[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2015170914A1 - 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법 - Google Patents

젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2015170914A1
WO2015170914A1 PCT/KR2015/004600 KR2015004600W WO2015170914A1 WO 2015170914 A1 WO2015170914 A1 WO 2015170914A1 KR 2015004600 W KR2015004600 W KR 2015004600W WO 2015170914 A1 WO2015170914 A1 WO 2015170914A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lactic acid
pdc5
seq
activity
pdc1
Prior art date
Application number
PCT/KR2015/004600
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
양은빈
이태희
김선혜
송규현
하철웅
나경수
양영렬
강민선
이효형
Original Assignee
씨제이제일제당 (주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to SG11201609397WA priority Critical patent/SG11201609397WA/en
Application filed by 씨제이제일제당 (주) filed Critical 씨제이제일제당 (주)
Priority to BR112016026286-7A priority patent/BR112016026286B1/pt
Priority to AU2015249090A priority patent/AU2015249090B2/en
Priority to JP2015563134A priority patent/JP6087451B2/ja
Priority to US14/783,012 priority patent/US20170175150A1/en
Priority to EP15739495.8A priority patent/EP2960326B1/en
Priority to RU2015130528A priority patent/RU2636467C2/ru
Priority to PL15739495T priority patent/PL2960326T3/pl
Priority to MYPI2016001969A priority patent/MY172440A/en
Priority to CN201580030614.7A priority patent/CN106459881B/zh
Priority to UAA201507617A priority patent/UA118022C2/uk
Publication of WO2015170914A1 publication Critical patent/WO2015170914A1/ko
Priority to US15/918,995 priority patent/US20180201960A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01028—D-Lactate dehydrogenase (1.1.1.28)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01001—Pyruvate decarboxylase (4.1.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01001—Acetate-CoA ligase (6.2.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant Saccharomyces sp. Microorganism producing lactic acid and a method of culturing the microorganism to produce lactic acid from the culture medium.
  • Lactic acid is not only commonly used as food additives such as food preservatives, odorants or acidulants, but is also an important organic acid widely used industrially in cosmetics, chemicals, metals, electronics, textiles, dyeing, pharmaceuticals and the like.
  • lactic acid is used as a raw material of polylactic acid, which is a kind of biodegradable plastics, and thus the demand for lactic acid is greatly increased.
  • Lactic acid is an important raw material that produces compounds such as acetaldehyde, polypropylene glycol, acrylic acid, and 2,3-pentathione, as well as polylactic acid.
  • D-type lactic acid is an optical isomer required for producing high heat resistant PLA and is a raw material for producing a so-called stereocomplex PLA.
  • lactic acid is produced by chemical synthesis method, it is produced in the form of racemic mixture containing 50% of D-type and L-type lactic acid, and it is impossible to control the composition ratio.
  • chemical synthesis method it is produced in the form of racemic mixture containing 50% of D-type and L-type lactic acid, and it is impossible to control the composition ratio.
  • the biological fermentation method using microorganisms can be selectively produced only l-type lactic acid according to the strain used, the latter biological fermentation method that can produce lactic acid of a specific isoform is preferred.
  • the present inventors tried to obtain microorganisms with low PDC titer but improved cell growth and improved lactic acid production ability.
  • the present inventors regulated the activity of PDC isotypes, aldehyde dehydrogenase (ALD) and acetyl-CoA synthetase (
  • ALD aldehyde dehydrogenase
  • ACS acetyl-CoA synthetase
  • One object of the present invention is to provide a Saccharomyces sp. Microorganism with improved lactic acid production.
  • Another object of the present invention to provide a method for producing lactic acid by using the microorganism of the genus Saccharomyces.
  • the present invention relates to the use of microorganisms with improved lactic acid fermentation production ability by regulating the activity of PDC isotypes and increasing the activity of aldehyde dehydrogenase (ALD) and acetyl-CoA synthetase (ACS). It can be widely used in the field of lactic acid fermentation production.
  • ALD aldehyde dehydrogenase
  • ACS acetyl-CoA synthetase
  • 1 is a diagram illustrating the relationship between the lactic acid production pathway, alcohol fermentation pathway and acetyl-CoA production pathway of Saccharomyces spp.
  • the present invention (a) the activity of pyruvate decarboxylase (PDC) is weakened compared to the non-mutated lactic acid producing strain; And (b) Saccharomyces genus with enhanced lactic acid production, in which the activity of aldehyde dehydrogenase (ALD) and acetyl-CoA synthetase (ACS) is enhanced compared to unmutated lactic acid producing strains. Saccharomyces sp. ) Provides microorganisms.
  • microorganisms of the genus Saccharomyces that produce lactic acid are produced through pyruvate-based lactate dehydrogenase (LDH).
  • LDH lactate dehydrogenase
  • Other pathways with pyruvate as a common substrate were blocked, typically the Ethanol ethanol fermentation pathway and the acetyl-CoA production pathway.
  • attenuating PDC activity may help to improve lactic acid production and yield, but if it exceeds a certain level, it is difficult to secure cytosolic acetyl-CoA, and thus cell growth is impossible and normal fermentation has not been achieved.
  • the present inventors have developed a microorganism of the genus Saccharomyces with increased lactic acid productivity by improving lactic acid productivity yield and maintaining cell growth rate and improving overall lactic acid fermentation productivity through a method of maintaining a minimum acetyl-CoA production pathway. .
  • pyruvate decarboxylase refers to a protein having an activity of mediating a reaction of producing carbonic acid and acetaldehyde by acting on pyruvate, and in the present invention, It is not limited to one derivative or isotype.
  • the protein is known to be involved in one step of alcohol fermentation and is known to be present mainly in yeast or plants.
  • the pyruvate decarboxylase of the present invention may be inherently present in Saccharomyces sp. Microorganisms, and may be PDC1, PDC5 and / or PDC6, specifically PDC1, PDC5 and / or Saccharomyces cerevisiae. Or PDC6, but is not limited thereto.
  • the protein sequence may be obtained from a known database and the like, but may be, for example, GenBank of NCBI, but is not limited thereto.
  • PDC1 may be an amino acid sequence of SEQ ID NO: 71
  • PDC5 may be an amino acid sequence of SEQ ID NO: 72
  • PDC6 may be composed of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 73, amino acids having at least 70% homology with each of the sequences listed above Sequences, specifically amino acid sequences having at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, even more specifically at least 95% homology.
  • variants of the base sequences encoding the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy are also included in the present invention.
  • the term “homology” refers to a degree of similarity between a plurality of nucleotide sequences or a plurality of amino acid sequences, and indicates a sequence having the same sequence as the amino acid sequence or the nucleotide sequence of the present invention or more than the above probability. Unit. Such homology may be determined by visual comparison of the two sequences, but may be determined using a readily available sequence comparison program that analyzes the degree of homology by arranging the sequences to be compared side by side. Sequence comparison programs readily available in the art include software including FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST and CLUSTAL W.
  • Another way to attenuate PDC activity is to create double-defective strains with simultaneous deletion of the PDC1 and PDC5 genes responsible for major PDC titers in yeast.
  • lactic acid can be fermented to sugar sources such as glucose without acetic acid or ethanol subsidiary substrate, but the rapid decrease in PDC titer slows down the growth rate of the cells and thus decreases the fermentation productivity (Biosci Biotechnol Biochem. 2006, 70 (5). ): 1148-1153).
  • the weakening of pyruvate decarboxylase (PDC) of the present invention comprises: i) inactivating the activity of PDC1 and weakening the activity of PDC5; Or ii) weakening the activity of PDC1 and inactivating the activity of PDC5.
  • a strain in the base Saccharomyces cerevisiae inactivated PDC1 a strain that attenuates the activity of PDC5 by replacing the promoter of the PDC5 gene, recovering the activity of PDC1 PDC5 Deleted strains, strains double-deleted PDC1 and PDC5 and strains triple-deleted PDC1, PDC5 and PDC6 were prepared. Of these, the triple-defect strain was confirmed that little growth of the cells.
  • aldehyde dehydrogenase refers to a protein having an activity of generating acetic acid in acetaldehyde, mainly a protein having an activity of oxidizing an aldehyde to generate a carboxylic acid or an acyl group. In the present invention, so long as it has the above activity, it is not limited to derived or isotype.
  • the aldehyde dehydrogenase of the present invention may be derived from Saccharomyces sp. Microorganism, and may be ALD2 and / or ALD3.
  • ALD2 and / or ALD3 may Saccharomyces cerevisiae, but is not limited thereto, and may include all of its variants or analogs as long as they have biologically the same or corresponding activity as the protein.
  • the protein sequence may be obtained from a known database and the like, but may be, for example, GenBank of NCBI, but is not limited thereto.
  • ALD2 may be an amino acid sequence of SEQ ID NO: 74
  • ALD3 may be composed of an amino acid sequence of SEQ ID NO: 75, an amino acid sequence having at least 70% homology with each of the sequences listed above, specifically 80% or more homology , More specifically, at least 90% homology, even more specifically at least 95% homology.
  • variants of the base sequences encoding the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy are also included in the present invention.
  • acetyl-CoA synthetase means a protein having an activity that catalyzes the thioesterification reaction of acetic acid and CoA by conjugation with ATP degradation reaction. As long as it has activity, it is not limited to a derivative or an isotype. It is also known to exist in microorganisms, plants and animals.
  • the aldehyde dehydrogenase of the present invention may be derived from Saccharomyces sp. Microorganism, and may be ACS1.
  • the ACS1 may be ACS1 to Saccharomyces cerevisiae, but is not limited thereto, and may include all of its variants or analogs as long as they have biologically the same or corresponding activity as the protein.
  • the protein sequence may be obtained from a known database and the like, but may be, for example, GenBank of NCBI, but is not limited thereto.
  • the ACS1 may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 76, an amino acid sequence having at least 70% homology with the sequence, specifically 80% or more homology, more specifically 90% or more homology, even more specific And amino acid sequences having at least 95% homology.
  • variants of the base sequences encoding the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy are also included in the present invention.
  • non-mutant microorganisms based on a strain that attenuates the activity of the PDC than non-mutant microorganisms were prepared strains to enhance the activity of the ALD2 or ALD3 and enhance the activity of ACS.
  • a strain that inactivates PDC1 through deletion and replaces the promoter of the PDC5 gene with a promoter with low expression ability to attenuate the activity of PDC5 was prepared to enhance the activity of ALD and ACS.
  • microorganisms of the genus Saccharomyces were prepared that inactivated the activity of PDC1, attenuated the activity of PDC5, enhanced one or more activities selected from the group consisting of ALD2 and ALD3, and enhanced the activity of ACS1. Accordingly, it was confirmed that the growth rate, D-lactic acid production and yield are significantly improved.
  • activation of the enzyme activity includes all methods for inactivating the activity of the enzyme so that the enzyme is not expressed, or the enzyme is not able to exhibit the original activity.
  • the methods may be deletion of part or all of a gene by homologous recombination, inhibition of enzyme expression by insertion of an exogenous gene into the gene, inhibition of expression through substitution or modification of a promoter sequence of the enzyme gene, or substitution of the enzyme. Or there may be a mutation to an inert enzyme that lost its original function through the modification, but is not limited thereto.
  • the "attenuation" of the enzyme activity is a method of weakening the activity of the enzyme, and includes all the methods of reducing the amount of expression of the enzyme or reducing the activity of the expressed enzyme.
  • the methods may include, but are not limited to, expression reduction through substitution or modification of a promoter sequence of the enzyme gene, or a change to an enzyme whose activity is reduced through the substitution or modification of the enzyme.
  • enhancing the activity of an enzyme introduces a plasmid containing a gene of the enzyme, increases the copy number of a gene encoding the enzyme on a chromosome, or replaces or modifies a promoter sequence of a gene of the enzyme. Or increase in enzyme activity due to mutation, but is not limited thereto.
  • yeast microorganism refers to a microorganism belonging to a fungus which is proliferated by budding, and is not limited as long as it includes the lactic acid production route, alcohol production route and / or acetyl-CoA production route.
  • Yeast microorganisms are divided into "saccharomyces genus”, “pchia genus”, “candida genus”, and “saccharomycoccus genus” by form, and specifically, in the present invention, “saccharomyces” including various species. Seth "microorganisms can be utilized.
  • the microorganisms of the genus Saccharomyces are Saccharomyces bayanus , Saccharomyces boulardii , Saccharomyces bulderi , Saccharomyces cariocanus (Saccharomyces cariocanus), saccharose in my process karioh carcass (Saccharomyces cariocus), as in my process serenity busy as Saccharomyces (Saccharomyces cerevisiae), saccharose in my process Ciba Rie Lee (Saccharomyces chevalieri), Saccharomyces Damai access seven days norbornene sheath (Saccharomyces dairenensis ), Saccharomyces ellipsoideus , Saccharomyces eubayanus , Saccharomyces exiguus , Saccharomyces florentinus Saccharomyces florentinus Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces
  • the inventors of the present invention confirmed that the production of microorganisms with reduced PDC activity and enhanced ALD and ACS activity in Saccharomyces cerevisiae resulted in a significant increase in lactic acid production.
  • the microorganism of the present invention may be further inactivated alcohol dehydrogenase (ADH).
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • Alcohol dehydrogenase refers to a protein having the activity of reversibly catalyzing the reaction of releasing hydrogen from alcohol to produce aldehydes or ketones. It is not limited to b isotypes.
  • Alcohol dehydrogenase of the present invention may be derived from Saccharomyces sp. Microorganism, it may be ADH1. Specifically, it may be ADH1 to Saccharomyces cerevisiae, but is not limited thereto and may include all of its variant analogs and the like as long as it has biologically the same or corresponding activity as the protein.
  • the protein sequence may be obtained from a known database and the like, but may be, for example, GenBank of NCBI, but is not limited thereto.
  • the ADH1 may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 77, an amino acid sequence having at least 70% homology with the sequence, specifically, at least 80% homology, more specifically at least 90% homology, even more specific And amino acid sequences having at least 95% homology.
  • variants of the base sequences encoding the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy are also included in the present invention.
  • the microorganism of the present invention may be further inactivated D-lactate dehydrogenase (DLD).
  • DLD D-lactate dehydrogenase
  • D-lactate dehydrogenase refers to a protein having an activity of generating pyruvate by dehydrogenating D-lactic acid, and in the present invention, a derivative or subtype thereof. It is not limited to (isotype).
  • D-lactic acid dehydrogenase of the present invention may be derived from Saccharomyces sp. Specifically, it may be DLD1 to Saccharomyces cerevisiae, but is not limited thereto, and may include all of its variant analogs and the like as long as it has biologically the same or corresponding activity as the protein.
  • the protein sequence may be obtained from a known database and the like, but may be, for example, GenBank of NCBI, but is not limited thereto.
  • the DLD1 may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 78, an amino acid sequence having 70% or more homology with the sequence, specifically 80% or more homology, more specifically 90% or more homology, even more specific And amino acid sequences having at least 95% homology.
  • variants of the base sequences encoding the same amino acid sequence due to genetic code degeneracy are also included in the present invention.
  • an additional strain was used to delete the ADH1 acting on the alcohol fermentation pathway using the aldehyde generated from pyruvate as a substrate and the DLD1, an enzyme that degrades the resulting D-lactic acid. This is to clearly measure the change in lactic acid fermentation ability according to the control.
  • the strains of the present invention that controlled the activity of PDC and ALD and ACS prepared in specific examples of the present invention showed significantly enhanced lactic acid fermentation production capacity (Table 12).
  • Another aspect of the present invention provides a method for producing lactic acid using the microorganism of the present invention.
  • culturing the microorganism of the present invention in a culture medium as a specific example of the present invention provides a lactic acid production method comprising the step of recovering lactic acid from the culture medium of the step.
  • the culturing process of the present invention can be made according to the appropriate medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the strain selected. Examples of the culture method include, but are not limited to, batch, continuous and fed-batch cultivation. The medium used for cultivation should suitably meet the requirements of the particular strain.
  • sucrose or glucose is used as the main carbon source
  • molasses containing a large amount of sucrose may also be used as the carbon source
  • other appropriate amounts of the carbon source may be used in various ways.
  • nitrogen sources that can be used are organic nitrogen sources and urea such as peptone, yeast extract, gravy, malt extract, corn steep liquor, and soybean wheat, mineral nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, anmonium carbonate, and ammonium nitrate This may be included. These nitrogen sources may be used alone or in combination.
  • the medium may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salts as personnel. It may also include metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate.
  • amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added batchwise or continuously to the culture.
  • compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • antifoaming agents such as fatty acid polyglycol esters can be used to suppress bubble generation.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without injecting gas to maintain anaerobic and unaerobic conditions.
  • the temperature of the culture can usually be 20 ° C to 40 ° C, specifically 25 ° C to 35 ° C, more specifically 30 ° C.
  • the incubation period can continue until the desired amount of useful substance is reached, specifically 10 to 100 hours.
  • the lactic acid produced in the culturing step of the present invention can be recovered from the culture solution using a suitable method known in the art according to the culture method, for example, batch, continuous or fed-batch culture method.
  • Example 1 Preparation of lactic acid producing strain
  • alcohol dehydrogenase 1 ADH1
  • PDC1 pyruvate decarboxylase 1
  • DLD1 D-lactic acid degradation Strains deficient in D-lactate dehydrogenase 1 (DLD1) were used as base strains of the present invention for blocking the pathway.
  • DLD1 is not a factor that directly affects growth, but it is known as a major enzyme that converts pyruvate using NAD + as a dehydrogenase of type D lactic acid. Therefore, a subsequent strain was prepared based on the strain lacking the DLD1 gene, which is an enzyme consuming lactate produced, to compare the fermentation productivity of the D-type lactic acid producing yeast to be produced in the present invention, and compared the fermentation productivity.
  • Genetic engineering of the present invention used a general molecular cloning method.
  • HIS3 marker gene was introduced into a double crossover for deletion of the gene of DLD1.
  • DNA fragments used herein were prepared using primers of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10.
  • the primers used for the genetic manipulation are summarized in Table 1 below.
  • ADH1 upstream forward primer (SEQ ID NO: 1) CGGGATCCACTGTAGCCCTAGACTTGATAGCC ADH1 upstream reverse primer (SEQ ID NO: 2) ATAAGAATGCGGCCGCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGCTT ADH1 downstream forward primer (SEQ ID NO: 3) GACTAGTGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATT ADH1 downstream reverse primer (SEQ ID NO: 4)
  • ACATGCCATGgAAGCATGCACGTATACACTTGAGTAA PDC1 upstream forward primer (SEQ ID NO: 5) CGGGATCCATTATGTATGCTCTTCTGACTTTTCGT PDC1 upstream reverse primer (SEQ ID NO: 6) ATAAGAATGCGGCCGCTTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC PDC1 downstream forward primer (SEQ ID NO: 7) CGGGATCCGCGATTTAATCTCTAATTATTAGTTAAAG PDC1 downstream reverse primer
  • D-lactate dehydrogenase (D-LDH), a gene for lactic acid production, was introduced.
  • the p413TEF1 vector was cloned with restriction enzyme sites of Xho I and Spe I at the 5 'and 3' ends, respectively, to contain the ldhD gene from Lb. plantarum between the TEF1 promoter from S.cerevisiae and the CYC1 terminator.
  • inserts were prepared by double cutting of Sac I / Pvu II.
  • the vector was made blunt end with Mungbean nuclease from DNA fragment double cut with BamHI / NotI at p- ⁇ -neo, and then treated with SacI to make a vector part with SacI sticky end and BamHI-derived blunt end.
  • pTL573 vector was completed by ligation of the vector and insert obtained by the above procedure.
  • pTL573 plasmid was identified as Lb. It contains a plantarum-derived ldhD gene and is designed to randomly insert multiple copies into ⁇ -sequence, a region of the retrotransposable element of the S. cerevisiae CEN.PK2-1D pdc1 ⁇ adh1 ⁇ dld1 ⁇ strain.
  • plasmid pTL573 was digested with Sal I restriction enzyme to construct a DNA fragment that induces a single crossover on ⁇ -sequence.
  • Example 1 Based on the CC02-0064 strain prepared in Example 1 was prepared a variant strain substituted for the promoter of PDC5. Cassette fabrication and strain selection were performed using the method described in Lee TH et al. (Development of reusable split URA3-marked knockout vectors for budding yeast, Saccharomyces cerevisiae . J Microbiol Biotechnol, 2006, 16: 979-982). .
  • a total of five novel strains in which the promoters of PDC5 of the CC02-0064 strain were substituted with the SCO1, SCO2, ACS1, IDP2, and FBA1 promoters were prepared.
  • a promoter substitution cassette was prepared using primers SEQ ID NO: 11 to SEQ ID NO: 36. was produced.
  • the primers used for the promoter substitution are summarized in Table 2 below.
  • the novel strain produced as above was named CC02-0167, CC02-0168, CC02-0169, CC02-0170, CC02-0174.
  • the strains and genetic traits are summarized in Table 3 below.
  • Lactic acid fermentation was evaluated for the PDC5 promoter mutant strain prepared in Example 2. To this end, a lactic acid fermentation evaluation medium was prepared.
  • the amino acid dropout mix (Sigma) is mixed according to the manufacturer's protocol to produce SC media (Synthetic Complex media), a yeast restriction medium. , Excluded amino acids were added. Leucine was added at 380 mg / L, uracil, tryptophan and histidine at 76 mg / L, and 8% glucose as carbon source and 1% CaCO 3 as neutralizer were added. The medium thus prepared was used for yeast strain lactic acid fermentation evaluation.
  • strain CC02-0174 in which PDC was replaced with a FBA1 promoter in the wild-type PDC5 promoter among the pathways that promote the production of acetyl-CoA, the cell growth rate and lactate productivity than the original strain (CC02-0064) It confirmed that this improved.
  • it is possible to increase cell growth rate and lactic acid productivity over time by simply strengthening the titer of PDC alone without enhancing the lower ALD and ACS in the acetyl-CoA production pathway. It was also confirmed that this is continuously decreasing.
  • the improvement of glucose consumption by PDC potency enhancement was 10.3% and the maximum lactic acid production concentration was 47.3 g / l.
  • the final lactic acid productivity improvement at this time was about 13.7%.
  • a PDC5 deletion cassette was prepared using primers SEQ ID NOs: 37 to 40 for deletion of the PDC5 gene based on the CC02-0064 strain, and the deletion strain was produced by the same method as the literature described in Example 1. .
  • a summary of the primers used in this is shown in Table 5 below.
  • the PDC5 deficient strain thus produced was named CC02-0450 (CC02-0064, pdc5 ⁇ ).
  • Example 4 Based on the CC02-0450 strain prepared in Example 4 was prepared strain replacing the PDC1 promoter. For this purpose, CC02-0451 (CC02-0450, PDC1p-PDC1), a comparative group that recovered PDC1 deficiency, was prepared, and CC02-0452 (CC02-0450, IDP1p-PDC1), a PDC1 weakened strain, was prepared as an experimental group.
  • Each strain was constructed by inserting the pRS406-PDC1p-PDC1-CYC1t and pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1t vectors, which cloned the target gene cassette into the pRS406 vector without the origin of replication in yeast.
  • PCR was carried out using primers of SEQ ID NOs: 41 and 42, using the chromosomal DNA of yeast as a template, to obtain a product containing the PDC1 gene, and the sequences of the CYC1 terminator were obtained using SEQ ID NOs: 43 and 44. .
  • PCR using each of them as a template was performed again using the primers SEQ ID NO: 41 and 44 to obtain DNA fragments to which the PDC1 and CYC1 terminators were linked.
  • the DNA fragment of the PDC1-CYC1 terminator and the pRS406 vector were treated with pRS406, SpeI, and XhoI restriction enzymes to obtain a pRS406-PDC1-CYC1t plasmid.
  • PCR was performed using yeast chromosomal DNA as a template by combining primers of SEQ ID NOs: 45 and 46 and primers of SEQ ID NOs: 47 and 48, respectively, for the PDC1 promoter and the IDP2 promoter.
  • the two plasmids prepared above were cut into StuI and introduced into the strains, respectively.
  • the completed strains were named CC02-0451 (CC02-0450, PDC1p-PDC1) and CC02-0452 (CC02-0450, IDP2p-PDC1), respectively. It was.
  • the prepared strains and genotypes are summarized in Table 7 below.
  • PDC1 alone deletion, PDC1 and PDC5 double deletion and PDC1, PDC5 and PDC6 triple deletion strains were made from the PDC family gene.
  • the base strain CC02-0064 prepared in Example 1 was used as the PDC1 alone deletion strain.
  • the PDC5 deletion cassette was prepared using primers SEQ ID NOs: 49 to 56, and introduced into CC02-0064 to produce PDC1 and PDC5 double deletion strains, which were named CC02-0256.
  • PDC1, PDC5 and PDC6 triple deletion strains were prepared using SEQ ID NOs: 57 to 64 based on the PDC1 and PDC5 double deletion strains, CC02-0256, and named them CC02-0257.
  • the deletion cassette production and strain selection process was prepared in the same manner as the literature described in Example 1.
  • the primers used therein are summarized in Table 8 below.
  • strains overexpressing ALD and ACS1 In order to prepare strains overexpressing ALD and ACS1, overexpressing plasmids of ALD2, ALD3 and ACS1 were prepared.
  • the ORF of ACS1 was taken to produce p415ADH-ALD2, p415ADH-ALD3, p414ADH-ACS1 and p416ADH-ACS1, which were recombinant vectors based on p414ADH, p415ADH and p416ADH plasmids using SpeI and XhoI or EcoRI restriction enzymes.
  • the primers used therein are summarized in Table 10 below.
  • the recombinant plasmid thus prepared was transformed into p415ADH-ALD2, p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD3, p414ADH- in strains CC02-0064, CC02-0168, CC02-0170, CC02-0256, CC02-0257, CC02-0451, and CC02-0452.
  • ACS1 combination, p415ADH-ALD2, p416ADH-ACS1 combination or p415ADH-ALD3, p416ADH-ACS1 combination were introduced using yeast transformation.
  • no transformant was obtained in the triple-defective CC02-0257 strain without PDC titer.
  • Example 7 The lactic acid fermentation ability of the ALD and ACS1 fortified strains prepared in Example 7 was evaluated.
  • the lactic acid fermentation evaluation medium prepared in Example 3 was dispensed at 25 ml per flask, inoculated with yeast, incubated for 71 hours at 30 ° C., and then analyzed by HPLC for the amount of type D lactic acid present in the fermentation broth.
  • the amount of acetic acid was analyzed by enzyme (Acetic acid, R-Biopharm, Germany).
  • the CC02-0277 and CC02-0278 strains which enhanced ALD and ACS based on the CC02-0170 strain, which replaced the PDC5 promoter with the IDP2 promoter, showed growth rate, D-lactic acid production production concentration, yield, and fermentation by enhancing ALD and ACS. It was confirmed that the productivity was improved.
  • the strain that weakened the expression of PDC5 with the IDP2 promoter showed a decrease in acetate by-product accumulation and a 1.3-fold increase in final OD compared to the strain in which PDC5 was normally expressed.
  • ALD and ACS were simultaneously controlled under the control of the ADH1 promoter. It was confirmed that the amount of sugar consumption and the rate of sugar consumption during expression increased and finally the yield increased from 56% or 59% to 66% or 67%.
  • the strains double-deleted PDC1 and PDC5 was clearly a decrease in acetic acid, but a decrease in the lactic acid production concentration due to the decrease in cell growth and sugar consumption was observed.
  • the strains in which PDC1 and PDC5 were double-deleted and the PDC pathway was almost inactivated did not improve cell growth, sugar consumption, and productivity even by enhancing ALD and ACS.
  • the pyruvate decarboxylase (PDC) pathway of the present invention is weakened and the aldehyde dehydrogenase (ALD) activity and acetyl-CoA synthase (ACS) activity is modified to improve compared to the non-mutant strain.
  • ALD aldehyde dehydrogenase
  • ACS acetyl-CoA synthase

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 피루베이트 탈탄산효소(pyruvate decarboxylase, PDC)의 활성이 약화되고; 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase, ALD) 및 acetyl-CoA 합성 효소(acetyl-CoA synthetase, ACS)의 활성이 증진된 젖산을 생산하는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 젖산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법
본 발명은 젖산을 생산하는 재조합 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물 및 상기 미생물을 배양하여 그 배양액으로부터 젖산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
젖산은 일반적으로 식품 보존제, 향취제 또는 산미제 등의 식품 첨가제로 사용될 뿐만 아니라 화장품, 화학, 금속, 전자, 직물, 염색, 제약 등 산업적으로 광범위하게 이용되는 중요한 유기산이다. 뿐만 아니라 젖산은 생분해성 플라스틱의 일종인 폴리락틱액시드의 원료물질로도 사용되므로, 젖산의 수요가 크게 증가하는 추세이다. 젖산은 폴리락틱액시드 뿐만 아니라 아세트알데히드(acetaldehyde), 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 아크릴산(acrylic acid), 2,3-펜타디온(2,3-pentathione) 등의 화합물을 생산하는 중요한 원료 물질로도 사용된다. 특히, D형의 젖산은 고내열성 PLA 생산에 필요한 광학적 이성질체로서 이른바 스테레오복합체 PLA (Streocomplex PLA)를 생산하는데 필요한 원료이다.
구체적으로 젖산을 생산하는 방법으로는 전통적인 화학합성법과 생물학적 발효법이 있다. 화학합성법을 이용하여 젖산을 생산할 경우, D형 젖산과 L형 젖산이 50%씩 섞여있는 라세믹(racemic) 혼합물 형태로 생성되고 조성비 조절이 불가능하여 폴리유산을 제조할 경우 용융점이 낮은 무정형의 고분자가 되어 용도 개발 시에도 제한이 많다. 반면, 미생물을 이용한 생물학적 발효법의 경우 사용하는 균주에 따라서 D형 또는 L형의 젖산만을 선택적으로 생산할 수 있어, 상업적으로는 특정 isoform의 젖산을 생산할 수 있는 후자의 생물학적 발효법이 선호된다.
한편, D형 젖산 전환효소의 유전자를 도입함으로써 D형 젖산 생산능이 부여된 사카로마이세스 속 미생물을 기반으로 각종 유전자 조작을 통하여 젖산의 생산율을 높이는 시도가 있어왔다. 구체적으로, 피루베이트 탈탄산효소(pyruvate decarboxylase, PDC), 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase, ALD) 및/또는 acetyl-CoA 합성 효소(acetyl-CoA synthetase, ACS)를 결손시키고 젖산 탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH)를 강화하여 젖산의 생산을 높이는 시도들이 있어 왔다(미국 공개특허 제2012-021421호, 미국 공개특허 제2010-0248233호, 미국 공개특허 제2006-0148050호). 그러나 상기 젖산 생산 균주는 세포성장이 더뎌짐에 따라 전체적인 발효 생산성이 낮았다.
본 발명자들은 PDC 역가를 낮추되 세포 성장이 원활하게 이루어져 젖산 생산능이 개선된 미생물을 얻고자 노력한 결과, PDC isotype들의 활성을 조절하고, 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase, ALD) 및 acetyl-CoA 합성 효소(acetyl-CoA synthetase, ACS)의 활성을 증가시킨 균주에서 젖산 생산 수율이 증가하고 균체 성장이 원활하게 일어나 전체적인 젖산 발효 생산성이 개선되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 사카로마이세스 속 미생물을 이용하여 젖산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 PDC isotype들의 활성을 조절하고, 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase, ALD) 및 acetyl-CoA 합성 효소(acetyl-CoA synthetase, ACS)의 활성을 증가시켜 젖산 발효 생산능이 개선된 미생물을 이용하는 것에 관한 것으로, 젖산 발효 생산 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 사카로마이세스 속 미생물의 젖산 생산 경로, 알코올 발효 경로 및 acetyl-CoA 생산 경로 간의 관계를 도식화한 도이다.
상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 (a) 피루베이트 탈탄산효소(pyruvate decarboxylase, PDC)의 활성이 비변이 젖산 생산 균주에 비하여 약화되고; 및 (b) 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase, ALD) 및 acetyl-CoA 합성 효소(acetyl-CoA synthetase, ACS)의 활성이 비변이 젖산 생산 균주에 비하여 증진된, 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.) 미생물을 제공한다.
일반적으로, 젖산을 생산하는 사카로마이세스 속 미생물은 피루베이트를 기질로 한 젖산 탈수소효소(Lactate lactate dehydrogenase, LDH)를 통하여 생산한다. 피루베이트를 공통 기질로 하는 다른 경로들, 대표적으로 알코올 발효 경로(Ethanol ethanol fermentation pathway)와 acetyl-CoA 생성 경로를 차단하였다. 그러나 PDC 활성을 약화하는 것이 젖산 생산과 수율 제고에 도움이 되나 일정 수준을 넘는 정도가 되면 cytosolic acetyl-CoA의 확보가 어려워 세포성장이 불가능하고 따라서 정상적인 발효가 이루어지지 않았다. 이에, 본 발명자들은 최소한의 acetyl-CoA 생성 경로를 유지하는 방법을 통하여 젖산 생산성 수율 증진과 함께 균체 생장율을 유지하여 전체적인 젖산 발효 생산성을 개선함으로써 젖산 생산성이 증가된 사카로마이세스 속 미생물을 개발하였다.
본 발명의 용어, "피루베이트 탈탄산효소(pyruvate decarboxylase, PDC)"는 피루베이트에 작용하여 탄산과 아세트알데히드를 생성하는 반응을 매개하는 활성을 가지는 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 상기 활성을 가지는 한 유래나 아형(isotype)에 한정되지 않는다. 상기 단백질은 알코올 발효의 한 단계에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 효모나 식물에 주로 존재하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 피루베이트 탈탄산효소는 사카로마이세스 속 미생물에 내재적으로 존재하는 것일 수 있으며, PDC1, PDC5 및/또는 PDC6일 수 있으며, 구체적으로 사카로마이세스 세레비지에의 PDC1, PDC5 및/또는 PDC6일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 단백질과 생물학적으로 동일하거나 상응하는 활성을 지니는 한, 그의 변이체 또는 유사체 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 단백질의 서열은 공지의 데이터 베이스 등에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 PDC1은 서열번호 71의 아미노산 서열, PDC5는 서열번호 72의 아미노산 서열, PDC6는 서열번호 73의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 각기 나열된 서열들과 70% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 염기서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 용어, "상동성"이란 다수의 염기서열 또는 다수의 아미노산 서열 사이의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 확률 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 나타내는 단위이다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해주는 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램을 사용하여 측정할 수 있다. 당업계에서 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어 등이 있다.
실제로 가장 주된 역가를 보이는 PDC1을 결손하여 젖산을 생산하는 예는 많이 보고되어 있다 (Appl Microbiol Biotechnol. 2009, 82(5):883-90). 이 경우, PDC6는 거의 발현이 되지 않는다고 여겨지므로 실제 PDC 활성을 가지는 효소는 PDC5 유전자의 발현에 의한 것으로 볼 수 있다. 보고에 따르면 야생형 균주의 경우에서도 PDC1만의 단독 유전자 결손만으로는 세포생장에 대한 저해가 없으며 PDC의 역가도 야생형과 비교하여 60~70% 정도로 유지하고 있기 때문에 균주의 표현형에서의 큰 변화는 없다고 한다 (J Bacteriol. 1990, 172(2):678-685).
PDC 활성을 약화할 수 있는 다른 방법으로는 효모에서 주요한 PDC 역가를 담당하는 PDC1, PDC5 유전자가 동시 결손된 이중 결손 균주를 제작할 수 있다. 이 경우에는 아세트산이나 에탄올의 보조기질 없이도 포도당 등의 당원으로 젖산 발효가 가능하나 PDC 역가의 급격한 감소로 균체성장속도가 느려지고 따라서 발효생산성이 감소되는 것을 확인하였다 (Biosci Biotechnol Biochem. 2006,70(5):1148-1153).
한편, 피루베이트에서 PDC와 경쟁하는 LDH 경로로 젖산 생산을 극대화하기 위하여 PDC1, PDC5, PDC6를 동시 결손한 삼중결손균주를 제작할 수 있다. 이 경우, 젖산 발효 수율은 극대화될 수 있겠으나 포도당 존재 시 유발되는 기질 제한 효과(catabolite repression) 에 의해 에탄올과 아세트산 등의 대사능이 더욱 제한되어 세포 성장이 저해되고(Curr Genet. 2003, 43(3):139-160) 결국 발효 생산성이 감소된다는 것을 알 수 있다.
구체적으로 본 발명의 피루베이트 탈탄산 효소(PDC)의 약화는 i) PDC1의 활성을 불활성화하고 PDC5의 활성을 약화하거나; 또는 ii) PDC1의 활성을 약화하고 PDC5의 활성을 불활성화하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, PDC1을 불활성화한 기반 사카로마이세스 세레비지에 균주를 이용하여, PDC5 유전자의 프로모터를 치환하여 PDC5의 활성을 약화하는 균주, PDC1의 활성을 회복시켜 PDC5를 결손시킨 균주, PDC1 및 PDC5를 이중 결손시킨 균주 및 PDC1, PDC5 및 PDC6를 삼중 결손시킨 균주를 제조하였다. 이 중에 상기 삼중 결손 균주는 균체 생장이 거의 이루어지지 않는 것을 확인하였다.
본 발명의 용어, "알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase, ALD)"는 알데히드를 산화하여 카르복실산 또는 아실기를 생성하는 활성을 가지는 단백질로 주로 아세트알데히드에서 아세트산을 생성하는 활성을 가지는 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 상기 활성을 가지는 한 유래나 아형(isotype)에 한정되지 않는다. 본 발명의 알데히드 탈수소효소는 사카로마이세스 속 미생물에서 유래한 것일 수 있으며, ALD2 및/또는 ALD3일 수 있다. 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에의 ALD2 및/또는 ALD3일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 단백질과 생물학적으로 동일하거나 상응하는 활성을 지니는 한, 그의 변이체 또는 유사체 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 단백질의 서열은 공지의 데이터 베이스 등에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 ALD2는 서열번호 74의 아미노산 서열, ALD3는 서열번호 75의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 각기 나열된 서열들과 70% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 염기서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 용어, "acetyl-CoA 합성 효소(acetyl-CoA synthetase, ACS)"는 ATP 분해 반응과 공역하여 아세트산과 CoA의 티오에스테르화 반응을 촉매하는 활성을 가지는 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 상기 활성을 가지는 한 유래나 아형(isotype)에 한정되지 않는다. 미생물, 식물 및 동물 등에도 존재하는 것이 알려져 있다. 본 발명의 알데히드 탈수소효소는 사카로마이세스 속 미생물에서 유래한 것일 수 있으며, ACS1일 수 있다. 구체적으로는, 특히 사카로마이세스 세레비지에의 ACS1일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 단백질과 생물학적으로 동일하거나 상응하는 활성을 지니는 한, 그의 변이체 또는 유사체 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 단백질의 서열은 공지의 데이터 베이스 등에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 ACS1은 서열번호 76의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 서열과 70% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 염기서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 PDC의 활성을 비변이 미생물보다 약화시킨 균주를 기반으로 상기 ALD2 또는 ALD3의 활성을 증진시키고 ACS의 활성을 증진시킨 균주를 제작하였다. 구체적으로는, PDC1을 결손을 통하여 불활성화시키고 PDC5 유전자의 프로모터를 발현능이 낮은 프로모터로 치환하여 PDC5의 활성을 약화시킨 균주를 기반으로 ALD 및 ACS의 활성을 증진시킨 균주를 제작하였다. 더욱 구체적으로는, PDC1의 활성을 불활성화하고 PDC5의 활성을 약화하며, ALD2 및 ALD3로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 활성을 증진시키고, ACS1의 활성을 증진시킨 사카로마이세스 속 미생물을 제작하였다. 이에 따라, 생장 속도, D-젖산 생산량 및 수율이 상당히 개선되는 것을 확인하였다.
본 발명에서 효소 활성의 "불활성화"는 당해 효소의 활성을 불활성화시키는 방법으로 해당 효소가 발현되지 않도록 하거나, 본래의 활성을 발휘할 수 없는 효소가 발현되도록 하는 모든 방법들을 포함한다. 상기 방법들은 상동성 재조합에 의한 유전자 일부 혹은 전체의 결실, 해당 유전자 내부에 외부유래 유전자 삽입에 의한 효소발현 억제, 당해 효소 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형시키는 것을 통한 발현 억제이거나, 당해 효소의 치환 또는 변형을 통한 본래 기능을 잃은 불활성 효소로의 변이 등이 있을 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 효소 활성의 "약화"는 효소의 활성을 약화시키는 방법으로 해당 효소의 발현량을 감소시키거나, 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 모든 방법들을 포함한다. 상기 방법들은 당해 효소 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형시키는 것을 통한 발현 감소이거나, 당해 효소 치환 또는 변형을 통하여 활성이 감소된 효소로의 변이 등이 있을 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 효소 활성의 "증진"은 당해 효소의 유전자를 갖는 플라스미드를 도입하거나, 염색체상에서 당해 효소를 코딩하고 있는 유전자의 카피수를 증가시키거나, 당해 효소의 유전자의 프로모터 서열을 치환 또는 변형시키거나, 돌연변이에 의한 효소 활성 증가 등이 있을 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "효모 미생물"은 출아에 의해 증식하는 진균류에 속하는 미생물로, 본 발명의 젖산 생산 경로, 알코올 생산 경로 및/또는 acetyl-CoA 생산 경로를 포함하는 이상 제한되지 않는다. 효모 미생물은 형태에 의해 "사카로마이세스 속", "피치아속", "캔디다 속" 및 "사이카로마이코프시스 속" 등으로 나뉘며, 구체적으로 본 발명에서는 다양한 종을 포함하는 "사카로마이세스 속" 미생물을 활용할 수 있다. 구체적으로 상기 사카로마이세스 속 미생물은 사카로마이세스 바야누스(Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 보울라디(Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 불데리(Saccharomyces bulderi), 사카로마이세스 카리오카누스(Saccharomyces cariocanus), 사카로마이세스 카리오커스(Saccharomyces cariocus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 시바리에리(Saccharomyces chevalieri), 사카로마이세스 다이레넨시스(Saccharomyces dairenensis), 사카로마이세스 엘립소이더스(Saccharomyces ellipsoideus), 사카로마이세스 유바야누스(Saccharomyces eubayanus), 사카로마이세스 엑시구스(Saccharomyces exiguus), 사카로마이세스 플로렌티누스(Saccharomyces florentinus), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 마르티니에(Saccharomyces martiniae), 사카로마이세스 모나센시스(Saccharomyces monacensis), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 파라독수스(Saccharomyces paradoxus), 사카로마이세스 파스토리아누그(Saccharomyces pastorianus), 사카로마이세스 스펜세로럼(Saccharomyces spencerorum), 사카로마이세스 츄리센시스(Saccharomyces turicensis), 사카로마이세스 유니스포러스(Saccharomyces unisporus), 사카로마이세스 우바럼(Saccharomyces uvarum), 및 사카로마이세스 조나투스(Saccharomyces zonatus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에일 수 있다.
본 발명자들은 사카로마이세스 속 미생물의 대표적인 예로 사카로마이세스 세레비지에에서 PDC의 활성 약화와 ALD 및 ACS 활성이 증진된 미생물을 제조한 결과, 젖산 생산이 크게 증가된 것을 확인하였다.
본 발명의 미생물은 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase, ADH)가 추가로 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase)"는 알코올에서 수소를 이탈시켜 알데히드 또는 케톤을 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 활성을 가지는 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 상기 활성을 가지는 한 유래나 아형(isotype)에 한정되지 않는다. 본 발명의 알코올 탈수소효소는 사카로마이세스 속 미생물에서 유래한 것일 수 있으며, ADH1일 수 있다. 구체적으로 사카로마이세스 세레비지에의 ADH1일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 단백질과 생물학적으로 동일하거나 상응하는 활성을 지니는 한, 그의 변이체 유사체 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 단백질의 서열은 공지의 데이터 베이스 등에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 ADH1은 서열번호 77의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 서열과 70% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 염기서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 미생물은 D-젖산 탈수소효소(d-lactate dehydrogenase, DLD)가 추가로 불활성화된 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "D-젖산 탈수소효소(d-lactate dehydrogenase)"는 D-젖산을 탈수소화하여 피루베이트를 생성하는 활성을 가지는 단백질을 의미하며, 본 발명에서는 상기 활성을 가지는 한 유래나 아형(isotype)에 한정되지 않는다.본 발명의 D-젖산 탈수소효소는 사카로마이세스 속 미생물에서 유래한 것일 수 있다. 구체적으로는 사카로마이세스 세레비지에의 DLD1일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 단백질과 생물학적으로 동일하거나 상응하는 활성을 지니는 한, 그의 변이체 유사체 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 단백질의 서열은 공지의 데이터 베이스 등에서 얻을 수 있으며, 그 예로 NCBI의 GenBank 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DLD1은 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 서열과 70% 이상의 상동성을 지니는 아미노산 서열, 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 코딩하는 상기 염기서열들의 변이체 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명에서는, 추가적으로 피루베이트로부터 생성된 알데히드를 기질로 활용하는 알코올 발효 경로에 작용하는 ADH1을 결손시키고, 생성된 D-젖산을 분해하는 효소인 DLD1을 결손시킨 균주를 이용하였으며, 이는 아세트산 생성 경로 조절에 따른 젖산 발효 생성능의 변화를 명확하게 측정하기 위해서이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 제조된 PDC와 ALD 및 ACS의 활성을 조절한 본 발명의 균주들은 현저히 증진된 젖산 발효 생산능을 보였다(표 12).
본 발명의 또 다른 일 양태는, 상기 본 발명의 미생물을 이용하여 젖산을 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 구체적 예로 배양액에서 본 발명의 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 단계의 배양액으로부터 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.
본 발명에서 사용되는 배지는 수크로오스 또는 글루코오스를 주 탄소원으로 사용하며, 수크로오스를 다량으로 포함한 당밀 또한 탄소원으로 이용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원이 포함될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다.
배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 40℃, 구체적으로는 25℃ 내지 35℃, 더욱 구체적으로는 30℃일 수 있다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성량에 도달할 때까지 계속 할 수 있으며, 구체적으로는 10 내지 100 시간일 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 젖산은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 회수될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 젖산 생산 균주 제작
본 발명의 젖산 생산 균주를 제작하기 위하여, EUROSCARF에서 분양 받은 야생형 효모 중 대표적인 Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1D에 일련의 유전자 조작을 가하였다.
구체적으로는, 알코올 합성 경로로의 피루베이트의 이탈을 최소화하기 위하여 알코올 탈수소효소 1(alcohol dehydrogenase 1; ADH1) 및 피루베이트 탈탄산효소 1(pyruvate decarboxylase 1; PDC1)을 결손시키고, D형 젖산 분해 경로의 차단을 위해 D-젖산 탈수소효소 1(d-lactate dehydrogenase 1; DLD1)을 결손한 균주를 본 발명의 기반 균주로 사용하였다.
DLD1은 생장 개선에 직접적인 영향을 미치는 요소는 아니나 D형 젖산의 탈수소효소로 NAD+를 이용하여 피루베이트로 전환시키는 주된 효소로 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서 제작하고자 하는 D형 젖산 생산 효모의 온전한 발효 생산성 비교를 위하여 생산된 젖산을 소모하는 효소인 DLD1 유전자를 결손한 균주를 기반으로 후속 균주를 제작하여, 발효 생산성을 비교하였다.
본 발명의 유전자 조작은 일반적인 molecular cloning 방법을 이용하였다.
먼저, 효모의 ADH1 및 PDC1 유전자 결손에 관한 실험은 Lee TH, et al.(J. Microbiol. Biotechnol. (2006), 16(6), 979-982) 논문에 개시된 내용을 참고로 하여 pWAL100 및 pWBR100 플라스미드를 이용하였다. 벡터에 삽입한 각 insert는 각각에 해당하는 프라이머(서열번호 1 내지 서열번호 8)를 이용하여 PCR을 통해 제조하였다.
또한, DLD1의 유전자 결손을 위하여 HIS3 마커 유전자를 double crossover로 도입하여 결손시켰다. 이에 사용된 DNA 단편은 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 이용하여 제조하였다.
상기 유전자 조작에 사용한 프라이머를 정리하면 하기 표 1과 같다.
표 1 기반 균주 제작에 사용한 프라이머
프라이머 5'->3' 서열
ADH1 upstream forward primer(서열번호 1) CGGGATCCACTGTAGCCCTAGACTTGATAGCC
ADH1 upstream reverse primer(서열번호 2) ATAAGAATGCGGCCGCTGTATATGAGATAGTTGATTGTATGCTT
ADH1 downstream forward primer(서열번호 3) GACTAGTGCGAATTTCTTATGATTTATGATTTTTATT
ADH1 downstream reverse primer(서열번호 4) ACATGCCATGgAAGCATGCACGTATACACTTGAGTAA
PDC1 upstream forward primer(서열번호 5) CGGGATCCATTATGTATGCTCTTCTGACTTTTCGT
PDC1 upstream reverse primer(서열번호 6) ATAAGAATGCGGCCGCTTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC
PDC1 downstream forward primer(서열번호 7) CGGGATCCGCGATTTAATCTCTAATTATTAGTTAAAG
PDC1 downstream reverse primer(서열번호 8) ATAAGAATGCGGCCGCTTTCAATCATTGGAGCAATCATTTTACA
DLD1-HIS3 upstream linking primer(서열번호 9) GCGTAGTTGGCCCCAACTGGTGCAGTAATACGTTTTAAGAGCTTGGTGAG
DLD1-HIS3 downstream linking primer(서열번호 10) CGTGAAGGGTGAAAAAGGAAAATCAGATACCTACATAAGAACACCTTTGG
상기와 같이 3개의 유전자를 결손시킨 균주를 바탕으로 젖산 생산을 위한 유전자인 D-젖산 탈수소효소(d-lactate dehydrogenase, D-LDH)를 도입하였다. S.cerevisiae 유래의 TEF1 프로모터와 CYC1 터미네이터 사이에 락토바실러스 플란타럼(Lb. plantarum) 유래 ldhD 유전자를 함유하도록 각각 5', 3' 말단에 XhoⅠ과 SpeⅠ의 제한효소 사이트를 가지고 p413TEF1 벡터에 클로닝하였으며 여기서 SacⅠ/PvuⅡ의 이중 절단으로 insert를 준비하였다. 그리고 벡터는 p-δ-neo에서 BamHⅠ/NotⅠ으로 이중 절단된 DNA 절편에서 Mungbean nuclease로 blunt end를 만든 다음, 다시 SacⅠ으로 처리하여 SacⅠ sticky end와 BamHⅠ 유래 blunt end를 갖는 벡터 부분을 만들었다.
상기의 과정으로 수득한 벡터와 insert를 ligation하여 pTL573 벡터를 완성하였다. pTL573 플라스미드는 Lb. plantarum 유래 ldhD 유전자를 포함하고 있으며, S.cerevisiae CEN.PK2-1D pdc1Δ adh1Δ dld1Δ 균주의 retrotransposable element 중 일부 영역인 δ-sequence에 무작위적으로 다수의 카피가 삽입되도록 설계되었다. 해당 유전자의 다중 삽입을 위하여 플라스미드 pTL573을 SalⅠ 제한효소로 절단하여 δ-sequence 상에 single crossover를 유도하는 DNA 단편을 제작하였다. 이를 형질전환으로 모균주 내에 도입하여 최대 5 mg/mL G418 농도의 YPD (1 % yeast extract, 2% bacto-peptone, 2% glucose) 배지에서 다수의 콜로니들을 얻었다. 이렇게 얻어진 균주는 최종적으로 D형 젖산 생산능 부여를 위해 락토바실러스 플란타럼(Lb. plantarum) 유래의 D-LDH가 복수로 삽입되어 있는 것을 확인하였으며, 이를 CC02-0064 균주라 명명하였다.
실시예 2: PDC5 약화 변이 균주 제조
상기 실시예 1에서 제조한 CC02-0064 균주를 기반으로 PDC5의 프로모터를 치환한 변이 균주를 제조하였다. 이 과정에서 카세트 제작 및 균주 선별 과정은 Lee T. H. et al.(Development of reusable split URA3-marked knockout vectors for budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. J Microbiol Biotechnol, 2006, 16:979-982)에 기재된 방법을 사용하였다.
구체적으로는 CC02-0064 균주의 PDC5의 프로모터를 SCO1, SCO2, ACS1, IDP2, FBA1 프로모터로 치환한 총 5개의 신규 균주를 제작하였으며, 이에 서열번호 11 내지 서열번호 36의 프라이머를 이용하여 프로모터 치환 카세트를 제작하였다.
상기 프로모터 치환에 사용한 프라이머를 정리하면 하기 표 2과 같다.
표 2 프로모터 치환 균주 제작에 사용한 프라이머
프라이머 5'-> 3' 서열
F_PDC5_UP_676(서열번호 11) GTCAGCATTGACACGTTCGATT
R_KlURA3-PDC5_UP(서열번호 12) TCTACCCAGAATCACTTCTTTCGAGAGATTGTCATAATC
F_PDC5_UP-AL_KlURA3(서열번호 13) CAATCTCTCGAAAGAAGTGATTCTGGGTAGAAGATCGG
R_AL_KlURA3(서열번호 14) GAGCAATGAACCCAATAACGAAATCTT
F_BR_KlURA3(서열번호 15) CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAG
R_PDC5_DOWN_522(서열번호 16) CAAGTCAACCAAGTTAGCTGGC
R_SCO1p-BR_KlURA3(서열번호 17) CTCTCCTAATAGACGTGGTGTCACCATGAACGACAATTCTTAA
F_SCO1p_500(서열번호 18) CGTTCATGGTGACACCACGTCTATTAGGAGAGCCATTC
R_PDC5_DOWN_500-SCO1p(서열번호 19) AAGGTTATTTCAGACATCTTTTCTACGTTTGCTGTTTTTTC
F_SCO1p-PDC5_DOWN_500(서열번호 20) CAGCAAACGTAGAAAAGATGTCTGAAATAACCTTAGGTAAAT
R_SCO2p-BR_KlURA3(서열번호 21) ATCGAATAAGTAACAAGCGTGTCACCATGAACGACAATTCTTAA
F_SCO2p_500(서열번호 22) CGTTCATGGTGACACGCTTGTTACTTATTCGATAACGC
R_PDC5_DOWN_500-SCO2p(서열번호 23) AAGGTTATTTCAGACATTTTACTCTCGCTTCCCAAATTCC
F_SCO2p-PDC5_DOWN_500(서열번호 24) GGAAGCGAGAGTAAAATGTCTGAAATAACCTTAGGTAAAT
R_IDP2p-BR_KlURA3(서열번호 25) TAAAAATAAATAGATAGACGTGTGTCACCATGAACGACAATTCTTAA
F_IDP2p_500(서열번호 26) CGTTCATGGTGACACACGTCTATCTATTTATTTTTATAACTC
R_PDC5_DOWN_500-IDP2p(서열번호 27) AAGGTTATTTCAGACATTACGATTTTATATATATACGTACGTTA
F_IDP2p-PDC5_DOWN_500(서열번호 28) CGTATATATATAAAATCGTAATGTCTGAAATAACCTTAGGTAAAT
R_ACS1p-BR_KlURA3(서열번호 29) CTGGACGTATGTGCACAGTGTCACCATGAACGACAATTCTTAA
F_ACS1p_500(서열번호 30) CGTTCATGGTGACACTGTGCACATACGTCCAGAATGAT
R_PDC5_DOWN_500-ACS1p(서열번호 31) AAGGTTATTTCAGACATAGCACAGTGGGCAATGTCTTTC
F_ACS1p-PDC5_DOWN_500(서열번호 32) CATTGCCCACTGTGCTATGTCTGAAATAACCTTAGGTAAAT
R_FBA1p-BR_KlURA3(서열번호 33) TTATTTACGTAATGACCCAGTGTCACCATGAACGACAATTCTTAA
F_FBA1p_500(서열번호 34) CGTTCATGGTGACACTGGGTCATTACGTAAATAATGATAG
R_PDC5_DOWN_500-FBA1p(서열번호 35) AAGGTTATTTCAGACATTTTGAATATGTATTACTTGGTTATGGT
F_FBA1p-PDC5_DOWN_500(서열번호 36) CCAAGTAATACATATTCAAAATGTCTGAAATAACCTTAGGTAAAT
상기와 같이 제작한 신규 균주를 CC02-0167, CC02-0168, CC02-0169, CC02-0170, CC02-0174으로 명명하였다. 해당 균주와 유전 형질을 정리하면 하기 표 3과 같다.
표 3 PDC5 프로모터 변이 균주
균주명 유전형질
CC02-0167 CC02-0064 PDC5 promoter::KlURA3-SCO1 promoter
CC02-0168 CC02-0064 PDC5 promoter::KlURA3-SCO2 promoter
CC02-0169 CC02-0064 PDC5 promoter::KlURA3-ACS1 promoter
CC02-0170 CC02-0064 PDC5 promoter::KlURA3-IDP2 promoter
CC02-0174 CC02-0064 PDC5 promoter::KlURA3-FBA1 promoter
실시예 3: PDC5 약화 변이 균주의 젖산 발효 평가
상기 실시예 2에서 제작한 PDC5 프로모터 변이 균주에 대하여 젖산 발효 평가를 하였다. 이를 위해서 젖산 발효 평가용 배지를 제작하였다.
구체적으로는, 효모용 제한배지인 SC media(Synthetic Complex media)를 제작하기 위하여 0.67 % yeast nitrogen base without amino acid를 기반으로 여기에 아미노산 dropout mix(Sigma)를 제조사의 프로토콜에 따라 혼합하고 필요에 따라, 제외된 아미노산을 첨가하였다. 류신(leucine)은 380 mg/L, 우라실, 트립토판 및 히스티딘은 76 mg/L가 되게 첨가하였고, 탄소원으로서 포도당 8%와 중화제로서 1% CaCO3를 첨가하였다. 이렇게 제조한 배지를 효모 균주 젖산 발효 평가에 이용하였다.
상기 실시예 2에서 제작한 PDC5 프로모터 변이 균주 중에서 본래 PDC5 프로모터보다 약한 프로모터로 변이된 균주들은 성장을 하지 못하고, 강한 프로모터로 변이된 균주는 더 잘 자랐다. 구체적으로는 본래 PDC5 프로모터보다 약한 프로모터인 SCO1, SCO2, IDP2 또는 ACS1 프로모터로 치환한 균주들은 성장하지 못하였고, FBA1 프로모터로 교체한 균주만이 생장하여 평가가 가능하였다. 상기 측정이 가능한 CC02-0064와 CC02-0174 균주의 젖산 발효 평가한 결과를 정리하면 하기 표 4와 같다.
표 4 PDC5 프로모터 변이 균주의 젖산 발효 평가
균주 24 시간 48 시간
OD 소모당 젖산 OD 소모당 젖산 수율 (%)
CC02-0064 3.9 15.0 10.9 8.7 63.4 41.6 65.7
CC02-0174 5.7 25.0 19.8 9.4 69.9 47.3 67.7
상기 젖산 발효 평가에서 확인할 수 있듯이, acetyl-CoA의 생성을 촉진하는 경로 중에서 PDC를 야생형의 PDC5 프로모터에서 FBA1 프로모터로 교체한 균주 CC02-0174로도 본래 균주(CC02-0064)보다 균체 생장 속도 및 젖산 생산성이 향상되는 것을 확인하였다. 그러나 이는 시료를 채취한 24시간 및 48시간에서의 결과를 비교해 볼 때, acetyl-CoA 생성 경로 중에서 하위 ALD와 ACS의 강화 없이 단순히 PDC의 단독 역가 강화만으로는 시간에 따른 균체 생장 속도 및 젖산 생산성의 향상이 지속적으로 감소한다는 것도 확인할 수 있었다. 본 실시예에서 PDC 역가 강화에 의한 포도당 소모능 향상은 10.3%이고 최대 젖산 생산 농도는 47.3 g/l이었다. 결과적으로 이 때의 최종 젖산 생산성 향상은 약 13.7%이었다.
실시예 4 : PDC5 결손 균주 제작
상기 실시예 2에서 제작한 PDC1을 결손시키고 PDC5를 약화시킨 균주 외에, 반대로 PDC5를 결손시키고 PDC1을 약화시킨 균주를 제작하여, 해당 균주에서도 PDC 경로가 약화되는지를 확인해보고자 하였다.
구체적으로는, CC02-0064 균주를 기반으로 하여 PDC5 유전자의 결손을 위하여 서열번호 37 내지 40의 프라이머를 이용하여 PDC5 결손 카세트를 제작하였으며, 결손 균주는 실시예 1에 명시된 문헌과 동일한 방법으로 제작하였다. 이에 사용된 프라이머를 정리하면 하기 표 5와 같다.
표 5 PDC5 결손 균주 제작에 사용한 프라이머
프라이머 5'->3' 서열
F-ALPDC5-BamHI(서열번호 37) GAGCTCGGATCCAAGGAAATAAAGCAAATAACAATAACACC
R-ALPDC5-NotI(서열번호 38) ACCATGGCGGCCGCTTTGTTCTTCTTGTTATTGTATTGTGTTG
F-BRPDC5-SpeI(서열번호 39) GGATCCACTAGTGCTAATTAACATAAAACTCATGATTCAACG
R-BRPDC5-NcoI(서열번호 40) CAGCTGCCATGGTATTCTAAATAAGATGTAAGGCCTTGTAAT
이렇게 제작한 PDC5 결손 균주는 CC02-0450(CC02-0064, pdc5Δ)이라 명명하였다.
실시예 5 : PDC5 결손 균주 기반 PDC1 프로모터 변이 균주 제작
상기 실시예 4에서 제작한 CC02-0450 균주를 기반으로 하여 PDC1 프로모터를 치환한 균주를 제작하였다. 이를 위하여 PDC1 결손을 회복시킨 비교군 균주인 CC02-0451(CC02-0450, PDC1p-PDC1)을 제작하였으며, 실험군으로 PDC1 약화 균주인 CC02-0452(CC02-0450, IDP1p-PDC1)를 제작하였다.
각 균주는 효모에서의 복제 원점이 없는 pRS406 벡터에 목적 유전자 카세트를 클로닝한 pRS406-PDC1p-PDC1-CYC1t와 pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1t 벡터를 삽입한 형태로 제작되었다.
구체적으로는, 효모의 염색체 DNA를 주형으로 하여 서열번호 41, 42의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 PDC1 유전자를 포함하는 산물을 얻고, 이를 서열번호 43, 44를 이용하여 CYC1 터미네이터의 서열을 얻었다. 이들 각각을 주형으로 한 PCR을 다시 서열번호 41, 44 프라이머로 수행하여 PDC1과 CYC1 터미네이터가 연결된 DNA 단편을 얻었다. PDC1-CYC1 터미네이터의 DNA 단편과 pRS406 벡터를 pRS406과 SpeI, XhoI 제한효소를 처리한 후 이들을 ligation한 pRS406-PDC1-CYC1t 플라스미드를 얻었다. 한편, 얻어진 플라스미드에 프로모터 영역을 도입하기 위하여 PDC1 프로모터와 IDP2 프로모터를 각각 서열번호 45, 46의 프라이머와 서열번호 47, 48의 프라이머의 조합으로 효모 염색체 DNA를 주형으로 사용한 PCR을 수행하여 얻었다. 각 프로모터를 포함하는 유전자 단편과 플라스미드 pRS406-PDC1-CYC1t를 SacI과 SpeI으로 절단하여 이들을 ligation하여 PDC1 프로모터 및 IDP2 프로모터에 의하여 PDC1 유전자의 발현이 조절되도록 설계된 효모 염색체 삽입용 플라스미드인 pRS406-PDC1p-PDC1-CYC1t 및 pRS406-IDP2p-PDC1-CYC1t를 각각 제작하였다.
상기 과정에서 사용된 프라이머를 정리하면 하기 표 6과 같다.
표 6 PDC5 결손 및 PDC1 약화 균주 제작에 사용한 프라이머
프라이머 5'->3' 서열
F_PDC1(서열번호 41) ATAACTAGTATGTCTGAAATTACTTTGGGTAAATATTT
R_PDC1(서열번호 42) CAAAGGAAAAGGGGCCTGTTTATTGCTTAGCGTTGGTAGCAGCA
F_CYC1t(서열번호 43) TACCAACGCTAAGCAATAAACAGGCCCCTTTTCCTTTGTCGAT
R_CYC1t(서열번호 44) ATACTCGAGGCAAATTAAAGCCTTCGAGCGTCC
F_PDC1p(서열번호 45) AAAGAGCTCCATGCGACTGGGTGAGCATATGTT
R_PDC1p(서열번호 46) ATAACTAGTTTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC
F_IDP2p(서열번호 47) AAAGAGCTC ACGTCTATCTATTTATTTTTATAACTCC
R_IDP2p(서열번호 48) ATAACTAGT TACGATTTTATATATATACGTACGTTAC
상기 제작된 두 개의 플라스미드를 StuI으로 각각 절단하여 이를 곧바로 균주에 도입하였고 완성된 균주는 CC02-0451(CC02-0450, PDC1p-PDC1)과 CC02-0452(CC02-0450, IDP2p-PDC1)라고 각각 명명하였다. 제작한 균주와 유전형질을 정리하면 하기 표 7과 같다.
표 7 PDC5 결손 및 PDC1 약화 균주
균주 유전형질
CC02-0450 CC02-0064 pdc5Δ
CC02-0451 CC02-0450 PDC1p-PDC1-CYC1t
CC02-0452 CC02-0450 IDP2p-PDC1-CYC1t
실시예 6 : PDC 이중 결손 또는 삼중 결손 균주 제작
PDC 패밀리 유전자에서 PDC1 단독 결손, PDC1 및 PDC5 이중 결손 및 PDC1, PDC5 및 PDC6 삼중 결손 균주를 제작하고자 하였다. PDC1 단독 결손 균주로는 상기 실시예 1에서 제작한 기반 균주 CC02-0064를 이용하였다. 서열번호 49 내지 서열번호 56의 프라이머를 이용하여 PDC5 결손 카세트를 제작하고 CC02-0064에 도입하여 PDC1 및 PDC5 이중 결손 균주를 제작하였으며 이를 CC02-0256이라 명명하였다. 또한, 상기 PDC1 및 PDC5 이중 결손 균주인 CC02-0256을 기반으로 서열번호 57 내지 서열번호 64를 이용하여 PDC1, PDC5 및 PDC6 삼중 결손 균주를 제작하고 이를 CC02-0257이라 명명하였다.
상기 결손 카세트 제작 및 균주 선별과정은 실시예 1에 명시된 문헌과 동일한 방법으로 제작하였다. 이에 사용한 프라이머를 정리하면 하기 표 8과 같다.
표 8 PDC 이중 또는 삼중 결손 균주 제작에 사용한 프라이머
프라이머 5'->3' 서열
F_BamHI-PDC5_UP(서열번호 49) CGGGATCCAGGCCAAGGAAATAAAGCAAATAACAA
R_NotI-PDC5_UP(서열번호 50) ATAAGAATGCGGCCGCTTTGTTCTTCTTGTTATTGTATTGTGTT
F_BamHI-PDC5_DOWN(서열번호 51) CGGGATCCGCTAATTAACATAAAACTCATGATTCAA
R_NotI-PDC5_DOWN(서열번호 52) ATAAGAATGCGGCCGCTATTCTAAATAAGATGTAAGGCCTTGTA
F_PDC5_UP(서열번호 53) AGGCCAAGGAAATAAAGCAAATAACAA
R_AL_KlURA3(서열번호 54) GAGCAATGAACCCAATAACGAAATCTT
F_BR_KlURA3(서열번호 55) CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAG
R_PDC5_DOWN(서열번호 56) TATTCTAAATAAGATGTAAGGCCTTGTA
F_BamHI-PDC6_UP(서열번호 57) CGGGATCCTGTTATAGAGTTCACACCTTATTCACA
R_NotI-PDC6_UP(서열번호 58) ATAAGAATGCGGCCGCTTTGTTGGCAATATGTTTTTGCTATATTA
F_BamHI-PDC6_DOWN(서열번호 59) CGGGATCCGCCATTAGTAGTGTACTCAAACGAAT
R_NotI-PDC6_DOWN(서열번호 60) ATAAGAATGCGGCCGCGATGCAGAATGAGCACTTGTTATTTAT
F_PDC6_UP(서열번호 61) TGTTATAGAGTTCACACCTTATTCACA
R_AL_KlURA3(서열번호 62) GAGCAATGAACCCAATAACGAAATCTT
F_BR_KlURA3(서열번호 63) CTTGACGTTCGTTCGACTGATGAG
R_PDC6_DOWN(서열번호 64) GATGCAGAATGAGCACTTGTTATTTAT
상기 제작한 균주와 유전형질을 정리하면 하기 표 9와 같다.
표 9 PDC 이중 또는 삼중 결손 균주
균주 유전 형질
CC02-0256 CC02-0064 pdc5Δ
CC02-0257 CC02-0256 pdc6Δ
실시예 7 : ALD와 ACS1 강화 균주의 제작
ALD와 ACS1이 과발현되는 균주를 제작하기 위하여, ALD2, ALD3 및 ACS1의 과발현 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로는, 서열번호 65 및 서열번호 66의 프라이머를 이용하여 ALD2의 ORF를, 서열번호 67 및 서열번호 68의 프라이머를 이용하여 ALD3의 ORF를, 그리고 서열번호 69 및 서열번호 70의 프라이머를 이용하여 ACS1의 ORF를 취하고 SpeI과 XhoI 또는 EcoRI 제한효소를 이용하여 p414ADH, p415ADH 및 p416ADH 플라스미드 기반의 재조합 벡터인 p415ADH-ALD2, p415ADH-ALD3, p414ADH-ACS1 및 p416ADH-ACS1을 제작하였다. 이에 사용한 프라이머를 정리하면 하기 표 10과 같다.
표 10 ALD와 ACS1 강화 균주 제작에 사용한 프라이머
프라이머 5'->3' 서열
F_SpeI_ALD2(서열번호 65) CAAGCTGGCCGCTCTAGAACTAGTATGCCTACCTTGTATACTGATATCGA
R_XhoI_ALD2(서열번호 66) ACATAACTAATTACATGACTCGAGTTAGTTGTCCAAAGAGAGATTTATGT
F_SpeI_ALD3(서열번호 67) CAAGCTGGCCGCTCTAGAACTAGTATGCCTACCTTGTATACTGATATCGA
R_XhoI_ALD3(서열번호 68) ACATAACTAATTACATGACTCGAGTTATTTATCCAATGAAAGATCCACAT
F_SpeI_ACS1(서열번호 69) TCCAAGCTGGCCGCTCTAGAACTAGTATGTCGCCCTCTGCCGTACA
R_EcoRI_ACS1(서열번호 70) TATCGATAAGCTTGATATCGAATTCTTACAACTTGACCGAATCAATTAGA
이렇게 제작된 재조합 플라스미드를 CC02-0064, CC02-0168, CC02-0170, CC02-0256, CC02-0257, CC02-0451, CC02-0452 균주에 p415ADH-ALD2, p414ADH-ACS1 조합, p415ADH-ALD3, p414ADH-ACS1 조합, p415ADH-ALD2, p416ADH-ACS1 조합 또는 p415ADH-ALD3, p416ADH-ACS1 조합으로 효모 형질전환법을 이용하여 도입하였다. 한편, PDC 역가가 없는 삼중 결손 CC02-0257 균주에서는 형질전환체가 확보되지 않았다.
상기 제작한 균주와 유전형질을 정리하면 하기 표 11과 같다.
표 11 ALD와 ACS1 강화 균주
균주 유전형질
CC02-0225 CC02-0064 p415ADH, p416ADH
CC02-0226 CC02-0064 p415ADH-ALD2, p416ADH-ACS1
CC02-0227 CC02-0064 p415ADH-ALD3, p416ADH-ACS1
CC02-0356 CC02-0168 p414ADH, p415ADH
CC02-0275 CC02-0168 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD2
CC02-0276 CC02-0168 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD3
CC02-0357 CC02-0170 p414ADH, p415ADH
CC02-0277 CC02-0170 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD2
CC02-0278 CC02-0170 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD3
CC02-0444 CC02-0256 p415ADH, p416ADH
CC02-0361 CC02-0256 p415ADH-ALD2, p416ADH-ACS1
CC02-0362 CC02-0256 p415ADH-ALD3, p416ADH-ACS1
CC02-0453 CC02-0451 p414ADH, p415ADH
CC02-0454 CC02-0451 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD2
CC02-0455 CC02-0451 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD3
CC02-0456 CC02-0452 p414ADH, p415ADH
CC02-0457 CC02-0452 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD2
CC02-0458 CC02-0452 p414ADH-ACS1, p415ADH-ALD3
실시예 8 : 효모 균주의 젖산 발효 평가
상기 실시예 7에서 제작한 ALD와 ACS1 강화 균주의 젖산 발효능을 평가하였다.
구체적으로는 상기 실시예 3에서 제작한 젖산 발효 평가용 배지를 한 플라스크당 25 ㎖로 분주하여 효모균을 접종하고 30 ℃에서 71 시간 동안 호기배양한 뒤 발효액에 존재하는 D형 젖산의 양을 HPLC 분석하고 아세트산(Acetic acid)의 양을 효소 분석(Acetic acid, R-Biopharm, 독일)하였다.
상기 실험의 결과를 정리하면 하기 표 12와 같다.
표 12 ALD 및 ACS 강화 균주의 생장율, 젖산 발효, 부산물, 생산수율 등의 평가
균주 최종 OD 초기당(g/L) 잔존당(g/L) Acetate(g/L) D-젖산(g/L) 수율(g/g) 생산성(g/1·h)
CC02-0225 9.3 88 10 2.87 41.1 0.53 0.579
CC02-0226 9.3 83 10.5 2.91 42.4 0.59 0.597
CC02-0227 10.1 84 9.5 2.91 41.8 0.56 0.589
CC02-0356 6.9 88 26 0.02 27.6 0.45 0.389
CC02-0275 11.6 88 11.5 0.01 47.6 0.62 0.670
CC02-0276 10.6 88 11 0.01 46.8 0.61 0.659
CC02-0357 12.2 88 13 0.04 38.1 0.51 0.537
CC02-0277 17.8 88 1 0.03 58.6 0.67 0.825
CC02-0278 18.8 88 0 0.02 56.9 0.66 0.801
CC02-0453 9.8 88 8.5 2.2 38.9 0.49 0.548
CC02-0454 10.2 88 8.1 2.4 39.5 0.49 0.556
CC02-0455 9.2 88 8.8 2.1 40 0.51 0.563
CC02-0456 12 88 10.1 0.02 38.5 0.49 0.542
CC02-0457 18.1 88 0 0.02 55.8 0.63 0.786
CC02-0458 18.5 88 0 0.02 56.5 0.64 0.800
상기 표 12에서 확인할 수 있듯이, PDC5가 IDP2 또는 SCO2 프로모터에서 발현되어 PDC5가 약화된 균주는 그렇지 않은 균주에 비해 아세테이트 부산물 축적이 현저히 감소하여 거의 검출되지 않음을 확인하였다. 이 경우에 ALD, ACS를 강화하지 않은 균주들의 최종 세포농도는 PDC5 프로모터 교체에 따른 감소 경향을 나타내었다. 그러나 PDC5의 발현을 감소하고 ALD, ACS를 강화한 균주들에서는 반대로 최종 세포농도가 증가하였으며 따라서 세포 생장이 개선되었음을 확인하였다. 특히, PDC5의 프로모터를 IDP2 프로모터로 바꾼 CC02-0170 균주 기반에서 ALD, ACS를 강화한 CC02-0277, CC02-0278 균주는 ALD, ACS를 강화함에 따라 생장속도, D-젖산 생산 생산 농도, 수율, 발효 생산성이 향상됨을 확인하였다.
요약하면, PDC5를 IDP2 프로모터로 약화 발현한 균주는 PDC5가 정상 발현되는 균주에 비해 아세테이트 부산물 축적이 감소하고, 최종 OD가 1.3배 증가하는 것을 확인하였으며, 추가적으로 ALD, ACS를 ADH1 프로모터의 조절 하에서 동시 발현시 당소모량과 당소모 속도가 증가하고 최종적으로 수율이 56% 또는 59%에서 66% 또는 67%로 증가되었음을 확인하였다.
구체적으로 PDC5 약화 발현에 적용된 2종의 프로모터를 비교하면 SCO2 프로모터 적용 균주와 IDP2 프로모터를 적용한 균주에서 모두 젖산 생산성이 향상되는 것을 확인하였다. 그러나 최종 세포농도와 당소모량과 당소모 속도의 측면에서 IDP2 프로모터를 적용한 경우가 보다 최적화된 형태임을 알 수 있었다.
실시예 9 : PDC1 및 PDC5가 이중 결손되고 ALD 및 ACS 강화된 효모 균주의 젖산 발효 평가
PDC5의 약화에 의한 생장 및 수율 개선의 효과가 뚜렷함에 따라 PDC를 추가적으로 결손한 균주에서의 젖산 생성 효과를 확인하고자 하였다. 각 균주의 평가 방법은 상기 실시예 8에서와 동일하며 배양은 74 시간 동안 진행하였다.
상기 실험을 진행한 결과는 하기 표 13과 같다.
표 13 PDC1, PDC5 이중 결손 균주 젖산 발효 평가 결과
균주 최종 OD 초기당(g/L) 잔존당(g/L) Acetate(g/L) D-젖산(g/L) 수율(%) 생산성(g/1·h)
CC02-0444 3.2 78.5 52 0.10 20.8 78.5 0.281
CC02-0361 3.9 78.5 49 0.05 25.4 86.3 0.343
CC02-0362 3.8 78.5 51 0.08 22.8 82.8 0.308
상기 표 13에서 확인할 수 있듯이, PDC1 및 PDC5가 이중 결손된 균주는 아세트산의 감소가 뚜렷하였으나, 세포 성장 및 당소모량의 감소로 인한 젖산 생산 농도의 감소가 관찰되었다. 또한 PDC1 및 PDC5가 이중 결손되어 PDC 경로가 거의 불활성화된 균주에서는 ALD와 ACS를 강화하여도 세포 성장과 당소모 및 생산성이 개선되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 10 : PDC 경로 약화 균주의 수크로오스를 이용한 젖산 발효 평가
PDC 경로가 약화된 젖산 생산 효모의 수크로오스를 이용한 발효 평가를 위해 실시예 8 및 실시예 9에서 평가한 동일한 균주를 탄소원으로서 포도당 대신 수크로오스로 대체하여 젖산 생성 효과를 확인하고자 하였다. 평가 방법은 실시예 8에서와 동일하게 진행하였다.
상기 실험을 진행한 결과는 하기 표 14와 같다.
표 14 PDC5 약화 또는 PDC1, PDC5 이중 결손 균주 젖산 발효 평가 결과
균주 최종 OD 초기당(g/L) 잔존당(g/L) Acetate(g/L) D-젖산(g/L) 수율(%) 생산성(g/1·h)
CC02-0225 5.15 91.5 27.5 1.95 25.19 39.36 0.34
CC02-0226 6.9 91.5 15 1.92 30.89 40.38 0.42
CC02-0227 6.18 91.5 15 1.98 29.59 38.68 0.40
CC02-0356 1.6 91.5 26.75 0.02 11.72 18.11 0.16
CC02-0275 1.88 91.5 21.75 0.02 13.79 19.77 0.19
CC02-0276 2.2 91.5 18.25 0.01 16.04 21.9 0.22
CC02-0357 2.78 91.5 22 0.03 17.08 24.58 0.23
CC02-0277 12.15 91.5 7.75 0.02 44.65 53.31 0.60
CC02-0278 11.88 91.5 6.25 0.01 43.84 51.43 0.60
CC02-0444 2.45 91.5 37 0.02 21.94 40.25 0.30
CC02-0361 2.5 91.5 18.25 0.02 21.73 29.66 0.29
CC02-0362 3.08 91.5 15.25 0.02 24.92 32.67 0.34
실시예 8, 9에서와 동일한 균주에 포도당 대신 수크로오스를 이용하게 한 결과 PDC 경로가 약화된 균주에서의 ALD, ACS의 강화에 의한 생장 및 수율 개선의 효과가 상기 실시예 8의 포도당을 사용한 발효 평가의 결과와 동일한 패턴임을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 확인하였던 PDC 약화 및 ALD, ACS 강화에 의한 수율 및 생장 개선의 효과가 사용한 당의 종류에 국한되지 않음을 확인하였다.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명의 피루베이트 탈탄산효소(PDC) 경로가 약화되고 알데히드 탈수소효소(ALD)의 활성 및 acetyl-CoA 합성 효소(ACS)들의 활성이 비변이 균주에 비하여 향상되도록 변형한 균주는 젖산 생산 수율이 증진됨과 동시에 생장률 또한 유지되는 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명, 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. (a) 피루베이트 탈탄산효소(pyruvate decarboxylase, PDC)의 활성이 비변이 젖산 생산 균주에 비하여 약화되고; 및
    (b) 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase, ALD) 및 acetyl-CoA 합성 효소(acetyl-CoA synthetase, ACS)의 활성이 비변이 젖산 생산 균주에 비하여 증진되도록 변이된, 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피루베이트 탈탄산효소는 PDC1, PDC5 및 PDC6로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 세레비지에 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 미생물은
    i) PDC1의 활성을 불활성화하고 PDC5의 활성을 약화하거나; 또는
    ii) PDC1의 활성을 약화하고 PDC5의 활성을 불활성화하는 것인, 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 세레비지에 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 알데히드 탈수소효소는 ALD2 및 ALD3로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이며, 상기 acetyl-CoA 합성 효소는 ACS1인 것인, 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 세레비지에 미생물.
  5. 제1항에 있어서, 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase, ADH)가 추가로 불활성화된 것인, 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 세레비지에 미생물.
  6. 제1항에 있어서, D-젖산 탈수소효소(d-lactate dehydrogenase, DLD)가 추가로 불활성화된 것인, 젖산 생산이 향상된 사카로마이세스 세레비지에 미생물.
  7. (a) 배양액에서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 배양액으로부터 젖산을 회수하는 단계를 포함하는 젖산 생산 방법.
PCT/KR2015/004600 2014-05-09 2015-05-08 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법 WO2015170914A1 (ko)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15739495.8A EP2960326B1 (en) 2014-05-09 2015-05-08 Microorganism capable of enhancing lactic acid production and method for producing lactic acid using same
BR112016026286-7A BR112016026286B1 (pt) 2014-05-09 2015-05-08 Micro-organismo com produtividade aumentada de ácido láctico e processo para produzir ácido láctico utilizando o mesmo
AU2015249090A AU2015249090B2 (en) 2014-05-09 2015-05-08 A microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same.
JP2015563134A JP6087451B2 (ja) 2014-05-09 2015-05-08 乳酸生産が向上した微生物及びこれを用いて乳酸を生産する方法
US14/783,012 US20170175150A1 (en) 2014-05-09 2015-05-08 Microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same
SG11201609397WA SG11201609397WA (en) 2014-05-09 2015-05-08 A microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same
RU2015130528A RU2636467C2 (ru) 2014-05-09 2015-05-08 Микроорганизм, имеющий повышенную продуктивность в отношении молочной кислоты, и способ получения молочной кислоты с использованием данного микроорганизма
CN201580030614.7A CN106459881B (zh) 2014-05-09 2015-05-08 乳酸生产率提高的微生物和使用其生产乳酸的方法
MYPI2016001969A MY172440A (en) 2014-05-09 2015-05-08 A microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same
PL15739495T PL2960326T3 (pl) 2014-05-09 2015-05-08 Mikroorganizm zdolny do zwiększenia wytwarzania kwasu mlekowego i sposób wytwarzania kwasu mlekowego przy jego użyciu
UAA201507617A UA118022C2 (uk) 2014-05-09 2015-08-05 Рекомбінантний мікроорганізм saccharomyces cerevisiae, який має підвищену здатність до продукування молочної кислоти, та спосіб продукування молочної кислоти
US15/918,995 US20180201960A1 (en) 2014-05-09 2018-03-12 Microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2014-0055865 2014-05-09
KR1020140055865A KR101577134B1 (ko) 2014-05-09 2014-05-09 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/783,012 A-371-Of-International US20170175150A1 (en) 2014-05-09 2015-05-08 Microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same
US15/918,995 Continuation US20180201960A1 (en) 2014-05-09 2018-03-12 Microorganism having enhanced productivity of lactic acid and a process for producing lactic acid using the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015170914A1 true WO2015170914A1 (ko) 2015-11-12

Family

ID=54392708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2015/004600 WO2015170914A1 (ko) 2014-05-09 2015-05-08 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법

Country Status (12)

Country Link
US (2) US20170175150A1 (ko)
EP (1) EP2960326B1 (ko)
JP (1) JP6087451B2 (ko)
KR (1) KR101577134B1 (ko)
CN (1) CN106459881B (ko)
AU (1) AU2015249090B2 (ko)
MY (1) MY172440A (ko)
PL (1) PL2960326T3 (ko)
RU (1) RU2636467C2 (ko)
SG (1) SG11201609397WA (ko)
UA (1) UA118022C2 (ko)
WO (1) WO2015170914A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021167279A1 (en) * 2020-02-18 2021-08-26 Pico Entech Co., Ltd. Saccharomyces cerevisiae kwon p-1, 2, 3 which produce aldehyde dehydrogenase and glutathione

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3309247A4 (en) * 2015-06-12 2019-01-09 Cj Cheiljedang Corporation MICROORGANISM HAVING IMPROVED LACTIC ACID PRODUCTION AND METHOD FOR PRODUCING LACTIC ACID USING THE SAME
KR20200040017A (ko) * 2018-10-08 2020-04-17 에스케이이노베이션 주식회사 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
FI20195716A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-01 Finnfoam Oy Genetically modified fungi and related methods and uses
KR102460570B1 (ko) * 2020-02-18 2022-10-28 주식회사 피코엔텍 신규한 돌연변이 효모를 함유하는 아토피 억제 조성물
KR20210158676A (ko) 2020-06-24 2021-12-31 에스케이이노베이션 주식회사 젖산 생산능이 증가된 재조합 내산성 효모
KR102460589B1 (ko) * 2021-02-17 2022-10-28 주식회사 피코엔텍 글루타치온과 알데히드탈수소효소를 함유하는 숙취해소제
WO2024117697A1 (en) * 2022-12-01 2024-06-06 PICOENTECH Co., LTD. Food and pharmaceutical composition for treatment of fatty liver and inflammation by relieving endoplasmic reticulum stress

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000067653A (ko) * 1999-04-30 2000-11-25 박호군 대장균 변이주 및 형질전환 대장균 및 이를 이용한 ｄ형 또는 ｌ형 젖산의 순수 생산방법
KR20020048910A (ko) * 1999-05-21 2002-06-24 카길 다우 엘엘씨 유기 생성물의 합성방법 및 재료
US20060148050A1 (en) 1997-09-12 2006-07-06 A.E. Staley Manufacturing Co. Yeast strains for the production of lactic acid
US20100248233A1 (en) 2007-07-23 2010-09-30 Dsm Ip Assets B.V. Acetyl-coa producing enzymes in yeast
US20120021421A1 (en) 2009-02-13 2012-01-26 Jacques Amar Bacterial DNA as Markers of Cardiovascular and/or Metabolic Disease
WO2013052604A1 (en) * 2011-10-04 2013-04-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Variants of glycerol dehydrogenase having d-lactate dehydrogenase activity and uses thereof
KR20130098603A (ko) * 2012-02-28 2013-09-05 한국화학연구원 Ｄ―형 젖산 생성 변이균주 및 이를 이용한 광학 순도가 높은 ｄ―형 젖산 생산 방법
KR20130126809A (ko) * 2012-04-24 2013-11-21 씨제이제일제당 (주) 신규한 ｄ형 젖산 생산균주
KR20140001165A (ko) * 2012-06-26 2014-01-06 한국생명공학연구원 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7109010B2 (en) * 2000-11-22 2006-09-19 Nature Works Llc Methods and materials for the synthesis of organic products
US20050112737A1 (en) * 2003-11-20 2005-05-26 A. E. Staley Manufacturing Co. Lactic acid producing yeast
RU2268304C1 (ru) * 2004-06-24 2006-01-20 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) Способ микробиологического синтеза молочной кислоты и рекомбинантный штамм дрожжей schizosaccharomyces pombe для его осуществления
CA2625492A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Toray Industries, Inc. Yeast and method of producing l-lactic acid
CA2715092A1 (en) * 2006-12-21 2008-07-03 Gevo, Inc. Butanol production by metabolically engineered yeast
JP4963488B2 (ja) * 2008-04-23 2012-06-27 トヨタ自動車株式会社 変異体酵母及びこれを用いた物質生産方法
KR101114912B1 (ko) * 2008-06-24 2012-02-14 한국과학기술원 폴리락테이트와 그 공중합체 생성능이 개선된 변이 미생물을 이용한 폴리락테이트와 그 공중합체의 제조방법
JP2011254747A (ja) * 2010-06-08 2011-12-22 Toyota Central R&D Labs Inc 高級アルコール生産微生物及びその利用
FI122886B (fi) * 2010-06-24 2012-08-31 Valtion Teknillinen Geneettisesti muokattuja sieniä ja niiden käyttö lipidituotannossa

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060148050A1 (en) 1997-09-12 2006-07-06 A.E. Staley Manufacturing Co. Yeast strains for the production of lactic acid
KR20000067653A (ko) * 1999-04-30 2000-11-25 박호군 대장균 변이주 및 형질전환 대장균 및 이를 이용한 ｄ형 또는 ｌ형 젖산의 순수 생산방법
KR20020048910A (ko) * 1999-05-21 2002-06-24 카길 다우 엘엘씨 유기 생성물의 합성방법 및 재료
US20100248233A1 (en) 2007-07-23 2010-09-30 Dsm Ip Assets B.V. Acetyl-coa producing enzymes in yeast
US20120021421A1 (en) 2009-02-13 2012-01-26 Jacques Amar Bacterial DNA as Markers of Cardiovascular and/or Metabolic Disease
WO2013052604A1 (en) * 2011-10-04 2013-04-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Variants of glycerol dehydrogenase having d-lactate dehydrogenase activity and uses thereof
KR20130098603A (ko) * 2012-02-28 2013-09-05 한국화학연구원 Ｄ―형 젖산 생성 변이균주 및 이를 이용한 광학 순도가 높은 ｄ―형 젖산 생산 방법
KR20130126809A (ko) * 2012-04-24 2013-11-21 씨제이제일제당 (주) 신규한 ｄ형 젖산 생산균주
KR20140001165A (ko) * 2012-06-26 2014-01-06 한국생명공학연구원 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 82, no. 5, 2009, pages 883 - 90
BIANCHI, M. MICHELE. ET AL.: "Efficient Homolactic Fermentation by Kluyveromyces lactis Strains Defective in Pyruvate Utilization and Transformed with the Heterologous LDH Gene .", APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 67, no. 12, 2001, pages 5621 - 5625, XP002236026 *
BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM., vol. 70, no. 5, 2006, pages 1148 - 1153
CURR GENET., vol. 43, no. 3, 2003, pages 139 - 160
ISHIDA, NOBUHIRO. ET AL.: "The Effect of Pyruvate Decarboxylase Gene Knockout in Saccharomyces cerevisiae on L-Lactic Acid Production.", BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM, vol. 70, no. 5, 2006, pages 1148 - 1153, XP008129166 *
J BACTERIOL., vol. 172, no. 2, 1990, pages 678 - 685
LEE T. H. ET AL.: "Development of reusable split URA3-marked knockout vectors for budding yeast, Saccharomyces cerevisiae", J MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 16, 2006, pages 979 - 982
LEE TH ET AL., J. MICROBIOL. BIOTECHNOL., vol. 16, no. 6, 2006, pages 979 - 982
PING LIU ET AL.: "Metabolic engineering of biocatalysts for carboxylic acids production.", CSBJ., vol. 3, no. Issue, 4., 2012, pages 1 - 9, XP055177846 *
TOKUHIRO, KENRO. ET AL.: "Double mutation of the PDC1 and ADH1 genes improves lactate production in the yeast Saccharomyces cerevisiae expressing the bovine lactate dehydrogenase gene .", APPL MICROBIOL BIOTECHNOL., vol. 82, 2009, pages 883 - 890, XP019705475 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021167279A1 (en) * 2020-02-18 2021-08-26 Pico Entech Co., Ltd. Saccharomyces cerevisiae kwon p-1, 2, 3 which produce aldehyde dehydrogenase and glutathione

Also Published As

Publication number Publication date
PL2960326T3 (pl) 2019-09-30
CN106459881A (zh) 2017-02-22
RU2636467C2 (ru) 2017-11-23
RU2015130528A (ru) 2017-05-17
AU2015249090A1 (en) 2015-11-26
EP2960326B1 (en) 2019-04-03
KR20150129266A (ko) 2015-11-19
JP2016521115A (ja) 2016-07-21
AU2015249090B2 (en) 2017-04-06
JP6087451B2 (ja) 2017-03-01
EP2960326A1 (en) 2015-12-30
BR112016026286A2 (pt) 2018-02-20
CN106459881B (zh) 2020-08-25
US20180201960A1 (en) 2018-07-19
EP2960326A4 (en) 2016-11-30
KR101577134B1 (ko) 2015-12-14
UA118022C2 (uk) 2018-11-12
US20170175150A1 (en) 2017-06-22
MY172440A (en) 2019-11-26
SG11201609397WA (en) 2016-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2015170914A1 (ko) 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법
WO2016200207A1 (ko) 젖산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 젖산 제조 방법
WO2014003439A1 (ko) 에탄올 생산 경로가 봉쇄된 클루이베로마이세스 막시아누스 균주 및 이의 용도
WO2013162274A1 (ko) 신규한 ｄ형 젖산 생산균주 및 그의 용도
WO2013095071A2 (ko) Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
WO2019203436A1 (ko) 에탄올 생산 경로가 억제된 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
WO2015186990A1 (ko) O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법
WO2020075986A2 (ko) 알코올 생성이 억제된 재조합 내산성 효모 및 이를 이용한 젖산의 제조방법
WO2022231368A1 (ko) 신규한 글루타메이트 합성 효소 서브 유니트 알파 변이체 및 이를 이용한 l-글루탐산 생산 방법
WO2012046924A1 (ko) 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법
WO2013103246A2 (ko) 퀴놀린산을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 퀴놀린산의 생산 방법
WO2016199966A1 (ko) 젖산 생산이 향상된 미생물 및 이를 이용하여 젖산을 생산하는 방법
WO2015156583A1 (ko) Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
WO2022215796A1 (ko) 신규한 전사 조절자 변이체 및 이를 이용한 l-발린 생산 방법
WO2014081084A1 (ko) 부탄올 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 부탄올 생산 방법
WO2016122107A1 (ko) 2,3-부탄다이올 또는 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 세포 및 그를 사용하여 2,3-부탄다이올 또는 아세토인을 생산하는 방법
WO2022154190A1 (ko) 신규한 포스포노아세테이트 하이드롤라제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022149865A2 (ko) GlxR 단백질 변이체 또는 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
WO2022225319A1 (ko) 신규한 l-세린 암모니아 분해 효소 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022004953A1 (ko) 아세토인 생산능을 갖는 유전적으로 조작된 효모 및 이를 이용한 아세토인 생산방법
WO2024167326A1 (ko) 3-하이드록시프로피온산 생산용 재조합 미생물
WO2022154192A1 (ko) 신규한 알데하이드 디하이드로게나제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2022154173A1 (ko) 신규한 abc 트랜스포터 atp-결합 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-라이신 생산 방법
WO2022163930A1 (ko) 신규한 2-숙시닐-5-엔도피루빌-6-하이드록시-3-사이클로헥센-1-카복실레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 xmp 또는 gmp 생산 방법
WO2018212366A1 (ko) 캔디다 트로피칼리스 유래의 피루베이트 데카르복실라아제가 도입된 2,3-부탄다이올 생산용 재조합 효모 및 이를 이용한 2,3-부탄다이올의 생산방법

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015739495

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14783012

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015563134

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2015249090

Country of ref document: AU

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015130528

Country of ref document: RU

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15739495

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112016026286

Country of ref document: BR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: IDP00201608146

Country of ref document: ID

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112016026286

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20161109