WO2015130081A1 - Stat3 저해활성을 갖는 토목향 헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
Stat3 저해활성을 갖는 토목향 헥산 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer containing water or a compound isolated therefrom as an active ingredient
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating breast cancer, which comprises a civil fenium helenium nucleic acid fraction having STAT3 inhibitory activity or a compound isolated therefrom as an active ingredient.
- breast cancer is one of the most common cancers of women in western countries. According to 2008 statistics, breast cancer is the second most common after thyroid cancer, accounting for 14.7% of all cancers in women. According to the Ministry of Health and Welfare, the incidence of breast cancer patients in Korea continues to increase, and as westernization progresses, it is expected to increase further due to lifestyle, fertility and lactation, and regular breast examination.
- Tumors are a group of abnormal cells in which biomagnetic cells continue to differentiate and proliferate, and tumor-related cachexia is the most important cause of poor quality of life in patients with malignant tumors, resulting in various chronic complications.
- Currently used tumor therapeutics have the problem of showing toxicity at the same time not only tumor cells but also normal cells.
- breast cancers are mainly hormone-positive breast cancers, which are treated by surgical methods or by pharmacotherapy such as tamoxi fen.
- breast cancer is frequently resistant to chemotherapy and easily evolves from hormone-dependent to hormone-independent and metastatic. Therefore, more than half of breast cancer patients metastasize cancer to other organs, which makes hormonal receptor treatment very difficult.
- triple negative breast cancer that does not express the estrogen receptor, the progesterone receptor, and HER2, there is no specific treatment until now, and thus treatment is mainly performed by bar specific chemotherapy.
- triple negative breast cancer is characterized by the continuous expression of activated STAT3, which is directly involved in tumor formation, invasion and metastasis, and makes it resistant to cancer cell death. Therefore, the search for a target substance targeting STAT3 has recently emerged as a promising chemotherapy strategy.
- STATs Signaling Transducers and Act ivators of Transc ipt ion proteins act as signaling proteins in the cytoplasm, signaling from the cell membrane into the nucleus 7 types of STATs are reported: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B, and STAT.
- STAT3 is essentially activated in most cancers and plays an important role in the development and differentiation of cancer.
- the activation of STAT3 is observed in many malignant tumor patients, and the continuously activated STAT3 is frequently observed in cancers with metastatic potential.
- STAT3 is directly involved in tumorigenesis, invasion and metastasis and makes it resistant to cancer cell death. Therefore, the search for a substance targeting STAT3 has recently emerged as a promising chemotherapy strategy.
- STAT3 is activated by phosphorylation. It has a tyrosine 705 residue (Tyros ine 705) and a serine 727 residue (Ser ine 727) at the C-terminal. STAT3 is an important mediator of cytokines and growth factors and is primarily activated by tumor proteins such as IL-6, epidermal growth factor and Src or Ras. When a growth factor such as a cytokine or epidermal growth factor such as IL-6 binds to the corresponding receptor, JAK kinase induces tyrosine phosphorylation in the receptor, and this phosphorylated tyrosine helps STAT bind to the receptor. give.
- STAT3 forms one dimer by the interaction of two STAT3s with the SH2 domain. After migration into the nucleus, the STAT3 dimer acts as a transcription factor, directly binding to the promoter gene of the target gene, which is important for cell growth and survival, and regulates the transcription of the lower target genes.
- Cyc l in D1 undergoes cell growth and division, and Bc l-2, a gene that inhibits apoptosis, is regulated.
- STAT3 regulates the expression of various genes associated with cancer proliferation.
- the breast cancer market is an area with high barometric medical needs.
- TNBC Tri-Negative Breast Cancer
- the perennial herb Inul ae Radix Inul ae Radix L.
- Its stem is straight and dense hairs are short, and its height is 80 cm to 2 m.
- the vagina is hard and not easily bent. Bent side Slightly flat, yellowish white to pale yellowish yellow, with slightly sunken oil.
- the cork layer consists of 5 to 8 rows of cork cells. The quadrilateral is broad, the formation layer is annular and indistinct.
- the neck is arranged in a single row of conduits, comparatively irregular. Loss is scattered in the head and neck.
- the flow cells in the dead quarter and the repair cells in the neck contain relatively large amounts of inulin. Civil scent has a peculiar aroma and tastes bitter.
- the root of the cedar is used as a medicine for phlegm, earth and sand, abdominal pain, vomiting, bronchitis, pertussis, pancreatitis, tuberculosis, nursing hari, stomach cramps, and malaria. do. However, there have been no reports about civil cancer breast cancer activity.
- the present inventors have made efforts to develop a natural product-derived breast cancer prevention and treatment, as a result of the extract or fraction of civil engineering (InuJa he 1 en him) or a compound isolated therefrom STAT3 to the breast cancer cells and mice transplanted with breast cancer cells
- a natural product-derived breast cancer prevention and treatment as a result of the extract or fraction of civil engineering (InuJa he 1 en him) or a compound isolated therefrom STAT3 to the breast cancer cells and mice transplanted with breast cancer cells
- Selectively inhibits tyrosine phosphorylation activity of the STAT3 target gene downregulates expression of the STAT3 target gene, inhibits cancer metastasis, and decreases tumor weight and tumor volume.
- the compounds minified therefrom have completed the present invention by confirming that the compounds can be effectively used as an effective ingredient of the pharmaceutical composition for preventing and treating breast cancer.
- An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer, which contains a civil fragrance (// ⁇ / a helenium) fraction as an active ingredient.
- Still another object of the present invention is an allantolactone represented by Formula 1 (Al antol actone, C 15 H 2 o0 2 ) or isoalantolactone represented by Formula 2 (Isoal antol actone, C 15 H 20 0 2 )
- Formula 1 Al antol actone, C 15 H 2 o0 2
- isoalantolactone represented by Formula 2 Isoal antol actone, C 15 H 20 0 2
- Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of breast cancer, which contains a civil fragrance fraction as an active ingredient.
- Still another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant containing allantolactone or isoalantolactone as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer. It is another object of the present invention to provide a use of a civil fragrance fraction for use as a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis.
- Still another object of the present invention is to provide the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis.
- Another object of the present invention is to provide a use of civil engineering fraction for use as a dietary supplement for the prevention and improvement of breast cancer.
- Still another object of the present invention is to provide the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a dietary supplement for inhibiting breast cancer metastasis. It is another object of the present invention to provide the use of a civil fragrance fraction for use as an anticancer adjuvant.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer containing the civil component (Inula helenium) fraction as an active ingredient.
- the present invention containing a Alan torak tone (Alantolactone, Ci 5 H 20 0 2) or iso Alan torak tone (Isoalantolactone, Ci 5 H 20 0 2) represented by the formula (2) the active ingredient represented by the following general formula (1) It provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer: "
- the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis, which contains a civil fragrance fraction as an active ingredient.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting metastasis of breast cancer containing allantolactone or isoalantolactone as an active ingredient.
- the present invention provides a health functional food for breast cancer prevention and improvement containing civil fraction fraction as an active ingredient.
- the present invention provides a dietary supplement for preventing and improving breast cancer containing allantolactone or isoalantolactone as an active ingredient.
- the present invention provides a health functional food for inhibiting metastasis of breast cancer, which contains a civil fragrance dust as an active ingredient.
- the present invention provides a health functional food for inhibiting breast cancer metastasis containing allantolactone or isoalantolactone as an active ingredient.
- the present invention also provides an anticancer adjuvant containing a civil fragrance fraction as an active ingredient.
- the present invention also provides an anticancer adjuvant containing allantolactone or isoalantolactone as an active ingredient.
- the present invention also provides a method for treating breast cancer comprising administering a pharmaceutically effective amount of a civil fraction to a subject having cancer.
- the present invention also provides a method for treating breast cancer, comprising administering a pharmaceutically effective amount of allantolactone or isoalantoractin to a subject with cancer.
- the present invention also provides a method for inhibiting breast cancer metastasis, comprising administering to a subject with cancer a pharmaceutically effective amount of a civil fraction.
- the present invention also provides a method for inhibiting breast cancer metastasis, comprising administering a pharmaceutically effective amount of allantolactone or isoalantolactone to a subject with cancer.
- the present invention provides the use of civil engineering fractions for use as pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of breast cancer.
- the present invention also provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer.
- the present invention also provides the use of civil engineering fractions for use as pharmaceutical compositions for inhibiting breast cancer metastasis.
- the present invention provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis.
- the present invention discloses the use of civil engineering fractions for use as a dietary supplement for the prevention and improvement of breast cancer.
- the present invention also provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a dietary supplement for the prevention and improvement of breast cancer.
- the present invention also provides the use of civil engineering fractions for use as a dietary supplement for inhibiting breast cancer metastasis. '
- the present invention provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a dietary supplement for breast cancer metastasis.
- the present invention also provides the use of a civil fragrance fraction for use as an anticancer adjuvant.
- the present invention provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as an anticancer adjuvant.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating breast cancer, which comprises a civil fenium helenium fraction or a compound isolated therefrom, wherein the fraction is tyrosine phosphorylation of STAT3 in breast cancer cells and mice transplanted with breast cancer cells.
- a pharmaceutical composition for preventing and treating breast cancer a composition for inhibiting breast cancer metastasis, a health functional food for preventing and improving breast cancer, a health functional food for breast cancer metastatic drug, or an anticancer adjuvant may be usefully used.
- FIG. 1 is a diagram confirming that allantolactone and isoalantolactone contained in civil engineering (//? £ / helenium) nucleic acid fractions are actually ' allantolactone and isoalantolactone ' using HPLC.
- FIG. 2 is a diagram confirming that allantolactone and isoalantolactone contained in civil engineering methanol extracts are actually using allantolactone and isoalantolactone using HPLC.
- Figure 3 is a diagram showing the HPLC standard foam of allantolactone and isoalantolactone.
- Figure 4 is a diagram showing the cell growth inhibitory effect of civil extract methanol extract on MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 5 shows a comparison of cell growth inhibitory effects of civil nucleic acid fractions, methylene chloride fractions, ethyl acetate fractions and butanol fractions on MDA—MB-231 human breast cancer cells.
- Figure 6 is a diagram showing the cell growth inhibitory effect of civil engineering nucleic acid fractions on MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 7 is a diagram showing a comparison of cell growth inhibitory effects by allantolactone and isoalantorakron on MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 8 is a diagram confirming the inhibitory effect of STAT3 tyrosine phosphorylation and protein expression when treated with allantolac ⁇ and isoalantolactone in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 9 is a diagram showing the effect of cell growth inhibitory effect by allantolactone, STAT3 target gene protein expression and phosphorylation effect in MDA-MB-231 human breast cancer cells, MCF-7 human breast cancer cells and MCF-10A normal breast cells.
- FIG. 10 is a diagram confirming the inhibitory effect of STAT3 tyrosine phosphorylation and Cycl in Dl protein expression when the civilized nucleic acid fractions were treated in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- Figure 11 is a diagram confirming the inhibitory effect of STAT3 tyrosine phosphorylation and Cycl in Dl protein expression when treated with civil extract methane to MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 12 shows the effect of inhibiting dimer formation by inhibiting phosphorylation of STAT3 tyrosine residues and blocking migration of STAT3 into the nucleus when MDA-MB-231 human breast cancer cells were treated with allantolactone isolated from a civil fragrance fraction. It is confirmed figure.
- Figure 13 is a diagram showing the effect of blocking the DNA binding of STAT3 transcription factor in the nucleus of the cells when treated with the allantolactone MDA-MB-231 human breast cancer cells isolated from the civil fraction fraction.
- FIG. 15 shows that phosphorylation of Ser ine residue, a phosphate functional group of STAT3, was not inhibited when MDA-MB-231 human breast cancer cells were treated with allantolactone isolated from a civil fragrance fraction.
- FIG. 16 shows STAT3 (Tyr 705) and STAT3 (ser 727) by treating lantolactone isolated from the civil fragrance fraction in MDA-MB-231 human breast cancer cells and treating S31-201 substance which effectively inhibits STAT3 activity as a control. ) Is a diagram comparing activity inhibition.
- 17 and 18 are diagrams showing the effect of inhibiting EGF and IL-6 stimulatory activity by treatment with allantolactone isolated from the civil fragrance fraction in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- 19 and 20 are diagrams showing the effect of specific STAT3 phosphorylation block by treatment with allantolactone isolated from civil engineering fraction in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- Fig. 21 shows cells by co-administration of allantolactone and doxorubicin, an anticancer agent. It is a figure which confirmed the growth inhibitory effect, the STAT3 target gene protein expression, and phosphorylation inhibitory effect.
- FIG. 22 is a diagram showing the effect of blocking specific STAT3 phosphorylation by treatment with civilized nucleic acid fraction in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- Figure 23 is a diagram showing the DNA fragmentation and its pathway by civil engineering nucleic acid fraction treatment in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 24 is a sesquiterpenlactone-based component allantolactone, isoalantolacto, igal an and degusi alactone, aloantholactone (al loantol actone) included in a civil engineering nucleic acid fraction;
- FIG. ) Is a diagram showing the presence, structure and inhibition of STAT3 activity of the complex.
- FIG. 25 is a diagram showing the effect of inhibiting STAT3 activity by treating A549 human lung cancer cells, AGS gastric cancer cells, and human pancreatic cancer cells with allantolactone isolated from civil engineering fractions.
- FIG. 26 shows that A549 human lung cancer cells, AGS gastric cancer cells, and human pancreatic cancer cells are treated with allantolactone isolated from civil engineering fractions to effectively block DNA binding of STAT3 transcription factors in the nuclei of these cells.
- FIG. 27 shows that the cell child rate decreases in a concentration-dependent manner when treated with allantolactone isolated from civil engineering fractions in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 28 shows that cell adhesion rate decreases in a concentration-dependent manner when treated with allantolactone isolated from civil engineering fractions in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 29 shows that cell infiltration decreases in a concentration-dependent manner when treated with allantolactone isolated from civil engineering fractions in MDA-VII-231 human breast cancer cells.
- FIG. 30 is a diagram showing that the concentration of cells in the formation of the growth of the cells when treated with the allantolactone isolated from the civil fragrance fraction in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- FIG. 31 is a diagram showing that the degradation activity of ⁇ P-9 is inhibited when treated with the allantolactone isolated from the civil fragrance fraction in MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- 33 is a diagram showing the effect of inhibiting breast cancer tumor by treating allantolactone isolated from civil engineering fraction in vivo);
- a) is a diagram showing the tumor volume reduction effect of the treatment of allantolactone isolated from the civil fraction fraction in BALB / c immunodeficient mice transplanted with breast cancer cells;
- b) shows the tumor weight reduction effect of the treatment of allantolactone isolated from the civil fraction fraction in BALB / c immunodeficient mice transplanted with breast cancer cells
- c) is a diagram showing the body weight of mice treated with allantolactone isolated from the civil-fraction fraction in BALB / c immunodeficient mice transplanted with breast cancer cells.
- 34 is a diagram showing the effect of reducing the expression of Cycl in D1 and p-STAT3 in mouse tissues by treatment with allantolactone isolated from the civil fraction fraction in BALB / c immune deficient mice transplanted breast cancer cells.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer, which contains civil engineering helenium fraction as an active ingredient.
- the present invention also provides a pharmaceutical treatment of breast cancer, including the step of administering to the 'object takes the effective amount of the aroma fractions in the civil arm method.
- the present invention also provides the use of a civil engineering fraction for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer.
- the fraction is a nucleic acid fraction, methylene chloride, ethyl acetate fraction obtained by sequentially fractionating from a civil extract of hexane, methylene chloride, ethyl acetate, butanol or water It is preferred that butane is a fraction or water fraction, and more preferably extracted with nucleic acid, but is not limited thereto.
- the extract is preferably extracted with water, d to C 2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, but not limited thereto.
- the lower alcohol is preferably ethanol or charcoal, more preferably methanol, but is not limited thereto.
- the extraction method is preferably cold extraction, heat extraction, ultrasonic extraction or reflux extraction, but is not limited thereto.
- the decompression concentration is preferably used as a residual air decompression concentrator or vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
- the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but not always limited thereto.
- the civil-fraction fractions have STAT3 inhibitory activity / more preferably have cancer inhibitory activity overexpressed STAT3.
- the STAT3 overexpressed cancer is preferably breast cancer, more preferably triple negative breast cancer, but is not limited thereto.
- the civil fragrance has STAT3 tyrosine (Tyr 705) and STAT3 serine (Ser 727) inhibitory activity.
- the civil fractions have EGF and IL-6 stimulatory inhibitory activity.
- the civil engineering fractions preferably have STAT3 phosphorylation inhibitory activity and degradation inhibitory activity of MMP-9.
- the civil engineering fraction is preferably c-Myc, COX-2, Cycl in Dl, VEGF and CXCR4 gene expression inhibitory activity.
- the inventors prepared a civil extract, and fractions were prepared from the extract.
- the present inventors extracted allantolatone and isoalantolactone from the civil engineering nucleic acid fraction (see FIG. 1).
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were treated with different concentrations of civil engineering methanol extract in order to confirm the cell growth inhibition of civil extract methanol extract, it was confirmed that the growth of the cells is reduced (Fig. 4 Reference) .
- the civil engineering sequential fractions were treated in MDA-MB-231 human breast cancer cells at different concentrations, It was confirmed that the growth of the cells was reduced, and effectively killed in the cells treated with the civilized nucleic acid fraction (see FIG. 5).
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were treated with different concentrations of the civil engineering nucleic acid fractions, and it was confirmed that the growth of the cells decreased. The higher the treatment concentration of (8 ug / ml) was confirmed that MDA-MB-231 human breast cancer cells are effectively killed (see Fig. 6).
- MDA-MB-231 human breast cancer cells MCF-7 human breast cancer cells
- MCF-10A normal breasts to compare the effects of allantolactone on cell growth and STAT3 target gene protein expression and phosphorylation in various cells.
- allantolactone did not affect cell growth in MCF-10A, which is normal breast cells, but allantolactone in MDA-MB-231 and MCF-7, human breast cancer cells.
- the growth of these cells Decrease in human breast cancer cells.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells treated with civil engineering nucleic acid fraction were subjected to concentration-dependent STAT3 tyrosine phosphorylation, ERK phosphorylation, and It was confirmed that Cycl in protein expression is inhibited (see FIG. 10).
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were treated with civil methanol extracts. It was confirmed that STAT3 tyrosine phosphorylation, ERK phosphorylation and Cycl in D x protein expression were effectively inhibited in the treated cells (see FIG. 11).
- MDA-MB-231 human breast cancer cells confirmed that the inhibition of STAT3 (Tyr 705) and STAT3 (ser 727) activity by the allantoic rock isolated from the civil fraction fraction, MDA-MB- treated with the allantolactone It was confirmed that STAT3 (Tyr 705) expression in 231 human breast cancer cells was inhibited at all times of 3, 6, 12, and 24 hours, and further suppressed expression in the early time period (see FIG. 14).
- MDA MB-231 human breast cancer cells confirmed the inhibition of EGF and IL-6 stimulatory activity by allantolactone isolated from the civil fraction fraction. It was confirmed that STAT3 phosphorylation activity peaked 20 minutes after interleukin (IL-6) stimulation or 10 minutes after epidermal growth factor (EGF) stimulation, and when the fractions were derived and treated with allantolactone, It was confirmed that the activity of STAT3 by the source was completely blocked (see FIGS. 17 and 18).
- IL-6 interleukin
- EGF epidermal growth factor
- MDA-MB-231 confirmed human growth inhibitory effect and STAT3 phosphorylation inhibitory effect by the combination administration of allantolactone and anticancer doxorubicin in human breast cancer cells, when allantolactone and doxorubicin combined treatment, allantolactone Or it was confirmed that significantly inhibit the cell growth than doxorubicin alone treatment, it was confirmed that the overexpression of STAT3 when treated with doxorubicin in combination with allantolactone (see Fig. 21).
- DNA fragmentation increased in a concentration-dependent manner in the cells treated with the nucleic acid fractions, thereby increasing apoptosis.
- the apoptosis induced by the civil engineering nucleic acid fractions increased the caspase 8 representing the extr ins ic pathway and the procaspase 9 representing the intr insi c pathway.
- Confirmation of the caspase 3 and c leaved PARP1 substeps confirms via both pathways (see FIG. 23).
- MMP-9 one of the STAT3 target genes, is a representative enzyme that decomposes extracellular matrix proteins, and it has been confirmed that inhibition of -9 P-9 activity by treatment of allantolactone derived from civil engineering fractions to MDA-MB-231 human breast cancer cells As a result, when treated with MDA-MB-231 cells derived from allanto lactone-derived allantolactone, it was confirmed that the degradation activity of MMP-9 in the cells (see Fig. 31).
- STAT3 activity also includes cell proliferation, survival, angiogenesis, cell cycle progression, and cell death.
- the civil fragrance (/ / a ze / e? / TM) fraction ⁇ or a compound isolated therefrom of the present invention significantly exhibits a selective inhibitory effect on tyrosine phosphorylation activity of STAT3, and lowers the expression of STAT3 target genes.
- the civil engineering fractions or fractions separated from fish can be usefully used in pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of breast cancer.
- the present invention contains an allantolactone (Alantolactone, Ci 5 H 2 o0 2 ) represented by the formula (1) or isoalantolactone (Isoalantolactone, Ci 5 H 20 0 2 ) represented by the formula ( 2 ) as an active ingredient
- an allantolactone (Alantolactone, Ci 5 H 2 o0 2 ) represented by the formula (1) or isoalantolactone (Isoalantolactone, Ci 5 H 20 0 2 ) represented by the formula ( 2 )
- pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of breast cancer are provided:
- the present invention also provides a method for treating breast cancer comprising administering a pharmaceutically effective amount of allantolactone or isoalantolactone to a subject with cancer.
- the present invention also provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of breast cancer.
- the allantolactone or isoalantoractone is preferably separated from the civil fragrance fraction, but is not limited thereto.
- the allantolactone or isoalantolactone is preferably characterized by inhibition of STAT3 activity, but is not limited thereto.
- the breast cancer is preferably STAT3 overexpressing breast cancer, more preferably triple negative breast cancer.
- Alantolactone isolated from the civil-fraction fraction of the present invention significantly inhibits the tyrosine phosphorylation activity of STAT3, down-regulates the expression of STAT3 target genes, inhibits cancer metastasis, tumor weight And by showing a tumor volume reduction effect, allantolactone isolated from the civil engineering fraction may be useful in pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of breast cancer.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis, which contains a civil fragrance fraction as an active ingredient.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis containing allantolactone or isoalantolactone as an active ingredient.
- the present invention also provides a method for inhibiting breast cancer metastasis, comprising administering a pharmaceutically effective amount of a civil fragrance fraction to a subject having cancer.
- the present invention inhibits breast cancer metastasis, comprising administering a pharmaceutically effective amount of allantolactone or isoalantolactone to a subject with cancer Provide a method.
- the present invention also provides the use of a civil engineering fraction for use as a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis.
- the present invention provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a pharmaceutical composition for inhibiting breast cancer metastasis.
- the breast cancer is preferably STAT3 overexpressing breast cancer, more preferably triple negative breast cancer.
- Civil engineering fraction of the present invention significantly inhibits the tyrosine phosphorylation activity of STAT3, downregulates the expression of STAT3 target gene, inhibits metastasis of cancer, decreases tumor weight and tumor volume.
- the civil engineering fraction or a compound isolated therefrom can be usefully used in the composition for inhibiting breast cancer metastasis.
- the composition containing the civil fraction fraction of the present invention or a compound isolated therefrom may contain one or more active ingredients which exhibit the same or similar functions in addition to the above components.
- composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive may include starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate. Lactose, Manni, Peel, Arabian Rubber, Pregelatinized Starch, Corn Starch, Powdered Cellulose, Hydroxypropyl Salose, Opadry, Sodium Starch Glycolate, Carnauba Lead, Synthetic Aluminum Silicate, Stearic Acid, Magnesium Stearate Aluminum stearate, calcium stearate, sucrose, textose, sorbitol and talc may be used.
- the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included 0.1 to 90 parts by weight based on the composition, but is not limited to ' me.
- composition of the present invention can be administered in various oral and parenteral dosage forms in actual clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc., which are commonly used It can be prepared using.
- Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient such as starch, calcium carbonate (Calcium Calcium) or a compound separated therefrom. carbonate), sucrose, lactose or gelatin.
- lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
- Oral liquid preparations include suspending agents, solution solutions, emulsions and syrups, and may include various types of crabs, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. have.
- Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
- the non-aqueous solvent and the suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as eurib oil, and injectable esters such as ethyl acrylate may be used.
- the suppository base includes witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, Glycerogeratin and the like can be used.
- composition of the present invention can be administered orally or parenterally according to the desired method, the external or intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection or intramuscular injection in parenteral administration It is preferable to select. Dosage varies according to the patient's weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate and severity of disease.
- composition according to the invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
- pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, the effective dose level is the type of disease, severity, drug activity of the patient And sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent drug use, and other factors well known in the medical arts.
- the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or isochronously with conventional therapeutic agents, and may be administered in single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
- the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally O per kg of body weight.
- l mg to 100 mg, preferably 0.5 mg to lO mg may be administered daily or every other day or divided into 1 to 3 times daily.
- the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
- the present invention provides a health functional food for breast cancer prevention and improvement containing the civil fraction fraction as an active ingredient.
- the present invention provides a gangganggeun functional foods for the prevention and improvement of breast cancer containing allantolatone or isoalantolactone as an active ingredient.
- the present invention provides a use of civil engineering fraction for use as a dietary supplement for the prevention and improvement of breast cancer.
- the present invention also provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a dietary supplement for the prevention and improvement of breast cancer.
- the breast cancer is preferably triple negative breast cancer, but is not limited thereto.
- the present invention provides a health functional food for inhibiting metastasis of breast cancer containing the civil fraction fraction as an active ingredient.
- the present invention provides a health functional food for inhibiting metastasis of breast cancer containing as an allantolactone or isoalantolactoneol active ingredient.
- the present invention provides a use of civil engineering fractions for use as a dietary supplement for inhibiting breast cancer metastasis.
- the present invention also provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as a dietary supplement for inhibiting breast cancer metastasis.
- the breast cancer is preferably triple negative breast cancer, but is not limited thereto.
- Allantolactone isolated from the civil engineering fractions or fractions thereof of the present invention significantly inhibits the tyrosine phosphorylation activity of STAT3, and down-regulates the expression of STAT3 target genes, and inhibits cancer metastasis.
- allantolactone isolated from the civil engineering fraction or fractions thereof may be usefully used in the health functional food for preventing and improving breast cancer or the health functional food for inhibiting breast cancer metastasis.
- the civil-fraction fraction of the present invention or a compound isolated from the fraction thereof to be used for the prevention and improvement of such breast cancer or the inhibition of breast cancer metastasis it may be prepared by various methods known in the food science or pharmaceutical field and itself. Or in any food form that can be ingested orally in combination with a food acceptable carrier, excipient, diluent, and the like.
- a food acceptable carrier Preferably in the form of beverages, pills, granules, tablets or capsules.
- the dietary supplement of the present invention may further include ingredients that are conventionally added in the manufacture of food and are food acceptable.
- ingredients that are conventionally added in the manufacture of food and are food acceptable.
- one or more components may be further included in citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, apple acid, fruit juice, and the like, in addition to the compound isolated from the civil-flavored powder or fractions thereof of the present invention.
- the amount that can be included as an active ingredient of the health functional food according to the present invention may be appropriately selected according to the age, sex, weight, condition, symptoms of the disease of the person who wants to prevent and improve breast cancer or inhibit breast cancer metastasis, preferably It is recommended to include 0.01 g to 10.0 g per day of adult standards, and by ingesting the functional foods having such a content, breast cancer prevention and improvement, or breast cancer metastasis suppression effect can be obtained.
- the present invention also provides an anticancer adjuvant containing a civil fragrance fraction as an active ingredient.
- the present invention also provides an anticancer adjuvant containing allantolactone or isoalantolactone as an active ingredient.
- the present invention also provides the use of a civil fragrance fraction for use as an anticancer adjuvant.
- the present invention also provides the use of allantolactone or isoalantolactone for use as an anticancer adjuvant.
- the fraction is preferably a nucleic acid fraction, methylene chloride, ethyl acetate fraction, butanol fraction or water fraction obtained by sequentially fractionating nucleic acid, methylene chloride, ethyl acetate, butanol or water from the civil extract, more preferably extracted with nucleic acid. Or not limited thereto.
- the extract is preferably extracted with water, to C 2 lower alcohol or a mixture thereof as a solvent, but not limited thereto.
- the lower alcohol is preferably ethanol or methane, more preferably methane, but is not limited thereto.
- As the extraction method it is preferable to use steam extraction, heat extraction, ultrasonic extraction or reflux cooling extraction, but not always limited thereto.
- the vacuum condenser is not limited thereto.
- the drying is preferably dried under reduced pressure, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but not always limited thereto.
- the civil fragrance fraction, or allantolactone or isoalantoractone is preferably treated in combination with an anticancer agent, but is not limited thereto.
- the anticancer agents include cisplatin, camptothecin, fluorouracil, paclitaxel, docetaxel, imaUnib, imaUnib, gef itinib, bevacizumab bevacizumab, vinblastine, vinblastine, vkicr ist ine, herceptin, doxorubicin and etoposide, preferably cisplatin, doxorubicin and etoposide. It is more preferably selected from the group consisting of, doxorubicin is most preferred, but is not limited thereto.
- Example 2 Preparation of Inula heleniwn Extract Nucleic Acid Soluble Fraction 100 g of the civil extract of methanol extract obtained in Example 1 was suspended by adding 1 L of water, followed by adding an equal amount of 100% nucleic acid. The combined and extracted three times extracts were filtered through filter paper and then dried in vacuo to yield 25 g of nucleic acid fractions.
- Example 3 Identification of Allantolactone and Isoalantolactone from Civilian Flavor heleniu Nucleic Acid Fractions HPLC was used to confirm the presence of allantolactone and isoalantolacto in the civil engineering nucleic acid fractions.
- nucleic acid fractions prepared in the same manner as in ⁇ Example 2> were separated from allantolactone and isoalantolactone using silica gel column chromatography (Bi ol Pharm Bul l 25 (10) 1370-1372, 2002),
- HPLC HPLC was used to determine the presence of allantolactone and isoalantolacto in the civil extract methanol extract.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were purchased from the Bank of Korea Cell Line, which cells were treated with DMEM medium containing antibiotics of 10% FBS, lOOug / ml penicillin and streptomycin at 37 ° C, 5% C0. Incubated in 2 incubators. Then, the MDA-MB-231 human breast cancer cells were dispensed in 96-well plates by 1 X 10 4 , and then cultured in a 37 ° C, 5% C0 2 incubator for 24 hours to culture the cells. After attaching to the civil engineering methane prepared in ⁇ Example 5> extract 0, 20 Treated at 40, 60, 80, 100 ug / ml concentrations and incubated for 6 hours and 24 hours. After that, remove the culture medium
- MTT (3- (4,5-dimethyl thiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazol ium bromide) reagent was added at 0.5 mg / ml per well and cultured at 37 ° C for 2 hours, and then the medium was removed. DMS0 100 ul was treated to dissolve formazan on the bottom of the well. It was then shaken for an additional 10 minutes and absorbance was measured with a microplate reader at 540 nm wavelength. The inhibition rate (%) of each sample was calculated based on the absorbance of the group treated with civil engineering fractions based on 100% activity. In addition, all experimental results were statistically calculated to calculate mean and standard deviation, and AN0VA analysis and student's-test were used for statistical analysis of multiple comparisons of data. When the value was 0.05 or less, it was judged to be statistically significant.
- nucleic acid fraction layer was filtered through filter paper and then dried in vacuo to yield 25 g of nucleic acid fraction.
- 1 L of methylene chloride was mixed with the separated suspension, and the lower methylene chloride was taken and repeated three times.
- the methylene chloride fraction layer was filtered through filter paper and then dried in vacuo to give 5 g of methylene chloride fraction.
- the mixture of 1 L of ethyl acetate and the suspension was combined to separate the lower suspension, and the upper ethyl acetate was taken. This was repeated three times.
- the ethyl acetate fraction layer was filtered through filter paper and dried in vacuo to give 2 g of ethyl acetate fraction.
- Butane was mixed with 1 L of the suspension to separate the lower suspension, and the upper butane was taken. This was repeated three times.
- the butanes were filtered through a filter paper, and then dried in vacuo to yield 11 g of butanol fractions.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were cultured in the same manner as in ⁇ Example 1>. Subsequently, the MDA-MB-231 human breast cancer cells were dispensed in 96-well plates by 1 ⁇ 10 4 , and then cultured in a 37 ° C., 5% C0 2 incubator for 24 hours to culture the cells. After attaching to the methylene chloride fraction, ethyl acetate fraction, butane fractions and the civilized nucleic acid fractions prepared in Example 2 at a concentration of 0, 10, 25, 50, 100 ug / ml and 6 hours and Incubated for 24 hours.
- ⁇ was performed in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>, and the absorbance was measured by a microplate reader. Inhibition rate (%) of each sample was calculated based on the absorbance of the group treated with the civil engineering sequential fraction based on 100% activity.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were purchased from the Bank of Korea Cell Line, and the cells were treated with DMEM medium containing antibiotics of 10% FBS, 100ug / ral penicillin, and straptomycin at 37 ° C, 5 Cultured in a% CO 2 incubator. Then, the MDA-MB-231 human breast cancer cells were dispensed in 96-well plates by 1 X 10 4 , and then cultured in a 37 ° C., 5% C0 2 incubator for 24 hours. After attaching, the civilized nucleic acid fractions prepared in Example 2 were treated with 0.5, 1 2, 4, 6, 8, 10 ug / ml and incubated for 6 hours and 24 hours. Then, remove the culture medium and MTT
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>. Then, MDA-MB-231 human breast cancer cells were dispensed in 96-well plates by 1 ⁇ 10 4 , and then cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 24 hours to attach the cells to the culture plate. After that, allantolactone and isoalantolactone were treated at concentrations of 0, 5, 10, and 15 uM and incubated for 6 hours and 24 hours. Thereafter, MTT was performed in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>, and the absorbance was measured with a microfolate reader at a wavelength of 540 nm. The inhibition rate (%) of each sample was calculated based on the absorbance of the group treated with allantolactone and isoalantolactone based on 100% activity.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells Alan torak tone and iso Alan torak tone when each were treated with different concentrations, Alan torak tons treated MDA-MB-231 human breast cancer It was confirmed that the cells were effectively killed (FIG. 7).
- the whole protein isolation was then performed in lysis buffer (20 mM HEPES [pH 7.6], 350 mM NaC 1, 20% glycerol, 0.5 mM EDTA, Ol mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM).
- Cell lysates were obtained using DTT, 0.1 mM PMSF, and a protease inhibitor cocktail, and then 20-30 ug of protein was used for 8 hours at 100 V using 8% SDS-PAGE gel. Electrophoresis and the separated protein were electrically transferred to nitrocell membranes. The membrane was blocked with 5% skim milk and then incubated at room temperature for 1 hour.
- the primary antibody P-STAT3 Tyrosine 705 (product number: ab76315, Abeam), p-STAT3 Serine 727 (product number: ab32143, Abeam), STAT3 product number: ab32500, Abeam), Cyclin (model number: ab40754, Abeam) was reacted with 1/1000 and reacted with the membrane overnight at 4 ° C.
- Membrane was washed three times for 10 minutes with TBST, then diluted HRP-binding anti-rabbit (product number: sc_2004, Santacruz) at a rate of 1: 1000 with a secondary antibody, incubated for 1 hour in a real cell, and then for 10 minutes with TBST.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells, MCF-7 human breast cancer cells and MCF-10A normal breast cells were cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>. Then, the cell growth inhibitory effect was applied to each of the MDA-MB-231 human breast cancer cells, MGF-7 human breast cancer cells and MCF-10A normal breast cells in 96-well plate (1 x 10 4 ) , Incubated for 24 hours at 37 ° C, 5% C0 2 incubator to attach the cells to the culture plate, after treatment with allantolactone and incubated for 4 hours, MTT in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> The absorbance was measured with a microplate reader at 540 nm wavelength.
- STAT3 target gene protein expression and phosphorylation inhibitory effect is the primary antibody p to the MDA-MB-231 human breast cancer cells, MCF-7 human breast cancer cells and MCF-10A normal breast cells in the same manner as in ⁇ Experimental Example 5> -STAT3 Tyrosine 705 (product number: ab76315, Abeam) and STAT3 (product number: ab32500, Abeam) were used to confirm the protein expression level and as a control to compare the expression level, anti- ⁇ _ actin (act in ) (Product No .: sc-47778, Santacruz) was used as the primary antibody to perform the same method as above to confirm the expression of ⁇ -actin.
- the isolated protein was then electrically transferred to nitrocells to the membrane.
- the membrane was blocked with 53 ⁇ 4 skim milk and incubated at room temperature for 1 hour. After blocking, primary antibody P-STAT3 Tyrosine 705 (product number: ab76315, Abeam), p-STAT3 Serine 727 (product number: ab32143, Abeam), STAT3 (product number: ab32500, Abeam), Cyclin product number: ab40754 ⁇ Abeam) was diluted to 1/1000 and reacted overnight at 4 ° C with membrane.
- Membrane was washed three times with TBST for 10 minutes, and then reacted with HRP-binding anti-rabbit (product number: sc-2004, Santacruz) at a rate of 1: 1000 with a secondary antibody and incubated at room temperature for 1 hour, followed by TBST. It was generated by treating the chemiluminescent substrate reagent by washing three times for 10 minutes. Luminescence generated by using LAS-1000 (fuzzy film) was detected to confirm the degree of protein expression. As a control for comparing the degree of expression, the expression of ⁇ -actin was performed by the same method as described above using anti- ⁇ -actin (product number: sc-47778, Santacruz) as the primary antibody. Confirmed.
- the allantolactone separated from the civil engineering nucleic acid fraction prepared by the method described in ⁇ Example 4.4> 0 , 5, 10, 15 uM treatment was incubated for 4 hours, or allantolactone was treated with 15 uM concentration was incubated for 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 hours.
- lysis buffer (20mMHEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20% glycerol, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, O Cell lysates were obtained using .lmMPMSF, and a protease inhibitor cocktai 1.
- cell nuclear proteins were performed according to sequential methods—first cytoplasmic lysis buffer (10mMHEPES [pH7.9]).
- Protein concentration was calculated using adford reagent (Bio-rad)
- the protein of the cell was isolated in the same manner as in ⁇ Experimental Example 2>, Western blot was performed to perform p-STAT3 (Tyr705) and STAT
- anti- ⁇ -actin Product No .: sc-47778, Santacruz
- the allantolactone separated from the civil engineering nucleic acid fraction prepared by the method described in ⁇ Example 4> 0, 5, 10, 15 uM concentration was incubated for 4 hours, or allantolactone was treated with 15 uM concentration was incubated for 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 hours.
- the nuclear protein isolated from the cell in the same manner as in Experimental Example ⁇ 9-1> was P—end-l abeled double-stranded STAT3 consensus ol igonuc leot ide (Santa Cruz) having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> were treated with allantolactone isolated from the civil-flavored nucleic acid fractions prepared in ⁇ Example 4> to STAT3 (Tyr 705). ) And STAT3 (ser 727) activities were performed as follows.
- the primary antibody p-STAT3 Tyrosine 705 (product number: ab76315, Abeam), p-STAT3 Ser ine 727 (product number: ab32143, Abeam), STAT3 (product number: ab32500, Abeam), Cyc l in Ed (product number: ab40754, Abeam) was diluted to 1/1000 and reacted overnight at 1 ° C with the membrane. The membrane was washed three times with TBST for 10 minutes, and then HRP-binding anti-rabbi t (product number: sc-2004, Santacruz) as a secondary antibody at a ratio of 1: 1000.
- ⁇ -actin was performed by the same method as the above method using anti- ⁇ ⁇ -actin (product number: sc-47778, Santacruz) as a primary antibody. It was confirmed.
- the allantolactone separated from the civil engineering nucleic acid fraction prepared by the method described in ⁇ Example 4> at a concentration of 15 uM Treated and commercialized STAT3 inhibitor S31-201 was treated with 10, 20, 50 and 100 uM and incubated for 6 hours. Then, the cell proteins were separated in the same manner as in Experimental Example ⁇ 9-1>, and then nitrocells were electrically transferred to the rose membrane, and the membranes were blocked with 5% skim milk, followed by incubation at room temperature for 1 hour.
- HRP-binding anti-rabbi t (product number: sc-2004, Santacruz) was diluted to a ratio of 1: 1000 with a secondary antibody, incubated for 1 hour at room temperature, and then TBST It was generated by treating the chemiluminescence substrate reagent by washing three times for 10 minutes. The luminescence generated using LAS-1000 (fuge film) was detected to confirm the expression level of the protein well. As a control for comparing the degree of expression, the expression of ⁇ -actin was carried out by the same method as described above using anti- ⁇ -actin (product number: sc-47778, Santacruz) as the primary antibody. It was confirmed.
- MDA-MB-231 cells, 10 ng / ml interleukin (IL-6), and 100 ng / ml epidermal growth in the medium containing no serum (serum) in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> Factor (EGF) was treated.
- MDA-MB-231 cells cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>, 10 ng / ml interleukin (IL-6) and 100 ng / ml epidermal growth factor (EGF) 0, 5, 10, 20, 30, 50 minutes were treated, and the civilized nucleic acid debris prepared by the method described in ⁇ Example 4> was treated at 15 uM concentration and incubated for 6 hours.
- the cell proteins were separated in the same manner as in Experimental Example ⁇ 9-1>, and then nitrocells were electrically transferred to the rose membrane, and the membranes were blocked with 5% skim milk, followed by incubation at room temperature for 1 hour. After blocking, the primary antibodies P-STAT3 Tyrosine 705 (product number: ab76315, Abeam) and STAT3 (product number: ab32500, Abeam) were diluted to 1/1000 and reacted overnight at 4 ° C with the membrane.
- Membrane was washed three times with TBST for 10 minutes, and then HRP-binding secondary antibody anti -rabbi t (product number: sc-2004, Santacruz)!-1: diluted at a rate of 1000, incubated for 1 hour at room temperature, and then TBST It was generated by treating the chemiluminescent substrate reagent by washing three times for 10 minutes. The luminescence generated by using LAS-1000 (fuge film) was detected to confirm the degree of protein expression. As a prairie group for comparing the degree of expression, the same method as described above using anti- ⁇ -actin (product number: sc-47778, Santacruz) as the primary antibody was performed. Expression was confirmed.
- HRP-binding secondary antibody anti-rabbi t (Product No .: sc-2004, Santacruz) was distilled at a ratio of 1: 1000, and incubated for 1 hour in a real cell. It was generated by treating the chemiluminescent substrate reagent by washing three times for a minute. The luminescence produced using the LAS 1000 (fuge film) was detected to confirm the degree of protein expression. As a control for comparing the degree of expression, the expression of ⁇ -actin was performed by the same method as described above using anti- ⁇ -actin (product number: sc-47778, Santacruz) as the primary antibody. It was confirmed.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>. Then, the cell growth inhibitory effect was measured by dispensing the MDA-MB-231 human breast cancer cells in 96-well plate with lx lO 4 at 37 ° C, 5% C0 2 incubator for 24 hours. After attaching the cells to the culture plate, treated with allantolactone (15 uM) and doxorubicin (0, 1 and 2 uM) and incubated for 4 hours, MTT was performed in the same manner as in ⁇ Experiment 6> The absorbance was measured by a microplate reader at a wavelength of 540 nm. Inhibition rate (%) of each sample was calculated based on the absorbance of the allantolactone treated group based on 100% activity. In addition, STAT3 target gene protein expression and phosphorylation inhibitory effect is
- DNA was extracted with 25: 24: l (v / v / v) neutral phenol: chloroform: isoamyl alcohol reagent, ammonium acetate and 100% ethanol DNA was precipitated using.
- EtBr ethidium bromide
- path identification was confirmed using caspase 8 representing an extrinsic pathway and procaspase 9 representing an intrinsic pathway, caspase 3 and cleaved PARP1, the substeps of the two pathways.
- the civil engineering nucleic acid fractions prepared by the method described in ⁇ Example 4> were 0, 2, 4, 6, 8 ug / ml concentration. Treated and incubated for 24 hours.
- the cell protein was isolated in the same manner as in Experimental Example ⁇ 9-1>, and then the primary antibody PARP-K product number: sc-7150, Santacruz) in the same manner as in Example ⁇ 9-6>, procaspase 3 (product number: sc-7148, Santacruz), active caspase 3 (product number: ab32042, Abeam), procaspase 9 (product number: sc-7885, Santacruz), procaspase 8 (product number: sc-7890, Santacruz) , protein expression level was determined using active caspase 8 (product number: ab32397, Abeam).
- the nucleic acid fractions prepared in the same manner as in ⁇ Example 2> was confirmed by HPLC to confirm the presence and structure of the compound, and the effect of inhibiting STAT3 activity was cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1>.
- Protein using one of the primary antibodies P-STAT3 Tyrosine 705 (product number: ab76315, Abeam) and STAT3 (product number: ab32500, Abeam) in the same manner as in ⁇ Experimental Example 5> to one MDA-MB-231 human breast cancer cells The degree of expression was confirmed, and as a control for comparing the degree of expression, the same method as described above was performed using anti- ⁇ -actin (product number: sc-47778, Santacruz) as the primary antibody. The expression of ⁇ -actin was confirmed.
- A549 human lung cancer cells were purchased from ATCC, Panc-1 human pancreatic cancer cells were obtained from Korea Cell Line Bank, AGS gastric cancer cells were purchased from Korea Cell Line Bank, A549 human lung cancer cells were 10% FBS, 100ug / ml penicillin and strap RPMI 1640 containing antibiotics of tomycin was used, and Panc-1 human pancreatic cancer cells were treated at 37 ° C, 5% using DMEM medium containing antibiotics of 10% FBS, lOOug / ml penicillinline and streptomycin. Cultured in a C0 2 incubator.
- the different cells were dispensed with lx iO 4 in 96-well plates and incubated in a 37 ° C., 5% C0 2 incubator for 24 hours to attach the cells to the culture plate.
- Alantolactone isolated from the civil engineering nucleic acid fractions prepared in Example 4 was treated at a concentration of 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 ug / ml and incubated for 6 hours and 24 hours.
- Civil engineering nucleic acid fraction prepared by the method described in ⁇ Example 3> from all proteins and nuclear proteins of A549 human lung cancer cells, Panc-1 human pancreatic cancer cells and AGS gastric cancer cells cultured in the same manner as in Experimental Example ⁇ 11_1>. The following method was performed to confirm the inhibition of STAT3 activity by treating allantolatron isolated from the.
- Cell lysates were obtained using mMEDTA, O.lmMEGTA, l% NP-40, 50 mM NaF, O.lmMDTT, O.lmMPMSF, and a protease inhibitor cocktail.
- Cell nucleus proteins were also performed according to sequential methods. First, the cells were treated with cytosolic lysis buffer (10 mM HEPES [H 7.9], 10 mM KC1, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM mM, 1 mM PMSF, and a protease inhibitor cocktail).
- cytosolic lysis buffer (10 mM HEPES [H 7.9], 10 mM KC1, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM mM, 1 mM PMSF, and a protease inhibitor cocktail).
- the cell membranes were exploded and centrifuged to remove the cytosol.
- the remaining nuclear protein was nuclear lysis buffer (20mMHEPES [pH 7.9], 400 mM NaCl, 1 mMEDTA, ImMEGTA, ImMDTT, ImMPMSF, and protease inhibitors (protease).
- Intracellular nuclear lysates were obtained using an inhibitor cocktail)
- the total protein or nuclear protein was calculated using the Bradford reagent (Bk) -rad) and the concentration of the protein was calculated in the same manner as in ⁇ Experimental Example 2>.
- Proteins of the cells were separated, and Western blot was performed to confirm the expression levels of p-STAT3 (Tyr705) and STAT proteins, and as a control for comparing the expression levels, anti- ⁇ -actin (product) Number: sc-47778, Santacruz The expression of ⁇ -actin was confirmed by the same method as described above using the primary antibody.
- the nuclear protein isolated from the cell in the same manner as in Experimental Example ⁇ 9-2> was a P-end-labeled double-stranded STAT3 consensus oligonucleotide Santa Cruz having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) and 37 ° C. Incubated for 30 minutes at. To confirm competitive response, 100-fold concentrations of oligonucleotide or STAT3 antibody were added 10 minutes before incubation. After incubation for 30 minutes, bound DNA and nuclear protein were electrophoresed at 100 V for 2 hours using 6% native PAGE. The gel was dried using a gel dryer,
- Radiolabeled bands were detected using BAS-1500 (fugefilm).
- MDA-MB-231 human breast cancer cells cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> were dispensed into 12-well culture plates and cultured until they were filled with 80 to 9 at 37 ° C. The cells were scraped off with a 200 ⁇ tip and the wounded cells were exposed to the sample. Then, the allantolactone isolated from the civil fragrance fraction prepared by the method described in Example 4 was treated with 5, 10 and 15 uM concentration, and then incubated for 24 hours. The cultured cells were fixed with 4% paraformaldehyde and analyzed under the microscope.
- the polycarbonate membrane of the upper chamber well was coated with Matr ige Knig /, BD, USA) and dried at 37 ° C. for 30 minutes. 5, 10 and 15 uM concentrations of allantolactone isolated from the civil fragrance fractions prepared by the method described in ⁇ Example 4> to MDA-MB-231 human breast cancer cells cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> Treated for 24 hours. Then, the cells were harvested with trypsin-EDTA, washed twice with PBS and centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> were dispensed at a concentration of 500 cells per well in a 24-well culture plate and incubated for 24 hours. Then, the allantolactone separated from the delicate civil fragrance fraction by the method described in ⁇ Example 4> was treated for 24 hours at 5, 10 and 15 uM concentration, and replaced with a clean medium. The cells were grown for 10 to 14 days until they formed, and when the cells were formed, the cells were fixed, stained using crystal viol et, and observed under a microscope.
- MMP-9 one of the STAT3 target genes, is a representative enzyme that degrades extracellular matrix proteins. Allantolactone isolated from civil engineering fractions is treated with MDA-MB-231 human breast cancer cells to confirm inhibition of -9 P-9 activity. Such as to It was performed by the method.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells were diluted to 2 ⁇ 10 5 cells / well, aliquoted into 12-well culture plates, incubated for 24 hours, and then replaced with medium containing no serum. Then, the allantolactone isolated from the civil fragrance fraction prepared by the method described in ⁇ Example 4> was treated for 24 hours at 5, 10 and 15 uM concentration. The culture medium was collected, concentrated and loaded onto 8% SDS-PAGE containing 0.1% gelatin, followed by electrophoresis.
- the gel was washed twice with 2.5% Triton ⁇ -100 solution for 30 minutes, washed for 30 minutes with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) to remove SDS, and then the gel contained 10 mM CaCl 2 and 200 mM NaCl.
- Gelatin was digested by incubating at 37 ° C for 24 hours using 50 mM Tris-HCKpH 6).
- the activated gel was stained with 0.11% Coomassie Blue R-250 in 45% methanol and 10% acetic acid followed by destaining with 45% methane and 10% acetic acid solution. The gelatin degrading activity of each gelatinase was detected by checking the clear band against the blue background.
- STAT3 activity modulates the activity of several genes, including cell proliferation, survival, angiogenesis, cell cycle progression, and programmed cell death It is becoming. Therefore, the following method was performed to confirm the expression of the STAT3 target gene by treating the allantolactone isolated from the civil fragrance fraction to MDA-MB-231 human breast cancer cells.
- MDA—MB-231 human breast cancer cells cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> were electrophoresed by obtaining cellular proteins in the same manner as in ⁇ Example 4>, and the isolated protein was converted into nitrocells. It was electrically transferred to the osmosis membrane. The membrane was blocked with 5% skim milk and incubated at room temperature for 1 hour.
- the primary antibodies c-Myc (product number: ab, Abeam), C0X-2 (product number: sc-1745, Santacruz), Cyclin (product number: ab40754, Abeam), VEGF (product number: ab51745 , Abeam) and CXCR4 (product number: ab2074, Abeam) were diluted to 1/1000 and reacted overnight at 4 ° C. with membrane. After washing the membrane three times with TBST for 10 minutes, HRP-binding secondary antibody anti -rabbit (Product No .: sc-2004, Santacruz) was diluted at a ratio of 1: 1000 and incubated for 1 hour in a real cell.
- MDA-MB-231 human breast cancer cells cultured in the same manner as in ⁇ Experimental Example 1> were removed from the bottom of the culture plate using trypsin-EDTA solution, and then the cells were placed into DMEM at 1 ⁇ 10 7 cells / Dilute to ml concentration. Subsequently, about 200 ul of the cells were injected subcutaneously into the right flank of 6-week-old female BALB / c immunodeficient mice purchased from Nara Biotech Co., Ltd. (Nara Biotech Co., Ltd., Korea). The tumor was maintained for about one week, and then divided into 6 populations per group and divided into control and treatment groups.
- the control group was treated with PBS, treated group is the ⁇ Example 4>
- the Alan torak tones separate from the Public flavor fraction produced by the method disclosed in was "administered intraperitoneally once a it to 2.5 mg / kg and 10 mg / kg concentration .
- the weight of the mouse and the size of the arm were measured using a caliper every time.
- the allantolactone in the breast cancer tissues was treated by treating the mice with transplanted breast cancer cells by the method described in Experimental Example ⁇ 18-2> and treating allantolactone isolated from the civil fragrance prepared in the same manner as in ⁇ Example 4>.
- the tissue of a mouse transplanted with breast cancer cells was extracted by the method described in Experimental Example ⁇ 18-2> to obtain a tissue protein in the same manner as in ⁇ Experimental Example 4>, followed by electrophoresis, and the isolated protein was nitrogen.
- the cell was electrically transferred to a rose membrane. The membrane was blocked with 5% skim milk and incubated at room temperature for 1 hour.
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Abstract
본 발명은 토목향(Inula helenium) 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 유방암 세포 및 유방암 세포가 이식된 마우스에 대하여 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타내므로, 상기 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 유방암 전이 억제용 조성물, 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품, 유방암 전이 억제용 건강기능식품, 또는 항암 보조제의 유효성분에 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
【명세서】
【발명의 명칭】
S T A T 3 저해활성을 갖는 토목향 핵산 분획ᅵ물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 STAT3 저해활성을 갖는 토목향 helenium) 핵산 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물올 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
유방암은 서구 여러 나라에서 여성의 가장 흔한 암의 하나로, 2008년 통계에 따르면 우리나라의 유방암은 갑상선암에 이어 두 번째로 많으며 전체 여성암의 14.7%를 차지한다. 보건복지부 통계쎄 의하면, 우리나라 유방암 환자의 발생은 계속 증가 되는 추세이고, 서구화가 진행됨에 따라 생활양식, 출산율 및 수유 감소, 유방 정기검사 강화 등에 의해 더욱 증가 될 것으로 판단된다. 종양은 생체 자기 세포가 계속해서 분화, 증식을 하는 이상세포 집단이고, 종양 관련 악액질 (cancer cachexi a)은 악성 종양 환자의 삶의 질을 저하 시키는 가장 중요한 원인으로 다양한 만성 합병증을 초래한다. 현재 사용되는 종양 치료제들은 종양세포만이 아닌 정상세포에도 동시에 독성을 나타내는 문제점이 있다. 유방암의 현재 치료방법은 외과적 수술어나 방사선 치료와 같은 전통적인 방법, 그리고 에스트로겐 수용체나 HER2를 타겟팅하는 호르몬 치료 또는 표적 치료와 같은 방법이 이용되고 있다. 대부분의 유방암은 주로 호르몬 양성 유방암으로 외과적 수술 방법이나, 타목시펜 ( tamoxi fen) 과 같은 약물요법으로 치료되고 있다. 그러나, 유방암은 화학적 치료방법에 빈번하게 내성이 잘 생기며, 호르몬 의존적인 형태에서 호르몬 비와존적이며, 전이능을 가진 형태로 쉽게 진화한다. 따라서 유방암 환자의 절반 이상은 암이 다른 장기로의 전이되며, 이때는 호르몬 수용체 치료가 매우 어렵게 된다. 특히 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, HER2를 발현하지 않는 삼중음성유방암의 경우 현재까지 별다른 치료방법이 없어서 주로 바특이적 항암치료에 의해 치료가 이루어진다. 그렇지만 삼중음성유방암은 지속적으로 활성화된 STAT3가 발현되어 있는 것을 특징으로 하는데, STAT3는 종양 형성과 침윤, 전이에 직접적으로 관여하며, 암세포 사멸에도 내성을 가지게 한다. 따라서 STAT3를 타겟 물질 탐색은 유망한 항암치료 전략으로 최근에 대두되고 있다.
STATs (Signal Transducers and Act ivators of Transc ipt ion) 단백질은 세포질에서 신호전달 단백질로 작용하여, 세포막으로부터 핵 내로 신호를
전달한다ᅳ STAT1 , STAT2 , STAT3 , STAT4 , STAT5A , STAT5B , STAT 의 모두 7종류의 STAT이 보고되어 있다. 이 중에서 STAT3은 대부분의 암에서 필수적으로 활성화되고, 암의 발생과 분화에 중요한 역할을 한다. 또한 많은 악성종양 환자에서 STAT3의 활성화가 관찰되며, 전이능을 가지는 암에서도 지속적으로 활성화된 STAT3가 빈번하게 관찰된다. STAT3은 종양형성과 침윤, 전이에 직접적으로 관여하며, 암세포 사멸에도 내성을 가지게 한다. 따라서 STAT3을 타겟 물질 탐색은 유망한 항암치료 전략으로 최근에 대두되고 있다.
STAT3은 인산화가 되면서 활성화되는데, C-말단 (C-terminal )에 타이로신 705번 잔기 (Tyros ine 705)와 세린 727번 잔기 (Ser ine 727)를 가지고 있다. STAT3은 사이토카인과 성장인자의 중요한 매개체로써, 주로 IL-6 , 표피성장인자, Src 나 Ras와 같은 종양 단백에 의해 활성화된다. IL-6와 같은 사이토카인 또는 표피성장인자와 같은 성장인자가 그에 해당하는 수용체와 결합하게 되면, JAK kinase는 수용체에 있는 타이로신 인산화를 유도하게 되고, 이렇게 인산화된 타이로신은 STAT이 수용체에 결합하도록 도와준다. 타이로신 705번 잔기의 인산화에 의해서 STAT3은 두 개의 STAT3가 SH2 domain 간의 상호결합에 의해 하나의 이합체를 형성한다. STAT3 이합체는 핵 내로 이동한 후에는 전사 인자로 작용하여, 세.포 성장 및 생존에 중요한 타겟 유전자의 프로모터 유전자에 직접 결합하여, 하위 타켓 유전자들의 전사를 조절한다. 대표적으로, 세포 성장 및 분열 주기를 진행하는 Cyc l in D1 , 그리고 세포사멸을 억제하는 유전자인 Bc l-2를 조절한다. 그 밖에, STAT3 은 암의 증식과 관련된 다양한 유전자의 발현을 조절한다. 유방암 시장은 높은 미층족 의학적 수요를 가지고 있는 분야이다. 호르몬 요법, 화학 요법, 표적 치료 등 다양한 질환의 특성을 가진 환자들을 대상으로 하는 여러 기전의 치료제가 있지만, 안전하고 효과적인 만족할만한 치료제에 대한 수요가 계속 요구되고 있다. 이 중에서도 전체 유방암의 16%를 차지하는 삼중음성유방암 (Tr iple-Negative Breast Cancer , TNBC)은 치료 예후가 불량하여 치료에 어려움이 있으나, 아직 삼중음성유방암을 대상으로 한 치료제가 없어 이에 대한 수요가 높다. 한편,국화과의 다년초인 토목향 (土木香, Inul ae Radix Inul ae Radix L . )은 유럽원산의 재배식물로써 줄기는 곧고 전처에 짧은 털이 밀생하여 높이는 80 cm 내지 2 m이다. 중국에서는 운목향 (학명 : Saussurea lappa또는 Aucklandia lappa) 、 뿌리를 약재로 사용하며, 대한약전외 한약규격집에서는 이것을 목향 이라 규정하여, 토목향 (학명: Inula heleniu , 대한약전외 한약규격집에 수재)과는 구별하고 있다. 토목향 Heleni Radix)은 토목향 ( InuJa heJenium linne , 국화과 Compos i t ae)의 뿌리이다. 성상은 뿌리로 원뿔모양이고 약간 구부러졌으며 길이 10내지 30cm ,지름 1내지 3 cm이다. 바깥면은 황갈색 내지 어두운 갈색이고 세로주름 및 수염뿌리 자국이 있다. 머리 부위는 굵고 위쪽 끝에는 줄기자국이 있으며 잎이 붙어있는 경우도 있고 그 주위에는 원뿔모양의 결가지가 있다. 질은 단단하여 쉽게 꺾이지 않는다. 꺾은 면은
약간 평탄하며 황백색 내지 연한 회황색이며 약간 패여진 유실 (油室)이 있다. 이 약의 횡단면을 현미경으로 볼 때 코르크층은 5 내지 8 열의 코르크세포로 되어 있다. 사부는 넓고 형성층은 고리를 이루며 뚜렷하지 않다. 목부는 도관이 한 줄로.비교적 불규칙하게 배열하고 있다. 사부 및 목부에는 유실이 흩어져 있다. 사부의 유세포와 목부의 수선 세포에는 이눌린 덩어리가 비교적 많이 들어 있다. 토목향은 특유한 향기가 약간 있으며 맛은 쓰고 맹다. 한방 및 민간에서 목향의 뿌리를 목향 (木香) 또는 토목향 (土木香)이라 하여 가래, 토사,복통,구토,기관지염, 백일해,만성장염, 결핵성이질,수양성하리,위경련, 말라리아에 약재로 사용한다. 그러나, 아직까지 토목향의 유방암 활성에 대하여는 보고된 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 천연물 유래의 유방암 예방 및 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, 토목향 ( InuJa he 1 en him) 추출물 또는 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 세포 및 유방암 세포가 이식된 마우스에 대하여 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타녜므로, 상기 토목향 추출물 또는 분획물 또는 이로부터 분뫼된 화합물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 토목향 ( //^/a helenium) 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 체공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤 (Al antol actone , C15H2o02) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤 ( Isoal antol actone , C15H2002)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤올 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 암에 걸란 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전이 억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전이 억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하가위한 토목향 분획물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 항암 보조제로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암 보조제로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용£를 제공하는 것이다.
[기술적 해결방법]
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 토목향 (Inula helenium) 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤 (Alantolactone, Ci5H2002) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤 (Isoalantolactone, Ci5H2002)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다: '
[화학식 1]
[화학식 2]
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향 분확물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 알란토락톤 또는 이소알란토락른을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물올 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전이 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전이 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 체공한다.
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다. '
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항암 보조제로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
아울러, 본 발명은 항암 보조제로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명은 토목향 helenium) 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 분획물은 유방암 세포 및 유방암 세포가 이식된 마우스에 대하여 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타내므로, 상기 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물, 유방암 전이 억제용 조성물,유방암 예방 및 개선용 건강기능식품, 유방암 전이 약제용 건강기능식품, 또는 항암 보조제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 토목향 ( //?£/ helenium) 핵산 분획물에 포함된 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 실제' 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 맞는지 HPLC를 사용하여 확인한 도이다.
도 2는 토목향 메탄올 추출물에 포함된 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 실제 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 맞는지 HPLC를 사용하여 확인한 도이다. 도 3은 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 HPLC 표준폼을 나타낸 도이다. 도 4는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 메탄올 추출물의 세포 성장 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 MDA— MB-231인간 유방암 세포에 대한 토목향 핵산 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물의 세포 성장 억제 효과 비교를 나타낸 도이다.
도 6은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 토목향 핵산 분획물의 세포 성장 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 대한 알란토락톤 및 이소알란토락론에 의한 세포 성장 억제 효과 비교를 나타낸 도이다.
도 8은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락휸 및 이소알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 9는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에서 알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 10은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 핵산 분획물을 처리하였을 때 STAT3타이로신 인산화 및 Cyc l in Dl단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 11은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 메탄을 추출물을 처리하였을 때 STAT3타이로신 인산화 및 Cycl in Dl단백질 발현의 억제 효과를 확인한 도이다.
도 12는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하는 효과를 확인한 도이다. 도 13은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 상기 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 차단하는 효과를 확인한 도이다.
도 14는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을처리하였을 때 STAT3타이로신 인산화 발현이 3, 6, 12, 24시간의 모든 시간에서 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 15는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3의 인산 작용기인 세린 (Ser ine) 잔기의 인산화는 억제하지 못하는 것을 확인한 도이다.
도 16은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하고, STAT3 활성억제를 효과적으로 시키는 S31-201 물질을 대조군으로 처리하여 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727) 활성억제를 비교한 도이다.
도 17및 도 18은 MDA-MB-231인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리에 의한 EGF및 IL-6자극원 활성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 19및 도 20은 MDA-MB-231인간유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리에 의한 특이적 STAT3 인산화 차단의 효과를 나타낸 도이다.
도 21은 알란토락톤 및 항암제인 독소루비신의 병용 투여에 의한 세포
성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인한 도이다.
도 22는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 핵산 분획물 처리에 의한 특이적 STAT3 인산화 차단의 효과를 나타낸 도이다.
도 23은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 핵산 분획물 처리에 의한 DNA 분절화 및 이의 경로를 확인하여 나타낸 도이다.
도 24는 토목향 핵산 분획물에 포함된 세스퀴테르펜락톤 계열 성분인 알란토락톤, 이소알란토락토, 이가란 ( igal an) 및 디구시알락톤 (degusi al actone), 알로안토락톤 (al loantol actone)의 흔합물의 존재 여부, 구조 및 STAT3 활성 억제를 나타낸 도이다.
도 25는 A549인간폐암세포, AGS위암 세포 및 인간 췌장암세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을처리하여 STAT3 활성 억제의 효과를 확인한 도이다.
도 26은 A549인간폐암세포, AGS위암 세포 및 인간 췌장암세포에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 상기 세포들의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 효과적으로 차단하는 것을 확인한 도이다.
도 27은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처라하였을 때 세포 아동률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 28은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 부착률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다ᅳ
도 29는 MDA-腿 -231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포 침윤이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 30은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 세포의 균집 형성률이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인한 도이다.
도 31은 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 画 P-9의 분해 활성이 억제하는 것을 확인한 도이다.
도 32는 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 c-Myc , C0X-2 , Cyc l in Dl , VEGF 및 CXCR4 유전자 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인한 도이다.
도 33은 생체내 )에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 유방암 종양 억제의 효과를 확인한 도이다;
a)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 종양 부피 감소 효과를 확인한 도이다;
b)는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 종양 무게 감소 효과를 확인한 도이다; 및
c )는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 마우스 체중을 확인한 도이다. 도 34는 유방암세포가 이식된 BALB/c 면역 결핍 마우스에 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 마우스 조직에서 Cyc l in D1 및 p-STAT3 발현의 감소 효과를 확인한 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 토목향 helenium) 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을쎄공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물을 암에 걸린 ' 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
상기 분획물은 토목향 추출물로부터 핵산 (hexane) , 메틸렌 클로라이드 (methylene chlor i de) , 에틸 아세테이트 (ethyl acet ate) , 부탄올 (butano l ) 또는 물로 순차적으로 분획하여 얻은 핵산 분획물, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 분획물, 부탄을 분획물 또는 물 분획물인 것이 바람직하며, 핵산으로 추출한 것이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출물은 토목향을 물, d 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 흔합물을 용매로 하여 추출되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 저급 알코을은 에탄올 또는 쩨탄을인 것이 바람직하며, 메탄올이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 방법으로는 냉침 추출, 가열 추출, 초음파 추출 또는 환류 넁각 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 감압농축은 잔공 감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. - 상기 토목향 분획물은 STAT3 억제활성을 갖는 것이고 / STAT3 과발현되는 암 억제활성을 갖는 것이 더 바람직하다.
상기 STAT3 과발현되는 암은 유방암인 것이 바람직하고, 삼중음성유방암인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 토목향 분확물은 STAT3 타이로신 (Tyr 705) 및 STAT3 세린 (Ser 727) 억제활성올 갖는 것이 바람직하다.
상기 토목향 분획물은 EGF 및 IL-6 자극원 억제활성을 갖는 것이 바람직하다.
상기 토목향 분획물은 STAT3 인산화 억제활성, MMP-9의 분해 억제활성을 갖는 것이 바람직하다.
상기 토목향 분획물은 c-Myc , COX-2 , Cyc l in Dl , VEGF 및 CXCR4 유전자 발현 억제활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토목향 추출물을 제조하고, 상기 추출물로부터 분획물을 제조하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 토목향 핵산 분획물로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 추출하였다 (도 1 참조) .
또한, 토목향 핵산 분획물과 메탄을 추출물에 포함된 알란토락톤 및 이소알란토락톤의 함유량을 비교하기 위하여, 토목향 메탄올 추출물로부터 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 HPLC를 이용하여 확인한 결과, 토몰향 핵산 분획물이 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 2배 이상 함유하는 것을 확인하였으며 (도 2 참조), 상기 분획물 및 추출물로부터 검출된 알란토락톤 및 이소알란토락론을 확인하기 위하여, HPLC를 이용하여 표준품과 비교하였다 (도 3 참조) .
또한, 토목향 메탄올 추출물의 세포 성장 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포쎄 상기 토목향 메탄올 추출물을 각기 다른 농도로 처리하여, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였다 (도 4 참조) . 또한, 토목향 핵산 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물의 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 순차적 분획물을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 토목향 핵산 분획물을 처리한 상기 세포에서 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다 (도 5 참조) .
또한, 토목향 핵산 분획물의 세포 성장 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 핵산 분획물을 각기 다른 농도로 처리하여, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 분획물의 처리 농도가 높을 (8 ug/ml )수록 MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다 (도 6 참조) .
또한, 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 알란토락톤을 처리한 상기 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다 (도 7 참조) .
또한, 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위해, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 처리하였을 때 STAT3 타이로신 인산화 및 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 알란토락톤을 처리한 상기 세포의 STAT3타이로신 인산화 발현이 이소알란토락톤을 처리한 세포보다 억제되는 것을 확인하였다 (도 8 참조) .
또한, 알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 다양한 세포에서 비교하기 위해, MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF— 10A 정상 유방 세포에 알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였을 때 정상 유방 세포인 MCF-10A에서는 알란토락톤이 세포 성장에 영향을 미치지 않았으나, 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231 및 MCF-7에서는 알란토락톤이 세포의 성장을
감소시키는 것을 확인하였고 이러한 효과는 인간 유방암 세포인
MDA-鹏 -231에서 가장 뛰어나게 억제하는 것을 확인하였으며, 인간 유방암 세포인 MDA-MB— 231에서 STAT3가 가장 활성화된 상태로 존재하였고, MCF-10A, MCF-7의 순서로 나타났으며, 알란토락톤을 처리하였을 때, 모든 세포에서 STAT3의 과발현을 현저히 억제하는 것을 확인하였다 (도 9 참조) .
또한, 토목향 핵산 분획물에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과를 확인하기 위해, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 핵산 분획물올 처리하였을 때 상기 세포에서 농도 의존적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cycl in이단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 10 참조) . 또한, 토목향 핵산 분획물과 토목향 메탄올 추출물에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과를 비교하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 토목향 메탄올 추출물을 처리하여 비교한 결과, 토목향 핵산 분획물을 처리한 세포에서 효과적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cyc l in Dx단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 11 참조) .
또한, 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란특에 의한 STAT3활성 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 알란토락톤에 의한 STAT3 활성 억제를 확인한 결과, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란록을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하여 전사인자로서의 역활을 무력화시키는 것을 확인하였다 (도 12 참조) .
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 단백질에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 DNA 결합 활성 억제를 확인하기 위하여 Electophoret i c mobi l i ty shi ft assay(EMSA)을 수행한 결과,상기 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란톡을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 13 참조) .
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알락토란록에 의한 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727)활성 억제를 확인한 결과, 상기 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3(Tyr 705) 발현은 3, 6, 12, 및 24시간의 모든 시간에서 억제되는 것을 확인하였고, 초기시간대쎄서 발현이 더 억제되는 것을 확인하였다 (도 14 참조) .
또한, STAT3의 또 다른 인산 작용기인 세린 (Ser ine) 잔기의 인사화는 억제하지 못한 것을 확인하였다 (도 15 참조) .
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 알란토락톤에 의한 STAT3(Tyr
705)및 STAT3(ser 727)활성 억제 효과를 확인하기 위하여, STAT3활성 억제제로 시판되는 S31— 201을 사용하여 STAT3 활성 억제를 비교한 결과, 상용화된 STAT3 억제제인 S31-201과 토목향 분획물 유래의 알란토락토를 상기 세포에 처리하여 비교한 결과, 상기 분획물을 처리한 세포에서 STAT3(Tyr 705) 인산화 활성이 낮은 농도에서 유의적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 16 참조) .
또한, MDA— MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 EGF 및 IL-6 자극원 활성 억제를 확인한 결과, 상기
세포에서 인터루킨 ( IL-6) 자극 20분 후 또는 표피성장인자 (EGF) 자극 10분 후 STAT3 인산화 활성이 최고조로 나타나는 것을 확인하였으며, 상기 분획물 유래와알란토락톤을 처리하였을 때, 두 종류의 자극원에 의한 STAT3의 활성이 완전하게 차단되는 것을 확인하였다 (도 17 및 도 18 참조) .
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락토에 꾀한 특이적 STAT3 인산화 차단을 확인한 결과, 상기 분획물 유래의 알란토락톤을 처리한 상기 세포에서 JAKl , JAK2 또는 Src 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-1 , SHP-2 및 PTEN 등의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확안함으로써, 상기 분획물 유래의 알란토락톤은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 19 및 도 20 참조) .
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 알란토락톤 및 항암제인 독소루비신의 병용 투여에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 인산화 억제 효과를 확인한 결과, 알란토락톤 및 독소루비신을 병용 처리하였을 때, 알란토락톤 또는 독소루비신 단독 처리하였을 때보다 세포 성장을 현저히 억제하는 것을 확인하였고, 독소루비신을 처리하였을 때 과발현되는 STAT3을 알란토락톤과 병용 처리시 억제하는 것을 확인하였다 (도 21 참조) .
또한, MDA-MB-231인간유방암 세포에서 토목향 핵산 분획물에 의한 AK1 , JAK2의 인산화 및 SHPᅳ 1, SHP-2 경로에 영향을 확인한 결과, 상기 핵산 분획물을 처리한 상기 세포에서 JAK1 및 JAK2 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-1 및 SHP-2의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확인함으로써, 상기 핵산 분획물은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 22 참조) .
또한, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 핵산 분획물에 의한 DNA 분절화 및 이의 경로에 영향을 미치는지 확인한 결과, 상기 핵산 분획물을 처리한 상기 세포에서 DNA 분절화가 농도 의존적으로 증가함으로써 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였고, 토목향 핵산 분획물로 인해 유도되는 세포사멸은 세포사멸의 대표적인 경로인 extr ins i c 경로를 대표하는 caspase 8의 증가 및 intr insi c경로를 대표하는 procaspase 9의 감소, 두 경로가 만나는 하위단계인 caspase 3 및 c leaved PARP1의 증가를 확인함으로써 두 경로 모두 경유하는 것을 확인하몄다 (도 23 참조) .
또한, 토목향 핵산 분획물에 포함된 세스퀴테르펜락톤 계열 성분인 알란토락톤, 이소알란토락토, 이가란 ( igal an) 및 디구시알락톤 (degusialactone) , 알로안토락톤 (al loantolactone)의 흔합물의 존재 여부, 구조 및 STAT3 활성 억제를 확인한 결과, 상기 토목향 핵산 분획물에 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 각각 40% 이상 존재하였으며, 미량성분으로 이가란, 디구시알락톤, 알≤:안토락톤이 존재하는 것을 확인하였고, 토목향 핵산 분획물의 모든 화합물에서 뛰어난 STAT3 타이로신 인산화 발현 억제 효능을 확인하였다 (도 24 참조) .
또한, 인간 폐암 세포, 인간 췌장암 세포 및 위암 세포에서 토목향
분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 STAT3 활성 억제를 확인한 결과, 상기 알란토락톤을 처리한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하여 전사인자로서의 역활을 무력화시키는 것을 확인하였다 (도 25 참조) .
또한, 인간 폐암 세포, 인간 췌장암 세포 및 위암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 DNA 결합 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, 각기 다른 세포에 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 상기 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합올 확인한 결과, 상기 분획물의 알란토락톤을 처리한 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 26 참조) .
또한, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 이동 억제 효과를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 각기 다른 농도로 알란토락톤을 처리하였을 때, 세포의 이동이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 27 참조) .
또한, 토목향 분획물 유래 알란토락톤의 세포 부착 억제 효과를 확인하기 위하여, CytoSelect™ 48-wel l 세포 부착 분석 (Cel l Biolabs , 미국)을 사용하여 측정한 결과, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 부착률이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 28 참조) .
또한, 토목향 분획물 유래 알란토락톤의 세포 침윤 억제 효과 확인한 결과, 상기 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 침윤이 분획물로부터 분라된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 29 참조) .
또한, 토목향 분획물 유래 알란토락톤의 균집 형성 억제 효과 확인한 결과, 상기 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포의 균집 형성이 분획물로부터 분리된 알란토락론농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 30 참조) .
또한, STAT3 표적 유전자의 하나인 MMP-9는 세포외 기질 단백질을 분해시키는 대표적인 효소로써, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 醒 P-9 활성 억제를 확인한 결과, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포에서 MMP-9의 분해 활성이 억제되는 것을 확인하였다 (도 31 참조) .
또한, STAT3 활성은 세포 증식 (cel l prol i ferat ion) , 생존 (survival ), 혈관 신생 (angiogenesis) , 세포 주기 진행 (cel l cycle progression) 및 세포 예정 사 (progra隱 ed cel l death)를 포함하는 여러 유전자의 활성을 조절한다고 보고되고 있다. 따라서, 토목향 분획물 유래 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 STAT3 표적 유전자의 발현을 확인한 결과, 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 c-Myc , COX-2 , Cycl in Dl , VEGF 및 CXCR4 유전자의 발현이 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 32 참조) .
또한, 생체 내 7/ 0)에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에
꾀한 유방암 세포 성장 억제를 확인하기 위하여, MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 BALB/c 면역 결핍 마우스 우측 옆구리에 상기 세포를 피하주사하여 종양을 형성시 킨 후 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 알란토락톤에 의한 유방암 종양 억제를 확인한 결과, 상기 알란토락톤을 처리한 군에서 종양부피 및 종양 평균 무게가 유의적으로 낮은 것을 확인하였으며, 마우스의 체증은 변화가 없는 것을 확인함으로써, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 독성을 가지고 있지 않는 것을 확인하였다 (도 33 참조) .
또한, 유방암 세포를 이식한 마우스의 종양 조직에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 p-STAT3 및 Cycl ind D1 발현 억제를 확인한 결과,상기 알란토락톤을 처리한 대조군과 처리순의 조직에서 Cycl in Dl 및 P-STAT3의 발현을 확인하였을 때, 상기 알란토락톤을 처리한 군의 조직에서 Cycl in D1 및 p-STAT3의 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 34 참조) .
따라서, 본 발명의 토목향 ( / /a ze/e ?/™) 분획물ᅵ또는 이로부터 분리된 화합물은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 어로부터 분리된 분획물은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤 (Alantolactone , Ci5H2o02) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤 ( Isoalantolactone , Ci5H2002)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
【화학식 1】
【화학식 2】
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 치료용 약학작 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
상기 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 토목향 분획물로부터 분리된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 STAT3 활성 억제를 특징인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 유방암은 STAT3 과발현 유방암인 것이 바람직하고, 삼중음성유방암인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전이 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전이 억제
방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
상기 유방암은 STAT3 과발현 유방암인 것이 바람직하고, 삼중음성유방암인 것이 더 바람직하다.
본 발명의 토목향 분획물은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고, STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물은 유방암 전이 억제용 조성물에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀를로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘 락토스, 만니를, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀를로오스, 히드록시프로필샐를로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 텍스트로스, 소르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이메 한정'되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 토목향 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate) , 수크로스 (Sucrose), 락토오스 (Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형게, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제ᅳ 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜, 을리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸을레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol ) , 마크로골, 트원 (tween) 61 , 카카오지, 라우린지,
글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 /위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 등시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 , 일반적으로는 체중 1 kg당 O . l mg내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg내지 lO mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1내지 3희로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용귄강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
상기 유방암은 삼중음성유방암인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤올 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다. -
상기 유방암은 삼중음성유방암인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유의적으로 STAT3의 타이로신 인산화 활성을 선택적으로 저해 효과를 나타내고 STAT3 타겟 유전자의 발현을 하향 조절 효과를 나타내며, 암 전이 억제 효과를 나타내고, 종양 무게 및 종양 부피 감소 효과를 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 유방암 예방 및 개선용 건강기능식품 또는 유방암 전이 억제용 건강기능식품에 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화합물이 상기와 같은 유방암 예방 및 개선, 또는 유방암 전이 억제를 위해 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 흔합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 토목향 분확물 또는 이의 분획물로부터 분리된 화합물 이외에 구연산, 액상과당,설탕,포도당,초산,사과산,과즙 등에서 하나 이상의 성분올 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 유방암 예방 및 개선, 또는 유방암 전이 억제를 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g내지 10.0 g정도로 포함되는 것이 좋으며 , 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 유방암 예방 및 개선, 또는 유방암 전이 억제 효과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명은 토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제를 제공한다.
또한, 본 발명은 항암 보조제로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도를 제공한다.
또한, ᅳ본 발명은 항암 보조제로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도를 제공한다.
상기 분획물은 토목향 추출물로부터 핵산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올 또는 물로 순차적으로 분획하여 얻은 핵산 분획물, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것이 바람직하며, 핵산으로 추출한 것이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출물은 토목향을 물, 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 흔합물을 용매로 하여 추출되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄을인 것이 바람직하며, 메탄을이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 추출 방법으로는 넁침 추출, 가열 추출, 초음파 추출 또는 환류 냉각 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 감압농축은 진공 감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 토목향 분획물, 또는 알란토락톤 또는 이소알란토락론은 항암제와 병용 처리되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 항암제는 시스플라틴 (cisplatin), 캄포테신 (camptothecin) , 플루오로우라실 (fluorouracil), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (docetaxel ) , 이마티닙 (imaUnib), 제피티님 (gef itinib), 베바시주맙 (bevacizumab) , 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vkicr ist ine), 허셉틴 (hercept in), 독소루비신 (doxorubicin) 및 에토포사이드 (etoposide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 시스플라틴, 독소루비신 및 에토포사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 보다 바람직하며, 독소루비신인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 항암체인 독소루비신과 병용 처리하였을 때, 세포 성장을 더 뛰어나게 억제하고, 과발현된 STAT3를 현저히 억제함을 나타냄으로써, 상기 토목향 분획물 또는 이의 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 항암 보조제에 유용하게 사용될 수 있다. 이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>토목향 (Inula heleniimi) 추출물의 제조
(주)광명당제약 (울산)에서 구입한 토목향 (//2i//a he!enium)^ 건조 뿌리를 구입한 후, 깨끗하게 세척한 후, 1.5 kg을 100% 메탄올 10리터에 넣고, 환류넁각 장치를 이용, 수욕상에서 3시간씩 3회 추출하였다. 추출'물을 여과한 다음 감압 농축하여 500 g의 추출물을 제조하였다. <실시예 2>토똑향 (Inula heleniwn) 추출물 핵산가용성 분획물의 제조 상기 <실시예 1>에서 얻어진 토목향 메탄올 추출물 중 100 g에 물 1 L를 첨가하여 현탁시키고, 동량의 100% 핵산을 가하여 흔합하고 3 차례 반복 추출하여 얻은 추출물을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 핵산 분획물 25 g을 수득하였다.
<실시예 3> 토목향 heleniu ) 핵산 분획물에서 알란토락톤 (Alantolactone) 및 이소알란토락톤 (isoalantolactone) 확인
토목향 핵산 분획물에서 알란토락톤 및 이소알란토락토의 존재 여부를 확인하기 위하여 , HPLC를 사용하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 제조한 핵산 분획물을 HPLC로 순도를 확인하였다. HPLC를 위한 표준품으로 시판되는 알란토락토표준품 (순도 99% 이상; TAUTO Biotech , 상하이, 증국) 및 이소알란토락론 (순도 99% 이상: TAUTO Biotech , 상하이, 중국) 표준품을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 상기 분획물에 알란토락톤 (38.4¾ 및 이소알란 £락톤 (46.2%)이 검출됨으로써, 알란토락톤 및 이소알락톤이 제대로 추출됨을 확인하였다 (도 1) .
<실시예 4> 토목향 helenium) 분획물로부터 알란토락톤 (Alantolactone) 분리
상기 <실시예 2〉와 동일한 방법으로 제조한 핵산 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 분리하였다 (Bi ol Pharm Bul l 25( 10) 1370-1372 , 2002) ,
<실시예 5> 토목향 ( / zw/a helenium) 쩨탄올 추출물에서 알란토락톤 (Alantolactone) 및 이소알란토락톤 ( isoalantolactone) 확인
토목향 메탄올 추출물에서 알란토락톤 및 이소알란토락토의 존재 여부를 확인하기 위하여, HPLC를 사용하였다.
구체적으로, 토목향와 뿌리 1.5 kg을 100% 메탄을 10리터에 넣고, 환류넁각 장치를 이용, 수욕상에서 3시간씩 3회 추출하였다. 추출물을 여과한 다음 감압 농축하여 500 g의 추출물을 제조하였다. HPLC를 위한 표준품으로 시판되는 알란토락토표준품 (순도 99% 이상; TAUTO Bi otech , 상하이, 중국) 및 이소알란토락톤 (순도 99% 이상: TAUTO Biotech , 상하이, 중국) 표준품을 사용하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 토목향 메탄올 추출물에 알란토락톤 ( 15.7%) 및 이소알락톤 ( 15.9%)이 검출됨으로써,상기 <실시예 3>에서 제조한 토목향 핵산 분획물이 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 2배 이상 더 함유하는 것을 확인하였다 (도 2) .
<실험예 1> 토목향 ( // /a helenium) 메탄올 추출물의 세포 성장 억제 측정
토목향 메탄올 추출물의 세포 성장 억제 측정을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 인간 유방암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 상기 세포는 10% FBS , lOOug/ml 페니실린 및 스트렙토마이신의 항생제를 함유하는 DMEM배지를 사용하여 37°C , 5% C02배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트 (wel l p l ate)에 1 X 104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37°C , 5% C02 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후상기 <실시예 5〉에서 제조한 토목향 메탄을 추출물을 0, 20
40 , 60 , 80 , 100 ug/ml 농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액의 배지를 제거하고
MTT(3-(4 , 5-dimethyl thiazol-2-yl )-2 , 5-diphenyl tetrazol ium bromide) 시약을 웰당 0.5 mg/ml 로 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양사킨 후 배지를 제거하였고 웰 바닥에 붙은 포르마잔 ( formazan)을 녹이기 위해 DMS0 100 ul를 처리하였다. 그런 다음, 추가로 10분 동안 흔들어 주고 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 토목향 분획물을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율 (%)을 계산하였다. 아울러, 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 데이터의 다중 비교의 통계학적 분석을 위해 AN0VA 분석 및 student ' s -테스트를 사용하였다. 값이 0.05 이하일 때, 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 토목향 추출물을 각기 다른 농도로 처라하였을 때 M -MB-231 인간 유방암 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 분획물의 처리 농도가 높을 수록 MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다 (도
4) .
<실험예 2>토목향 ( / /Ja AeJenj'um)순차적 분획물의 세포 성장 억제 측정 토목향 순차적 분획물의 세포 성장 억제 측정을 비교하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 토목향 메탄올 추출물 중 100 g에 증류수 1 L를 첨가하여 현탁시키고 핵산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 부탄올의 순서로 용매 분획하였다. 먼저 토목향 메탄올 추출물의 현탁액에 동량의 핵산을 가하여 흔합하고 하층의 현탁액을 분리한 후 상층의 핵산을 취하였고 이를 3차례 반복 시행하였다. 핵산 분획층을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하며 핵산 분획물 25 g을 수득하였다. 1 L의 메틸렌 클로라이드를 따로 분리한 현탁액과 흔합하여 하층의 메틸렌 클로라이드를 취하여 3차례 반복 시행하였다. 메틸렌 클로라이드 분획층을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 메틸렌 클로라이드 분획물 5 g을 수득하였다. 에틸 아세테이트 1 L와 현탁액을 흔합하여 하층의 현탁액을 분리한 후 상층의 에틸 아세테이트를 취하였고 이를 3 차례 반복 시행하였다. 에틸 아세테이트 분획층을 여과지로 여과한 다흠, 진공 건조하여 에틸 아세테이트 분획물 2 g을 수득하였다. 부탄을 1 L와 현탁액을 흔합하여 하층의 현탁액을 분리한 후 상층의 부탄을을 취하였고 이를 3 차례 반복 시행하였다. 부탄을 분획층을 여과지로 여과한 다음, 진공 건조하여 부탄올 분획물 11 g을 수득하였다. 나머지 토목향 메탄올 추출물의 현탁액을 진공 건조하여 57 g올 수득하였다. 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 배양하였다. 그런 다음, 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트 (wel l plate)에 1 X 104씩 분주한 다음, 24시간 동안 37°C , 5% C02 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 메틸렌 클로라이드 분획물, 에틸아세테이트 분획물,부탄을 분획물 및 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 핵산 분획물을 0, 10 , 25, 50, 100 ug/ml 농도로 처리하고 6시간 및
24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 ΜΊΤ를 수행하였고, 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 토목향 순차적 분획물을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율 (%)홀 계산하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231인간 유방암 세포에 상기 토목향 순차적 분획물을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 상기 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 핵산 분획물을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 사멸하는 것을 확인하였다 (도 5) .
<실험예 3>토목향 ( Inula heleniwn) 분획물의 세포성장 억제 측정
토목향 핵산 분획물과 상기 <실험예 1>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 메탄올 추출물 및 상기 <실험예 2>에 기재된 방법으로 제조한 각각의 토목향 분획물의 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, MDA-MB-231 인간.유방암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며, 상기 세포는 10% FBS , 100ug/ral 페니실린 및 스트랩토마이신의 항생제를 함유하는 DMEM배지를 사용하여 37°C , 5% C02배양기에서 배양하였다. 그런 다음 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트 (wel l plate)에 1 X 104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37°C , 5% C02 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후,상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 핵산 분획물을 0.5, 1 2 , 4, 6 , 8, 10 ug/ml농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 배양액의 배지를 제거하고 MTT
(3-(4, 5-dimethyl thi azol-2-yl )-2 , 5-diphenyl tetrazol ium bromide)시약을 웰당 0.5 mg/ml 로 첨가하고 37° C에서 2시간 동안 배양시킨 후 배지를 제거하였고 웰 바닥에 붙은 formazan을 녹이기 위해 DMS0 100 ul를 처리하였다. 그런 다음, 추가로 10분 동안 흔들어 주고 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 토목향 분획물을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율 («을 계산하였다. 아울러, 모든 실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 데이터의 다중 비교의 통계학적 분석을 위해 AN0VA 분석 및 student ' s -테스트를 사용하였다. Ρ 값이 0.05 이하일 때, 통계학적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231인간 유방암 세포에 상기 토목향 핵산 분획물을 각기 다른 농도로 처리하였을 때 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 성장이 감소하는 것을 확인하였으며, 상기 토목향 핵산 분획물의 처리 농도가 높을 (8 ug/ml )수록 MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다 (도 6) . 따라서, 상기 <실험예 3>의 결과를 통해 토목향 핵산 분획물이 메탄올 추출물 및 각각의 분획물 보다 인간 유방암 세포를 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다.
<실험예 4> 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 비교
알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과를 비교하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231인간 유방암 세포를 배양하였다. 그런 다음ᅳ 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트 (well plate)에 1X104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37°C, 5% C02 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 0, 5, 10, 및 15 uM 농도로 처리하고 6사간 및 24시간 동안 배양하였다. 이후,상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MTT를 수행하였고, 540 nm 파장에서 마이크로폴레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 처뫼한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율 (%)을 계산하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 이소알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였을 때, 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간, 유방암 세포가 효과적으로 사멸하는 것을 확인하였다 (도 7).
<실험예 5> 알란토락톤 및 이소알란토락톤에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과비교
상기 <실험예 1〉과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토란톤 및 이소알란토락톤을 처리하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 비교하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다. 구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 알란토란톤 및 이소알란토락톤을 으 5, 10 및 15 uM 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼 ( 20 mM HEPES [pH 7.6], 350 mM NaC 1 , 20%글리세를, 0.5 mM EDTA , O.l mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 흔합물 (protease inhibitor cocktail))를 사용하여 세포 용해물을 수득한 다음, 20 내지 30 ug의 단백질을 8% SDS-PAGE gel를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하고, 분리된 단백질을 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실은에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 P-STAT3 Tyrosine 705 (제품번호: ab76315, Abeam) , p-STAT3 Serine 727(제품번호: ab32143, Abeam), STAT3 제품번호: ab32500, Abeam) , Cyclin (제품번호 : ab40754, Abeam)을 1/1000로 회석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP—결합 항 -rabbit (제품번호: sc_2004, Santacruz)을 2차 항체로 하여 1:1000의 비율로 희석하여 실은에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 (luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -βᅳ액틴 (actin) (제품번호: sc—47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 알란토란톤 및 이소알란토락톤을 처리한 MDA— MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 STAT3 타이로신 인산화 및 Cyc l in Di 단백질의 발현이 억제되는 것을 확인하였으며, 알란토락톤을 '처리한 상기 세포의 STAT3 타이로신 인산화 발현이 이소알란토락톤을 처리한 세포보다 억제되는 것을 확인하였다 (도 8) .
<실험예 6> 알란토락톤에 의한 세포 성장 및 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 효과 비교
알란토락톤에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 다양한 세포에서 비교하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231인간 유방암 세포, MCF-7인간 유방암 세포 및 MCF-10A정상 유방 세포를 배양하였다. 그런 다음, 세포 성장 억제 효과는 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MGF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포를 각각 96웰 프레이트 (wel l plate)에 1 X 104씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37 °C , 5% C02 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 알란토락톤을 처리하고 4시간 동안 배양한 후, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MTT를 수행하였고, 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 알란토락톤을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제을 (%)을 계산하였다. 또한, STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과는 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abeam)및 STAT3(제품번호: ab32500 , Abeam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였고, 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 - β _액틴 (act in) (제품번호: sc-47778 , Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포, MCF-7 인간 유방암 세포 및 MCF-10A 정상 유방 세포에 알란토락톤을 각기 다른 농도로 처리하였올 때, 정상 유방 세포인 MCF-10A에서는 알란토락톤이 세포 성장에 영향을 미치지 않았으나, 인간 유방암 세포인 MDA— MB-231 및 MCF-7에서는 알란토락톤이 세포의 성장을 감소시키는 것을 확인하였고, 이러한 효과는 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 가장 뛰어나게 억제하는 것을 확인하였으며, 인간 유방암 세포인 MDA-MB-231에서 STAT3가 가장 활성화된 상태로 존재하였고, MCF-10A , MCF-7의 순서로 나타났으며, 알란토락톤을 처리하였올 때, 모든 세포에서 STAT3의 과발현을 현저히 억제하는 것을 확인하였다 (도 9) .
<실험예 7> 토목향 Ui /a helenium) 분획물에 의한 S AT3 인산화 및 단백질 발현 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA— MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 핵산 분획물 유래 알락토란톤을
처리하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법올 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물 유래 알락토란톤을 0, 1, 2, 4, 6 ug/ml 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼 (20mMHEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20%글리세를, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, 0.1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 흔합물 (protease inhibitor cocktail))를 사용하여 세포 용해물을 수득한 다음, 20 내지 30 ug의 단백질을 8% SDS-PAGE gel를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하고, 분리된 단백질을 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5¾탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 P-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315, Abeam) , p-STAT3 Serine 727(제품번호: ab32143, Abeam) , STAT3(제품번호: ab32500, Abeam) , Cyclin 제품번호: ab40754ᅳ Abeam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안 반웅시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 항 -rabbit (제품번호: sc-2004, Santacruz)을 2차 항체로 하여 1:1000의 비율로 회석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 (luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β-액틴 (actin) (제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이 , 상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물을 처리한 MDA MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cyclin Di단백.질의 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 10).
<실험예 8>토목향 (/ /a helenium) 메탄을추출물에 의한 STAT3 인산화 및 단백질 발현 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 5>에서 제조한 토목향 메탄을 추출물을 처리하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 5〉에 기재된 방법으로 제조한 토목향 추출물을 0, 10, 20, 40, 60 ug/ml 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 <실험예 7〉과 동일한 방법을 수행하여 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제를 확인하였다.
그 결과,도 11에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 5>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 메탄을 추출물을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 농도 의존적으로 STAT3타이로신 인산화 및 (;11111)1단백질의 발현이 억제되는 것을
확인하였으나, 토목향 핵산 분획물을 처라한 세포에서 효과적으로 STAT3 타이로신 인산화, ERK 인산화 및 Cyclin Dx 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 11). <실험예 9> 토독향 (Jnula helenii ) 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 STAT3 활성 억제 확인
<9-1> DA-MB-231 인간 유방암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 알란토락톤에 의한 STAT3 활성 억제 확인
상기 <실험예 1〉과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 전체 단꿱질 및 핵 단백질에서 상기 <실시예 4〉에서 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 .4>에 7ᅵ재된 방법으로 제조한토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM농도로 처리하여 4시간 동안 배양하거나, 알란토락톤을 15 uM농도로 처리하여 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼 (20mMHEPES [pH 7.6], 350 mM NaCl, 20%글리세를, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1% NP-40, 50 mM NaF, 0.1 mM DTT, O.lmMPMSF, 및 프로테아제 저해제 흔합물 (protease inhibitor cocktai 1 )를 사용하여 세포 용해물을 수득하였다. 또한, 세포 핵 단백질은 순차적 방법에 따라서 수행하였다ᅳ 먼저 세포에 세포질 용해 버퍼 (10mMHEPES[pH7.9], 10 mM KC1, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 흔합물 (protease inhibitor cocktail)와 NP-40을 처리하여 세포막을 터뜨려준 후, 원심분리하여 세포질 용해물을 제거하였다. 남아있는 핵 단백질은 핵 용해 버퍼 (20 mM HEPESlpH 7.9], 400 ml NaCl , l mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 (protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포내 핵 용해물을 수득하였다. 전체 단백잘 또는 핵 단백질은 Bradford 시약 (Bio-rad)을 사용하여 단백질의 농도를 계산하였다. 아울러, 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 상기 세포의 단백질을 분리하고, 웨스턴 블랏을 수행하여 p-STAT3(Tyr705) 및 STAT 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항— β-액틴 (actin) (제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동을 차단하여 전사인자로서의 역할을 무력화시키는 것을 확인하였다 (도 12).
<9-2> MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 단백질에서 알란토락톤에 의한 DNA결합 활성 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 단백질에서 상기 <실시예 4>에서 기재된 방법으로 제조한 토목향
핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤 처리하여 STAT3 전사인자의 DNA에 대한 결합 능력을 확인하기 위하여 Electophoret i c mobi l i ty shi ft assay(EMSA)를 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1〉과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5 , 10 , 15 uM농도로 처리하여 4시간 동안 배양하거나, 알란토락톤을 15 uM농도로 처리하여 0, 0.25 , 0.5 , 1, 2, 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 상기 세포로부터 분리된 핵 단백질은 서열번호 1로 기재된 염기서열을 가진 P— end-l abeled 이중 -가닥 STAT3 consensus ol igonuc leot ide(Santa Cruz)와 37°C에서 30분 동안 배양하였다. 경쟁적 반웅을 확인하기 위해서, 100배 농도의 올리고뉴클레오티드 (ol igonucleot ide) 또는 STAT3 항체를 배양 10분 전에 첨가하였다. 30분간 배양한 후, 결합된 DNA와 핵 단백질은 6% nat ive PAGE를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하였다. 젤 드라이어를 이용하여 젤을 건조시켰고, BAS-1500(푸지필름)을 이용하여, 방사능 표지 밴드를 검출하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포의 핵 내에서 STAT3 전사인자의 DNA 결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 13) .
<9-3> MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 알란토락톤에 의한 STAT3(TVr 705) 및 STAT3(ser 727)활성 억제 확인
상기 <실험예 1〉과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4〉에서 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 시간에 따른 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3(ser 727)활성을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4〉에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM농도로 처리하여 3 , 6, 12및 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5¾탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실은에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315 , Abeam) , p-STAT3 Ser ine 727(제품번호: ab32143 , Abeam) , STAT3(제품번호: ab32500 , Abeam) , Cyc l in Ed (제품번호: ab40754, Abeam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안 반웅사켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 항 -rabbi t (제품번호: sc-2004, Santacruz)를 2차 항체로 하여 1 : 1000의 비율로
회석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000 푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 ( luminescence )을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항ᅳ β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778 , Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 3〉에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 STAT3(Tyr 705) 발현은 3, 6, 12, 및 24시간의 모든 시간에서 억제되는 것을 확인하였고, 초기시간대에서 발현이 더 억제되는 것을 확인하였다 (도 14) .
또한, 도 15에 나타낸 바와 같이, STAT3의 또 다른 인산 작용기인 세란 (Ser ine) 잔기의 인사화는 억제하지 못한 것올 확인하였다 (도 15) . <9-4> DA-MB-231 인간 유방암 세포에서 알란토락톤에 의한 STAT3(TVr
705) 및 STAT3(ser 727)활성 억제와 S31-201에 의한 STAT3 활성 억제 비교
상기 <실험예 1〉과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4〉에서 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 시간에 따른 STAT3(Tyr 705) 및 STAT3( ser 727)활성 억제와 S31-201에 의한 STAT3 활성 억제를 비교하기 위해 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 15 uM 농도로 처리하고 상용화된 STAT3 억제제 S31-201는 10, 20 , 50 및 100 uM을 처리하여 6 시간 동안 배양하였다. 그런 다음ᅳ 상기 실험예 <9— 1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5%탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 P-STAT3 Tyros ine 705(제품번호: ab76315 , Abeam) , p-STAT3 Ser ine 727(제품번호: ab32143 , Abeam) , STAT3 제품번호: ab32500 , Abeam) , Cyc l in (제품번호: ab40754 , Abeam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 항 -rabbi t (제품번호: sc-2004 , Santacruz)를 2차 항체로 하여 1 : 1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 ( luminescence)을 검출하여 단백잘 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778 , Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 상용화된 STAT3억제제인 S31-2()l과 토목향 분획물 유래의 알란토락톤을 상기 세포에 처리하여 비교한 결과, 상기 분획물을 처리한 세포에서 STAT3(Tyr 705) 인산화 활성이 낮은 농도에서
유의적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 16) .
<9-5> MDA-MB-231 인간유방암세포에서 알란토락톤에 의한 EGF 및 IL-6 자극원 활성 억제 확인
상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 EGF 및 IL-6 자극원 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 세럼 (serum)이 함유되어 있지 않은 배지에서 상기 <실험예 1〉과 동일한 방법으로쎄양한 MDA-MB-231 세포와 10 ng/ml 인터루킨 ( IL-6) 및 100 ng/ml 표피성장인자 (EGF)를 처리하였다. 또한, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 10 ng/ml 인터루킨 ( IL-6) 및 100 ng/ml 표피성장인자 (EGF)를 0 , 5, 10, 20, 30 , 50분 동안 처리하고, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분확물을 15 uM 농도로 처리하여 6 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분라한 다음 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 P-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315 , Abeam)및 STAT3(제품번호: ab32500 , Abeam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안 반웅시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 2차 항체 항 -rabbi t (제품번호: sc-2004 , Santacruz)!- 1 : 1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 ( luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대초군으로, 항 -β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778 , Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 17 및 도 18에 나타낸 바와 같이, 상기 세포에서 인터루킨 ( IL-6) 자극 20분 후 또는 표피성장인자 (EGF) 자극 10분 후 STAT3 인산화 활성이 최고조로 나타나는 것을 확인하였으며ᅳ 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때, 두 종류의 자극원에 의한 STAT3의 활성이 완전하게 차단되는 것을 확인하였다 (도 17 및 도 18) .
<9-6> MDA-MB-231인간유방암세포에서 알란토락톤에 의한특이적 STAT3 인산화차단 확인
STAT3의 인산화는 상위단계 경로인 JAKl , JA 2 또는 Src의 인산화에 의해서 이루어진다. 따라서, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하였을 때 JAKl , JAK2 또는 Src의 인산화에 영향올 미치는지 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다. 구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터'
분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM농도로 처리하여 4시간 동안 배양하거나, 알란토락톤을 15 uM농도로 처리하여 0 , 0.25 , 0.5, 1, 2 , 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시키고 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 p-JAKK제품번호: abl38005 , Abeam) , JAK1 (제품번호: abl33666 , Abeam) , p-JAK2(제품번호 : ab32101 , Abeam) , JAK2(제품번호 : abl08596 , Abeam) , p-Src (제품번호 : ab32078 , Abeam) 및 Src (제품번호: ab32102 , Abeam) , 또는 SHP-K제품번호: GTX102864 , Genet ex) , SHP-2(제품번호: GTX101062 , Genet ex)및 PTEN (제품번호: GTX101025, Genetex)을 1八 000로 희석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안 반웅시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP-결합 2차 항체 항 -rabbi t (제품번호: sc-2004, Santacruz)를 1 : 1000의 비율로 회석하여 실은에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS 1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 ( luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 19및 도 20에 나타낸 바와 같이, 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 상기 세포에서 JAKl , JAK2 또는 Src 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-l , SHP-2 및 PTEN 등의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확인함으로써, 상기 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 19 및 도 20) .
<9-7 알란토락톤 및 항암제인 독소루비신 (doxorubicin)의 병용 투여에 의한세포성장및 STAT3인산화 및 단백질 발현 억제 효과 비교
알란토락톤 및 항암제인 독소루비신의 병용 투여에 의한 세포 성장 억제 효과 및 STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 MDA-MB-231인간 유방암 세포를 배양하였다. 그런 다음, 세포 성장 억제 효과는 상기 MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 96웰 프레이트 (wel l pl ate)에 l x lO4씩 분주한 다음, 24 시간 동안 37°C , 5% C02 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 알란토락톤 ( 15 uM) 및 독소루비신 (0, 1 및 2 uM)을 처리하고 4시간 동안 배양한 후, 상기 <실험예 6>과 동일한 방법으로 MTT를 수행하였고, 540 nm 파장에서 마이크로플레이트 리더로 흡광도를 측정하였다. 상기 알란토락톤을 처리한 군의 흡광도를 100% 활성 기준으로 하여 각 시료의 억제율 (%)을 계산하였다. 또한, STAT3 표적 유전자 단백질 발현 및 인산화 억제 효과는 상기
MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실험예 6>과 동일한 방법으로 1차 항체 P-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315 , Abeam) 및 STAT3 제품번호: ab32500 ,
Abeam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였고, 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778 , Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이 , MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 알란토락톤 및 독소루비신을 병용 처리하였을 때, 알란토락톤 또는 독소루비신 단독 처리하였을 때보다 세포 성장을 현저히 억제하는 것을 확인하였고, 독소루비신을 처리하였올 때 과발현되는 STAT3을 알란토락톤과 병용 처리시 억제하는 것을 확인하였다 (도 21) .
<실험예 10>토목향 핵산분획물에 의한 STAT3활성 억제 확인
<10-1> MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 토목향 핵산 분획물에 의한 특이적 STAT3 인산화차단 확인
STAT3의 인산화는 상위단계인 JAKl , JAK2의 인산화 및 SHP-1 , SHP-2 경로에 의해서 이루어진다. 따라서, 상기 <실험예 1>과 흥일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 2>에서 제조한 토목향 핵산 분획물을 처라하였을 때 JMl , JAK2의 인산화 및 SHP-l , SHP-2 경로에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에,상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 체조한 토목향 핵산 분획물을 0, 2 , 4, 6, 8 iig/ml 농도로 처리하여 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1>과 동일한 방법으로 제포 단백질을 분리한 다음, 상기 실험예 <9-6>과 동일한 방법으로 1차 항체 p-JAKl (제품번호: abl38005 , Abeam) , JAKl (제품번호: abl33666 , Abeam) , p-JAK2(체품번호: ab32101 , Abeam) , JAK2(제품번호: abl08596 , Abeam) , p-STAT3 Tyros ine 705(제품번호: ab76315 , Abeam) , p-STAT3 Ser ine 727(제품번호: ab32143 , Abeam) 및 STAT3(제품번호: ab32500 , Abeam) , 또는 SHP-1(제품번호: GTX102864 , Genet ex) 및 SHP-2(제품번호: GTX101062 , Genetex)를 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778 , Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과 도 22에 나타낸 바와 같이, 상기 핵산 분획물을 처리한 상기 세포에서 JAK1 및 JAK2 인산화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였으며, STAT3의 인산화는 억제하는 것을 확인하였다. 또한, STAT3의 대표적 인산가수분해효소인 SHP-1 및 SHP-2의 발현 증가에도 영향을 미치지 않는 것을 확인함으로써, 상기 핵산 분획물은 STAT3 인산화만 특이적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 22) . <10-2> MDA-MB-231인간유방암 세포에서 토목향 핵산 분획물에 의한 DNA 분절화 (fragmented) 확인
세포사멸이 증가하면 DNA분절화가 증가하게된다. 따라서, 상기 <실험예
1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 2>에서 쎄조한 토목향 핵산 분획물을 처리하였을 때 DNA 분절화 및 이의 경로쎄 영향을 미치는지 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에,상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물을 0, 2, 4, 6, 8 ug/ml 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, DNA분절 분석은 각 시간마다 물질이 처리된 세포를 수확하여 PBS로 2회 세척하고 10분간 15,000 rpm에서 원심분리하였다. 세포는 Triton X-100용해 버퍼 (50 mM Tris-Cl buffer [ H 8.0] , 0.2 M EDTA, 5% Triton X-100)를 처리하여 세포 용해물을 수득하였다. DNA는 25:24:l(v/v/v) 중성 페놀 (neutral phenol):클로로포름 (chloroform):이소아밀알코올 (isoamyl alcohol) 시약을 사용하여 추출하였고, 아세트산암모늄 (ammonium acetate) 및 100% 에탄올을 이용하여 DNA를 침전시켰다. 불순물 및 RNA를 제거하기 위하여 70% 에탄올로 씻어주고, 공기 중에서 완전히 건조시킨 뒤, 에티디움브로마이드 (EtBr)를 포함하는 2%아가로스 겔로 1시간 동안 전기영동하여, UV transilhiminator에서 관찰하였다. ᅳ 또한, 경로 확인은 외적인 (extrinsic) 경로를 대표하는 caspase 8 및 고유한 (intrinsic) 경로를 대표하는 procaspase 9, 두 경로가 만나는 하위단계인 caspase 3및 cleaved PARP1을 이용하여 확인하였다. 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물을 0, 2, 4, 6, 8 ug/ml 농도로 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-1〉과 동일한 방법으로 세포 단백질을 분리한 다음, 상기 실함예 <9-6>과 동일한 방법으로 1차 항체 PARP-K제품번호: sc-7150, Santacruz), procaspase 3(제품번호: sc-7148, Santacruz) , active caspase 3(제품번호: ab32042 , Abeam) , procaspase 9(제품번호: sc-7885, Santacruz), procaspase 8(제품번호: sc-7890 , Santacruz), active caspase 8(제품번호: ab32397, Abeam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β-액틴 (actin) (제품번호: sc-47778, Santacruz)올 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 23에 나타낸 바와 같이, 상기 핵산 분획물을 처리한 상기 세포에서 DNA 분절화가 농도 의존적으로 증가함으로써 세포사멸이 증가하는 것을 확인하였고, 토목향 핵산 분획물로 인해 유도되는 세포사멸은 세포사멸의 대표적인 경로인 extrinsic 경로를 대표하는 caspase 8의 증가 및 intrinsic 경로를 대표하는 procaspase 9의 감소, 두 경로가 만나는 하위단계인 caspase 3 및 cleaved PARP1의 증가를 확인함으로써 두 경로 모두 경유하는 것을 확인하였다 (도 23).
<10-3>토목향 핵산분획물 구성성분의 구조 및 STAT3활성 억제 확인 토목향 핵산 분획물에 포함된 세스퀴테르펜락톤 계열 성분인 알란토락톤, 이소알란토락토, 이가란 (igalan) 및 디구시알락톤 (degusialactone), 알로안토락톤 (alloantolactone)의 흔합물의 존재 여부, 구조 및 STAT3 활성
억제를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 제조한 핵산 분획물을 HPLC로 확인하여 화합물의 존재 여부 및 구조를 확인하였고, 또한, STAT3 활성 억쩨 효과는 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실험예 5>와 동일한 방법으로 1차 항체 P-STAT3 Tyrosine 705(제품번호: ab76315 , Abeam)및 STAT3(제품번호: ab32500 , Abeam)을 사용하여 단백질 발현 정도를 확인하였고, 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778 , Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 24메 나타난 바와 같이, 상기 토목향 핵산 분획물에 알란토락톤 및 이소알란토락톤이 각각 40% 이상 존재하였으며, 미량성분으로 이가란, 디구시알락톤, 알로안토락톤이 존재하는 것을 확인하였고, 토목향 핵산 분획물의 모든 화합물에서 뛰어난 STAT3 타이로신 인산화 발현 억제 효능을 확인하였다 (도 24) .
<실험예 11>인간폐암 세포, 인간 췌장암 세포 및 위암 세포에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 꾀한 STAT3촬성 먹제 확인
<11-1>세포 배양
Α549 인간 폐암 세포는 ATCC로부터 구입하였고, Panc-1 인간 췌장암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하였으며 , AGS 위암 세포는 한국 세포주 은행으로부터 구입하여, A549인간 폐암 세포는 10% FBS , 100ug/ml 페니실린 및 스트랩토마이신의 항생제를 함유하는 RPMI 1640을 사용하였고, Panc-1 인간 췌장암 세포는 10% FBS , lOOug/ml 페니실ᅳ린 및 스트렙토마이신의 항생제를 함유하는 DMEM 배지를 사용하여 37°C , 5% C02 배양기에서 배양하였다. 그런 다음, 각기 다른 상기 세포를 96웰 프레이트 (wel l pl ate)에 l x iO4씩 분주한 다음, 24시간 동안 37°C , 5% C02 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착한 후, 상기 <실시예 4>에서 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0.5, 1, 2, 4, 6 , 8 ug/ml 농도로 처리하고 6시간 및 24시간 동안 배양하였다.
<11-2> 각기 다른 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 STAT3 활성 억제 확인
상기 실험예 <11_1〉과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 상기 <실시예 3>에서 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락론을 처리하여 STAT3 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <11-1>과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에, 상기 <실시예 4〉에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM농도로 처리하여 4시간 동안 배양하몄다. 그런 다음,상기 세포 전체 단백질 분리는 용해 버퍼 (20 mM HEPES [pH 7.6] , 350 mM NaCl , 20%글리세를, 0.5
mMEDTA, O.lmMEGTA, l%NP-40, 50mMNaF, O.lmMDTT, O.lmMPMSF,및 프로테아제 저해제 혼합물 (protease inhibitor cocktail))를 사용하여 세포 용해물을 수득하였다. 또한ᅳ 세포 핵 단백질은 순차적 방법에 따라서 수행하였다. 먼저 세포에 세포질 용해 버퍼 (10 mM HEPES [ H 7.9], 10 mM KC1, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM ΌΉ, 1 mM PMSF, 및 프로테아제 저해제 혼합물 (protease inhibitor cocktail)와 NP-40을 처리하여 세포막을 터뜨려준 후, 원심분리하여 세포질 용해물을 제거하였다. 남아있는 핵 단백질은 핵 용해 버퍼 (20mMHEPES [pH 7.9], 400 mM NaCl , 1 mMEDTA, ImMEGTA, ImMDTT, ImMPMSF, 및 프로테아제 저해제 (protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포내 핵 용해물을 수득하였다. 전체 단백질 또는 핵 단백질은 Bradford 시약 (Bk)-rad)을 사용하여 단백질의 농도를 계산하였다. 아울러, 상기 <실험예 2>와 동일한 방법으로 상기 세포의 단백질을 분리하고, 웨스턴 블랏을 수행하여 p-STAT3(Tyr705) 및 STAT 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β-액틴 (act in) (제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β—액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 25에 나타낸 바와 같이, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 Α549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에서 STAT3의 타이로신 잔기의 인산화를 억제하여 이합체 형성을 억제하고, STAT3의 핵 내로의 이동올 차단하여 전사인자로서의 역활을 무력화시키는 것을 확인하였다 (도 25).
<11-3>、각기 다른 세포의 핵 단백질에서 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 의한 DNA결합활성 억제 확인
상기 실험예 <11-1>과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포,
Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포의 전체 단백질 및 핵 단백질에서 상기 <실시예 4>에서 기재된 방법으로 분리된 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 STAT3 전사인자의 DNA에 대한 결합 능력을 확인하기 위하여 Electophoretic mobility shift assay(EMSA)을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실험예 <11-1〉과 동일한 방법으로 배양한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포에, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 핵산 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 0, 5, 10, 15 uM 농도로 처리하여 4시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 실험예 <9-2>와 동일한 방법으로 상기 세포로부터 분리된 핵 단백질은 서열번호 1로 기재된 염기서열을 가진 P-end- labeled 이중 -가닥 STAT3 consensus oligonucleotide Santa Cruz)와 37° C에서 30분 동안 배양하였다. 경쟁적 반웅을 확인하기 위해서, 100배 농도의 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 또는 STAT3 항체를 배양 10분 전에 첨가하였다. 30분간 배양한 후, 결합된 DNA와 핵 단백질은 6% native PAGE를 이용하여 100 V에서 2시간 동안 전기영동하였다. 젤 드라이어를 이용하여 젤을 건조시켰고,
BAS— 1500(푸지필름)을 이용하여, 방사능 표지 밴드를 검출하였다.
그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이 , 상기 토목향 분획물로부터 분리된
알란토락톤을 처리한 A549 인간 폐암 세포, Panc-1 인간 췌장암 세포 및 AGS 위암 세포의 핵 내에서 STAT3전사인자의 DNA결합을 매우 효과적으로 차단하는 것을 확인하였다 (도 26) . <실험예 12> 토목향 helenium) 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 이동 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 이동 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231인간 유방암 세포를 12-웰 배양판에 분주하여 37°C에서 80 내지 9 로 가득 찰 때까지 배양하였다. 세포는 200 ≠ 팁으로 긁어내었고, 상처입은 세포들을 시료에 노출시켰다. 그런 다음, 상기 <실시예 4〉에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5 , 10및 15 uM농도로 처리한 다음, 24 시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 세포들을 4% 파라포름알데히드로 고정시키고 현미경하에 분석하였다.
그 결과, 도 27에 나타낸 바와 같이, MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 각기 다른 농도로 알란토락톤을 처리하였을 때, 세포의 이동이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 27) . <실험예 13> 토폭향 ( Inula helenium) 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 부착 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포부착 억제 효과를 확인하기 위하여 , CytoSelect™ 48-wel l 세포 부착 분석 (Cel l Biol abs , 미국)을 사용하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5 , 10 및 15 uM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 트립신 -EDTA로 세포를 회수하고 넁각시킨 PBS로 2회 세척하여 3000 rpm로 5분 동안 원심분리하였다. 또한, 동일한 개수의 세포를 피브로넥틴 ( f i bronect in) , 콜라겐 타입 Kcol lagen type I ) , 콜라겐 타입 IV( col lagen type IV) , 라미닌 ( laminin), 피브리노겐 ( f ibr inogen) 또는, BSA로 기질이 코팅된 웰에 첨가하고 90분 동안 37°C , .5% 이산화탄소 배양기에서 배양하여 세포를 배양판에 부착시켰다. 비-부착성 세포는 PBS로 세척하여 제거하였다. 부착성 세포는 세포 염색 용액을 처리하고, 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 정량하였다.
그 결과, 도 28에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 부착를이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 28) .
<실험예 14>토똑^ {Inula helenium) 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 침윤 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤의 세포 침윤 억제 효과를 확인하기 위하여, 24-웰 트랜스웰 챔버 (SPL , 한국)를 사용하여 폴리카보네이트 막 (8 μ Μ pore s i ze , Corning , NY , NY)을 통과하는 세포를 측정함으로써 평가하였다.
구체적으로, 상부 챔버 웰의 폴리카보네이트 막은 Matr ige K l nig/ , BD , 미국)으로 코팅하고 37°C에서 30분 동안 건조시켰다. 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10및 15 uM 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 트립신 -EDTA로 상기 세포를 회수하고 넁각시킨 PBS로 2회 세척하여 3000 rpm에서 5분 동안 원심분리 하였다. 상부 챔버 웰 당 5 X 104 농도로 세포를 첨가하고 37°C에서 24 시간 동안 배양한 후에, 막의 상부에서 침윤되지 않은 세포들을 면봉으로 닦아내고, 막을 통과하여 침윤한 세포들을 고정한 후에 2% 크리스탈 바이올렛 (cryst al vi ol et )으로 염색하였다. 상기 염색된 세포들은 광학현미경하에 무작위로 선택된 곳에서 계수하였다.
그 결과, 도 29에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포 침윤이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 29) .
<실험예 15>토목향 e/en/uro) 분획물로부터 분리된 알탄토락톤의 균집 형성 억제 효과 확인
토목향 분획물로부터 분라된 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 장기간의 효과를 확인하기 위하여, 균집 형성 억제 효과를 하기와 같은 방법을 수행하여 측정하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231인간 유방암 세포를 24-웰 배양판에 웰 당 500 세포 농도로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 쎄조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10및 15 uM농도로 24시간 동안 처리하고, 깨끗한 배지로 교체해 주었다. 균집이 형성될 때까지 상기 세포를 10일 내지 14일 동안 키우고, 균집이 형성되었을 때, 상기 세포를 고정하여 크리스탈 바이올렛 ( crystal viol et )을 사용하여 염색시킨 후 현미경에서 관찰하였다. 그 결과, 도 30에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때, 상기 세포의 균집 형성이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 억제되는 것올 확인하였다 (도 30) .
<실험예 16> 유방암 세포에서 토목향 ( ImiJa heleniwn) 분획물로부터 분리된 알란토락톤에 대한 M P-9의 활성 억제 확인
STAT3 표적 유전자의 하나인 MMP-9는 세포외 기질 단백질을 분해시키는 대표적인 효소로써, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에 처리하여 麗 P-9 활성 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은
방법으로 수행하였다.
구체적으로, MDA-MB-231인간 유방암 세포를 2 x 105세포 /웰로 희석하여 12-웰 배양판에 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 세럼 (serum)이 포함되지 않은 배지로 교체하였다. 그런 다음, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 5, 10및 15uM농도로 24시간 동안 처리하였다. 배양 배지를 모아서, 농축한 다음 0.1% 젤라틴을 포함하는 8% SDS-PAGE상에 로딩하고, 전기영동을 수행하였다. 젤을 2.5% Triton Χ-100 용액으로 30 분 동안 2회 세척하고, 50 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.6)로 30분간 세척하여 SDS를 제거한 후, 젤을 10 mM CaCl2 및 200 mM NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCKpH 그 6)를 사용하여 37°C에서 24 시간 동안 배양하여 젤라틴을 분해시켰다. 활성화된 젤을 45% 메탄올 및 10% 아세트산에서 0.11% 쿠마씨 블루 (Coomassie Blue) R-250으로 염색한 후, 45% 메탄을 및 10% 아세트산 용액으로 탈염색 하였다. 각 젤라티나아제의 젤라틴 분해 활성은 파란색 배경에 대한 깨끗한 밴드를 확인하여 검출하였다.
그 결과, 도 31에 나타낸 바와 같이, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB— 231 세포에 처리하였을 때, 상가 세포에서 MMP-9의 분해 활성이 억제되는 것을 확인하였다 (도 31).
<실험예 17> 유방암 세포에서 STAT3 조절 하위단계 유전자 발현 억제 확인
STAT3 활성은 세포 증식 (cell proliferation), 생존 (survival), 혈관 신생 (angiogenesis), 세포 주기 진행 (cell cycle progression) 및 세포 예정 사 (progra ed cell death)를 포함하는 여러 유전자의 활성을 조절한다고 보고되고 있다. 따라서, 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 MDA-MB-231인간 유방암 세포에 처리하여 STAT3표적 유전자의 발현을 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과 동일한 방법으로 배양한 MDA— MB-231인간 유방암 세포를 상기 <실시예 4>와 동일한 방법으로 세포 단백질을 수득하여 전기영동 하고, 분리된 단백질을 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 c-Myc (제품번호: ab, Abeam) , C0X-2(제품번호: sc-1745, Santacruz), Cyclin (제품번호: ab40754, Abeam) , VEGF (제품번호: ab51745, Abeam)및 CXCR4(제품번호: ab2074, Abeam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안 반웅시켰다. 멤브레인을 TBST로 10분간 3회씩 세척.한 후 HRP-결합 2차 항체 항 -rabbit (제품번호: sc-2004, Santacruz)를 1:1000의 비율로 희석하여 실은에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분간 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-1000(푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 (luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 -β-액틴 (actin) (제품번호: sc-47778, Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 β-액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 32에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4〉에 기재된 방법으로
제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 MDA-MB-231 인간 유방암 세포에서 c-Myc , COX-2 , Cycl in Dl , VEGF 및 CXCR4 유전자의 발현이 분획물로부터 분리된 알란토락톤 농도의존적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 32) .
<실험예 18>생체내 ( / 7 Vo)에서 토목향 ( //Mz/a Ae/en/ua?)으로부터 분리된 알란토락톤에 의한유방암세포성장 억제 확인
<18-1>동물사육
동물 사육과 모든 실험 절차는 서울대학교 동물실험윤리위원회의 승인과 절차에 따라서 진행되었다 (승인번호: 130417-5) . 실험 동물실 온도 23±3 °C , 습도 55 ±5 % 및 명암주기는 12시간으로 유지하고, 모든 실험동물은 실험동물실에서 1주일 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
<18-2> £목향 U w//a Ae/eo ^으로부터 분라된 할관토락톤에 의한 유방암종양억쩨 확인
생체내 /W)에서 토목향으로부터 분리된 알란토락톤의 항종양 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실험예 1>과동일한 방법으로 배양한 MDA-MB-231인간 유방암 세포를 트립신 -EDTA 용액을 이용하여 배양판 바닥으로부터 떼어낸 다음, DMEM에 상기 세포를 1 X 107 세포 /ml 농도가 되도록 희석하였다. 그런 다음, (주)나라바이오텍에서 구입한 암컷 BALB/c 면역 결핍 마우스 6주령 ( (주 )나라바이오텍, 한국) 우측 옆구리에 상기 세포를 약 200 ul 씩 피하주사하였다. 종양이 형성되도록 1 주일가량 유지시킨 후, 그룹당 개체수 6마리로 분리하여, 대조군 및 처리 군으로 나누었다. 대조군은 PBS로 처리하였고, 처리군은 상기 <실시예 4〉에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 2.5 mg/kg및 10 mg/kg농도로 이를에 '한번씩 복강 투여하였다. 상기 마우스의 무게 및 암의 크기는 이를마다 캘리퍼를 이용하여 측정하였다.
그 결과, 도 33에 나타낸 바와 같이, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 군과 대조군에서 종양 부피 및 종양 무게를 비교하였을 때, 상기 알란토락톤을 처리한 군에서 종양부피 및 종양 평균 무게가 유의적으로 낮은 것을 확인하였으며, 상기 마우스의 체중은 변화가 없는 것을 확인함으로써, 상기 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤은 독성을 가지고있지 않는 것을 확인하였다 (도 33) .
<18-3> 유방암 종양 조직에서 토목향 ( Jnu/a Ae/en/ )으로부터 분리된 알란토락톤에 의한 P-STAT3 및 Cycl ind Dl발현 억제 확인
상기 실험예 <18-2〉에 기재된 방법으로 유방암 세포를 이식한 마우스에 상기 <실시예 4〉와 동일한 '방법으로 제조한 토목향으로부터 분리된 알란토락톤을 처리하여 유방암 조직에서 상기 알란토락톤에 의해 P-STAT3 및 Cycl ind Dl 발현 억제를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 <18-2>에 기재된 방법으로 유방암 세포를 이식한 마우스의 조직을 적출하여 상기 <실험예 4>와 동일한 방법으로 조직 단백질을 수득하여 전기영동 하고, 분리된 단백질을 니트로셀를로오스 멤브레인에 전기적으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 후, 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 블로킹이 끝난 후, 1차 항체 Cyc l in (제품번호: ab40754, Abeam) 및 p-STAT3 Tyrosine 705 (제품번호: ab76315 , Abeam)를 1/1000로 희석하여 멤브레인과 4°C에서 하루 밤 동안. 반웅시켰다. 멤브레안을 TBST로 10분간 3회씩 세척한 후 HRP—결합 2차 항체 항 -rabbi t (제품번호: sc-2004 , Sant acruz)를 1 : 1000의 비율로 희석하여 실온에서 1시간 배양한 후 TBST로 10분갚 3회씩 세척하여 화학발광기질 시약을 처리하여 발생시켰다. LAS-100CX푸지필름)을 이용하여 생성된 발광 ( luminescence)을 검출하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 발현의 정도를 비교하기 위한 대조군으로, 항 - β -액틴 (act in) (제품번호: sc-47778ᅳ Santacruz)을 1차 항체로 사용하여 상기의 방법과 동일한 방법을 수행하여 -액틴의 발현을 확인하였다.
그 결과,도 34에 나타낸 바와 같어, 상기 <실시예 4>에 기재된 방법으로 제조한 토목향 분획물로부터 분리된 알란토락톤을 처리한 처리 군과 대조군의 조직에서 Cycl in D1 및 p-STAT3의 발현을 확인하였을 때, 상기 알란토락톤을 처리한 군의 조직에서 Cycl in D1 및 p-STAT3의 발현이 억제되는 것을 확인하였다 (도 34) .
Claims
【청구항 1】 _ 목향 InuJa helenhmd분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서ᅳ 상기 분획물은 토목향 추출물로부터 핵산 (hexane) , 메틸렌 클로라이드 (methylene chlor ide) , 부탄올 (butanol ) 또는 물로 순차적으로 분획하여 얻은 핵산 분획물, 메틸렌 클로라이드 분획물, 부탄을 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 2항에 있어서, 상기 추출물은 토목향을 물, d 내지 C2 저급 알코올 또는 이들의 흔합물을 용매로 하여 추출되는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄을 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5】
제 1항에 있어서, 토목향 분획물은 S†AT3억체활성을 갖는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 6】
하기 화학식 1로 표시되는 알란토락톤 (Alantolactone , C15H2002) 또는 화학식 2로 표시되는 이소알란토락톤 ( Isoalantol actone , Ci5H2002)을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물:
[화학식 1]
【청구항 7】
제 6항에 있어서, 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 토목향 분획물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 8】
제 6항에 있어서, 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 STAT3 억제 활성을 하는 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 9]
제 1항 내지 제 8항에 있어서, 상기 유방암은 STAT3 과발현 유방암인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 10】
제 9항에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 11】
토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 12】
알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 약학적 조성물.
【청구항 13】
토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강식품.
【청구항 14】
알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 및 개선용 건강식품.
【청구항 15】
제 14항에 있어서, 상기 유방암은 삼중음성유방암인 것을 특징으로 하는 유방암 예방 및 개선용 건강식품.
[청구항 16】
토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강식품.
【청구항 17】
알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 유방암 전이 억제용 건강식품.
【청구항 18】
토목향 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제.
【청구항 19】
제 18항에 있어서, 상기 토목향 분획물은 항암제와 병용 처리되는 것을 특징으로 하는 항암 보조제 .
【청구항 20】 ᅳ
제 19항에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴 (cisplatin), 캄포테신
(camptothecin), 플루오로우라실 (f luorouracil) , 파클리탁셀 (pacl itaxel) , 도세탁셀 (docetaxel), 이마티닙 ( imat inib), 제피티님 (gefitinib),
베바시주맙 (bevac i zumab) , 빈블라스틴 (vinblast ine), 빈크리스틴 (vincr i st ine), 허셉틴 (hercept in) , 독소루비신 (doxorubicin) 및 에토포사이드 (etopos ide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것올 특징으로 하는 항암 보조제.
[청구항 21】
알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 유효성분으로 함유하는 항암 보조제 .
【청구항 22】
제 21항에 있어서, 상기 알란토락톤 또는 이소알란토락톤은 항암제와 병용 처리되는 것을 특징으로하는 항암 보조체.
【청구항 23】
약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 치료 방법 .
[청구항 24】
약학적으로 유효한 양의 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 치료 방법.
【청구항 25】
약학적으로 유효한 양의 토목향 분획물을 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전이 억제 방법.
[청구항 26】
약학적으로 유효한 양의 알란토탁톤 또는 이소알란토락톤올 암에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함한 유방암 전어 억제 방법.
【청구항 27】
유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도.
【청구항 28】
유방암 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도.
【청구항 29】
유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도.
【청구항 30】
유방암 전이 억제용 약학적 조성물로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도.
[청구항 31】
유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도.
【청구항 32】
유방암 예방 및 개선용 건강기능식품으로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도.
【청구항 33】
유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도.
【청구항 34】
유방암 전이 억제용 건강기능식품으로 사용하기, 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도.
【청구항 35】
항암 보조제로 사용하기 위한 토목향 분획물의 용도.
【청구항 36】
항암 보조제로 사용하기 위한 알란토락톤 또는 이소알란토락톤의 용도.
Applications Claiming Priority (4)
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106866955A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-06-20 | 石家庄学院 | 一种含有聚乙二醇基的异土木香内酯衍生物及其制备和应用 |
CN107445931A (zh) * | 2016-05-30 | 2017-12-08 | 天津尚德药缘科技股份有限公司 | 土木香内酯衍生物,其药物组合物及其制备方法和用途 |
CN108653275A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-10-16 | 山东大学 | 依瓦菊内酯在制备抗乳腺癌侵袭转移药物中的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20040107185A (ko) * | 2003-06-13 | 2004-12-20 | 이상국 | 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 포함하는 암 또는염증질환 예방 및 치료용 조성물 |
KR20120092281A (ko) * | 2011-02-11 | 2012-08-21 | 주식회사한국전통의학연구소 | 토목향 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 화장료 조성물 |
KR20130022393A (ko) * | 2011-08-26 | 2013-03-06 | 주식회사한국전통의학연구소 | 토목향 추출물을 포함하는 췌장암 치료용 조성물 및 화장료 조성물 |
-
2015
- 2015-02-25 WO PCT/KR2015/001831 patent/WO2015130081A1/ko active Application Filing
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20040107185A (ko) * | 2003-06-13 | 2004-12-20 | 이상국 | 알란토락톤 또는 이소알란토락톤을 포함하는 암 또는염증질환 예방 및 치료용 조성물 |
KR20120092281A (ko) * | 2011-02-11 | 2012-08-21 | 주식회사한국전통의학연구소 | 토목향 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 화장료 조성물 |
KR20130022393A (ko) * | 2011-08-26 | 2013-03-06 | 주식회사한국전통의학연구소 | 토목향 추출물을 포함하는 췌장암 치료용 조성물 및 화장료 조성물 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DORN, DAVID C. ET AL.: "Tumor cell Specific Toxicity of Inula helenium Extracts.", PHYTOTHERAPY RESEARCH, vol. 20, 2006, pages 970 - 980, XP055220162 * |
KONISHI, TENJI ET AL.: "Antiproliferative Sesquiterpene lactones from the Roots of Inula helenium.", BIOLOGICAL AND PHARMACEUTICAL BUILETIN., vol. 25, no. 10, 2002, pages 1370 - 1372, XP002372794 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107445931A (zh) * | 2016-05-30 | 2017-12-08 | 天津尚德药缘科技股份有限公司 | 土木香内酯衍生物,其药物组合物及其制备方法和用途 |
CN106866955A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-06-20 | 石家庄学院 | 一种含有聚乙二醇基的异土木香内酯衍生物及其制备和应用 |
CN106866955B (zh) * | 2017-01-16 | 2019-07-30 | 石家庄学院 | 一种含有聚乙二醇基的异土木香内酯衍生物及其制备和应用 |
CN108653275A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-10-16 | 山东大学 | 依瓦菊内酯在制备抗乳腺癌侵袭转移药物中的应用 |
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