候性、症候性に下位分類)、焦点性か全般性か決定できないもの、特殊症候群(熱性痙攣など)に分けられている。
　また、１歳前後の乳児期に始まる短時間の前屈型発作を主徴とするてんかんとして、ウエスト症候群（または点頭痙攣）がある。この疾患は、上体と頭部を強く前屈する瞬間的強直発作が続けて起きるシリーズを形成する。ウエスト症候群の病因は多様であり、先天脳奇形、結節性硬化症など神経皮膚症候群、ビタミンB6欠乏症など先天代謝異常などが公知である。精神発達遅滞(精神遅滞)を伴うことが多く、成長に伴って全身強直－間代発作(大発作てんかん)を主とする全般てんかんやレノックス症候群、側頭葉てんかんなど他の型のてんかんに移行することが普通である。本発明のrAAVベクターは、ウエスト症候群に対して治療効果を有し得る。
３．本発明の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクター
　本願発明において、シナプスの機能制御に用いられる遺伝子を神経系細胞に送達するためのベクターとしては、WO 2012/057363に記載される、末梢投与によっても神経細胞に効率的に遺伝子送達できる組換えアデノ随伴ウイルスベクター（本明細書中、血管投与型ベクターともいう）、あるいはWO 2008/124724などに記載されるものを用いることができる。本発明のrAAVベクターは、生体の血液脳関門を通過可能であり、したがって血液脳関門を介して脳に送達される投与手段、例えば患者への末梢投与などによって、患者の脳、脊髄などの神経系細胞に目的の治療用遺伝子を導入可能である。また、髄腔内投与や脳内の標的部位に直接投与することも可能である。
　本発明のrAAVベクターは、好ましくは由来の天然のアデノ随伴ウイルス１型（AAV1）、２型（AAV2）、３型（AAV3）、４型（AAV4）、５型（AAV5）、６型（AAV6）、７型（AAV7、８型（AAV8）、９型（AAV9）などより作製できるが、これらに限定されない。これらのアデノ随伴ウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、それぞれ、GenBank登録番号：AF063497.1（AAV1）、AF043303（AAV2）、NC_001729(AAV3)、NC_001829.1（AAV4）、NC_006152.1（AAV5）、AF028704.1（AAV6）、NC_006260.1（AAV7）、NC_006261.1（AAV8）、AY530579（AAV9）のヌクレオチド配列を参照できる。これらのうち、２型、３型、５型および９型がヒト由来である。本発明において、特にAAV1、AAV2またはAAV9に由来するカプシドタンパク質（VP1、VP2、VP3など）を利用することが好ましい。AAV1とAAV9はヒト由来のAAVのうちで神経細胞への感染効率が比較的高いことが報告されている(Taymans, et al., Hum Gene Ther 18:195-206, 2007など)。
　本発明に用いるrAAVベクターが含むカプシドタンパク質は、好ましくはWO 2012/057363やWO 2008/124724などに記載されるように、野生型のアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのチロシンがフェニルアラニンなどの別のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有する変異体タンパク質である。例えば、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列（配列番号９）、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中444位のチロシンがフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列（配列番号１０）、または野生型のAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸配列中446位のチロシン残基がフェニルアラニン残基に置換されているアミノ酸配列（配列番号１１）を有する変異タンパク質が挙げられる（WO 2012/057363、WO 2008/124724）。このようなカプシドタンパク質は、単独で又は他のカプシドタンパク質メンバー（例えば、VP2、VP3など）と一緒になってキャプソメアを形成する機能を有する。また、当該キャプソメア内には、神経系細胞に送達されるための目的の治療用遺伝子などを含むポリヌクレオチドがパッケージングされる。
　本発明のrAAVベクターは、血流中に投与される場合、成体及び胎児を含む生体の血液脳関門を通過できる。本発明において、遺伝子導入標的としての神経系細胞は、少なくとも脳、脊髄など中枢神経系に含まれる神経細胞を含み、さらに、神経膠細胞、小膠細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、脳室上衣細胞、脳血管内皮細胞などを含んでもよい。遺伝子導入される神経系細胞のうち神経細胞の割合は、好ましくは、70%以上、80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上、または100％である。
　本発明において用いられるRepタンパク質は、ITR配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型AAVゲノム（又はrAAVゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能など公知の機能を同程度に有する限り、上記と同様の数のアミノ酸配列同一性を有してもよいし、上記と同様の数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加を含み得る。機能的に同程度の範囲については、上記の比活性に関する説明において記載される範囲が挙げられる。本発明において、好ましくは、公知のAAV3由来のRepタンパク質が使用される。
　本発明において用いられるRepタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ITR配列を認識してその配列に依存してゲノム複製を行う機能、ウイルスベクター内へと野生型AAVゲノム（又はrAAVゲノム）をリクルートしてパッケージングする機能、本発明のrAAVベクターを形成する機能などの公知の機能を同程度に有するRepタンパク質をコードする限り、上記と同様の数の同一性を有してもよいし、上記と同様の数のヌクレオチドの欠失、置換、挿入および／または付加を含んでもよい。機能的に同程度の範囲については、上記の比活性に関する説明において記載される範囲が挙げられる。本発明において、好ましくは、AAV3またはAAV2由来のrep遺伝子が使用される。
　本発明の１実施形態において、上記の野生型AAVゲノムの内部領域にコードされるカプシドタンパク質VP1など（VP1、VP2および／またはVP3）、およびRepタンパク質は、これをコードするポリヌクレオチドがAAVヘルパープラスミドに組込まれて用いられる。本発明で用いるカプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）、ならびにRepタンパク質は、必要に応じて１種、２種、３種またはそれ以上のプラスミドに組込まれていてもよい。場合によって、これらのカプシドタンパク質およびRepタンパク質のうちの1種以上がAAVゲノムに含まれてもよい。本発明において、好ましくは、カプシドタンパク質（VP1、VP2および／またはVP3）およびRepタンパク質は全て、１種のポリヌクレオチドにコードされ、AAVヘルパープラスミドとして提供される。
　本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）は、野生型ゲノムの5'側および3'側に位置するITRの間に位置する内部領域（すなわち、rep遺伝子及びcap遺伝子の一方または両方）のポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（治療用遺伝子）およびこのポリヌクレオチドを転写するためのプロモーター配列などを含む遺伝子カセットによって置換することにより作製できる。好ましくは、5'側および3'側に位置するITRは、それぞれAAVゲノムの5’末端および3’末端に位置する。好ましくは、本発明のrAAVゲノムは、5’末端および3’末端に位置するITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8またはAAV9のゲノムに含まれる5'側ITRおよび3'側ITRを含む。一般的に、ITR部分は容易に相補配列が入れ替わった配列(flip and flop structure)をとるため、本発明のrAAVゲノムに含まれるITRは、5’と3’の方向が逆転していてもよい。本発明のrAAVゲノムにおいて、内部領域と置き換えられるポリヌクレオチド（すなわち、治療用遺伝子）の長さは、元のポリヌクレオチドの長さと同程度が実用上好ましい。すなわち、本発明のrAAVゲノムは、全長が野生型の全長である5kbと同程度、例えば約2～6kb、好ましくは約4～6kbであることが好ましい。本発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子の長さは、プロモーター、ポリアデニレーションなどを含めた転写調節領域の長さ（例えば、約１～1.5kbと仮定する場合）を差し引くと、好ましくは長さが約0.01～3.7kb、より好ましくは長さが約0.01～2.5kb、さらに好ましく約0.01～2kbであるが、これに限定されない。
　一般的に、組換えアデノ随伴ウイルスベクター内にパッケージングされるポリヌクレオチドは、一本鎖である場合には目的の治療用タンパク質を発現するまで時間（数日）を要する場合がある。この場合、導入される治療用遺伝子を、自己相補性を有するsc（self-complementary)型となるように設計して、より短期間に効果を示すことも可能である。具体的な詳細については、例えば、Foust KD, et al.(Nat Biotechnol. 2009 Jan;27(1):59-65)などに記載されている。本発明のｒAAVベクター中にパッケージングされているポリヌクレオチドは、非sc型であってもよいしsc型であってもよい。
　１実施形態において、本発明のrAAVベクターは、好ましくは、神経系細胞特異的なプロモーター配列およびそのプロモーター配列と作動可能に連結された治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む（すなわち、そのようなポリヌクレオチドがパッケージングされている）。本発明に用いるプロモーター配列としては、神経系細胞に特異的なプロモーター配列は、例えば、神経細胞、神経膠細胞、乏突起膠細胞、脳血管内皮細胞、小膠細胞、脳室上皮細胞などに由来するが、これらに限定されない。このようなプロモーター配列としては、具体的には、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質プロモーター配列、L7プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列、グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD65/GAD67）プロモーター配列が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のrAAVベクターにおいて、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列などのプロモーター配列も使用され得る。上記のこれらプロモーター配列は、単独であっても任意の複数の組み合わせであってもよい。また、CMVプロモーター、CAGプロモーターなどの通常使用される強力なプロモーター配列であってもよい。本発明において特に好ましいプロモーター配列としては、シナプシンＩプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、L7プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）が挙げられる。さらに、mRNAの転写、タンパク質への翻訳などを補助するエンハンサー配列、Kozak配列、適切なポリアデニル化シグナル配列などの公知の配列を含んでもよい。
　本発明のrAAVゲノムに組込まれる目的の治療用遺伝子は、高い効率で神経系細胞に送達され、その細胞のゲノム中に組込まれる。本発明のrAAVベクターを使用する場合、従来のrAAVベクターを用いる場合と比較して、約10倍以上、約20倍以上、約30倍以上、約40倍以上または約50倍以上の数の神経細胞に遺伝子導入可能である。遺伝子導入された神経細胞の数は、例えば、任意のマーカー遺伝子を組込んだrAAVベクターゲノムをパッケージングするrAAVベクターを作製し、次いでこのrAAVベクターを被検動物に投与して、rAAVベクターゲノムに組込まれたマーカー遺伝子（またはマーカータンパク質）を発現する神経系細胞の数を計測することによって測定可能である。使用されるマーカー遺伝子としては公知のものを選択できる。このようなマーカー遺伝子としては、例えば、LacZ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子、発光タンパク質遺伝子（ホタルルシフェラーゼなど）などが挙げられる。
４．他の治療用遺伝子について
　抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させる他の手段または追加の手段として、例えば、ニューロリギン２の結合パートナーであるニューレキシン１αの発現を増強させる手段、ニューロリギン２の細胞内シグナル伝達を向上させる手段などが期待できる。あるいは、そのような他の手段または追加の手段として、興奮性シナプスの機能を低下させる手段、例えば興奮性シナプスの作動に関するタンパク質の発現を抑制すること、具体的にはニューロリギン１のアンチセンスによってニューロリギン１を低減させる手段（非特許文献４：Fangら、Mol. Neurobiol. 2014 Nov.）等もまた有用となり得る。
　本発明のrAAVベクターは、シナプスの機能制御のための異なるタンパク質を発現させてもよいが、このような異なるタンパク質としては、例えば、シナプスの膜上に存在するタンパク質やレセプターに対する中和抗体（抗原結合部位、Fab、Fab2、単鎖抗体（scFv）などを含む）などが挙げられる。これら抗体のクラスとしては、IgG、IgM、IgA、IgD、またはIgE等が挙げられる。
　例えば興奮性シナプスの機能抑制のために、本発明のrAAVゲノムに組込まれる治療用遺伝子は、アンチセンス分子、リボザイム、干渉性RNA（iRNA）、マイクロRNA(miRNA)のような、標的とする内在性遺伝子の機能を変化（例えば、破壊、低下）させるためのポリヌクレオチド、または内在性タンパク質の発現レベルを変化（例えば、低下）させるためのポリヌクレオチドであってもよい。例えば、アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、好ましくは、アンチセンス核酸の長さは、10塩基以上、15塩基以上、20塩基以上であり、100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンス核酸の長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
　リボザイムを用いることによって、目的のタンパク質のmRNAを特異的に切断してそのタンパク質の発現を抑制できる。このようなリボザイムの設計については、種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986など参照）。
　また、「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるRNAとしては、例えば、21～25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)、shRNA(short hairpin RNA)、又はmiRNA (microRNA)が挙げられる。このようなRNAは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA、shRNA又はmiRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.等参照）。
　これら他の治療用遺伝子を用いるために、例えば、本発明のベクターが含むポリヌクレオチドに、公知のinternal ribosome entry site(IRES)配列を介在させることができる。本発明のrAAVゲノムが非sc型である場合、より広範な長さのプロモーターと目的遺伝子とを選択でき、複数の目的遺伝子を利用することも可能である。本発明のrAAVベクター中にパッケージングされるポリヌクレオチドの全長は約5kb以下（ITR領域を除いて約4.7kb以下）であることが好ましい。
５．本発明のrAAVベクターの調製
　本発明のrAAVベクターを調製する方法としては一般的なものを利用することができ、例えば、(a)カプシドタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド（一般に、AAVヘルパープラスミドと称される）、および(b)本発明のrAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチド（目的の治療用遺伝子を含む）を、培養細胞にトランスフェクトする工程を含むことができる。本発明における調製方法はさらに、(c)アデノウイルス（AdV）ヘルパープラスミドと称されるアデノウイルス由来因子をコードするプラスミドを培養細胞にトランフェクトする工程、またはアデノウイルスを培養細胞に感染させる工程も含むことができる。さらに、上記のトランスフェクトされた培養細胞を培養する工程、および培養上清より組換えアデノ随伴ウイルスベクターを収集する工程を含むこともできる。(d)さらに、本発明のrAAVベクターの調製方法は、上記(a)(b)のポリヌクレオチドをそれぞれ含むバキュロウイルスを作製し、昆虫細胞であるSf9などに感染させることにより、rAAVを大量に産生する方法も含む。このような方法は既に公知であり、本明細書の実施例においても利用される。
　第１のポリヌクレオチド(a)において本発明のカプシドタンパク質をコードするヌクレオチドは、好ましくは、培養細胞において作動可能である公知のプロモーター配列に作動可能に結合される。このようなプロモーター配列としては、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、EF-1αプロモーター、SV40プロモーターなどを適宜使用することができる。さらに、公知のエンハンサー配列、Kozak配列、ポリA付加シグナル配列などを適宜含み得る。
　第２のポリヌクレオチド(b)は、神経系細胞特異的プロモーターと作動可能である位置に治療用遺伝子を含む。さらに、公知のエンハンサー配列、Kozak配列、ポリA付加シグナル配列などを適宜含み得る。この第１のポリヌクレオチドはさらに、神経系細胞特異的プロモーター配列の下流に、種々の公知の制限酵素のよって切断可能なクローニングサイトを含み得る。複数の制限酵素認識部位を含むマルチクローニングサイトがより好ましい。当業者は、公知の遺伝子操作手順に従って、目的の治療用遺伝子を神経系細胞特異的プロモーターの下流に組込むことができる。このような遺伝子操作手順については、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning 3rd Edition, J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab. Press. 2001）などを参照のこと。
　本発明のrAAVベクターの調製において、ヘルパーウイルスプラスミド（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス又はワクシニア）を使用して、上記第１および第２のポリヌクレオチドと同時に培養細胞に導入され得る。好ましくは、本発明の調製方法は、アデノウイルス（AdV）ヘルパープラスミドを導入する工程をさらに含む。本発明において、好ましくは、AdVヘルパーは、培養細胞と同じ種のウイルスに由来する。例えば、ヒト培養細胞293Tを用いる場合、ヒトAdV由来のヘルパーウイルスベクターを用いることができる。このようなAdVヘルパーベクターとして、市販されているもの（例えば、Agilent Technologies社のAAV Helper-Free System (カタログ番号240071)）を使用することができる。
　本発明のrAAVベクターの調製において、上記の１種以上のプラスミドを培養細胞にトランスフェクションする方法は、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法など、公知の種々の方法を使用することができる。このような方法は、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている。
６．本発明のrAAVベクターを含む医薬組成物
　本発明のrAAVベクターは、神経疾患、とりわけシナプスにおけるタンパク質機能異常に係る疾患（例、統合失調症、自閉症スペクトラム障害など）などに対する治療に有用である遺伝子を含むことができる。それら遺伝子を含むrAAVベクターを、例えば血管内に投与し、血液脳関門を通過して脳、脊髄、網膜の神経細胞中に組込むことができる。このような治療用遺伝子を含むrAAVベクターは、本発明の医薬組成物に含められる。このような治療用遺伝子としては、例えば上記のような抗体、神経栄養因子(NGF)、成長因子(HGF)、酸性線維細胞増殖因子(aFGF)、miRNAなどをコードするポリヌクレオチドを選択できる。このようなrAAVベクターを被検体に末梢投与することによって、などの神経疾患を治療することが期待できる。
　本発明の医薬組成物の有効成分は単独で、あるいは組み合わせて配合されても良いが、これに製薬学的に許容しうる担体あるいは製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。この場合、本発明の有効成分は、例えば、製剤中、0.1～99.9重量％含有することができる。
　製薬学的に許容しうる担体あるいは添加剤としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、pH調整剤、安定化剤等を用いることができる。経口投与の場合、微晶質セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムなどの賦形剤、澱粉、アルギン酸などの崩壊剤、ポリビニルピロリドンなどの顆粒形成結合剤、滑沢剤など、当該分野において慣用される賦形剤と共に使用することができる。経口投与用として水性懸濁液および／またはエリキシルにしたい場合、活性成分を各種の甘味料または香味料、着色料または染料と併用する他、必要であれば乳化剤および／または懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、およびそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
　経口投与に適する製剤の例としては、例えば散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤またはシロップ剤等を挙げることが出来る。非経口投与に適する製剤としては、例えば注射剤、髄注液、坐剤等を挙げることが出来る。非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油または落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は必要に応じて適宜に緩衝し（好適にはｐＨ８以上）、液体希釈剤をまず等張にする必要がある。このような液体希釈剤としては、例えば、生理食塩水を使用できる。調製された水溶液は静脈内注射に適し、一方、油性溶液は関節内注射、筋肉注射および皮下注射に適する。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
　本発明の医薬組成物の投与量は特に限定されず、疾患の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、例えば、成人（例えば、体重60kg）１日当たり1～5000mg、好ましくは10～1000mgであるが、これらに限定されない。これらの１日投与量は２回から４回に分けて投与されても良い。また、投与単位としてvg（vector genome）を利用する場合、例えば、体重1kgあたり、109～1014vg、好ましくは1010～1013vg、さらに好ましくは1010～1012vgの範囲の投与量を選択することが可能であるが、これらに限定されない。
７．本発明のrAAVベクターの投与
　本発明のrAAVは、生体の血液脳関門（未完成な胎児及び新生児の血液脳関門、および確立した成体の血液脳関門を含む）を通過可能であるので、生体（成体および胎児または新生児を含む）に末梢投与することによって、本発明のrAAVを脳、脊髄などの神経系細胞に遺伝子の送達が可能である。さらに、本発明に用いるrAAVベクターは、末梢投与によって成体の脳、脊髄などに含まれる神経細胞を標的とすることができる。本明細書において末梢投与とは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、心腔内投与、筋肉内投与、臍帯血管内投与（例えば、胎児を対象とする場合）など、当業者に末梢投与として通常理解される投与経路をいう。また、血液以外に脳と流体接続される投与方法、例えば髄腔内投与も、本発明のrAAVベクターに用いることができる。別の実施形態において、本発明のrAAVベクターを、海馬などの脳内の標的部位に局所投与することも可能である。例えば、本発明のrAAVを、髄腔内投与にて髄液内に、または末梢投与によって血中内に投与する場合、脳実質内投与と比較して、より平易な投与手段を提供できる。
８．本発明のrAAVベクターの調製キット
　本発明は別の実施形態において、本発明のrAAVを作製するためのキットを提供する。このようなキットは、例えば、(a)カプシドタンパク質VP1等を発現するための第１のポリヌクレオチド、および(b)rAAVベクター内にパッケージングされる第２のポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、第１のポリヌクレオチドは、配列番号：のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、第２のポリヌクレオチドは、目的の治療用遺伝子を含んでも含まなくてもよいが、好ましくは、そのような目的の治療用遺伝子を組込むための種々の制限酵素切断部位を含むことができる。
　本発明のrAAVベクターを作製するためのキットは、本明細書中に記載されるいずれの構成（例えば、AdVヘルパーなど）もさらに含むことができる。本発明のキットはまた、本発明のキットを使用してrAAVベクターを作製するためのプロトコルを記載した指示書もさらに含み得る。
９．本発明のrAAVと併用される化学療法剤について
　本願発明に係るrAAVベクターは、既存の化学療法剤と併用することもできる。そのような化学療法剤の例としては、フェニトイン、カルバマゼピン、バルプロ酸、トピラマート、ラモトリギン、ルフィナミド、フェノバルビタール、ジアゼパム、クロナゼパム、エトスクシミド、ゾニサミド、ガバペンチン、レベチラセタム、ミダゾラム、クロバザム、プロポフォールが挙げられる。例えば、本願発明のrAAVの投与後に、上記化学治療剤の投与量を大きく低減することが期待できる。
１０．治療効果の測定について
　本発明のrAAVベクターの治療効果は、興奮が抑えられることを測定するための公知手段を用いて判断される。そのような公知手段としては、例えば、行動レベルの解析、標識した伝達物質（GABAなど）の薬理動態の解析、興奮性シナプス後電位や抑制性シナプス後電位の測定、薬剤または電気刺激よるてんかん誘発閾値変化の測定、脳波、光トポグラフィー、陽電子放出断層撮影（PET）などが挙げられるが、これらに限定されない。。
１１．本明細書中の用語について
　本明細書中に用いられる各用語が示す意味は以下のとおりである。本明細書中、特には説明されない用語については、当業者が通常理解する用語が意味する範囲を指すことが意図される。
　本明細書中で使用される場合、特に述べられない限り、「ウイルスベクター」、「ウイルスビリオン」、「ウイルス粒子」の各用語は、相互に交換可能に用いられる。
　本明細書中に用いられる場合、「神経系」とは、神経組織により構成される器官系を指す。また、本明細書中に用いられる場合、「神経系細胞」とは、少なくとも脳、脊髄など中枢神経系に含まれる神経細胞を含み、さらに、神経膠細胞、小膠細胞、星状膠細胞、乏突起膠細胞、脳室上衣細胞、脳血管内皮細胞などを含んでもよい。
　本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「核酸」、「遺伝子」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレオチド配列」は、「核酸配列」または「塩基配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。例えば、「配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
　本発明に係る「ウイルスゲノム」および「ポリヌクレオチド」は各々、DNAの形態（例えば、cDNAまたはゲノムDNA）で存在し得るが、場合によってはRNA（例えば、mRNA）の形態であってもよい。本明細書において使用されるウイルスゲノムおよびポリヌクレオチドは各々、二本鎖または一本鎖のDNAであり得る。一本鎖DNAまたはRNAの場合、コード鎖（センス鎖としても知られる）であっても、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であってもよい。特に述べられない限り、本明細書中、rAAVゲノムがコードするプロモーター、目的遺伝子、ポリアデニレーションシグナルなどの遺伝子上の配置について説明される場合、rAAVゲノムがセンス鎖である場合についてはその鎖自体について、アンチセンス鎖である場合はその相補鎖について記載される。
　本明細書において、「タンパク質」と「ポリペプチド」とは相互に交換可能に用いられ、アミノ酸の重合体が意図される。本明細書において使用されるポリペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がN末端（アミノ末端）、右端がC末端（カルボキシル末端）である。本発明のポリペプチドの部分ペプチド（本明細書中、本発明の部分ペプチドと略記する場合がある）としては、前記した本発明のポリペプチドの部分ペプチドで、好ましくは、前記した本発明のポリペプチドと同様の性質を有するものである。
　本明細書において、用語「プラスミド」は、種々の公知の遺伝子要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体等を意味する。プラスミドは特定の宿主において複製することができ、そして細胞間で遺伝子配列を輸送できる。本明細書において、プラスミドは、種々の公知のヌクレオチド（DNA、RNA、PNAおよびその混合物）を含み、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖である。例えば、本明細書において、用語「rAAVベクタープラスミド」は、特に明記しない限り、rAAVベクターゲノムおよびその相補鎖により形成される二本鎖を含むことが意図される。本発明において使用されるプラスミドは、直鎖状であっても環状であってもよい。
　本明細書中において使用される場合、用語「パッケージング」とは、１本鎖ウイルスゲノムの調製、外被タンパク質（キャプシド）の組み立て、およびウイルスゲノムをキャプシドで包むこと（encapsidation）などを含む事象をいう。適切なプラスミドベクター（通常、複数のプラスミド）が適切な条件下でパッケージング可能な細胞株に導入される場合、組換えウイルス粒子（すなわち、ウイルスビリオン、ウイルスベクター）が組み立てられ、培養物中に分泌される。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されるものではない。
実験の概要
　生後６週時にrAAV-Neuroligin2（rAAV-NL2）を心腔内投与
　・発作頻度・持続時間・強さ・持続時間×強さ・電気刺激に対する閾値の変化
　ニューロリギン2搭載血管内投与型rAAVの脳内発現
　モデル動物を用いたてんかんの遺伝子治療の報告は散在するが、いずれも定位的に局所投与したものである。ヒト患者に応用する場合、侵襲的処置を伴わない投与法が望ましい。今回、本願発明者らは、血管内投与型アデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターを作成し、てんかん自然発生ELマウス（Suzuki, Proc. Jpn. Acad., Ser.B89(2013)）に投与し、脳内の発現状況及び発作抑制効果の有無を観察した。
実験材料及び方法
○　組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクター
　本実施例において用いるベクターは、先に公開されたAAV9/3 (AAV9のカプシドにチロシン変異(Y446→F)を導入し、AAV3のITRを持つ)にSynapsin I promoterを搭載しているものである（WO 2012/057363）。内因性のNeuroligin 2 (NL2)と区別するため、FLAG tag (DDDDK)配列がＮ末端に結合したニューロリギン２を発現するrAAVベクターを調製し（AAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL2）、これを対象動物に投与した。
○ 動物への投与
　ELマウス（6週齢、雄、体重22 - 32g）を使用した。
　2-4%セボフルレン麻酔下にAAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL2を4.1×1013 vector genome/ml × 0.1ml /mouse心注した (NL2心注群n = 10)。AAV9/3-Syn1-AcGFP-WPREを2.3×1013 vg/ml × 0.1ml /mouse心注した群(n=17)と生理食塩水のみを0.1ml/mouse心注した群(n=14)を対照とした。また、局所投与と比較するため、両側海馬CA3領域（Bregmaより 0.5 mm後方、3.0 mm側方、脳表より2.0 mm）にAAV9/3-Syn1-FLAG (DDDDK)-NL 2を4.1×1013 vg/ml × 0.005 ml注入したグループを局所投与群（n = 3）とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
○ 回転加速度刺激による評価
　ベクター等投与後、22週齢に至るまで1週間毎に、尻尾を持ってマウスを一定数回転させ（8回転）、行動をビデオ記録した。後にビデオ上で発作の有無、発作を起こした場合の持続時間、強度を観察した。
　発作強度を
　　1点: 発作なし
    2点: 尻尾を挙げる、または体を震わせるのみ
　　3点: 明らかな発作だが、倒れずに姿勢を保つ
　　4点: 激しい発作で、姿勢を保てず、横に倒れる
として得点化した。
　発作の持続時間を
　　1点: 発作なし
    2点: 1-10秒
　　3点: 11-20秒
　　4点: 21-30秒
　　5点: 31-60秒
　　6点: 61秒－
として得点化した。
　各グループの発作出現率、平均発作時間、平均発作強度、平均発作時間×強度を週毎に評価した
○　電気刺激による評価
  5（ベクター投与前）, 12, 18, 22週齢において、両耳に電極を装着し、電気刺激（NIHON KOHDEN社製のNeuropack S1において以下のパラメーターを用いた：duration：1ms, interval：50ms, 10train, strength：0mA～5mA毎にmax 50mAまで）を与え、てんかん発作を誘発し、発作閾値を測定した。50mAで発作が誘発されなかった場合は発作閾値を60mAとして評価した。局所投与群のみ5, 12, 22週齢で行った。
○　統計処理
　発作出現率：Fisher正確検定
  その他：Welchのt検定
　により評価した。
○　組織解析
　脳標本作成：ペントバルビタールで深麻酔し、左心室からの４％パラフォルムアルデヒドを含む0.1Mリン酸バッファー（pH7.4）注入し灌流固定した。固定後、脳を取り出して灌流固定液での半日の浸積固定後15％ショ糖を含む0.1Mリン酸バッファー（pH7.4）に移して冷蔵庫で組織化学実験まで保存した。
○　rAAV9-GFP発現と細胞の同定
　凍結ミクロトームで40μmの矢状断切片を作成し蛍光顕微鏡で脳各部位のGFP発現を確認した。GFPを発現している細胞の同定は以下のマーカーとの2重染色を行った。神経細胞；NeuNまたはMAP2、グリア細胞；GFAP、抑制性介在ニューロン；Parvalbumin 
○　rAAV9-NL2発現と細胞の同定
　GFP確認と同様、40μmの矢状断切片を作成してFLAG（DDDDK）抗体染色により導入遺伝子NL2発現を確認した。FLAG抗体はアブカム株式会社より購入し、Alexafluor 488付き2次抗体を用いた画像処理により蛍光顕微鏡で発現を確認した。
実験結果および考察
　海馬スライス標本を用いて虚血負荷時の細胞内Ca2＋流入変化をrhod 2-AM（DOJINDOカタログ番号：R002 ）の蛍光変化により測定した。虚血負荷により海馬で起きる細胞内Ca2＋流入はELマウスがDDYマウスに比べてCA３ 領域で有意な上昇を示し、CA3 領域における抑制系の脆弱性が示唆された。次に興奮抑制系である介在細胞のEL海馬における発現をparvalbumin抗体（カタログ番号：LS-C39101 ）による免疫染色で組織学的に検討した。海馬各領域のparvalbumin陽性細胞数においてはELマウスとDDYマウスで有意差は認められず、シナプスレベルでの変化の可能性が示唆された。以上の結果に基づき、抑制系シナプス関連分子の遺伝子を発現するrAAVベクターを調製し、定位的海馬注入および血管内注入により同ベクターをELに投与し、FLAG抗体を用いる染色によって、組織学的に脳内分布を観察した（図1a、1b）。図1aに示すように、本発明のベクターの血管内投与によって海馬及び大脳皮質の神経細胞にFLAGタグ付NLGN2が広く発現していたため、rAAVによる遺伝子送達が良好であったことを確認できた。
　次いで、血管内注入群でてんかん発作抑制効果の有無を観察した（図2～6）。緑色蛍光タンパクEGFP発現AAVベクター投与群および生理食塩水投与群をコントロールとした。てんかん抑制効果の評価は、各週齢のマウスにおいて、発作の発現頻度、強さ、持続時間、発作強さ×持続時間の各項目において行った。なお、図中の「*」、「**」を付した箇所において有意差が認められた。NLGN2投与群は、コントロール群に対して発作を有意に抑制しつつも、電気刺激に対する閾値を変更することがなかった（図2～6）電気刺激の閾値が変更しなかったことから、抑制シナプスの作動開始は導入前と変化せず、よって副作用が低いことが示唆された。
　海馬注入群では海馬ニューロンに、血管内投与群では海馬を含む全脳ニューロンに目的遺伝子の発現を認めた（結果は示さず）。海馬注入群では、コントロール群と比較すると、NLGN2投与群は発作頻度において有意差が認められる場合があったが、全体として効果の有意差は認められなかった（図7～11）。なお、図中の「*」、「**」を付した箇所において有意差が認められた。また、心腔内投与群と比較すると、発作頻度、発作時間及び発作強度のいずれにおいても全体的に心腔内投与群の方がてんかんの抑制効果が高い傾向が認められた。
　血管内投与型AAVベクターにより標的分子が脳全体のニューロンに供給された。本分子の興奮抑制作用がてんかん発作を抑制しつつ、電気刺激の閾値は変化させない、より治療方法として有益な非侵襲的てんかん遺伝子治療の可能性が示唆された。
　本発明のrAAVベクターを用いることによって、神経系細胞における遺伝子上の不具合（先天的なものおよび後天的なものを含む）を治療（緩和、改善、修復など）することが期待できる。
配列番号１：ヒトニューロリギン２ヌクレオチド配列
配列番号２：ヒトニューロリギン２アミノ酸配列
配列番号３：マウスニューロリギン２ヌクレオチド配列
配列番号４：マウスニューロリギン２アミノ酸配列
配列番号５：ラットニューロリギン２ヌクレオチド配列
配列番号６：ラットニューロリギン２アミノ酸配列
配列番号７：Flagタグ付マウスニューロリギン２のヌクレオチド配列
配列番号８：Flagタグ付マウスニューロリギン２のアミノ酸配列
配列番号９：ＡＡＶ１カプシドタンパク質Ｙ４４５Ｆ変異体のアミノ酸配列
配列番号１０：ＡＡＶ２カプシドタンパク質Ｙ４４４Ｆ変異体のアミノ酸配列
配列番号１１：ＡＡＶ９カプシドタンパク質Ｙ４４６Ｆ変異体のアミノ酸配列

Claims (12)

  1. 　生体における抑制性シナプスの興奮抑制機能を向上させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、てんかん、統合失調症、自閉症スペクトラム障害、精神遅滞、不安、躁鬱病、片頭痛、恐怖強迫症状、薬物依存症、アンジェルマン症候群、ジスキネジア、ジストニア、アルツハイマー病、発達障害（注意欠陥多動性障害、アスペルガー症候群）からなる群より選択される疾患の治療のための組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
  2. 　前記ポリヌクレオチドが、配列番号２、４もしくは６のアミノ酸配列、またはこれら配列と約９０％以上の同一性を有してニューレキシンと結合するアミノ酸配列を含むニューロリギン２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
  3. 　前記疾患がてんかんである、請求項１又は２に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
  4. 　前記組換えアデノ随伴ウイルスベクターが、野生型AAV1カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、野生型のAAV2カプシドタンパク質のアミノ酸配列中445位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質、または野生型のAAV9カプシドタンパク質のアミノ酸配列中446位のチロシンがフェニルアラニンに置換されている変異アミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項１～３のいずれかに記載のアデノ随伴ウイルス組換えベクター。
  5. 　前記ポリヌクレオチドが、シナプシンIプロモーター配列、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター配列、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター配列、カルシウム/カルモジュリンー依存性蛋白キナーゼII(CMKII)プロモーター配列、チュブリンαIプロモーター配列、血小板由来成長因子β鎖プロモーター配列、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター配列、L7プロモーター配列（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）、グリア線維酸性タンパク質(hGfa2)プロモーター配列、およびグルタミン酸受容体デルタ２プロモーター（小脳プルキンエ細胞特異的プロモーター）配列、グルタミン酸脱炭酸酵素（GAD65/GAD67）プロモーター配列からなる群より選択されるプロモーター配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
  6. 　前記ポリヌクレオチドが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV8、およびAAV9からなる群より選択されるインバーテッドターミナルリピート（ITR）を含む、請求項１～５のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
  7. 　前記ポリヌクレオチドが、興奮性シナプスの興奮を抑制するためのポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～６のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス組換えベクターを含む、医薬組成物。
  9. 　脳内投与されるための、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 　髄腔内投与されるための、請求項８に記載の医薬組成物。
  11. 　末梢投与されるための、請求項８に記載の医薬組成物。
  12. 　神経精神疾患に係る化学療法剤と併用するための、請求項８～１１のいずれかに記載の医薬組成物。
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