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WO2016063702A1 - 多糖類モノリス構造体の製造方法 - Google Patents

多糖類モノリス構造体の製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2016063702A1
WO2016063702A1 PCT/JP2015/077917 JP2015077917W WO2016063702A1 WO 2016063702 A1 WO2016063702 A1 WO 2016063702A1 JP 2015077917 W JP2015077917 W JP 2015077917W WO 2016063702 A1 WO2016063702 A1 WO 2016063702A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polysaccharide
monolith structure
component
monolith
production method
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/077917
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
夏己 岡庭
名嘉真　剛
恵里 岩本
修治 佐々木
拓生 池田
Original Assignee
Jnc株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jnc株式会社 filed Critical Jnc株式会社
Priority to US15/520,390 priority Critical patent/US20190210003A1/en
Priority to EP15853157.4A priority patent/EP3211028A4/en
Priority to JP2016555155A priority patent/JPWO2016063702A1/ja
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    • C08J2301/00—Characterised by the use of cellulose, modified cellulose or cellulose derivatives
    • C08J2301/08—Cellulose derivatives
    • C08J2301/10—Esters of organic acids
    • C08J2301/12—Cellulose acetate

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a polysaccharide monolith structure.
  • biopharmaceuticals produced using various animals, insects and their cells and microorganisms as hosts.
  • productivity of biopharmaceuticals has been improved by large-capacity culture and high-titer culture, and the efficiency of the purification process has been demanded accordingly.
  • biopharmaceuticals are derived from living organisms, very advanced purification techniques are required, and they are performed in combination with centrifugation, ultrafiltration, microfiltration, chromatography, etc. In particular, chromatography is the core of purification. Technology.
  • Chromatographic packing materials used for the separation of proteins, nucleic acids, viruses, etc. which are raw materials for biopharmaceuticals, include porous particles with various pore sizes and porous particles with functional groups introduced to impart adsorption performance. Manufactured and marketed. Many of these chromatographic fillers use natural polymers such as cellulose. However, most of the commercially available products are mainly intended for the separation of proteins having a molecular weight of several hundreds of thousands, and few are suitable for large biopolymers such as nucleic acids having a molecular weight of 1 million or more. This is because it is difficult to increase the pore diameter without impairing the pressure resistance of the particles.
  • a monolith which is a lump porous body having a three-dimensional network structure skeleton and voids continuously has attracted attention as a next-generation porous material.
  • the monolith can independently control the size of the skeleton and the pores serving as the flow paths.
  • a silica monolith formed using silica as a material is commercially available as a monolith column, which has a high resolution and excellent mechanical strength.
  • a technology for controlling the skeleton diameter and the flow path hole and a technology for controlling the surface pore are being developed.
  • most of the sizes are capillary sizes having an inner diameter of 0.3 mm or less. This is because a capillary-sized monolith column is easy to prepare.
  • the silica monolith is for analysis and does not have an adsorption capacity that can be used for purification steps in biopharmaceutical production.
  • various monolith structures composed of polymer materials and production methods thereof have been reported so far (Patent Documents 1 to 3).
  • Patent Documents 4 to 6 disclose a thermally induced phase separation method using a high-boiling solvent as a method for producing a porous membrane using a cellulose derivative.
  • the hole is not a continuous hole but an independent hole, and it is difficult to use it as a column material. Further, it is in the form of a film having a thickness of 1 to 100 ⁇ m, and a molded body having an arbitrary shape cannot be produced. That is, there are few reports on monolith structures made of polysaccharides and derivatives thereof, having continuous pores, and capable of producing molded bodies of any shape, and those using lactic acid esters as production methods are not known. In view of such circumstances, the present invention is a porous body made of a polysaccharide, which is a natural polymer, and has an average pore size that is suitable for separating biomolecules and can be molded into any shape. An object of the present invention is to provide a method for manufacturing a monolith structure.
  • the present inventors have found that a monolith structure can be easily produced from a polysaccharide by selecting an appropriate solvent, and have completed the present invention. That is, the present invention is as follows. [1] A method for producing a polysaccharide monolith structure, wherein a polysaccharide is obtained by dissolving a polysaccharide in a mixed solvent of a first component and a second component below the boiling point of the mixed solvent.
  • a third step of saponifying the obtained polysaccharide monolith structure is performed after the step of producing the polysaccharide monolith structure by the production method according to any one of [1] to [9].
  • a method for producing a saponified polysaccharide monolith structure comprising: [11] Fourth step of performing a crosslinking and / or ligand introduction treatment on the obtained saponified polysaccharide monolith structure after the step of manufacturing the saponified polysaccharide monolith structure by the production method according to [10]
  • a monolith structure having a pore size suitable for separation of biopolymers can be provided from inexpensive polysaccharides and polysaccharide derivatives. Further, through the steps of saponification and cross-linking and / or introduction of a ligand, the monolith structure can be arbitrarily given adsorption performance for biopolymers, and the purification method of the target substance using the monolith structure Useful materials can be provided.
  • FIG. 4 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 3.
  • FIG. 6 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 4.
  • FIG. 10 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 6.
  • 10 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 7.
  • FIG. 10 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 8.
  • 10 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 9.
  • 14 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 11.
  • 18 is an SEM photograph of a cross section of the monolith structure body of Production Example 15.
  • the graph which shows the relationship between the flow velocity at the time of the liquid passing of the test example 2, and a pressure.
  • the polysaccharide is dissolved in a mixed solvent of the first component and the second component below the boiling point of the mixed solvent to obtain a polysaccharide solution. And a second step of cooling the polysaccharide solution to obtain a polysaccharide monolith structure.
  • Polysaccharides used as materials include polysaccharide derivatives, and preferred materials include those in which the sugar hydroxyl group is esterified. By using such a polysaccharide derivative, nonspecific adsorption can be suppressed when the resulting monolith structure is used as a chromatography substrate.
  • esterified polysaccharides include esterified cellulose and esterified glucomannan. Specific examples include cellulose acetate, cellulose propionate, cellulose butyrate, cellulose acetate propionate, cellulose acetate butyrate, and glucomannan acetate. Among them, cellulose acetate is particularly preferable.
  • the molecular weight of the polysaccharide used as the material is not particularly limited.
  • cellulose acetate it is preferable from the viewpoints of handleability during the manufacturing process and the strength of the monolith structure to be formed or the pore diameter of the pores of the monolith structure.
  • Mw average molecular weight
  • Cellulose acetate having an average molecular weight of 40,000 can be obtained from Wako Pure Chemical and can be preferably used.
  • the monolith structure produced according to the present invention can be a column material that can withstand alkaline washing more than silica, which is a conventional column material.
  • Polysaccharides are suitable as chromatographic base materials because of their low non-specific adsorption.
  • polysaccharides have many hydroxyl groups, and the monolith structure produced according to the present invention has utility as a chromatographic substrate also in that functional groups and ligands can be easily introduced therein.
  • Silica can introduce a functional group or a ligand to a hydroxyl group, but is not practical because the introduction procedure is complicated.
  • the first component in the production method of the present invention is a solvent selected from lactic acid esters.
  • the lactic acid ester is preferably an ester of lactic acid and a lower alcohol (alcohol having 1 to 5 carbon atoms), for example, methyl lactate or ethyl lactate is more preferable.
  • Lactic acid esters are safe solvents that do not fall under the regulations of the PRTR system, the organic solvent poisoning prevention rules, and the specific chemical substance prevention rules, etc. in the Chemical Substances Emissions Control Management Promotion Law, so they have a low impact on workers and the environment. . It is also inexpensive.
  • the polysaccharide can be efficiently dissolved by heating.
  • it mixes arbitrarily with water since water can be used as a washing
  • the second component in the production method of the present invention is a solvent selected from water, lower alcohols (alcohols having 1 to 5 carbon atoms), and combinations thereof.
  • Lower alcohols preferably include, for example, alkyl alcohols and glycols.
  • the alkyl alcohol is not particularly limited, but preferably includes ethanol and 1-propanol.
  • the glycol is not particularly limited, but ethylene glycol, 1,2-propylene glycol, and 1,3-butylene glycol are more preferable.
  • the second component is usually one that hardly dissolves the polysaccharide alone at room temperature, for example, 0.0001% by weight or more cannot be dissolved.
  • the polysaccharide in the first step, the polysaccharide is dissolved below the boiling point of the mixed solvent to obtain a polysaccharide solution, and in the second step, the polysaccharide solution is cooled.
  • a polysaccharide monolith structure is obtained from the polysaccharide solution by phase separation using a temperature difference.
  • a mixed solvent of the first component and the second component having different properties as described above is employed.
  • the mixing ratio of the first component and the second component is preferably 5 to 60 v / v% for the first component and 95 to 40 v / v% for the second component.
  • the ratio of the first component is within this range, precipitation due to phase separation easily occurs when the polysaccharide solution is cooled. If the ratio of a 2nd component is this range, it will become easy to dissolve a polysaccharide uniformly.
  • the ratio of the polysaccharide in the mixed solvent is preferably 0.1 to 30% by weight, and more preferably 1 to 20% by weight. If it is this range, a uniform solution will be obtained and the porous body which has a clean continuous pore will be easy to be obtained. Further, when the polysaccharide solution is cooled, precipitation due to phase separation is likely to occur, and the strength of the obtained monolith structure becomes sufficient, and the shape is easily maintained. In addition, the larger the proportion of polysaccharide in the mixed solvent, the smaller the pore diameter of the continuous pores of the resulting porous body.
  • the liquid permeability is good when the ratio of the polysaccharide in the mixed solvent is 5 to 30% by weight, further 5 to 20% by weight. It is particularly preferable from the viewpoint of pore size.
  • the pore diameter of the continuous pores of the obtained porous body can be increased.
  • the third component may be a component that is soluble in either the first component or the second component as long as it is soluble in the mixed solvent.
  • Preferred examples of the third component include water-soluble polymers such as polyethylene glycol (PEG) and polyvinyl alcohol (PVA), sugars such as glucose, sucrose, and starch, and salts such as calcium chloride and calcium carbonate. Polyethylene glycol is more preferable.
  • the third component is polyethylene glycol
  • its molecular weight is not particularly limited, but it is preferable from the viewpoint of the handleability during the manufacturing process and the strength of the monolith structure to be formed or the pore diameter of the pores of the monolith structure.
  • the average molecular weight (Mw) is 100 to 30000, more preferably 1000 to 10000, and still more preferably 2000 to 5000.
  • Polyethylene glycol having an average molecular weight of 3000 can be obtained from Wako Pure Chemicals, and can be preferably used.
  • the polysaccharide solution is cooled to a temperature lower by 5 to 200 ° C., preferably 5 ° C. to 150 ° C. than the temperature before cooling (temperature at the time of dissolution in the first step). Until more preferably 5 to 100 ° C.
  • the temperature lowering rate is preferably 0.1 to 200 ° C./min, more preferably 0.1 to 100 ° C./min.
  • the polysaccharide monolith structure is obtained by the first step and the second step, but after the second step, the following treatment may be further performed as necessary.
  • the monolith structure after the second step includes the mixed solvent used in the first step. Therefore, this may be replaced with an arbitrary solvent.
  • the method of substitution is not particularly limited, for example, the monolith structure after the second step can be immersed in another container containing an arbitrary solvent to perform substitution by mutual diffusion.
  • the substitution solvent be miscible with the solvent used in the first step at an arbitrary ratio in order to maintain the uniformity of the monolith structure obtained in the second step.
  • Preferred examples of the substitution solvent include alcohols and water.
  • saponification may be performed as a third step after the second step.
  • saponification treatment can be arbitrarily performed according to a conventional method such as alkali treatment.
  • the 4th process which introduce
  • the monolith structure to which the adsorption performance with respect to target substances, such as the above-mentioned biopolymer, was provided can be obtained, and it can be used suitably for purification and detection of a target substance mentioned below.
  • the ligand is not particularly limited, but ion exchange groups such as 2-diethylaminoethyl (DEAE), carboxymethyl (CM), sulfone, quaternary ammonium (Q), sulfate, etc., hydrophobic groups such as phenyl and butyl, ions
  • ion exchange groups such as 2-diethylaminoethyl (DEAE), carboxymethyl (CM), sulfone, quaternary ammonium (Q), sulfate, etc.
  • hydrophobic groups such as phenyl and butyl
  • ions include ligands that can be used for separation of so-called mixed modes having both exchange and hydrophobic groups, protein adsorption ligands such as protein A and antibodies, polycations such as polylysine, and functional polymers such as polyanions such as heparin and polyglutamic acid.
  • the monolith structure can be arbitrarily selected according to the purpose of use, and the introduction thereof can be arbitr
  • a treatment for crosslinking the polysaccharide may be performed.
  • the crosslinking treatment can be optionally performed according to a conventional method using a reactive bifunctional reagent as a crosslinking agent.
  • Reactive bifunctional reagents include epichlorohydrin, epibromohydrin, diisocyanate, dimethylurea, dimethylethyleneurea, dimethylchlorosilane, bis (2-hydroxyethylsulfone), butanediol diglycidyl ether, ethylene glycol diglycidyl Preferred examples include ether, glycerol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, divinyl sulfone, alkylene dihalogen, and hydroxyalkylene dihalogen. Among these, epichlorohydrin can be particularly preferably used.
  • the monolith structure obtained by the production method of the present invention is a porous body that includes a polysaccharide as a main component, has continuous pores, and is a thick three-dimensional body.
  • the monolith structure refers to a single porous structure having a three-dimensional network structure skeleton and voids continuously.
  • the monolith structure obtained by the production method of the present invention has continuous pores having an average pore diameter of 0.01 to 20.0 ⁇ m.
  • the average pore diameter can be determined from an image taken using a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope
  • continuous holes refer to continuous voids rather than individual cavities.
  • the shape of the holes is not particularly limited, although it is preferable that the holes on the surface and / or inside of the structure have a circular shape, an elliptical shape, or a shape similar to them.
  • the monolith structure obtained by the production method of the present invention has excellent liquid permeability by having such continuous holes. Also, any amount of functional group or ligand can be introduced, and the reaction efficiency in the functional group or ligand is good. Therefore, it is suitable for the column material used for the purification method described later.
  • the monolith structure obtained by the production method of the present invention has a thickness of 100 ⁇ m or more, preferably 150 ⁇ m or more, and has a three-dimensional form different from the film.
  • the shape of the porous body is not limited, but the length in the shortest axial direction among the three directions of the vertical and horizontal heights of the porous body is referred to as the thickness for convenience.
  • the monolith structure obtained by the production method of the present invention can be molded into a columnar shape, a cylindrical shape, or any other shape.
  • the monolith structure obtained by the production method of the present invention can be used for chromatography in the form of a column or the like. Since the monolith structure obtained by the production method of the present invention has continuous pores, it is difficult for the pressure in the column to increase during liquid passage. Therefore, it is possible to maintain or increase the flow rate, which is suitable for performing chromatography. In addition, as described above, since a desired functional group or ligand can be introduced into the monolith structure obtained by the production method of the present invention, it is possible to impart adsorption performance to biopolymers. By utilizing this, it becomes possible to purify various target substances.
  • a monolith structure into which an ion exchange group is introduced is used for purification of an expressed protein
  • a monolith structure in which protein A is immobilized as a ligand is applied to purification of IgG
  • a monolith structure in which an antibody is immobilized can be applied to detection and purification of an antigen corresponding to the antibody.
  • the obtained monolith structure was put into an excessive amount of water in a separate container to obtain a cylindrical monolith structure having a diameter of 13.7 mm containing water inside the hole.
  • the obtained monolith structure was put into an excessive amount of water in a separate container to obtain a cylindrical monolith structure containing water inside the hole.
  • the monolith structure was cut with an ultrasonic cutter (SONOFILE, SF-30, manufactured by SONOTEC), frozen at ⁇ 78 ° C. and then dried under reduced pressure at room temperature to obtain a dried monolith structure.
  • the cross section of the obtained monolith structure was observed with a scanning electron microscope (SEM) (VE-8800, manufactured by Keyence), and the obtained photograph is shown in FIG.
  • Ethylene glycol 0.800 g (density 1.114 g / mL) (18 v / v%) was added as the second component, heated and dissolved at 100 ° C., and then 10 wt% polyethylene glycol 20,000 ( Average molecular weight: 20000 ⁇ 5000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Add 0.500 g (10 v / v%) ethylene glycol solution and 0.433 g (10 v / v%) ethylene glycol as the second component, heat and polysaccharide solution Got. (Second step) The aluminum block heater was cooled from 75 ° C. to 20 ° C.
  • the temperature of the block heater is lowered to 75 ° C., 40.0 mL (26.7 v / v%) of 1-propanol as the second component and 5.7 g of polyethylene glycol 4,000 as the third component are added, and 95 ° C. Was heated with a block heater for 1 hour to obtain a polysaccharide solution.
  • the temperature of the block heater was lowered to 75 ° C., and the polysaccharide solution was dispensed into a glass test tube having an inner diameter of 14.0 mm that had been heated to 75 ° C. with a block heater in advance.
  • the obtained test tube containing the polysaccharide solution was transferred to a 75 ° C. hot water bath and cooled to 20 ° C.
  • ⁇ Production Example 12> (Third process) Add 1 mL of 10 M sodium hydroxide aqueous solution and 1 mL of water into a test tube having an inner diameter of 15.4 mm, stir well, add 1 piece of the monolith obtained in Production Example 11 cut to 1 cm in length with an ultrasonic cutter, and add 30 ° C And then deacetylated by shaking for 5 hours. The obtained deacetylated monolith was put into an excessive amount of water in a separate container, and the aqueous alkali solution contained in the pores of the monolith structure was removed.
  • ⁇ Production Example 14> (Fourth step: Ligand introduction) To a test tube with an inner diameter of 15.4 mm, add 1.69 g of an aqueous glycidyltrimethylammonium chloride solution (73.2 wt%) and 1.55 mL of water, stir well, add one piece of the monolith structure of Production Example 12 at 30 ° C. Shake for 1 hour. In another test tube, add 1.7 mL of 10 M aqueous sodium hydroxide solution and 1.3 mL of water, stir well, add monolith soaked with aqueous glycidyltrimethylammonium chloride solution, shake at 50 ° C. for 2 hours, and introduce trimethylammonium. Went.
  • the temperature of the hot water bath is lowered to 75 ° C., and 0.625 g of polyethylene glycol as the third component and 9.5 mL (19 v / v%) of ethylene glycol as the second component are added.
  • a polysaccharide solution was obtained by heating for 1 hour. (Second step) The temperature of the hot water bath was lowered to 75 ° C., and the polysaccharide solution was dispensed into a test tube previously heated to 75 ° C. in a hot water bath. The obtained test tube containing the polysaccharide solution was transferred to a 75 ° C. hot water bath and cooled to 20 ° C.
  • the sample was placed in Sumitube C (SUMI-C-14, manufactured by Sumitomo Electric Fine Polymer Co., Ltd.), and the whole was heated in a 95 ° C. hot water bath to shrink the Sumitube. Furthermore, put a structure covered with Sumitube that shrinks so that the monolith part becomes the center of the heat shrinkable tube in the Teflon (registered trademark) heat shrinkable tube (FEP-120, purchased from ASONE) cut to 5cm length. The whole was heated with a heat gun and contracted to prepare a column. Different diameter unions (U-20C, manufactured by Tokyo Rika Kikai Co., Ltd.) were connected to both ends of the column apparatus including the monolith structure.
  • Sumitube C SUMI-C-14, manufactured by Sumitomo Electric Fine Polymer Co., Ltd.
  • a tube with an outer diameter of 6 mm was connected to this and liquid was passed through.
  • a pump (LC8A, manufactured by Shimadzu Corporation) and a pressure gauge (GP-M025, manufactured by Keyence) were used.
  • GP-M025, manufactured by Keyence For evaluation of flow velocity, values indicated for the pump were used.
  • the flow rate per unit area was calculated, and the liquid permeability of various monolith structures was compared using this as the linear velocity.
  • the same evaluation was performed using a column (Cellfine A-500, 5 ml Mini-Column, manufactured by JNC) packed with spherical particles. The results are shown in FIG. It was found that the monolith structure obtained by the production method of the present invention can be passed through at a low pressure and at a high flow rate.
  • BSA was eluted from the column by passing an eluent (1M sodium chloride, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, pH 8.3) at a flow rate of 3 mL / min.
  • eluent 1M sodium chloride, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, pH 8.3
  • DBC dynamic adsorption capacity
  • SBC static adsorption capacity
  • ⁇ Test Example 4> Measurement of ion exchange capacity of ligand-introduced monolith The diameter and height of the diethylaminoethyl-introduced monolith structure obtained in Production Example 13 or the trimethylammonium-introduced monolith structure obtained in Production Example 14 were measured. Thereafter, the monolith structure was pulverized using a mixer (Fiber Mixer MX-X103, manufactured by National), and the pulverized monolith was recovered using a Kiriyama funnel and filter paper. An excess amount of 0.5 M NaOH aqueous solution was poured into the pulverized monolith on the filter paper and washed with water until neutral.
  • a mixer Fiber Mixer MX-X103, manufactured by National
  • the pulverized monolith on the filter paper was collected, and water was added so that the total amount of the pulverized monolith was 8 g. Further, 2 mL of 0.5 M HCl aqueous solution was added and shaken for 1 hour. The suspension containing the pulverized monolith was allowed to stand, and 2 mL of the supernatant was collected and titrated with a 0.1 M NaOH aqueous solution. The suspension precipitate containing the pulverized monolith was collected with a filter paper, dried and weighed. The ion exchange capacity was calculated by subtracting the dry weight of the pulverized monolith from the total of 8 g of the pulverized monolith and water as the amount of water. The results are shown in Table 3.
  • a monolith structure having a pore size suitable for separation of biopolymers can be provided from inexpensive polysaccharides and polysaccharide derivatives.
  • the monolith structure can be arbitrarily imparted with the ability to adsorb biopolymers, and can contribute to improving the efficiency of the purification process in pharmaceutical production and the like, which is very useful industrially.

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Abstract

天然高分子である多糖からなる多孔質体であり、平均孔径が生体分子の分離に適したサイズの連続孔を有し、任意の形状に成形可能なモノリス構造体の製造方法を提供する。多糖類を、第一の成分と第二の成分との混合溶媒に、該混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含み、第一の成分が乳酸エステルから選ばれる溶媒であり、第二の成分が水、低級アルコール、及びこれらの組み合わせから選ばれる溶媒である方法により、多糖類モノリス構造体を製造する。得られる多糖類モノリス構造体は、平均孔径０．０１～２０μｍの連続孔を有し、１００μｍ以上の厚みを有する多孔質体である。

Description

多糖類モノリス構造体の製造方法
　本発明は、多糖類モノリス構造体の製造方法に関する。
　種々の動物、昆虫およびその細胞や微生物を宿主として製造されるバイオ医薬品の研究開発に注目が集まっている。バイオ医薬品の生産性は、大容量培養、高力価培養によって向上しており、それに伴い精製工程も効率化が求められている。バイオ医薬品は生物由来であるため、非常に高度な精製技術が必要とされ、遠心分離、限外ろ過、精密ろ過、クロマトグラフィーなどを組み合わせて行われているが、特にクロマトグラフィーは精製の核となる技術である。
　バイオ医薬品の原料となるたんぱく質、核酸、ウイルス等の分離に用いるクロマトグラフィー用充填剤としては、様々な孔径を持つ多孔性粒子や、吸着性能を付与するために官能基を導入した多孔性粒子が製造され、市販されている。また、これらクロマトグラフィー用充填剤の多くはセルロース等天然高分子が用いられている。
　しかし、市販品の多くは分子量数十万程度までのたんぱく質の分離を主目的としたものであり、分子量１００万以上の核酸等の巨大な生体高分子に適したものは少ない。これは、粒子の耐圧強度を損なうことなく、孔径を大きくすることが困難なことに起因している。
　近年、多孔質材料として、三次元網目構造の骨格と空隙をそれぞれ連続に有する一塊の多孔体であるモノリスが次世代型多孔材料として注目されている。モノリスは骨格と流路となる孔のサイズを独立して制御可能である。
　例えば、シリカを材料として形成されるシリカモノリスがモノリスカラムとして市販されており、これは分離能が高く、機械的強度に優れている。また、骨格径や流路孔を制御する技術や表面細孔を制御する技術開発が進んでいる。
　しかし、そのサイズは内径が０．３ｍｍ以下のキャピラリーサイズのものがほとんどである。これはキャピラリーサイズのモノリスカラムが調製しやすいという理由からである。つまり、シリカモノリスは分析用であり、バイオ医薬品生産における精製工程に利用できる吸着容量を持たない。
　また、シリカの他にも、これまでに高分子材料で構成されるモノリス構造体およびその製造方法が種々報告されている（特許文献１～３）。
　ところで、天然高分子である多糖やその誘導体も、多くの水酸基を有し、タンパク質等の生体物質との相互作用が少ないと予想されることから、多孔質膜の材料として利用されており、その製造方法が開示されている（特許文献４～６）。特に、特許文献６にはセルロース誘導体による多孔質膜の製造方法として、高沸点溶媒を用いる熱誘起相分離法が開示されている。
特開２００９－０３００１７号公報 特開２０１２－１０７２１６号公報 特開２０１０－２６０９５２号公報 特開２００６－０８２００６号公報 国際公開第２０１３－１１８８５９号パンフレット 特開２００３－００１０７４号公報
　特許文献６の方法で得られるものは多孔質ではあるがその孔は連続孔ではなく個々に独立した孔であり、カラム材料としての利用はし難い。また、１～１００μｍの厚みの膜状の形態のものであり、任意の形状の成形体を製造することはできない。
　すなわち、多糖やその誘導体からなり、連続孔を有し、任意の形状の成形体を製造できる、モノリス構造体に関する報告は乏しく、その製造方法として乳酸エステルを用いるものも知られていない。
　このような状況を鑑みて、本発明は、天然高分子である多糖からなる多孔質体であり、平均孔径が生体分子の分離に適したサイズの連続孔を有し、任意の形状に成形可能なモノリス構造体の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究の末、適切な溶媒を選択することによって、多糖からモノリス構造体を容易に製造できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］多糖類モノリス構造体の製造方法であって、多糖類を、第一の成分と第二の成分との混合溶媒に、該混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含み、第一の成分が乳酸エステルから選ばれる溶媒であり、第二の成分が水、低級アルコール、及びこれらの組み合わせから選ばれる溶媒である、製造方法。
［２］多糖類がセルロースである、［１］に記載の製造方法。
［３］多糖類が、少なくとも１つの水酸基がエステル化されたものである、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］混合溶媒が第三の成分をさらに含有する、［１］～［３］の何れかに記載の製造方法。
［５］混合溶媒における第三の成分の濃度が、０．１～５重量％である、［４］に記載の製造方法。
［６］第三の成分がポリエチレングリコールである、［４］又は［５］に記載の製造方法。
［７］混合溶媒における第一の成分と第二の成分との体積比が、５：９５～６０：４０である、［１］～［６］の何れかに記載の製造方法。
［８］混合溶媒における多糖類の濃度が、０．１～３０重量％である、［１］～［７］の何れかに記載の製造方法。
［９］第二工程が、冷却前の多糖類溶液の温度から５～２００℃低い温度まで冷却することを特徴とする、［１］～［８］の何れかに記載の製造方法。
［１０］［１］～［９］の何れかに記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体を製造する工程の後に、得られた多糖類モノリス構造体をケン化する第三工程を行うことを含む、多糖類モノリス構造体ケン化物の製造方法。
［１１］［１０］に記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体ケン化物を製造する工程の後に、得られた多糖類モノリス構造体ケン化物に、架橋及び／又はリガンド導入処理を行う第四工程を行うことを含む、多糖類モノリス構造体架橋物及び／又はリガンド導入物の製造方法。
　本発明により、安価な多糖や多糖誘導体から、生体高分子の分離に適した孔径を持つモノリス構造体を提供することができる。また、ケン化、並びに架橋及び／又はリガンドを導入する工程を経ることによって、モノリス構造体に生体高分子に対する吸着性能を任意に付与することができ、モノリス構造体を用いる目的物質の精製方法に有用な材料を提供することができる。
製造例３のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 製造例４のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 製造例６のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 製造例７のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 製造例８のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 製造例９のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 製造例１１のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 製造例１５のモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真。 試験例２の通液時の流速と圧力の関係を示すグラフ。
　本発明の多糖類モノリス構造体の製造方法は、多糖類を、第一の成分と第二の成分との混合溶媒に、前記混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、前記多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含む。
　材料として用いる多糖類には多糖類誘導体も含まれ、好ましい材料としては、糖の水酸基がエステル化されているものが挙げられる。そのような多糖類誘導体を用いることにより、得られるモノリス構造体をクロマトグラフィー基材とする場合に非特異吸着を抑制することができる。エステル化多糖類としては、例えばエステル化セルロース、エステル化グルコマンナンを挙げることができ、具体的には、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロース、酢酸プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸グルコマンナンが好ましく挙げられ、これらの中でも酢酸セルロースが特に好ましい。
　材料として用いる多糖類の分子量は、特に限定されないが、例えば酢酸セルロースの場合は、製造工程中の取扱い性と生成するモノリス構造体の強度あるいはモノリス構造体が有する空孔の孔径の観点から、好ましくは１０００～２０万、より好ましくは５０００～１０万の平均分子量（Ｍｗ）である。なお、酢酸セルロースは、平均分子量４００００のものを和光純薬から入手することができ、好ましく利用できる。
　モノリス構造体の構成材料として、多糖類、特にセルロースを採用することにより、本発明により製造されるモノリス構造体は、従来のカラム材料であるシリカよりもアルカリ洗浄に耐えうるカラム材料となり得る。また、多糖類は非特異吸着が小さいため、クロマトグラフィー基材として適する。また、多糖類は多くの水酸基を有し、ここに官能基やリガンドを導入しやすい点でも、本発明により製造されるモノリス構造体は、クロマトグラフィー基材としての有用性がある。
　なお、シリカでも水酸基に官能基やリガンドを導入することはできるが、導入手順が煩雑であるためあまり実用的でない。
　本発明の製造方法における第一の成分は、乳酸エステルから選ばれる溶媒である。乳酸エステルは、乳酸と低級アルコール（炭素数１～５のアルコール）とのエステルが好ましく、例えば乳酸メチルや乳酸エチルがより好ましい。
　乳酸エステルは、化学物質排出把握管理促進法におけるＰＲＴＲ制度、有機溶剤中毒予防規則、及び特定化学物質障害予防規則等による規制に該当しない安全な溶媒であるため、作業者や環境への負荷が小さい。また、安価である。さらに、沸点が高く、加熱によって多糖類を効率的に溶解することができる。また、水と任意に混和するため、得られた多糖類モノリスから溶媒を除去する際の洗浄液として水を使用できるため、経済的である。
　本発明の製造方法における第二の成分は、水、低級アルコール（炭素数１～５のアルコール）及びこれらの組み合わせから選ばれる溶媒である。低級アルコールは、例えばアルキルアルコール及びグリコールを好ましく含む。アルキルアルコールとしては、特に限定されないが、エタノール、及び１－プロパノールが好ましく挙げられる。また、グリコールとしては、特に限定されないが、エチレングリコール、１，２－プロピレングリコール、及び１，３－ブチレングリコールがより好ましく挙げられる。
　第二の成分は、通常、室温で単独で多糖類を溶解し難く、例えば０．０００１重量％以上溶解することができないものである。
　本発明の製造方法において、第一の工程では多糖類を混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液とし、第二の工程では多糖類溶液を冷却する。これらの工程を経ることにより、温度差を利用した相分離によって多糖類溶液から多糖類モノリス構造体が析出して得られる。かかる相分離を容易に実現するために、上記の如く性質の異なる第一の成分と第二の成分との混合溶媒を採用する。
　第一の成分と第二の成分との混合割合は、第一の成分が５～６０ｖ／ｖ％、第二の成分が９５～４０ｖ／ｖ％が好ましい。第一の成分の割合がこの範囲であれば、多糖類溶液を冷却した時に相分離による析出が容易に生じる。第二の成分の割合がこの範囲であれば、多糖類を均一に溶解させやすくなる。
　また、混合溶媒中の多糖類の割合は０．１～３０重量％が好ましく、１～２０重量％がさらに好ましい。この範囲であれば、均一な溶液が得られ、きれいな連続孔を有する多孔質体が得られやすい。また、多糖類溶液を冷却した時に相分離による析出が生じやすく、得られたモノリス構造体の強度が十分なものとなり、形状を維持しやすくなる。
　また、混合溶媒中の多糖類の割合が大きくなるほど、得られる多孔質体の連続孔の孔径は小さくなる傾向にある。そのため、多孔質体を後述するクロマトグラフィーに適用する場合は、混合溶媒中の多糖類の割合を５～３０重量％、さらには５～２０重量％とすることが、良好な通液性となる孔径とする観点から特に好ましい。
　本発明の製造方法において、混合溶媒が第三の成分をさらに含有することにより、得られる多孔質体の連続孔の孔径を大きくすることができる。
　第三の成分としては、混合溶媒に可溶なものであれば、第一の成分と第二の成分のどちらに溶解する成分でもよい。
　第三の成分としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等の水溶性高分子、グルコース、スクロース、デンプン等の糖類、塩化カルシウム、炭酸カルシウム等の塩類のような成分を好ましく挙げることができ、ポリエチレングリコールがより好ましい。
　第三の成分がポリエチレングリコールである場合、その分子量は、特に限定されないが、製造工程中の取扱い性と生成するモノリス構造体の強度あるいはモノリス構造体が有する空孔の孔径の観点から、好ましくは１００～３００００、より好ましくは１０００～１００００、さらに好ましくは２０００～５０００の平均分子量（Ｍｗ）である。なお、ポリエチレングリコールは、平均分子量３０００のものを和光純薬から入手することができ、好ましく利用できる。
　本発明の製造方法における第二工程においては、多糖類溶液を、冷却前の温度（第一工程の溶解時の温度）から、５～２００℃低い温度まで、好ましくは５℃～１５０℃低い温度まで、さらに好ましくは５～１００℃低い温度まで冷却する。この際の降温速度は０．１～２００℃／分が好ましく、０．１～１００℃／分がより好ましい。
　上記のごとく、第一工程及び第二工程により多糖類モノリス構造体が得られるが、第二工程の後にさらに以下の処理を必要に応じて行ってもよい。
　第二工程後のモノリス構造体は、第一工程で用いた混合溶媒をその内部に包含している。そのため、これを任意の溶媒に置換してもよい。置換の方法は特に限定されないが、例えば、第二工程後のモノリス構造体を、任意の溶媒の入った別の容器内に浸漬して、相互拡散による置換を行うことができる。ここで置換溶媒は、第二工程で得られるモノリス構造体の均一性を保つために、第一工程で使用した溶媒と任意の割合で混和できるものであることが望ましい。好ましい置換溶媒として、アルコール類、水を挙げることができる。
　また、モノリス構造体内部に包含される溶媒を除去する処理を行ってもよい。除去方法は、加熱、減圧等、通常の方法が使用できる。
　また、第一工程で材料としてエステル化多糖類を用いた場合は、第二工程の後に第三工程としてケン化（脱エステル化）を行ってもよい。例えば、材料の多糖類として酢酸セルロースを用いた場合は、第三工程により脱アセチル化してもよい。ケン化処理は、アルカリ処理等の常法に従って任意に行うことができる。
　さらに、第三工程後のケン化（脱エステル化）したモノリス構造体に対して、そのフリーの水酸基に任意の官能基やリガンドを導入する第四工程を行ってもよい。これにより、前述したような生体高分子等の目的物質に対する吸着性能が付与されたモノリス構造体を得ることができ、後述する目的物質の精製や検出に好適に利用することができる。
　リガンドとしては、特に限定されないが、２－ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホン、４級アンモニウム（Ｑ）、硫酸エステル等のイオン交換基やフェニル、ブチルなどの疎水性基、イオン交換と疎水基を併せ持ついわゆるミックスモードの分離に使えるリガンド、プロテインＡ、抗体等のタンパク吸着用リガンドやポリリジン等のポリカチオン、ヘパリンやポリグルタミン酸等のポリアニオンなどの機能性高分子等が挙げられ、モノリス構造体の使用目的に応じて任意に選択でき、その導入は、常法に従って任意に行うことができる。
　また、第四工程としては、官能基やリガンドの導入に加えて／代えて、多糖類を架橋する処理を行ってもよい。糖鎖間が架橋されることにより、モノリス構造体の強度を向上させることができる。
　架橋処理は、反応性の二官能試薬を架橋剤として用いて、常法に従って任意に行うことができる。反応性の二官能試薬としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジイソシアネート、ジメチル尿素、ジメチルエチレン尿素、ジメチルクロロシラン、ビス（２－ヒドロキシエチルスルホン）、ブタンジオールジグリシジルエーテル、エチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アルキレンジハロゲン、ヒドロキシアルキレンジハロゲン等が好ましく挙げられ、これらのうちエピクロロヒドリンを特に好ましく用いることができる。
　本発明の製造方法により得られるモノリス構造体は、多糖類を主成分として含み、連続孔を有し、厚みのある立体である多孔質体である。なお、一般に、モノリス構造とは、三次元網目構造の骨格と空隙をそれぞれ連続に有する一塊の多孔体構造をいう。
　具体的には、本発明の製造方法により得られるモノリス構造体は、平均孔径が０．０１～２０.０μｍの連続孔を有する。平均孔径は、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて撮影した画像より求めることができる。
　ここで、連続孔とは、１つ１つ独立した空洞ではなく、連続的な空隙をいう。なお、複数のモノリス構造体サンプルのＳＥＭ写真において、孔の形状が同一または類似の形状であること、また通液時のカラム内の圧力が上がりにくいことから、孔が連続孔であることが確認できる。
　孔の形状は、構造体表面及び／又は内部にある孔が、円形もしくは楕円形又はそれらに近似した形状のものあることが好ましいが、特に限定されない。
　本発明の製造方法により得られるモノリス構造体は、このような連続孔を有することにより、通液性に優れる。また、官能基やリガンドを任意の量導入することができ、さらに該官能基やリガンドにおける反応効率が良い。そのため、後述する精製方法等に用いるカラム材料に好適である。
　また、本発明の製造方法により得られるモノリス構造体は、１００μｍ以上の、好ましくは１５０μｍ以上の厚みを有し、膜とは異なる立体的な形態である。多孔質体の形状は限定されないが、この多孔質体の縦横高さの３つの方向のうち、最短軸方向の長さを便宜的に厚みと呼ぶ。また、本発明の製造方法により得られるモノリス構造体は、円柱状、円筒状、その他の任意の形状に成型できる。
　本発明の製造方法により得られるモノリス構造体は、カラム等の態様にしてクロマトグラフィーに用いることができる。
　本発明の製造方法により得られるモノリス構造体は、連続孔を有することにより通液時にカラム内の圧力が上がりにくい。そのため、流速を維持したり大きくしたりすることも可能であるため、クロマトグラフィーの実施に適する。
　また、前述のように、本発明の製造方法により得られるモノリス構造体には、所望の官能基やリガンドを導入することができるため、生体高分子に対する吸着性能を付与することができる。これを利用して、種々の目的物質を精製することが可能となる。例えば、イオン交換基を導入したモノリス構造体を、発現タンパク質の精製に用いたり、リガンドとしてプロテインＡを固定化したモノリス構造体をＩｇＧの精製に適用したり、抗体を固定化したモノリス構造体を、該抗体に対応する抗原の検出や精製に適用することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜製造例１＞
（第一工程）
　内径１４．０ｍｍの透明ガラス試験管中に、多糖類として酢酸セルロース５００ｍｇ（１０重量％）（酢化度：５３～５６％、ＭＷ：４００００、和光純薬工業製）、第一の成分として乳酸エチル１．５ｍＬ（３０ｖ／ｖ％）、第二の成分としてエタノール３．０ｍＬ（６０ｖ／ｖ％）及び水０．５ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）を加え、７５℃のブロックヒーターで加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　得られた多糖類溶液を、湯浴中で２０℃まで自然冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む直径１３．７ｍｍの円柱状のモノリス構造体を得た。
＜製造例２＞
　多糖類としての酢酸セルロース５００ｍｇ（１０重量％）と共に、第三の成分としてポリエチレングリコール６，０００　１００ｍｇ（平均分子量：７３００～９３００、和光純薬工業製）を同時に添加する以外は、製造例１と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
＜製造例３＞
（第一工程）
　内径１４．０ｍｍの透明ガラス試験管中に、多糖類として酢酸セルロース５００ｍｇ（１０重量％）、第一の成分として乳酸エチル２．０ｍＬ（４０ｖ／ｖ％）、第二の成分として１－プロパノール２．５ｍＬ（５０ｖ／ｖ％）及び水０．５ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）を加え、９５℃のブロックヒーターで３時間加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　得られた多糖類溶液を含む試験管を７５℃の湯浴に移し、－１０℃／ｈの冷却速度で２０℃まで冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む円柱状のモノリス構造体を得た。
　モノリス構造体を超音波カッター（ＳＯＮＯＦＩＬＥ、ＳＦ－３０、ＳＯＮＯＴＥＣ製）で切断後、－７８℃で凍結した後に室温で減圧乾燥を行い、乾燥したモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体の断面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＶＥ－８８００、キーエンス製）で観察し、得られた写真を図１に示す。
＜製造例４＞
　多糖類としての酢酸セルロース５００ｍｇ（１０重量％）と共に、第三の成分としてポリエチレングリコール４，０００　１９０ｍｇ（平均分子量：３０００、和光純薬工業製）を同時に添加する以外は、製造例３と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図２に示す。
＜製造例５＞
　多糖類としての酢酸セルロース５００ｍｇ（１０重量％）と共に、第三の成分としてポリエチレングリコール６，０００　５０ｍｇを同時に添加する以外は、製造例３と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
＜製造例６＞
（第一工程）
　４ｍＬガラスねじ口瓶に、多糖類として酢酸セルロース４００ｍｇ（１０重量％）及び第一の成分として乳酸エチル２．４８ｍＬ（６２ｖ／ｖ％）を加え、１００℃のブロックヒーターで加熱溶解した。第二の成分としてエチレングリコール０．８９３ｇ（密度＝１．１１４ｇ／ｍＬ）（２０ｖ／ｖ％）を加え、１００℃のブロックヒーターで加熱溶解後、さらに第二の成分としてエチレングリコール０．８００ｇ（１８ｖ／ｖ％）を加え、加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　アルミブロックヒーターを７５℃から－１０℃／ｈの冷却速度で２０℃まで冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図３に示す。
＜製造例７＞
（第一工程）
　４ｍＬガラスねじ口瓶に、多糖類として酢酸セルロース４００ｍｇ（１０重量％）及び第一の成分として乳酸エチル２．４８ｍＬ（６２ｖ／ｖ％）を加え、１００℃のブロックヒーターで加熱した。第二の成分としてエチレングリコール０．８００ｇ（密度＝１．１１４ｇ／ｍＬ）（１８ｖ／ｖ％）を加え、１００℃で加熱溶解後、第三の成分として１０重量％のポリエチレングリコール２０，０００（平均分子量：２００００±５０００、和光純薬工業製）エチレングリコール溶液０．５００ｇ（１０ｖ／ｖ％）及び第二の成分としてエチレングリコール０．４３３ｇ（１０ｖ／ｖ％）を加え、加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　アルミブロックヒーターを７５℃から－１０℃／ｈの冷却速度で２０℃まで冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図４に示す。
＜製造例８＞
（第一工程）
　４ｍＬガラスねじ口瓶に、多糖類として酢酸セルロース４００ｍｇ（１０重量％）、第一の成分として乳酸エチル２．２７ｇ（密度＝１．０３４ｇ／ｍＬ）（５５ｖ／ｖ％）、及び第二の成分として１，２－プロピレングリコール０．８３ｇ（密度＝１．０３６ｇ／ｍＬ）（２０ｖ／ｖ％）を加え、１００℃のブロックヒーターで加熱溶解した。さらに第二の成分として１，２－プロピレングリコール１．０４ｇ（２５ｖ／ｖ％）を加え、１００℃で加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　アルミブロックヒーターを７５℃から－１０℃／ｈの冷却速度で２０℃まで冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図５に示す。
＜製造例９＞
（第一工程）
　４ｍＬガラスねじ口瓶に、多糖類として酢酸セルロース４００ｍｇ（１０重量％）、第一の成分として乳酸エチル２．６８８ｇ（６５ｖ／ｖ％）、及び第二の成分として１，３－ブチレングリコール０．４０２ｇ（密度＝１．００５ｇ／ｍＬ）（１０ｖ／ｖ％）を加え、１００℃のブロックヒーターで加熱溶解した。さらに第二の成分として１，３－ブチレングリコール１．００５ｇ（２５ｖ／ｖ％）を加え、１００℃で加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　アルミブロックヒーターを７５℃から－１０℃／ｈの冷却速度で２０℃まで冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図６に示す。
＜製造例１０＞
　混合溶媒の組成を、第一の成分として乳酸メチル１．５ｍＬ（３０ｖ／ｖ）、第二の成分として１－プロパノール３．０ｍＬ（６０ｖ／ｖ％）及び水０．５ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）の混合とした以外は、製造例３と同様にして、円柱状のモノリス構造体を得た。
＜製造例１１＞
（第一工程）
　３００ｍＬナスフラスコに、第一の成分として乳酸エチル６０．０ｍＬ（４０ｖ／ｖ％）、第二の成分として１－プロパノール３５．０ｍＬ（２３．３ｖ／ｖ％）及び水１５．０ｍＬ（１０ｖ／ｖ％）を加えて混合し、多糖類として酢酸セルロース１５．０ｇ（１０重量％）を加え、９５℃のブロックヒーターで３時間加熱し溶解させた。ブロックヒーターの温度を７５℃まで低下させ、第二の成分として１－プロパノール４０．０ｍＬ（２６．７ｖ／ｖ％）と第三の成分としてポリエチレングリコール４，０００　５．７ｇを加えて、９５℃のブロックヒーターで１時間加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　ブロックヒーターの温度を７５℃まで低下させ、予めブロックヒーターで７５℃に加熱した内径１４．０ｍｍのガラス試験管に多糖類溶液を分注した。得られた多糖類溶液を含む試験管を７５℃の湯浴に移し、－１０℃／ｈの冷却速度で２０℃まで冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図７に示す。
＜製造例１２＞
（第三工程）
　内径１５．４ｍｍの試験管内に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１ｍＬと水１ｍＬを加えよく攪拌し、製造例１１で得られたモノリスを長さ１ｃｍに超音波カッターで切断したもの１片を加え、３０℃で５時間振とうして脱アセチル化を行った。得られた脱アセチルモノリスを別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体の孔内部に含まれるアルカリ水溶液を除去した。
（第四工程：架橋）
　次に試験管内にエピクロロヒドリン０．３５ｍＬと水５．０ｍＬを加え、ボルテックスジェネレーターを用いてエピクロロヒドリンを溶解させた。このエピクロロヒドリン水溶液を含む試験管に、脱アセチルモノリス１片を加え３０℃で１時間振とうした。さらに別の試験管に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液０．４５ｍＬと水２．５５ｍＬを加えよく攪拌し、エピクロロヒドリン水溶液が浸漬したモノリス構造体１片を加え、５０℃で２時間振とうして架橋反応を行った。これらのエピクロロヒドリン水溶液の浸漬と水酸化ナトリウム水溶液による反応を、さらに１回繰り返して行い、計２回の架橋反応を行った。反応終了後は、モノリス構造体を別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体の孔内部に含まれる溶媒を水に置換した。
＜製造例１３＞
（第四工程：リガンド導入）
　内径１５．４ｍｍの試験管内に、２－ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩１．４ｇと水２．０ｍＬを加えよく攪拌し、製造例１２のモノリス構造体１片を加えて３０℃で１時間振とうした。さらに別の試験管に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１．７ｍＬと水１．３ｍＬを加えよく攪拌し、２－ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩水溶液が浸漬したモノリスを加え、５０℃で２時間振とうしてジエチルアミノエチル導入反応を行った。これらの２－ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩水溶液の浸漬と水酸化ナトリウム水溶液による反応を、さらに１回繰り返して行い、計２回のＤＥＡＥ導入反応を行った。反応終了後は、モノリス構造体を別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体の孔内部に含まれる溶媒を水に置換した。
＜製造例１４＞
（第四工程：リガンド導入）
　内径１５．４ｍｍの試験管に、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液（７３．２重量％）１．６９ｇと水１．５５ｍＬを加えよく攪拌し、製造例１２のモノリス構造体１片を加えて３０℃で１時間振とうした。さらに別の試験管に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液１．７ｍＬと水１．３ｍＬを加えよく攪拌し、グリシジルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液が浸漬したモノリスを加え、５０℃で２時間振とうしてトリメチルアンモニウム導入反応を行った。これらのグリシジルトリメチルアンモニウムクロリド水溶液の浸漬と水酸化ナトリウム水溶液による反応を、さらに１回繰り返して行い、計２回のトリメチルアンモニウム導入反応を行った。反応終了後は、モノリス構造体を別容器内の過剰量の水中に投入し、モノリス構造体の孔内部に含まれる溶媒を水に置換した。
＜製造例１５＞
（第一工程）
　１００ｍＬナスフラスコに、多糖類として酢酸セルロース５．０ｇ（１０重量％）と第二の成分としてエチレングリコール９．５ｍＬ（１９ｖ／ｖ％）を加え攪拌した。ナスフラスコ内の攪拌を継続しつつ、第一の成分として乳酸エチル３１．０ｍＬ（６２ｖ／ｖ％）を加え、９５℃の湯浴で４時間加熱し溶解させた。湯浴の温度を７５℃まで低下させ、第三の成分としてポリエチレングリコール２０，０００　０．６２５ｇと第二の成分としてエチレングリコール９．５ｍＬ（１９ｖ／ｖ％）を加え、９５℃の湯浴で１時間加熱し多糖類溶液を得た。
（第二工程）
　湯浴の温度を７５℃まで低下させ、予め湯浴で７５℃に加熱した試験管に多糖類溶液を分注した。得られた多糖類溶液を含む試験管を７５℃の湯浴に移し、－１０℃／ｈの冷却速度で２０℃まで冷却して、孔内部に溶媒を含むモノリス構造体を得た。得られたモノリス構造体を、別容器内の過剰量の水中に投入し、孔内部に水を含む円柱状のモノリス構造体を得た。このモノリス構造体の断面のＳＥＭ写真を図８に示す。
＜製造例１６＞
（第三工程）（第四工程：架橋）
　製造例１５のモノリス構造体を用いる以外は、製造例１２と同様にして、架橋モノリス構造体を得た。
＜製造例１７＞
（第三工程）（第四工程：架橋及びリガンド導入）
　製造例１６のモノリス構造体を用いる以外は、製造例１３と同様にして、ＤＥＡＥ導入モノリス構造体を得た。
＜試験例１＞硬度の評価
　製造例３、４、５、６、７、８、９、１１、及び１５で得られた水を含む円柱状のモノリス構造体を超音波カッターで長さ０．５～１．０ｃｍに切断した。次にデュロメーター（ＧＳ－７４３Ｇ、ＴＥＣＬＯＯＫ製）を切断したモノリス構造体の断面に押し当てて硬度を測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜試験例２＞通液時の流速と圧力による評価
　製造例１１、１３、１４、１５、及び１７で得られたモノリス構造体に純水を通液し、その際のカラム入り口にかかる圧力を測定することで、通液性を評価した。カラムの作製手順については以下のように行った。
　得られた円柱状のモノリス構造体を、超音波カッターを用いて長さ１．０ｃｍに切断した。５．０ｃｍの四フッ化パイプ（Ｉ．Ｄ．７ｍｍ、Ｏ．Ｄ．９ｍｍ）、直径９．３ｍｍ、厚さ２．４ｍｍのポリスチレン製フリッツでモノリス構造体の両端をはさみ、全長が覆われる長さのスミチューブＣ（ＳＵＭＩ－Ｃ－１４、住友電工ファインポリマー製）の中にいれ、全体を９５℃の湯浴で加熱してスミチューブを収縮させた。さらに長さ５ｃｍに切断したテフロン（登録商標）熱収縮チューブ（ＦＥＰ-１２０、アズワンより購入）内に、モノリス部分が熱収縮チューブの中央になるように収縮したスミチューブで覆われた構造物を入れ、全体をヒートガンで加熱して収縮させてカラムを作製した。このモノリス構造体を含むカラム装置の両端に、異径ユニオン（Ｕ－２０Ｃ、東京理化器械製)を接続した。これに外径６ｍｍのチューブを接続し通液を行った。
　通液性の評価には、ポンプ(ＬＣ８Ａ、島津製作所製)、圧力計（ＧＰ－Ｍ０２５、キーエンス製）を用い、流速の評価にはポンプに示された値を用いた。さらに単位面積あたりの流速を算出し、これを線速として各種モノリス構造体の通液性を比較した。
　比較例として、球状粒子を充填したカラム（セルファインＡ－５００、５ｍｌ　Ｍｉｎｉ－Ｃｏｌｕｍｎ、ＪＮＣ製）を用いて、同様に評価した。
　結果を図１０に示す。本発明の製造方法で得られたモノリス構造体は、低圧且つ高流速での通液が可能であることがわかった。
＜試験例３＞牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の吸着性による評価
　製造例１３、１４、及び１７で得られたジエチルアミノエチルまたはトリメチルアンモニウム導入モノリス構造体を用いたカラムに、ＢＳＡ水溶液を通液してＢＳＡ吸着性を測定した。カラムの作製手順と吸着性評価手順については以下の通りである。
　ＰＥＥＫチューブが貫通したシリコンゴム、ポリプロピレン製フリッツでモノリス両端を挟み、更にそれを全長が覆われる長さのスミチューブＣの中に入れ、全体を９５℃の湯浴で加熱してスミチューブを収縮させた。さらにそれを全長が覆われる長さのテフロン（登録商標）熱収縮チューブ（ＦＥＰ－１２０）の中に入れ、全体をヒートガンで加熱して収縮させ、カラムを作製した。
　作製したカラムを低圧クロマトグラフィーシステム（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ　ｐｌｕｓ、ＧＥヘルスケア製）に装着した。このクロマトグラフィーシステムを通して、流速３ｍＬ／ｍｉｎで濃度１ｍｇ／ｍＬとしたＢＳＡ溶液（５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、ｐＨ８．３）を通液し、カラムにＢＳＡを吸着させた。また、流速３ｍＬ／ｍｉｎで溶出液（１Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、ｐＨ８．３）を通液して、カラムからＢＳＡを溶出させた。このときカラムからの流出液に含まれるＢＳＡ量を測定することによりＢＳＡ吸着性を測定した。動的吸着容量（ＤＢＣ）は、通液したＢＳＡ溶液の１０％が破過した時点での吸着量を１０％ＤＢＣとして評価した。また、静的吸着容量（ＳＢＣ）は、カラムからの溶出量を用いて評価した。ＤＢＣとＳＢＣの結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜試験例４＞リガンド導入モノリスのイオン交換容量の測定
　製造例１３で得られたジエチルアミノエチル導入モノリス構造体、又は製造例１４で得られたトリメチルアンモニウム導入モノリス構造体の直径と高さを測定した後、このモノリス構造体をミキサー（ファイバーミキサー　ＭＸ－Ｘ１０３、ナショナル製）を用いて粉砕し、桐山ロートとろ紙で粉砕モノリスを回収した。ろ紙上の粉砕モノリスに過剰量の０．５Ｍ　ＮａＯＨ水溶液を流し、水で中性になるまで洗浄した。次にろ紙上の粉砕モノリスを回収し、この粉砕モノリスと合計して８ｇとなるように水を加えた。さらに０．５Ｍ　ＨＣｌ水溶液２ｍＬを加えて１時間振とうした。この粉砕モノリスを含む懸濁液を静置して上澄み２ｍＬを採取し、０．１Ｍ　ＮａＯＨ水溶液で滴定した。粉砕モノリスを含む懸濁液の沈殿をろ紙で回収し、乾燥して重量を測定した。イオン交換容量の計算は、粉砕モノリスと水の合計８ｇから、粉砕モノリス乾燥重量を差し引いた値を水分量として計算した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明により、安価な多糖や多糖誘導体から、生体高分子の分離に適した孔径を持つモノリス構造体を提供することができる。また、該モノリス構造体には、生体高分子に対する吸着性能を任意に付与することができ、医薬品製造等における精製工程の効率向上に寄与することができるため、産業上非常に有用である。

Claims (11)

  1. 　多糖類モノリス構造体の製造方法であって、
    　多糖類を、第一の成分と第二の成分との混合溶媒に、該混合溶媒の沸点未満で溶解させて多糖類溶液を得る第一工程と、
    　多糖類溶液を冷却して多糖類モノリス構造体を得る第二工程とを含み、
    　第一の成分が乳酸エステルから選ばれる溶媒であり、
    　第二の成分が水、低級アルコール、及びこれらの組み合わせから選ばれる溶媒である、製造方法。
  2. 　多糖類がセルロースである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　多糖類が、少なくとも１つの水酸基がエステル化されたものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　混合溶媒が第三の成分をさらに含有する、請求項１～３の何れか一項に記載の製造方法。
  5. 　混合溶媒における第三の成分の濃度が、０．１～５重量％である、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　第三の成分がポリエチレングリコールである、請求項４又は５に記載の製造方法。
  7. 　混合溶媒における第一の成分と第二の成分との体積比が、５：９５～６０：４０である、請求項１～６の何れか一項に記載の製造方法。
  8. 　混合溶媒における多糖類の濃度が、０．１～３０重量％である、請求項１～７の何れか一項に記載の製造方法。
  9. 　第二工程が、冷却前の多糖類溶液の温度から５～２００℃低い温度まで冷却することを特徴とする、請求項１～８の何れか一項に記載の製造方法。
  10. 　請求項１～９の何れか一項に記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体を製造する工程の後に、
    　得られた多糖類モノリス構造体をケン化する第三工程を行うことを含む、多糖類モノリス構造体ケン化物の製造方法。
  11. 　請求項１０に記載の製造方法によって多糖類モノリス構造体ケン化物を製造する工程の後に、得られた多糖類モノリス構造体ケン化物に、架橋及び／又はリガンド導入処理を行う第四工程を行うことを含む、多糖類モノリス構造体架橋物及び／又はリガンド導入物の製造方法。
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