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WO2014122973A1 - 標的物質の測定方法 - Google Patents

標的物質の測定方法 Download PDF

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Publication number
WO2014122973A1
WO2014122973A1 PCT/JP2014/050997 JP2014050997W WO2014122973A1 WO 2014122973 A1 WO2014122973 A1 WO 2014122973A1 JP 2014050997 W JP2014050997 W JP 2014050997W WO 2014122973 A1 WO2014122973 A1 WO 2014122973A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
target substance
surfactant
substance
vitamin
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/050997
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
内田　好昭
拓弥 佐久
和也 小見
Original Assignee
富士レビオ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 富士レビオ株式会社 filed Critical 富士レビオ株式会社
Priority to JP2014560702A priority Critical patent/JP6330666B2/ja
Publication of WO2014122973A1 publication Critical patent/WO2014122973A1/ja

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/82—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a target substance.
  • the target substance is measured for various tests such as clinical tests.
  • the target substance may be bound to the binding substance for the target substance in the sample to be measured.
  • Vitamin D hereinafter simply referred to as vitamin D
  • DBP vitamin D binding protein, also referred to as Gc globulin
  • a dissociation operation between vitamin D and DBP is required.
  • an organic solvent eg, ethanol, methanol, DMSO
  • a denaturant eg, acid, protein denaturant, surfactant, hydrolase
  • the present invention provides a method for measuring a target substance.
  • the present inventors have been able to accurately measure a target substance by treating a target substance-containing sample with a hydrophobic part composed of a hydrocarbon chain and a surfactant containing a hydrophilic part. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows.
  • Method for measuring target substance including: 1) treating the sample with a surfactant comprising a hydrophobic moiety composed of hydrocarbon chains and a hydrophilic moiety; and 2) detecting a target substance in the treated sample.
  • the hydrocarbon chain is a linear hydrocarbon group having 10 or more carbon atoms.
  • the hydrophilic moiety is a sulfonate group, a carboxylate group, or an ammonium group.
  • a kit for measuring a target substance comprising: 1) a hydrophobic part composed of a hydrocarbon chain and a surfactant containing a hydrophilic part; and 2) an affinity substance and / or a target substance preparation for the target substance.
  • the method of the present invention is useful for measuring a target substance. According to the present invention, a target substance can be measured quickly and easily.
  • the kit of the present invention is useful for simple implementation of the method of the present invention, for example.
  • the present invention provides a method for measuring a target substance in a sample.
  • the method of the present invention includes: 1) treating the sample with a surfactant comprising a hydrophobic moiety composed of hydrocarbon chains and a hydrophilic moiety; and 2) detecting a target substance in the treated sample.
  • Step 1 a sample is treated with a surfactant containing a hydrophobic part composed of hydrocarbon chains and a hydrophilic part.
  • a surfactant including a hydrophobic part composed of a hydrocarbon chain and a hydrophilic part may be abbreviated as “main surfactant” as necessary.
  • the sample used in the method of the present invention is a sample containing or suspected of containing a target substance.
  • the target substance include low molecular weight substances, proteins, sugars, nucleic acids (eg, DNA, RNA), and derivatives thereof.
  • the term “small substance” refers to a compound having a molecular weight of less than 1,500.
  • the low molecular weight substance is a natural substance or a synthetic substance.
  • the molecular weight of the low molecular weight substance may be less than 1,200, less than 1,000, less than 800, less than 700, less than 600, less than 500, less than 400, or less than 300.
  • the molecular weight of the low molecular weight substance may also be 50 or more, 100 or more, 150 or more, or 200 or more.
  • low molecular weight substances include ligands, hormones, lipids, fatty acids, vitamins, opioids, neurotransmitters (eg, catecholamines), nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, monosaccharides, oligosaccharides, amino acids, and oligopeptides, or pharmaceuticals. , Toxicants, and metabolites.
  • hormones include steroid hormones, thyroid hormones, and peptide hormones.
  • the low molecular weight substance may be a vitamin.
  • vitamins include vitamins A, B1, B2, B6, B12, C, D, E, and K.
  • the vitamin is a fat-soluble vitamin (eg, vitamin A, D, E, K), more preferably vitamin D as shown below.
  • the low molecular weight substance may also be a metabolite of a vitamin.
  • vitamin metabolites include compounds having a hydroxyl group added to vitamins as described above, and conjugates (eg, glucuronic acid conjugates, sulfate conjugates, glutathione conjugates, acetyl conjugates, amino acid conjugates). Is mentioned.
  • the low molecular weight substance may further be a vitamin-like therapeutic drug or a metabolite thereof.
  • vitamin is intended to encompass vitamins and drugs similar to vitamins, and their metabolites, unless otherwise specified.
  • vitamin D is intended to encompass vitamin D2 and vitamin D3, and drugs similar to vitamin D2 and vitamin D3, and metabolites thereof.
  • the low molecular weight substance may be a steroid compound.
  • a steroid compound refers to a compound having a steroid skeleton.
  • Steroid compounds include steroid hormones and derivatives thereof that retain the steroid skeleton (eg, synthetic steroids such as anabolic steroids, anti-androgenic and anti-follicular hormone agents).
  • steroid hormones include male hormones, follicular hormones, luteinizing hormones, and corticoids (eg, glucocorticoids and mineralocorticoids), with follicular hormones being preferred.
  • Examples of follicular hormones include estrone, estradiol, and estriol.
  • the low molecular weight substance may also be a metabolite of a steroid compound.
  • the metabolite of the steroid compound include a compound in which a hydroxyl group is added to the steroid compound as described above, and a conjugate.
  • the conjugate for example, a glucuronic acid conjugate, a sulfate conjugate (eg, a hydroxyl group at either the 3-position or 17-position of estradiol, or a hydroxyl group at both the 3-position and 17-position was conjugated with a sulfate group).
  • Compound glutathione conjugates, acetyl conjugates, and amino acid conjugates.
  • the low molecular weight substance may further be a steroid compound-like therapeutic drug (eg, estramustine) or a metabolite thereof (eg, estromustine).
  • the low molecular weight substance may be an amino acid compound.
  • An amino acid compound refers to a compound having an amino group and a carboxyl group.
  • amino acid compounds include ⁇ -amino acids (eg, glycine, alanine, asparagine, cysteine, glutamine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, aspartic acid, glutamic acid, arginine, Histidine, lysine, ornithine, citrulline), ⁇ -amino acids (eg, ⁇ -alanine), ⁇ -amino acids (eg, ⁇ -aminobutyric acid), and derivatives thereof that retain amino and carboxyl groups.
  • ⁇ -amino acids eg, glycine, alanine, asparagine, cysteine, glutamine, isoleucine, le
  • the amino acid compound may be L-form or D-form.
  • the low molecular weight substance may also be a metabolite of an amino acid compound. Examples of the metabolite of the amino acid compound include a compound in which a hydroxyl group is added to the amino acid compound as described above, and a conjugate as described above.
  • the low molecular weight substance may further be an amino acid compound-like therapeutic drug or a metabolite thereof.
  • the amino acid compound may be a tyrosine derivative biosynthesized from tyrosine.
  • the tyrosine derivative include thyroid hormone (eg, triiodothyronine, thyroxine).
  • the tyrosine derivative may also be a metabolite of thyroid hormone.
  • thyroid hormone metabolites include compounds in which a hydroxyl group is added to thyroid hormone and conjugates as described above.
  • the low molecular weight substance may further be a thyroid hormone-like therapeutic drug or a metabolite thereof.
  • the origin of the sample is not particularly limited, and may be a biological sample derived from a living organism or an environmental sample.
  • organisms from which biological samples are derived include animals such as mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, horses, goats, sheep), birds (eg, chickens), insects, and the like. , Microorganisms, plants, fungi, and fish, preferably mammals, fungi, and fish, more preferably mammals, and even more preferably humans.
  • a biological sample can also be a blood-related sample (eg, whole blood, serum, plasma), saliva, urine, milk, tissue or cell extract, or a mixture thereof, which is the blood itself or a sample derived from blood.
  • a blood-related sample is preferred.
  • environmental samples include samples derived from soil, seawater, and fresh water.
  • the sample used in the method of the present invention is preferably a sample containing a complex of a target substance and a molecule capable of binding to the target substance.
  • the method of the present invention has an advantage that the target substance can be accurately measured even when a molecule (eg, protein) having a strong binding ability to the target substance exists in the sample.
  • a molecule eg, protein
  • the target substance in the sample can be accurately measured.
  • the target substance can be accurately measured according to the method of the present invention even when a molecule having an ability to bind to the target substance is present in the sample.
  • a sample containing a complex of a target substance eg, vitamin D such as vitamin D
  • a molecule capable of binding to the target substance include blood-related samples (eg, whole blood, serum, plasma). It is done.
  • the sample may be subjected to other treatments before being treated with the main surfactant.
  • treatment includes centrifugation, extraction, filtration, precipitation, heating, freezing, refrigeration, and stirring.
  • the volume of the sample to be treated with the main surfactant is not particularly limited as long as the target substance can be measured, but is, for example, 0.1 to 1000 ⁇ l, preferably 0.5 to 100 ⁇ l, more preferably 1 to 50 ⁇ l. .
  • the hydrophobic portion is composed of hydrocarbon chains.
  • the hydrocarbon chain is a linear or branched hydrocarbon group, and the number of carbon atoms in the hydrocarbon chain is usually 8 to 60.
  • the main surfactant need only have at least one such hydrocarbon chain.
  • the number of carbon atoms in the hydrocarbon chain is preferably 10 or more.
  • the number of carbon atoms in the hydrocarbon chain is also preferably 40 or less, more preferably 30 or less, and even more preferably 20 or less, from the viewpoint of easy synthesis or availability.
  • the number of carbon atoms in the hydrocarbon chain is particularly preferably 10 or 11.
  • linear hydrocarbon group examples include an alkyl group which is a linear saturated hydrocarbon group, and a linear unsaturated hydrocarbon group (eg, alkenyl group and alkynyl group).
  • alkyl group having 8 to 60 carbon atoms examples include octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, heptadecyl, octadecyl, nonadecyl and icosyl.
  • Examples of the straight chain unsaturated hydrocarbon group having 8 to 60 carbon atoms include, for example, 1 to 4 (preferably 1 or 2) unsaturated bonds (double bonds or triple bonds) in the alkyl group described above. ) Part.
  • Examples of the branched hydrocarbon group include carbon atoms having 1 to 4 (preferably 1 or 2) carbon atoms having 1 to 10 carbon atoms on the above-described linear saturated or unsaturated hydrocarbon group. The thing substituted by the hydrogen group is mentioned.
  • hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, cyclo Examples include propyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, cyclononyl, cyclodecyl, phenyl, naphthalenyl.
  • the hydrocarbon chain constituting the hydrophobic portion is preferably a linear saturated hydrocarbon group, more preferably a linear saturated hydrocarbon group having 10 or 11 carbon atoms.
  • examples of the hydrophilic portion include an anionic hydrophilic portion and a cationic hydrophilic portion.
  • the surfactant including a hydrophobic part composed of a hydrocarbon chain and a hydrophilic part may have one or more hydrophilic parts, and includes an anionic hydrophilic part and a cationic hydrophilic part. You may have both.
  • examples of the anionic hydrophilic moiety include a sulfonate group (—SO 3 ⁇ ), a carboxylate group (—COO ⁇ ), and a phosphonate group (—POO 2 ⁇ ).
  • examples of the cationic hydrophilic portion include an ammonium group (N + ) and a phosphonium group (P + ).
  • the hydrophilic moiety is preferably a sulfonate group (—SO 3 ⁇ ), a carboxylate group (—COO ⁇ ), an ammonium group (N + ), or a phosphonium group (P + ), more preferably a sulfonate group ( —SO 3 ⁇ ), a carboxylate group (—COO ⁇ ), or an ammonium group (N + ), and even more preferably a sulfonate group (—SO 3 ⁇ ) or a carboxylate group (—COO ⁇ ). Particularly preferred is a sulfonate group (—SO 3 ⁇ ).
  • the main surfactant may contain other parts (for example, between the hydrophobic part and the hydrophilic part) in addition to the hydrophobic part and the hydrophilic part composed of the hydrocarbon chain.
  • Such other moieties include, for example, cyclic groups (eg, aryl groups such as cycloalkyl groups and phenyl groups, heterocyclic groups), and acyclic groups (eg, amino groups, oxy groups, oxo groups, carbonyl groups). , Carbonylamino group, carbonyloxy group).
  • the main surfactant may or may not be in the form of a salt.
  • the term “salt” is any salt, including, for example, inorganic salts, organic salts, and inner salts.
  • the inorganic salt include metal salts, halide salts, acid addition salts, and ammonium salts.
  • the metal salt include a salt of an alkali metal (eg, lithium, sodium, potassium) and a salt of an alkaline earth metal (eg, magnesium, calcium).
  • the halogen in the halide salt include fluorine, bromine, chlorine, and iodine.
  • Examples of acid addition salts that are inorganic salts include salts with inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, and sulfuric acid.
  • Examples of the organic salt include salts with organic bases such as trimethylamine, triethylamine and pyridine, and salts with organic acids such as oxalic acid.
  • examples of the main surfactant include hexyl sulfate, octyl sulfate, decyl sulfate, dodecyl sulfate, tetradodecyl sulfate, hexadecyl sulfate, dodecyl phosphonic acid, dodecyl benzene sulfonic acid, N-lauroyl sarcosine acid, and dodecacate. Noyl sarcosinic acid, as well as their salts.
  • Sample processing may be performed using one or more (eg, 2 or 3) primary surfactants.
  • the concentration of the main surfactant is not particularly limited as long as it is an effective concentration for the measurement of vitamin D, and can be adjusted as appropriate. For example, 0.001% (w / v) to 10% (w / v )% (W / v).
  • the concentration of such a surfactant when processing a sample with a main surfactant is a mixture of the reaction solution and the sample when the sample is processed by a method using a reaction solution as described later.
  • the concentration is not particularly limited as long as the concentration is such that its action is exerted, but may be, for example, 0.001% (w / v) to 10% (w / v).
  • the concentration of the main surfactant may be preferably 0.005% (w / v) or more, more preferably 0.01% (w / v) or more.
  • the concentration of the main surfactant is also preferably 8% (w / v) or less, more preferably 5% (w / v) or less, even more preferably 2% (w / v) or less, particularly preferably 1% It may be (w / v) or less.
  • the concentration of each surfactant is also as described above.
  • the concentration of the main surfactant in the case of processing the sample with the main surfactant is determined in the mixed liquid of the pretreatment liquid and the sample.
  • the concentration is not particularly limited as long as the effect is exhibited, but may be, for example, 0.001% (w / v) to 10% (w / v).
  • the concentration of the main surfactant is preferably 0.005% (w / v) or higher, more preferably 0.01% (w / v) or higher, even more preferably 0.1% (w / V) or more.
  • the concentration of the main surfactant is also preferably 8% (w / v) or less, more preferably 5% (w / v) or less, even more preferably 2% (w / v) or less, particularly preferably 1% It may be (w / v) or less.
  • concentration of each surfactant is also as described above. If it is intended to use the main surfactant at a lower concentration in the reaction solution, preferably dodecyl sulfate or a salt thereof may be used as the main surfactant. It has been confirmed that sodium dodecyl sulfate (SDS) exhibits a strong effect at low concentrations (see Tables 5 and 7).
  • Such a low concentration is a concentration of less than 0.1% (w / v), preferably less than 0.08% (w / v), more preferably 0.06% (w / v). ) Less than, and even more preferably less than 0.05% (w / v).
  • sample processing may be performed in combination with a reducing agent in addition to the main surfactant.
  • the method of the present invention may further comprise treating the sample with a reducing agent.
  • Treatment of the sample with the main surfactant and the reducing agent can be performed simultaneously or separately, but preferably is performed simultaneously.
  • Any reducing agent can be used as such a reducing agent, but a thiol group-containing reducing agent is preferred.
  • the thiol group-containing reducing agent include dithioerythritol, cysteine, 2-mercaptoethylamine, and dithiothreitol.
  • the concentration of the reducing agent is not particularly limited as long as it is an effective concentration for measuring the target substance, and can be adjusted as appropriate, but may be, for example, 0.01 to 1000 mM.
  • the concentration of the reducing agent when processing the sample with the reducing agent is such that when the sample is processed by a method using a reaction solution as described later, the effect is exerted in the mixed solution of the reaction solution and the sample.
  • the concentration is not particularly limited as long as the concentration is such that it may be, for example, 0.01 to 100 mM. In such a case, the concentration of the reducing agent may be preferably 0.05 mM or more, more preferably 0.1 mM or more.
  • the concentration of the reducing agent may also be preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, even more preferably 20 mM or less, and particularly preferably 10 mM or less.
  • concentration of each reducing agent is also as described above.
  • the concentration of the reducing agent when processing the sample with the reducing agent is effective when the sample is processed by a method using a pretreatment liquid as will be described later.
  • the concentration is not particularly limited as long as the concentration is such that it may be, for example, 0.1 to 100 mM. In such a case, the concentration of the reducing agent may be preferably 0.05 mM or more, more preferably 0.1 mM or more.
  • the concentration of the reducing agent may also be preferably 100 mM or less, more preferably 50 mM or less, and even more preferably 20 mM or less.
  • concentration of each reducing agent is also as described above.
  • the sample may be processed in combination with a main surfactant, or a combination of a main surfactant and a reducing agent, and another modifier different from the main surfactant.
  • the method of the present invention may further comprise treating the sample with another denaturing agent.
  • the treatment of the sample with the main surfactant, reducing agent and another denaturant can be done simultaneously or separately, but preferably is done simultaneously.
  • examples of such modifiers include surfactants (eg, anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants or nonionic surfactants) and chaotropic agents. Although 1 type may be sufficient as a modifier
  • denaturant multiple (for example, 2 or 3 types) may be sufficient as it.
  • Such a denaturant may be used at a concentration effective for the denaturing action, but may be used at a concentration effective for an action other than the denaturing action in anticipation of an action other than the denaturing action.
  • a surfactant having a steroid skeleton may be used as another denaturing agent different from the main surfactant.
  • the surfactant having a steroid skeleton is a compound having a steroid skeleton as an independent cyclic structure (that is, a steroid skeleton not condensed with another ring), or a salt thereof.
  • the three-dimensional structure at the 5-position may be ⁇ or ⁇ .
  • the concentration of the surfactant having a steroid skeleton is not particularly limited as long as it is an effective concentration for measurement of the target substance, and can be adjusted as appropriate. For example, 0.005% (w / v) to 10% (w / V), preferably 0.01% (w / v) to 1% (w / v).
  • the surfactant having a steroid skeleton may be a compound having a steroid skeleton as a hydrophobic moiety and a hydrophilic moiety or a salt thereof.
  • hydrophilic part of the surfactant having a steroid skeleton include an anionic part [eg, sulfonate (—SO 3 ⁇ ), carboxylate (—COO ⁇ ), and phosphonate (—POO 2 ⁇ )], cationic Moieties (eg, quaternary ammonium and quaternary phosphonium optionally substituted with 1 to 4 hydrocarbon groups), nonionic hydrophilic moieties (eg, multiple ethers) and groups having them (eg, this Hydrocarbon group having such a hydrophilic portion).
  • anionic part eg, sulfonate (—SO 3 ⁇ ), carboxylate (—COO ⁇ ), and phosphonate (—POO 2 ⁇ )
  • cationic Moieties eg
  • the surfactant having a steroid skeleton can be an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant or a nonionic surfactant, depending on the type of the hydrophilic moiety.
  • the hydrocarbon group described above include methyl, ethyl, propyl, iso-propyl, butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, dodecyl (lauryl).
  • the hydrocarbon group is preferably a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, and more preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the steroid skeleton may have 1 to 6 (preferably 1, 2, 3 or 4) substituents in addition to the hydrophilic portion.
  • a substituent is not particularly limited as long as it does not significantly impair the properties (eg, hydrophobicity) of the steroid skeleton, and examples thereof include a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms, a hydroxyl group, and 1 to 1 carbon atoms.
  • Hydroxyl group substituted with 10 hydrocarbon groups eg, alkyloxy group
  • hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms-carbonyl-oxy group eg, alkyl-carbonyl-oxy group
  • oxo group formyl group
  • a hydrocarbon group having 1 to 10 carbon atoms-oxy-carbonyl group eg, alkyloxy-carbonyl group
  • halogen atom eg, fluorine atom, chlorine atom, bromine atom, iodine atom
  • the surfactant having a steroid skeleton is a bile acid or a derivative thereof or a salt thereof.
  • bile acids include deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid, ursodeoxycholic acid, hyodeoxycholic acid, cholic acid, glycocholic acid, taurocholic acid, hyocholic acid, 5 ⁇ -cypurinol, lithocholic acid, taurodeoxycholic acid, and Taurocholic acid is mentioned.
  • bile acid derivatives include CHAPS, BIGCHAP, and deoxy-BIGCHAP.
  • the surfactant having a steroid skeleton may have a steroid skeleton having no hydroxyl group at the 7-position.
  • the surfactant having a steroid skeleton having no hydroxyl group at the 7-position for example, a surfactant having a steroid skeleton having a group other than the hydroxyl group (eg, the above-described substituent excluding the hydroxyl group) at the 7-position, And a surfactant having a steroid skeleton having no substituent at the 7-position (in other words, a carbon atom at the 7-position is bonded to a hydrogen atom).
  • the surfactant having a steroid skeleton having no hydroxyl group at the 7-position is a surfactant having a steroid skeleton having no substituent at the 7-position.
  • the surfactant having a steroid skeleton having no substituent at the 7-position include deoxycholic acid, taurodeoxycholic acid, lithocholic acid, 5 ⁇ -cyprinol, and salts thereof.
  • Sample processing may also be performed in the presence of other substances.
  • a substance include an affinity substance for a target substance, albumin (eg, bovine serum albumin, human serum albumin), gelatin, and skim milk.
  • the affinity substance for the target substance refers to a substance having an ability to bind to the target substance, and examples thereof include antibodies and aptamers for the target substance.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the antibody may also be a fragment of an antibody (eg, Fab, F (ab ′) 2 ), a recombinant antibody (eg, scFv).
  • the antibody may further be an antibody-like molecule (eg, affibody, anticalin, DARPins, monobody) produced by molecular biological techniques such as phage display and / or by protein engineering techniques using existing protein motifs. May be.
  • Sample processing includes, for example, (a) mixing the sample with an aqueous solution (eg, buffer) containing the components as described above to prepare a mixture, and (b) incubating the mixture. .
  • aqueous solution eg, buffer
  • Tris buffer eg, Tris-HCl buffer, TE buffer, TAE buffer, TBE buffer, Tris buffered saline
  • phosphate buffer eg, phosphate buffered saline
  • Water e.g, carbonate-sodium bicarbonate buffer
  • GOOD buffer e.g, MES, ADA, PIPES, ACES, collamine hydrochloride, BES, TES, HEPES, acetamide glycine, tricine, glycinamide, bicine
  • the sample can be treated under neutral conditions or under acidic or alkaline conditions, but preferably under neutral conditions.
  • the pH value employed in the treatment of the sample is, for example, 4.0 to 9.5, preferably 5.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6.0 to 8. .0.
  • the pH value in the sample processing can be adjusted using a buffer solution, an acidic substance, and an alkaline substance.
  • the temperature of the sample treatment is not particularly limited as long as the components such as the main surfactant are suitable for exerting the action, but for example, 15 to 60 ° C.
  • the temperature is preferably 20 to 50 ° C, more preferably 20 to 45 ° C.
  • the time required for preparing the mixed solution in (a) is usually 30 seconds or less, preferably 20 seconds or less, more preferably 15 seconds or less, and even more preferably 10 seconds or less.
  • the incubation time in (b) is, for example, 60 minutes or less, preferably 30 minutes or less, more preferably 10 minutes or less.
  • the incubation time is still more preferably 5 minutes or less, particularly preferably 3 minutes or less, 2 minutes or less, 1 minute or less, 50 seconds or less, 40 seconds or less, 30 It may be 2 seconds or less, 20 seconds or less, 15 seconds or less, 10 seconds or less, or 5 seconds or less. Therefore, from the viewpoint of shortening the processing time for measurement, the sample processing time (eg, the total time of (a) and (b) above) is 3 minutes or less, 2 minutes or less, 1 minute or less, 50 seconds or less, It may be 40 seconds or less, 30 seconds or less, or 15 seconds or less.
  • Sample processing may also be performed by mixing alone.
  • the processing of the sample by “mixing only” means that the processing of the sample is performed by the above (a) and the above (b) is not performed (that is, incubation is unnecessary). From the viewpoint of quick and simple measurement, the sample may be processed only by mixing.
  • the above step 1) can be performed by treating the sample with a reaction solution containing a main surfactant and an affinity substance for the target substance.
  • the reaction solution contains a main surfactant and an affinity substance for the target substance.
  • the reaction solution may also contain a reducing agent.
  • the reaction solution further includes another modifying agent different from the main surfactant (eg, anionic surfactant, cationic surfactant, amphoteric surfactant or nonionic surfactant), a chaotropic agent, and a steroid skeleton.
  • another modifying agent different from the main surfactant eg, anionic surfactant, cationic surfactant, amphoteric surfactant or nonionic surfactant
  • a chaotropic agent e.g, a chaotropic agent
  • a steroid skeleton e.g, a steroid skeleton.
  • One or more (for example, 2 or 3 or more) of other components such as a surfactant having the above may be contained.
  • the concentration of the main surfactant in the reaction solution is not particularly limited as long as the concentration is such that the action is exerted in the mixed solution of the reaction solution and the sample. For example, 0.001 to 10% (w / v ).
  • the concentration of the main surfactant is preferably 0.005% (w / v) or more, more preferably 0.01% (w / v) or more.
  • the concentration of the main surfactant is also preferably 5% (w / v) or less, more preferably 3% (w / v) or less, even more preferably 1% (w / v) or less, particularly preferably 0.8. It may be 5% (w / v) or less.
  • the concentration of each major surfactant is also as described above.
  • the concentration of the reducing agent in the reaction solution is not particularly limited as long as the concentration is such that the action is exerted in the mixture of the reaction solution and the sample. For example, 0.001 to 1000 mM, preferably 0.01 to 100 mM. More preferably, it is 0.1 to 10 mM.
  • the concentration of the main surfactant in the reaction solution, and the concentration of the reducing agent, if included, is not particularly limited as long as the concentration is such that the action is exerted in the mixture of the reaction solution and the sample. In such a concentration that the above-mentioned concentration (main surfactant and / or reducing agent concentration when the sample is treated with the main surfactant and / or reducing agent) can be achieved in the mixture of the reaction solution and the sample. is there. Accordingly, the concentration of the main surfactant and / or the reducing agent in the reaction solution can be appropriately set so as to achieve the above-described concentration based on the volume of the sample and the reaction solution.
  • the reaction solution contains the above-described substances in an aqueous solution (eg, a buffer solution as described above).
  • the reaction solution may be a neutral solution, an acidic solution or an alkaline solution, but is preferably a neutral solution. Therefore, the pH value of the reaction solution is, for example, 4.0 to 9.5, preferably 5.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.5, and more preferably 6.0 to 8.0. .
  • the volume of the reaction solution can be appropriately determined according to the volume and type of the sample, the purpose of the assay (eg, qualitative or quantitative measurement), etc., but is 1 to 300 times, for example, preferably 1 to 150 times, more preferably 1 to 50 times.
  • the treatment of the sample with the reaction solution is appropriately performed in an appropriate manner to exert the action of components such as the main surfactant contained in the reaction solution.
  • the processing of the sample with the reaction liquid can be performed in the same manner as the processing of the sample as described above, (a1) mixing the sample with the reaction liquid to prepare a mixed liquid, and (b1) the mixed liquid. May be included.
  • the temperature and time conditions in (a1) and (b1) are the same as those described above in (a) and (b), respectively.
  • step 1) above comprises: i) treating the sample with a pretreatment liquid comprising a major surfactant; and ii) treating the sample treated with the pretreatment liquid with a diluent. It can be carried out.
  • the pretreatment liquid contains a main surfactant.
  • the pretreatment liquid may also contain a reducing agent.
  • the pretreatment liquid may further contain another modifier different from the main surfactant.
  • a surfactant having a steroid skeleton, and another surfactant different from the surfactant having a steroid skeleton eg, anionic surfactant, cationic surfactant, amphoteric surfactant
  • Agents or nonionic surfactants eg, anionic surfactant, cationic surfactant, amphoteric surfactant
  • Each of the main surfactant and another modifying agent contained in the pretreatment liquid may be one kind, but may be plural (eg, two or more kinds).
  • the pretreatment liquid is one or more (eg, 1 to 3) denaturing agents (eg, a surfactant having a steroid skeleton and another surfactant) that are the same type as the other denaturing agent contained in the diluent. May be included.
  • the pretreatment liquid may also contain other components as described above.
  • the concentration of the main surfactant in the pretreatment liquid, and when included, the concentration of the reducing agent is not particularly limited as long as the concentration is such that the action is exerted in the mixed liquid of the pretreatment liquid and the sample, For example, it is possible to achieve a concentration as described above (concentration of main surfactant and / or reducing agent when the sample is processed with the main surfactant and / or reducing agent) in the mixture of the pretreatment liquid and the sample.
  • concentration is high. Accordingly, the concentration of the main surfactant and / or the reducing agent in the pretreatment liquid can be appropriately set so as to achieve the above-described concentration based on the volume of the sample and the pretreatment liquid.
  • the pretreatment liquid contains the above-described substances in an aqueous solution (eg, a buffer as described above).
  • the pretreatment liquid may be a neutral solution, an acidic solution or an alkaline solution, but is preferably a neutral solution.
  • the pH value of the pretreatment liquid is, for example, 4.0 to 9.5, preferably 5.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.5, more preferably 6.0 to 8.0. is there.
  • the volume of the pretreatment liquid can be appropriately determined according to the volume and type of the sample, the purpose of the assay (eg, qualitative or quantitative measurement), etc., but is 0.5 to 100 times the sample volume, for example.
  • the ratio is preferably 1 to 10 times, more preferably 1 to 5 times.
  • the processing of the sample with the pretreatment liquid is appropriately performed in an appropriate manner to exert the action of the components contained in the pretreatment liquid.
  • the processing of the sample with the pretreatment liquid can be performed in the same manner as the processing of the sample as described above.
  • (A2-1) The sample is mixed with the pretreatment liquid to prepare the first mixed liquid, And (b2-1) incubating the first mixture.
  • the temperature and time conditions in (a2-1) and (b2-1) are the same as those described above in (a) and (b), respectively.
  • Processing of the sample with the pretreatment liquid may also be performed by mixing alone as described above.
  • the diluent may be, for example, the above-described components (eg, a surfactant having a steroid skeleton, an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, a nonionic surfactant, a chaotropic agent, and a reducing agent. ) May be included (for example, 2 or 3 or more types).
  • the diluent may also contain other components as described above (eg, affinity substance for vitamin D, albumin).
  • the concentration of the above-described components in the diluent is not particularly limited as long as the concentration is such that the action is exhibited in the pretreatment liquid, the diluent, and the mixed solution of the sample, and can be set as appropriate.
  • the diluent includes the above-described substances in an aqueous solution (eg, a buffer as described above).
  • the diluent may be a neutral solution, an acidic solution or an alkaline solution, but is preferably a neutral solution.
  • the pH value of the diluted solution is, for example, 4.0 to 9.5, preferably 5.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.5, and more preferably 6.0 to 8.0. .
  • the volume of the diluent can be appropriately determined depending on the volume and type of the sample and the pretreatment liquid, the purpose of the assay (eg, qualitative or quantitative measurement), etc., but is larger than the total volume of the sample and the pretreatment liquid.
  • the volume of the diluted solution is, for example, 1 to 20 times, preferably 1 to 10 times, more preferably 1 to 5 times the total volume of the sample and the pretreatment solution.
  • the processing of the sample with the diluent is appropriately performed in an appropriate manner to exert the action of the components contained in the diluent.
  • the sample processing with the diluent can be performed in the same manner as the sample processing with the pretreatment liquid.
  • the sample processing with the diluent includes (a2-2) preparing a second mixture by mixing the sample treated with the pretreatment liquid with the diluent, and (b2-2) second Incubating the mixture may include.
  • the temperature and time conditions in (a2-2) and (b2-2) are the same as those described above in (a) and (b), respectively.
  • the target substance is detected in the sample processed as described above.
  • the target substance is detected qualitatively or quantitatively.
  • it may include adding the affinity substance to the treated sample.
  • the target substance can be detected by any method, for example, using an affinity substance for the target substance.
  • the detection of the target substance may also be performed by an immunological technique.
  • immunological techniques include enzyme immunoassay (EIA) (eg, direct competition ELISA, indirect competition ELISA, sandwich ELISA), radioimmunoassay (RIA), fluorescence immunoassay (FIA), Examples thereof include a magnetic particle method, an immunochromatography method, a luminescence immunoassay method, a spin immunoassay method, and a latex agglutination method.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • FFA fluorescence immunoassay
  • a secondary antibody may be further used.
  • the secondary antibody may be an antibody against the primary antibody part of an antibody against the target substance (primary antibody), or an antibody against the complex of the target substance and the primary antibody.
  • An antibody such as a secondary antibody may be linked to a detection substance.
  • the detection substance examples include enzymes (eg, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase), affinity substances (eg, streptavidin, biotin), fluorescent substances (eg, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine), luminescent substances (eg, , Luciferin, aequorin), radioactive substances (eg, 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 125 I).
  • the antibody such as a secondary antibody may be immobilized on a support.
  • the support include particles (eg, magnetic particles), membranes (eg, nitrocellulose membrane), glass, plastic, metal, plates (eg, multiwell plates), and devices.
  • the antibody may also be provided in a form impregnated in a medium such as filter paper.
  • the present invention also provides a kit for measuring a target substance.
  • the kit of the present invention comprises: 1) major surfactants; and 2) affinity substances for target substances and / or target substance preparations.
  • the kit of the present invention may also contain a reducing agent.
  • the kit of the present invention may further contain a modifying agent such as a surfactant having a steroid skeleton.
  • the affinity substance for the target substance is a primary antibody
  • the kit of the present invention may further contain a secondary antibody.
  • the kit of the present invention includes a reaction solution containing a main surfactant and an affinity substance for a target substance.
  • the reaction solution may further contain a reducing agent.
  • the kit of the invention comprises: 1) A pretreatment liquid containing a main surfactant (which may further contain a reducing agent); 2) Diluent; and 3) Affinity substance and / or target substance preparation for the target substance.
  • the reaction solution and the pretreatment solution and dilution solution may further contain the components and / or substances described above in the method of the present invention.
  • the target substance preparation is an aqueous solution or target substance powder containing a predetermined concentration (single or plural) of the target substance, and is useful as a control.
  • each component may be provided in a form accommodated in a different container (eg, tube, plate).
  • the kit of the present invention may be provided in the form of a device. Specifically, all of the components may be provided in a form housed in the device. Alternatively, some of the components may be provided in a form housed in the device, and the rest may be provided in a form that is not housed in the device (eg, a form housed in a different container). In this case, components that are not contained in the device may be used by being injected into the device during measurement of the target substance.
  • the structure of the device is, for example, 1) a first area for preparing a mixed solution by mixing a sample and a main surfactant, and contacting the prepared mixed solution with an affinity substance for a target substance.
  • a device comprising a second zone for detecting the target substance; 2) a device comprising a zone for detecting the target substance by mixing the sample, the main surfactant and an affinity substance for the target substance; and 3)
  • Examples of the device include a channel that allows mixing of a sample and the above-described components (eg, reaction solution, pretreatment solution and dilution solution), and an area for detecting a target substance.
  • 25OH vitamin D2 and 25OH vitamin D3 are used as immunological methods for measuring vitamin D as a target substance.
  • the primary antibody that recognizes (abbreviated as) was used.
  • the values measured in the following examples may correspond to the total amount of 25OH vitamin D2 and 25OH vitamin D3.
  • Example 1 Examination of 25OH Vitamin D Measurement Method Using Anionic Surfactant and Reducing Agent Human serum was treated with anionic surfactant (SDS) and reducing agent (DTT) and then humanized by immunological methods. Serum 25OH vitamin D was measured.
  • SDS anionic surfactant
  • DTT reducing agent
  • the method was performed as follows. 1) To 10 ⁇ l of the same serum collected from the same human, add 1%, 0.30%, 0.1% or 0% (w / v) SDS + 8 mM, 4 mM in PBS (pH 7.6) 40 ⁇ l of 2 mM or 0 mM DTT + 0.1% (w / v) deoxycholate sodium salt + 0.1% (w / v) CHAPS] was added to prepare a first mixed solution (50 ⁇ l) of serum and pretreatment solution. . The concentration of each component in the first mixture is as follows: 0.8%, 0.24%, 0.08% or 0% (w / v) SDS; 6.4 mM, 4 mM, 1.
  • Example 2 Investigation of effective reducing agents to denature vitamin D binding protein Human serum is treated with an anionic surfactant (SDS) and various reducing agents and then immunologically treated in human serum Of 25OH vitamin D was measured.
  • SDS anionic surfactant
  • the method was performed as follows. 1) To 10 ⁇ l of the same serum collected from the same human, pretreatment solution [PBS (pH 7.6) 0.3% (w / v) SDS + 5 mM each reducing agent + 0.1% (w / v) deoxycholic acid 40 ⁇ l of sodium salt + 0.1% (w / v) CHAPS] was added to prepare a first mixed solution (50 ⁇ l) of serum and pretreatment solution. The concentration of each component in the first mixture is as follows: 0.24% (w / v) SDS; 4 mM each reducing agent; 0.08% (w / v) deoxycholate sodium salt; and 0.08% (w / v) CHAPS. 2) Subsequent operations were performed in the same manner as in the above 2) to 12) of Example 1.
  • Example 3 Examination of treatment time with anionic surfactant (SDS) The treatment time with an anionic surfactant (SDS), which is required for highly sensitive measurement of 25OH vitamin D, was examined.
  • SDS anionic surfactant
  • the method was performed as follows. 1 Pre-treatment solution (0.3% (w / v) SDS + 5 mM 2-MEA + 0.1% (w / v) deoxycholate sodium salt + 0.1% in PBS was added to 10 ⁇ l of the same serum collected from the same human. w / v) 40 ⁇ l of CHAPS) was added, and a first mixed solution (50 ⁇ l) of serum and pretreatment solution was prepared by mixing by stirring. The concentration of each component in the first mixture is as follows: 0.24% (w / v) SDS; 4 mM 2-MEA; 0.08% (w / v) deoxycholate sodium salt; and 0.08% (w / v) CHAPS. The time required for mixing by stirring was about 3 seconds.
  • the luminescence count measured under the condition of mixing alone (incubation time: 0 min) was almost the same as the luminescence count measured under the condition of 10 min incubation time.
  • the incubation operation in the above step 2) is not necessarily required, and vitamin D is dissociated from DBP only by gently stirring the serum and the pretreatment liquid. Therefore, it was shown that the time required for measuring the target substance can be shortened by the method of the present invention.
  • Reference Example 1 Time required for pretreatment using an existing product
  • the time required for pretreatment of a serum sample is as follows according to its instruction manual.
  • Existing products include DiaSorin-RIA (DiaSorin), DiaSorin-Liaison (DiaSorin)
  • Example 4 Comparison between the method of the present invention and an existing method using an organic solvent (I) In order to verify the measurement accuracy of the target substance by the method of the present invention using an anionic surfactant (SDS), the measured value of the target substance by the method of the present invention and the measured value obtained by the existing method using an organic solvent And the correlation coefficient was compared.
  • SDS anionic surfactant
  • the concentration of each component in the mixture is as follows: about 0.03% (w / v) SDS; about 0.5 mM 2-MEA; about 0.04% (w / v) sodium deoxycholate About 0.04% (w / v) CHAPS; 2) The mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes. 3) After incubation, the magnetic particles in the sample were collected on the magnetic plate, and the magnetic particles were washed three times. 4) Alkaline phosphatase labeled antibody (antibody against 25OH vitamin D-anti-25OH vitamin D antibody immune complex) suspended in MES buffer was added to the magnetic particles excluding the washing solution. 5) The solution obtained in the above 4) was incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
  • Luminescence count was measured with a label reader (ARVO; Perkin Elmer).
  • Example 5 Comparison between the method of the present invention and an existing method (DiaSorin-RIA) (II) In order to further verify the measurement accuracy of the target substance by the method of the present invention using an anionic surfactant (SDS), the measured value of the target substance by the method of the present invention and the existing method (DiaSorin-RIA) were obtained. The correlation coefficient with the measured value was compared.
  • SDS anionic surfactant
  • DiaSorin-RIA Measurement by an existing method (DiaSorin-RIA) As an existing method, DiaSorin-RIA was used as described later. DiaSorin-RIA was performed using a commercially available kit (25-Hydroxyvitamin D 125I RIA Kit, manufactured by DiaSorin). The method was performed as follows. As a measurement sample, the same 13 human serum samples as in 5-1) above were used. I) Pretreatment operation a) A glass test tube is prepared. b) Dispense 500 ⁇ l of acetonitrile into each test tube. c) Add 50 ⁇ l of calibrator, control, or sample (such as serum). d) Stir the sample solution for 10 seconds. e) Centrifuge the sample solution at 1200 g for 10 minutes at room temperature. f) The supernatant is used as a sample.
  • a measurement sample the same 13 human serum samples as in 5-1) above were used. I) Pretreatment operation a) A glass test tube is prepared. b) Dispense 500 ⁇ l
  • Example 6 Measurement of vitamin D with SDS-like surfactant Next, the measurement of vitamin D with an SDS-like surfactant was examined.
  • the method was performed as follows. 1) 50 ng / ml fortified horse serum 3.75 ⁇ l, reaction solution [Tris-HCl buffer (pH 7.6), 0.03% (w / v) or 0.1% (w / v)] Agent + 0.038% (w / v) deoxycholate sodium salt + 0.038% (w / v) BSA + anti-25OH vitamin D antibody-binding particle solution] 146.25 ⁇ l was added, and a mixture of serum and reaction solution ( 150 ⁇ l) was prepared.
  • the concentration of each component in the mixture is as follows: about 0.03% (w / v) or about 0.1% (w / v) The following surfactant; about 0.04% (w / v) v) sodium deoxycholate; and about 0.04% (w / v) BSA. 2) Subsequent operations were performed in the same manner as in 2) to 9) of Example 4-1).
  • Example 7 Measurement of vitamin D by a surfactant having a hydrocarbon chain Next, measurement of vitamin D by a surfactant having a hydrocarbon chain was examined.
  • the method was as follows. 1) The reaction solution [Tris-HCl buffer (pH 7.6), 0.03% (w / v) or 0.1% (w / v)] was added to 3.75 ⁇ l of 100 ng / ml fortified horse serum. Agent, 0.038% (w / v) sodium deoxycholate, 0.038% (w / v) BSA, anti-25OH vitamin D antibody-binding particle solution] 146.25 ⁇ l is added, and the serum and reaction mixture are mixed A liquid (150 ⁇ l) was prepared.
  • the concentration of each component in the mixture is as follows: about 0.03% (w / v) or about 0.1% (w / v) The following surfactant; about 0.04% (w / v) v) sodium deoxycholate; and about 0.04% (w / v) BSA. 2) Subsequent operations were performed in the same manner as in 2) to 9) of Example 4-1).
  • the method and kit of the present invention are useful for measuring a target substance.

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Abstract

　本発明は、標的物質の測定方法を提供する。　具体的には、本発明は、以下を含む、標的物質の測定方法を提供する： １）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルを処理すること；ならびに ２）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。　本発明はまた、以下を含む、標的物質の測定用キットを提供する： １）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤；ならびに ２）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。

Description

標的物質の測定方法
　本発明は、標的物質の測定方法などに関する。
　標的物質の測定は、臨床検査等の種々の検査のため、標的物質が測定されている。しかしながら、標的物質は、測定対象のサンプル中で、標的物質に対する結合性物質と結合していることがある。例えば、Ｖｉｔａｍｉｎ　Ｄ類（以下、単にビタミンＤと略称する）は血中で結合タンパク質（ＤＢＰ：ビタミンＤ結合タンパク質。Ｇｃグロブリンとも呼ばれる）と強固に結合していることが知られている。したがって、ビタミンＤを抗原抗体法で正確に測定するためには、ビタミンＤとＤＢＰの解離操作（前処理）が必要とされる。このような前処理としては、変性剤（例、酸、タンパク変性剤、界面活性剤、加水分解酵素）に加えて有機溶媒（例、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ）が使用されている（特許文献１～７）。
国際公開第０３／１０４８２０号 国際公開第０７／０３９１９４号 国際公開第０２／０４６７４６号 国際公開第０４／０６３７０４号 国際公開第０８／０９２９１７号 国際公開第０２／０５７７９５号 国際公開第０７／１４０９６２号
　本発明は、標的物質の測定方法を提供する。
　本発明者らは、鋭意検討したところ、炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤で標的物質含有サンプルを処理することにより、標的物質を正確に測定できることなどを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕以下を含む、標的物質の測定方法：
１）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルを処理すること；ならびに
２）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
〔２〕炭化水素鎖が、１０個以上の炭素原子数を有する直鎖の炭化水素基である、〔１〕の方法。
〔３〕親水性部分が、スルホネート基、カルボキシレート基、またはアンモニウム基である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記界面活性剤が、デシル硫酸、ドデシル硫酸またはこれらの塩である、〔１〕～〔３〕のいずれかの方法。
〔５〕チオール基含有還元剤でサンプルを処理することをさらに含む、〔１〕～〔４〕のいずれかの方法。
〔６〕チオール基含有還元剤が、ジチオエリトリトール、システイン、２－メルカプトエチルアミンおよびジチオスレイトールからなる群より選ばれる、〔５〕の方法。
〔７〕サンプルの処理が混合のみによって行われる、〔１〕～〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕以下を含む方法である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法：
１’）前記界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む反応液でサンプルを処理すること；ならびに
２’）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
〔９〕以下を含む方法である、〔１〕～〔７〕のいずれかの方法：
１’’）前記界面活性剤を含む前処理液でサンプルを処理すること；
２’’）前記１’’）で処理されたサンプルを希釈液で処理すること；ならびに
３’’）前記２’’）で処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
〔１０〕サンプルがヒト由来のサンプルである、〔１〕～〔９〕のいずれかの方法。
〔１１〕サンプルが血液関連サンプルである、〔１〕～〔１０〕のいずれかの方法。
〔１２〕標的物質がサンプル中で標的物質に対する結合性物質と結合している、〔１〕～〔１１〕のいずれかの方法。
〔１３〕標的物質が低分子物質である〔１〕～〔１２〕のいずれかの方法。
〔１４〕低分子物質がビタミンである、〔１３〕の方法。
〔１５〕ビタミンがビタミンＤである、〔１４〕の方法。
〔１６〕以下を含む、標的物質の測定用キット：
１）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤；ならびに
２）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。
　本発明の方法は、標的物質の測定に有用である。本発明によれば、迅速かつ簡便に標的物質を測定できる。
　本発明のキットは、例えば、本発明の方法の簡便な実施に有用である。
図１は、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いた本発明の方法により得られた測定値と、有機溶媒（アセトニトリル）を用いるタンパク質除去法により得られた測定値との高い相関性（Ｒ２＝０．９９８１）を示す図である。 図２は、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いた本発明の方法により得られた測定値と、Ｄｉａｓｏｒｉｎ　ＲＩＡ法による測定値との相関性（Ｒ２＝０．９４２５）を示す図である。
（１．標的物質の測定方法）
　本発明は、サンプル中の標的物質の測定方法を提供する。
　本発明の方法は、以下を含む：
１）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルを処理すること；ならびに
２）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
（Ａ－１．工程１）
　先ず、炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルが処理される。以下、必要に応じて、「炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤」を、「主要界面活性剤」と略記することがある。
　本発明の方法で用いられるサンプルは、標的物質を含有する、または含有すると疑われるサンプルである。標的物質としては、例えば、低分子物質、タンパク質、糖、核酸（例、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。用語「低分子物質（ｓｍａｌｌ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）」とは、分子量１，５００未満の化合物をいう。低分子物質は、天然物質または合成物質である。低分子物質の分子量は、１，２００未満、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満または３００未満であってもよい。低分子物質の分子量はまた、５０以上、１００以上、１５０以上または２００以上であってもよい。低分子物質としては、例えば、リガンド、ホルモン、脂質、脂肪酸、ビタミン、オピオイド、神経伝達物質（例、カテコールアミン）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、およびオリゴペプチド、あるいは医薬、毒物、および代謝産物が挙げられる。ホルモンとしては、例えば、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ペプチドホルモンが挙げられる。
　一実施形態では、低分子物質は、ビタミンであってもよい。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋが挙げられる。好ましくは、ビタミンは、脂溶性ビタミン（例、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ）であり、より好ましくは、以下に示すようなビタミンＤである。低分子物質はまた、ビタミンの代謝産物であってもよい。ビタミンの代謝産物としては、例えば、上述したようなビタミンにヒドロキシル基が付加された化合物、および抱合体（例、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体、グルタチオン抱合体、アセチル抱合体、アミノ酸抱合体）が挙げられる。低分子物質はさらに、ビタミン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「ビタミン」は、特に指定されないかぎり、ビタミン、およびビタミンに類似する薬物、ならびにそれらの代謝産物を包括的に含むものとする。例えば、用語「ビタミンＤ」は、特に指定されないかぎり、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３、およびビタミンＤ２およびビタミンＤ３に類似する薬物、ならびにそれらの代謝産物を包括的に含むものとする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　別の実施形態では、低分子物質は、ステロイド化合物であってもよい。ステロイド化合物とは、ステロイド骨格を有する化合物をいう。ステロイド化合物としては、ステロイドホルモン、およびステロイド骨格を保持するその誘導体（例、タンパク質同化ステロイド、抗男性ホルモン剤および抗卵胞ホルモン剤等の合成ステロイド）が挙げられる。ステロイドホルモンとしては、例えば、男性ホルモン、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、コルチコイド（例、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド）が挙げられるが、卵胞ホルモンが好ましい。卵胞ホルモンとしては、例えば、エストロン、エストラジオール、エストリオールが挙げられる。低分子物質はまた、ステロイド化合物の代謝産物であってもよい。ステロイド化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなステロイド化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および抱合体が挙げられる。抱合体としては、例えば、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体（例、エストラジオールの３位もしくは１７位のいずれかのヒドロキシル基、または３位および１７位の双方のヒドロキシル基に硫酸基が抱合された化合物）、グルタチオン抱合体、アセチル抱合体、アミノ酸抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、ステロイド化合物類似治療用薬物（例、エストラムスチン）またはその代謝産物（例、エストロムスチン）であってもよい。
　さらに別の実施形態では、低分子物質は、アミノ酸化合物であってもよい。アミノ酸化合物とは、アミノ基およびカルボキシル基を有する化合物をいう。アミノ酸化合物としては、例えば、α－アミノ酸（例、グリシン、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン、シトルリン）、β－アミノ酸（例、β－アラニン）、γ－アミノ酸（例、γ-アミノ酪酸）、ならびに、アミノ基およびカルボキシル基を保持するそれらの誘導体が挙げられる。アミノ酸化合物は、Ｌ体またはＤ体であってもよい。低分子物質はまた、アミノ酸化合物の代謝産物であってもよい。アミノ酸化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなアミノ酸化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、アミノ酸化合物類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。
　アミノ酸化合物は、チロシンから生合成されるチロシン誘導体であってもよい。チロシン誘導体としては、甲状腺ホルモン（例、トリヨードチロニン、チロキシン）が挙げられる。チロシン誘導体はまた、甲状腺ホルモンの代謝産物であってもよい。甲状腺ホルモンの代謝産物としては、例えば、甲状腺ホルモンにヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、甲状腺ホルモン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。
　サンプルの由来は特に限定されず、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）、鳥類（例、ニワトリ）等の動物、昆虫、微生物、植物、菌類、魚類が挙げられるが、好ましくは哺乳動物、菌類、魚類であり、より好ましくは哺乳動物であり、さらにより好ましくはヒトである。生物学的サンプルはまた、血液自体または血液に由来するサンプルである血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）、唾液、尿、乳汁、組織または細胞抽出液、あるいはこれらの混合物であってもよいが、血液関連サンプルが好ましい。環境サンプルとしては、土壌、海水、淡水由来のサンプルが挙げられる。
　本発明の方法で用いられるサンプルは、好ましくは、標的物質およびそれに対する結合能を有する分子の複合体を含むサンプルである。本発明の方法は、サンプル中に標的物質に対する強い結合能を有する分子（例、タンパク質）が存在していた場合であっても、標的物質を正確に測定できるという利点を有する。例えば、ビタミンＤは、ヒト血清中に存在するＤＢＰと強固に結合することが知られており、その解離定数はＫｄ＝５×１０－８であることが報告されているが（特許文献４を参照）、本発明の方法によれば、このような強い結合能を有するタンパク質がサンプル中に存在する場合であっても、サンプル中の標的物質を正確に測定することができる。したがって、標的物質に対する結合能を有する分子がサンプル中に存在する場合であっても、本発明の方法によれば、標的物質を正確に測定することができると考えられる。具体的には、標的物質（例、ビタミンＤ等のビタミン）およびそれに対する結合能を有する分子の複合体を含むサンプルとしては、例えば、血液関連サンプル（例、全血、血清、血漿）が挙げられる。
　本発明の方法では、サンプルは、主要界面活性剤により処理される前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、加熱、凍結、冷蔵、攪拌が挙げられる。
　主要界面活性剤により処理されるべきサンプルの容量は、標的物質の測定が可能な限り特に限定されないが、例えば０．１～１０００μｌ、好ましくは０．５～１００μｌ、より好ましくは１～５０μｌである。
　主要界面活性剤において、疎水性部分は、炭化水素鎖から構成される。炭化水素鎖は、直鎖または分岐鎖の炭化水素基であり、炭化水素鎖中の炭素原子数は通常８～６０個である。主要界面活性剤は、少なくとも１つのこのような炭化水素鎖を有していればよい。炭化水素鎖中の炭素原子数は、好ましくは１０個以上である。炭化水素鎖中の炭素原子数はまた、合成または入手の容易の観点から、４０個以下が好ましく、３０個以下がより好ましく、２０個以下がさらにより好ましい。炭化水素鎖中の炭素原子数は、特に好ましくは１０または１１個である。
　直鎖の炭化水素基としては、直鎖の飽和炭化水素基であるアルキル基、ならびに直鎖の不飽和炭化水素基（例、アルケニル基およびアルキニル基）が挙げられる。炭素原子数８～６０個のアルキル基としては、例えば、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシルが挙げられる。炭素原子数８～６０個の直鎖の不飽和炭化水素基としては、例えば、上述したアルキル基において、１～４個（好ましくは１または２個）の不飽和結合（二重結合または三重結合）部分を含むものが挙げられる。
　分岐鎖の炭化水素基としては、例えば、上述した直鎖の飽和または不飽和炭化水素基上の水素原子が、１～４個（好ましくは１または２個）の炭素原子数１～１０の炭化水素基で置換されたものが挙げられる。炭素原子数１～１０の炭化水素基としては、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、フェニル、ナフタレニルが挙げられる。
　疎水性部分を構成する炭化水素鎖は、好ましくは、直鎖の飽和炭化水素基であり、より好ましくは、１０または１１個の炭素原子数を有する直鎖の飽和炭化水素基である。
　主要界面活性剤において、親水性部分としては、例えば、アニオン性親水性部分およびカチオン性親水性部分が挙げられる。炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤は、１または２種以上の親水性部分を有していてもよく、アニオン性親水性部分およびカチオン性親水性部分の双方を有していてもよい。アニオン性親水性部分としては、例えば、スルホネート基（－ＳＯ３ －）、カルボキシレート基（－ＣＯＯ－）、およびホスホネート基（－ＰＯＯ２ －）が挙げられる。カチオン性親水性部分としては、例えば、アンモニウム基（Ｎ＋）、およびホスホニウム基（Ｐ＋）が挙げられる。親水性部分は、好ましくは、スルホネート基（－ＳＯ３ －）、カルボキシレート基（－ＣＯＯ－）、アンモニウム基（Ｎ＋）、またはホスホニウム基（Ｐ＋）であり、より好ましくは、スルホネート基（－ＳＯ３ －）、カルボキシレート基（－ＣＯＯ－）、またはアンモニウム基（Ｎ＋）であり、さらにより好ましくは、スルホネート基（－ＳＯ３ －）、またはカルボキシレート基（－ＣＯＯ－）であり、特に好ましくは、スルホネート基（－ＳＯ３ －）である。
　主要界面活性剤は、炭化水素鎖から構成される疎水性部分および親水性部分に加えて、他の部分（例えば、疎水性部分と親水性部分との間）を含んでいてもよい。このような他の部分としては、例えば、環状基（例、シクロアルキル基、フェニル基等のアリール基、複素環基）、および非環状基（例、アミノ基、オキシ基、オキソ基、カルボニル基、カルボニルアミノ基、カルボニルオキシ基）が挙げられる。
　主要界面活性剤は、塩の形態であっても、なくてもよい。本明細書中で用いられる用語「塩」は、任意の塩であり、例えば、無機塩、有機塩および分子内塩が挙げられる。無機塩としては、例えば、金属塩、ハロゲン化物塩、酸付加塩、およびアンモニウム塩が挙げられる。金属塩としては、例えば、アルカリ金属（例、リチウム、ナトリウム、カリウム）の塩、アルカリ土類金属（例、マグネシウム、カルシウム）の塩が挙げられる。ハロゲン化物塩におけるハロゲンとしては、例えば、フッ素、臭素、塩素、およびヨウ素が挙げられる。無機塩である酸付加塩としては、例えば、塩酸、硝酸、硫酸等の無機酸との塩が挙げられる。有機塩としては、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩、ならびにシュウ酸等の有機酸との塩が挙げられる。
　具体的には、主要界面活性剤としては、例えば、ヘキシル硫酸、オクチル硫酸、デシル硫酸、ドデシル硫酸、テトラドデシル硫酸、ヘキサデシル硫酸、ドデシルホスホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、Ｎ－ラウロイルサルコシン酸、およびドデカノイルサルコシン酸、ならびにそれらの塩が挙げられる。
　サンプルの処理は、１種または複数（例、２または３種）の主要界面活性剤を用いて行われてもよい。主要界面活性剤の濃度は、ビタミンＤの測定に有効な濃度である限り特に限定されず、適宜調整することができるが、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）％（ｗ／ｖ）であってもよい。
　具体的には、主要界面活性剤によりサンプルを処理する場合におけるこのような界面活性剤の濃度は、後述するような反応液を用いる方法によりサンプルを処理する場合、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。このような場合、主要界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。主要界面活性剤の濃度はまた、好ましくは８％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であってもよい。複数の界面活性剤を用いる場合、各界面活性剤の濃度もまた、上記のとおりである。
　また、主要界面活性剤によりサンプルを処理する場合における主要界面活性剤の濃度は、後述するような前処理液を用いる方法によりサンプルを処理する場合には、前処理液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．００１％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。このような場合、主要界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上、さらにより好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。主要界面活性剤の濃度はまた、好ましくは８％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは２％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下であってもよい。複数の界面活性剤を用いる場合、各界面活性剤の濃度もまた、上記のとおりである。
　反応液において、より低濃度での主要界面活性剤の使用が意図される場合、好ましくは、ドデシル硫酸またはその塩を、主要界面活性剤として使用してもよい。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、低濃度で強い効果を示すことが確認されている（表５、７を参照）。このような低濃度は、０．１％（ｗ／ｖ）未満の濃度であり、好ましくは０．０８％（ｗ／ｖ）未満の濃度であり、より好ましくは０．０６％（ｗ／ｖ）未満の濃度であり、さらにより好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）未満の濃度である。
　一実施形態では、サンプルの処理は、主要界面活性剤に加えて、還元剤を併用して行われてもよい。したがって、本発明の方法は、還元剤でサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。主要界面活性剤および還元剤によるサンプルの処理は、同時または別々に行うことができるが、好ましくは同時に行われる。このような還元剤としては、任意の還元剤を用いることができるが、チオール基含有還元剤が好ましい。チオール基含有還元剤としては、例えば、ジチオエリトリトール、システイン、２－メルカプトエチルアミンおよびジチオスレイトールが挙げられる。還元剤の濃度は、標的物質の測定に有効な濃度である限り特に限定されず、適宜調整することができるが、例えば０．０１～１０００ｍＭであってもよい。
　具体的には、還元剤によりサンプルを処理する場合における還元剤の濃度は、後述するような反応液を用いる方法によりサンプルを処理する場合、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．０１～１００ｍＭであってもよい。このような場合、還元剤の濃度は、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であってもよい。還元剤の濃度はまた、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは２０ｍＭ以下、特に好ましくは１０ｍＭ以下であってもよい。複数の還元剤を用いる場合、各還元剤の濃度もまた、上記のとおりである。
　また、還元剤によりサンプルを処理する場合における還元剤の濃度は、後述するような前処理液を用いる方法によりサンプルを処理する場合には、前処理液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．１～１００ｍＭであってもよい。このような場合、還元剤の濃度は、好ましくは０．０５ｍＭ以上、より好ましくは０．１ｍＭ以上であってもよい。還元剤の濃度はまた、好ましくは１００ｍＭ以下、より好ましくは５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは２０ｍＭ以下であってもよい。複数の還元剤を用いる場合、各還元剤の濃度もまた、上記のとおりである。
　別の実施形態では、サンプルの処理は、主要界面活性剤、または主要界面活性剤および還元剤の組合せに加えて、主要界面活性剤と異なる別の変性剤を併用して行われてもよい。したがって、本発明の方法は、別の変性剤でサンプルを処理することをさらに含んでいてもよい。主要界面活性剤、還元剤および別の変性剤によるサンプルの処理は、同時または別々に行うことができるが、好ましくは同時に行われる。このような変性剤としては、例えば、界面活性剤（例、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）、カオトロピック剤が挙げられる。変性剤は、１種であってもよいが、複数（例、２または３種）であってもよい。このような変性剤は、変性作用のために有効な濃度で用いられてもよいが、変性作用以外の作用を期待して、変性作用以外の作用に有効な濃度で用いられてもよい。
　主要界面活性剤と異なる別の変性剤として、ステロイド骨格を有する界面活性剤を用いてもよい。ステロイド骨格を有する界面活性剤は、ステロイド骨格を、独立した環状構造（即ち、他の環と縮合していないステロイド骨格）として有する化合物、またはその塩である。ステロイド骨格を有する界面活性剤において、その５位の立体構造はαであってもβであってもよい。ステロイド骨格を有する界面活性剤の濃度は、標的物質の測定に有効な濃度である限り特に限定されず、適宜調整することができるが、例えば０．００５％（ｗ／ｖ）～１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）～１％（ｗ／ｖ）である。
　ステロイド骨格を有する界面活性剤は、疎水性部分としてのステロイド骨格、および親水性部分を有する化合物またはその塩であり得る。ステロイド骨格を有する界面活性剤の親水性部分としては、例えば、アニオン性部分〔例、スルホネート（－ＳＯ３ －）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、およびホスホネート（－ＰＯＯ２ －）〕、カチオン性部分（例、１～４個の炭化水素基で置換されていてもよい４級アンモニウムおよび４級ホスホニウム）、非イオン性親水性部分（例、複数のエーテル）およびそれらを有する基（例、このような親水性部分を有する炭化水素基）が挙げられる。したがって、ステロイド骨格を有する界面活性剤は、親水性部分の種類に応じて、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤であり得る。上述した炭化水素基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、ｉｓｏ－プロピル、ブチル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル（ラウリル）、テトラデシル（ミリスチル）、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、フェニル、およびナフタレニルが挙げられる。炭化水素基は、好ましくは、炭素原子数１～１０の炭化水素基であり、より好ましくは炭素原子数１～６のアルキル基である。
　ステロイド骨格は、親水性部分の他に、１～６個（好ましくは１、２、３または４個）の置換基を有していてもよい。このような置換基としては、ステロイド骨格の性質（例、疎水性）を大きく損なうものでない限り特に限定されないが、例えば、炭素原子数１～１０の炭化水素基、ヒドロキシル基、炭素原子数１～１０の炭化水素基で置換されたヒドロキシル基（例、アルキルオキシ基）、炭素原子数１～１０の炭化水素基－カルボニル－オキシ基（例、アルキル－カルボニル－オキシ基）、オキソ基、ホルミル基、炭素原子数１～１０の炭化水素基－オキシ－カルボニル基（例、アルキルオキシ－カルボニル基）、ハロゲン原子（例、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、およびシアノが挙げられる。
　好ましくは、ステロイド骨格を有する界面活性剤は、胆汁酸またはその誘導体あるいはそれらの塩である。胆汁酸としては、例えば、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ヒオコール酸、5α-シプリノール、リトコール酸、タウロデオキシコール酸、およびタウロコール酸が挙げられる。胆汁酸の誘導体としては、例えば、ＣＨＡＰＳ、ＢＩＧＣＨＡＰ、およびｄｅｏｘｙ－ＢＩＧＣＨＡＰが挙げられる。
　より好ましくは、ステロイド骨格を有する界面活性剤は、７位にヒドロキシル基を有しないステロイド骨格を有していてもよい。７位にヒドロキシル基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤としては、例えば、ヒドロキシル基以外の基（例、ヒドロキシル基を除く上述した置換基）を７位に有するステロイド骨格を有する界面活性剤、および７位に置換基を有しない（換言すれば、７位の炭素原子が水素原子と結合している）ステロイド骨格を有する界面活性剤が挙げられる。特に好ましくは、７位にヒドロキシル基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤は、７位に置換基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤である。７位に置換基を有しないステロイド骨格を有する界面活性剤としては、例えば、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、５α－シプリノール、およびそれらの塩が挙げられる。
　サンプルの処理はまた、他の物質の存在下で行われてもよい。このような物質としては、例えば、標的物質に対する親和性物質、アルブミン（例、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン）、ゼラチン、およびスキムミルクが挙げられる。
　標的物質に対する親和性物質とは、標的物質に結合する能力を有する物質をいい、例えば、標的物質に対する抗体、アプタマーが挙げられる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれでもよい。抗体はまた、抗体のフラグメント（例、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、組換え抗体（例、ｓｃＦｖ）であってもよい。抗体はさらに、ファージディスプレイ等の分子生物学的手法により、および／または既存のタンパク質モチーフを利用してタンパク質工学的手法により作製された抗体様分子（例、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ｍｏｎｏｂｏｄｙ）であってもよい。
　サンプルの処理は、例えば、（ａ）サンプルを、上述したような成分を含む水溶液（例、緩衝液）と混合して混合液を調製すること、および（ｂ）混合液をインキュベートすることを含む。
　緩衝液としては、例えば、トリス緩衝液（例、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液、ＴＥ緩衝液、ＴＡＥ緩衝液、ＴＢＥ緩衝液、トリス緩衝生理食塩水）、リン酸緩衝液（例、リン酸緩衝生理食塩水）、炭酸緩衝液（例、炭酸－重炭酸ナトリウム緩衝液）、ＧＯＯＤ緩衝液（例、ＭＥＳ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、コラミン塩酸、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、アセトアミドグリシン、トリシン、グリシンアミド、ビシン）が挙げられる。サンプルの処理は、中性条件下あるいは酸性またはアルカリ性条件下で行うことができるが、好ましくは中性条件下で行われる。したがって、サンプルの処理において採用されるｐＨ値は、例えば４．０～９．５、好ましくは５．０～９．０、好ましくは５．５～８．５、より好ましくは６．０～８．０である。サンプルの処理におけるｐＨ値の調整は、緩衝液、酸性物質およびアルカリ性物質を利用して行うことができる。
　サンプルの処理（例、上記（ａ）（ｂ）の工程）の温度は、主要界面活性剤等の成分がその作用を発揮するのに適切である限り特に限定されないが、例えば１５～６０℃、好ましくは２０～５０℃、より好ましくは２０～４５℃である。（ａ）における混合液の調製に要する時間は、通常、３０秒以下であり、好ましくは２０秒以下であり、より好ましくは１５秒以下であり、さらにより好ましくは１０秒以下である。（ｂ）におけるインキュベート時間は、例えば６０分以下、好ましくは３０分以下、より好ましくは１０分以下である。測定のための処理時間の短縮の観点から、インキュベート時間は、さらにより好ましくは５分以下であり、特に好ましくは３分以下、２分以下、１分以下、５０秒以下、４０秒以下、３０秒以下、２０秒以下、１５秒以下、１０秒以下または５秒以下であってもよい。したがって、測定のための処理時間の短縮の観点から、サンプルの処理時間（例、上記（ａ）（ｂ）の合計時間）は、３分以下、２分以下、１分以下、５０秒以下、４０秒以下、３０秒以下または１５秒以下であってもよい。
　サンプルの処理はまた、混合のみによって行われてもよい。サンプルの処理が「混合のみ」によって行われるとは、サンプルの処理が上記（ａ）によって行われ、上記（ｂ）が行われないこと（即ち、インキュベーションが不要であること）を意味する。迅速かつ簡便な測定という観点からは、サンプルの処理を混合のみによって行ってもよい。
（Ａ－１－１．反応液の使用）
　好ましい実施形態では、上記工程１）は、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む反応液でサンプルを処理することにより行うことができる。
　反応液は、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む。反応液はまた、還元剤を含んでいてもよい。反応液はさらに、主要界面活性剤と異なる別の変性剤（例、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）、およびカオトロピック剤、ならびにステロイド骨格を有する界面活性剤等の他の成分を１種または複数（例、２または３種以上）含んでいてもよい。
　反応液中の主要界面活性剤の濃度は、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、０．００１～１０％（ｗ／ｖ）であってもよい。主要界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００５％（ｗ／ｖ）以上、より好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であってもよい。主要界面活性剤の濃度はまた、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下、より好ましくは３％（ｗ／ｖ）以下、さらにより好ましくは１％（ｗ／ｖ）以下、特に好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以下であってもよい。複数の主要界面活性剤を用いる場合、各主要界面活性剤の濃度もまた、上記のとおりである。反応液中の還元剤の濃度は、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば０．００１～１０００ｍＭ、好ましくは０．０１～１００ｍＭ、より好ましくは０．１～１０ｍＭである。
　反応液中の主要界面活性剤の濃度、および含まれる場合、還元剤の濃度は、反応液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、反応液とサンプルとの混合液において上述したような濃度（主要界面活性剤および／または還元剤でサンプルを処理する場合における主要界面活性剤および／または還元剤の濃度）を達成できるような濃度である。したがって、反応液中の主要界面活性剤および／または還元剤の濃度は、サンプルおよび反応液の容量に基づいて、上述したような濃度を達成するように適宜設定できる。
　反応液は、上述したような物質を水溶液（例、上述したような緩衝液）中に含む。反応液は、中性溶液あるいは酸性溶液またはアルカリ性溶液であり得るが、好ましくは中性溶液である。したがって、反応液のｐＨ値は、例えば４．０～９．５、好ましくは５．０～９．０、好ましくは５．５～８．５、より好ましくは６．０～８．０である。
　反応液の容量は、サンプルの容量および種類、ならびにアッセイの目的（例、定性的または定量的測定）等に応じて適宜決定できるが、サンプルの容量に対して、例えば１～３００倍、好ましくは１～１５０倍、より好ましくは１～５０倍である。
　反応液によるサンプルの処理は、反応液中に含まれる主要界面活性剤等の成分の作用を発揮するのに適切な様式で適宜行われる。例えば、反応液によるサンプルの処理は、上述したようなサンプルの処理と同様にして行うことができ、（ａ１）サンプルを反応液と混合して混合液を調製すること、および（ｂ１）混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。（ａ１）および（ｂ１）における温度および時間の条件は、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において上述したものと同様である。
（Ａ－１－２．前処理液および希釈液の使用）
　別の好ましい実施形態では、上記工程１）は、ｉ）主要界面活性剤を含む前処理液でサンプルを処理すること、およびｉｉ）前処理液で処理されたサンプルを希釈液で処理することにより行うことができる。
（工程ｉ）
　前処理液は、主要界面活性剤を含む。前処理液はまた、還元剤を含んでいてもよい。前処理液はさらに、主要界面活性剤と異なる別の変性剤を含んでいてもよい。別の変性剤としては、例えば、ステロイド骨格を有する界面活性剤、ならびにステロイド骨格を有する界面活性剤と異なる別の界面活性剤（例、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）、およびカオトロピック剤が挙げられる。前処理液に含まれる主要界面活性剤および別の変性剤は、それぞれ、１種であってもよいが、複数（例、２または３種以上）であってもよい。前処理液は、希釈液に含まれる別の変性剤と同種の１または２個以上（例、１～３個）の変性剤（例、ステロイド骨格を有する界面活性剤および別の界面活性剤）を含んでいてもよい。前処理液はまた、上述したような他の成分を含んでいてもよい。
　前処理液中の主要界面活性剤の濃度、および含まれる場合、還元剤の濃度は、前処理液とサンプルとの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されないが、例えば、前処理液とサンプルとの混合液において上述したような濃度（主要界面活性剤および／または還元剤でサンプルを処理する場合における主要界面活性剤および／または還元剤の濃度）を達成できるような濃度である。したがって、前処理液中の主要界面活性剤および／または還元剤の濃度は、サンプルおよび前処理液の容量に基づいて、上述したような濃度を達成するように適宜設定できる。
　前処理液は、上述したような物質を水溶液（例、上述したような緩衝液）中に含む。前処理液は、中性溶液あるいは酸性溶液またはアルカリ性溶液であり得るが、好ましくは中性溶液である。したがって、前処理液のｐＨ値は、例えば４．０～９．５、好ましくは５．０～９．０、好ましくは５．５～８．５、より好ましくは６．０～８．０である。
　前処理液の容量は、サンプルの容量および種類、ならびにアッセイの目的（例、定性的または定量的測定）等に応じて適宜決定できるが、サンプルの容量に対して、例えば０．５～１００倍、好ましくは１～１０倍、より好ましくは１～５倍である。
　前処理液によるサンプルの処理は、前処理液中に含まれる成分の作用を発揮するのに適切な様式で適宜行われる。例えば、前処理液によるサンプルの処理は、上述したようなサンプルの処理と同様にして行うことができ、（ａ２－１）サンプルを前処理液と混合して第１混合液を調製すること、および（ｂ２－１）第１混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。（ａ２－１）および（ｂ２－１）における温度および時間の条件は、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において上述したものと同様である。前処理液によるサンプルの処理はまた、上述したように混合のみによって行われてもよい。
（工程ｉｉ）
　希釈液は、例えば、上述した成分（例、ステロイド骨格を有する界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カオトロピック剤、および還元剤）を１種または複数（例、２または３種以上）含んでいてもよい。希釈液はまた、上述したような他の成分（例、ビタミンＤに対する親和性物質、アルブミン）を含んでいてもよい。
　希釈液における上述した成分の濃度は、前処理液、希釈液およびサンプルの混合液においてその作用が発揮されるような濃度である限り特に限定されず、適宜設定できる。
　希釈液は、上述したような物質を水溶液（例、上述したような緩衝液）中に含む。希釈液は、中性溶液あるいは酸性溶液またはアルカリ性溶液であり得るが、好ましくは中性溶液である。したがって、希釈液のｐＨ値は、例えば４．０～９．５、好ましくは５．０～９．０、好ましくは５．５～８．５、より好ましくは６．０～８．０である。
　希釈液の容量は、サンプルおよび前処理液の容量および種類、ならびにアッセイの目的（例、定性的または定量的測定）等に応じて適宜決定できるが、サンプルおよび前処理液の総容量よりも多い容量において用いられ得る。具体的には、希釈液の容量は、サンプルおよび前処理液の総容量に対して、例えば１～２０倍、好ましくは１～１０倍、より好ましくは１～５倍である。
　希釈液によるサンプルの処理は、希釈液中に含まれる成分の作用を発揮するのに適切な様式で適宜行われる。例えば、希釈液によるサンプルの処理は、前処理液によるサンプルの処理と同様にして行うことができる。具体的には、希釈液によるサンプルの処理は、（ａ２－２）前処理液で処理されたサンプルを希釈液と混合して第２混合液を調製すること、および（ｂ２－２）第２混合液をインキュベートすることを含んでいてもよい。（ａ２－２）および（ｂ２－２）における温度および時間の条件は、それぞれ、上記（ａ）および（ｂ）において上述したものと同様である。
（Ａ－２．工程２）
　上述したとおり処理されたサンプルにおいて、標的物質が検出される。標的物質の検出は、定性的または定量的に行われる。本工程では、上述した親和性物質が用いられる場合、親和性物質を処理されたサンプルに添加することを含んでいてもよい。
　標的物質の検出は、任意の方法により行うことができ、例えば、標的物質に対する親和性物質を利用して行うことができる。標的物質の検出はまた、免疫学的手法により行なわれてもよい。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、磁性粒子法、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ラテックス凝集法が挙げられる。標的物質の検出を可能とする上記以外の方法としては、例えば、ＬＣ－ＭＳが挙げられる。
　標的物質に対する親和性物質として抗体が用いられる場合、２次抗体がさらに用いられてもよい。２次抗体としては、標的物質に対する抗体（１次抗体）の１次抗体部分に対する抗体であってもよく、標的物質および１次抗体の複合体に対する抗体であってもよい。２次抗体等の抗体は、検出用物質に連結されていてもよい。検出用物質としては、例えば、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、親和性物質（例、ストレプトアビジン、ビオチン）、蛍光物質（例、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン）、発光物質（例、ルシフェリン、エクオリン）、放射性物質（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ）が挙げられる。２次抗体等の抗体は、抗体は、支持体に固定されていてもよい。支持体としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレート（例、マルチウェルプレート）、デバイスが挙げられる。抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。
（Ｂ．標的物質の測定用キット）
　本発明はまた、標的物質の測定用キットを提供する。
　本発明のキットは、以下を含む：
１）主要界面活性剤；ならびに
２）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。
　本発明のキットはまた、還元剤を含んでいてもよい。本発明のキットはさらに、ステロイド骨格を有する界面活性剤等の変性剤を含んでいてもよい。標的物質に対する親和性物質が１次抗体である場合、本発明のキットは、２次抗体をさらに含んでいてもよい。
　好ましい実施形態では、本発明のキットは、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む反応液を含む。反応液は、還元剤をさらに含んでいてもよい。
　別の好ましい実施形態では、本発明のキットは、以下を含む：
１）主要界面活性剤を含む前処理液（還元剤をさらに含んでいてもよい）；
２）希釈液；ならびに
３）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。
　本発明のキットに含まれる上述の構成成分の詳細（例、有効成分および濃度、好ましい例）は、本発明の方法において上述したとおりである。反応液ならびに前処理液および希釈液は、本発明の方法において上述した成分および／または物質をさらに含んでいてもよい。標的物質標品は、所定の濃度（単一または複数）の標的物質を含む水溶液または標的物質の粉末であり、コントロールとして有用である。
　本発明のキットでは、各構成成分が、それぞれ異なる容器（例、チューブ、プレート）に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、本発明のキットは、デバイスの形態で提供されてもよい。具体的には、構成成分の全部がデバイス中に収容された形態で提供されてもよい。あるいは、構成成分の一部がデバイス中に収容された形態で提供され、残りのものがデバイス中に収容されない形態（例、異なる容器に収容された形態）で提供されてもよい。この場合、デバイス中に収容されない構成成分は、標的物質の測定の際に、デバイス中に注入されることにより使用されてもよい。デバイスの構造としては、例えば、１）サンプルと主要界面活性剤とを混合して混合液を調製するための第１区域、および調製された混合液を、標的物質に対する親和性物質と接触させて、標的物質を検出するための第２区域を備えるデバイス；２）サンプル、主要界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を混合して、標的物質を検出するための区域を備えるデバイス；ならびに３）サンプルと上記構成成分（例、反応液、ならびに前処理液および希釈液）との混合を可能にする流路、および標的物質を検出するための区域を備えるデバイスが挙げられる。
　以下、本発明の実施例を記載するが、これらの実施例により本発明が限定されるものではない。
　以下の実施例では、標的物質としてのビタミンＤを測定する免疫学的方法として、２５ＯＨビタミンＤ２および２５ＯＨビタミンＤ３（以下、必要に応じて、２５ＯＨビタミンＤ２および２５ＯＨビタミンＤ３を包括して２５ＯＨビタミンＤと略記する）を認識する１次抗体を用いた。したがって、以下の実施例で測定された値は、２５ＯＨビタミンＤ２および２５ＯＨビタミンＤ３の総量に対応し得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
実施例１：アニオン性界面活性剤および還元剤による２５ＯＨビタミンＤ測定法の検討
　ヒト血清を、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）および還元剤（ＤＴＴ）で処理し、次いで、免疫学的方法によりヒト血清中の２５ＯＨビタミンＤを測定した。
　方法は、以下のとおり行った。
１）同一のヒトから採取された同一血清１０μｌに、前処理液〔ＰＢＳ（ｐＨ７．６）に、１％、０．３０％、０．１％または０％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ＋８ｍＭ、４ｍＭ、２ｍＭまたは０ｍＭ　ＤＴＴ＋０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ〕を４０μｌ加えて、血清と前処理液との第１混合液（５０μｌ）を調製した。第１混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：０．８％、０．２４％、０．０８％または０％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ；６．４ｍＭ、４ｍＭ、１．６ｍＭまたは０ｍＭ　ＤＴＴ；０．０８％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム塩；および０．０８％（ｗ／ｖ）　ＣＨＡＰＳ。
２）第１混合液を、室温（２５℃。以下同様）にて１０分間インキュベートした。
３）インキュベートした第１混合液に、希釈液〔ＰＢＳ（ｐＨ７．６）に０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ〕を１５０μｌ加えて、第１混合液と希釈液との第２混合液（２００μｌ）を調製した。第２混合液中のデオキシコール酸ナトリウム塩の濃度は、約０．１％（ｗ／ｖ）であった。
４）第２混合液７５μｌと抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合磁性粒子液７５μｌを混合した。
５）上記４）で得られた溶液を、３７℃にて１０分間インキュベートした。
６）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
７）洗浄液を除いた磁性粒子に、ＭＥＳ緩衝液で懸濁したアルカリホスファターゼ標識抗体（２５ＯＨビタミンＤ－抗２５ＯＨビタミンＤ抗体の免疫複合体に対する抗体）を加えた。
８）上記７）で得られた溶液を、３７℃にて１０分間インキュベートした。
９）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
１０）洗浄液を除いた磁性粒子に、発光基質　（ＡＭＰＰＤ）液を加えた。
１１）上記１０）で得られた溶液を、３７℃にて５分間インキュベートした。
１２）発光カウントを、ラベルリーダー（ＡＲＶＯ；　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
　結果は、以下の表１に示すとおりであった。なお、表１では、ＳＤＳおよびＤＴＴを含まない前処理液で処理されたヒト血清の発光カウントを１（コントロール）とし、各種条件下で測定された発光カウントを、コントロールに対する割合で表示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　その結果、ＳＤＳ　０．３％（ｗ／ｖ）を含む前処理液を加えた条件では、未処理条件の１０倍以上のカウントが得られた（表１）。また、ＤＴＴを５ｍＭ以上を含む前処理液を加えた条件では、なにも加えなかった条件の２０倍近くのカウントが得られた（表１）。したがって、２５ＯＨビタミンＤを含むサンプルの処理において、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いることで、２５ＯＨビタミンＤの測定感度を向上できること、ならびにアニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）および還元剤（ＤＴＴ）を併用することで、２５ＯＨビタミンＤの測定感度をさらに向上できることが示された。
実施例２：ビタミンＤ結合タンパクを変性させるのに有効な還元剤の検討
　ヒト血清を、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）および種々の還元剤で処理し、次いで、免疫学的方法によりヒト血清中の２５ＯＨビタミンＤを測定した。
　方法は、以下のとおりに行った。
１）同一のヒトから採取された同一血清１０μｌに、前処理液〔ＰＢＳ（ｐＨ７．６）に０．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ＋５ｍＭ　各還元剤＋０．１％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ）　ＣＨＡＰＳ〕を４０μｌ加えて、血清と前処理液との第１混合液（５０μｌ）を調製した。第１混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：０．２４％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ；４ｍＭ　各還元剤；０．０８％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム塩；および０．０８％（ｗ／ｖ）　ＣＨＡＰＳ。
２）以降の操作は、実施例１の上記２）～１２）と同じ方法により行った。
　結果は、以下の表２に示すとおりであった。なお、表３では、還元剤を含まない前処理液で処理されたヒト血清の発光カウントを１（コントロール）とし、還元剤としてＤＴＥ（ジチオエリトリトール）、ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ－２－カルボキシエチルホスフィン塩酸塩）、Ｌ－Ｃｙｓ（Ｌ－システイン）、２－ＭＥＡ（２－メルカプトエチルアミン）またはＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む前処理液で処理されたヒト血清の発光カウントを、コントロールに対する割合（％）で表示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表２に示されるように、チオール基（－ＳＨ）含有還元剤（例、ＤＴＥ、Ｌ－Ｃｙｓ、２－ＭＥＡ、ＤＴＴ）を用いた場合、シグナル強度（発光カウント）が向上した。特に、２－ＭＥＡで高い効果が確認された。
実施例３：アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）による処理時間の検討
　２５ＯＨビタミンＤの高感度測定に必要とされる、アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）による処理時間について検討した。
　方法は、以下のとおりに行った。
１同一のヒトから採取された同一血清１０μｌに、前処理液（ＰＢＳに０．３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ＋５ｍＭ　２－ＭＥＡ＋０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．１％（ｗ／ｖ）　ＣＨＡＰＳ）を４０μｌ加えて、攪拌による混合により血清と前処理液との第１混合液（５０μｌ）を調製した。第１混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：０．２４％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ；４ｍＭ　２－ＭＥＡ；０．０８％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム塩；および０．０８％（ｗ／ｖ）　ＣＨＡＰＳ。攪拌による混合に要した時間は、約３秒であった。
２）第１混合液を、室温（２５℃）にてインキュベートした（１０分、５分または１分）。また、攪拌による混合のみにより調製された第１混合液を、インキュベートすることなく、次の操作に供した（インキュベート時間：０分）。
３）以降の操作は、実施例１の３）～１２）と同じ方法により行った。
　結果は、以下の表３に示すとおりであった。なお、表３では、上記工程２）に関して、１０分のインキュベート時間の条件下で測定された発光カウントを１００％（コントロール）とし、０分、１分および５分のインキュベート時間の条件下で測定された発光カウントを、コントロールに対するパーセントで表示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　その結果、上記工程２）に関して、混合のみ（インキュベート時間：０分）の条件下で測定された発光カウントは、１０分のインキュベート時間の条件下で測定された発光カウントとほぼ同じであった。このことは、上記工程２）のインキュベート操作は必ずしも必要でなく、血清と前処理液とを軽く攪拌するだけで、ビタミンＤが、ＤＢＰから解離することを示す。したがって、本発明の方法により、標的物質の測定に要する時間が短縮できることが示された。
参考例１：既存製品を用いた前処理に要する時間
　既存製品では、血清サンプルの前処理に必要とされる時間は、その使用説明書によれば、以下のとおりである。既存製品として、ＤｉａＳｏｒｉｎ－ＲＩＡ（ＤｉａＳｏｒｉｎ社製）、ＤｉａＳｏｒｉｎ－Ｌｉａｉｓｏｎ（ＤｉａＳｏｒｉｎ社製）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例４：本発明の方法と有機溶媒を用いる既存の方法との比較（Ｉ）
　アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いる本発明の方法による標的物質の測定精度を検証するため、本発明の方法による標的物質の測定値と、有機溶媒を用いる既存の方法により得られた測定値との相関係数を比較した。
４－１）本発明の方法による測定
　方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、ヒト血清５サンプルを用いた。
１）ヒト血清３．７５μｌに、反応液（ＰＢＳに約０．０３％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ＋約０．５ｍＭ　２－ＭＥＡ＋約０．０４％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．０４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ＋抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液）１４６．２５μｌを加えて、血清と反応液との混合液（１５０μｌ）を調製した。混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：約０．０３％（ｗ／ｖ）　ＳＤＳ；約０．５ｍＭ　２－ＭＥＡ；約０．０４％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム；約０．０４％（ｗ／ｖ）　ＣＨＡＰＳ。
２）混合液を、３７℃にて１０分間インキュベートした。
３）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
４）洗浄液を除いた磁性粒子に、ＭＥＳ緩衝液中に懸濁したアルカリホスファターゼ標識抗体（２５ＯＨビタミンＤ－抗２５ＯＨビタミンＤ抗体免疫複合体に対する抗体）を加えた。
５）上記４）で得られた溶液を、３７℃にて１０分間のインキュベートした。
６）インキュベート後、磁性プレート上にてサンプル中の磁性粒子を集め、磁性粒子を３回洗浄した。
７）洗浄液を除いた磁性粒子に、発光基質（ＡＭＰＰＤ）液を加えた。
８）磁性粒子および発光基質を含む溶液を、３７℃にて５分間インキュベートした。
９）発光カウントを、ラベルリーダー（ＡＲＶＯ；Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）で測定した。
４－２）有機溶媒を用いる既存の方法による測定
　既存の方法としては、有機溶媒（アセトニトリル）によるタンパク質除去法を用いた。方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、上記４－１）と同じヒト血清５サンプルを用いた。
ａ）ヒト血清２５μｌに、７５μｌのアセトニトリルを加えた。
ｂ）血清とアセトにトリルの混合液を、６０００ｒｐｍにて１０分間遠心した。
ｃ）上清５０μｌを回収し、希釈液（ＭＥＳ緩衝液：０．１％　ＢＳＡ、０．１％デオキシコール酸ナトリウム）を２００μｌ加えた。
ｄ）上記ｃ）で得られた溶液７５μｌと抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合磁性粒子液を７５μｌ混合した。
ｅ）以降の操作は、上記４－１）の２）～９）と同じ方法により行った。
４－３）結果
　本発明の方法による測定値は、有機溶媒（アセトニトリル）を用いるタンパク質除去法による測定値との相関性が高かった（図１、Ｒ２＝０．９９８１）。したがって、本発明の方法は、ビタミンＤの測定に有用であると考えられる。
実施例５：本発明の方法と既存の方法（ＤｉａＳｏｒｉｎ－ＲＩＡ）との比較（ＩＩ）
　アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いる本発明の方法による標的物質の測定精度をさらに検証するため、本発明の方法による標的物質の測定値と、既存の方法（ＤｉａＳｏｒｉｎ－ＲＩＡ）により得られた測定値との相関係数を比較した。
５－１）本発明の方法による測定
　方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、ヒト血清１３サンプルを用いた。
１）ヒト血清３．７５μｌに、反応液（ＰＢＳに０．０３％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ＋０．５ｍＭ　２－ＭＥＡ＋０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．０１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ＋０．０３８％ＢＳＡ＋抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液）１４６．２５μｌを加えた。
２）以降の操作は、実施例４－１）の２）～９）と同じ方法により行った。
５－２）既存の方法（ＤｉａＳｏｒｉｎ－ＲＩＡ）による測定
　既存の方法としては、後述するとおり、ＤｉａＳｏｒｉｎ－ＲＩＡを用いた。ＤｉａＳｏｒｉｎ－ＲＩＡは、市販のキット（２５－ＨｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ　１２５Ｉ　ＲＩＡ　Ｋｉｔ，ＤｉａＳｏｒｉｎ製）を用いて行った。方法は、以下のとおりに行った。なお、測定サンプルとしては、上記５－１）と同じヒト血清１３サンプルを用いた。
Ｉ）前処理操作
ａ）ガラス試験管を準備する。
ｂ）アセトニトリルを各試験管に５００μｌずつ分注する。
ｃ）キャリブレーター、コントロール、またはサンプル（血清など）を５０μｌずつ加える。
ｄ）サンプル溶液を１０秒間攪拌する。
ｅ）サンプル溶液を、室温にて１２００ｇで１０分間遠心分離する。
ｆ）上清をサンプルとして用いる。
ＩＩ）測定操作
ａ）上記サンプル　２５μｌ、Ｉ１２５　２５ＯＨビタミンＤ（ＤｉａＳｏｒｉｎ製）　５０μｌおよび抗２５ＯＨビタミンＤ抗体液　１ｍｌを混合する。
ｂ）混合液を、室温にて９０分インキュベートする。
ｃ）インキュベートした混合液に、ロバ由来抗ヤギ抗体を５００μｌ加える。
ｄ）得られた溶液を、室温にて２５分インキュベートする。
ｅ）インキュベートした溶液に、ＮＳＢ／添加緩衝液を５００μｌ加える。
ｆ）得られた溶液を、室温にて１８００ｇで２０分間遠心分離する。
ｇ）遠心分離した溶液から完全に上清を除く。
ｈ）ガンマシンチレーションカウンターを用いて測定を行う。
５－３）結果
　アニオン性界面活性剤（ＳＤＳ）を用いた本発明の方法による測定値は、Ｄｉａｓｏｒｉｎ　ＲＩＡ法による測定値との相関性が高かった（図２、Ｒ２＝０．９４２５）。したがって、本発明の方法は、ビタミンＤの測定に有用であると考えられる。
実施例６：ＳＤＳ類似界面活性剤によるビタミンＤの測定
　次いで、ＳＤＳ類似界面活性剤によるビタミンＤの測定について検討した。
　方法は、以下のとおりに行った。
１）５０ｎｇ／ｍｌ強化ウマ血清３．７５μｌに、反応液〔Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）に、０．０３％（ｗ／ｖ）または０．１％（ｗ／ｖ）　下記界面活性剤＋０．０３８％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム塩＋０．０３８％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ＋抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液〕１４６．２５μｌを加えて、血清と反応液との混合液（１５０μｌ）を調製した。混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：約０．０３％（ｗ／ｖ）または約０．１％（ｗ／ｖ）　下記界面活性剤；約０．０４％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム；および約０．０４％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ。
２）以降の操作は、実施例４－１）の２）～９）と同じ方法により行った。
　結果は、以下の表５に示すとおりであった。なお、表５では、上記工程１）に関して、界面活性剤の非存在下で測定された発光カウントを１００（コントロール）とし、各種界面活性剤の存在下で測定された発光カウントを、コントロールに対する割合で表示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　その結果、１０以上の炭素原子数を有する炭化水素鎖を含むＳＤＳ類似界面活性剤で高い効果が認められた。特に、デシル硫酸ナトリウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム塩を用いたときに高い効果が認められた。親水性部分を構成する硫黄原子がリン原子である場合、効果が認められなかった。以上のことから、界面活性剤の親水性部分および疎水性部分のどちらもビタミンＤの測定に重要であることが考えられた。
実施例７：炭化水素鎖を有する界面活性剤によるビタミンＤの測定
　次いで、炭化水素鎖を有する界面活性剤によるビタミンＤの測定について検討した。
　具体的には、方法は、以下のとおりであった。
１）１００ｎｇ／ｍｌ強化ウマ血清３．７５μｌに、反応液〔Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）、０．０３％（ｗ／ｖ）または０．１％（ｗ／ｖ）　下記の界面活性剤、０．０３８％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、０．０３８％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、抗２５ＯＨビタミンＤ抗体結合粒子液〕１４６．２５μｌを加えて、血清と反応液との混合液（１５０μｌ）を調製した。混合液中の各成分の濃度は、次のとおりである：約０．０３％（ｗ／ｖ）または約０．１％（ｗ／ｖ）　下記界面活性剤；約０．０４％（ｗ／ｖ）　デオキシコール酸ナトリウム；および約０．０４％（ｗ／ｖ）　ＢＳＡ。
２）以降の操作は、実施例４－１）の２）～９）と同じ方法により行った。
　結果は、以下の表６に示すとおりであった。なお、表６では、上記工程（１）に関して、界面活性剤の非存在下で測定された発光カウントを１００（コントロール）とし、界面活性剤の存在下で測定された発光カウントを、コントロールに対する割合で表示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　その結果、これらの界面活性剤で効果が認められた。特に、ＳＤＳは、低濃度で高い効果を示した。
　本発明の方法およびキットは、標的物質の測定に有用である。

Claims (16)

  1. 　以下を含む、標的物質の測定方法：
    １）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤でサンプルを処理すること；ならびに
    ２）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
  2. 　炭化水素鎖が、１０個以上の炭素原子数を有する直鎖の炭化水素基である、請求項１記載の方法。
  3. 　親水性部分が、スルホネート基、カルボキシレート基、またはアンモニウム基である、請求項１または２記載の方法。
  4. 　前記界面活性剤が、デシル硫酸、ドデシル硫酸またはこれらの塩である、請求項１～３のいずれか一項記載の方法。
  5. 　チオール基含有還元剤でサンプルを処理することをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項記載の方法。
  6. 　チオール基含有還元剤が、ジチオエリトリトール、システイン、２－メルカプトエチルアミンおよびジチオスレイトールからなる群より選ばれる、請求項５記載の方法。
  7. 　サンプルの処理が混合のみによって行われる、請求項１～６のいずれか一項記載の方法。
  8. 　以下を含む方法である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法：
    １’）前記界面活性剤および標的物質に対する親和性物質を含む反応液でサンプルを処理すること；ならびに
    ２’）処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
  9. 　以下を含む方法である、請求項１～７のいずれか一項記載の方法：
    １’’）前記界面活性剤を含む前処理液でサンプルを処理すること；
    ２’’）前記１’’）で処理されたサンプルを希釈液で処理すること；ならびに
    ３’’）前記２’’）で処理されたサンプルにおいて標的物質を検出すること。
  10. 　サンプルがヒト由来のサンプルである、請求項１～９のいずれか一項記載の方法。
  11. 　サンプルが血液関連サンプルである、請求項１～１０のいずれか一項記載の方法。
  12. 　標的物質がサンプル中で標的物質に対する結合性物質と結合している、請求項１～１１のいずれか一項記載の方法。
  13. 　標的物質が低分子物質である、請求項１～１２のいずれか一項記載の方法。
  14. 　低分子物質がビタミンである、請求項１３記載の方法。
  15. 　ビタミンがビタミンＤである、請求項１４記載の方法。
  16. 　以下を含む、標的物質の測定用キット：
    １）炭化水素鎖から構成される疎水性部分、および親水性部分を含む界面活性剤；ならびに
    ２）標的物質に対する親和性物質および／または標的物質標品。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018047792A1 (ja) * 2016-09-06 2018-03-15 富士レビオ株式会社 サイログロブリンの測定方法及び測定試薬
WO2018051965A1 (ja) * 2016-09-13 2018-03-22 富士レビオ株式会社 心筋トロポニンの測定方法及び測定試薬
CN108918848A (zh) * 2018-05-22 2018-11-30 德康润生物科技（北京）有限公司 维生素d释放剂及其制备方法与应用
WO2020241443A1 (ja) * 2019-05-24 2020-12-03 富士レビオ株式会社 サイログロブリンの測定方法及び測定試薬

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000241429A (ja) * 1998-07-31 2000-09-08 Mitsubishi Chemicals Corp 生理活性成分の測定法
JP2009236810A (ja) * 2008-03-28 2009-10-15 Itea Inc 食品検査方法及び食品抽出液処理用試薬
JP2010122205A (ja) * 2008-08-29 2010-06-03 Sysmex Corp 麻疹ウイルス検出方法、メンブレンアッセイ用試験具およびメンブレンアッセイ用試験キット
WO2012091569A1 (en) * 2010-12-28 2012-07-05 Future Diagnostics B.V. Release reagent for vitamin d

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3487642B2 (ja) * 1994-06-16 2004-01-19 アボットジャパン株式会社 Ｈａｖ抗原及びその抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法
JP2008275534A (ja) * 2007-05-02 2008-11-13 Olympus Corp 標的高分子の精製方法及び検出方法
US7790401B2 (en) * 2007-08-06 2010-09-07 Siemens Healthcare Diagnostics Methods for detection of immunosuppressant drugs

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000241429A (ja) * 1998-07-31 2000-09-08 Mitsubishi Chemicals Corp 生理活性成分の測定法
JP2009236810A (ja) * 2008-03-28 2009-10-15 Itea Inc 食品検査方法及び食品抽出液処理用試薬
JP2010122205A (ja) * 2008-08-29 2010-06-03 Sysmex Corp 麻疹ウイルス検出方法、メンブレンアッセイ用試験具およびメンブレンアッセイ用試験キット
WO2012091569A1 (en) * 2010-12-28 2012-07-05 Future Diagnostics B.V. Release reagent for vitamin d

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018047792A1 (ja) * 2016-09-06 2018-03-15 富士レビオ株式会社 サイログロブリンの測定方法及び測定試薬
JPWO2018047792A1 (ja) * 2016-09-06 2019-06-24 富士レビオ株式会社 サイログロブリンの測定方法及び測定試薬
JP7007278B2 (ja) 2016-09-06 2022-02-10 富士レビオ株式会社 サイログロブリンの測定方法及び測定試薬
US11768209B2 (en) 2016-09-06 2023-09-26 Fujirebio Inc. Method and reagent for measuring thyroglobulin
WO2018051965A1 (ja) * 2016-09-13 2018-03-22 富士レビオ株式会社 心筋トロポニンの測定方法及び測定試薬
JPWO2018051965A1 (ja) * 2016-09-13 2019-06-24 富士レビオ株式会社 心筋トロポニンの測定方法及び測定試薬
JP6999561B2 (ja) 2016-09-13 2022-02-10 富士レビオ株式会社 心筋トロポニンの測定方法及び測定試薬
US11802867B2 (en) 2016-09-13 2023-10-31 Fujirebio Inc. Cardiac troponin assay method and assay reagent
CN108918848A (zh) * 2018-05-22 2018-11-30 德康润生物科技（北京）有限公司 维生素d释放剂及其制备方法与应用
WO2020241443A1 (ja) * 2019-05-24 2020-12-03 富士レビオ株式会社 サイログロブリンの測定方法及び測定試薬
CN113631924A (zh) * 2019-05-24 2021-11-09 富士瑞必欧株式会社 甲状腺球蛋白的测定方法和测定试剂
JP7547329B2 (ja) 2019-05-24 2024-09-09 富士レビオ株式会社 サイログロブリンの測定方法及び測定試薬

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