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WO2014126332A1 - 금나노입자-앱타머 결합체를 기반으로 하는 단백질 전달체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

금나노입자-앱타머 결합체를 기반으로 하는 단백질 전달체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2014126332A1
WO2014126332A1 PCT/KR2013/011851 KR2013011851W WO2014126332A1 WO 2014126332 A1 WO2014126332 A1 WO 2014126332A1 KR 2013011851 W KR2013011851 W KR 2013011851W WO 2014126332 A1 WO2014126332 A1 WO 2014126332A1
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WO
WIPO (PCT)
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protein
aunp
apt
bim
results
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/011851
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이강석
배지현
성맹제
한민수
염지현
유상미
하남출
Original Assignee
중앙대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 중앙대학교 산학협력단 filed Critical 중앙대학교 산학협력단
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to a protein carrier and a method for preparing the same, and more particularly, to a protein carrier having an improved protein delivery capacity into cells by binding aptamers or protein specific aptamers of various tags to gold nanoparticles, and a method for preparing the same. .
  • nanoparticles have been used as promising tools in biomedical fields such as drug delivery, gene delivery, intracellular imaging, and phototherapy, in particular gold nanomaterials are easy to synthesize, act on, chemical stability and biocompatibility. Attention has been paid to due to the fact that the optical and electrical characteristics are adjustable.
  • materials prepared for diagnosis or treatment have to be delivered into the cell in a diagnostic or therapeutically effective amount thereof, and since the cells are impermeable to large molecules such as proteins, there is a limit to diagnosis or treatment using such proteins. There is a problem.
  • An object of the present invention is to provide a protein carrier comprising an aptamer coupled to the surface of the gold nanoparticles and the gold nanoparticles in order to solve the problems of the prior art as described above.
  • the present invention is to provide a method for producing a protein carrier comprising the step of binding the gold nanoparticles and aptamer (aptamer).
  • the present invention provides a protein carrier comprising gold nanoparticles and an aptamer bound to the surface of the gold nanoparticles.
  • the gold nanoparticles are characterized in that having a size of 10-20 nm.
  • the aptamer is characterized in that it specifically binds to the protein to be delivered.
  • the protein is characterized in that the protein labeled with a tag (tag).
  • the aptamer is characterized in that it specifically binds to the label.
  • the label is characterized in that the histidine and / or glutathione S-transferase (GST; glutathione S-transferase).
  • GST glutathione S-transferase
  • the present invention provides a method for producing a protein carrier comprising the step of binding the gold nanoparticles and aptamers.
  • the present invention provides a complex consisting of a protein carrier and a protein.
  • the present invention provides a protein delivery method comprising the step of administering the complex to a subject.
  • the protein carrier according to the present invention is capable of effectively delivering proteins into cells by specifically binding to proteins to be delivered by aptamers or protein-specific aptamers of various tags bound to gold nanoparticles, and having very low cytotoxicity. Not only harmless to the human body by using the particles, but also reflects light at various wavelengths can easily determine the location in the cell, it is expected to be useful in the diagnosis or treatment of diseases.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the production of aptamer-gold nanoparticle-protein complexes by binding His-aptamer and His-tagged protein to metal nanoparticles.
  • Figure 2 shows the results of confocal microscopy analysis of E. coli AcrA protein delivery labeled secondary antibody Rabbit-488 (Green).
  • Figure 3 shows the results of confocal microscopy analysis of E. coli AcrA protein delivery labeled secondary antibody Rabbit-584 (Red).
  • Figure 4 shows the results of confocal microscopy analysis of AcrA protein delivery when HeLa cells were treated with AcrA or His-AcrA protein with or without binding AuNP-His-Apt.
  • Figure 5 shows the results of Western blotting analysis for detecting E. coli AcrA protein.
  • Figure 6 shows the results of Western blotting analysis for AcrA protein delivery when HeLa cells were treated with AcrA or His-AcrA protein with or without AuNP-His-Apt binding.
  • Figure 7 shows the results of confocal microscopy analysis of BCL-xL protein delivery labeled secondary antibody Rabbit-488 (Green).
  • Figure 10 shows the results of Western blotting analysis for BCL-xL protein delivery when BCL-xL or His-BCL-xL protein with or without binding AuNP-His-Apt to HeLa cells.
  • FIG. 11 shows flow cytometry results for BCL-xL protein delivery labeled with Alexa488.
  • FIG. 12 shows flow cytometry results for the delivery of cy5 (Red) labeled His-aptamer gold nanocarriers and Alexa488 (Green) labeled BCL-xL proteins.
  • FIG. 13 shows flow cytometry results of BCL-xL protein delivery when HeLa cells were treated with BCL-xL or His-BCL-xL proteins with or without AuNP-His-Apt binding.
  • Figure 14 shows the results of confocal microscopy analysis of FOXL2 protein delivery labeled with secondary antibody Rabbit-Rodamine (Red).
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of analysis of confocal microscopy of HeLa cells treated with AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2 to confirm internalization of GST-FOXL2 protein by AuNP-GST-Apt. .
  • Figure 17 shows the results of Western blotting analysis of HeLa cells treated with AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2 and cultured to confirm internalization of GST-FOXL2 protein by AuNP-GST-Apt.
  • FIG. 18 is a diagram showing the result of Western blotting of nuclear extract in order to confirm the nuclear localization of GST-FOXL2.
  • FIG. 19 shows the results of real time-PCR using cDNA library synthesized from RNA isolated from HeLa cells cultured with AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2.
  • 20 is a view showing the results of confirming the transmission of BIM protein in HeLa cells by confocal microscopy by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • 21 is a diagram showing the results confirmed by flow cytometry the delivery of BIM protein in HeLa cells by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results confirmed by Western blotting analysis of the delivery of BIM protein in HeLa cells by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • Figure 23 is a diagram showing the results confirmed by flow cytometry the delivery of BIM protein in HeLa cells by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • 24 is a diagram showing the results of confirming cell viability after treatment with HeNP cells in AuNP-His-Apt-His-BIM.
  • 25 is a view showing the results of confirming the transmission of BIM protein in human primary granulosa cells by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention by confocal microscopy.
  • FIG. 26 is a diagram illustrating the results of Western blotting analysis of BIM protein delivery in human primary granulosa cells by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • FIG. 26 is a diagram illustrating the results of Western blotting analysis of BIM protein delivery in human primary granulosa cells by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • FIG. 27 is a diagram showing the results of confirming the transmission of BIM protein in KGN cells by confocal microscopy by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results confirmed by Western blotting analysis of the delivery of BIM protein in KGN cells by the gold nanoparticle-aptamer conjugate (AuNP-His-Apt) of the present invention.
  • ESA endosomal marker protein
  • LAMP1 lysosomal-associated membrane protein 1
  • FIG. 31 shows the results of flow cytometry analysis of the cells of FIG. 29 in the presence or absence of FBS.
  • FIG. 32 is a diagram showing the results obtained by treating AuNP-His-Apt-His-BIM to HeLa cells and confirming their cross section through Transmission Electron Microscopy (TEM).
  • TEM Transmission Electron Microscopy
  • FIG. 33 shows the results of quantitative analysis of aptamers to evaluate the aptamer loading capacity of gold nanoparticles (AuNP).
  • Fig. 34 shows the results of measuring protein binding ability of AuNP-His-Apt or AuNP-GST-Apt.
  • 35 is a diagram showing the results of measuring cell viability after treatment with HeLa cells at different AuNP-His-Apt concentrations (0, 0.5, 1.0 and 2 nM) and cultured.
  • FIG. 37 shows the results of measurement of tumor volume and weight change over time by AuNP-His-Apt-His-BIM complex injection in an in vivo mouse xenograft model.
  • FIG. 38 shows confocal microscopy of His-BIM delivery to tumor tissues by AuNP-His-Apt conjugates in an in vivo mouse xenograft model.
  • 40 shows the results confirmed by immunohistochemical analysis of his-BIM delivery to tumor tissues by AuNP-His-Apt conjugates in an in vivo mouse xenograft model.
  • FIG. 41 shows the results of confirming the target delivery ability of proteins by AuNP-His-Apt in an in vivo mouse xenograft model by confocal microscopy.
  • FIG. 42 shows the results of measuring the relative intensity of fluorescence in tumor and organ cross sections using Image J software to confirm target delivery ability of AuNP-His-Apt protein in an in vivo mouse xenograft model. .
  • FIG. 43 shows the results of immunohistochemical analysis of tumor tissues using anti-BIM antibodies to confirm target delivery ability of proteins by AuNP-His-Apt in an in vivo mouse xenograft model.
  • FIG. 45 shows the results of measuring the relative intensities of fluorescence in tissues using Image J software to confirm biodistribution of the AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM complex.
  • Figure 46 shows the results of confirming the change in the release of AST and LDH content by AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM to confirm the biodistribution of AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM complex The figure shown.
  • the present inventors have completed the present invention as a result of studying a protein carrier having very little cytotoxicity and excellent protein delivery ability into cells.
  • the present invention provides a protein carrier comprising gold nanoparticles and an aptamer bound to the surface of the gold nanoparticles.
  • nanoparticles means particles of various materials having a diameter in nano units, and the nanoparticles are not particularly limited as long as the particles have nano-size particles.
  • gold nanoparticle refers to a metal particle of gold having a diameter in nano units, and such small particle size facilitates the penetration of nanoparticles of the present invention into cells of interest (eg, human cells). Thereby allowing the penetration of protein carriers into the cell.
  • Gold nanoparticles are not only easy to manufacture in the form of stable particles, but also can be varied in size from 0.8 nm to 200 nm.
  • gold can be combined with various kinds of molecules such as peptides, proteins, nucleic acids, etc., to modify its structure, and reflect light at various wavelengths.
  • gold nanoparticles have advantages in that they are harmless to the human body and have high biocompatibility, and have very little cytotoxicity, unlike heavy metals such as manganese, aluminum, cadmium, lead, mercury, cobalt, nickel, and beryllium.
  • the gold nanoparticles When the gold nanoparticles are larger than 100 nm in diameter, their properties as nanoparticles disappear, and the bonding of functional groups such as thiol groups and the surface of gold without nanomaterials is weakened, and the diameter is other than 10-20 nm. Since gold nanoparticles cause cytotoxicity, the gold nanoparticles of the present invention preferably have a diameter of 10 to 20 nm.
  • aptamer means a single-stranded nucleic acid (DNA, RNA or modified nucleic acid) which has a stable tertiary structure and has a characteristic that can bind to a target molecule with high affinity and specificity.
  • SELEX Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment
  • the aptamer binding to the gold nanoparticles may use any kind of aptamer or protein specific aptamer of various tags, and is not particularly limited.
  • the protein carrier according to the present invention can effectively deliver proteins into cells by specifically binding to proteins to be delivered by aptamers or protein-specific aptamers of various tags bound to gold nanoparticles, which is useful for diagnosing or treating diseases. Can be used.
  • the present invention provides a complex made by combining the protein carrier and the protein.
  • the present invention also provides a protein delivery method comprising administering the complex to a subject.
  • subject refers to a subject in need of diagnosis or treatment of a disease, and more particularly human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle Means such mammals.
  • the histidine-tag aptamer or GST-tag aptamer to gold nanoparticles to prepare a protein carrier (see Example 2), AcrA protein by the protein carrier (Example 3)
  • the cell delivery capacity of the BCL-xL protein (Example 4), FOXL2 protein (Example 5), and BIM protein (Example 7) was confirmed, and the protein delivery system of the present invention confirmed that the proteins were effectively delivered into cells. It was.
  • the protein carrier (gold nanoparticle-aptamer conjugate) of the present invention is not only cytotoxic (see Example 10), but also can simultaneously deliver a plurality of proteins ( See Example 11).
  • antitumor activity see Example 12
  • in vivo distribution see Example 14
  • His-BIM protein was effectively delivered by AuNP-His-Apt-His-BIM injection in vivo .
  • HeLa Human cervical carcinoma cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
  • Human adult-type granulosa cell tumor-derived KGN and primary rat granulosa cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium / F12. All media contain 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Caisson, USA) and 1% penicillin-streptomycin (Welgene, Korea).
  • the gold nanoparticle-aptamer conjugate was pre-incubated at 80 ° C. for 5 minutes to prevent secondary structure formation.
  • AuNP-His / GST-Apt (1 nM) and purified His / GST-tagged protein were reacted for 10 minutes at room temperature in 1 ⁇ PBS containing 5 mM MgCl 2 (pH7.2) and then centrifuged at 13,000 ⁇ g. The supernatant was removed after separation.
  • AuNP-Apt-protein complexes were washed using TBST with 500 mM NaCl and 1M KCl.
  • HeLa cells (1 x 10 7 ) 18-20 g of 6-week-old immunodeficiency BALB / c-nu / nu mice (Central Lab Animal Inc, Korea) were injected subcutaneously and the AuNP-GST-Apt-His-BIM or AuNP-His-Apt-His-BIM complex ( complex) was injected directly into tumors (tumor volume ⁇ 0.1 cm 3 ). The length of the long and short axis of the tumor was measured daily. Mice were sacrificed 30 days after the initial infusion of the complex and tumor samples were collected for further analysis. Results were expressed as mean ⁇ SEM of tumors from 5 mice in each group, with * marks indicating significant values when compared to the corresponding control (P ⁇ 0.05).
  • Histidine-tag added protein was generated in BL21 (DE3) E. coli cells and purified by Ni-NTA agarose resin (Qiagen, USA) or GST Sepharose 4B bead (GE Life science, USA). To remove His-tag or GST-tag from the purified protein, TAGZyme system (Qiagen) and Thrombin (GE Life science) were used. For protein uptake experiments, proteins were labeled with Alexa Fluor® 488 Microscale Protein Labeling Kit (Invitrogen, USA) or Texas Red® X Protein Labeling Kit (Invitrogen).
  • HeLa cells were seeded in 96-well plates and incubated overnight to allow the cells to adhere. Cells were incubated with AuNP-His-Apt-His-BIM and cell viability was measured (Yeom, JH et al. Inhibition of Xenograft Tumor Growth by Gold Nanoparticle-DNA Oligonucleotide Conjugates-Assisted Delivery of BAX mRNA.PLoS One 8, e75369 (2013)).
  • HeLa cells were treated with AuNP-His-Apt-His-BIM and cultured for 1 hour, and then mitochondrial fractions were obtained using a mitochondria isolation kit (Thermo, USA).
  • HeLa cells were treated with AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2 for 1 hour, and then nuclear fractions were separated using NE-PER® nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo).
  • Reverse transcription and real-time PCR were performed according to known methods (Kim, JH et al. Differential apoptotic activities of wild-type FOXL2 and the adult-type granulosa cell tumor-associated mutant FOXL2 (C134W). Oncogene 30, 1653-1663 (2010)).
  • Protein carriers were prepared using his-tag aptamer and glutathione S-transferase (GST) aptamers, the schematic diagram of which is shown in FIG. 1.
  • a histidine that detects and specifically binds thereto was used. More specifically, the histidine-tag DNA aptamer is 3 'A terminal is a thiol group modified aptamer, consisting of the nucleotide sequence of 5'-GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGCAAAAAAAA-3' (SH) (SEQ ID NO: 1.)
  • SH thiol group modified aptamer
  • DNA aptamer pretreated and precipitated in Example 2-1 a was dissolved in water, and then added to gold nanoparticles, and the present inventors used gold nanoparticles (AuNP) as gold colloids purchased from BBI Life Science, UK. -15 nm (# EM.GC15) was used. Meanwhile, to confirm localization of gold nanoparticles (AuNP), gold nanoparticles (AuNP) were combined with 5'-Cy5-labeled His-aptamer (Bioneer).
  • a glutathione S-transferase (GST) was detected and a DNA aptamer (GST-tag aptamer) that specifically binds thereto was used.
  • GST-tag DNA aptamer is an aptamer modified with a thiol group at the 3 'end, and is an aptamer composed of a nucleotide sequence of 5'-CTGCCCCGCTATAGAACACCCGTTGGGCAAATGTGTTCGAAAAAAAAA-3' (SH) (SEQ ID NO: 2).
  • the GST-tag DNA aptamer was pretreated in the same manner as 2-1 a).
  • DNA aptamer pretreated and precipitated through a) of Example 2-2 was combined with gold nanoparticles in the same manner as b) of Example 2-1 to obtain a final aptamer-gold conjugate.
  • the gold nanoparticle-aptamer conjugate 1 nM prepared in Example 2-1 was treated at 80 ° C. for 5 minutes, and then cooled to room temperature. 1-2 ⁇ g / ⁇ l histidine-tag-added AcrA (His-AcrA) or histidine-tag-free AcrA protein (AcrA) was added to 5 mM MgCl 2 -PBS buffer and reacted at room temperature for 2 hours. . The reacted gold nanoparticle-aptamer-protein complex was centrifuged at ⁇ 10,000 ⁇ g for 20 minutes to remove supernatant.
  • the gold nanoparticle-aptamer-protein complex from which the supernatant was removed was treated with a human uterine cancer cell line (HeLa cell) and then incubated for 1 hour. After incubation, washed with PBS, fixed with 4% paraformaldehyde (paraformaldehyde), and the immobilized samples were immunostained (observe) with a confocal microscope (confocal microscope), the results are shown in Figures 2 and 3 Indicated.
  • Figure 2 shows the results of confocal microscopy analysis of Escherichia coli AcrA protein delivery using a secondary antibody labeled Rabbit-488 (Green)
  • Figure 3 is a secondary antibody labeled Rabbit-584 (Red)
  • Confocal microscopic analysis of E. coli AcrA protein delivery is shown. Since the histidine-tag aptamer in histidine-tag aptamer-gold nanoparticle conjugate can detect and specifically bind histidine, the histidine-tag aptamer-gold nanoparticle conjugate is shown in FIGS. 2 and 3. When combined with the histidine-tag added AcrA protein was confirmed that the intracellular protein transfer ability is very excellent than when combined with the histidine-tag removed AcrA protein.
  • AcrA or His-AcrA protein with or without binding AuNP-His-Apt was treated in HeLa cells and incubated for 1 hour, followed by Western blotting analysis using anti-AcrA antibody. 6 is shown.
  • Figure 7 shows the results of confocal microscopy analysis of BCL-xL protein delivery labeled secondary antibody Rabbit-488 (Green), as shown in Figure 7, histidine-tag aptamer-gold nano The binding of the particle conjugate to the BCL-xL protein to which the histidine-tag was added was confirmed to be superior to the intracellular protein delivery ability compared to the BCL-xL protein to which the histidine-tag was removed.
  • BCL-xL or His-BCL-xL proteins with or without binding AuNP-His-Apt were treated in HeLa cells and incubated for 1 hour, followed by mouse IgG labeled with anti-BCL-xL and Alexa 488. Immunostaining was carried out using the same, and confirmed by confocal fluorescence microscopy, and the results are shown in FIG. 8. Representative confocal fluorescence images were obtained from a 40 ⁇ water immersion objective, with a scale bar of 20 ⁇ m.
  • Figure 9 shows the results of Western blotting analysis for the detection of BCL-xL protein, as shown in Figure 9, histidine-tag aptamer-gold nanoparticle conjugate BCL-xL with histidine-tag added When combined with the protein (lane 3), it was confirmed that the BCL-xL protein is detected.
  • BCL-xL or His-BCL-xL proteins with or without AuNP-His-Apt were treated in HeLa cells and incubated for 1 hour, followed by Western blotting analysis. Indicated.
  • Composites were prepared in the same manner as -1. After preparation of the complex, the aptamer-gold nanoparticle-protein complex from which the supernatant was removed was treated with a human uterine cancer cell line (HeLa cell) and then incubated for 1 hour. After incubation, the cells were washed with PBS and dispersed again in 1 ml PBS buffer. Samples were observed using flow cytometry and the results are shown in FIGS. 11 and 12.
  • Figure 11 shows the flow cytometry results for the delivery of His-BCL-xL protein and BCL-xL protein labeled with Alexa488 (Green) fluorescent material
  • Figure 12 is a gold nano-labeled cy5 (Red)- Flow cytometer showing the number of cells having both the red wavelength of the gold nanoparticles and the green wavelength of the protein by constructing a His-BCL-xL protein and a BCL-xL protein complex labeled with an Alexa488 (Green) phosphor on the aptamer conjugate The results are shown.
  • BCL-xL or His-BCL-xL proteins with or without AuNP-His-Apt were treated with HeLa cells and incubated for 1 hour, followed by flow cytometry analysis of Alexa 488-positive cells. Is shown in FIG. 13.
  • Example 3-1 Intracellular delivery ability of GST-FOXL2 protein was confirmed in the same manner as in Example 3-1 with the gold nanoparticle-aptamer conjugate prepared in Example 2-2, and the results are shown in FIG. 14.
  • FIG. 14 shows the results of confocal microscopy analysis of FOXL2 protein delivery in which the secondary antibody is labeled with Rabbit-Rodamine (Red), and as shown in FIG. 14, the GST-tag aptamer-gold nanoparticle conjugate.
  • Red Rabbit-Rodamine
  • Example 2-2 Western blotting was performed in the same manner as in Example 3-2 with the gold nanoparticle-aptamer conjugate prepared in Example 2-2 to confirm the intracellular delivery capacity of the GST-FOXL2 protein. It is shown in 15.
  • FIG. 15 shows the results of Western blotting analysis for FOXL2 protein detection.
  • the GST-tag aptamer-gold nanoparticle conjugate was combined with the FOXL2 protein to which the GST-tag was added. In some cases (lane 3), it was confirmed that FOXL2 protein was detected.
  • the aptamer-gold nanoparticle-protein complex (AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2) prepared by reacting AuNP-GST-Apt and FOXL2 protein (GST-FOXL2) to which GST-tag was added was prepared, and this was HeLa. Cells were incubated for 1 hour and then immunostained using anti-FOXL2 and Alexa546-rabbit IgG. Cells were then observed under confocal fluorescence microscopy, and the results are shown in FIG. 16. At this time, the image was obtained from a 40 x water immersion objective, excitation at 556 nm and emission at 573 nm, with a scale bar of 20 ⁇ m.
  • FOXL2 was effectively delivered into HeLa cells. It was also confirmed that the FOXL2 protein was localized in the cell nucleus.
  • Real time-PCR was performed using a cDNA library synthesized from RNA isolated from HeLa cells treated with AuNP-GST-apt or AuNP-GST-apt-GST-FOXL2 and incubated for 1 hour. Shown in The results were expressed by normalizing by expression of glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and folding the relative expression levels. The results (mean ⁇ SEM) were obtained from the results obtained by repeating three times. Statistically significant values are indicated as P ⁇ 0.05.
  • TNF-R1 tumor necrosis factor-receptor 1
  • Fas CD95 / APO-1
  • Example 7 Experiment of confirming intracellular delivery ability of BIM protein by gold nanoparticle-aptamer conjugate
  • Aptamer-gold nanoparticle-protein complex (AuNP-His-) prepared by adding histidine-tag to AuNP-His-Apt and AuNP-His-Apt and reacting BIM protein (His-BIM) labeled with Alexa 488 Apt-His-BIM) was treated in human uterine cancer cell lines (HeLa cells) and incubated for 1 hour, and then stained with Mitotracker (red) and DAPI, and observed by confocal fluorescence microscopy. The results are shown in FIG. It was.
  • the final concentrations of AuNP-His-Apt and His-BIM used were 1 nM and 0.4 ⁇ M, respectively, and the cells were visualized using an ax 40 water immersion objective, and the scale bar was 20 ⁇ m.
  • HeLa cells cultured with AuNP-His-Apt loaded with His-BIM protein (Alexa 488-His-BIM) labeled with Alexa 488 showed green fluorescence of Alexa 488, whereas AuNP It was confirmed that no signal was observed in cells treated with -His-Apt alone. In addition, it was confirmed that His-BIM protein delivered by AuNP-His-Apt was largely localized to mitochondria. From the above results, it was found that His-BIM protein was delivered into cells by the aptamer-gold nanoparticle conjugate of the present invention.
  • Alexa 488-His-BIM was treated with HeLa cells with or without reacting with AuNP-His-Apt, incubated for 1 hour, and observed using flow cytometry. The results are shown in FIG. 21. .
  • Aptamer-gold nanoparticle-protein complex (AuNP-His-Apt-His-BIM), which combines AuNP-His-Apt and His-BIM protein, was incubated in HeLa cells for 1 hour, and then Western blotting ) Analysis was performed and the results are shown in FIG. 22. Meanwhile, efficient separation of mitochondrial and cytoplasmic fractions was confirmed by Western blotting using anti-Cox IV and anti- ⁇ -actin, respectively.
  • His-BIM protein delivered by AuNP-His-Apt was delivered into cells, and particularly localized to mitochondria.
  • Annexin V-positive killer cells increased when AuNP-His-Apt-His-BIM was treated than the control group. From the above results, it was found that His-BIM protein was delivered into cells by the aptamer-gold nanoparticle conjugate of the present invention.
  • KGN cells were treated with AuNP-His-Apt (1 nM) or AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM complexes and incubated for 1 hour, and observed by confocal fluorescence microscopy. Indicated. At this time, the cells were visualized using an a ⁇ 40 water immersion objective, and the scale bar was 20 ⁇ m.
  • KGN cells were treated with AuNP-His-Apt (1 nM) or AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM complexes and incubated for 1 hour, followed by western blotting analysis. Is shown in FIG. 28.
  • aptamer-gold nanoparticle conjugate (Cy5-AuNP-His-Apt) labeled with Cy5 (Cyanine 5) fluorophore at the aptamer 5 'end and Cy5-AuNP-His-Apt and Alexa 488
  • the aptamer-gold nanoparticle-protein complex (Cy5-AuNP-His-Apt-His-BIM) prepared by reacting BIM protein (His-BIM) was treated with HeLa cells, incubated for 1 hour, and then confocal. Observation was made under a fluorescence microscope and the results are shown in FIG. 29. At this time, the cells were visualized using a 40 x water immersion objective, and the scale bar was 20 ⁇ m.
  • confocal fluorescence microscopic analysis of endosomal marker proteins (early endosome antigen 1 (EEA), or lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1)) was performed, and the results are shown in FIG. 30. More specifically, AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM was treated with HeLa cells and incubated for 1 or 3 hours, and then treated with anti-EEA-1 (1: 500) and anti-LAMP1 (1: 100). The reaction was observed by confocal fluorescence microscopy. At this time, counterstain was performed with Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (1: 1,000) and Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (1: 1,000).
  • EAA endosome antigen 1
  • LAMP1 lysosomal-associated membrane protein 1
  • the cells were subjected to flow cytometry in the presence or absence of FBS, and the results are shown in FIG. 31.
  • the percentages shown in FIG. 31 are positive cell populations for both Cy5 and Alexa 488.
  • AuNP-His-Apt-His-BIM was treated in HeLa cells (1 ⁇ 10 7 ) and incubated for 15 or 30 minutes, respectively, trypsizined, centrifuged, and then with phosphate buffered saline (PBS). Washed. Once the trypsin is removed, the cell pellet is fixed in Karnovsky's glutaraldehyde-paraformaldehyde mixture in 0.2 M cacodylate buffer (pH 7.4) at room temperature for about 3 hours, and the pellet is cacodylate buffer (to remove the fixative). pH 7.4).
  • Aptamers were quantitatively analyzed to assess the loading capacity of AuNPs for His-apt or GST-apt.
  • the protein binding ability of AuNP-His-Apt or AuNP-GST-Apt was measured. More specifically, known amounts of His-BIM, His-BCL-xL, His-AcrA, or GST-FOXL2 were developed on SDS-PAGE to be used as a standard. AuNP-Apt (1 nM) in 10 ⁇ l binding buffer was reacted with His-BIM, His-BCL-xL, His-AcrA, or GST-FOXL2 at the indicated concentrations and analyzed by SDS-PAGE. The amount of protein bound to AuNP was measured by the intensity of the band compared to the standard, and the results are shown in FIG. 34. On the other hand, dissociation constants (K D ) were obtained based on the slope calculated from the graph of the right panel.
  • K D dissociation constants
  • HeLa cells were treated with different AuNP-His-Apt concentrations (0, 0.5, 1.0 and 2 nM) and cultured for 12 hours, and then cell viability was measured. The results are shown in FIG. 35. On the other hand, the results (mean ⁇ SEM) were obtained from the results of experiments performed three times.
  • Annexin V-positive killer cells were identified by flow cytometry, and the results are shown in FIG. 35.
  • DAPI was used for nuclear staining, cells were imaged with ax 40 water immersion objective (Scale bar; 20 ⁇ m) and detection of Alexa 488-labeled mouse IgG or Alexa 546-labeled-rabbit IgG was performed. Each protein was identified through.
  • AuNPs bound with both His-tag and GST-tag aptamers confirmed that each of the two proteins (His-BCL-xL and GST-FOXL2) were delivered into the appropriate intracellular compartments.
  • His-BCL-xL and GST-FOXL2 were delivered into the appropriate intracellular compartments.
  • HeLa cells are injected into nude mice to develop cervical cancer, and 0.5 mg / kg AuNP-His-Apt-His-BIM complex is injected into xenograft tumors every two days, over time.
  • Tumor volume (cm 3 ) was calculated using the following equation, and the results are shown in FIG. 37. Meanwhile, the control mice were injected with AuNP-GST-Apt-His-BIM complex
  • AuNP-His-Apt conjugate To confirm His-BIM delivery efficiency to tumor tissue by AuNP-His-Apt conjugate, AuNP-His-Apt loaded with His-BIM protein (Alexa 488-His-BIM) labeled with Alexa 488 was injected. Tumor sections prepared from mice were confirmed by confocal fluorescence microscopy, and the results are shown in FIG. 38. At this time, the scale bar was 200 ⁇ m.
  • TUNEL analysis confirmed increased BIM protein-mediated apoptosis (apoptotic cell death), and the results are shown in FIG. 40. More specifically, dead cells were observed using a terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay kit (Roche, USA).
  • Xenograft tumors were generated by intraperitoneally injecting epidermal growth factor receptor (EGFR) -expressing A431 human epidermoid carcinoma cells into nude mice. After 10 days, AuNP- (His-GST) -Apt loaded with only His-BIM, or AuNP- (His-GST) -Apt loaded with both His-BIM and GST-EGF (0.5 mg / kg of body weight) was injected through the tail vein into mice with tumors. At this time, His-BIM and GST-EGF were labeled with Alexa 488 and Texas Red, respectively.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • mice were sacrificed and organs (brain, liver, spleen, ovary) were recovered, and cross-sections of xenograft tumor tissues were observed by confocal fluorescence microscopy, and the results are shown in FIG. 41.
  • the scale bar was 200 ⁇ m.
  • a strong green signal reflecting efficient BIM protein delivery was observed in the case of AuNP-Apt with both Texas Red labeled EGF and Alexa 488 labeled BIM bound, whereas in the absence of EGF protein Less BIM protein delivery could be confirmed.
  • the gold nanoparticle-aptamer conjugate of the present application can target delivery of protein in vivo .
  • the protein carrier according to the present invention is capable of effectively delivering proteins into cells by specifically binding to proteins to be delivered by aptamers or protein-specific aptamers of various tags bound to gold nanoparticles, and having very low cytotoxicity. Not only harmless to the human body by using the particles, but also reflects light at various wavelengths can easily determine the location in the cell, it is expected to be useful in the diagnosis or treatment of diseases.

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Abstract

본 발명은 금 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 앱타머(aptamer)를 포함하는 단백질 전달체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질 전달체는 금 나노입자에 결합한 다양한 tag의 앱타머 또는 단백질 특이적 앱타머가 전달하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하여 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있고, 매우 적은 세포독성을 갖는 금 나노입자를 이용하여 인체에 무해할 뿐만 아니라, 다양한 파장에서 빛을 반사하여 세포 내에서의 위치를 쉽게 확인할 수 있는바, 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

금나노입자-앱타머 결합체를 기반으로 하는 단백질 전달체 및 이의 제조 방법
본 발명은 단백질 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 금 나노입자에 다양한 tag의 앱타머 또는 단백질 특이적 앱타머를 결합하여 세포 내로 단백질 전달능이 향상된 단백질 전달체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
세포수준에서 병의 진단과 치료를 위해서 탐침 혹은 치료물질을 특정 세포나 세포 내 소기관으로 이동시키는 것은 매우 중요하다. 따라서 현재 유전자, 단백질 또는 치료제 등과 같은 타겟 물질을 세포 내에 존재하는 다양한 방해 요소들을 극복하고 세포막을 거쳐 핵막 내부까지 전달하기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있다(참조문헌: Yu Jin Kim, Sang-Mi Ryou, Sudeok Kim, Ji-Hyun Yeom, Min Su Han, Kangseok Lee, Maeng-Je Seong, Enhanced protein-mediated binding between oligonucleotidegold nanoparticle composites and cell surfaces: co-transport of proteins and composites, J. Mater. Chem., 2012, 22, 25036).
한편, 나노입자(nanoparticle)는 약물 전달, 유전자 전달, 세포 내 영상, 광선치료와 같은 생체의학 분야에서 촉망되는 도구로서 사용되어 왔으며, 특히 금 나노소재는 합성과 작용의 용이성, 화학적 안정성, 생체 적합성, 및 조정 가능한 광학적 및 전기적 특성으로 인해 많은 관심을 받고 있다.
일반적으로, 진단 또는 치료를 위해 제조되는 물질들은 이것의 진단 또는 치료학적 유효량이 세포 내로 전달되어야 하는데, 세포는 단백질 등과 같은 거대 분자에 대해서 불투과성이기 때문에, 이러한 단백질을 이용한 진단 또는 치료에는 한계가 있는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 전기충격(electroporation), 리포좀을 이용한 막 융합, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등과 같이 단백질 등의 거대 분자들을 세포 외부나 표적 세포의 표면에서 작용시켜 세포 내로 전달시키기 위한 여러 가지 방법들이 개발되었으나, 이러한 방법들은 세포 내 전달능이 떨어져 전달하고자 하는 전체 세포 수 중 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 영향을 주는 경향을 나타내는 단점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 금 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 앱타머(aptamer)를 포함하는 단백질 전달체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
또한 본 발명은 금 나노입자와 앱타머(aptamer)를 결합시키는 단계를 포함하는 단백질 전달체 제조 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 금 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 앱타머(aptamer)를 포함하는 단백질 전달체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 금 나노입자는 10-20 nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 앱타머는 운반되는 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질은 표지물질(tag)로 표지된 단백질인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 앱타머는 상기 표지물질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 표지물질은 히스티딘 및/또는 글루타티온 S-전달효소(GST; glutathione S-transferase)인 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 금 나노입자와 앱타머(aptamer)를 결합시키는 단계를 포함하는 단백질 전달체 제조 방법을 제공한다.
더욱이, 본 발명은 단백질 전달체와 단백질이 결합하여 이루어진 복합체를 제공한다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 단백질 전달 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단백질 전달체는 금 나노입자에 결합한 다양한 tag의 앱타머 또는 단백질 특이적 앱타머가 전달하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하여 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있고, 매우 적은 세포독성을 갖는 금 나노입자를 이용하여 인체에 무해할 뿐만 아니라, 다양한 파장에서 빛을 반사하여 세포 내에서의 위치를 쉽게 확인할 수 있는바, 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 금속 나노입자에 His-앱타머와 His-tagged 단백질을 결합하여 앱타머-금나노입자-단백질 복합체를 제조하는 개략적인 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2는 이차항체가 Rabbit-488(Green)로 표지된 대장균 AcrA 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 이차항체가 Rabbit-584(Red)로 표지된 대장균 AcrA 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 AcrA 또는 His-AcrA 단백질을 HeLa 세포에 처리한 경우의 AcrA 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 대장균 AcrA 단백질 검출을 위한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 AcrA 또는 His-AcrA 단백질을 HeLa 세포에 처리한 경우의 AcrA 단백질 전달에 대한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 이차항체가 Rabbit-488(Green)로 표지된 BCL-xL 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 BCL-xL 또는 His-BCL-xL 단백질을 HeLa 세포에 처리한 경우의 BCL-xL 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 BCL-xL 단백질 검출을 위한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 BCL-xL 또는 His-BCL-xL 단백질을 HeLa 세포에 처리한 경우의 BCL-xL 단백질 전달에 대한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은 Alexa488로 표지된 BCL-xL 단백질 전달에 대한 유세포 분석기 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 cy5(Red)가 표지된 His-앱타머 금나노 전달체와 Alexa488(Green)로 표지된 BCL-xL 단백질 전달에 대한 유세포 분석기 결과를 나타낸 도면이다.
도 13은 AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 BCL-xL 또는 His-BCL-xL 단백질을 HeLa 세포에 처리한 경우의 BCL-xL단백질 전달에 대한 유세포 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 이차항체가 Rabbit-Rodamine(Red)로 표지된 FOXL2 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 FOXL2 단백질 검출을 위한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 AuNP-GST-Apt에 의한 GST-FOXL2 단백질의 내재화(internalization) 확인을 위해 AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2를 처리하여 배양한 HeLa 세포를 공초점 현미경으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 AuNP-GST-Apt에 의한 GST-FOXL2 단백질의 내재화(internalization) 확인을 위해 AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2를 처리하여 배양한 HeLa 세포를 웨스턴 블로팅 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 18은 GST-FOXL2의 핵내 위치(nuclear localization)를 확인하기 위해, 핵 추출물(nuclear extract)의 웨스턴 블로팅을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2를 처리하여 배양한 HeLa 세포로부터 분리된 RNA로부터 합성된 cDNA library를 사용하여 Real time-PCR을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 HeLa cell 내 BIM 단백질의 전달을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 HeLa cell 내 BIM 단백질의 전달을 유세포 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22는 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 HeLa cell 내 BIM 단백질의 전달을 웨스턴 블로팅 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 HeLa cell 내 BIM 단백질의 전달을 유세포 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 24는 AuNP-His-Apt-His-BIM을 HeLa 세포에 처리한 후, 세포 생존능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 25는 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 Human primary granulosa cell 내 BIM 단백질의 전달을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 26은 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 Human primary granulosa cell 내 BIM 단백질의 전달을 웨스턴 블로팅 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 27은 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 KGN cells 내 BIM 단백질의 전달을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 28은 본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 KGN cells 내 BIM 단백질의 전달을 웨스턴 블로팅 분석법으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 29는 Cy5-AuNP-His-Apt-His-BIM을 HeLa 세포에 처리한 후, AuNP-His-Apt (Red) 및 His-BIM (Green)이 세포 내에서 공존(colocalization)하고 있음을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 30은 endosomal marker proteins(early endosome antigen 1 (EEA), or lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1))의 공초점 형광 현미경 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 31은 도 29의 세포를 FBS의 존재 또는 부존재 상에서 유세포 분석을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 32는 AuNP-His-Apt-His-BIM을 HeLa 세포에 처리한 후, 이의 단면을TEM(Transmission Electron Microscopy)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 33은 금 나노입자(AuNP)의 앱타머 적재 능력(loading capacity)을 평가하기 위해 앱타머의 정량분석을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 34는 AuNP-His-Apt 또는 AuNP-GST-Apt의 단백질 결합 능력을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 35는 HeLa 세포에 AuNP-His-Apt 농도를 달리하여(0, 0.5, 1.0 및 2nM) 처리하고 배양한 후 세포 생존능을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 36은 His-tag 및 GST-tag 앱타머 모두와 결합된 AuNP이 두 개의 각 단백질(His-BCL-xL 및 GST-FOXL2)을 적절한 세포 내 구획(compartment) 내로 전달하였음을 공초점 현미경 및 웨스턴 블로팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 37은 In vivo 마우스 이종이식 모델에서 AuNP-His-Apt-His-BIM 복합체 주입에 의한 시간별 종양 체적 및 무게 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 38은 In vivo 마우스 이종이식 모델에서 AuNP-His-Apt 결합체에 의한 종양조직으로의 His-BIM 전달을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 39는 In vivo 마우스 이종이식 모델에서 AuNP-His-Apt 결합체에 의한 종양조직으로의 His-BIM 전달을 웨스턴 블로팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 40은 In vivo 마우스 이종이식 모델에서 AuNP-His-Apt 결합체에 의한 종양조직으로의 His-BIM 전달을 면역조직화학 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 41은 In vivo 마우스 이종이식 모델에서 AuNP-His-Apt에 의한 단백질의 표적 전달능을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 42는 In vivo 마우스 이종이식 모델에서 AuNP-His-Apt에 의한 단백질의 표적 전달능을 확인하기 위해, 종양과 장기 단면에서 형광의 상대적 강도를 Image J software를 사용하여 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 43은 In vivo 마우스 이종이식 모델에서 AuNP-His-Apt에 의한 단백질의 표적 전달능을 확인하기 위해, anti-BIM 항체를 사용하여 종양 조직의 면역조직화학 분석을 실시한 결과를 나타낸 도면이다.
도 44는 AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM 복합체의 생체 내 분포 (biodistribution) 확인을 위해, AuNP-His-apt에 의한 His-BIM 단백질의 전신 분포를 공초점 현미경 및 웨스턴 블로팅 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 45는 AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM 복합체의 생체 내 분포 (biodistribution) 확인을 위해, 조직에서의 형광의 상대적 강도를 Image J software를 사용하여 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 46은 AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM 복합체의 생체 내 분포 (biodistribution) 확인을 위해, AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM에 의한 AST 및 LDH 함량의 방출 변화를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명자들은 매우 적은 세포독성을 가지면서 세포 내로 단백질 전달능이 우수한 단백질 전달체에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 금 나노입자 및 상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 앱타머(aptamer)를 포함하는 단백질 전달체를 제공한다.
본 발명에서 "나노입자(nanoparticle)"란, 나노 단위의 직경을 가지는 다양한 물질의 입자를 의미하며, 상기 나노입자는 나노크기를 갖는 입자라면 특별히 제한되지는 않는다.
본 발명에서 "금 나노입자"란, 나노 단위의 직경을 가지는 금의 금속입자를 의미하며, 이러한 작은 입자 크기는 본 발명의 나노입자가 목적의 세포(예컨대, 인간 세포)로 침투하는 것을 용이하게 하여 세포 내에 단백질 전달체의 침투를 가능하게 한다.
금 나노입자는 안정한 입자의 형태로 제조가 쉬울 뿐만 아니라 0.8nm에서 200nm까지 다양하게 사용목적에 맞추어 크기를 변화시킬 수 있다. 또한, 금은 다양한 종류의 분자들, 예컨대 펩타이드, 단백질, 핵산 등과 함께 결합하여 구조를 변형시킬 수 있고, 다양한 파장에서 빛에 반사하는바, 이를 이용해 세포 내에서의 위치를 쉽게 확인할 수 있다. 더욱이, 금 나노입자는 망간, 알루미늄, 카드늄, 납, 수은, 코발트, 니켈, 베릴륨 등의 중금속과 달리 인체에 무해하여 높은 생체친화성을 가지며, 매우 적은 세포 독성을 가지는 장점이 있다.
금 나노입자는 직경이 100 nm 이상으로 커질 경우 나노 입자로서의 특성이 소멸될 뿐 아니라, 나노 물질의 특성이 없는 금 표면과 티올기 등의 작용기와의 결합이 약해지고, 직경이 10-20 nm 이외의 금 나노 입자는 세포독성을 유발하기 때문에, 본 발명의 금 나노입자는 직경은 10~20 nm의 크기를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에서, "앱타머 (aptamer)"란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산 (DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment)라는 방법으로 원하는 다양한 목적 물질 (단백질, 당, 염색물질, DNA,금속이온, 세포 등)에 대한 앱타머를 개발할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 전달체에서, 금 나노입자와 결합하는 앱타머는 다양한 tag의 앱타머 또는 단백질 특이적 앱타머의 어떠한 종류도 사용할 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 단백질 전달체는 금 나노입자에 결합한 다양한 tag의 앱타머 또는 단백질 특이적 앱타머가 전달하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하여 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있는바, 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
이에, 본 발명은 상기 단백질 전달체와 단백질이 결합하여 이루어진 복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 단백질 전달 방법을 제공한다. 본 발명에서 "개체"란 질병의 진단 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 일실시예에서는, 금 나노입자에 히스티딘-tag 앱타머 또는 GST-tag 앱타머를 결합하여 단백질 전달체를 제조하고(실시예 2 참조), 상기 단백질 전달체에 의한 AcrA 단백질(실시예 3), BCL-xL 단백질(실시예 4), FOXL2 단백질(실시예 5), BIM 단백질(실시예 7)의 세포 전달능을 확인한 결과, 본 발명의 단백질 전달체에 의해 상기 단백질들이 세포 내로 효과적으로 전달되었음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 금 나노입자(AuNP)의 앱타머 적재 능력(loading capacity)을 평가한 결과, 25 앱타머가 하나의 AuNP에 적재됨을 확인하였다(실시예 9 참조).
더욱이, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 단백질 전달체(금나노입자-앱타머 결합체)는 세포독성이 없을 뿐만 아니라(실시예 10 참조), 복수의 단백질을 동시에 전달할 수 있음을 확인하였다(실시예 11 참조).
뿐만 아니라, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 in vivo에서의 AuNP-His-Apt-His-BIM 주입에 의해 항종양 활성(실시예 12 참조) 및 생체 내 분포(실시예 14 참조)를 확인한 결과, in vivo에서도 AuNP-His-Apt-His-BIM 주입에 의해 His-BIM 단백질이 효과적으로 전달됨을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험 방법
1-1. 동물 준비
18-20g의 6주령 면역결핍 BALB/c-nu/nu 마우스(Central Lab Animal Inc, Korea)와 18일차 Sprague-Dawley 랫트(Samtako, Korea)에 2 mg의 diethylstilbesterol (DES; Sigma)를 3일 동안 매일 피하주사하였고, 동물사육실은 30-40% 습도와 22±1℃의 온도를 유지하였다. 실내의 조명은 12-h light/dark 주기로 하였다. 동물 프로토콜은 동물 실험에 대한 중앙대 Support Center에 의해 승인되었고, 동물은 프로토콜에 기재된 대로 처리되었다.
1-2. 동물세포배양(mammalian cell culture)
HeLa (Human cervical carcinoma) 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 배양되었다. A431 (Human epidermoid carcinoma) 세포는 2.5 mM HEPES(N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethanesulfonate) 버퍼를 포함한 RPMI 배지에서 배양되었다. Human adult-type granulosa cell tumor-derived KGN 및 primary rat granulosa 세포는 Dulbecco's modified Eagle's medium/F12에서 배양되었다. 모든 배지는 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Caisson, USA) 및 1% penicillin-streptomycin (Welgene, Korea)을 포함한다.
1-3. 금나노입자-앱타머-단백질 복합체 제조(Preparation of the AuNP-Apt-protein complex)
금나노입자-앱타머 결합체는 이차 구조의 형성을 방지하기 위해 80℃에서 5분 간 pre-incubate 시켰다. AuNP-His/GST-Apt (1 nM) 및 정제된 His/GST-tagged 단백질은 5 mM MgCl2(pH7.2)가 포함된 1x PBS에서 상온에서 10분 동안 반응시켰고, 이후 13,000 × g에서 원심분리 후 상층액을 제거하였다. AuNP-Apt-protein 복합체는 500 mM NaCl 및 1M KCl이 추가된 TBST를 사용하여 세척되었다.
1-4. In vivo 마우스 이종이식 모델( In vivo mouse xenograft model)
HeLa 세포(1 x 107)를 18-20g의 6주령 면역결핍 BALB/c-nu/nu 마우스(Central Lab Animal Inc, Korea)에 피하주사하였고, AuNP-GST-Apt-His-BIM 또는 AuNP-His-Apt-His-BIM 복합체(complex)를 종양(tumor volume ~ 0.1 cm3)에 직접 주사하였다. 종양의 길고 짧은 축의 길이를 매일 측정하였다. 복합체의 최초 주입 후 30일 째에 마우스를 희생시킨 후, 추가 분석을 위해 종양 샘플을 수집하였다. 결과는 각 그룹 내 5마리 마우스의 종양의 평균±S.E.M.으로 나타내었고, * 표시는 대응하는 대조군(P < 0.05)과 비교할 때 유의한 값을 나타낸다.
1-5. 재조합 단백질 정제(Recombinant protein purification)
히스티딘-tag가 첨가된 단백질은 BL21 (DE3) E. coli 세포에서 생성되었고, Ni-NTA agarose resin (Qiagen, USA) 또는 GST Sepharose 4B bead (GE Life science, USA)에 의해 정제되었다. 정제된 단백질에서 His-tag 또는 GST-tag를 제거하기 위해, TAGZyme 시스템(Qiagen) 및 Thrombin (GE Life science)을 이용하였다. 단백질 흡수(uptake) 실험을 위해, 단백질은 Alexa Fluor® 488 Microscale Protein Labeling Kit (Invitrogen, USA) 또는 Texas Red® X Protein Labeling Kit (Invitrogen)로 표지되었다.
1-6. 공초점 현미경을 이용한 금 나노입자-앱타머 결합체에 의한 단백질 전달능 분석
세포 내로 단백질 전달을 관찰하기 위해, 라이신 코팅된 10mm 커버 슬립(cover slip) 상에서 배양된 세포에 금 나노입자-앱타머-단백질 복합체(AuNP-Apt-protein complex)를 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)(Sigma, USA)로 고정시켰다. 공초점 현미경(laser scanning confocal microscopy (Carl Zeiss ZEN 2011, Germany)을 통하여 Alexa488 (495 nm excitation, 519 nm emission), Alexa546 (556 nm excitation, 573 nm emission), 및 Cy5 (646 nm excitation, 670 nm emission) 형광을 탐지하였다. 상대적인 형광 강도는 Image J software (NIH, USA)를 사용하여 측정하였다.
1-7. 세포 생존능 분석(Cell viability assay)
HeLa 세포를 96-well 플레이트에 접종하고, 세포가 부착되도록 하룻밤 배양하였다. 세포를 AuNP-His-Apt-His-BIM와 배양시키고, 세포 생존능을 측정하였다(Yeom, J.H. et al. Inhibition of Xenograft Tumor Growth by Gold Nanoparticle-DNA Oligonucleotide Conjugates-Assisted Delivery of BAX mRNA. PLoS One 8, e75369 (2013)).
1-8. 초원심세포분획법(Subcellular fractionation)
HeLa 세포에 AuNP-His-Apt-His-BIM을 처리하여 1시간 배양 후, mitochondria isolation kit(Thermo, USA)를 사용하여 미토콘드리아 분획을 얻었다.
HeLa 세포에 AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2를 처리하여 1시간 배양 후, NE-PER® nuclear and cytoplasmic extraction reagents (Thermo)를 사용하여 핵 분획을 분리하였다.
1-9. 역전사 및 real-time PCR analysis
역전사 및 real-time PCR은 기존에 공지된 방법에 따라 진행되었다(Kim, J.H. et al. Differential apoptotic activities of wild-type FOXL2 and the adult-type granulosa cell tumor-associated mutant FOXL2 (C134W). Oncogene 30, 1653-1663 (2010)).
1-10. 면역조직화학적 분석(Immunohistochemical analysis)
종양 단면을 준비하고, 면역 염색을 하였다(Biomaterials). 항체 희석액(antibody diluent)(Dako, USA)에 희석된 폴리클로날 anti-BIM 항체 (1:100) (Santa Cruz Biotechnology, USA)를 사용하였다.
1-11. 통계 분석
측정된 값들의 비교분석은 Student-Newman-Keuls test (SAS, USA)에 의해 수행되었고, 유의한 값들은 Student's t-test (SAS)를 사용하여 대조군과의 비교에 의해 분석되었다. 데이터는 평균±SEM으로 나타내었고, P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다. 중요한 결과의 P값이 표시되었다.
실시예 2. 금나노입자-앱타머 결합체의 단백질 전달체 제조
his-tag 앱타머 및 글루타티온 S-전달효소(GST; glutathione S-transferase) 앱타머를 이용하여 단백질 전달체를 제조하였고, 이의 개략적인 모식도는 도 1에 나타내었다.
2-1. his-tag 앱타머를 이용한 단백질 전달체(AuNP-His-Apt) 제조
가) DNA 앱타머 전처리
본 발명에 따른 단백질 전달체를 제조하기 위해, 히스티딘((histidine)을 탐지하여 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(his-tag aptamer)를 사용하였다. 보다 구체적으로, 상기 히스티딘-tag DNA 앱타머는 3'말단이 티올기로 변형된 앱타머로서, 5'-GCTATGGGTGGTCTGGTTGGGATTGGCCCCGGGAGCTGGCAAAAAAAAAA-3'(SH)(서열번호 1)의 염기서열로 이루어졌다. 건조된 상기 DNA 앱타머를 최종 농도가 100 μM이 되도록 물에 녹인 후, 50 μl의 올리고에 10 μl의 1N DTT(dithiothreitol)를 넣고, 실온에서 15분간 반응시켰다. 원하지 않은 티올기 분자를 포함한 DTT를 제거하기 위해, 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 50 μl를 넣고 섞은 후, 원심분리하여 상층액을 제거하였으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 에탄올 침전법(EtOH precipitating method)을 이용하여 앱타머를 침전시켰다.
나) 금 나노입자와 DNA 앱타머 결합
실시예 2-1의 가)를 통해 전처리되어 침전된 DNA 앱타머를 물에 녹인 후, 이를 금 나노입자에 첨가하였으며, 본 발명자들은 금 나노입자(AuNP)로 영국 BBI Life Science로부터 구입한 Gold colloid-15nm(#EM.GC15)을 사용하였다. 한편, 금 나노입자(AuNP)의 localization을 확인하기 위해, 금 나노입자(AuNP)를 5'-Cy5-labeled His-aptamer (Bioneer)와 결합하였다.
2 nM의 금 나노입자에 앱타머를 넣고(DNA: AuNP = 100:1) 충분히 섞은 후, 최종 농도가 10 mM이 되도록 0.5 M citrate buffer(pH3)를 첨가하여 혼합하였다. 실온에서 3-5분간 반응시킨 후, 반응이 끝나면 금의 중화를 위해 최종농도가 30 mM이 되도록 0.5 M HEPES buffer(pH7.6)를 넣고 실온에서 10분간 반응시켰다. 앱타머와 금의 혼합물은 ~10,000 x g에서 20 분간 원심분리하여 모은 뒤 상층액에 있는 반응하지 않은 올리고를 제거하였고, 이 과정을 3회 반복하였다. 최종 앱타머-금 결합물은 5 mM HEPES buffer(pH 7.6)에 넣고 분산시켰다.
2-2. GST-tag 앱타머를 이용한 단백질 전달체(AuNP-GST-Apt) 제조
가) DNA 앱타머 전처리
본 발명에 따른 단백질 전달체를 제조하기 위해, 글루타티온 S-전달효소(GST; glutathione S-transferase)를 탐지하여 이에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머(GST-tag aptamer)를 사용하였다. 보다 구체적으로, 상기 GST-tag DNA 앱타머는 3'말단이 티올기로 변형된 앱타머로서, 5'-CTGCCCCGCTATAGAACACCCGTTGGGCAAATGTGTTCGAAAAAAAAAAA-3'(SH)(서열번호 2)의 염기서열로 이루어진 앱타머이고, 상기 실시예 2-1의 가)와 동일한 방법으로 상기 GST-tag DNA 앱타머를 전처리하였다.
나) 금 나노입자와 DNA 앱타머 결합
실시예 2-2의 가)를 통해 전처리되어 침전된 DNA 앱타머를 실시예 2-1의 나)와 동일한 방법으로 금 나노입자와 결합하여, 최종 앱타머-금 결합물을 얻었다.
실시예 3. 금 나노입자-앱타머 결합체에 의한 대장균 AcrA 단백질의 세포 내 전달능 확인 실험
3-1. 공초점 현미경 분석
실시예 2-1에 의해 제조된 금 나노입자-앱타머 결합체 1 nM을 80℃에서 5분간 처리 후 실온까지 온도를 낮췄다. 여기에 1-2 μg/μl의 히스티딘-tag가 첨가된 AcrA(His-AcrA) 또는 히스티딘-tag가 제거된 AcrA 단백질(AcrA)과 5 mM MgCl2-PBS 버퍼에 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응시킨 금 나노입자-앱타머-단백질 복합체를 ~10,000 x g에서 20분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다.
상층액을 제거한 금 나노입자-앱타머-단백질 복합체를 인간자궁암세포주(HeLa cell)에 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 세척한 뒤 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시키고, 고정시킨 샘플을 면역염색(immunostaining)한 후 공초점현미경(confocal microscope)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.
보다 구체적으로, 도 2는 Rabbit-488(Green)로 표지된 이차항체를 사용한 대장균 AcrA 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 3은 Rabbit-584(Red)로 표지된 이차항체로 대장균 AcrA 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이다. 히스티딘-tag 앱타머-금 나노입자 결합체에서 히스티딘-tag 앱타머는 히스티딘을 탐지하여 이에 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 히스티딘-tag 앱타머-금 나노입자 결합체를 히스티딘-tag가 첨가된 AcrA 단백질과 결합시킨 경우가 히스티딘-tag가 제거된 AcrA 단백질과 결합시킨 경우보다 세포 내 단백질 전달능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
추가적으로, AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 AcrA 또는 His-AcrA 단백질을 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, anti-AcrA 항체 및 Alexa 546 rabbit-IgG 항체를 이용하여 면역염색을 실시하고, 이를 공초점 형광 현미경을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 대표적인 공초점 형광 이미지는 40 x 수침 대물렌즈(water immersion objective), 556nm 에서의 여기(excitation) 및 573nm에서의 방출(emission)에서 얻었고, 스케일 바(scale bar)는 20 μm이었다.
3-2. 웨스턴 블로팅 분석
세포 내로 전달된 단백질 검출을 위해 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 히스티딘-tag 앱타머-금 나노입자 결합체를 히스티딘-tag가 첨가된 AcrA 단백질과 결합시킨 경우에(레인 2 및 레인 3), AcrA 단백질이 검출됨을 확인할 수 있었다.
추가적으로, AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 AcrA 또는 His-AcrA 단백질을 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, anti-AcrA 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
실시예 4. 금 나노입자-앱타머 결합체에 의한 사람 BCL-xL 단백질의 세포 내 전달능 확인 실험
4-1. 공초점 현미경 분석
실시예 3-1과 동일한 방법으로 BCL-xL 단백질의 세포 내 전달능을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
보다 구체적으로, 도 7은 이차항체가 Rabbit-488(Green)로 표지된 BCL-xL단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 7에 나타낸 바와 같이, 히스티딘-tag 앱타머-금 나노입자 결합체를 히스티딘-tag가 첨가된 BCL-xL 단백질과 결합시킨 경우가 히스티딘-tag가 제거된 BCL-xL 단백질과 결합시킨 경우보다 세포 내 단백질 전달능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
추가적으로, AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 BCL-xL 또는 His-BCL-xL 단백질을 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, anti-BCL-xL 및 Alexa 488로 표지된 마우스 IgG를 사용하여 면역염색을 실시하고, 이를 공초점 형광 현미경을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 대표적인 공초점 형광 이미지는 40 x 수침 대물렌즈(water immersion objective)에서 얻었고, 스케일 바(scale bar)는 20 μm이었다.
4-2. 웨스턴 블로팅 분석
실시예 3-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 수행하여 BCL-xL 단백질의 세포 내 전달능을 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
보다 구체적으로, 도 9는 BCL-xL 단백질 검출을 위한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 것이며, 도 9에 나타낸 바와 같이, 히스티딘-tag 앱타머-금 나노입자 결합체를 히스티딘-tag가 첨가된 BCL-xL 단백질과 결합시킨 경우에(레인 3), BCL-xL 단백질이 검출됨을 확인할 수 있었다.
추가적으로, AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 BCL-xL 또는 His-BCL-xL 단백질을 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, 웨스턴 블로팅 분석을 수행하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
4-3. 유세포 분석기 분석
실시예 2-1에 의해 제조된 His-tag 앱타머 금 나노입자 전달체에 의한 세포내 전달능을 다시 확인하기 위해 Alexa488-His-BCL-xL 단백질과 Alexa488-BCL-xL 단백질을 이용하여 실시예 3-1과 동일한 방법으로 복합체를 제조하였다. 복합체 제조 후, 상층액을 제거한 앱타머-금 나노입자-단백질 복합체를 인간자궁암세포주(HeLa cell)에 처리한 후 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 세척한 뒤 다시 1 ml PBS 버퍼에 세포를 분산시켰다. 샘플을 유세포 분석기 (Flow cytometry)로 이용해 관찰했고, 그 결과를 도 11 및 도 12 에 나타내었다.
보다 구체적으로, 도 11은 Alexa488 (Green) 형광물질로 레이블 시킨 His-BCL-xL 단백질과 BCL-xL 단백질 전달에 대한 유세포 분석기 결과를 나타낸 것이고, 도 12는 cy5 (Red)로 레이블 시킨 금나노-앱타머 결합체에 Alexa488 (Green) 형광물질로 레이블 시킨 His-BCL-xL 단백질과 BCL-xL 단백질 복합체를 제작하여 금나노 입자의 Red 파장과 단백질의 Green 파장을 동시에 가지고 있는 세포의 수를 나타낸 유세포 분석기 결과를 나타낸 것이다.
도 11에 나타낸 바와 같이, His-tag 앱타머-금 나노입자 결합체를 His-tag가 첨가된 BCL-xL 단백질과 결합시킨 경우가 His-tag가 제거된 BCL-xL 단백질과 결합시킨 경우보다 세포 내 단백질 전달능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 도 12에 나타낸 바와 같이, His-tag 앱타머-금 나노입자 결합체가 His-tag가 첨가된 BCL-xL 단백질과 함께 세포 속에 존재함을 확인할 수 있었다.
추가적으로, AuNP-His-Apt와 결합하거나 결합하지 않은 BCL-xL 또는 His-BCL-xL 단백질을 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, Alexa 488-positive 세포의 유세포 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
실시예 5. 금 나노입자-앱타머 결합체에 의한 사람 FOXL2 단백질의 세포 내 전달능 확인 확인 실험
5-1. 공초점 현미경 분석
실시예 2-2에 의해 제조된 금 나노입자-앱타머 결합체를 가지고 실시예 3-1과 동일한 방법으로 GST-FOXL2 단백질의 세포 내 전달능을 확인하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
보다 구체적으로, 도 14는 이차항체가 Rabbit-Rodamine (Red)로 표지된 FOXL2 단백질 전달에 대한 공초점 현미경 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 14에 나타낸 바와 같이, GST-tag 앱타머-금 나노입자 결합체를 GST-tag가 첨가된 FOXL2 단백질과 결합시킨 경우가 GST-tag가 제거된 FOXL2 단백질과 결합시킨 경우보다 세포 내 단백질 전달능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
5-2. 웨스턴 블로팅 분석
실시예 2-2에 의해 제조된 금 나노입자-앱타머 결합체를 가지고 실시예 3-2와 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 수행하여 GST-FOXL2 단백질의 세포 내 전달능을 확인하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
보다 구체적으로, 도 15는 FOXL2 단백질 검출을 위한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 15에 나타낸 바와 같이, GST-tag 앱타머-금 나노입자 결합체를 GST-tag가 첨가된 FOXL2 단백질과 결합시킨 경우에(레인 3), FOXL2 단백질이 검출됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6. AuNP-GST-Apt에 의한 GST-FOXL2 단백질의 내재화(internalization) 확인
6-1. 공초점 현미경 분석
AuNP-GST-Apt와 GST-tag가 첨가된 FOXL2 단백질(GST-FOXL2)을 반응시켜 제조된 앱타머-금나노입자-단백질 복합체(AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2)를 제조하고, 이를 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, anti-FOXL2 및 Alexa546-rabbit IgG를 이용하여 면역염색을 하였다. 이후 세포를 공초점 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다. 이때, 이미지는 40 x 수침 대물렌즈(water immersion objective), 556nm 에서의 여기(excitation) 및 573nm에서의 방출(emission)에서 얻었고, 스케일 바(scale bar)는 20 μm이었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, FOXL2가 HeLa 세포 내로 효과적으로 전달되었음을 확인할 수 있었다. 또한, FOXL2 단백질이 세포핵에서 국소화되어있음을 확인할 수 있었다.
6-2. 웨스턴 블로팅 분석
AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2를 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, FOXL2가 HeLa 세포 내로 효과적으로 전달되었음을 확인할 수 있었다.
추가적으로, GST-FOXL2의 핵 위치(nuclear localization)를 확인하기 위해, 핵 추출물(nuclear extract)의 웨스턴 블로팅을 실시하였고, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 이때, 핵 및 세포질(cytosolic) 분획은 AuNP-GST-Apt-GST-FOXL2를 처리하고 1시간동안 배양된 세포에서 분리되었고, 적절한 항체를 이용한 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 상대적인 핵 정제(nuclear purification)를 확인하기 위해, 모든 분획물 또한 핵 마커 (PARP) 및 세포질 마커(β-tubulin)를 탐지하기 위한 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅되었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, FOXL2 단백질이 세포핵에서 국소화되어있음을 확인할 수 있었다.
6-3. Real time PCR 분석
AuNP-GST-apt 또는 AuNP-GST-apt-GST-FOXL2를 처리하고 1시간 동안 배양한 HeLa 세포로부터 분리된 RNA로부터 합성된 cDNA library를 사용하여 Real time- PCR을 실시하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 결과는 glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 발현에 의해 정규화된 후 상대적인 발현양을 폴드(fold)화 하여 나타내었고, 상기 결과(평균±SEM)는 세 번 반복 실시하여 얻은 결과로부터 얻었다. 통계적으로 유의한 값은 P < 0.05로 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 세포 내로 전달된 FOXL2 단백질은 TNF-R1 (tumor necrosis factor-receptor 1) 및 Fas (CD95/APO-1)를 포함하는 타겟 유전자를 효과적으로 상향조절시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 7. 금 나노입자-앱타머 결합체에 의한 BIM 단백질의 세포 내 전달능 확인 실험
본 발명의 금 나노입자-앱타머 결합체(AuNP-His-Apt)에 의한 BIM 단백질의 세포 내 전달을 확인하기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.
7-1. BIM 단백질의 HeLa cell 내 전달능 확인
가. 공초점 현미경 분석
AuNP-His-Apt와 AuNP-His-Apt에 히스티딘-tag가 첨가되고, Alexa 488로 표지된 BIM 단백질(His-BIM)을 반응시켜 제조된 앱타머-금나노입자-단백질 복합체(AuNP-His-Apt-His-BIM)를 인간자궁암세포주(HeLa cell)에 처리하여 1시간 동안 배양하고, 이를 Mitotracker(red) 및 DAPI 염색을 한 후, 공초점 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 20에 나타내었다. 이때, 사용된 AuNP-His-Apt 및 His-BIM의 최종 농도는 각각 1 nM 및 0.4 μM이었고, 세포는 a x 40 수침 대물렌즈(water immersion objective)를 사용하여 시각화되었으며, 스케일 바(scale bar)는 20 μm이었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, Alexa 488로 표지된 His-BIM 단백질(Alexa 488-His-BIM)이 적재된 AuNP-His-Apt를 처리하여 배양된 HeLa 세포는 Alexa 488의 녹색 형광을 나타내는 반면, AuNP-His-Apt 단독으로 처리한 세포 내에서는 어떠한 신호도 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, AuNP-His-Apt에 의해 전달된 His-BIM 단백질은 미토콘드리아로 크게 국소화(localized)되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 앱타머-금 나노입자 결합체에 의해 His-BIM 단백질이 세포 내로 전달되었음을 알 수 있었다.
나. 유세포 분석
Alexa 488-His-BIM을 AuNP-His-Apt과 반응시키거나 반응시키지 않고 HeLa 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후, 유세포 분석기 (Flow cytometry)를 이용해 관찰했고, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21에 나타낸 바와 같이, AuNP-His-Apt에 의한 His-BIM 단백질의 내재화(internalization)는 Alexa 488-positive 세포를 구분하는 유세포 분석에 의해 확인할 수 있었다. 즉, Alexa 488-His-BIM을 AuNP-His-Apt과 반응시킨 경우에 His-BIM 단백질 전달이 우수함을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 실험을 3번 반복하여 이로부터 His-BIM 단백질의 흡수 효율(uptake efficiency) (평균±SEM)을 산출하였고, 이를 도 21에 나타내었다(right panel).
도 21에 나타낸 바와 같이, Alexa 488-His-BIM을 AuNP-His-Apt과 반응시킨 경우에 His-BIM 단백질의 흡수 효율이 우수함을 확인할 수 있었다.
다. 웨스턴 블로팅 분석
AuNP-His-Apt와 His-BIM 단백질을 결합한 앱타머-금나노입자-단백질 복합체(AuNP-His-Apt-His-BIM)를 HeLa cell에 처리하여 1시간 동안 배양하고, 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 22에 나타내었다. 한편, 미토콘드리아 및 세포질 분획의 효율적인 분리는 각각 anti-Cox IV 및 anti-β-actin을 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 확인하였다.
도 22에 나타낸 바와 같이, AuNP-His-Apt에 의해 전달된 His-BIM 단백질이 세포 내로 전달되었고, 특히 미토콘드리아로 크게 국소화(localized)되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
라. 유세포 분석 (Flow cytometry)
His-BIM 단백질에 의해 유도된 세포 사멸은 Annexin V-positive 사멸 세포(apoptotic cell)의 유세포 분석에 의해 정량화하였다. 즉, AuNP-His-Apt와 지정된 농도(0.4 μM 및 0.8 μM)의 His-BIM 단백질을 결합한 앱타머-금나노입자-단백질 복합체(AuNP-His-Apt-His-BIM)를 12시간 동안 HeLa 세포에 처리한 후, 유세포 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 23에 나타내었다. 결과(평균±SEM)는 3회 반복된 세 개의 독립적인 실험으로부터 얻었고, 달리 언급하지 않는 한, 통계적으로 유의한 값은 P < 0.05로 표시된다.
도 23에 나타낸 바와 같이, 대조군 보다 AuNP-His-Apt-His-BIM을 처리한 경우에 Annexin V-positive 사멸 세포가 증가함을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 본 발명의 앱타머-금 나노입자 결합체에 의해 His-BIM 단백질이 세포 내로 전달되었음을 알 수 있었다.
한편, His-BIM 단백질의 국소화는 사이토크롬 c(cytochrome c), Smac/DIABLO 및 카스파제(caspases) 활성과 같은 미토콘드리아 상의 세포사멸 유도 인자 조절에 의한 세포사멸-유도 단백질과 같은 생물학적 기능과 잘 조정될 수 있다. 이에, 추가적으로, AuNP-His-Apt-His-BIM을 12시간 동안 HeLa 세포에 처리한 후, 세포 생존능을 확인하였고, 그 결과를 도 24에 나타내었다. 결과(평균±SEM)는 3회 반복된 결과로부터 얻었다.
도 24에 나타낸 바와 같이, AuNP-His-Apt 결합체에 의해 전달된 His-BIM 단백질의 농도에 의존적으로 HeLa 세포의 생존능이 감소한 것으로 확인할 수 있었다.
7-2. BIM 단백질의 Human primary granulosa cells 내 전달능 확인
가. 공초점 현미경 분석
Human primary granulosa cells에 AuNP-His-Apt (1 nM) 또는 AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM 복합체를 처리하여 1시간 동안 배양하고, 이를 공초점 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 25에 나타내었다. 이때, 세포는 a x 40 수침 대물렌즈(water immersion objective)를 사용하여 시각화되었으며, 스케일 바(scale bar)는 20 μm이었다.
나. 웨스턴 블로팅 분석
Human primary granulosa cells에 AuNP-His-Apt (1 nM) 또는 AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM 복합체를 처리하여 1시간 동안 배양하고, 이를 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
7-3. BIM 단백질의 KGN cells 내 전달능 확인
가. 공초점 현미경 분석
KGN cells에 AuNP-His-Apt (1 nM) 또는 AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM 복합체를 처리하여 1시간 동안 배양하고, 이를 공초점 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 27에 나타내었다. 이때, 세포는 a x 40 수침 대물렌즈(water immersion objective)를 사용하여 시각화되었으며, 스케일 바(scale bar)는 20 μm이었다.
나. 웨스턴 블로팅 분석
KGN cellss에 AuNP-His-Apt (1 nM) 또는 AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM 복합체를 처리하여 1시간 동안 배양하고, 이를 웨스턴 블로팅(western blotting) 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 28에 나타내었다.
실시예 8. AuNP-His-Apt에 의한 His-BIM 단백질의 내재화(internalization) 확인
앱타머 5' 말단에 Cy5(Cyanine 5) 형광단(fluorophore)으로 표지된 앱타머-금나노입자 결합체(Cy5-AuNP-His-Apt)와 상기 Cy5-AuNP-His-Apt와 Alexa 488로 표지된 BIM 단백질(His-BIM)을 반응시켜 제조된 앱타머-금나노입자-단백질 복합체(Cy5-AuNP-His-Apt-His-BIM)를 HeLa 세포에 처리하여 1시간 동안 배양한 후, 이를 공초점 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 29에 나타내었다. 이때, 세포는 40 x 수침 대물렌즈(water immersion objective)를 사용하여 시각화되었으며, 스케일 바(scale bar)는 20 μm이었다.
도 29에 나타낸 바와 같이, AuNP-His-Apt (Red) 및 His-BIM (Green)이 세포 내에서 공존(colocalization)하고 있음을 확인할 수 있었다.
추가적으로, endosomal marker proteins(early endosome antigen 1 (EEA), 또는 lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1))의 공초점 형광 현미경 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 30에 나타내었다. 보다 구체적으로 AuNP-His-Apt-Alexa 488-His-BIM을 HeLa 세포에 처리하고 1시간 또는 3시간 배양하고, 이를 anti-EEA-1 (1:500) 및 anti-LAMP1 (1:100)로 반응시키고 공초점 형광 현미경으로 관찰하였다. 이때, Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (1:1,000) 및 Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (1:1,000)으로 대비염색(counterstain)을 하였다.
또한, 상기 세포를 FBS의 존재 또는 부존재 상에서 유세포 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 31에 나타내었다. 도 31에 나타낸 퍼센트는 Cy5 및 Alexa 488 모두에 대한 양성세포 집단이다.
뿐만 아니라, AuNP-His-Apt-His-BIM을 HeLa 세포(1 x 107)에 처리하고 각각 15분 또는 30분 동안 배양하고, 이를 trypsizined 시키고, 원심분리한 후, PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다. 트립신이 제거되면, 세포 펠렛(cell pellet)을 0.2 M cacodylate buffer (pH 7.4) 의 Karnovsky's glutaraldehyde-paraformaldehyde mixture에 상온에서 약 3시간 동안 고정시키고, 고정액(fixative)을 제거하기 위해 상기 펠렛을 cacodylate buffer (pH 7.4)로 세척하였다. 이후, 알코올 계에서 탈수시키고, Spurr's resin 에 봉입하여 70nm 두께로 슬라이스하고, 이를 TEM(Transmission Electron Microscopy)을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 32에 나타내었다. 이때, TEM 이미지는 80 kV의 가속 전압 10K 및 25 K 배율에서 운영되는 JEOL 모델 JEM-1010에서 촬영되었다.
상기 결과로부터, His-tagged BIM 단백질이 AuNP-Apt 결합체로 인해 전달되었다는 것을 알 수 있었다.
실시예 9. 금 나노입자(AuNP)의 앱타머 적재 능력(loading capacity) 평가
His-apt 또는 GST-apt에 대한 AuNP의 적재 능력(loading capacity)을 평가하기 위해 앱타머의 정량분석을 실시하였다.
보다 구체적으로, 공지된 양(0, 0.5, 1, 2, 4, 및 8 pmol)의 GST-Apt, His-Apt, 및 His-GST-Apt를 아기로스 겔 상에서 전개하고 표준(standard)으로 사용할 수 있도록 정량화하였다.
그리고, AuNP (1 nM)에 혼성화된 다양한 양(0, 2.5, 5, 10, 20 및 40 pmol)의 상기 앱타머의 반응 용액으로부터의 펠렛을 정량화하였고, 데이터는 두 개의 독립적인 실험 결과로부터 얻었으며, 그 결과를 도 33에 나타내었다.
정량 데이터(right panel) 및 분자량을 이용한 계산에 기초하여 약 25 앱타머가 하나의 AuNP에 적재됨을 확인할 수 있었다.
추가적으로, AuNP-His-Apt 또는 AuNP-GST-Apt의 단백질 결합 능력을 측정하였다. 보다 구체적으로, 표준(standard)으로 사용할 수 있도록 공지된 양의 His-BIM, His-BCL-xL, His-AcrA, 또는 GST-FOXL2를 SDS-PAGE 상에서 전개하였다. 10 μl 결합 버퍼(binding buffer)에서 AuNP-Apt (1 nM)를 표시된 농도의 His-BIM, His-BCL-xL, His-AcrA, 또는 GST-FOXL2와 반응시킨 후, SDS-PAGE에 의해 분석하였고, AuNP에 결합한 단백질의 양은 표준과 비교한 밴드의 강도를 측정하였고, 그 결과를 도 34에 나타내었다. 한편, 해리 상수 (Dissociation constants; KD)는 right panel의 그래프로부터 계산된 기울기에 근거하여 얻었다.
도 34에 나타낸 바와 같이, 반응 혼합물에서 AuNP-His-Apt당 단백질의 60%가 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 10. AuNP-His-Apt에 의한 세포생존능 평가
HeLa 세포에 AuNP-His-Apt 농도를 달리하여(0, 0.5, 1.0 및 2nM) 처리하고 12시간 동안 배양한 후 세포 생존능을 측정하였고, 그 결과를 도 35에 나타내었다. 한편, 결과(평균±SEM)는 세 번 반복 실시된 실험결과로부터 얻었다.
추가적으로, 유세포 분석에 의해 Annexin V-positive 사멸세포를 확인하였고, 그 결과를 도 35에 나타내었다.
도 35에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AuNP-His-Apt는 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다.
실시예 11. 금나노입자-앱타머 결합체의 복수 단백질 전달능 확인
금나노입자-앱타머 결합체의 복수 단백질 전달능을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 진행하였다.
즉, His-Apt 및 GST-Apt 모두와 결합한 AuNP(AuNP-(His-GST)-Apt)에 His-BCL-xL,GST-FOXL2, 또는 His-BCL-xL와 GST-FOXL2 모두를 반응시키고, 이를 HeLa 세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, anti-BCL-xL 항체 또는 anti-FOXL2 항체로 면역염색을 하고, 공초점 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 36에 나타내었다. 이때, DAPI는 핵 염색을 위해 사용되고, 세포는 a x 40 수침 대물렌즈(water immersion objective)(Scale bar; 20 μm)로 이미지화 되었고, Alexa 488-labeled mouse IgG 또는 Alexa 546-labeled-rabbit IgG의 탐지를 통하여 각각의 단백질을 확인할 수 있었다.
추가적으로, BCL-xL 또는 FOXL2 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 분석도 수행하였고, 그 결과를 도 36에 나타내었다.
도 36에 나타낸 바와 같이, His-tag 및 GST-tag 앱타머 모두와 결합된 AuNP는 두 개의 각 단백질(His-BCL-xL 및 GST-FOXL2)을 적절한 세포 내 구획(compartment) 내로 전달하였음을 확인할 수 있었다.
실시예 12. in vivo 에서의 AuNP-His-Apt-His-BIM에 의한 항종양 활성 확인
12-1. 종양 체적(volume) 및 무게(weight) 변화 확인
HeLa 세포를 누드 마우스(nude mouse)에 주입하여 자궁경부암을 발생시키고, 0.5 mg/kg AuNP-His-Apt-His-BIM 복합체를 2일마다 이종이식 종양(xenograft tumors)에 주입하고, 시간에 따른 종양 체적(cm3)을 하기의 수학식을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 도 37에 나타내었다. 한편, 대조군 마우스에는 AuNP-GST-Apt-His-BIM 복합체를 주입하였다
[수학식]
(length×width2×π)/6
또한, 이식 후 30일 째, 마우스를 희생시킨 후, 종양의 무게를 측정하였고, 그 결과를 도 37에 나타내었다. 종양의 무게는 대조군 무게의 백분율로 표시되었고, 데이터는 평균±SEM으로 나타냈으며, * 표시는 대응하는 대조군(n=5)과 비교할 때 통계학적으로 유의한 값(P < 0.05)을 나타낸다.
도 37에 나타낸 바와 같이, AuNP-His-Apt-His-BIM이 주입된 종양의 체적 및 무게 모두 대조군과 비교할 때 현저히 줄어들었음을 확인하였고, 상기 결과로부터 AuNP-His-Apt-His-BIM의 주입에 의해 종양의 성장이 억제되었음을 알 수 있었다.
12-2. 종양 조직으로의 His-BIM 단백질 전달 확인
AuNP-His-Apt 결합체에 의한 종양조직으로의 His-BIM 전달 효율을 확인하기 위하여, Alexa 488로 표지된 His-BIM 단백질(Alexa 488-His-BIM)이 적재된 AuNP-His-Apt를 주입한 마우스로부터 준비된 종양 단면을 공초점 형광 현미경으로 확인하였고, 그 결과를 도 38에 나타내었다. 이때 스케일 바(scale bar)는 200μm이었다.
도 38에 나타낸 바와 같이, Alexa 488로 표지된 AuNP-His-Apt-His-BIM을 주입한 경우에 Alexa 488의 녹색 형광을 나타냄을 확인할 수 있었고, 상기 결과로부터, AuNP-His-Apt 결합체에 의해 종양조직으로 His-BIM 단백질이 전달되었음을 알 수 있었다.
추가적으로, 종양 조직에서의 BIM 단백질 발현 수준을 웨스턴 블로팅 분석 및 anti-BIM 항체를 사용한 면역조직화학 분석을 통해 확인하였고, 그 결과를 각각 도 39 및 도 40에 나타내었다.
도 39 및 도 40에 나타낸 바와 같이, AuNP-His-Apt-His-BIM이 주입된 종양에서 증가된 BIM 단백질 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, TUNEL 분석을 통해 증가된 BIM 단백질-매개 사멸세포사(apoptotic cell death)를 확인하였고, 그 결과를 도 40에 나타내었다. 보다 구체적으로, 사멸세포는 terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) assay kit (Roche, USA)를 사용하여 관찰하였다.
도 40에 나타낸 바와 같이, AuNP-His-Apt-His-BIM이 주입된 종양에서 증가된 사멸 세포를 확인할 수 있었고(lower panel), 이때 화살표 머리는 TUNEL 양성 세포를 나타낸다.
실시예 13. in vivo 에서의 AuNP-His-Apt에 의한 단백질의 표적 전달능 확인
EGFR(epidermal growth factor receptor)-과발현 A431 human epidermoid carcinoma cell을 누드 마우스(nude mouse)에 복강 내 주입하여 이종이식 종양(xenograft tumors)을 발생시켰다. 10일 후, 오직 His-BIM만이 적재된 AuNP-(His-GST)-Apt, 또는 His-BIM 및 GST-EGF 모두 적재된 AuNP-(His-GST)-Apt(0.5 mg/kg of body weight)를 종양이 발생한 마우스 내로 꼬리 정맥을 통해 주입하였다. 이때, His-BIM 및 GST-EGF은 각각 Alexa 488 및 Texas Red로 표지하였다. 주입 12 시간 후, 마우스를 희생시키고, 장기들(뇌, 간, 비장, 난소)을 회수한 후, 이종이식 종양조직의 단면을 공초점 형광 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 41에 나타내었다. 이때 스케일 바(Scale bar)는 200μm이었다. 도 41에 나타낸 바와 같이, 효율적인 BIM 단백질 전달을 반영하는 강한 녹색 신호가 Texas Red가 표지된 EGF 및 Alexa 488이 표지된 BIM이 모두 결합된 AuNP-Apt의 경우에서 관찰된 반면, EGF 단백질의 부재에서는 더 적은 BIM 단백질 전달을 확인할 수 있었다.
또한, 종양과 장기 단면에서 형광의 상대적 강도를 Image J software를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 42에 나타내었다. 결과(평균±SEM)는 세 마리의 마우스 결과로부터 얻었고, 통계학적으로 유의한 값은 P < 0.05로 나타내었다.
도 42에 나타낸 바와 같이, 종양 조직과 뇌, 간, 비장, 난소의 다른 장기와 비교할 때, EGFR을 발현하는 종양 내에서 현저히 증가된 BIM 흡수를 나타냄을 확인할 수 있었다.
추가적으로, anti-BIM 항체를 사용하여 종양 조직의 면역조직화학 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 43에 나타내었다.
상기 결과로부터, 본원의 금나노입자-앱타머 결합체는 in vivo에서 단백질의 표적 전달을 할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 14. AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM 복합체의 생체 내 분포 (biodistribution) 확인
14-1. AuNP-His-Apt에 의한 His-BIM 단백질의 전신 분포 확인
10 μg Alexa488-His-BIM와 1 mg/kg AuNP-His-Apt를 반응시켜 제조한 AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM을 랫트로 정맥 주사 후, 각 시간(0, 1, 6, 12, 24 h)에서 장기 샘플(뇌, 심장, 신장, 간, 난소, 비장 및 흉선)을 수집하고, 이를 공초점 현미경으로 관찰하였고, 이를 도 44에 나타내었다. 대표 형광 이미지는 뇌, 심장, 신장, 간, 난소, 비장 및 흉선에서 각 시간대별 조직 내 Alexa488-His-BIM을 나타내며, 스케일 바(Scale bar)는 200 μm이다.
또한, anti-BIM, anti-β-actin 항체를 이용하여 장기 용해물(organ lysates)의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 44에 나타내었다.
추가적으로, 조직에서의 형광의 상대적 강도를 Image J software를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 45에 나타내었다. 값은 AuNP-His-Apt로 처리된 장기로부터의 형광 강도를 1로 세팅함으로써 나타내었고(n = 6/7, respectively), 통계적으로 유의한 값은 P < 0.05로 나타내었다.
14-2. AuNP-His-Apt-Alexa488-His-BIM에 의한 AST 및 LDH 함량의 방출 변화 확인
10 μg His-BIM과 1 mg/kg AuNP-His-Apt를 반응시켜 제조한 AuNP-His-Apt-His-BIM을 4주령 암컷 랫트에 정맥 주사한지 24시간 후에 비색분석법(colorimetric assay)을 통해 AST 및 LDH 수준을 측정하였다. 보다 구체적으로, AST(aspartate transaminase) 및 LDH(lactate dehydrogenase)의 혈정 수준(serum level)은 각각 IDToxTM Aspartate Transaminase (AST) Color Endpoint Assay Kit (ID LabsTM Inc, Canada) 및 IDToxTM Lactate Dehydrogenase (LDH) Color Endpoint Assay Kit (ID LabsTM Inc)를 사용하여 측정되었고, 그 결과를 도 46에 나타내었다. 한편, 결과는 각각 평균±SEM(n=3 rat)으로 표현되었다(P value not significant).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명에 따른 단백질 전달체는 금 나노입자에 결합한 다양한 tag의 앱타머 또는 단백질 특이적 앱타머가 전달하고자 하는 단백질에 특이적으로 결합하여 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있고, 매우 적은 세포독성을 갖는 금 나노입자를 이용하여 인체에 무해할 뿐만 아니라, 다양한 파장에서 빛을 반사하여 세포 내에서의 위치를 쉽게 확인할 수 있는바, 질병의 진단 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (9)

  1. 금 나노입자; 및
    상기 금 나노입자의 표면에 결합되는 앱타머(aptamer)를 포함하는, 단백질 전달체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 금 나노입자는 10-20 nm의 크기를 가지는 것을 특징으로 하는, 단백질 전달체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 앱타머는 운반되는 단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 단백질 전달체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 단백질은 표지물질(tag)로 표지된 단백질인 것을 특징으로 하는, 단백질 전달체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 앱타머는 상기 표지물질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는, 단백질 전달체.
  6. 제4항에 있어서, 상기 표지물질은 히스티딘 및/또는 글루타티온 S-전달효소(GST; glutathione S-transferase)인 것을 특징으로 하는, 단백질 전달체.
  7. 금 나노입자와 앱타머(aptamer)를 결합시키는 단계를 포함하는, 단백질 전달체 제조 방법.
  8. 제1항의 단백질 전달체와 단백질이 결합하여 이루어진, 복합체.
  9. 제8항의 복합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 단백질 전달 방법.
PCT/KR2013/011851 2013-02-13 2013-12-19 금나노입자-앱타머 결합체를 기반으로 하는 단백질 전달체 및 이의 제조 방법 WO2014126332A1 (ko)

Priority Applications (1)

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EP13875242.3A EP2995300B1 (en) 2013-02-13 2013-12-19 Protein transduction domain based on gold nanoparticle-aptamer conjugate and method for producing same

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KR20130015552 2013-02-13
KR10-2013-0015552 2013-02-13
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