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WO2017175374A1 - 画像取得装置 - Google Patents

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Publication number
WO2017175374A1
WO2017175374A1 PCT/JP2016/061531 JP2016061531W WO2017175374A1 WO 2017175374 A1 WO2017175374 A1 WO 2017175374A1 JP 2016061531 W JP2016061531 W JP 2016061531W WO 2017175374 A1 WO2017175374 A1 WO 2017175374A1
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WO
WIPO (PCT)
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light
signal
illumination light
intensity
illumination
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/061531
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
兼太郎 井元
厚志 土井
Original Assignee
オリンパス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オリンパス株式会社 filed Critical オリンパス株式会社
Priority to PCT/JP2016/061531 priority Critical patent/WO2017175374A1/ja
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens

Definitions

  • the present invention relates to an image acquisition device.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and an operator can accurately acquire a signal light image regardless of environmental changes without adjusting the intensity ratio of illumination light for each observation.
  • An object of the present invention is to provide an image acquisition device capable of performing the above.
  • a modulation unit that generates illumination light in which two different states are periodically switched by modulating light from a light source, and illumination that detects the illumination light generated by the modulation unit
  • a light detection unit an illumination optical system that irradiates the sample with the illumination light generated by the modulation unit; and the signal light generated at the illumination light irradiation position on the sample by the illumination optical system is collected and detected.
  • illumination light in which two different states are switched periodically is generated, and the generated illumination light is irradiated onto the sample by the illumination optical system. Is done.
  • the signal light generated at the irradiation position of the illumination light on the sample is detected by the signal light detector.
  • the intensity signal of the detected signal light is demodulated by the demodulator, and a signal light image is generated by the image generator based on the demodulated signal light intensity signal.
  • the illumination light generated by the modulation unit is detected by the illumination light detection unit, and the intensity signal of the detected illumination light is demodulated by the demodulation unit.
  • the intensity signal in each state of illumination light having two states can be compared by the modulation unit, and the intensity signal of the illumination light in two states can be obtained even when the modulation ratio by the modulation unit varies due to environmental changes. Correction can be performed in the modulation section so that the ratio is constant.
  • the signal light image can be accurately acquired regardless of the environmental change without the operator adjusting the intensity ratio of the illumination light for each observation.
  • the two states are states in which time integrated intensity is equal
  • the demodulator outputs a difference in time integrated intensity of the illumination light demodulated for each state
  • the modulator is The modulation intensity may be corrected so that the difference becomes zero.
  • the modulation intensity is corrected by the modulation unit until the difference in time integration intensity of the illumination light output from the demodulation unit becomes zero, thereby making the time integration intensity of the illumination light in the two states equal. Can be maintained.
  • the state where the time integrated intensities of the two states are equal includes not only the case where the intensity of the illumination light is equal but also the case where the intensities are different.
  • the state which irradiates the said illumination light to the different position of a sample may be sufficient as said two states.
  • it is applied to a scanning confocal microscope, and the illumination light in one state is condensed at a position optically conjugate with the pinhole in front of the detector, and the illumination light in the other state is condensed.
  • the light is condensed at a position optically unconjugated with the pinhole.
  • the focus signal light from the condensing position and the out-of-focus signal light from other than the condensing position pass through the pinhole, and in the other state, only the out-of-focus signal light passes through the pinhole.
  • the out-of-focus fluorescence can be accurately removed by correcting the intensity of the illumination light applied to the sample in the two states in the modulation unit so as to match with high accuracy.
  • the two states may be a state where the signal light generated in the sample is saturated and a state where the signal light is not saturated.
  • SAX saturated Excitation
  • the time integrated intensity of the illumination light is the same in the two states, but the signal light generated in the sample is saturated with the illumination light with the higher intensity.
  • high-precision observation can be performed by accurately matching the time integrated intensities of the illumination light in the two states.
  • the optical system includes a branching unit that branches the light from the light source into two optical paths, and the modulation unit modulates the light of each optical path branched by the branching unit with a different frequency, respectively.
  • the modulation intensity of the illumination light may be corrected so that the intensity ratio of the two illumination lights demodulated by the demodulator has a preset value.
  • the obtained signal light intensity is proportional to the square of the instantaneous intensity of the illumination light. Even if the intensities are matched, there is a difference in the intensity of the detected signal light. According to this aspect, it is possible to acquire a signal light image without color unevenness by correcting the modulation intensity of the illumination light so as to obtain a preset intensity ratio in consideration of the irradiation pattern.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram illustrating an image acquisition device according to a first embodiment of the present invention. It is a figure which shows an example of the illumination light modulated by the modulation part of the image acquisition apparatus of FIG. It is a figure which shows an example of the illumination light used for the modification of the image acquisition apparatus of FIG. It is a whole block diagram which shows the image acquisition apparatus which concerns on the 2nd Embodiment of this invention. It is a figure which shows an example of the illumination light modulated by the 1st modulator of the image acquisition apparatus of FIG. It is a figure which shows an example of the laser beam inject
  • the image acquisition apparatus 1 includes a laser light source (light source) 2 that emits laser light having a constant intensity, and a modulation unit that modulates laser light from the laser light source 2.
  • a laser light source (light source) 2 that emits laser light having a constant intensity
  • a modulation unit that modulates laser light from the laser light source 2.
  • a microscope optical system for condensing fluorescence (signal light) generated in the sample X while irradiating the illumination light modulated in the modulation unit 3 to the sample X (not shown), and the microscope
  • a photodetector (signal light detection unit) 5 for detecting fluorescence that has passed through the pinhole 16 of the optical system 4
  • a detector (illumination light detection unit) 6 for detecting the illumination lights L1 and L2 modulated by the modulation unit 3; Based on the fluorescence intensity signal detected by the photodetector 5 and the intensity signal of the illumination lights L1 and L2 detected by the detector 6, the demodulator 7 and the fluorescence intensity signal demodulated by the demodulator 7 To generate fluorescent images And an image generation unit 8 that.
  • the modulation unit 3 is arranged on each optical path and a first beam splitter (branching unit) 9 that branches the laser light from the laser light source 2 into two optical paths, and turns on and off the laser light that passes through each optical path at alternate timings.
  • Modulators 10a and 10b such as an acousto-optic modulator (AOM) that modulates in this way, a modulation control unit 11 that controls these modulators 10a and 10b, and illumination light L1 output from the modulators 10a and 10b
  • AOM acousto-optic modulator
  • the second beam splitter 12 is arranged at an angle slightly different from 45 ° with respect to the optical axis of one optical path, and the two illumination lights L1 and L2 after being combined are emitted at different angles. It is like that.
  • the microscope optical system 4 is an optical system of a laser scanning fluorescence microscope, and includes a scanner 13 that scans two illumination lights L1 and L2 emitted from the modulation unit 3, and an illumination light L1 that is scanned by the scanner 13. , L2 on the sample X, a dichroic mirror 15 for branching the fluorescence condensed by the objective lens 14 from the optical path of the illumination light L1, L2, and a pinhole 16.
  • reference numeral 17 denotes an optical path forming mirror.
  • the two illumination lights L1 and L2 having different emission angles by the second beam splitter 12 of the modulation unit 3 are incident on the pupil of the objective lens 14 from different angles, thereby being condensed at different positions in the sample X.
  • the fluorescent material existing in the sample X is excited to generate fluorescence. That is, the illumination light L1 that has passed through one optical path is condensed at a position optically conjugate with the pinhole 16 disposed in the front stage of the photodetector 5, while the illumination light L2 that has passed through the other optical path. Is condensed at a position optically unconjugated with the pinhole 16.
  • the illumination light L1 and L2 passing through the two optical paths are alternately emitted by the operation of the modulation control unit 11, as shown in FIG. 2, the illumination light L1 that is condensed at the conjugate position and the non-conjugated light Illumination light is generated in which the illumination light L1, L2 in two states of the illumination light L2 condensed at the position is switched periodically.
  • the modulation control unit 11 outputs a modulation signal to the demodulation unit 7.
  • the photodetector 5 is, for example, a photomultiplier tube, and detects the intensity of the fluorescence condensed by the objective lens 14.
  • the demodulating unit 7 modulates the intensity signals of the fluorescence generated by the illumination lights L1 and L2 in the two states detected by the photodetector 5 by the modulators 10a and 10b sent from the modulation control unit 11, respectively.
  • the signal is demodulated in synchronization with the timing, and the difference between the fluorescence intensity signals is output.
  • the image generator 8 generates a fluorescent image by arranging the difference value of the fluorescence intensity signal output from the demodulator 7 in association with the information of the scanning position by the scanner 13.
  • the fluorescence detected by the photodetector 5 includes the focus fluorescence generated at the focus position and the path to the focus in the sample X. Part of the generated out-of-focus fluorescence is included.
  • the fluorescence detected by the photodetector 5 when the illumination light L2 is condensed at a position unconjugated with the pinhole 16 includes the focus fluorescence generated at the focal position because it cannot pass through the pinhole 16. Only the out-of-focus fluorescence is included. Therefore, the difference between these fluorescence intensity signals output from the demodulator 7 includes only the focus fluorescence from which the out-of-focus fluorescence is removed, and a clear fluorescence image with less noise is generated. Will be able to.
  • the detector 6 is disposed, for example, at the subsequent stage of the modulation unit 3, and includes a beam sampler 18 including a low-reflectance half mirror that separates part of the illumination lights L 1 and L 2 output from the modulation unit 3, and the beam sampler 18. And a single point detector 19 disposed at a position where the illumination lights L1 and L2 in the two states separated by (2) can be detected.
  • the single point detector 19 may be arranged at a position conjugate with the pupil plane of the objective lens 14 by a relay lens (not shown), may be arranged at the focal position of a condenser lens (not shown), or two illuminations You may employ
  • the output of the single point detector 19 is input to the demodulator 7, and the output from the demodulator 7 is input to the modulation controller 11.
  • the modulation control unit 11 corrects the modulation intensity of the illumination lights L1 and L2 modulated by one of the modulators 10a and 10b in accordance with the difference value input from the demodulation unit 7. That is, based on the intensity of the illumination lights L1 and L2 in two states separated by the beam sampler 18, the modulation control unit 11 sets the intensity of any illumination light so that the output from the demodulation unit 7 becomes zero. Therefore, the intensities of the illumination lights L1 and L2 in the two states are adjusted with high accuracy.
  • the laser light emitted from the laser light source 2 is branched into two optical paths by the first beam splitter 9 in the modulation unit 3 and passes through the optical paths. During this time, the light is modulated by the modulators 10a and 10b arranged in the respective optical paths, combined by the second beam splitter 12, and emitted at different angles.
  • Illumination lights L1 and L2 output from the modulation unit 3 and that change in two states in terms of time are made incident on the microscope optical system 4, and a part of the illumination lights L1 and L2 are separated by the beam sampler 18 and single point detector 19 is used. Is detected.
  • the illumination lights L1 and L2 in two states scanned by the scanner 13 in the microscope optical system 4 and condensed by the objective lens 14 are condensed at two different positions in the sample X, and fluorescent at each condensing position. Is generated.
  • Fluorescence generated in the sample X by irradiation with the illumination lights L1 and L2 in two states is detected by the photodetector 5 and input to the demodulator 7.
  • the difference between the fluorescence intensity signals generated by the illumination lights L 1 and L 2 in each state is output from the demodulator 7.
  • the difference in the intensity signal of the fluorescence output from the demodulator 7 is an intensity signal of only the fluorescence from the focal position of the illumination light from which the out-of-focus fluorescence is removed.
  • the intensities of the illumination lights L1 and L2 in the two states are required to be the same.
  • the modulation control unit 11 is set so that the intensity of the illumination lights L1 and L2 in the two states output from the modulation unit 3 are the same, but the use environment such as temperature fluctuates, There may be a difference in the intensity of the illumination lights L1 and L2 output from the modulators 10a and 10b.
  • part of the illumination lights L1 and L2 output from the modulation unit 3 are separated by the beam sampler 18, detected by the single point detector 19, and detected illumination light L1.
  • L2 intensity signals are demodulated by the demodulator 7 so that the difference between the signal intensities of the two illumination lights L1 and L2 is output from the demodulator 7.
  • the difference output from the demodulator 7 is input to the modulation control unit 11, so that the modulation intensity of the illumination lights L1 and L2 modulated by the modulators 10a and 10b according to the difference is modulated by the modulation control unit 11. It is corrected.
  • the demodulator 7 that outputs the difference between the fluorescence intensity signals is used to obtain the difference between the intensity signals of the illumination lights L1 and L2, so that the beam sampler 18 and the single point detector 19
  • a demodulator for illumination light may be prepared separately from the demodulator 7 for fluorescence.
  • the image acquisition device 1 that uses modulation / demodulation to remove out-of-focus fluorescence has been described as an example, but instead, this is applied to a SAX microscope as shown in FIG. You may decide. That is, as shown in FIG. 3, the modulation unit 3 generates illumination lights L1 and L2 having two different peak values and equal time integration intensities, unlike the above embodiment. Yes.
  • the modulators 10a and 10b may employ electro-optic modulators instead of the acousto-optic modulators.
  • the illumination light L1 having a higher peak intensity saturates the fluorescence generated in the sample X and the illumination light L2 having a lower peak intensity does not saturate the fluorescence, even if the usage environment changes, two In this state, the time integrated intensities of the illumination lights L1 and L2 can be maintained in a highly accurate state, and high-precision observation can be performed.
  • an image acquisition apparatus 20 according to a second embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
  • the same reference numerals are given to portions having the same configuration as that of the image acquisition device 1 according to the first embodiment described above, and description thereof is omitted.
  • the image acquisition device 20 is applied to a two-photon excitation microscope, and divides illumination light composed of ultrashort pulse laser light into two optical paths, The light is modulated at different frequencies by the arranged modulators 10a and 10b, condensed at two different points of the sample X, and the fluorescence emitted from each focal point is detected and demodulated to detect the fluorescence from the two points.
  • the light is modulated at different frequencies by the arranged modulators 10a and 10b, condensed at two different points of the sample X, and the fluorescence emitted from each focal point is detected and demodulated to detect the fluorescence from the two points.
  • the first modulator 10a in one optical path cuts every other pulse of the ultrashort pulse laser light from the laser light source 2 to become 50% duty. So that it can be modulated.
  • the other second modulator 10b reduces the peak intensity of all pulses of the ultrashort pulse laser beam from the laser light source 2 shown in FIG. 5B to 70% as shown in FIG. 5C. Yes.
  • the first modulator 10a modulates the ultrashort pulse laser light from the laser light source 2 to generate the 40 MHz illumination light L2. Yes.
  • the illumination light L2 has an alternating current pattern whose intensity changes at 40 MHz.
  • the second modulator 10b modulates the peak intensity of the ultrashort pulse laser light from the laser light source 2 to 70% to generate 80 MHz illumination light L1.
  • the signals are subtracted and a fluorescent signal corresponding to L2 is output.
  • the fluorescence intensity signals output from the two demodulation units 21a and 21b are substantially equal, and the occurrence of uneven brightness in the fluorescence image generated using these fluorescence intensities can be prevented.
  • the intensity signals of the illumination lights L1 and L2 in the two states detected by the single point detector 19 and demodulated by the demodulation units 21a and 21b are output as a difference, unlike the first embodiment. And output as separate intensity signals.
  • the modulation intensity in each of the modulators 10a and 10b controls so that correction is not performed. That is, the modulation control unit 11 multiplies the intensity signal of the illumination light L1 output from the first demodulation unit 21a by a preset ratio, 10/7 in the above example, and the second value.
  • the two modulators 10a and 10b are controlled so that the difference from the intensity signal of the illumination light L2 output from the demodulator 21b becomes zero.
  • the image acquisition device 20 even if the usage environment changes, two-point simultaneous detection is performed without the operator adjusting the intensity ratio of the illumination lights L1 and L2 for each observation. There is an advantage that a fluorescent image with little luminance unevenness can be acquired while improving the frame rate by the above.
  • the present invention is applied to a light sheet microscope for photographing fluorescence generated by sheet-like illumination light incident on different positions along the optical axis of the objective lens 14 with a camera. May be.
  • the sampling ratio by the beam sampler 18 may be different for each of the illumination lights L1 and L2. Can do. In such a case, even if the two illumination lights L1 and L2 have the same intensity, they are detected as having different intensities in the single point detector 19, so that the single point detector is detected by the correction coefficient obtained in advance.
  • a signal correction unit (not shown) that corrects the intensity signals of the illumination lights L1 and L2 detected by the projector 19 may be provided.
  • the modulation control unit 11 corrects the modulation intensity by the two modulators 10a and 10b, the modulation intensity may be corrected by only one modulator 10a.
  • the timing of correcting the modulation intensity of the illumination lights L1 and L2 is not particularly limited. For example, it is automatically performed before the fluorescence observation of the sample X is performed. do it.
  • the intensity correction of the illumination lights L1 and L2 can be performed without using the sample X, and can be performed without damaging the sample X.

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Abstract

作業者が観察毎に照明光の強度比率の調整を行うことなく、環境変化に関わらず、信号光画像を精度よく取得することを目的として、本発明に係る画像取得装置（１）は、光源（２）からの光を変調することにより、異なる２つの状態が時間周期的に切り替わる照明光を生成する変調部（３）と、生成された照明光（Ｌ１，Ｌ２）を検出する照明光検出部（６）と、生成された照明光（Ｌ１，Ｌ２）を試料（Ｘ）に照射する照明光学系（４）と、照明光（Ｌ１，Ｌ２）の試料（Ｘ）における照射位置において発生した信号光を集光して検出する信号光検出部（５）と、検出された信号光の強度信号および検出された照明光の強度信号に対し変調に対する復調を行う復調部（７）と、復調された信号光の強度信号に基づいて信号光画像を生成する画像生成部（８）とを備え、変調部（３）が、復調部（８）により復調された照明光の強度信号に基づいて照明光の変調強度を補正する。

Description

画像取得装置
　本発明は、画像取得装置に関するものである。
　レーザ走査顕微鏡等の画像取得装置において、変調することにより生成された２つの状態の励起光を試料に照射し、試料において発生した蛍光を検出した後に復調することにより、各状態の励起光に対応する蛍光を取得して画像を生成する技術が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
ＷＯ２０１５／１６３２６１号パンフレット
　特許文献１の顕微鏡では、２つの状態の励起光の強度が理想的には同一であることが必要であるが、光学部品の特性が温度等の環境変化によって変化するため、強度比率を一定に保持することは困難である。このため、作業者が観察に先立って励起光の強度比率を一定となるように調節する必要があり、手間がかかって煩わしいという不都合がある。
　本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、作業者が観察毎に照明光の強度比率の調整を行うことなく、環境変化に関わらず、信号光画像を精度よく取得することができる画像取得装置を提供することを目的としている。
　本発明の一態様は、光源からの光を変調することにより、異なる２つの状態が時間周期的に切り替わる照明光を生成する変調部と、該変調部により生成された前記照明光を検出する照明光検出部と、前記変調部により生成された前記照明光を試料に照射する照明光学系と、該照明光学系による前記照明光の試料における照射位置において発生した信号光を集光して検出する信号光検出部と、該信号光検出部により検出された前記信号光の強度信号および前記照明光検出部により検出された前記照明光の強度信号に対し前記変調に対する復調を行う復調部と、該復調部により復調された前記信号光の強度信号に基づいて信号光画像を生成する画像生成部とを備え、前記変調部が、前記復調部により復調された前記照明光の強度信号に基づいて前記照明光の変調強度を補正する画像取得装置である。
　本態様によれば、光源から発せられた光が変調部に入射されると、異なる２つの状態が時間周期的に切り替わる照明光が生成され、生成された照明光が照明光学系によって試料に照射される。試料における照明光の照射位置において発生した信号光は信号光検出部により検出される。検出された信号光の強度信号が復調部において復調され、復調された信号光の強度信号に基づいて画像生成部により信号光画像が生成される。
　その一方で、変調部により生成された照明光は照明光検出部により検出され、検出された照明光の強度信号が復調部において復調される。変調部により２つの状態を有する照明光の各状態における強度信号を比較することが可能となり、環境変化によって変調部による変調比率が変動した場合であっても２つの状態の照明光の強度信号が一定の比率となるように変調部において補正することができる。これにより、作業者が観察毎に照明光の強度比率の調整を行うことなく、環境変化に関わらず、信号光画像を精度よく取得することができる。
　上記態様においては、前記２つの状態は、時間積分強度が等しくなる状態であり、前記復調部が、状態毎に復調された前記照明光の時間積分強度の差分を出力し、前記変調部は、前記差分がゼロとなるように前記変調強度を補正してもよい。
　このようにすることで、復調部から出力される照明光の時間積分強度の差分がゼロとなるまで変調部により変調強度が補正されることによって、２つの状態における照明光の時間積分強度を等しく維持することができる。２つの状態の時間積分強度が等しくなる状態には、照明光の強度が等しい場合の他、強度が異なる場合も含まれる。
　また、上記態様においては、前記２つの状態が、前記照明光を試料の異なる位置に照射する状態であってもよい。
　このようにすることで、例えば、走査型共焦点顕微鏡に適用し、一方の状態の照明光を検出器前のピンホールと光学的に共役な位置に集光させ、他方の状態の照明光をピンホールと光学的に非共役な位置に集光させる。
　一方の状態では集光位置からの焦点信号光および集光位置以外からの焦点外信号光がピンホールを通過し、他方の状態では焦点外信号光のみがピンホールを通過するので、その差分を取得することによって、焦点外信号光を除去することができる。
　この場合において、２つの状態において試料に照射する照明光の強度を変調部において補正して精度よく一致させることにより、焦点外蛍光を精度よく除去することができる。
　また、上記態様においては、前記２つの状態が、試料において発生する前記信号光が飽和する状態と飽和しない状態であってもよい。
　このようにすることで、例えば、ＳＡＸ（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）顕微鏡に適用し、２つの状態で照明光の時間積分強度は等しいが、強度が高い方の照明光では試料において発生する信号光が飽和し、強度の低い方の照明光では信号光が飽和しない状態とする場合に、２つの状態での照明光の時間積分強度を精度よく一致させることにより、高精度の観察を行うことができる。
　また、上記態様においては、前記光源からの光を２つの光路に分岐する分岐部を備え、前記変調部が、前記分岐部により分岐された各前記光路の光をそれぞれ異なる周波数で変調するとともに、前記復調部により復調された２つの前記照明光の強度比が予め設定された値となるように前記照明光の変調強度を補正してもよい。
　このようにすることで、分岐部により２つの光路に分岐された光源からの光が異なる周波数で変調されて試料の２箇所に照射され、検出された信号光の強度信号を復調部により復調することによって、試料の２点を同時観察することができる。
　２光子励起顕微鏡に代表される非線形顕微鏡に適用する場合には、得られる信号光強度は照明光の瞬間強度の２乗に比例するので、照明光の照射パターンが異なる場合には、照明光の強度を一致させても検出される信号光の強度に差がでる。本態様によれば、照射パターンを考慮して予め設定された強度比となるように照明光の変調強度を補正することにより、色ムラのない信号光画像を取得することができる。
　また、上記態様においては、前記照明光検出部により検出された前記照明光の強度信号を予め設定された補正係数により補正する信号補正部を備えていてもよい。
　このようにすることで、照明光検出部が照明光の偏光状態や周波数によって異なる特性を有する場合に、信号補正部において予め設定された補正係数によってその特性差による検出誤差をなくすことができる。
　本発明によれば、作業者が観察毎に照明光の強度比率の調整を行うことなく、環境変化に関わらず、信号光画像を精度よく取得することができるという効果を奏する。
本発明の第１の実施形態に係る画像取得装置を示す全体構成図である。 図１の画像取得装置の変調部により変調された照明光の一例を示す図である。 図１の画像取得装置の変形例に用いられる照明光の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る画像取得装置を示す全体構成図である。 図４の画像取得装置の第１変調器により変調された照明光の一例を示す図である。 図４の画像取得装置の光源から射出されるレーザ光の一例を示す図である。 図４の画像取得装置の第２変調器により変調された照明光の一例を示す図である。
　以下、本発明の第１の実施形態に係る画像取得装置１について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る画像取得装置１は、図１に示されるように、一定の強度を有するレーザ光を射出するレーザ光源（光源）２と、該レーザ光源２からのレーザ光を変調する変調部３と、該変調部３において変調された照明光を図示しない試料Ｘに照射する一方、試料Ｘにおいて発生した蛍光（信号光）を集光する顕微鏡光学系（照明光学系）４と、該顕微鏡光学系４のピンホール１６を通過した蛍光を検出する光検出器（信号光検出部）５と、変調部３により変調された照明光Ｌ１，Ｌ２を検出するディテクタ（照明光検出部）６と、光検出器５により検出された蛍光の強度信号およびディテクタ６により検出された照明光Ｌ１，Ｌ２の強度信号を復調する復調部７と、該復調部７により復調された蛍光の強度信号に基づいて蛍光画像を生成する画像生成部８とを備えている。
　変調部３は、レーザ光源２からのレーザ光を２つの光路に分岐する第１ビームスプリッタ（分岐部）９と、各光路に配置され、各光路を通過するレーザ光を交互のタイミングでオンオフするように変調する音響光学変調器（ＡＯＭ）のような変調器１０ａ，１０ｂと、これらの変調器１０ａ，１０ｂを制御する変調制御部１１と、変調器１０ａ，１０ｂから出力された照明光Ｌ１，Ｌ２を合波する第２ビームスプリッタ１２とを備えている。第２ビームスプリッタ１２は、一方の光路の光軸に対して４５°とは微小に異なる角度をなして配置されており、合波後の２つの照明光Ｌ１，Ｌ２が異なる角度で射出されるようになっている。
　顕微鏡光学系４は、レーザ走査型蛍光顕微鏡の光学系であって、変調部３から射出されてきた２つの照明光Ｌ１，Ｌ２を走査するスキャナ１３と、該スキャナ１３により走査された照明光Ｌ１，Ｌ２を試料Ｘに集光する対物レンズ１４と、対物レンズ１４により集光された蛍光を照明光Ｌ１，Ｌ２の光路から分岐するダイクロイックミラー１５と、ピンホール１６とを備えている。
　図中、符号１７は光路形成用のミラーである。
　変調部３の第２ビームスプリッタ１２により射出角度が異ならされた２つの照明光Ｌ１，Ｌ２は、対物レンズ１４の瞳に異なる角度から入射させられることにより、試料Ｘ内の異なる位置に集光させられ、試料Ｘ内に存在する蛍光物質を励起して蛍光を発生させるようになっている。
　すなわち、一方の光路を通過した照明光Ｌ１は、光検出器５の前段に配置されているピンホール１６と光学的に共役な位置に集光させられる一方、他方の光路を通過した照明光Ｌ２は、ピンホール１６とは光学的に非共役な位置に集光させられるようになっている。
　変調制御部１１の作動により、２つの光路を通過する照明光Ｌ１，Ｌ２が交互に射出させられるので、図２に示されるように、共役な位置に集光させられる照明光Ｌ１および非共役な位置に集光させられる照明光Ｌ２の２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２が時間周期的に切り替わる照明光が生成されるようになっている。変調制御部１１は、復調部７に対し、変調信号を出力するようになっている。
　光検出器５は、例えば、光電子増倍管であり、対物レンズ１４により集光された蛍光の強度を検出するようになっている。
　復調部７は、光検出器５により検出された、２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２によりそれぞれ発生した蛍光の強度信号を、変調制御部１１から送られてくる変調器１０ａ，１０ｂの変調のタイミングに同期して復調し、それらの蛍光の強度信号の差分を出力するようになっている。
　画像生成部８は、復調部７から出力された蛍光の強度信号の差分の値を、スキャナ１３による走査位置の情報と対応づけて配列することにより、蛍光画像を生成するようになっている。ピンホール１６と共役な位置に照明光Ｌ１が集光されたときに、光検出器５により検出される蛍光には、焦点位置において発生した焦点蛍光の他、試料Ｘ内の焦点までの経路で発生した焦点外蛍光が一部含まれている。
　一方、ピンホール１６と非共役な位置に照明光Ｌ２が集光されたときに光検出器５により検出される蛍光には、焦点位置において発生した焦点蛍光はピンホール１６を通過できないので含まれておらず、焦点外蛍光のみが含まれている。したがって、復調部７から出力される、これらの蛍光の強度信号の差分には焦点外蛍光が除去された焦点蛍光のみが含まれていることになり、ノイズが少ない鮮明な蛍光画像を生成することができるようになる。
　ディテクタ６は、例えば、変調部３の後段に配置され、変調部３から出力された照明光Ｌ１，Ｌ２の一部を分離する反射率の低いハーフミラーからなるビームサンプラ１８と、該ビームサンプラ１８により分離された２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２を検出可能な位置に配置されたシングルポイントディテクタ１９とを備えている。
　シングルポイントディテクタ１９は、図示しないリレーレンズによって対物レンズ１４の瞳面と共役な位置に配置されていてもよいし、図示しない集光レンズの焦点位置に配置されていてもよいし、２つの照明光Ｌ１，Ｌ２を広い範囲で検出可能な大口径のものを採用してもよい。
　本実施形態においては、シングルポイントディテクタ１９の出力は、復調部７に入力され、復調部７からの出力は変調制御部１１に入力されるようになっている。
　変調制御部１１は、復調部７から入力される差分の値に応じて、いずれかの変調器１０ａ，１０ｂにより変調される照明光Ｌ１，Ｌ２の変調強度を補正するようになっている。すなわち、ビームサンプラ１８により分離された２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度に基づいて、変調制御部１１が、復調部７からの出力がゼロとなるようにいずれかの照明光の強度を変化させるので、２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度が精度よく一致するように調節されるようになっている。
　このように構成された本実施形態に係る画像取得装置１によれば、レーザ光源２から射出されたレーザ光は変調部３において、第１ビームスプリッタ９により２つの光路に分岐され各光路を通過させられる間に、各々の光路に配置された変調器１０ａ，１０ｂによって変調され、第２ビームスプリッタ１２によって合波されて異なる角度で射出される。
　変調部３から出力された、時間周期的に２つの状態が変化する照明光Ｌ１，Ｌ２は、顕微鏡光学系４に入射されるとともに、その一部がビームサンプラ１８によって分離されてシングルポイントディテクタ１９により検出される。顕微鏡光学系４内のスキャナ１３によって走査され対物レンズ１４によって集光された２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２は試料Ｘ内の２つの異なる位置に集光させられて、各集光位置において蛍光を発生させる。
　２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２が照射されることにより試料Ｘにおいて発生した蛍光は光検出器５によって検出され、復調部７に入力される。復調部７においては、変調部３における変調に同期した復調を受けることにより、各状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の照射により発生した蛍光の強度信号の差分が復調部７から出力される。
　上述したように、復調部７から出力される蛍光の強度信号の差分は、焦点外蛍光が除去された照明光の焦点位置からの蛍光のみの強度信号となっているので、この差分の値とスキャナ１３による走査位置とを、画像生成部８において対応づけて配列することにより、ノイズのない鮮明な蛍光画像を取得することができる。
　この場合において、復調部７において焦点外蛍光を精度よく除去するためには、２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度が同一であることが必要である。観察に先立って、変調部３から出力される２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度が同一となるように変調制御部１１が設定されるが、温度等の使用環境が変動することにより、各変調器１０ａ，１０ｂから出力される照明光Ｌ１，Ｌ２の強度に差が発生する場合がある。
　本実施形態に係る画像取得装置１によれば、変調部３から出力される照明光Ｌ１，Ｌ２の一部がビームサンプラ１８によって分離され、シングルポイントディテクタ１９により検出され、検出された照明光Ｌ１，Ｌ２の強度信号が復調部７によって復調されることにより、２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の信号強度の差分が復調部７から出力される。そして、復調部７から出力された差分が変調制御部１１に入力されることにより、変調制御部１１が差分に応じて各変調器１０ａ，１０ｂにより変調される照明光Ｌ１，Ｌ２の変調強度が補正される。
　すなわち、２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度信号の差分がゼロであれば変調強度の補正は行われないので、２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度が精度よく一致させられる。これにより、復調部７において焦点外蛍光を精度よく除去することができ、使用環境が変動しても、作業者が観察毎に照明光Ｌ１，Ｌ２の強度比率の調整を行うことなく、ノイズのない鮮明な蛍光画像を取得することができるという利点がある。
　特に、本実施形態においては、蛍光の強度信号の差分を出力する復調部７を照明光Ｌ１，Ｌ２の強度信号の差分を求めるために利用しているので、ビームサンプラ１８とシングルポイントディテクタ１９とを新たに設置するだけで足り、簡易な構成で低コストに実現できるという利点がある。
　なお、蛍光用の復調部７とは別に照明光用の復調部を用意してもよい。
　また、本実施形態においては、焦点外蛍光を除去するために変復調を利用する画像取得装置１を例示して説明したが、これに代えて、図３に示されるように、ＳＡＸ顕微鏡に適用することにしてもよい。
　すなわち、変調部３が、図３に示されるように、異なるピーク値を有し、かつ、時間積分強度が等しい２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２を生成する点で上記実施形態と相違している。
　また、変調器１０ａ，１０ｂは、音響光学変調器に代えて、電気光学変調器を採用してもよい。
　ピーク強度が高い方の照明光Ｌ１では試料Ｘにおいて発生する蛍光が飽和し、ピーク強度の低い方の照明光Ｌ２では蛍光が飽和しない状態とする場合に、使用環境が変動しても、２つの状態での照明光Ｌ１，Ｌ２の時間積分強度を精度よく一致させた状態に維持することができ、高精度の観察を行うことができる。
　次に本発明の第２の実施形態に係る画像取得装置２０について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る画像取得装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
　本実施形態に係る画像取得装置２０は、図４に示されるように、２光子励起顕微鏡に適用したものであり、極短パルスレーザ光からなる照明光を２つの光路に分岐し、各光路に配置された変調器１０ａ，１０ｂにより異なる周波数で変調して、試料Ｘの異なる２点に集光し、各集光点から発せられた蛍光を検出して復調することにより、２点からの蛍光を別々に取得するようになっている。
　具体的には、一方の光路の第１変調器１０ａは、図５Ａに示されるように、レーザ光源２からの極短パルスレーザ光のパルスを１つ置きに遮断して、５０％デューティとなるように変調させるようになっている。
　他方の第２変調器１０ｂは、図５Ｂに示されるレーザ光源２からの極短パルスレーザ光の全てのパルスのピーク強度を、図５Ｃに示されるように、７０％に低下させるようになっている。
　例えば、レーザ光源２から射出される光が８０ＭＨｚである場合に、第１変調器１０ａは、レーザ光源２からの極短パルスレーザ光を変調して４０ＭＨｚの照明光Ｌ２を生成するようになっている。これにより、照明光Ｌ２は、４０ＭＨｚで強度が変化する交流パターンを有している。第２変調器１０ｂは、レーザ光源２からの極短パルスレーザ光のピーク強度を７０％に変調して８０ＭＨｚの照明光Ｌ１を生成している。
　そして、光検出器５により検出された試料Ｘからの蛍光の強度信号を２つの復調部２１ａ，２１ｂに入力する。入力される信号は二つの焦点から来る蛍光信号の合計であり、蛍光信号は照明光Ｌ１のピーク強度の２乗に比例するので、到着パルスごとに時間関数で表現すると、Ｆａｌｌ（ｔ）＝［１０２＋７２，７２，１０２＋７２，７２］と表現される。
　一方の第１復調部２１ａでは、第１変調器１０ａの変調信号に同期する復調信号として、ｃｏｄｅ１（ｔ）＝（１，－１，１，－１）が乗算されて積分された蛍光信号が出力される。
　具体的には、Ｌ１に対応するＦ１＝Ｆａｌｌ（ｔ）・ｃｏｄｅ１（ｔ）＝１０２＋７２－７２＋１０２＋７２－７２＝２００が出力される。
　また、他方の第２復調部２１ｂでは、第２変調器１０ｂの変調信号に同期する復調信号としてｃｏｄｅ１＝（１，１，１，１）が乗算されて積分された後、Ｌ１に対応する蛍光信号が差分されＬ２に対応する蛍光信号が出力される。具体的には、蛍光信号は照明光Ｌ１のピーク強度の２乗に比例するので、Ｆ２＝Ｆａｌｌ（ｔ）・ｃｏｄｅ２（ｔ）－Ｆ１＝１０２＋７２＋７２＋１０２＋７２＋７２－２００≒２００が出力される。
　これにより、２つの復調部２１ａ，２１ｂから出力される蛍光の強度信号は略同等となり、これらの蛍光強度を用いて生成される蛍光画像の輝度ムラの発生を防止することができる。
　この場合において、シングルポイントディテクタ１９により検出され復調部２１ａ，２１ｂにより復調された２つの状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度信号は、第１の実施形態とは異なって、差分として出力されることなく、別々の強度信号として出力される。
　したがって、各復調部２１ａ，２１ｂから出力された各状態の照明光Ｌ１，Ｌ２の強度信号が、上記の例ではＬ１：Ｌ２＝７：１０の場合に、各変調器１０ａ，１０ｂにおける変調強度の補正が行われなくなるように、変調制御部１１が制御するようになっている。すなわち、変調制御部１１は、第１復調部２１ａから出力されてきた照明光Ｌ１の強度信号に、予め設定された比率、上記の例では１０／７を乗算して得られた値と第２復調部２１ｂから出力されてきた照明光Ｌ２の強度信号との差分がゼロとなるように、２つの変調器１０ａ，１０ｂを制御する。
　このように、本実施形態に係る画像取得装置２０によれば、使用環境が変動しても、作業者が観察毎に照明光Ｌ１，Ｌ２の強度比率の調整を行うことなく、２点同時検出によるフレームレートの向上を図りながら、輝度ムラの少ない蛍光画像を取得することができるという利点がある。
　なお、本実施形態においては、照明光Ｌ１，Ｌ２を試料Ｘに同時に２点で集光させて蛍光を検出する場合について説明したが、３点以上を同時に集光することにしてもよい。また、スキャナ１３によるポイントスキャン方式のものを例示したが、対物レンズ１４の光軸に沿う方向に異なる位置に入射されるシート状の照明光により発生する蛍光をカメラによって撮影するライトシート顕微鏡に適用してもよい。
　また、２つの変調器１０ａ，１０ｂによって別々に変調される結果、２つの照明光Ｌ１，Ｌ２の偏光状態が異なる場合に、ビームサンプラ１８によるサンプリング比率が照明光Ｌ１，Ｌ２毎に異なる場合が発生し得る。このような場合には、２つの照明光Ｌ１，Ｌ２が同じ強度を有していてもシングルポイントディテクタ１９において異なる強度を有するものとして検出されてしまうので、事前に求めた補正係数によってシングルポイントディテクタ１９により検出された照明光Ｌ１，Ｌ２の強度信号を補正する信号補正部（図示略）を設けてもよい。
　また、変調制御部１１において２つの変調器１０ａ，１０ｂによる変調強度を補正することとしたが、一方の変調器１０ａのみにおいて変調強度を補正することにしてもよい。
　また、上記各実施形態においては、照明光Ｌ１，Ｌ２の変調強度の補正のタイミングは、特に限定されるものではないが、例えば、試料Ｘの蛍光観察を行う前に自動的に実施することにすればよい。照明光Ｌ１，Ｌ２の強度補正は試料Ｘを用いることなく実施でき、試料Ｘにダメージを与えずに行うことができる。
　１，２０　画像取得装置
　２　レーザ光源（光源）
　３　変調部
　４　顕微鏡光学系（照明光学系）
　５　光検出器（信号光検出部）
　６　ディテクタ（照明光検出部）
　７，２１ａ，２１ｂ　復調部
　８　画像生成部
　９　第１ビームスプリッタ（分岐部）
　Ｌ１，Ｌ２　照明光
　Ｘ　試料

Claims (6)

  1. 　光源からの光を変調することにより、異なる２つの状態が時間周期的に切り替わる照明光を生成する変調部と、
    　該変調部により生成された前記照明光を検出する照明光検出部と、
    　前記変調部により生成された前記照明光を試料に照射する照明光学系と、
    　該照明光学系による前記照明光の試料における照射位置において発生した信号光を集光して検出する信号光検出部と、
    　該信号光検出部により検出された前記信号光の強度信号および前記照明光検出部により検出された前記照明光の強度信号に対し前記変調に対する復調を行う復調部と、
    　該復調部により復調された前記信号光の強度信号に基づいて信号光画像を生成する画像生成部とを備え、
    　前記変調部が、前記復調部により復調された前記照明光の強度信号に基づいて前記照明光の変調強度を補正する画像取得装置。
  2. 　前記２つの状態は、時間積分強度が等しくなる状態であり、
    　前記復調部が、状態毎に復調された前記照明光の時間積分強度の差分を出力し、
    　前記変調部は、前記差分がゼロとなるように前記変調強度を補正する請求項１に記載の画像取得装置。
  3. 　前記２つの状態が、前記照明光を試料の異なる位置に照射する状態である請求項１または請求項２に記載の画像取得装置。
  4. 　前記２つの状態が、試料において発生する前記信号光が飽和する状態と飽和しない状態である請求項１または請求項２に記載の画像取得装置。
  5. 　前記光源からの光を２つの光路に分岐する分岐部を備え、
    　前記変調部が、前記分岐部により分岐された各前記光路の光をそれぞれ異なる周波数で変調するとともに、前記復調部により復調された２つの前記照明光の強度比が予め設定された値となるように前記照明光の変調強度を補正する請求項１に記載の画像取得装置。
  6. 　前記照明光検出部により検出された前記照明光の強度信号を予め設定された補正係数により補正する信号補正部を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の画像取得装置。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112507956A (zh) * 2020-12-21 2021-03-16 北京百度网讯科技有限公司 信号灯识别方法、装置、电子设备、路侧设备和云控平台
JP7536028B2 (ja) 2019-03-25 2024-08-19 エイアイ・バイオメッド・コーポレーション 組織検出システムおよびその使用方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008012852A (ja) * 2006-07-07 2008-01-24 Konica Minolta Business Technologies Inc 画像形成装置
JP2011141427A (ja) * 2010-01-07 2011-07-21 Seiko Epson Corp プロジェクター
JP2015168184A (ja) * 2014-03-07 2015-09-28 株式会社リコー 光書き込み装置、画像形成装置及び光書き込み方法
WO2015163261A1 (ja) * 2014-04-24 2015-10-29 オリンパス株式会社 顕微鏡および顕微鏡観察方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008012852A (ja) * 2006-07-07 2008-01-24 Konica Minolta Business Technologies Inc 画像形成装置
JP2011141427A (ja) * 2010-01-07 2011-07-21 Seiko Epson Corp プロジェクター
JP2015168184A (ja) * 2014-03-07 2015-09-28 株式会社リコー 光書き込み装置、画像形成装置及び光書き込み方法
WO2015163261A1 (ja) * 2014-04-24 2015-10-29 オリンパス株式会社 顕微鏡および顕微鏡観察方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7536028B2 (ja) 2019-03-25 2024-08-19 エイアイ・バイオメッド・コーポレーション 組織検出システムおよびその使用方法
CN112507956A (zh) * 2020-12-21 2021-03-16 北京百度网讯科技有限公司 信号灯识别方法、装置、电子设备、路侧设备和云控平台

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