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WO2017169192A1 - Ｐｃｒ用容器 - Google Patents

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Publication number
WO2017169192A1
WO2017169192A1 PCT/JP2017/005127 JP2017005127W WO2017169192A1 WO 2017169192 A1 WO2017169192 A1 WO 2017169192A1 JP 2017005127 W JP2017005127 W JP 2017005127W WO 2017169192 A1 WO2017169192 A1 WO 2017169192A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pcr
pcr container
container
angle
cells
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/005127
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
金子　泰久
Original Assignee
富士フイルム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士フイルム株式会社 filed Critical 富士フイルム株式会社
Priority to CN201780018521.1A priority Critical patent/CN108779423B/zh
Priority to JP2018508529A priority patent/JP6875375B2/ja
Publication of WO2017169192A1 publication Critical patent/WO2017169192A1/ja
Priority to US16/118,547 priority patent/US10710080B2/en

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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
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    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L3/5085—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates
    • B01L3/50851—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above for multiple samples, e.g. microtitration plates specially adapted for heating or cooling samples
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    • B01L2200/0647—Handling flowable solids, e.g. microscopic beads, cells, particles
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    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/12—Specific details about materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/16—Surface properties and coatings
    • B01L2300/161—Control and use of surface tension forces, e.g. hydrophobic, hydrophilic

Definitions

  • the present invention relates to a PCR container, and more particularly to a PCR container that can be used for both cell photography and PCR processing.
  • the target cells are separated by flow cytometry.
  • flow cytometry cells are dispersed in a fluid, the fluid is finely flowed, the cells are optically analyzed, and the cells to be obtained are determined and sorted based on the analysis results. This is an analysis.
  • a plurality of cells are put together on a well slide, dropped into a minute well, a cell image is taken by microscopic examination, and the obtained image is analyzed to identify the target cell.
  • An operation is performed in which target cells are sucked with a capillary and transferred to a well plate used for PCR (polymerase chain reaction) treatment.
  • Examples of well plates used for such microscopic examination and PCR treatment include well plates described in Patent Documents 1 to 5 below.
  • Patent Documents 1 to 5 The well plate described in Patent Documents 1 to 5 is used for either image capturing or PCR, and is a well plate that can perform both cell image capturing and PCR processing. There wasn't. In addition, this method has problems such as difficult operation, time consuming and expensive capillaries.
  • the proportion of target cells in the sorted cells is about 70% to 80%. Therefore, all the cells sorted by flow cytometry are analyzed. Or, preprocessing for analysis was inefficient. Furthermore, since the bottom surface of the PCR plate is not flat, it is difficult to focus on the cells, and the cells were not observed on the PCR plate.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a PCR container capable of performing both cell observation and PCR processing with a single container.
  • the present invention is a PCR container, the inner bottom surface is flat, and the bottom surface shape is a circle or a polygon more than a quadrangle, and the size of the bottom surface is the bottom surface.
  • a vessel for PCR having a diameter of 0.05 mm ⁇ or more and 1 mm ⁇ or less when approximating a circumscribed circle, and an angle between the side surface adjacent to the bottom surface and the bottom surface is 50 ° or more and 80 ° or less.
  • the PCR container of the present invention by flattening the bottom surface inside the container, it becomes easy to focus on the whole cell when imaging the cell using a microscope or the like, and imaging of the cell is ensured. Can be done.
  • the shape of the bottom surface as a circle or a polygon more than a quadrangle, and by setting the size of the bottom surface within the above range, imaging using an objective lens with a normally used magnification (5 to 63 times), It is possible to capture the entire bottom surface with a single image with a preferable cell size. Therefore, imaging and image analysis can be performed efficiently.
  • the space formed by the bottom surface and the side surface can be narrowed by setting the angle of the side surface formed by the side surface adjacent to the bottom surface and the bottom surface to be 50 ° or more. Therefore, cells can be immersed in the liquid with a small amount of the culture solution used, and the depth of the culture solution in the container can be maintained, so that drying of the cells can be prevented.
  • the “angle on the side surface formed by the side surface and the bottom surface” refers to the angle on the side surface side of the angle formed between the inner surface and the side surface of the container.
  • the angle of the side surface between the side surface adjacent to the bottom surface and the bottom surface is 80 ° or less, bubbles in the culture solution in the PCR container are easily removed, and a good image that is not affected by the bubbles is taken. be able to.
  • the side surface preferably has a plurality of two or more inclined surfaces having different angles with respect to the bottom surface.
  • the angle formed by the inclined surface other than the inclined surface adjacent to the bottom surface and the parallel line of the bottom surface is greater than the angle on the side surface formed by the side surface adjacent to the bottom surface and the bottom surface.
  • the angle on the side surface side is 40 ° or more and 90 ° or less at an angle formed by an inclined surface not adjacent to the bottom surface and a parallel line of the bottom surface.
  • the side surface has a plurality of inclined surfaces having two or more steps, and the angle formed between the side surface not adjacent to the bottom surface and the parallel line of the bottom surface is set to 40 ° or more, whereby the cells are contained in the container.
  • the angle formed between the side surface not adjacent to the bottom surface and the parallel line of the bottom surface is set to 40 ° or more, whereby the cells are contained in the container.
  • an angle formed between an inclined surface other than the inclined surface in contact with the bottom surface and a parallel line of the bottom surface, and the angle on the side surface is the opening of the PCR container. It is preferable that it becomes small toward a bottom face from a part.
  • the angle of the inclined surface that forms the side surface that is not in contact with the bottom surface is gradually decreased toward the bottom surface, so that the cells can reach the bottom surface without staying on the inclined surface that is the side surface. Easy to introduce.
  • an angle that is twice the angle between the line connecting the center of the circle and the edge of the opening when approximated to a circle circumscribing the bottom surface is a straight line perpendicular to the bottom surface, It is preferable that it is 45 degrees or less.
  • an angle that is twice the angle formed by the line connecting the center of the circle approximated to the circle circumscribing the bottom surface and the end of the opening to a straight line perpendicular to the bottom surface is 45 ° or less.
  • the thickness of the bottom surface is preferably 0.2 mm or more and 1 mm or less.
  • the lens can be focused on the cell, and a good image can be captured. it can. If the thickness of the bottom surface is 0.2 mm or more, scratches on the outside of the container and attached dust do not affect the captured image due to the depth of focus, and only the cell image can be captured. It becomes. Further, if the thickness of the bottom surface is 1 mm or less, the lens can be brought close to the cell, so that an enlarged image of the cell can be easily obtained.
  • the transmittance for light having a wavelength of 350 nm or more and 800 nm or less is preferably 60% or more.
  • a good image can be taken by setting the transmittance of the material used for the PCR container to light having the above wavelength to 60% or more.
  • the material is preferably polypropylene or polystyrene.
  • the material used for the PCR container is limited. By using polypropylene or polystyrene, the transparency of the container can be obtained and a good image can be taken. In addition, since the PCR process is performed at a temperature, heat resistance can be ensured by using the above materials.
  • a low cell adhesion treatment is performed on the inside of the PCR container.
  • the low cell adhesion treatment is a treatment for preventing cells, ie, proteins, from adhering to the container, and is a treatment for coating a material that does not adsorb proteins on the inner surface of the PCR container. According to this aspect, cell adhesion to the inner wall of the container can be prevented, and the cells can surely reach the bottom surface, thereby enabling cell observation.
  • PCR container of the present invention cell imaging (observation) and PCR processing can be performed in the same container. Therefore, it is not necessary to move the cells in the container after taking the image, and the analysis can be performed efficiently. In addition, an expensive instrument such as a capillary is unnecessary, and the cost required for analysis can be reduced.
  • ⁇ is used to mean that the numerical values described before and after it are included as a lower limit value and an upper limit value.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing the configuration of an apparatus for capturing an image of a target cell sorted into a PCR container and acquiring optical information from the cell.
  • the analyzer is capable of acquiring fluorescence emission information from a fluorescent dye labeled on cells sorted by antigen-antibody reaction or the like, or acquiring a light transmission image of cells by visible light.
  • the analysis device 10 shown in FIG. 1 is a fluorescent excitation light source device 12 that emits light for measuring fluorescence emitted from a target cell, and a light that emits light (visible light) for measuring transmitted light of the cell.
  • a light source device 14 for visual field a tray 19 composed of a PCR container 17 and a plate 18 for storing cells 16 to be imaged, and a filter group (lens 20, excitation filter 22, dichroic mirror 24, and filter group holding a fluorescence filter 26 ( Filter cube) 28 and an imaging device 30 for imaging fluorescence and transmitted light from the cells 16.
  • a high-pressure mercury lamp, a high-pressure xenon lamp, an LED (light emitting diode), a LASER (light amplification by radiation, radiation, etc.) can be used. By using these light sources, it is possible to reliably perform analysis with high accuracy by narrowing the wavelength region of the irradiation light with which the cells 16 are irradiated.
  • a tungsten lamp, a halogen lamp, a white LED, or the like can be used. Even when these light sources are used, the cell 16 can be irradiated with light having a target wavelength by transmitting only the target wavelength with the excitation filter 22.
  • the bright field light source device 14 the same light source as the fluorescence excitation light source device 12 can be used.
  • the tray 19 includes a plate 18 and the PCR container 17 of the present embodiment, and the PCR container 17 holds cells 16 to be observed.
  • the cells 16 are supplied to the PCR container 17 together with the cell culture solution.
  • the PCR container 17 will be described later.
  • the lens 20 expands the fluorescence emitted from the cell 16 by the light output from the fluorescence excitation light source device 12 and the transmitted light transmitted through the cell 16 by the light output from the bright field light source device 14.
  • the lens 20 can be a lens used for optical measurement.
  • the filter group 28 includes an excitation filter 22, a dichroic mirror 24, and a fluorescence filter 26.
  • a filter cube For example, Zeiss Filter Set49 (DAPI) can be used.
  • the light emitted from the fluorescence excitation light source device 12 transmits only light in the target wavelength region through the excitation filter 22.
  • the light transmitted through the excitation filter 22 is reflected by the dichroic mirror 24 in the direction of the tray 19.
  • the fluorescence emitted from the cells 16 generated by the excitation light emitted from the fluorescence excitation light source device 12 is imaged by the imaging device 30 via the lens 20, the dichroic mirror 24, and the fluorescence filter 26.
  • the imaging device 30 can capture an image with only the information of the fluorescence emitted from the cell 16. Therefore, the image captured by the imaging device 30 can be acquired without being influenced by the excitation light, and the accuracy of the inspection based on the fluorescence emission information can be improved.
  • immunostaining is usually performed using a plurality of types of dyes in order to acquire a plurality of information for one cell according to the purpose of cell inspection. Made.
  • the fluorescence generated from the multiple types of dyes of the immunostained cells is photographed using a filter group having transmission characteristics or reflection characteristics suitable for the fluorescence wavelengths of the respective dyes.
  • the optical information can be obtained independently.
  • imaging the transmitted light of the cell 16 with the light source device 14 for bright fields it images with the filter group 28 removed. Thereby, the transmitted light can be imaged by the imaging device 30.
  • the imaging device 30 is not particularly limited as long as it can capture the fluorescence or transmitted light of the cells 16 sorted in the PCR container 17 on the tray 19.
  • a CCD (charge-coupled device) camera is used. be able to.
  • a method for sorting cells into a PCR container for example, flow cytometry can be used.
  • a plurality of cells are collected and dropped onto a tray in which the PCR container and the plate are integrated, and centrifuged (100 rpm, 1 minute) or allowed to stand to drop into the PCR container, thereby separating into the PCR container.
  • a cutting introduction mechanism such as a groove, a cut line, or a printed line on the plate.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view showing the shape of the PCR container 17 used in the present embodiment.
  • excitation light is irradiated from the back side of the PCR container 17, and fluorescence is emitted from cells emitted by the excitation light transmitted through the PCR container 17.
  • the material of the PCR container 17 is transparent, does not fluoresce, does not scatter, and can withstand the temperature cycle performed in PCR. It is necessary for the material to satisfy the following conditions.
  • the bottom surface 17a inside the PCR container 17 has a flat shape. By making the bottom surface 17a of the PCR container 17 flat, it is possible to focus on the cells 16, and image analysis of the cells 16 existing on the bottom surface 17a can be performed with high accuracy.
  • the shape of the bottom surface 17a is a circle or a polygon having a quadrangle or more. Further, when the size of the bottom surface 17a is approximated to a circle circumscribing the bottom surface 17a, the diameter L of the circle is 0.05 mm ⁇ to 1 mm ⁇ , and more preferably 0.2 mm ⁇ to 0.5 mm ⁇ . In FIG. 2, the bottom surface 17a is described as a circle. By taking the shape and size of the bottom surface 17a as described above, and using an objective lens with a magnification of 5 to 63 times, it is possible to photograph with a preferred cell image size and one field of view ( The entire bottom surface 17a can be imaged by one-shot imaging.
  • the imaging of the cells 16 can be performed by performing bright field imaging with fluorescence information from each dye, and superimposing the images after imaging to analyze the cells.
  • FIG. 3 is a diagram showing the relationship between the image capturing area 40 captured by the microscope and the flat bottom surface inside the PCR container.
  • the size of the bottom surface is such that the diameter L of the bottom surface is shorter than the length of the short side d of the two orthogonal sides, the long side e, and the short side d of the image capturing region 40 and is 1 ⁇ 2 of the length of the short side d.
  • the above is preferable.
  • the flat bottom surface 17a inside the PCR container in which the cells are stored is preferably a cell in the imaging region 40. It is possible to capture a cell with a size of an image and a single visual field.
  • the size of the image photographing area 40 is determined by the magnification of the objective lens of the microscope and the photographing camera.
  • the bottom surface 17a can be imaged in the image capturing area 40 by setting the diameter L of the bottom surface to 0.4 mm ⁇ .
  • the diameter L of the bottom surface is 0.2 mm ⁇ for a 40 ⁇ objective lens
  • the diameter L is 0.1 mm ⁇ for a 63 ⁇ objective lens
  • the diameter L is 1 mm ⁇ for a 5 ⁇ objective lens.
  • the bottom surface 17a can be imaged with one image.
  • the magnification for observing the cells is preferably a high magnification, but the magnification of the objective lens is preferably about 20 times because the accuracy of image analysis starts to be affected by the unevenness of the bottom surface of the PCR container when the magnification is increased.
  • the side surface 17b in contact with the bottom surface 17a is at an angle of the side surface side of the corner theta B in angle between the bottom surface 17a and side surface 17b is from 50 ° to less than 80 °.
  • angle theta B angle of 50 ° or more the size of the bottom surface, when approximated to a circle circumscribed by the diameter L of the circle is less 1mm ⁇ than 0.05 mm, is formed in the bottom surface 17a and side surface 17b Space can be narrowed, and the cells 16 can be immersed in the culture solution with a small amount of the culture solution.
  • the angle of the corner theta B is more preferably set to 55 ° to 70 ° or less.
  • the thickness t of the bottom surface 17a of the PCR container 17 is preferably 0.2 mm or more and 1 mm or less. As shown in FIG. 1, the cell 16 is preferably imaged from the bottom surface 17 a side of the PCR container 17. If the thickness of the bottom surface 17a is within 1 mm, the lens 20 can approach the cell 16, which is preferable. In addition, if it is 0.2 mm or more, the focus such as scratches on the outside of the PCR container 17, adhering dust, dirt, etc. is deviated from the depth of focus, so that only the cell image is not affected. Since it becomes possible to image, it is preferable.
  • the thickness t of the bottom surface 17a is more preferably 0.3 mm or more and 0.5 mm or less, and most preferably 0.4 mm.
  • the material of the PCR container 17 is preferably a material that easily transmits light when an image is taken, and specifically, a material selected from polypropylene or polystyrene can be used.
  • PCR containers using these materials have excellent heat resistance, and even when applied to a PCR thermal cycler, PCR processing can be performed without deterioration of the PCR container.
  • the PCR container manufactured using these materials preferably has a transmittance for light having a wavelength of 350 nm or more and 800 nm or less of 60% or more, more preferably 70% or more, and 80% or more. More preferably.
  • the shape of the outer side of the PCR container 17 is preferably a shape that can be mounted on a PCR processing apparatus, preferably a PCR thermal cycler. By making it correspond to the apparatus which performs PCR processing, PCR processing can be performed with the PCR container in which an image is captured. In the case where the PCR thermal cycler can be mounted, it is preferable that the gap between the outer shape of the PCR processing apparatus and the PCR container 17 is narrow. By reducing the gap with the PCR container 17, the temperature can be efficiently applied to the PCR container 17.
  • the outer shape and the inner shape of the PCR container are substantially the same (similar shape), and further, the thickness of the side surface from the bottom surface to the opening portion. It is more preferable that the thickness is uniform. By making the thickness uniform, heat can be efficiently and uniformly transmitted to the cells in the PCR container and the culture solution, so that the PCR process can be accurately controlled.
  • the inside of the PCR container 17 is subjected to a low cell adhesion treatment.
  • the low cell adhesion process is a process for preventing cells, ie, proteins, from adhering to the inside of the PCR container 17, and is a process for coating the surface with a material that does not adsorb proteins.
  • the cause of protein adsorption to the inside of the PCR container 17 is mainly caused by a hydrophobic interaction in which a hydrophobic group on the surface of the resin, which is a material of the PCR container 17, and a hydrophobic group in the protein bind to each other. . Therefore, the low cell adhesion treatment is possible by coating with a material having a hydrophilic group.
  • a polymer containing a phosphocholine group for example, Lipidure (registered trademark) (also known as MPC (2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine) polymer) (manufactured by NOF Corporation)), polyvinylpyrrolidone, polyethylene glycol, A material having a hydrophilic group such as PVA (polyvinyl alcohol) hydrogel or BSA (Bovine serum alcohol) can be used.
  • coating method coating can be performed by dipping in a dispersion obtained by dispersing the above materials in a solvent and then drying.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view showing the shape of the PCR container 117 of another embodiment.
  • the side surface can be bent in multiple steps and formed by two or more inclined surfaces.
  • the side surfaces 117c other than the side surface 117b in contact with the bottom surface 117a are angles formed by the parallel lines of the side surfaces 117c and the bottom surface 117a, and the angles of the side surface angles ⁇ C1 to ⁇ C3 are 40. It is preferable that the angle is from 90 ° to 90 °.
  • the angle is 40 ° or more, the cells do not stay on the inclined surface of the side surface 117c, and the cells can be reliably stored up to the bottom surface.
  • the angle of 40 ° or more is preferable because the opening 117d of the PCR container 117 can be narrowed, and a plurality of PCR containers can be stored in the narrow space of the tray 19. .
  • the angles ⁇ C1 to ⁇ C3 gradually decrease from the opening 117d toward the bottom surface 117a except for the side surface 117b that is in contact with the bottom surface 117a, that is, ⁇ C1 > ⁇ it is preferable that the C2> ⁇ C3.
  • the amount of the culture medium in the PCR container 117 can be easily adjusted by reducing the second-stage angle (the angle ⁇ C3 in FIG. 4) from the bottom surface in the PCR container 117. It becomes.
  • the pipette When removing the culture solution from the PCR container 117 using a pipette or the like, the pipette is applied to the side surface 117c to remove the culture solution, thereby forming a space close to the bottom surface of the PCR container formed by the bottom surface 117a and the side surface 117b. Only the culture medium can be left.
  • an angle ⁇ that is twice the angle formed by the line connecting the center of the bottom surface 117a (the center of the circle when approximated to a circumscribed circle) and the end of the opening 117d is a straight line perpendicular to the bottom surface.
  • the widest angle of A is preferably less than 45 °.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing the shape of a PCR container 217 of still another embodiment. 4 differs from the PCR container 117 of the embodiment shown in FIG.
  • Number of bending of the sides is not limited, it is possible to form the inclined surfaces with two sides 217c that is bent at a side surface 217b adjacent the bottom surface 217a, angle theta B and different angles of the corner theta C.

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Abstract

１つの容器で、細胞観察とＰＣＲ処理を行うことができるＰＣＲ用容器を提供する。内部の底面１７ａが、平坦であり、かつ、底面の形状が円形または四角形以上の多角形であり、底面１７ａの大きさは、底面１７ａを外接する円に近似した時の直径Ｌが０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下であり、底面１７ａと隣接する側面１７ｂと、１７ａ底面とのなす側面側の角θＢの角度が５０°以上８０°以下であるＰＣＲ用容器である。

Description

ＰＣＲ用容器
　本発明は、ＰＣＲ用容器に係り、特に、細胞撮影とＰＣＲ処理を兼用することができるＰＣＲ用容器に関する。
　複数の細胞から目的細胞を取得する方法として、フローサイトメトリーにより、目的細胞を分取することが行われている。フローサイトメトリーは、細胞を流体中に分散させ、その流体を細かく流して、細胞を光学的に分析し、この分析結果に基づいて取得する細胞の判定、および、分取を行い、その後の細胞の解析を行うものである。
　また、複数の細胞をまとめてウエルスライド上に滴下し、微小なウエルに細胞を落とし、顕微鏡検査によって細胞画像を撮影し、得られた画像を解析して目的細胞を特定した後に、その特定した目的細胞をキャピラリーにより吸引し、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）処理に用いられるウエルプレートに移す操作が行われている。
　このような顕微鏡検査や、ＰＣＲ処理に用いられるウエルプレートとしては、例えば、下記の特許文献１から５に記載のウエルプレートが挙げられる。
特表２０１０－５３１６４４号公報 特表２００７－５２６７６７号公報 特開２００９－２０４４５１号公報 特表２０１４－５１８７５８号公報 特表２００１－５０９２７２号公報
　特許文献１から５に記載されているウエルプレートは、画像撮影用、または、ＰＣＲ用のいずれかで使用されるものであって、細胞の画像撮影、および、ＰＣＲ処理の両方を行えるウエルプレートではなかった。また、この方法においては、操作が難しい、時間がかかる、キャピラリーが高額などの問題があった。
　また、フローサイトメトリーにおいては、分取した細胞の中において、目的の細胞である割合は、７割から８割程度であり、そのため、フローサイトメトリーにより分取した細胞の全てに対して、解析、または解析のための前処理を行うことは非効率であった。更に、ＰＣＲプレートの底面が平坦な構造ではないため、細胞に焦点を合わせることが難しく、ＰＣＲプレート上での細胞の観察は行われていなかった。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、１つの容器により、細胞観察とＰＣＲ処理のどちらも行うことが可能なＰＣＲ用容器を提供することを目的とする。
　本発明は上記目的を達成するために、ＰＣＲ用容器であって、内部の底面が、平坦であり、かつ、底面の形状が円形または四角形以上の多角形であり、底面の大きさは、底面を外接する円に近似した時の直径が０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下であり、底面と隣接する側面と、底面とのなす側面側の角度が５０°以上８０°以下であるＰＣＲ用容器を提供する。
　本発明のＰＣＲ用容器によれば、容器内部の底面を平坦とすることにより、顕微鏡などを用いて細胞を撮像する際に、細胞全体に焦点を合わせることが容易となり、細胞の撮像を確実に行うことが可能となる。また、底面の形状を円形または四角形以上の多角形とし、底面の大きさを上記範囲とすることにより、通常用いられる倍率（５倍以上６３倍以下）の対物レンズを用いて撮像することにより、好ましい細胞の大きさで、かつ底面全体を１枚の画像により撮像することが可能となる。したがって、効率良く撮像、画像の解析を行うことができる。
　また、底面と隣接する側面と、底面とのなす側面側の角度を５０°以上とすることにより、底面と側面により形成される空間を狭くすることができる。そのため、少ない培養液の使用量で、細胞を液中に浸すことができ、また、容器中の培養液の深さを保つことができるので、細胞の乾燥を防止することができる。なお、「側面と底面とのなす側面側の角度」とは、側面と底面とのなす角の、容器の内部側と側面側の角のうち、側面側の角度のことをいう。
　さらに、底面に隣接する側面と底面とのなす側面側の角度を８０°以下とすることにより、ＰＣＲ用容器内の培養液中の気泡が抜け易くなり、気泡に影響されない良好な画像を撮像することができる。
　本発明の別の態様においては、側面は、底面に対して異なる角度を有する二段以上の複数の傾斜面を有することが好ましい。
　この態様において、複数の傾斜面のうち、底面と隣接している傾斜面以外の傾斜面と、底面の平行線とのなす角度が、底面に隣接する側面と底面とがなす側面側の角度よりも浅い角度を有する傾斜面を、少なくとも１つ有する態様のＰＣＲ容器である場合には、容器の開口部を広くすることが可能となり、細胞を容器内に導入することが容易となる。
　本発明の別の態様においては、底面と隣接していない傾斜面と、底面の平行線とのなす角で、側面側の角度が４０°以上９０°以下であることが好ましい。
　この態様によれば、側面を二段以上の複数の傾斜面を有し、底面と隣接していない側面と、底面の平行線とのなす角度を４０°以上とすることにより、細胞を容器内に導入した場合に、細胞が底面まで到達せずに側面である傾斜面にとどまってしまうことを防止することができる。
　本発明の別の態様においては、複数の傾斜面のうち、底面と接している傾斜面以外の傾斜面と、底面の平行線とのなす角で、側面側の角度が、ＰＣＲ用容器の開口部から底面に向かって小さくなることが好ましい。
　この態様によれば、側面を形成する傾斜面で、底面と接していない傾斜面の角度を、底面に向かって徐々に小さくすることにより、側面である傾斜面にとどまることなく、細胞を底面まで導入しやすくすることができる。
　本発明の別の態様においては、底面に外接する円に近似した時の円の中心と開口部の端部とを結ぶ線が底面に対して垂直な直線となす角度の２倍の角が、４５°以下であることが好ましい。
　この態様によれば、底面に外接する円に近似した時の円の中心と、開口部の端部とを結ぶ線が底面に対して垂直な直線となす角度の２倍の角を４５°以下とすることにより、開口部が広くなることを防止し、プレート上に配置した際のスペースを狭くすることができる。また、開口部を狭くすることにより、側面の傾斜の角度が大きくなるので、細胞を底面まで導きやすくすることができる。
　本発明の別の態様においては、底面の厚みが、０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下であることが好ましい。
　この態様によれば、底面の厚みを上記範囲とすることにより、ＰＣＲ用容器の底面側から細胞を撮像した際に、細胞にレンズの焦点を当てることができ、良好な画像を撮像することができる。底面の厚みが０．２ｍｍ以上であると、焦点深度により、容器の外側のキズや付着したゴミなどが、撮像される画像に影響を及ぼすことがなくなり、細胞の画像のみを撮像することが可能となる。また、底面の厚みが１ｍｍ以下であると、レンズを細胞に接近させることが可能となるので、細胞の拡大画像を容易に取得することが可能となる。
　本発明の別の態様においては、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の光に対する透過率が６０％以上であることが好ましい。
　この態様によれば、ＰＣＲ用容器に用いられる材料の上記波長の光に対する透過率を６０％以上とすることにより、良好な画像を撮像することができる。
　本発明の別の態様においては、材質が、ポリプロピレンまたはポリスチレンであることが好ましい。
　この態様は、ＰＣＲ用容器に用いられる材料を限定したものであり、ポリプロピレンまたはポリスチレンを用いることにより、容器の透明性を得ることができ、良好な画像を撮像することができる。また、ＰＣＲ処理においては、温度をかけて処理するため、上記の材料を用いることにより、耐熱性を確保することができる。
　本発明の別の態様においては、ＰＣＲ容器の内側に、細胞低付着処理が施されていることが好ましい。
　細胞低付着処理は、細胞すなわちタンパク質を、容器に付着させないようにする処理であり、ＰＣＲ容器の内部表面にタンパク質を吸着させない材料をコートする処理である。この態様によれば、容器の内壁への細胞付着を防止して、底面に確実に細胞を到達させることができ、細胞観察が可能となる。
　本発明のＰＣＲ用容器によれば、細胞の撮像（観察）とＰＣＲ処理を、同じ容器内において行うことができる。したがって、画像を撮像した後に、容器内の細胞を移動させる操作が不要であり、効率良く、解析を行うことができる。また、キャピラリーなどの高価な器具が不要であり、解析に要するコストを下げることが可能となる。
細胞を撮像する装置の構成を示す概略構成図である。 ＰＣＲ用容器の形状を示す断面図である。 撮像される画像とＰＣＲ用容器の底面のサイズとの関係を示した図である。 他の実施形態のＰＣＲ用容器の形状を示す断面図である。 さらに他の実施形態のＰＣＲ用容器の形状を示す断面図である。
　以下、添付図面に従って本発明に係るＰＣＲ用容器について説明する。なお、本明細書において、「～」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
　≪解析装置≫
　まず、本実施形態のＰＣＲ用容器を適用し、画像を撮像する撮像装置を備える解析装置について説明する。
　図１は、ＰＣＲ用容器に分取された目的細胞の撮像や、細胞からの光学情報を取得する装置の構成を示す概略構成図である。好ましい態様として、抗原抗体反応などによって分取した細胞に標識した蛍光色素からの蛍光発光の情報の取得や、可視光による細胞の光透過画像の取得が可能な解析装置である。
　図１に示す解析装置１０は、対象となる細胞の発する蛍光を測定するための光を照射する蛍光用励起光源装置１２、細胞の透過光を測定するための光（可視光）を照射する明視野用光源装置１４、撮像の対象となる細胞１６を収納するＰＣＲ用容器１７およびプレート１８からなるトレー１９、および、レンズ２０、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４および蛍光フィルタ２６を保持したフィルタ群（フィルタキューブ）２８、ならびに、細胞１６からの蛍光および透過光を撮像する撮像装置３０を備える。
　蛍光用励起光源装置１２は、高圧水銀ランプ、高圧キセノンランプ、ＬＥＤ（light emitting diode）、または、ＬＡＳＥＲ（light amplification by stimulated emission of radiation）などを用いることができる。これらの光源を用いることにより、細胞１６に照射する照射光の波長領域を狭くすることにより、精度の高い分析を確実に行うことが可能となる。また、蛍光用励起光源装置１２としては、タングステンランプ、ハロゲンランプ、白色ＬＥＤなどを用いることができる。これらの光源を用いる場合でも、励起フィルタ２２で、目的の波長のみ透過させることで、細胞１６に目的の波長の光を照射させることができる。なお、明視野用光源装置１４としても、蛍光用励起光源装置１２と同様の光源を用いることができる。
　トレー１９は、プレート１８と、本実施形態のＰＣＲ用容器１７と、からなり、ＰＣＲ用容器１７は、観察対象となる細胞１６を保持する。細胞１６は、細胞培養液とともに、ＰＣＲ用容器１７に供される。ＰＣＲ用容器１７については、後述する。
　レンズ２０は、蛍光用励起光源装置１２から出力された光により細胞１６が発した蛍光、および、明視野用光源装置１４から出力された光が細胞１６を透過した透過光を拡大する。レンズ２０は、光学測定に使用されるレンズを用いることができる。
　フィルタ群２８は、励起フィルタ２２、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を備える。このようなフィルタ群２８の具体例としては、フィルタキューブを用いることが好ましく、例えば、Zeiss Filter Set49 (DAPI)を用いることができる。蛍光用励起光源装置１２から照射された光は、励起フィルタ２２により、目的の波長領域の光のみを透過する。励起フィルタ２２を透過した光は、ダイクロイックミラー２４において、トレー１９の方向に反射する。蛍光用励起光源装置１２から出射した励起光により生じた、細胞１６からの蛍光発光は、レンズ２０、ダイクロイックミラー２４、蛍光フィルタ２６を経て撮像装置３０により撮像される。励起光により発光する蛍光は、励起光に比べてより長波長側の波長帯域を有するので、ダイクロイックミラー２４を使用することにより、蛍光発光のみを透過させることが可能となる。更に、励起光は透過させずに、蛍光のみを透過させる蛍光フィルタ２６を用いることにより、撮像装置３０によって細胞１６からの蛍光発光のみの情報により撮像することが可能となる。従って、撮像装置３０により撮像される画像が、励起光に影響されることなく、画像を取得することができ、蛍光発光情報による検査の精度を向上させることができる。
　蛍光用励起光源装置１２から照射された光による蛍光撮影は、細胞の検査目的に応じて１つの細胞に対する複数の情報を取得するために、通常は複数の種類からなる色素を用いて免疫染色がなされる。この場合、この免疫染色された細胞の複数の種類の色素から生じる蛍光に対して、それぞれの色素の蛍光波長に適した透過特性または反射特性を有するフィルタ群を用いて撮影することにより、異なる波長の光学情報を独立して手得することができる。なお、明視野用光源装置１４により細胞１６の透過光を撮像する場合は、フィルタ群２８を取り外した状態で撮像する。これにより、透過光を撮像装置３０により撮像することができる。
　撮像装置３０としては、トレー１９上のＰＣＲ用容器１７中に分取された細胞１６の蛍光または透過光を撮像することができれば特に限定されず、例えば、ＣＣＤ（charge-coupled device）カメラを用いることができる。
　ＰＣＲ用容器に細胞を分取する方法としては、例えば、フローサイトメトリーにより行うことができる。また、複数の細胞をまとめて、ＰＣＲ用容器とプレートが一体となったトレー上に滴下し、遠心（１００ｒｐｍ・１分）または静置してＰＣＲ用容器に落とすことにより、ＰＣＲ用容器に分取することができる。ＰＣＲ用容器とプレートが一体となって形成されている場合には、プレートに、溝、切り取り線、または、印刷線などの切断導入機構を設けることが好ましい。この切断導入機構に従って、プレートを切断することにより、ＰＣＲ用容器を個別に処理することが可能となる。
　≪ＰＣＲ用容器≫
　図２は、本実施形態で用いられるＰＣＲ用容器１７の形状を示す断面図である。図１に示す解析装置１０においては、ＰＣＲ用容器１７の裏面側から励起光を照射し、ＰＣＲ用容器１７を透過したその励起光により発光した細胞から蛍光発光が生じる。この細胞の情報を含む蛍光を受光するため、これらの蛍光に対して、ＰＣＲ用容器１７の材質が、透明であること、自家蛍光しないこと、散乱しないこと、ＰＣＲにおいて行う温度サイクルに耐えられることなどの条件を満たす材質であることが必要となる。また、細胞１６を撮像するため、ＰＣＲ用容器１７の内部の底面１７ａが、平坦な形状である。ＰＣＲ用容器１７の底面１７ａを平坦とすることにより、焦点を細胞１６に合わせることが可能となり、底面１７ａに存在する細胞１６の画像解析を精度良く行うことができる。
　また、底面１７ａの形状は、円形または四角形以上の多角形である。また、底面１７ａの大きさは、底面１７ａに外接する円に近似した時、円の直径Ｌが０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下であり、０．２ｍｍφ以上０．５ｍｍφ以下であることがより好ましい。なお、図２は、底面１７ａを円形として記載されている。底面１７ａの形状、大きさを上記の形状、サイズとすることにより、そして、５倍以上６３倍以下の倍率の対物レンズを用いることにより、好ましい細胞画像の大きさで、かつ１視野による撮影（ワンショット撮影）で、底面１７ａ全体を撮像することができる。細胞の検査目的に応じて１つの細胞に対する複数の情報を取得するために、通常は複数種類の色素を用いて免疫染色を行うことが好ましい。従って、細胞１６の撮像は、それぞれの色素からの蛍光情報と、明視野撮影を行って、撮影後に各画像を重ね合わせて、細胞の解析を行うことができる。
　図３は、顕微鏡により撮像される画像撮像領域４０とＰＣＲ用容器の内部の平坦な底面との関係を示した図である。底面のサイズは、底面の直径Ｌが、画像撮影領域４０の直交する２辺、長辺ｅ、短辺ｄのうち短辺ｄの長さより短く、かつ、短辺ｄの長さの１／２以上とすることが好ましい。このように、底面の直径Ｌの長さをｄ＞Ｌ＞ｄ／２とすることにより、細胞が収納されるＰＣＲ用容器の内部の平坦な底面１７ａを、画像撮影領域４０内において、好ましい細胞画像の大きさで、かつ１視野による細胞の撮影が可能となる。この画像撮影領域４０のサイズは、顕微鏡の対物レンズの倍率と撮影カメラにより決定される。通常用いられるカメラを用いることにより、例えば、２０倍の対物レンズであれば、底面の直径Ｌを０．４ｍｍφとすることにより、画像撮影領域４０内に１枚で底面１７ａを撮像することができる。また、４０倍の対物レンズであれば底面の直径Ｌを０．２ｍｍφ、６３倍の対物レンズであれば直径Ｌを０．１ｍｍφ、５倍の対物レンズであれば直径Ｌを１ｍｍφとすることにより、１枚の画像で底面１７ａを撮像することができる。細胞を観察する倍率は高倍率が好ましいが、倍率が高くなるとＰＣＲ用容器の底面の凹凸などにより、画像解析の精度に影響が出始めることから、対物レンズの倍率は２０倍程度が好ましい。
　図２において、底面１７ａに接している側面１７ｂは、底面１７ａと側面１７ｂとがなす角で側面側の角θＢの角度が５０°以上８０°以下である。底面１７ａと側面１７ｂとがなす角θＢの角度を８０°以下とすることにより、培養液中の気泡を抜きやすくすることができる。また、角θＢの角度を５０°以上、底面のサイズを、外接する円に近似した時、円の直径Ｌが０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下とすることにより、底面１７ａと側面１７ｂとで形成される空間を狭くすることができ、少ない培養液量で、細胞１６を培養液に浸すことができる。さらに、培養液、および、細胞１６が乾燥することを防止することができるとともに、培養液の深さを確保することにより、培養液の液面のメニスカスにより、光が屈折し、画像解析に影響を及ぼすことを防止することができる。この角θＢの角度は、５５°以上７０°以下とすることがより好ましい。
　また、ＰＣＲ用容器１７の底面１７ａの厚みｔは０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下とすることが好ましい。図１に示すように、細胞１６の撮像は、ＰＣＲ用容器１７の底面１７ａ側から撮像する態様が好ましい。底面１７ａの厚みが１ｍｍ以内であれば、レンズ２０が細胞１６に接近することが可能となり、好ましい。また、０．２ｍｍ以上であれば、焦点深度から、ＰＣＲ用容器１７の外側のキズや付着したゴミ、汚れなどの焦点がずれて、撮像される画像に影響を及ぼさず、細胞の画像のみを撮像することが可能となるため好ましい。底面１７ａの厚みｔは、０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下が更に好ましく、０．４ｍｍが最も好ましい。
　ＰＣＲ用容器１７の材質としては、画像を撮像する際に、光を透過しやすい材質とすることが好ましく、具体的には、ポリプロピレン、または、ポリスチレンから選択される材料を用いることができる。また、これらの材料を用いたＰＣＲ用容器は、耐熱性も優れており、ＰＣＲサーマルサイクラーに適用してもＰＣＲ用容器が劣化することなくＰＣＲ処理を行うことができる。これらの材料を用いて製造されたＰＣＲ用容器は、３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の光に対する透過率が６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、８０％以上であることがさらに好ましい。なお、本発明において、「透過率」とは、透過光を入射光により割った値（透過率＝透過光／入射光）であり、例えば１００の光束を入射させたときに透過した光束が６０であれば透過率は６０％と算出される。
　ＰＣＲ用容器１７の外側の形状は、ＰＣＲ処理を行う装置、好ましくは、ＰＣＲサーマルサイクラーへの搭載が可能な形状であることが好ましい。ＰＣＲ処理を行う装置に対応させることにより、画像を撮像したＰＣＲ用容器のまま、ＰＣＲ処理を行うことができる。ＰＣＲサーマルサイクラーに搭載可能とする場合、ＰＣＲ処理を行う装置とＰＣＲ用容器１７の外形の隙間が狭いことが好ましい。ＰＣＲ用容器１７との隙間を小さくすることにより、温度を効率良くＰＣＲ用容器１７にかけることができる。また、ＰＣＲ処理を行う際に、温度を効率良くかけるためには、ＰＣＲ用容器の外側形状と内側形状がほぼ同じ（相似形）であることが好ましく、更には底面から開口部にかけて側面の厚さが均一であることがより好ましい。厚みを均一にすることにより、ＰＣＲ用容器内の細胞、および、培養液に効率良く、均一に熱が伝わることにより、ＰＣＲ処理を精度よく制御することが可能となる。
　また、ＰＣＲ用容器１７の内部には、細胞低付着処理が施されていることが好ましい。細胞低付着処理は、細胞、すなわち、タンパク質がＰＣＲ用容器１７の内部に付着しないようにする処理であり、表面にタンパク質を吸着させない材料をコートする処理である。。ＰＣＲ用容器１７の内部へのタンパク質吸着の原因は、ＰＣＲ用容器１７の材料である樹脂表面の疎水性基とタンパク質中の疎水性基が結合する疎水性相互作用が主な原因とされている。したがって、細胞低付着処理は、親水性基を有する材料を用いてコーティングすることにより可能となる。
　細胞低付着処理に用いられる材料として、ホスホコリン基を含む高分子（例えば、リピジュア（登録商標）（別名：ＭＰＣ（2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine）ポリマー）（日油株式会社製））、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ＰＶＡ（polyvinyl alcohol）ヒドロゲル、ＢＳＡ（Bovine serum albumin）などの親水性基を有する材料を用いることができる。コーティング方法としては、上記材料を溶媒に分散させた分散液に、ディップ浸漬後、乾燥することにより、コーティングを行うことができる。
　ＰＣＲ用容器１７の内部に細胞低付着処理を施すことにより、ＰＣＲ用容器１７の内壁への細胞の付着を防止して、底面１７ａに確実に細胞を到達させて、細胞観察を可能とすることができる。
　図４は、他の実施形態のＰＣＲ用容器１１７の形状を示す断面図である。図４に示すように、側面は、多段で屈曲し、二段以上の傾斜面により形成することもできる。多段で屈曲している場合、底面１１７ａと接している側面１１７ｂ以外の側面１１７ｃは、それぞれの側面１１７ｃと底面１１７ａの平行線とがなす角で側面側の角θＣ１～θＣ３の角度が４０°以上９０°以下であることが好ましい。角度が４０°以上であると、側面１１７ｃの傾斜面に細胞がとどまることがなくなり、細胞が底面までに確実に収納することが可能となる。また、角度が４０°以上であることにより、ＰＣＲ用容器１１７の開口部１１７ｄを狭くすることが可能となり、トレー１９の狭いスペースにおいて複数のＰＣＲ用容器を収納することが可能となるため、好ましい。
　さらに、多段で屈曲している場合、底面１１７ａに接している側面１１７ｂを除き、開口部１１７ｄから底面１１７ａに向かって、角θＣ１～θＣ３が、徐々に小さくなる、すなわち、θＣ１＞θＣ２＞θＣ３とすることが好ましい。このような構成とすることにより、ＰＣＲ用容器１１７内に分取された細胞を底面１７ａに導きやすくすることが可能となる。また、ＰＣＲ用容器１１７内の底面から二段目の角度（図４においては、角θＣ３）を小さくすることにより、ＰＣＲ用容器１１７内の培養液の量の調節を容易に行うことが可能となる。ピペットなどを用いてＰＣＲ用容器１１７内の培養液を抜く場合、側面１１７ｃにピペットをあてて培養液を抜くことにより、底面１１７ａと側面１１７ｂとにより形成されるＰＣＲ用容器の底面に近い空間にのみ培養液を残すことが可能となる。角θＣ１～θＣ３の角度は、例えば、図４において、θＣ１＝９０°、θＣ２＝７５°、θＣ３＝４５°とすることができる。
　また、底面１１７ａの中心（外接する円に近似した時の円の中心）と開口部１１７ｄの端部とを結ぶ線が底面に対して垂直な直線となす角度の２倍の角である角θＡの角度で最も広い角度が４５°未満であることが好ましい。角θＡの角度を４５°未満とすることにより、ＰＣＲ用容器１１７の開口部１１７ｄが広くなることを防止し、トレー１９のスペースを小さくすることが可能となる。
　図５は、さらに別の実施形態のＰＣＲ用容器２１７の形状を示す断面図である。図４に示す実施形態のＰＣＲ用容器１１７とは、側面の屈曲する段数が異なっている。側面の屈曲する段数は限定されず、底面２１７ａに隣接する側面２１７ｂと、角θＢと異なる角度の角θＣで屈曲する側面２１７ｃの２段の傾斜面で形成することが可能である。
１０　解析装置
１２　蛍光用励起光源装置
１４　明視野光源装置
１６　細胞
１７、１１７、２１７　ＰＣＲ用容器
１７ａ、１１７ａ、２１７ａ　底面
１７ｂ、１１７ｂ、１１７ｃ、２１７ｂ、２１７ｃ　側面
１１７ｄ　開口部
１８　プレート
１９　トレー
２０　レンズ
２２　励起フィルタ
２４　ダイクロイックミラー
２６　蛍光フィルタ
２８　フィルタ群（フィルタキューブ）
３０　撮像装置
４０　画像撮影領域

Claims (9)

  1. 　ＰＣＲ用容器であって、
    　内部の底面が、平坦であり、かつ、前記底面の形状が円形または四角形以上の多角形であり、
    　前記底面の大きさは、前記底面を外接する円に近似した時の直径が０．０５ｍｍφ以上１ｍｍφ以下であり、
    　前記底面と隣接する側面と、前記底面とのなす前記側面側の角度が５０°以上８０°以下であるＰＣＲ用容器。
  2. 　側面は、前記底面に対して異なる角度を有する二段以上の複数の傾斜面を有する請求項１に記載のＰＣＲ用容器。
  3. 　前記複数の傾斜面のうち、前記底面と接している傾斜面以外の傾斜面と、前記底面の平行線とのなす角で、側面側の角度が４０°以上９０°以下である請求項２に記載のＰＣＲ用容器。
  4. 　前記複数の傾斜面のうち、前記底面と接している傾斜面以外の傾斜面と、前記底面の平行線とのなす角で、側面側の角度が、前記ＰＣＲ用容器の開口部から前記底面に向かって小さくなる請求項２または３に記載のＰＣＲ用容器。
  5. 　前記底面に外接する円に近似した時の円の中心と前記ＰＣＲ用容器の開口部の端部とを結ぶ線が前記底面に対して垂直な直線となす角度の２倍の角が、４５°以下である請求項２から４のいずれか１項に記載のＰＣＲ用容器。
  6. 　前記底面の厚みが、０．２ｍｍ以上１ｍｍ以下である請求項１から５のいずれか１項に記載のＰＣＲ用容器。
  7. 　３５０ｎｍ以上８００ｎｍ以下の波長の光に対する透過率が６０％以上である請求項１から６のいずれか１項に記載のＰＣＲ用容器。
  8. 　材質が、ポリプロピレンまたはポリスチレンである請求項１から７のいずれか１項に記載のＰＣＲ用容器。
  9. 　前記ＰＣＲ用容器の内側に、細胞低付着処理が施されている請求項１から８のいずれか１項に記載のＰＣＲ容器。
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