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WO2016047645A1 - 腫瘍治療用遺伝子改変麻疹ウイルス - Google Patents

腫瘍治療用遺伝子改変麻疹ウイルス Download PDF

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WO2016047645A1
WO2016047645A1 PCT/JP2015/076817 JP2015076817W WO2016047645A1 WO 2016047645 A1 WO2016047645 A1 WO 2016047645A1 JP 2015076817 W JP2015076817 W JP 2015076817W WO 2016047645 A1 WO2016047645 A1 WO 2016047645A1
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WO
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rmv
slamblind
cells
cancer
tumor
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/076817
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English (en)
French (fr)
Inventor
甲斐知惠子
米田美佐子
Original Assignee
国立大学法人東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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    • C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18471—Demonstrated in vivo effect

Definitions

  • the present invention relates to an oncolytic measles virus, a pharmaceutical composition for treating cancer using the oncolytic measles virus, and a method for treating cancer.
  • Measles virus is a pathogenic virus that belongs to the Paramyxoviridae Mobilivirus genus, infects humans as natural hosts, and causes immunosuppression and respiratory symptoms. Since it has been revealed that measles virus infects tumor cells and induces tumor regression (Non-patent Document 1), measles virus has attracted attention as a tool for cancer virus treatment. Up to now, ovarian cancer and myeloma have been conducted as clinical research on virus treatment using measles virus based on vaccine strain (Non-patent Document 2).
  • Measles virus uses three molecules as receptors when infecting host cells. These molecules are CD46 (Non-patent document 3 and Non-patent document 4), SLAM (signaling lymphocyte activation molecule) (Non-patent document 5) and PVRL4 (Poliovirus recptor related 4) (also referred to as Nectin-4) (non- Patent Document 6 and Non-Patent Document 7). Measles virus vaccine strains can use all three of these molecules as receptors, whereas wild-type measles virus strains can use PVRL4 and SLAM, but cannot use CD46. CD46 is ubiquitously present in human nucleated cells, but its expression is increased particularly in tumor cells (Non-patent Documents 8 and 9).
  • PVRL4 The expression of PVRL4 is selectively increased in tumor cells including breast cancer cells, ovarian cancer cells, and lung cancer cells (Non-patent Documents 10 to 13). Normally, PVRL4 is expressed in human placenta, but is hardly observed in other tissues (Non-patent Document 14). The inventors considered using a wild strain of measles virus to selectively target PVRL4. The receptor for wild-type measles virus to be pathogenic is SLAM. SLAM is selectively expressed in immune cells, enabling measles virus to cause serious immunosuppression and spread of the virus throughout the body (Non-patent Document 15).
  • Non-patent Document 16 and Patent Document 1 a recombinant measles virus that does not recognize SLAM (rMV-SLAMblind) based on the wild-type measles virus HL strain.
  • rMV-SLAMblind a recombinant measles virus that does not recognize SLAM
  • Non-patent Document 16 and Patent Document 1 In vitro or in vivo, infecting breast cancer cells with rMV-SLAMblind can kill it. Its antitumor activity is higher than conventional measles virus vaccine strains.
  • RMV-SLAMblind is completely attenuated, and it has been confirmed that even if it is inoculated subcutaneously in monkeys, it does not cause typical clinical symptoms of measles and is highly safe (Non-patent Document 16). And Patent Document 1).
  • rMV-SLAMblind which is a recombinant measles virus that does not recognize SLAM, is expected to be very effective as a tool for cancer treatment.
  • rMV-SLAMblind which is a recombinant measles virus that does not recognize SLAM, is expected to be very effective as a tool for cancer treatment.
  • primary cancers not only primary cancers but also metastatic cancers are treated, and further, there is a great expectation for the damaging effect on cancer stem cells.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical or a pharmaceutical composition effective for treating various cancers.
  • the present inventors have identified rMV-SLAMblind or rMV-V (-) as a recombinant measles virus not recognizing SLAM for a cancer or a pharmaceutical composition containing a recombinant measles virus not recognizing SLAM.
  • rMV-SLAMblind or rMV-V (-) as a recombinant measles virus not recognizing SLAM for a cancer or a pharmaceutical composition containing a recombinant measles virus not recognizing SLAM.
  • a medicine or a pharmaceutical composition containing a recombinant measles virus that does not recognize SLAM exhibits a tumor regression effect not only by intratumoral administration but also by intravenous administration, and compared to conventional viral medicines, It has been found for the first time that lower doses show tumor regression effects.
  • the present invention has been completed based on the above findings.
  • the present invention includes the following (1) to (6).
  • a pharmaceutical composition for treating cancer comprising rMV-SLAM-blind or rMV-V (-)-SLAM-blind.
  • the pharmaceutical composition according to claim 1 which kills cancer stem cells.
  • the pharmaceutical composition according to claim 1, wherein the cancer is an intractable cancer.
  • the pharmaceutical composition according to any one of (1) to (3), wherein the cancer is metastatic cancer.
  • the present invention makes it possible to develop a medicine or a pharmaceutical composition for treating difficult-to-treat cancer. Further, according to the present invention, various types of cancer can be treated.
  • a photograph of a representative cell is shown.
  • Cell viability was measured at 1 dpi, 3 dpi, 5 dpi and 7 dpi by WST-1 assay.
  • the numerical value was expressed as an average value ⁇ SD of three experimental values.
  • (A) Virus (•) or medium ( ⁇ ) was further administered from the first administration (day 0) on day 10 and 19 (n 4).
  • PVRL4 / GAPDH ⁇ SD values of three experiments are shown.
  • the value of PVRL4 / GAPDH of DLD1 cells was set to 1.
  • the result of examining the ability of rMV-SLAMblind to infect colon cancer cell lines was set to 1.
  • (A) Cells were infected with rMV-EGFP-SLAMblind at moi 2. A fluorescence micrograph of a representative cell is shown.
  • B The survival rate of PVRL4 positive cells is shown. Viablity; survival rate, dpi; days post first inoculation
  • C The survival rate of PVRL4 negative cells.
  • a photograph of a representative cell is shown.
  • Triple negative breast cancer cells were infected with rMV-EGFP-SLAMblind and rMV-V ( ⁇ )-EGFP-SLAMblind.
  • A The survival rate of HCC70 cells, which are triple negative breast cancer cells, was measured by the WST-1 assay at 1 dpi, 3 dpi, 5 dpi, 7 ⁇ ⁇ ⁇ dpi, and 9dpi.
  • B B95a survival rate of control cells not expressing PVRL4. The numerical value was expressed as an average value ⁇ SD of three experimental values.
  • rMV-SLAMblind Days after first viral administration The result of investigating the effect of intravenous administration of rMV-SLAMblind on breast cancer cell-derived tumors. rMV-SLAMblind was administered from the first dose (day 0) at a further 4 days. The examination result of the cytotoxicity of rMV-SLAMblind with respect to the cancer stem cell derived from a breast cancer. (A) It is the result of examining the ability of rMV-EGFP-SLAMblind to infect cancer stem cells. (B) The survival rate of HCC1187 cells infected with rMV-SLAMblind was measured at the time of 1 dpi, 3 dpi, 5 dpi and 7 dpi by WST-1 assay.
  • NCSC mock and CSC mock indicate the survival rate of non-cancer stem cells (NCSC) and cancer stem cells (CSC) when treated with medium.
  • NCSC SLAM blind and CSC SLAM blind are rMV-SLAM blind The survival rate of non-cancer stem cells (NCSC) and cancer stem cells (CSC) when treated is shown.
  • the cell viability was expressed with the value of mock (from the medium) as 1.
  • A Results showing the presence or absence of PVRL4 expression on the cell surface.
  • CoBL cells are cells expressing SLAM and CD46, and the results of CoBL cells are shown as a positive control. Results of infectivity and cytotoxicity of rMV-SLAMblind against human pancreatic cancer cell lines in vitro.
  • A The results of examining the ability of rMV-EGFP-SLAMblind to infect the KLM1 cell line, PK1 cell line, and Capan-2 cell line.
  • B Infect KMV1 cell line, PK1 cell line and Capan-2 cell line with rMV-EGFP-SLAMblind, and determine survival rate at 1 dpi, 3 dpi, 5 dpi, 7dpi and 9dpi by WST-1 assay. It is the result of measurement.
  • ( ⁇ ) is the result of treating the cells with the virus, and ( ⁇ ) is the result of treating the cells with the medium.
  • Cell viablity cell viability, dpi ; days post first inoculation Antitumor effect of rMV-SLAMblind in a xenograft model of human pancreatic cancer cell line.
  • One embodiment of the present invention is a medicament or pharmaceutical composition for treating cancer, comprising rMV-SLAMblind or rMV-V ( ⁇ )-SLAMblind.
  • rMV-SLAMblind or rMV-V ( ⁇ )-SLAMblind are also developed rMV for human lung cancer cells, human colon cancer cells, and canine breast cancer cells. It was confirmed that -SLAMblind and rMV-V (-)-SLAMblind cause cell death efficiently. rMV-SLAMblind and rMV-V (-)-SLAMblind have lost their infectivity to SLAM-positive cells and are not originally infected with CD46-positive cells and do not induce cytotoxic effects.
  • PVRL4 / Nectin-4 (mainly described as “PVRL4” in this specification) is used as a receptor for infection of cerebral cancer, it specifically infects PVRL4-positive cancer cells and kills them. To induce. In cells infected with rMV-SLAMblind or rMV-V ( ⁇ )-SLAMblind, these viruses proliferate, destroy the cells and are released outside the cells, resulting in cell death.
  • rMV-SLAMblind is obtained by substituting the 533 amino acid residue of the amino acid sequence of the H protein of the measles virus strain with alanine in the wild type strain or the like.
  • rMV-V (-)-SLAMblind replaces arginine at the 533rd amino acid residue of the amino acid sequence of H protein with alanine, and further the 687th and 690th bases in the P gene from U to C, C, respectively. To U.
  • rMV-SLAMblind uses, for example, the plasmid pMV-HL (7+), which encodes the full-length antigenomic cDNA of the measles virus HL wild-type strain, to convert the arginine of the 533rd amino acid residue of the H protein with an alanine amino acid
  • a substituted vector (pMV-SLAMblind) is prepared and can be prepared by reverse genetics using this.
  • the full-length antigenomic cDNA of the measles virus HL wild-type strain in which arginine at the 533rd amino acid residue used here is amino acid substituted with alanine contains the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and is encoded by this base sequence.
  • N protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • P protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • M protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the F protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • the H protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • the L protein consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • a vector (pMV-V (-)) in which the arginine group is substituted with amino acid by alanine (pMV-SLAMblind) and the P gene is further replaced with two mutations (687 at U to C and 690 at C to U) SLAMblind) can be prepared and can be prepared by reverse genetics techniques.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by pMV-V ( ⁇ ) SLAMblind is exactly the same as rMV-SLAMblind.
  • the original virus strain for producing rMV-SLAMblind or rMV-V (-)-SLAMblind may be a strain other than the wild type MV-HL strain. Therefore, the rMV-SLAMblind or rMV-V ( ⁇ )-SLAMblind of the present invention is not limited to those using the above-described pMV-SLAMblind vector or pMV-V ( ⁇ ) SLAMblind.
  • the medicament and pharmaceutical composition of the present invention also effectively exert a therapeutic effect against cancer that has metastasized from the primary lesion to other tissues (described as metastatic cancer). Cancer cells often invade blood vessels and lymphatic vessels from where they first occurred, and move to other organs and organs on the blood and lymph flow, where they proliferate. Thus, it is difficult to predict which tissues or organs in the body metastatic cancer that has occurred in a different site from the primary lesion, and when metastasis is found, It can already be slow. Therefore, in order to kill cancer cells that have metastasized to any tissue in the body, a pharmaceutical composition that shows the killing effect of cancer cells is required not only by intratumoral administration but also by intravenous administration.
  • the inventors of the present invention show that the expression level of PVRL4 in cancer cells derived from metastatic cancer is higher than the expression level in cancer cells derived from the primary lesion, and rMV against cancer cells derived from metastatic cancer. -It has been confirmed that the efficiency of SLAMblind increases. Usually, it is difficult for conventional chemotherapy to kill only cancer cells that have spread to the whole body without affecting normal cells.
  • the medicament and pharmaceutical composition of the present invention containing rMV-SLAMblind or rMV-V (-)-SLAMblind as an active ingredient have a killing ability against cancer cells of metastatic cancer rather than cancer cells of the primary lesion. It is considered to have a high and very high therapeutic effect.
  • the effect of rMV-SLAMblind (and rMV-V ( ⁇ )-SLAMblind) on such metastatic cancers was first discovered by the present inventors.
  • the medicament and the pharmaceutical composition of the present invention exert an effect of killing cancer cells even by intravenous administration. Therefore, the medicament and pharmaceutical composition of the present invention are very effective for the treatment of metastatic cancer.
  • the medicament and pharmaceutical composition of the present invention can be killed if they are cancer cells expressing PVRL4 on the cell surface.
  • the expression of PVRL4 on the surface of cancer cells does not need to be steadily expressed, and even if the abundance of PVRL4 on the cell surface changes due to changes in the abundance ratio on the cytoplasm and cell surface Good.
  • the type of cancer to be treated by the medicament and pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited.
  • colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, and breast cancer are also referred to as triple negative breast cancer. Cancers that are difficult to treat are also included.
  • Triple negative breast cancer is a breast cancer that is negative for receptors for two hormones (estrogens and progesterone) and one protein (HER2) involved in the development and growth of breast cancer.
  • the medicament and pharmaceutical composition of the present invention are effective for anti-tumor effects even for refractory cancers that are resistant to conventional molecular target drugs (eg, cancers derived from the DLD1 cell line). Indicates. Therefore, the medicament and the pharmaceutical composition of the present invention can be used for refractory cancer (where “refractory cancer” refers to cancer that cannot be ameliorated by chemotherapy and molecular target therapy, or chemotherapy and molecular target. Cancer that is resistant to therapy).
  • the medicament and pharmaceutical composition of the present invention exert an excellent killing effect on cancer stem cells.
  • Cancer stem cells are thought to play an important role in metastasis and the growth of cancer at the metastasis destination, have a slow mitotic rate and multipotency, and chemotherapy such as anticancer drugs and radiation therapy It is an undifferentiated cell having high malignancy and having resistance. Therefore, effective killing of cancer stem cells is important in suppressing cancer metastasis and cancer cell growth at the metastasis destination. Therefore, the medicament and pharmaceutical composition of the present invention can suppress cancer metastasis and proliferation at the metastasis destination by killing cancer stem cells.
  • the medicament of the present invention may administer only rMV-SLAMblind and / or rMV-V ( ⁇ )-SLAMblind which are active ingredients, but generally, in addition to these viruses which are active ingredients, 1 or It is desirable to administer in the form of a pharmaceutical composition comprising two or more pharmaceutical additives.
  • rMV-SLAMblind or rMV-V ( ⁇ )-SLAMblind as well as other oncolytic viruses, anticancer agents, or auxiliary components (for example, the active ingredient) in the pharmaceutical composition of the present invention
  • immune checkpoint inhibitors such as CTLA-4 blockers and PD-1 antibodies, and immunostimulators such as GM-CSF, etc.
  • the type of pharmaceutical composition is not particularly limited.
  • any type can be used as long as it is suitable as a form for administering an oncolytic virus.
  • it can be used as a liquid preparation.
  • the type of pharmaceutical additive used for the production of the pharmaceutical composition, the ratio of the pharmaceutical additive to the active ingredient, or the method for producing the pharmaceutical composition can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the form of the composition. It is.
  • an additive for formulation an inorganic or organic substance, or a solid or liquid substance can be used, and it can generally be blended in an amount of 1 to 90% by weight based on the weight of the active ingredient. .
  • examples of such substances are lactose, glucose, mannitol, dextrin, cyclodextrin, starch, sucrose, magnesium aluminate metasilicate, synthetic aluminum silicate, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropyl starch, carboxymethylcellulose calcium.
  • Ion exchange resin methylcellulose, gelatin, gum arabic, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, light anhydrous silicic acid, magnesium stearate, talc, tragacanth, bentonite, bee gum, titanium oxide, sorbitan fatty acid ester, Sodium lauryl sulfate, glycerin, fatty acid glycerin ester, purified lanolin, glycerogelatin, polyso Bate, macrogol, vegetable oils, waxes, liquid paraffin, white petrolatum, fluorocarbons, nonionic surfactants, propylene glycol, water and the like.
  • the active ingredient is adjusted to pH such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, etc. as necessary. It is dissolved in distilled water for injection together with an isotonic agent such as a conditioner, sodium chloride, and glucose, and is aseptically filtered and filled into an ampoule. Further, mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin, etc. are added and lyophilized in a vacuum. Also, it may be an ergonomic injection. In addition, reticine, polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil and the like can be added to the active ingredient and emulsified in water to give an emulsion for injection.
  • pH such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactose, lactic acid, sodium, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, etc.
  • an isotonic agent such as a conditioner, sodium chlor
  • the pharmaceutical or pharmaceutical composition of the present invention may be any route of administration as long as it can exert the lytic effect of the tumor, and for example, may be intravenous administration in addition to intratumoral administration.
  • the dose and number of doses of the medicament or pharmaceutical composition of the present invention are not particularly limited, and depending on conditions such as the purpose of treatment, the type of cancer, the weight and age of the patient, the severity of the disease, etc. It is possible to select appropriately according to the judgment.
  • various unit dosage may be included.
  • the unit dose is the content of the predetermined amount of the recombinant measles virus of the present invention, and this unit dose may be administered as a single injection, or a continuous injection over a set period of time. May be included.
  • the unit dose of the present invention is the reported effective dose of oncolytic virus (dose showing tumor growth inhibitory effect) (Russell et al., Mayo Clin Proceedings, 89 (7): 926-33, 2014)), it has the effect of suppressing tumor growth.
  • the dose of the measles virus of the present invention is, for example, 10 3 TCDID 50 (50% tissue culture infectious dose; for example, Reed-Muench method, Reed et al., Am J Hyg 1938, 27: 493- 497) or more, 10 4 TCDID 50 or more, 10 5 TCDID 50 or more, preferably 10 6 TCDID 50 or more. From an experiment of intraluminal luminescence intensity (see Examples), a tumor growth inhibitory effect of about 10 7 TCDID 50 can be expected.
  • the present invention includes a therapeutic method in which the medicament or pharmaceutical composition of the present invention is administered to a patient (including a mammal other than a human) and the like to treat cancer (such as tumor regression).
  • the cancer treatment method of the present invention includes treatment aimed at regression of tumors that have already occurred, treatment aimed at killing metastasized cancer cells when metastasis is expected, and surgery. This includes preoperative or postoperative adjuvant therapies.
  • the “mammal” to be treated means any animal classified as a mammal, and is not particularly limited. For example, in addition to humans, pet animals such as dogs, cats, rabbits, cows, pigs, sheep Any animal such as a domestic animal such as a horse may be used. Preferred are humans and dogs.
  • ABC-1, Calu-3, RERF-LC-MS, RERF-LC-OK, VMRC-LCD, SK-LU-1, SBC1, SBC2, SBC3 and SBC5 are 10% FCS, 1 mM It was maintained in MEM (Minimum Essential Medium) supplemented with sodium pyruvate and non-essential amino acids.
  • NCI-H441, NCI-H522, PC-14, NCI-H69, N417, Lu134A and Lu139 were maintained in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS.
  • Human colon cancer cell lines CaCo-2, DLD1, HCT116, HT29, LoVo, LS174, RKO, SW48, SW480 and SW948 were purchased from ATCC (American Type Culture Collection) (Rockville, MD, USA).
  • DLD1, HT29 and SW48 cells were maintained in RPMI 1640 supplemented with 10% FCS.
  • Other cells were maintained in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) (Life Technologies) supplemented with 10% FCS.
  • Human breast cancer cell lines Triple negative breast cancer cells, HCC1599, HCC1187, HCC70, MDA-MB-468, HCC38, HCC1143, HCC1937, BT-20, HCC1806, DU4475 and BT549C were purchased from ATCC.
  • BT-20 was maintained in EMEM supplemented with 10% FCS, and other cells were maintained in RPMI supplemented with 10% FCS.
  • MCF7 human breast cancer cells (The Cell Resource Center for the Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University, Miyagi, Japan) were maintained by conventional methods. (Sugiyama et al., Gene therapy 20: 338-347 2013).
  • Human pancreatic cancer cell line Capan-2 was obtained from ATCC (ATCC, HTB-80).
  • KLM1 and PK1 were distributed by Dr. Yoichi Furukawa of the Department of Clinical Genome Oncology, Institute of Medical Science, University of Tokyo.
  • the canine breast cancer cell line CF33 was distributed by the Department of Veterinary Medicine, Nihon University School of Bioresource Sciences, and CTBp, CTBm, CHMp and CHMm were distributed by the graduate School of Agricultural and Life Sciences, the University of Tokyo. CF33 was maintained in RPMI with 10% FCS supplemented with DMEM, CTBp, CTBm and CHMmC supplemented with 10% FCS.
  • RMV-SLAMblind carrying the viral EGFP gene was prepared by the method already reported (JP 2013-216609; Sugiyama et al., Gene therapy 20: 338-347 2013, JP The entire disclosure of 2013-216609 is incorporated herein by reference).
  • RMV-V (-)-SLAM-blind was prepared by introducing two mutations (687th and 690th bases from U to C and C to U, respectively) into the P gene of the rMV-SLAMblind genome. . Each virus was infected with MCF7 cells, and the virus-infected cells were collected together with the culture supernatant, and the collected material was subjected to ultrasonic treatment for 8 seconds for 3 cycles to release the virus.
  • the collected material was centrifuged at 3,000 rpm (1,940 ⁇ g) for 10 minutes at 4 ° C., and the virus was collected in the supernatant.
  • the virus solution was concentrated to obtain virus at high titers for in vivo administration.
  • the 200 ml virus suspension was centrifuged at 19 krpm for 2 hours at 4 ° C. After centrifugation, the pellet was collected, resuspended in about 1 ml of medium, and stored at -70 ° C.
  • the titer of the virus is as TCID50 / ml (50% tissue culture infectious dose) against MCF7 cells. Were determined.
  • RT-PCR and sequence analysis Colon cancer cells were lysed with TRIzol LS reagent (Life Technologies), and total RNA was extracted according to the instructions. cDNA was synthesized using an RT-PCR kit (PrimeScript; Takara). PCR for human PVRL-4 and GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) was performed using AmpliTaq polymerase (Life Technologies). The primers used for PCR are as follows.
  • PVRL4-specific forward primer 5'- ACATCCTCCACGTGTCCTTC-3 '(SEQ ID NO: 8) PVRL4-specific reverse primer; 5'-CAAAGTGTCCCCATCCACTC-3 '(SEQ ID NO: 9) GAPDH-specific forward primer; 5'-CACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3 '(SEQ ID NO: 10) GAPDH-specific reverse primer; 5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 '(SEQ ID NO: 11) PCR was performed using LA Taq (Takara) to remove the entire coding region of PVRL4.
  • the primers used for PCR are as follows.
  • KIT-specific forward primer 5'-GGTCAGTTCCTTATTCAAGTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 12) KIT-specific reverse primer; 5'-GCTAAAATCTCCCATGTCAACAG-3 '(SEQ ID NO: 13) PCR products were cloned into TA cloning vector (pGEM-T; Promega) and sequenced. The determined sequence was compared with a sequence registered in GenBank (accession number: NM030916.2).
  • Flow cytometry 5-1 Cell line After washing the cells with PBS, they were detached from the culture plate with 0.025% trypsin, 0.24 mM EDTA. The collected cells were centrifuged, and the obtained cell pellet was resuspended in HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (Life Technologies) containing 2% FCS.
  • HBSS Hort's Balanced Salt Solution
  • Cell suspensions consist of anti-human Nectin-4 monoclonal antibody (Clone 337516, R & D Systems), anti-PVRL4 mAB (Clone N4.61; Millipore), anti-human SLAM antibody [A12 (7D4) BioLegend, San Diego, CA], Incubated with anti-CD46 antibody (M177, HyCult Biotech, Uden, Netherland) or mouse IgG (R & D Systems) on ice. After incubation, the cells were washed with PBS containing 2% FCS and incubated with anti-mouse IgG-Alexa 488 (Life Technologies) on ice.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • Tumor cells Tumors derived from colon cancer cells excised from mice were treated with HBSS containing 5 mM HEPES, 2% FCS, 1 mg / mL collagenase (Wako Pure Chemicals) and 0.1% DNase I (Life Technologies). Cells collected from the tumor were stained with 7AADAAD (7-amino-actinomycin D) and anti-mouse H2Kd-PE-Cy7 Ab (clone SF 1-1.1; BD Biosciences), fixed with 4% paraformaldehyde, and BD FACS Verse Analysis was performed using an analyzer (BD Biosciences).
  • 7AADAAD 7-amino-actinomycin D
  • anti-mouse H2Kd-PE-Cy7 Ab clone SF 1-1.1; BD Biosciences
  • Cell viability was measured using the WST-1 cell proliferation kit (Takara). Virus was infected at a moi suitable for each cell and cultured. At several dpi (days post first inoculation; the same applies hereinafter), cell viability was measured according to the instructions attached to the WST-1 cell proliferation kit.
  • Xenograft model All animal experiments were approved by the University of Tokyo Laboratory Animal Committee. In the case of subcutaneous transplantation, the transplanted tumor cells have arrived and grown to a sufficient size (100 mm 3 to 250 mm 3 , and in some cases 500 mm 3 ) before administering a virus to verify the therapeutic effect. went. The period until the tumor mass grows to a sufficient size varies depending on the type of cancer cell and the proliferation rate. 7-1. Lung cancer cell line 5-week-old female scid (severe combined immune deficiency) mice were purchased from Clare Japan.
  • NCI-H441 cells (lung cancer cell line) were suspended in HBSS containing 2% FCS at 1 ⁇ 10 8 cells / ml and mixed with an equal volume of Matrigel (BD Biosciences). 100 ⁇ l of cell suspension (5 ⁇ 10 7 cells) was injected subcutaneously into scid mice (5 ⁇ 10 7 cells / 1 mouse). Virus administration was started when the tumor mass grew to 400-500 mm 3 after transplantation. 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind was intratumorally administered to mice three times on days 0, 10, and 19. Tumor volume was calculated by (width ⁇ width ⁇ length) / 2.
  • Tumor volume was analyzed by the Wilcoxon-log-rank test using JMP software (JMP Pro 10.0.2, SAS Institute Inc., Cary, NC).
  • JMP Pro 10.0.2 SAS Institute Inc., Cary, NC
  • an experiment was also conducted in which the virus was administered once in the tumor.
  • NCI-H441 / CMV-Luc cells (1 x 10 5 cells in 100 ⁇ l) were administered intravenously into mice. Thereafter, 200 ⁇ l of D-luciferin (10 mg / ml, Gold Biotechnology, Inc.) was administered subcutaneously.
  • Luminescence was measured using a Xenogen IVIS Imaging System 100 (Xenogen / Caliper Life Sciences) to monitor tumor growth. The imaging parameters were exposure for 1 minute, binning of 8, and a 15 cm field of view. After transplantation of lung cancer cells, when the tumor mass became sufficiently large, 100 ⁇ l of 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind was intravenously administered to the mice. Furthermore, 250 ⁇ l of rMV-EGFP-SLAMblind was intravenously administered to mice on the 14th, 41st, and 48th day after the first administration of rMV-EGFP-SLAMblind. The mice were then euthanized and the lungs were observed using a fluorescence microscope.
  • Colon cancer cell lines 5 ⁇ 10 6 cells of DLD1 cells or HT29 cells were suspended in 50% Matrigel (BD Biosciences) and injected subcutaneously into the flank of 6-week-old female scid mice. Thereafter, the change of the tumor was observed, and the size was measured every 2 or 3 days. After transplantation, when the tumor mass reached 150 mm 3 , 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind was administered intratumorally 3 times per week. Tumor volume was calculated by (width ⁇ width ⁇ length) / 2.
  • rMV-EGFP-SLAMblind administered intravenously to the grown breast cancer tumor cells was examined.
  • 1.5 ⁇ 10 6 cells of MCF7 cells were suspended in 50% strength Matrigel (BD Biosciences) and injected subcutaneously into 6 week old female scid mice.
  • 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind was intravenously administered to the mice.
  • rMV-EGFP-SLAMblind was also administered 4 days after the first administration. Tumor volume was calculated by (width ⁇ width ⁇ length) / 2.
  • Canine breast cancer cells 5 ⁇ 10 6 cells of CF33 cells were suspended in 50% Matrigel (BD Biosciences) and injected subcutaneously into 6-week-old female scid mice. Thereafter, changes in the tumor were observed, and when the tumor mass became sufficiently large, 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind was administered intratumorally. Tumor volume was calculated by (width ⁇ width ⁇ length) / 2.
  • Pancreatic cancer cells 1 ⁇ 10 6 KLM1 cells were suspended in 50% Matrigel (BD Biosciences) and transplanted subcutaneously into the right flank of CB-17 / Icr-scid mice. On the 19th day after transplantation, the mice were divided into 2 groups (7 mice each) and inoculated with 1 ⁇ 10 6 of rMV-EGFP-SLAMblind. On the 8th, 14th and 37th days after the inoculation, the virus was inoculated in the same manner as the first time. Tumor volume was measured every 2-3 days after inoculation. Tumor volume was calculated by (width ⁇ width ⁇ length) / 2.
  • PVRL4 Effect on human lung cancer Infectivity of rMV-SLAMblind to PVRL4-positive lung cancer cells
  • PVRL4 consists of eight non-small cell lung cancer cell lines (ABC1, NCI-H441, NCI-H2170, NCI-H358, Calu-3, PC14, A431 and NCI-H1666) and one small cell lung cancer cell line ( It was expressed in SBC-2) (FIGS. 1 and 2).
  • SBC-2 small cell lung cancer cell line
  • NCI-H441 was selected as a lung cancer cell line used for transplantation. NCI-H441 is a cell line that expresses a lot of PVRL4, and its survival rate is clearly reduced by infection with rMV-EGFP-SLAMblind, and can be transplanted to Scid mice. Has been. After the transplanted tumor began to grow and became a sufficient mass, 1 ⁇ 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind was administered intratumorally to mice three times.
  • Intravenous administration was performed by intravenous administration of NCI-H441 / CMV-Luc carrying the luciferase gene It was. Tumor growth was monitored by measuring luminescence using a Xenogen IVIS Imaging System 100. RMV-EGFP-SLAMblind was administered intravenously several times after the growing tumor was clearly visualized. According to the analysis by IVIS, luminescence from the transplanted tumor cells and fluorescence from the virus replicated in the tumor cells were observed in the same area. Since the fluorescence observation by IVIS is not so high in resolution, the mouse was euthanized and the lung was observed under a fluorescence microscope.
  • Fluorescence microscopy revealed that multiple tumors were present in the lung. The number of tumors ranged from 16 to 36 per lung. And the fluorescence signal from rMV-SLAMblind-EGFP was detected in many of these tumors depending on the administration of rMV-SLAMblind-EGFP (FIGS. 5C and D). This indicates that rMV-SLAMblind can infect multiple tumors existing in different parts of the lung by intravenous administration.
  • rMV-SLAMblind is useful for metastasized cancer (cancer that has spread and propagated to sites other than the primary lesion via veins, etc.)
  • metastasized cancer cancer that has spread and propagated to sites other than the primary lesion via veins, etc.
  • intravenous administration is suggested.
  • Example 2 Effect on human colon cancer Infectivity of rMV-SLAMblind to PVRL4-positive colorectal cancer cells.
  • the expression level of PVRL4 in colorectal cancer cell lines was examined by flow cytometry. Among the 10 colorectal cancer cell lines, expression of PVRL4 was observed in CaCo-2, DLD1, HT29, LS174, RKO, SW48, SW480 and SW948 (FIG. 6A).
  • CD46 and SLAM there was no SLAM expression in all cell lines, and CD46 was expressed in all cell lines (FIG. 6A).
  • the expression of PVRL4 mRNA was examined by RT-PCR, the expression of PVRL4 mRNA was consistent with the expression of PVRL4 on the cell surface (FIGS. 6A and B).
  • the tumor weight of the group administered rMV-EGFP-SLAMblind was clearly light compared to the tumor of the control group administered the medium (FIG. 8C).
  • FIG. 8C The tumor weight of the group administered rMV-EGFP-SLAMblind was clearly light compared to the tumor of the control group administered the medium.
  • rMV-SLAMblind exerts a good antitumor effect on tumors derived from colon cancer cells.
  • the DLD1 cell line is derived from an intractable cancer that is resistant to anti-EGFR antibody, which is a conventional molecular target drug, but rMV-SLAMblind is used for tumors transplanted with the DLD1 cell line.
  • rMV-SLAMblind is considered to be effective for the treatment of refractory cancer.
  • Example 3 Effect on human triple negative breast cancer Infectivity of rMV-SLAMblind to triple negative breast cancer cells PVRL4 expression level in triple negative breast cancer cell lines was examined by flow cytometry.
  • mice were intratumorally administered with 1 ⁇ 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind or rMV-V ( ⁇ )-EGFP-SLAMblind at the time indicated by the arrows in FIG. .
  • TCID 50 1 ⁇ 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind or rMV-V ( ⁇ )-EGFP-SLAMblind
  • tumor growth was clearly suppressed as compared to the control mice (FIG. 11).
  • Example 4 Tumor regression effect derived from human breast cancer by intravenous administration of rMV-SLAMblind
  • rMV-EGFP-SLAMblind administered intravenously to a tumor derived from breast cancer shows tumor regression effect
  • MCF7 was selected as a breast cancer cell line used for transplantation. It has been confirmed that rMV-EGFP-SLAMblind is intratumorally administered to MCF7-derived tumors (Japanese Patent Laid-Open No. 2013-216609).
  • Example 5 Effect on human breast cancer-derived cancer stem cells Expression level of PVRL4 on the surface of cancer stem cells
  • human cancer cell line HCC1187 was analyzed using CSC markers (CD44, CD24 and After staining with an antibody against EpCAM), the expression of PVRL4 was analyzed by flow cytometry.
  • the proportion of CSC present in the HCC1187 cell population was 4.9%.
  • the proportion of cells expressing PVRL4 was 99.5% for the entire HCC1187 cell and 99.7% for the CSC cell fraction. From this result, it was found that PVRL4 was expressed in cancer stem cells at the same level as non-cancer stem cells.
  • Example 6 Effect on breast cancer in dogs Infectivity of rMV-SLAMblind to canine breast cancer cells Since the wild type of rMV-SLAMblind of the present invention is a virus that infects humans as a natural host, it is less infectious to other animals and experimentally infects measles virus. But dogs never develop. On the other hand, the number of breast cancer cases in dogs has increased in recent years, and the development of an effective method for treating breast cancer in dogs is required as in humans. Therefore, the infectivity of rMV-SLAMblind to canine breast cancer cells was examined.
  • rMV-SLAMblind Antitumor effect of rMV-SLAMblind on canine breast cancer cell-derived tumor in vivo
  • CF33 was selected as a canine breast cancer cell line used for transplantation.
  • the time when the tumor mass reached a sufficient size was defined as 0 dpi, and 1 ⁇ 10 6 TCID 50 of rMV-EGFP-SLAMblind was administered intratumorally at the time of 0 dpi and 8 dpi.
  • Example 7 Effect on human pancreatic cancer Expression level of PVRL4 on the surface of human pancreatic cancer cells
  • PVRL4 expression was analyzed by flow cytometry. The expression of PVRL4 was confirmed in these cells (FIG. 18A). Further, when the expression of SLAM and CD46 was examined for these three types of cells, no SLAM expression was observed in any of the cells, but the expression of CD46 was confirmed in all cells (FIG. 18B). CoBL cells expressed both SLAM and CD46, and the results were shown as a positive control (FIG. 18B).
  • KLM1 cell line and the PK1 cell line are derived from the same patient, but KLM1 is obtained by xenotransplantation of PK1 cells into mice and collected from the metastasized cancer site.
  • KLM1 cells are cancer cell lines with higher metastatic potential and tumorigenicity than PK1 cells, and the expression level of PVRL4 was found to be higher in KLM1 cells (FIG. 18A).
  • KLM1 cells had a more significant decrease in survival rate than PK1 cells.
  • Analysis using clinical samples from patients with pancreatic cancer indicates that PVRL4 is strongly expressed in large tumors larger than 4 cm (Izumi et al., Surg Today, 2015 Apr, 45 (4): 487-94 .), RMV-SLAMblind therapy can be expected to exert therapeutic effects on highly malignant pancreatic cancer such as metastatic cancer.
  • the control group was inoculated with the same amount of HBSS medium.
  • the virus was inoculated again on the 8th, 14th, and 37th days after the inoculation in the same manner as the first inoculation. Tumor size was measured every 2-3 days after inoculation ( Figure 20A).
  • Figure 20A As a result, when rMV-EGFP-SLAMblind was administered, tumor growth was clearly suppressed as compared to the control inoculated with the medium (FIG. 20A).
  • the medium-inoculated group (mock) was euthanized, the tumor was excised and weighed.
  • the rMV-SLAMblind inoculated group (dSLAM) was euthanized on the 84th day (47th day after the last inoculation) after the first virus inoculation, and the tumor weight was measured (FIG. 20B).
  • dSLAM rMV-SLAMblind inoculated group
  • a significant difference was observed in the tumor size compared to the tumor size in the group inoculated with the medium, indicating that rMV-SLAMblind suppressed the growth of KLM1 cells in the xenograft model.
  • frozen sections of tumors extracted from rMV-SLAMblind-administered mice were prepared and observed with a fluorescence microscope.
  • the present invention provides a pharmaceutical or a pharmaceutical composition containing an oncolytic recombinant measles virus, and can particularly effectively regress cancers that are difficult to treat or metastasized cancer cells. Therefore, it is a very useful technique in the field of cancer treatment.

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Abstract

　本発明は、様々ながんの治療のために有効な医薬、または医薬組成物を提供する。　より具体的には、本発明は、rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを含む、がんを治療するための医薬組成物である。該医薬組成物は、静脈内投与によっても、腫瘍を退縮させる効果を有し、原発巣から転移したがんに対しても効果を示す。

Description

腫瘍治療用遺伝子改変麻疹ウイルス
　本発明は、腫瘍溶解性麻疹ウイルス、および、該腫瘍溶解性麻疹ウイルスを用いたがんの治療のための医薬組成物、ならびに、がんの治療方法に関する。
　麻疹ウイルス（Measles virus;MV）は、パラミクソウイルス科モービリウイルス属に属し、ヒトを自然宿主として感染し、免疫抑制や呼吸器症状を引き起こす病原性ウイルスである。麻疹ウイルスが腫瘍細胞に感染し、腫瘍の退縮を誘導することが明らかになったことから（非特許文献１）、麻疹ウイルスは、がんのウイルス治療のツールとして注目されてきた。現在までのところ、ワクチン株に基づく麻疹ウイルスを用いたウイルス治療の臨床的研究として、卵巣がん、ミエローマについて行われている（非特許文献２）。
　麻疹ウイルスは、宿主細胞へ感染する際に、３つの分子をレセプターとして使用する。これらの分子は、CD46（非特許文献３および非特許文献４）、SLAM(signaling lymphocyte activation molecule)（非特許文献５）およびPVRL4(Poliovirus recptor related 4)(Nectin-4とも称される)（非特許文献６および非特許文献７）である。麻疹ウイルスのワクチン株は、これら３つの全ての分子をレセプターとして使用することができるが、野生型の麻疹ウイルス株は、PVRL4およびSLAMを使用することができるものの、CD46を使用できない。CD46は、ヒトの有核細胞に偏在的に存在しているが、特に、腫瘍細胞において発現が上昇する（非特許文献８および非特許文献９）。そのため、麻疹ウイルスワクチン株を用いたウイルス治療開発研究には、主要なレセプターであるCD46をターゲットとすることを目的とするものがある。しかしながら、CD46は正常細胞においても発現しているため、副作用の問題や、ターゲットの腫瘍細胞への感染率への影響が懸念されていた。また、ワクチン接種者では免疫による早期の排除も懸念されている。
　PVRL4は、乳がん細胞、卵巣がん細胞、肺がん細胞を含む腫瘍細胞において、選択的にその発現が上昇している（非特許文献１０～非特許文献１３）。通常、PVRL4は、ヒトの胎盤に発現しているが、他の組織での発現はほとんど認められない（非特許文献１４）
　発明者らは、PVRL4を選択的にターゲットとするため、麻疹ウイルスの野生株を用いることを考えた。野生型麻疹ウイルスが病原性を示すためのレセプターはSLAMである。SLAMは免疫細胞に選択的に発現しており、麻疹ウイルスによる、深刻な免疫抑制やウイルスの全身への拡散を可能ならしめている（非特許文献１５）。そこで、発明者らは、野生型麻疹ウイルスHL株をベースにして、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルス（rMV-SLAMblind）を作製した（非特許文献１６および特許文献１）。インビトロまたはインビボにおいて、rMV-SLAMblindを乳がん細胞に感染させると、これを死滅させることができる。その抗腫瘍活性は、従来の麻疹ウイルスワクチン株よりも高い。また、rMV-SLAMblindは、完全に弱毒化されており、サルへ皮下接種しても麻疹の典型的な臨床症状を引き起こすことがなく、安全性も高いことが確認されている（非特許文献１６および特許文献１）。
　以上のように、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスであるrMV-SLAMblindは、がん治療のためのツールとして、非常に有効であると期待されている。特に、原発性のがんのみならず、転移性のがんの治療、さらには、がん幹細胞に対する傷害効果に対する期待度も大きい。
特開2013-216609
Groteら,Blood 97:3746-3754 2001. Galanisら, Cancer research 70:875-882 2010. Dorigら, Cell 75:295-305 1993 Nanicheら, Journal of virology 67:6025-6032 1993 Tatsuoら, Nature 406:893-897　2000 Muhlebachら, Nature 480:530-533 2011 Noyceら, PLoS pathogens 7:e1002240 2011 Liszewskiら, Annual review of immunology 9:431-455 1991 Fishelsonら, Molecular immunology 40:109-123 2003 Takanoら,Cancer research 69:6694-6703 2009 Fabre-Lafayら, BMC cancer 7:73 2007 Fabre-Lafayら, The Journal of biological chemistry 280:19543-19550　2005 Deryckeら, American journal of clinical pathology 134:835-845 2010 Reymondら, The Journal of biological chemistry 276:43205-43215 2001 Delpeutら, Current opinion in virology 2:773-783 2012 Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013
　上記状況に鑑み、本発明者らは、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスが、乳がん以外の種々のがんにも効果を示すかどうか、および、治療が困難とされているがん（例えば、転移したがん、トリプルネガティブ乳がんなど）に対する治療効果を示すかどうか等につき、さらに詳細な検討を行った。
　そこで、本発明は、様々ながんの治療のために有効な医薬、または医薬組成物の提供を目的とする。
　本発明者ら、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスを含む医薬、または医薬組成物の治療対象となるがんについて、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスとして、rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindを用い、様々な検討を行った結果、非常に治療が困難とされているトリプルネガティブ乳がん、および、転移したがんの治療が可能であることを見出した。さらに、SLAMを認識しない組換え麻疹ウイルスを含む医薬、または医薬組成物が、腫瘍内投与のみならず、静脈内投与によっても腫瘍の退縮効果を示し、かつ、従来のウイルス医薬と比較して、より低い投与量によっても腫瘍の退縮効果を示すことを初めて見出した。
　以上の知見に基づいて本発明は完成された。
　すなわち、本発明は、以下の（１）～（６）である。
（１）rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを含む、がんを治療するための医薬組成物。
（２）がん幹細胞を殺傷することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
（３）前記がんが、難治性のがんであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
（４）前記がんが、転移がんである、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（５）前記がんが、トリプルネガティブ乳がん、膵臓がん、肺がんまたは大腸がんである、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の医薬組成物。
（６）前記rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを静脈投与することにより用いられることを特徴とする、上記（１）乃至（５）のいずれかに記載の医薬組成物。
（７）治療対象がイヌであることを特徴とする上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の医薬組成物。
　本発明により、治療困難ながんの治療のための医薬、あるいは、医薬組成物の開発が可能となる。また、本発明により、様々な種類のがんの治療が可能となる。
肺がん細胞株における麻疹ウイルスレセプターの発現状況。　細胞表面上における麻疹ウイルスレセプターの発現状況について、フローサイトメトリーを用いて解析した結果である（麻疹ウイルスレセプター；濃灰色のグラフ、アイソタイプコントロール；灰色のグラフ）。 肺がん細胞株におけるPVRL4の発現状況。　肺がん細胞株におけるPVRL4の発現を、MFI(Mean Fluorescent Intensity)の割合として表示した。黒のグラフは非小細胞肺がん株の結果を、白のグラフは小細胞肺がん株の結果を示す。 rMV-SLAMblindのPVRL4発現肺がん細胞株への感染能力を検討した結果。　各種細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=0.1または2で感染させた。代表的な細胞の写真を示す。 インビトロにおける肺がん細胞に対するrMV-SLAMblindの細胞傷害性の検討結果。　各種肺がん細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=1で感染させた。細胞の生存率は、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpiおよび7 dpiの時点で測定した。数値は、3回の実験値の平均値±SDとして表した。Viablity；生存率、dpi；days post first inoculation 肺がん細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果。（ＡおよびＢ）皮下投与したNCI-H441の腫瘍の大きさを、rMV-EGFP-SLAMblindの腫瘍内投与後に測定した。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。*：p<0.05。（Ａ）ウイルス（●）または培地（△）を最初の投与（0 日）から、10日、19日の時点で、さらに投与した（n=4）。（Ｂ）ウイルス（●）または培地（△）を１回投与した（mock（培地）につきn=8、ウイルス投与につきn=9）。（Ｃ）NCI-H441/CMV-Luc細胞をマウスに静脈投与により移植した。rMV-EGFP-SLAMblindを数回にわたり静脈内投与した。（Ｃ）ウイルス（i-iii）または培地（iv）を投与したマウスの肺および腫瘍を、蛍光顕微鏡を用いて観察した。（Ｄ）肺において蛍光を発する腫瘍細胞の割合を示した。各ドットは個々のマウスのデータを示している。 大腸がん細胞株における麻疹ウイルスレセプターの発現状況。（Ａ）細胞表面上における麻疹ウイルスレセプターの発現を、フローサイトメトリーを用いて解析した（麻疹ウイルスレセプター；白のグラフ、アイソタイプコントロール；灰色のグラフ）。（Ｂ）各大腸がん細胞株のRT-PCR解析の結果を示す。左図はPCR産物を電気泳動した結果を示す。また、右図は、GAPDHの発現量に対するPVRL4の発現量の割合を示す。3回の実験のPVRL4/GAPDH±SD値を示す。DLD1細胞のPVRL4/GAPDHの値を1とした。 rMV-SLAMblindの大腸がん細胞株への感染能力を検討した結果。（Ａ）細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=2で感染させた。代表的な細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。（Ｂ）PVRL4ポジティブ細胞の生存率を示す。Viablity；生存率、dpi；days post first inoculation（Ｃ）PVRL4ネガティブ細胞の生存率を示す。（Ｂ）（Ｃ）については、細胞にrMV-EGFP-SLAMblindをmoi=2で感染させ、グラフの示すdpiにおいてWSTアッセイを行った。数値は、3回の実験値の平均値±SDとして表した。 大腸がん細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果。（ＡおよびＢ）皮下投与したDLD1細胞（Ａ）およびHT29細胞（Ｂ）の移植片の体積は、rMV-EGFP-SLAMblindの腫瘍内投与後の値である。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。*, **：p<0.05、p<0.01。ウイルス（○）または培地（●）を最初の投与（0日）から、7日, 14日の時点で、さらに、投与した（n=7）。dpi；days post first inoculation（Ｃ）最初の感染から20日目にマウスを安楽死させ、DLD1細胞およびHT29細胞由来の腫瘍の重量を測定した。（Ｄ）蛍光を発する細胞の割合を示した。各ドットは個々のマウスのデータを示している（各グループにおいてn=7）。*, p<0.05。 トリプルネガティブ乳がん細胞株におけるPVRL4の発現状況。（Ａ）細胞表面上におけるPVRL4の発現の有無を示す結果である。（Ｂ）rMV-EGFP-SLAMblindのトリプルネガティブ乳がん細胞株への感染能力を検討した結果である。代表的な細胞の写真を示す。 インビトロにおけるトリプルネガティブ乳がん細胞に対するrMV-SLAMblindの細胞傷害性の検討結果。トリプルネガティブ乳がん細胞にrMV-EGFP-SLAMblindおよびrMV-V(-)-EGFP-SLAMblindを感染させた。（Ａ）トリプルネガティブ乳がん細胞であるHCC70細胞の生存率を、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpi, 7 dpiおよび9dpiの時点で測定した。（Ｂ）PVRL4を発現していないコントロール細胞のB95aの生存率を測定した結果である。数値は、3回の実験値の平均値±SDとして表した。Viablity；生存率、dpi；days post first inoculation トリプルネガティブ乳がん細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindの抗腫瘍効果。皮下投与したHCC70が増殖した腫瘍の体積（Tumor volume）を測定した。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。1 x 106TCID50のrMV-SLAMblind、rMV-V(-)-SLAMblindまたは培地（control）を、最初の投与（0日）から、7日、17日の時点で、さらに投与した。Days after first viral administration；最初のウイルス投与からの日数 乳がん細胞由来の腫瘍に対するrMV-SLAMblindの静脈内投与の効果を調べた結果。rMV-SLAMblindを最初の投与（0日）から、さらに4日の時点で投与した。 乳がん由来のがん幹細胞に対するrMV-SLAMblindの細胞傷害性の検討結果。（Ａ）rMV-EGFP-SLAMblindのがん幹細胞への感染能力を検討した結果である。（Ｂ）rMV-SLAMblind を感染させたHCC1187細胞の生存率を、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpiおよび7 dpiの時点で測定した。図中、NCSC mockおよびCSC mockは、培地で処理したときの非がん幹細胞（NCSC）およびがん幹細胞（CSC）の生存率を示し、NCSC SLAM blindおよびCSC SLAM blindは、rMV-SLAM blindで処理したときの非がん幹細胞（NCSC）およびがん幹細胞（CSC）の生存率を示す。細胞生存率は、mock（培地より）の値を1として示した。Cell viablity；細胞生存率、d.p.i.；days post first inoculation イヌ乳がん細胞におけるPVRL4の発現状況。（Ａ）細胞表面上におけるPVRL4の発現の有無を示す結果である。rMV-EGFP-SLAMblindのイヌ乳がん細胞株（Ｂ）および初代培養細胞株（Ｃ）への感染性について検討した結果である。代表的な細胞の写真を示す。 原発がん由来のイヌ乳がん細胞株と転移がん由来のイヌ乳がん細胞株に対するrMV-SLAMblindの感染性の比較。（Ａ）CHMp細胞（原発がん由来）とCHMm細胞（転移がん由来）の細胞表面上にけるPVRL4の発現の有無を示す結果である。（Ｂ）CHMp細胞とCHMm細胞に対するrMV-EGFP-SLAMblindの感染性について検討した結果である。 インビトロにおけるイヌ乳がん細胞株に対するrMV-SLAMblindの細胞傷害性の検討結果。各種細胞にrMV-EGFP-SLAMblindを感染させ、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpiおよび7 dpi時点で生存率を測定した。Viablity；生存率、dpi；days post first inoculation イヌ乳がん細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果。　（Ａ）免疫不全マウスに皮下移植したイヌ乳がん由来細胞株CF33細胞が増殖した腫瘍の体積を測定した。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。1 x 106TCID50のrMV-SLAMblind（n=8）、または培地（n=8）を、最初の投与（0日）から、さらに6日の時点で投与した。（Ｂ）（Ａ）の実験で、最初のウイルス投与から５０日目採取した腫瘍の重量を表した。数値は実験値の平均値±SDとした。 ヒト膵臓がん細胞表面におけるPVRL4の発現状況。（Ａ）細胞（KLM1、PK1およびCapan-2）表面上におけるPVRL4の発現の有無を示す結果である。（Ｂ）細胞（KLM1、PK1およびCapan-2）表面上におけるSLAMとCD46の発現の有無を示す結果である。CoBL細胞は、SLAMおよびCD46が発現している細胞で、陽性対照としてCoBL細胞の結果を示す。 インビトロにおけるヒト膵臓がん細胞株に対するrMV-SLAMblindの感染性および細胞傷害性の検討結果。（Ａ）rMV-EGFP-SLAMblindのKLM1細胞株、PK1細胞株およびCapan-2細胞株への感染能力を検討した結果である。（Ｂ）KLM1細胞株、PK1細胞株およびCapan-2細胞株にrMV-EGFP-SLAMblindを感染させ、WST-1アッセイにより、1 dpi, 3 dpi, 5 dpi, 7dpiおよび9dpiの時点で生存率を測定した結果である。（○）は細胞をウイルスで処理した結果で、（●）は細胞を培地で処理した結果である。Cell viablity；細胞生存率、dpi；days post first inoculation ヒト膵臓がん細胞株の異種移植モデルにおける、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果。　（Ａ）免疫不全マウスに皮下移植したヒト膵臓がん由来細胞株KLM1細胞が増殖した腫瘍の体積を測定した。数値は、実験値の平均値±SDとして表した。1 x 106TCID50のrMV-SLAMblind（n=7）、または培地（control）（n=7）を、最初の投与（0日）から、さらに8日、14日および37日の時点で投与した。（Ｂ）（Ａ）の実験で、最初のウイルス投与から８４日目に採取した腫瘍の重量を表した。数値は実験値の平均値±SDとした。（Ｃ）rMV-SLAMblindを投与したマウスから摘出した腫瘍の凍結切片を、蛍光顕微鏡で観察した結果である。（Ｄ）rMV-SLAMblindを投与したマウスから摘出した腫瘍から、接種後47日目に分離したウイルスのH遺伝子の配列を解析した結果である。
　本発明の実施形態の一つは、rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindを含む、がんを治療するための医薬、または医薬組成物である。
　本発明者らは、すでに報告している乳がん以外の、治療が困難とされるヒトのトリプルネガティブ乳がん細胞の他、ヒト肺がん細胞、ヒト大腸がん細胞、さらには、イヌ乳がん細胞に対し、rMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindが細胞死を効率的に引き起こすことを確認した。rMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindは、SLAM陽性の細胞に対する感染性を喪失しており、また、CD46陽性細胞に対しても、もともと感染せず細胞傷害作用を誘導しないが、細胞への感染のためのレセプターとして、PVRL4/Nectin-4（本明細書では、主として、「PVRL4」と記載する）を使用するため、PVRL4陽性のがん細胞に特異的に感染し、その細胞死を誘導する。rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindが感染した細胞内では、これらのウイルスが増殖し、細胞を破壊して、細胞外に放出され、その結果細胞死が誘導される。
　rMV-SLAMblindは、麻疹ウイルス株のHタンパク質のアミノ酸配列の533番目のアミノ酸残基を、野生型株などにおけるアルギニンをアラニンに置換したものである。他方、rMV-V(-)-SLAMblindは、Hタンパク質のアミノ酸配列の533番目のアミノ酸残基のアルギニンをアラニンに置換し、さらにP遺伝子中の687、690番目の塩基をそれぞれUからC、CからUに置換したものである。
　rMV-SLAMblindは、例えば、麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドpMV-HL(7+)を使用して、そのHタンパク質の533番目のアミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換したベクター（pMV-SLAMblind）を調製し、これを利用して、リバースジェネティクス手法により調製することができる。ここで使用される533番目アミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換した麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAは、配列番号１に示される塩基配列を含んでおり、この塩基配列によってコードされるタンパク質のうち、Nタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、Ｐタンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、Mタンパク質は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、Fタンパク質は、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、Hタンパク質は、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなり、Lタンパク質は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。これらのタンパク質によって、ウイルスが構成される。
　　他方、rMV-V(-)-SLAMblindは、例えば、麻疹ウイルスHL野生型株の全長アンチゲノムcDNAをコードするプラスミドpMV-HL(7+)を使用して、そのHタンパク質の533番目のアミノ酸残基のアルギニンをアラニンによりアミノ酸置換したベクター（pMV-SLAMblind）のP遺伝子にさらに２カ所の変異（687番目をUからC、690番目をCからU）に置換したベクター（pMV-V(-)SLAMblind）を調製し、これを利用して、リバースジェネティクス手法により調製することができる。なお、pMV-V(-)SLAMblindによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列は、rMV-SLAMblindと全く同じである。
　rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindを作製するための、元のウイルス株は、野生型MV-HL株以外の株であってもよい。従って、本発明のrMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindは、上述のpMV-SLAMblindベクターやpMV-V(-)SLAMblindを利用したものには限定されない。
　本発明の医薬および医薬組成物は、原発巣から他の組織に転移したがん（転移がんと記載する）に対しても有効に治療効果を発揮する。がん細胞は、しばしば、最初に発生した場所から、血管やリンパ管に侵入して、血液やリンパの流れに乗って別の臓器や器官に移動し、そこで、増殖を行うことがある。このように、原発巣とは異なる部位で生じた転移がんは、体内のどの組織、あるいは、臓器において生じるか、予測することは難しく、転移が見つかった時点では、治療の開始時期としては、すでに、遅い場合もあり得る。そのため、体内のいずれかの組織に転移したがん細胞を死滅させるためには、腫瘍内投与のみならず、静脈内投与によっても、がん細胞の殺傷効果を示す医薬組成物等が必要である
　本発明の発明者らは、転移がん由来のがん細胞におけるPVRL4の発現量が、原発巣由来のがん細胞における発現量よりも増加しており、転移がん由来のがん細胞に対するrMV-SLAMblindの効率が上昇することを確認している。通常、正常細胞には影響を与えずに、全身に転移したがん細胞のみを死滅させることは、従来の化学療法では難しい。rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindを有効成分として含有する本発明の医薬および医薬組成物は、原発巣のがん細胞よりも、むしろ、転移がんのがん細胞に対する殺傷能力が高く、非常に高い治療効果を発揮すると考えられる。このような転移がんに対するrMV-SLAMblind（およびrMV-V(-)-SLAMblind）の効果は、本発明者らにより、初めて見出された。
　また、本発明の医薬および医薬組成物は、実施例において示すように、静脈内投与によっても、がん細胞を死滅させる効果を発揮する。従って、本発明の医薬および医薬組成物は、転移がんの治療にも非常に有効である。
　本発明の医薬および医薬組成物は、細胞表面にPVRL4を発現しているがん細胞であれば、死滅させることができる。がん細胞表面上におけるPVRL4の発現は、定常的に発現している必要はなく、細胞質と細胞表面上における存在比率が変化することで、細胞表面上のPVRL4の存在量に増減が生じてもよい。
　本発明の医薬および医薬組成物の治療対象となるがんの種類としては、特に限定はしないが、例えば、大腸がん、肺がん、膵臓がん、さらに、乳がんの中でも、トリプルネガティブ乳がんと称される治療が困難とされるがんも含まれる。トリプルネガティブ乳がんとは、乳がんの発症と増殖に関わる２つのホルモン（エストロゲン、プロゲステロン）と１つのタンパク質（HER2）に対する受容体が陰性の乳がんのことで、現在の治療法として有力なホルモン療法や、抗HER2（トラスツズマブなど）療法による治療が効果を示さないため、治療が困難ながんの一つである。乳がん全体の10～15%を占め、極めて予後不良である。また、本発明の医薬および医薬組成物は、従来の分子標的薬に対し抵抗性を示す難治性のがん（例えば、DLD1細胞株が由来するがんなど）に対しても有効な抗腫瘍効果を示す。従って、本発明の医薬および医薬組成物は、難治性のがん（ここで、「難治性のがん」とは化学療法及び分子標的療法により寛解を達成できないがん、または化学療法および分子標的療法に対する耐性を持つがんのことである）も治療の対象となる。
　また、本発明の医薬および医薬組成物は、がん幹細胞に対してもすぐれた殺傷効果を発揮する。がん幹細胞は、転移および転移先におけるがんの増殖に重要な役割をしていると考えられており、分裂速度が遅く多分化能を有し、抗がん剤や放射線治療などの化学療法にも抵抗性を有する悪性度の高い未分化な細胞である。そのため、がん幹細胞を効果的に殺傷させることが、がんの転移および転移先におけるがん細胞の増殖を抑える上で、重要である。従って、本発明の医薬および医薬組成物は、がん幹細胞を死滅させることで、がんの転移および転移先における増殖を抑えることが可能である。
　本発明の医薬は、有効成分であるrMV-SLAMblindおよび／またはrMV-V(-)-SLAMblindのみを投与してもよいが、一般的には、有効成分であるこれらのウイルスの他、１または２以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与することが望ましい。また、本発明の医薬組成物には、その有効成分として、rMV-SLAMblindまたはrMV-V(-)-SLAMblindの他、これら以外の腫瘍溶解性ウイルス、抗がん剤、または、補助成分（例えば、CTLA-4 blockersやPD-1 antibodiesなどの免疫チェックポイント阻害剤、及び、GM-CSFなどの免疫賦活剤など）が含まれていてもよく、医薬組成物の種類は特に限定されず、剤型としても、腫瘍溶解性ウイルスを投与する形態として適したものであれば、如何なるものであってもよく、例えば、液体製剤などとして使用することができる。
　医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、または医薬組成物の製造方法は、組成物の形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して１重量％から９０重量％の間で配合することができる。具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物が注射剤として製造される場合、その有効成分を、必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０ 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。
　本発明の医薬または医薬組成物は、腫瘍の溶解効果を発揮し得る経路であれば、如何なる投与経路であってもよく、例えば、腫瘍内投与の他、静脈内投与であってもよい。
　本発明の医薬または医薬組成物は、投与量および投与回数は特に限定されず、治療の目的、がんの種類、患者の体重や年齢、疾患の重篤度などの条件に応じて、医師の判断により適宜選択することが可能である。
　また、本発明の医薬または医薬組成物を投与する場合、様々な単位投与量を含んでいてもよい。単位投与量は、所定量の本発明の組換え麻疹ウイルスの含有量のことであり、この単位投与量を1回の注入として投与してもよく、あるいは、設定された期間にわたる連続的注入を含んでもよい。本発明の単位投与量は、すでに報告されている、腫瘍溶解性ウイルスの有効投与量（腫瘍の増大抑制効果を示す投与量）（Russellら、Mayo Clin Proceedings、89(7):926-33、2014）よりも少ない投与量により、腫瘍の増大を抑制する効果を有している。本発明の麻疹ウイルスの投与量としては、腫瘍内投与の場合、例えば、103TCDID50（50%組織培養感染量；例えば、Reed-Muench法、Reedら, Am J Hyg 1938，27:493-497）以上、104TCDID50以上、105TCDID50以上、好ましくは、106TCDID50以上である。腫瘍内発光強度の実験（実施例を参照のこと）から、107TCDID50程度で十分な腫瘍増大抑制効果が期待できる。
　さらに、本発明には、本発明の医薬または医薬組成物を患者（ヒト以外の哺乳動物を含む）等に投与して、がんの治療（腫瘍の退縮など）を行う、治療方法が含まれる。本発明のがんの治療方法には、すでに発生している腫瘍の退縮を目的とする治療、転移が予想される場合の転移したがん細胞の殺傷を目的とする治療などが含まれ、外科的手術の術前または術後の補助療法なども含まれる。
　治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコ、ウサギなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物など、如何なる動物　であってもよい。好ましくは、ヒト、イヌなどである。
　以下に実施例を示し、本発明についてさらに詳細な説明を行うが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
材料と方法
１．細胞
１－１．ヒト肺がん細胞株
　NCI-H358、NCI-H1666およびNCI-H2170は、ATCC(American Type Culture Collection) (Rockville, MD, USA)から購入した。NCI-H441/CMV-Lucは、独立行政法人医薬基盤研究所（National Institute of Biomedical Innovation）（Osaka, Japan）から購入した。細胞は、指示書に従って維持を行った。ABC-1, Calu-3, A431, PC14, NCI-H441, VMRC-LCD, RERF-LC-MS, NCI-H522, SKLU1, RERF-LC-OK, SBC-1, SBC-2, SBC-3, SBC-5, NCI-H69, N417, Lu139, and Lu134Aは、すでに開示されている方法により、維持を行った（Kikuchiら, Clinical cancer research 11:2954-2961 2005）。 具体的には、ABC-1, Calu-3, RERF-LC-MS, RERF-LC-OK, VMRC-LCD, SK-LU-1, SBC1, SBC2, SBC3およびSBC5は、10% FCS、1 mM ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸を添加したMEM（Minimum Essential Medium）中で維持した。NCI-H441, NCI-H522, PC-14, NCI-H69, N417, Lu134AおよびLu139は、10% FCSを添加したRPMI 1640 中で維持した。
１－２．ヒト大腸がん細胞株
　CaCo-2, DLD1, HCT116, HT29, LoVo, LS174, RKO, SW48, SW480およびSW948は、ATCC(American Type Culture Collection) (Rockville, MD, USA)から購入した。DLD1, HT29および SW48細胞は、10% FCSを添加したRPMI 1640 中で維持した。その他の細胞は、10% FCSを添加したDMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium) (Life Technologies)中で維持した。
１－３．ヒト乳がん細胞株
　トリプルネガティブ乳がん細胞である、HCC1599, HCC1187, HCC70, MDA-MB-468, HCC38, HCC1143, HCC1937, BT-20, HCC1806, DU4475およびBT549Cは、ATCCから購入した。BT-20は10％FCSを添加したEMEM中で、それ以外の細胞は10％FCSを添加したRPMI中で維持した。
　MCF7ヒト乳がん細胞（東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センター；The Cell Resource Center for the Biomedical Research Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University, Miyagi, Japan）は、従前の方法により維持を行った（Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013）。
１－４．ヒト膵臓がん細胞株
　Capan-2は、ATCCより入手した（ATCC, HTB-80）。KLM1およびPK1は、東京大学医科学研究所臨床ゲノム腫瘍学分野の古川洋一博士より分与を受けた。
１－５．イヌ乳がん細胞株
　CF33は日本大学生物資源科学部獣医学科、 CTBp, CTBm, CHMpおよびCHMmは東京大学農学生命科学研究科から分与された。CF33は、10％FCSを添加したDMEM、CTBp, CTBmおよびCHMmCは10％FCSを添加したRPMI中で維持した。
２．ウイルス
　EGFP遺伝子を保持するrMV-SLAMblind（rMV-EGFP-SLAMblind）は、すでに報告されている方法により調製した（特開2013-216609；Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013、なお、特開2013-216609の全開示内容は参照によって本願に組み込まれる）。また、rMV-V(-)-SLAM-blindは、rMV-SLAMblindのゲノムのP遺伝子に２カ所の変異（687、690番目の塩基をそれぞれUからC、CからU）を導入して調製した。
　各ウイルスをMCF7細胞に感染させ、ウイルスが感染した細胞を培養上清と共に回収し、回収物に対し8秒間の超音波処理を3サイクル行い、ウイルスを放出させた。超音波処理後、回収物を3,000rpm(1,940 x g)で10分間、4℃で遠心を行い、ウイルスを上清に回収した。インビボでの投与用に、高力価でウイルスを得るために、ウイルス溶液を濃縮した。200mlのウイルス懸濁液を、19krpmで2時間、4℃で、遠心した。遠心後、ペレットを回収し、約1 mlの培地に最懸濁し、-70℃で保存した。ウイルスの力価は、すでに報告されているようにして（特開2013-216609；Sugiyamaら,Gene therapy 20:338-347 2013）、MCF7細胞に対する、TCID50/ml（50%組織培養感染量）として決定した。
３．細胞へのウイルス感染
３－１．肺がん細胞株への感染
　肺がん細胞株を24ウェルプレートで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi = 0.1または2で感染させた。感染後、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて、経時的に観察した。
３－２．大腸がん細胞株への感染
　大腸がん細胞株を96ウェルプレートで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi = 2で感染させた。感染3日後に、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて観察した。
３－３．乳がん細胞株への感染
　トリプルネガティブ乳がん細胞株は、24-well-plateで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi =2で、また、rMV-V(-)-EGFP-SLAMblindを、moi =2で、感染させた。感染後、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて、経時的に観察した。
　イヌの乳がん細胞株は、24-well-plateで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi =2で、感染させた。また、乳がんを発症したイヌ由来の初代培養細胞株は、24-well-plateで培養し、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi =0.1または0.01で、感染させた。感染後、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて、経時的に観察した。
３－４．膵臓がん細胞株への感染
　膵臓がん細胞株に、rMV-EGFP-SLAMblindを、moi = 1で感染させた。感染2日後に、蛍光のシグナルを、共焦点顕微鏡（(FV1000, Olympus）を用いて観察した。
４．RT-PCRおよび配列解析
　大腸がん細胞をTRIzol LS reagent (Life Technologies)で溶解させ、全RNAを指示書に従って抽出した。cDNAは、RT-PCRキット(PrimeScript; Takara)を使用して合成した。ヒトPVRL-4およびGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)に対するPCRは、AmpliTaq polymerase (Life Technologies)を用いて行った。PCRに使用したプライマーは以下の通りである。
PVRL4-specific forward primer；5’- ACATCCTCCACGTGTCCTTC-3’（配列番号８）
PVRL4-specific reverse primer；5’-CAAAGTGTCCCCATCCACTC-3’ （配列番号９）
GAPDH-specific forward primer；5’-CACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3’ （配列番号１０）
GAPDH-specific reverse primer；5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’ （配列番号１１）
　PVRL4の全コード領域を除くために、LA Taq(Takara)を用いてPCRを行った。PCRに使用したプライマーは以下の通りである。
KIT-specific forward primer；5’-GGTCAGTTCCTTATTCAAGTCTGC-3’ （配列番号１２）
KIT-specific reverse primer；5’-GCTAAAATCTCCCATGTCAACAG-3’ （配列番号１３）
　PCR産物は、TA cloning vector (pGEM-T; Promega)にクローニングし、配列決定を行った。決定した配列は、GenBankに登録されている配列（アクセッション番号；NM030916.2）と比較した。
５．フローサイトメトリー
５－１．細胞株
　細胞をPBSで洗浄した後、0.025% トリプシン、0.24 mM EDTAにより、培養プレートから剥がした。回収した細胞を遠心し、得られた細胞のペレットを、2% FCS を含むHBSS (Hank’s Balanced Salt Solution)( Life Technologies)に再懸濁した。細胞懸濁液は、抗ヒトNectin-4モノクローナル抗体(Clone 337516, R&D Systems)、抗PVRL4 mAB (Clone N4.61; Millipore)、抗ヒトSLAM抗体[A12 (7D4) BioLegend, San Diego, CA]、抗CD46抗体(M177, HyCult Biotech, Uden, Netherland)、または、マウスIgG(R & D Systems)と共に、氷上で、インキュベートした。インキュベート後、細胞を、2% FCSを含むPBSで洗浄し、抗マウスIgG-Alexa 488 (Life Technologies)と共に、氷上で、インキュベートした。その後、細胞は、2% FCSを含むPBSで洗浄した後、FACSCalibur (BD Biosciences)を使用して、蛍光強度を測定した。各種抗体で染色した細胞の蛍光強度平均値（MFI; Mean Fluorescent Intensity）を、アイソタイプを使用したコントロールの値で除し、PVRL4/ Nectin-4、SLAMおよびCD46の相対的な発現レベルとして表示した。
５－２．腫瘍細胞
　マウスから切除した大腸がん細胞由来の腫瘍は、5mM HEPES, 2% FCS, 1mg/mL コラゲナーゼ（和光純薬）および0.1% DNase I（Life Technologies）を含むHBSSで処理した。腫瘍から採取した細胞を、7AADAAD（7-amino-actinomycin D）および抗マウスH2Kd-PE-Cy7 Ab（clone SF 1-1.1; BD Biosciences）で染色し、4% パラホルムアルデヒドで固定し、BD FACS Verse analyzer (BD Biosciences)を使用して解析を行った。
６．細胞の生存率
　細胞の生存率は、WST-1細胞増殖キット（Takara）を使用して測定した。細胞毎に適したmoiでウイルスを感染させ、培養を行った。いくつかのdpi（days post first inoculation；最初の感染からの日数。以下、同じ）の時点で、WST-1細胞増殖キットに添付の指示書に従い、細胞の生存率を測定した。
７．異種移植モデル
　全ての動物実験は、東京大学実験動物委員会による承認を受けて行った。
　皮下移植の場合は、移植した腫瘍細胞が正着し、十分な大きさ（100 mm3～250 mm3、場合によっては500 mm3）に成長してから治療効果を検証するためのウイルス投与を行った。腫瘍塊が十分な大きさに成長するまでの期間は、がん細胞の種類や増殖速度によって異なる。
７－１．肺がん細胞株
　5週齢の雌のscid(severe combined immune deficiency)マウスをクレアジャパンから購入した。
　NCI-H441細胞（肺がん細胞株）を、1 x 108細胞/mlになるように、2% FCSを含むHBSSに懸濁し、等容量のマトリゲル（BD Biosciences）と混合した。100μlの細胞懸濁液(5 x 107細胞)を、scidマウスに皮下注射した（5 x 107細胞/1マウス）。移植後、腫瘍塊が400～500mm3に成長した時点で、ウイルス投与を開始した。0日、10日、19日の計3回、106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindをマウスに腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。JMP software (JMP Pro 10.0.2, SAS Institute Inc., Cary, NC) を使用して、ウィルコクソンログランク検定（Wilcoxon-log-rank test）により腫瘍体積を解析した。また、腫瘍塊が小さい時点（150?200mm3）で同ウイルスを１回腫瘍内投与する実験も行った。
　静脈内投与した肺がん細胞が肺において増殖するかどうか、および、静脈内投与したrMV-EGFP-SLAMblindが腫瘍に蓄積するかどうかを検討するために、NCI-H441/CMV-Luc細胞 (1 x 105 cells in 100μl)をマウスの静脈内に投与した。その後、200μlのD-ルシフェリン(10 mg/ml, Gold Biotechnology, Inc.)を皮下投与した。腫瘍の増殖をモニターするために、Xenogen IVIS Imaging System 100 (Xenogen/Caliper Life Sciences) を用いて、ルミネッセンスを測定した。イメージングパラメーターは、露光を1分間、ビニングを8とし、15 cmの視野で行った。肺がん細胞の移植後、腫瘍塊が十分な大きさになった時点で、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindを100μl、マウスに静脈内投与した。さらに、最初のrMV-EGFP-SLAMblind の投与から、14日、 41日、および48日の時点においても、rMV-EGFP-SLAMblindを250μl、マウスに静脈内投与した。その後、マウスを安楽死させ、蛍光顕微鏡を用いて、肺を観察した。
７－２．大腸がん細胞株
　5 x 106細胞数のDLD1細胞またはHT29細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスの脇腹に皮下注射した。その後、腫瘍の変化を観察し、2または3日毎に大きさを測定した。移植後、腫瘍塊腫瘍塊が150mm3に達した時点で、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindを、週毎に3回腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
７－３．乳がん細胞株
　トリプルネガティブ乳がん細胞株については、5 x 106細胞数のHCC70細胞またはMB-468細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスに皮下注射した。その後、腫瘍の変化を観察し、2または3日毎に大きさを測定した。トリプルネガティブ乳がん細胞の移植後、腫瘍塊が十分な大きさになった時点から、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP-SLAMblindを、週毎に3回腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
　ヒト乳がん細胞MCF7をマウスに移植し、増殖した乳がん腫瘍細胞に対し、静脈内投与したrMV-EGFP-SLAMblindの腫瘍退縮効果を調べた。この場合、1.5 x 106細胞数のMCF7細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスに皮下注射した。MCF7細胞の移植後、腫瘍塊が十分な大きさになった時点で、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindをマウスに静脈内投与した。さらに、最初の投与後4日の時点においても、rMV-EGFP-SLAMblindの投与を行った。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
７－４．イヌ乳がん細胞
　5 x 106細胞数のCF33細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、6週齢の雌のscidマウスに皮下注射した。その後、腫瘍の変化を観察し、腫瘍塊が十分な大きさになった時点において、106 TCID50の rMV-EGFP-SLAMblindを腫瘍内投与した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
７－５．膵臓がん細胞
　1 x 106細胞数のKLM1細胞を50%濃度のマトリゲル（BD Biosciences）に懸濁し、C.B-17/Icr-scidマウスの右側腹部皮下へ移植した。移植後19日目に2群（7匹ずつ）に分け、rMV-EGFP-SLAMblindを1 x 106で腫瘍内に接種した。接種後8日、14日および37日後に、1回目と同様にウイルスの接種を行った。接種後2～3日おきに腫瘍の体積を測定した。腫瘍の体積は、（幅×幅×長さ）／２により算出した。
〔実施例１〕ヒト肺がんに対する効果
PVRL4陽性肺がん細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性
　14種の非小細胞肺がんおよび8種の小細胞肺がんを含む肺がん細胞株におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べた。PVRL4は、8種の非小細胞肺がん細胞株（ABC1, NCI-H441, NCI-H2170, NCI-H358, Calu-3, PC14, A431およびNCI-H1666）と、1種の小細胞肺がん細胞株（SBC-2）において、発現していた（図１および２）。
　また、麻疹ウイルスレセプターとして機能する他の分子がこれらの細胞株において発現しているかどうかを検討するために、CD46およびSLAMの発現レベルを調べた。CD46は、全ての細胞株において発現していたが、SLAMは発現していなかった（図１）。moi = 0.1 または 2で、rMV-EGFP-SLAMblindを感染させると、PVRL4を発現している全ての細胞は、いずれのmoiによる感染においても蛍光を発し、合胞体を形成した（図３）。
インビトロにおけるrMV-SLAMblindの肺がん細胞の殺傷効果
　rMV-SLAMblindの感染により、PVRL4発現肺がん細胞株が死滅するかどうかを調べるため、8種の非小細胞肺がん細胞株（ABC1, NCI-H441, NCI-H2170, Callu-3, NCI-H358, PC14, A431, and NCI-H1666）の生存率について、rMV-EGFP-SLAMblindの感染後検討を行った。ABC1, NCI-H441, NCI-H2170, NCI-H358, Calu-3およびNCI-H1666の生存率は、7 dpiの時点で、40%以下にまで低下した（図４）。ABC1, NCI-H441, H2170, H358およびCalu-3は、比較的多くPVRL4を発現しており（図１）、これら5種の細胞株は、全て、rMV-SLAMblindの感染により死滅した。NCI-H1666, PC14およびA431におけるPVRL4の発現量は低かった。そして、7 dpiまでに、PC14およびA431は、rMV-SLAMblindの感染後、明白な生存率の低下は認められなかったが、NCI-H1666の生存率は低下した。rMV-EGFP-SLAMblindによる殺傷効果は、PVRL4の発現レベルと相関していた。
インビボにおけるrMV-SLAMblindの肺がん由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
　次に、rMV-SLAMblindのインビボにおける抗腫瘍効果について、マウスの異種移植モデルを用いて検討した。移植に用いる肺がん細胞株としてNCI-H441を選択した。NCI-H441は、PVRL4を多く発現しており、rMV-EGFP-SLAMblindの感染により生存率の低下が明らかに認められた細胞株であり、また、Scidマウスへの移植が可能であることが報告されている。移植した腫瘍が増殖し始め十分な塊になった後、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindを、3回、マウスに腫瘍内投与した。その結果、コントロールのマウスと比較して、腫瘍の増殖が顕著に抑制された（図５Ａ）。ウイルス治療をより小さな腫瘍に対して行った場合には、rMV-SLAMblindの1回の投与で腫瘍を明らかに退縮させた（図５Ｂ）。これらの結果は、rMV-SLAMblindが抗腫瘍効果をインビボにおいて発揮することを示している。
静脈内投与
　さらに、rMV-SLAMblindが肺で増殖した腫瘍をターゲットにすることができるかを調べるため、ルシフェラーゼ遺伝子を保持するNCI-H441/CMV-Lucを静脈内投与することにより、異種移植を行った。腫瘍の増殖は、Xenogen IVIS Imaging System 100を用いて、発光を測定することによりモニターした。増殖した腫瘍がはっきりと視覚化されてから、rMV-EGFP-SLAMblind を数回にわたり静脈内投与した。IVISによる解析により、移植した腫瘍細胞由来の発光と腫瘍細胞で複製したウイルス由来の蛍光が、同一エリアにおいて観察された。IVISによる蛍光観察は、解像度がそれほど高くないため、マウスを安楽死させ、蛍光顕微鏡下にて、肺の観察を行った。蛍光顕微鏡観察により、増殖した複数の腫瘍が肺に存在することが明らかとなった。腫瘍の数は、１つの肺あたり、16～36の範囲であった。そして、rMV-SLAMblind-EGFPからの蛍光シグナルは、rMV-SLAMblind-EGFPの投与に依存して、これらの腫瘍の多くに検出された（図５ＣおよびＤ）。このことは、rMV-SLAMblindは、肺の異なる部位に存在する複数の腫瘍に対し、静脈内投与により、感染することが可能であることを示している。
　後述の乳がんに対するrMV-SLAMblindの静脈内投与の結果を考慮すると、rMV-SLAMblindは、転移したがん（静脈等を経由して原発巣以外の部位に着床し増殖したがん）等に対しても、静脈内投与による、有効な治療効果を示す可能性が示唆される。
〔実施例２〕ヒト大腸がんに対する効果
PVRL4陽性大腸がん細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性。
　大腸がん細胞株におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べた。10種の大腸がん細胞株のうち、CaCo-2, DLD1, HT29, LS174, RKO, SW48, SW480およびSW948において、PVRL4の発現が認められた（図６Ａ）。他方、CD46およびSLAMの発現については、全ての細胞株において、SLAMの発現はなく、CD46は、全ての細胞株において、発現していた（図６Ａ）。
　また、PVRL4のmRNAの発現について、RT-PCRで調べたところ、PVRL4mRNAの発現は、PVRL4の細胞表面上における発現と一致していた（図６ＡおよびＢ」）。
インビトロにおけるrMV-SLAMblindの大腸がん細胞の殺傷効果
　各種細胞株に対し、rMV-EGFP-SLAMblindをmoi=2で感染させ、3dpiの時点で蛍光顕微鏡観察を行ったところ、PVRL4陽性細胞においてのみ、EGFP由来の蛍光が細胞全体に広がって観察された（図７Ａ）。次に、PVRL4に対するrMV-EGFP-SLAMblindの殺傷能力を調べるために、WSTアッセイを行った。PVRL4陽性細胞にrMV-EGFP-SLAMblindを感染させてインキュベートすると、経時的に細胞の生存率が低下した（図７Ｂ）。これに対し、PVRL4陰性細胞の生存率は、rMV-EGFP-SLAMblind存在下においても変化しなかった（図７Ｃ）。
インビボにおけるrMV-SLAMblindの大腸がん細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
　次に、DLD1細胞およびHT29細胞をマウスに移植し、増殖した腫瘍に対するrMV-EGFP-SLAMblindの効果について検討した。図８Ａに示すように、毎週、rMV-EGFP-SLAMblindを投与すると、DLD1細胞を移植して生じた腫瘍に対し、培地を投与したコントロールと比較して、およそ55％の腫瘍退縮が確認された。同様に、HT29細胞を移植した腫瘍に対しても、およそ60%の腫瘍の退縮が確認された（図８Ｂ）。最初の感染から20日後、各マウスを安楽死させ、腫瘍の重量を測定した。rMV-EGFP-SLAMblindを投与したグループの腫瘍の重量は、培地を投与したコントロールグループの腫瘍と比較すると、明らかに軽かった（図８Ｃ）。
　次に、最後のrMV-EGFP-SLAMblindの感染から1週間後において、rMV-EGFP-SLAMblindが腫瘍内に止まっているかどうか、検討を行った。フローサイトメーターを用い、7-ADDの取り込み状況に基づいて、7-AADで染色されない生細胞を選択した。そして、EGFPポジティブな細胞（rMV-EGFP-SLAMblindが止まっている細胞）の比率を調べたところ、DLD1細胞由来の腫瘍細胞では、1～6%（平均2.9%）の細胞が、また、HT29細胞由来の腫瘍細胞では、0.2%～2%（平均1.0%）の細胞が、EGFPポジティブであった（図８Ｄ）。培地で処理したrMV-EGFP-SLAMblind非投与の腫瘍細胞においては、EGFPはネガティブであった（図８Ｄ）。
　以上の結果において、rMV-SLAMblindは、大腸がん細胞由来の腫瘍に対し、良好な抗腫瘍効果を発揮することを確認できた。特に、DLD1細胞株は、従来の分子標的薬である抗EGFR抗体に対し抵抗性を示す難治性のがんに由来するものであるが、rMV-SLAMblindは、DLD1細胞株を移植した腫瘍に対しても有効な抗腫瘍効果を示しており、rMV-SLAMblindは難治性がんの治療にも有効であると考えられる。
〔実施例３〕ヒトトリプルネガティブ乳がんに対する効果
トリプルネガティブ乳がん細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性
　トリプルネガティブ乳がん細胞株におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べたところ、9種の細胞（HCC1599, HCC1187, HCC70, MDA-MB-468, HCC38, HCC1143, HCC1937, BT-20およびHCC1806）において発現していた（図９Ａ）。そこで、PVRL4を発現しているHCC38細胞に、rMV-EGFP-SLAMblindをmoi =２で感染させると、細胞は、蛍光を発して合胞体を形成した（図９Ｂ）。
インビトロにおけるrMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindのトリプルネガティブがん細胞の殺傷効果
　rMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindの感染により、PVRL4発現細胞株が死滅するかどうかを調べるため、PVRL4陽性のトリプルネガティブ乳がん細胞株であるHCC70細胞の生存率について検討した。その結果、7dpiの時点で、生存率は10～20%程度にまで低下していた（図１０Ａ）。なお、コントロールとして用いたB95a細胞（マーモセットBリンパ球芽細胞由来）に対しては、殺傷効果を示さなかった（図１０Ｂ）。
インビボにおけるrMV-SLAMblindおよびrMV-V(-)-SLAMblindのトリプルネガティブがん細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
　次に、rMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindのトリプルネガティブ乳がん細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果について、Scidマウスの異種移植モデルを用いて検討した。移植に用いるトリプルネガティブ乳がん細胞株として、HCC70細胞を選択した。移植した腫瘍が増殖し始めた後、図１１に矢印で示す時点で、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindまたはrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindを、マウスに腫瘍内投与した。その結果、rMV-EGFP-SLAMblindおよびrMV-V(-)-EGFP -SLAMblindのいずれを投与した場合においても、コントロールのマウスと比較して、腫瘍の増殖が明らかに抑制された（図１１）。
〔実施例４〕rMV-SLAMblindの静脈投与によるヒト乳がん由来の腫瘍退縮効果
　次に、乳がん（非トリプルネガティブ乳がん）由来の腫瘍に対し、静脈内投与したrMV-EGFP-SLAMblindが腫瘍退縮効果を示すかどうかについて検討を行った。移植に用いる乳がん細胞株として、MCF7を選択した。MCF7由来の腫瘍に対しては、rMV-EGFP-SLAMblindを腫瘍内投与すると腫瘍が退縮することを確認している（特開2013-216609）。移植後、腫瘍塊が約100mm3に達した時点、および最初の投与から4日目の時点で、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindを尻尾の静脈内に投与し、経時的に腫瘍の体積を測定した（図１２）。その結果、rMV-EGFP-SLAMblind非投与のコントロール群と比較して、rMV-EGFP-SLAMblind投与群においては、腫瘍の増殖が明らかに抑制された（図１２）。
　この結果から、rMV-SLAMblindは静脈内投与によっても、腫瘍増殖を著しく抑制する効果を示すことが分かった。
〔実施例５〕ヒト乳がん由来のがん幹細胞に対する効果
がん幹細胞表面におけるPVRL4の発現レベル
　がん幹細胞（cannce stem like cells;CSC）の細胞表面上におけるPVRL4の発現状況を調べるために、ヒトがん細胞株HCC1187を、CSCマーカー（CD44,、CD24およびEpCAM）に対する抗体で染色し、その後、PVRL4の発現をフローサイトメトリーで解析した。HCC1187細胞集団中のCSCの存在割合は、4.9%であった。PVRL4を発現している細胞の割合は、HCC1187細胞全体に対し99.5%、CSC細胞画分に対し99.7%であった。
　この結果から、がん幹細胞においては、非がん幹細胞と同等のレベルで、PVRL4が発現していることが分かった。
乳がん由来がん幹細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性
　本発明のrMV-SLAMblindのがん幹細胞に対する感染性を調べるために、ヒトがん細胞株HCC1187を、CSCマーカー（CD44,、CD24およびEpCAM）に対する抗体で染色した後、がん幹細胞（CSCs）と非がん幹細胞（NCSCs）にソートした。分画した細胞に対し、moi=1でを感染させ、蛍光顕微鏡で観察した（図１３Ａ）。その結果、rMV-SLAMblindは、がん幹細胞に感染することが分かった。
インビトロにおけるrMV-SLAMblindのがん幹細胞の殺傷効果
　HCC1187細胞集団からソートしたがん幹細胞に、rMV-EGFP -SLAMblindをmoi=1で感染させ、1dpi、3dpi、5dpiおよび7dpiの時点で細胞の生存率を調べた。rMV-SLAMblindが感染したがん幹細胞の生存率は、非がん幹細胞と同様に減少した（図１３Ｂ）。
　以上の結果から、rMV-SLAMblindは、がん幹細胞にも感染することが可能であり、効果的に殺傷する能力を有することが明らかとなった。
〔実施例６〕イヌの乳がんに対する効果
イヌの乳がん細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性
　本発明のrMV-SLAMblindの野生型は、ヒトを自然宿主として感染するウイルスであることから、他の動物に対する感染性は低く、麻疹ウイルスを実験感染させてもイヌは全く発症しない。一方イヌにおいても近年乳がん症例が増加し、ヒトと同様に有効なイヌの乳がん治療法の開発が求められている。そこで、イヌの乳がん細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性について検討を行った。
　9種のイヌの乳がん細胞株におけるPVRL4の発現レベルをフローサイトメトリーで調べたところ、4種の細胞（CF33, CTBp, CTBmおよびCHMm）において発現していた（図１４Ａ）。なお、CHMpとCHMmは同一のイヌに由来する細胞で、CHMpは原発がん由来でCHMmは転移がん由来である。この２つの細胞のPVRL4の発現量を比較すると、原発がん由来のCHMpには発現がなく、転移がん由来のCHMmにおいて発現が確認された（図１４Ａ）。
　CF33, CTBp, CTBmおよびCHMmに対し、 moi =2で、rMV-EGFP-SLAMblindを感染させると、これらPVRL4を発現している細胞は、蛍光を発し、合胞体を形成した（図１４Ｂ）。
　さらに、乳がんを発症しているイヌから採取した乳がん細胞（初代培養細胞株）2例についても、PVRL4の発現について調べたところ、2例ともPVRL4を発現しており、moi =0.1で、rMV-EGFP-SLAMblindが感染し、合胞体を形成した（図１４Ｃ）。
　次に、原発がん由来の乳がん細胞株と転移がん由来の乳がん細胞株におけるPVRL4の発現レベルを比較するために、CHMp細胞（原発がん由来）とCHMm細胞（転移がん由来）におけるPVRL4の発現量をフローサイトメトリーで調べた。上述の通り、転移がん由来のCHMmではPVRL4の発現が確認できたが、原発がん由来のCHMpではPVRL4の発現は確認できなかった（図１５Ａ）。そして、CHMp細胞とCHMm細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性についても検討したところ、原発がん由来のCHMp細胞に対する感染は全く見られなかったのに対し、転移がん由来のCHMm細胞に対しては良く感染してウイルスが増殖し、ウイルスによって殺傷されることによる細胞変性（融合巨細胞）が引き起こされていた（図１５Ｂ）。
　以上のことから、PVRL4は、原発がんより転移がんにおいてより多く発現しており、転移がん細胞に対するrMV-SLAMblindの感染がより顕著に誘導されると考えられる。
インビトロにおけるrMV-SLAMblindのイヌ乳がん細胞の殺傷効果
　rMV-EGFP-SLAMblindの感染により、PVRL4陽性のイヌ乳がん細胞が死滅するかどうかを調べるため、4種のPVRL4陽性のイヌ乳がん細胞株（CF33, CTBp, CTBmおよびCHMm）の生存率について検討した。その結果、7dpiの時点で、CTBm の生存率は80%程度であったが、CF33, CTBmおよびCHMmの生存率は40%程度にまで低下していた。従って、rMV-EGFP-SLAMblindはイヌの乳がん細胞に対しても有効な殺傷効果を示すことが分かった（図１６）。特に、原発がん由来のCHMpについては、rMV-SLAMblindの感染が確認できず、殺傷効果がほとんど見られないのに対し、転移がん由来のCHMmについては、良好な殺傷効果を示した（図１６）。
インビボにおけるrMV-SLAMblindのイヌ乳がん細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
　次に、rMV-SLAMblindのイヌ乳がん細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果について、Scidマウスの異種移植モデルを用いて検討した。移植に用いるイヌ乳がん細胞株として、CF33を選択した。移植後、腫瘍塊が十分な大きさに達した時点を0dpiとし、0dpiおよび8dpiの時点で、1 x 106 TCID50のrMV-EGFP-SLAMblindを、腫瘍内投与した。その結果、rMV-EGFP-SLAMblindを投与した場合、コントロールと比較して、腫瘍の増殖が明らかに抑制された（図１７Ａ）。
　また、最初の感染から５０日後、マウスを安楽死させ、腫瘍の重量を測定した。rMV-EGFP-SLAMblindを投与したグループの腫瘍の重量は、培地を投与したコントロールグループの腫瘍と比較すると、明らかに軽かった（図１７Ｂ）。
〔実施例７〕ヒト膵臓がんに対する効果
ヒト膵臓がん細胞表面におけるPVRL4の発現レベル
　ヒト由来の膵臓がん細胞株であるKLM1、PK1およびCapan-2について、PVRL4の発現をフローサイトメトリーによってPVRL4の発現を解析したところ、これら3種類全ての細胞において、PVRL4の発現が確認できた（図１８Ａ）。また、これら3種類の細胞ついてSLAMおよびCD46の発現を調べたところ、いずれの細胞においてもSLAMの発現は認められなかったが、CD46は全ての細胞においてその発現が確認された（図１８Ｂ）。なお、CoBL細胞は、SLAMおよびCD46のいずれも発現しており、陽性対照として、結果を示した（図１８Ｂ）。
　なお、KLM1細胞株とPK1細胞株は、同一の患者に由来する細胞株であるが、KLM1はPK1細胞をマウスに異種移植し、転移したがん部位から採取したものである。KLM1細胞は、PK1細胞と比較して転移能および造腫瘍性の高いがん細胞株であり、PVRL4の発現量は、KLM1細胞の方が多いことが分かった（図１８Ａ）。
ヒト膵臓がん細胞に対するrMV-SLAMblindの感染性および殺傷効果
　KLM1、PK1およびCapan-2の各細胞株に対し、rMV-EGFP -SLAMblindをmoi=1で感染させた。その結果、感染２日後に、いずれの細胞においてもウイルスの感染が認められた（図１９Ａ）。
　さらに、KLM1細胞、PK1細胞およびCapan-2細胞に対し、rMV-EGFP -SLAMblindをmoi=1で感染させた後の生存率を解析した。その結果、いずれの細胞株においても、生存率の低下が認められた（図１９Ｂの白丸）。すなわち、rMV-SLAMblindは、膵臓がん細胞に対しても、良好な殺傷効果を発揮することが分かった。
　ここで、図１９Ｂを参照すると、KLM1細胞はPK1細胞よりも生存率の低下が著しかった。膵臓がん患者の臨床サンプルを用いた解析では、PVRL4は４cm 以上の大きな腫瘍に強く発現することが報告されていることから（Izumiら, Surg Today, 2015 Apr, 45(4): 487-94.）、rMV-SLAMblind療法は、転移がんなどの悪性度の高い膵臓がんに対しての治療効果を発揮しうると期待できる。
インビボにおけるrMV-SLAMblindのヒト膵臓がん細胞由来の腫瘍に対する抗腫瘍効果
　ヒト膵臓がん細胞由来の腫瘍に対する、rMV-SLAMblindの抗腫瘍効果について、Scidマウスの異種移植モデルを用いて検討した。移植に用いるヒト膵臓がん細胞株として、転移能の高いKLM1細胞を選択した。
　1×106のKLM1細胞をC.B-17/Icr-scid mouseの右側腹部皮下へ移植した。移植後19日目に2群（7匹ずつ）に分け、rMV-SLAMblind-EGFPを1×106で腫瘍内に接種した。対照群は同じ量のHBSS培地を接種した。接種後8日、14日、および37日後に再度1回目の接種と同様にウイルス接種を行った。接種後2～3日おきに腫瘍サイズを測定した（図２０Ａ）。その結果、rMV-EGFP-SLAMblindを投与した場合、培地を接種したコントロールと比較して、腫瘍の増殖が明らかに抑制されていた（図２０Ａ）。
　初回ウイルス接種から70日目に培地接種群（mock）を安楽死させ、腫瘍を摘出して重量を測定した。rMV-SLAMblind接種群（dSLAM）については、1回目のウイルス接種後84日目（最後の接種から47日目）に安楽死させ、腫瘍重量を測定した（図２０Ｂ）。rMV-SLAMblind接種群において、培地接種群の腫瘍サイズと比較し腫瘍のサイズに有意差が認められたことから、異種移植モデルにおいてrMV-SLAMblindがKLM1細胞の増殖を抑制することが示された。
　また、rMV-SLAMblind投与マウスから摘出した腫瘍の凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡で観察した結果、ウイルスにコードされたEGFP由来の蛍光が観察された（図２０Ｃ）。そして、rMV-SLAMblindを投与したマウスの腫瘍塊から、接種後47日目にウイルス分離を試みた結果、ウイルスが分離された。rMV-SLAMblindのH遺伝子に導入した変異部位をダイレクトシークエンスにより解析したところ、SLAMblindを導く変異は保存されていた。
　本発明は、腫瘍溶解性組換え麻疹ウイルスを含む医薬または医薬組成物を提供するものであり、特に、治療が困難ながんや転移したがん細胞を有効に退縮させることができる。従って、がんの治療分野において極めて有用な技術である。

Claims (7)

  1. rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを含む、がんを治療するための医薬組成物。
  2. 　がん幹細胞を殺傷することを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 　前記がんが、難治性のがんであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 　前記がんが、転移がんである、請求項１乃至３のいずれかに記載の医薬組成物。
  5. 　前記がんが、トリプルネガティブ乳がん、膵臓がん、肺がんまたは大腸がんである、請求項１乃至４のいずれかに記載の医薬組成物。
  6. 　前記rMV-SLAM-blindまたはrMV-V(-)-SLAM-blindを静脈投与することにより用いられることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載の医薬組成物。
  7. 　治療対象がイヌであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の医薬組成物。
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