WO2014007367A1 - Method for detecting or assaying two kinds of substances in same sample - Google Patents
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Definitions
- kits according to the present invention includes first to third antibodies.
- Each antibody may be labeled so as to be distinguishable from each other, or a reagent necessary for labeling separately from the antibody may be provided in the kit.
- a buffer solution, a reagent, a microtiter plate, a solid phase carrier such as a microplate reader and beads, an instruction manual, and the like necessary for the detection or measurement method according to the present invention may be provided.
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Abstract
The purpose of the present invention is to provide a method for easily and highly sensitively detecting or assaying two substances respectively, said substances having a common site and uncommon sites each possibly serving as an epitope, from a sample that contains these two substances. Provided is a method for detecting or assaying two substances respectively, said substances having a common site and uncommon sites each possibly serving as an epitope, from a sample that contains these two substances, said method comprising: a step for incubating the sample in contact with a first antibody that is capable of recognizing the common site; a step for incubating the substances, said substances having bound to the first antibody, in contact with a second antibody that is capable of recognizing the uncommon site of one of the substances; and a step for detecting or assaying the common site and the uncommon site.
Description
本発明は、共通な部位を有する２種の物質を同一の試料において検出又は測定する方法等に関する。
The present invention relates to a method for detecting or measuring two kinds of substances having a common site in the same sample.
多くのタンパク質は翻訳された後、プロテアーゼによる限定分解を受け、活性を有する成熟体に変換される。この過程をプロセシングと呼ぶ。膜タンパク質の場合、プロテアーゼによる限定分解には、膜直上で起こるシェディングと細胞外領域で起こるプロセシングがある。前者は膜タンパク質を分泌型へと変換するのに対して、後者は膜タンパク質の活性制御に寄与する。
近年、膜タンパク質のプロセシングの重要性が徐々に認知され、癌、慢性炎症疾患、アルツハイマー病など各種の難治疾患の発症に関与していることも明らかとなってきた。例えば、卵巣癌腹水中のＨＢ－ＥＧＦの膜型ＭＭＰによるプロセシング断片は卵巣癌の悪性度と相関がある。ＨＢ－ＥＧＦの増殖因子活性は、Ｎ末端にあるヘパリン結合性を持つ配列により抑制的に制御されているが、ＭＴ１－ＭＭＰがＨＢ－ＥＧＦのＮ末端を切断することで、ＨＢ－ＥＧＦをヘパリン非依存的な増殖因子に変換し、ＥＧＦ受容体の活性化を強く亢進させる。進行性の卵巣癌組織ではＨＢ－ＥＧＦとＭＴ１－ＭＭＰの両方の発現が観察され、卵巣癌患者より採取した腹水中に浸潤した腹水癌細胞においても、ＨＢ－ＥＧＦ及びＭＴ１－ＭＭＰの発現が免疫組織学的に確認された。また、腹水中のＨＢ－ＥＧＦの分子種をＥＧＦ様ドメイン抗体でウエスによるンブロットで解析すると、１０検体中３検体の腹水でＭＴ１－ＭＭＰによるプロセシングを受けたＨＢ－ＥＧＦが検出された（非特許文献１及び２）。よって、患者サンプルにおけるＨＢ－ＥＧＦの膜型ＭＭＰによるプロセシング断片は、卵巣癌治療の奏功を判断する方法として有効であると考えられる。 Many proteins are translated and then subject to limited degradation by proteases and converted to active mature forms. This process is called processing. In the case of membrane proteins, limited degradation by proteases includes shedding that occurs directly above the membrane and processing that occurs in the extracellular region. The former converts a membrane protein into a secreted form, while the latter contributes to the activity control of the membrane protein.
In recent years, the importance of membrane protein processing has been gradually recognized, and it has become clear that it is involved in the development of various intractable diseases such as cancer, chronic inflammatory diseases, and Alzheimer's disease. For example, the processing fragment of membrane type MMP of HB-EGF in ovarian cancer ascites correlates with the malignancy of ovarian cancer. The growth factor activity of HB-EGF is repressively controlled by the heparin-binding sequence at the N-terminus, but MT1-MMP cleaves the N-terminus of HB-EGF, thereby converting HB-EGF to heparin. It is converted into an independent growth factor, and the activation of the EGF receptor is strongly enhanced. Expression of both HB-EGF and MT1-MMP was observed in advanced ovarian cancer tissues, and the expression of HB-EGF and MT1-MMP was also immunized in ascites cancer cells infiltrated in ascites collected from ovarian cancer patients. Confirmed histologically. In addition, when molecular species of HB-EGF in ascites were analyzed by West blot with EGF-like domain antibody, HB-EGF processed by MT1-MMP was detected in 3 out of 10 ascites (non-patented)References 1 and 2). Therefore, it is considered that the processing fragment of HB-EGF by membrane-type MMP in a patient sample is effective as a method for determining the success of ovarian cancer treatment.
近年、膜タンパク質のプロセシングの重要性が徐々に認知され、癌、慢性炎症疾患、アルツハイマー病など各種の難治疾患の発症に関与していることも明らかとなってきた。例えば、卵巣癌腹水中のＨＢ－ＥＧＦの膜型ＭＭＰによるプロセシング断片は卵巣癌の悪性度と相関がある。ＨＢ－ＥＧＦの増殖因子活性は、Ｎ末端にあるヘパリン結合性を持つ配列により抑制的に制御されているが、ＭＴ１－ＭＭＰがＨＢ－ＥＧＦのＮ末端を切断することで、ＨＢ－ＥＧＦをヘパリン非依存的な増殖因子に変換し、ＥＧＦ受容体の活性化を強く亢進させる。進行性の卵巣癌組織ではＨＢ－ＥＧＦとＭＴ１－ＭＭＰの両方の発現が観察され、卵巣癌患者より採取した腹水中に浸潤した腹水癌細胞においても、ＨＢ－ＥＧＦ及びＭＴ１－ＭＭＰの発現が免疫組織学的に確認された。また、腹水中のＨＢ－ＥＧＦの分子種をＥＧＦ様ドメイン抗体でウエスによるンブロットで解析すると、１０検体中３検体の腹水でＭＴ１－ＭＭＰによるプロセシングを受けたＨＢ－ＥＧＦが検出された（非特許文献１及び２）。よって、患者サンプルにおけるＨＢ－ＥＧＦの膜型ＭＭＰによるプロセシング断片は、卵巣癌治療の奏功を判断する方法として有効であると考えられる。 Many proteins are translated and then subject to limited degradation by proteases and converted to active mature forms. This process is called processing. In the case of membrane proteins, limited degradation by proteases includes shedding that occurs directly above the membrane and processing that occurs in the extracellular region. The former converts a membrane protein into a secreted form, while the latter contributes to the activity control of the membrane protein.
In recent years, the importance of membrane protein processing has been gradually recognized, and it has become clear that it is involved in the development of various intractable diseases such as cancer, chronic inflammatory diseases, and Alzheimer's disease. For example, the processing fragment of membrane type MMP of HB-EGF in ovarian cancer ascites correlates with the malignancy of ovarian cancer. The growth factor activity of HB-EGF is repressively controlled by the heparin-binding sequence at the N-terminus, but MT1-MMP cleaves the N-terminus of HB-EGF, thereby converting HB-EGF to heparin. It is converted into an independent growth factor, and the activation of the EGF receptor is strongly enhanced. Expression of both HB-EGF and MT1-MMP was observed in advanced ovarian cancer tissues, and the expression of HB-EGF and MT1-MMP was also immunized in ascites cancer cells infiltrated in ascites collected from ovarian cancer patients. Confirmed histologically. In addition, when molecular species of HB-EGF in ascites were analyzed by West blot with EGF-like domain antibody, HB-EGF processed by MT1-MMP was detected in 3 out of 10 ascites (non-patented)
このように、プロセシングの有無や異常を調べることにより、疾患の診断や、治療の奏功の判断ができる可能性がある。膜タンパク質のプロセシング断片を検出する方法としては、切断部位を特異的に認識するネオエピトープ抗体を用いる方法が知られている。しかしながら、ネオエピトープ抗体の作製は非常に困難である。また、切断部位は、エンドペプチダーゼによる消化を受ける可能性があり、その場合には抗原性が消失してネオエピトープ抗体に認識されなくなる。さらに、ネオエピトープ抗体の検出感度は一般にあまり高くない。そこで、さらに感度良く簡便にプロセシング断片を検出する方法が求められている。
Thus, by examining the presence or absence of processing and abnormalities, there is a possibility that diagnosis of disease and judgment of the success of treatment can be made. As a method for detecting a processing fragment of a membrane protein, a method using a neoepitope antibody that specifically recognizes a cleavage site is known. However, the production of neoepitope antibodies is very difficult. In addition, the cleavage site may be digested by endopeptidase, in which case the antigenicity is lost and the neoepitope antibody is not recognized. Furthermore, the detection sensitivity of neoepitope antibodies is generally not very high. Therefore, there is a need for a method for detecting processing fragments with higher sensitivity and ease.
本発明は、エピトープとなりうる共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料において、それぞれの物質を簡便且つ高感度に検出又は測定する方法を提供することを目的とする。かかる方法は、例えば、タンパク質のプロセシングが関与する疾患の診断や治療の奏功の判断にも用いられうる。
An object of the present invention is to provide a method for detecting and measuring each substance easily and with high sensitivity in a sample containing two kinds of substances having a common site and an uncommon site that can be epitopes. Such a method can be used, for example, for diagnosis of a disease involving protein processing and determination of the success of treatment.
本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、膜タンパク質のシェディングやプロセシングによって生じた２種類の断片は、これらの断片が共通に有する部位に対する第一の抗体と、一方の断片における非共通部位を認識する第二の抗体、及び／又は、第一の抗体とは異なる共通部位又は第二の抗体とは異なる非共通部位を認識する第三の抗体と、これらの抗体と断片との結合を検出することにより、簡便且つ高感度にプロセシング断片のそれぞれを検出できることを見出し、その種々の応用を検討して、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
〔１〕共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料において、少なくとも一方の物質を検出又は測定する方法であって、
前記試料と、共通部位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一の抗体に結合した物質と、一方の物質の非共通部位を認識する第二の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一及び／又は第二の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む方法；
〔２〕前記第一の抗体と、前記第二の抗体が、互いに識別可能に標識されている、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記第一の抗体が固相担体に固定されており、
さらに、前記第一の抗体と結合した物質と、前記第一の抗体とは異なる共通部位を認識する第三の抗体と、を接触させてインキュベートする工程を含み、
前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されており、前記第一、第二及び／又は第三の抗体と前記物質との結合の検出又は測定を、該標識を検出又は測定することによって行う、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記第一の抗体が固相担体に固定されており、
さらに、前記第一の抗体と結合した物質と、前記第二の抗体とは異なる非共通部位を認識する第三の抗体と、を接触させてインキュベートする工程を含み、
前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されており、
前記第一、第二及び／又は第三の抗体と前記物質との結合の検出又は測定を、該標識を検出又は測定することによって行う、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔５〕前記２種の物質は、タンパク質がプロセシング及び／又はシェディングによって生じた断片である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔６〕各抗体の認識部位が、前記断片の末端ではない、上記〔５〕に記載の方法；
〔７〕共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料において、少なくとも一方の物質を検出又は測定するためのキットであって、
共通部位を認識する第一の抗体と、一方の物質の非共通部位を認識する第二の抗体と、を含むキット；
〔８〕前記第一と第二の抗体は、それぞれ異なる色で蛍光標識されている、上記〔７〕に記載のキット；
〔９〕さらに、前記第一の抗体とは異なる共通部位を認識する第三の抗体を含む、上記〔７〕又は〔８〕に記載のキット；
〔１０〕さらに、前記第二の抗体とは異なる非共通部位を認識する第三の抗体を含む、上記〔７〕又は〔８〕に記載のキット；
〔１１〕前記第二と第三の抗体は、それぞれ異なる色で蛍光標識されている、上記〔９〕又は〔１０〕に記載のキット；
〔１２〕前記２種の物質は、タンパク質がプロセシング及び／又はシェディングによって生じた断片である、上記〔７〕から〔１１〕のいずれか１項に記載のキット；
〔１３〕アルツハイマー病の検査方法であって、
被検者に由来する試料と、配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一の抗体に結合した物質と、配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体とを接触させてインキュベートする工程と、
前記第二の抗体及び／又は第三の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む方；
〔１４〕前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されている、上記〔１３〕に記載の方法；及び
〔１５〕アルツハイマー病の検査用キットであって、
配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、
配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体と、を含むキット、
に関する。 As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have found that two types of fragments generated by shedding and processing of membrane proteins include a first antibody against a site that these fragments have in common, A second antibody recognizing a non-common site in one fragment and / or a third antibody recognizing a common site different from the first antibody or a non-common site different from the second antibody, and By detecting the binding between the antibody and the fragment, it was found that each of the processing fragments can be detected easily and with high sensitivity, and various applications thereof were studied, thereby completing the present invention.
That is, the present invention
[1] A method for detecting or measuring at least one substance in a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part,
Contacting the sample with a first antibody that recognizes a common site and incubating;
Incubating the substance bound to the first antibody and the second antibody recognizing a non-common site of one substance in contact with each other;
Detecting or measuring the binding between the first and / or second antibody and the substance;
[2] The method according to [1] above, wherein the first antibody and the second antibody are labeled so as to be distinguishable from each other;
[3] The first antibody is immobilized on a solid support,
And a step of contacting and incubating the substance bound to the first antibody and a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody,
The second antibody and the third antibody are labeled so as to be distinguishable from each other, and the detection or measurement of the binding between the first, second and / or third antibody and the substance is detected by the label. The method according to [1] or [2], wherein the method is performed by detecting or measuring
[4] The first antibody is immobilized on a solid support,
And a step of contacting and incubating the substance bound to the first antibody and a third antibody that recognizes a non-common site different from the second antibody,
The second antibody and the third antibody are labelably distinguishable from each other;
The method according to [1] or [2] above, wherein the detection or measurement of the binding between the first, second and / or third antibody and the substance is performed by detecting or measuring the label;
[5] The method according to any one of [1] to [4] above, wherein the two substances are fragments generated by processing and / or shedding of proteins;
[6] The method according to [5] above, wherein the recognition site of each antibody is not the end of the fragment;
[7] A kit for detecting or measuring at least one substance in a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part,
A kit comprising: a first antibody that recognizes a common site; and a second antibody that recognizes a non-common site of one substance;
[8] The kit according to [7] above, wherein the first and second antibodies are fluorescently labeled with different colors, respectively.
[9] The kit according to [7] or [8] above, further comprising a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody;
[10] The kit according to [7] or [8] above, further comprising a third antibody that recognizes a non-common site different from the second antibody;
[11] The kit according to [9] or [10], wherein the second and third antibodies are fluorescently labeled with different colors, respectively.
[12] The kit according to any one of [7] to [11], wherein the two kinds of substances are fragments generated by processing and / or shedding of proteins;
[13] A test method for Alzheimer's disease,
Incubating a sample derived from the subject and a first antibody that recognizespositions 672 to 687 of SEQ ID NO: 1 in contact;
A substance bound to the first antibody; a secondantibody recognizing positions 1 to 671 of SEQ ID NO: 1; and / or a third antibody recognizing positions 688 to 711 of SEQ ID NO: 1. And incubating with, and
Detecting or measuring the binding between the second antibody and / or the third antibody and the substance;
[14] The method according to [13] above, wherein the second antibody and the third antibody are labeled so as to be distinguishable from each other; and [15] a test kit for Alzheimer's disease,
A first antibody that recognizespositions 672 to 687 of SEQ ID NO: 1;
A second antibody that recognizespositions 1 to 671 of SEQ ID NO: 1 and / or a third antibody that recognizes positions 688 to 711 of SEQ ID NO: 1.
About.
即ち、本発明は、
〔１〕共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料において、少なくとも一方の物質を検出又は測定する方法であって、
前記試料と、共通部位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一の抗体に結合した物質と、一方の物質の非共通部位を認識する第二の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一及び／又は第二の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む方法；
〔２〕前記第一の抗体と、前記第二の抗体が、互いに識別可能に標識されている、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記第一の抗体が固相担体に固定されており、
さらに、前記第一の抗体と結合した物質と、前記第一の抗体とは異なる共通部位を認識する第三の抗体と、を接触させてインキュベートする工程を含み、
前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されており、前記第一、第二及び／又は第三の抗体と前記物質との結合の検出又は測定を、該標識を検出又は測定することによって行う、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記第一の抗体が固相担体に固定されており、
さらに、前記第一の抗体と結合した物質と、前記第二の抗体とは異なる非共通部位を認識する第三の抗体と、を接触させてインキュベートする工程を含み、
前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されており、
前記第一、第二及び／又は第三の抗体と前記物質との結合の検出又は測定を、該標識を検出又は測定することによって行う、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔５〕前記２種の物質は、タンパク質がプロセシング及び／又はシェディングによって生じた断片である、上記〔１〕から〔４〕のいずれか１項に記載の方法；
〔６〕各抗体の認識部位が、前記断片の末端ではない、上記〔５〕に記載の方法；
〔７〕共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料において、少なくとも一方の物質を検出又は測定するためのキットであって、
共通部位を認識する第一の抗体と、一方の物質の非共通部位を認識する第二の抗体と、を含むキット；
〔８〕前記第一と第二の抗体は、それぞれ異なる色で蛍光標識されている、上記〔７〕に記載のキット；
〔９〕さらに、前記第一の抗体とは異なる共通部位を認識する第三の抗体を含む、上記〔７〕又は〔８〕に記載のキット；
〔１０〕さらに、前記第二の抗体とは異なる非共通部位を認識する第三の抗体を含む、上記〔７〕又は〔８〕に記載のキット；
〔１１〕前記第二と第三の抗体は、それぞれ異なる色で蛍光標識されている、上記〔９〕又は〔１０〕に記載のキット；
〔１２〕前記２種の物質は、タンパク質がプロセシング及び／又はシェディングによって生じた断片である、上記〔７〕から〔１１〕のいずれか１項に記載のキット；
〔１３〕アルツハイマー病の検査方法であって、
被検者に由来する試料と、配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一の抗体に結合した物質と、配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体とを接触させてインキュベートする工程と、
前記第二の抗体及び／又は第三の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む方；
〔１４〕前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されている、上記〔１３〕に記載の方法；及び
〔１５〕アルツハイマー病の検査用キットであって、
配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、
配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体と、を含むキット、
に関する。 As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have found that two types of fragments generated by shedding and processing of membrane proteins include a first antibody against a site that these fragments have in common, A second antibody recognizing a non-common site in one fragment and / or a third antibody recognizing a common site different from the first antibody or a non-common site different from the second antibody, and By detecting the binding between the antibody and the fragment, it was found that each of the processing fragments can be detected easily and with high sensitivity, and various applications thereof were studied, thereby completing the present invention.
That is, the present invention
[1] A method for detecting or measuring at least one substance in a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part,
Contacting the sample with a first antibody that recognizes a common site and incubating;
Incubating the substance bound to the first antibody and the second antibody recognizing a non-common site of one substance in contact with each other;
Detecting or measuring the binding between the first and / or second antibody and the substance;
[2] The method according to [1] above, wherein the first antibody and the second antibody are labeled so as to be distinguishable from each other;
[3] The first antibody is immobilized on a solid support,
And a step of contacting and incubating the substance bound to the first antibody and a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody,
The second antibody and the third antibody are labeled so as to be distinguishable from each other, and the detection or measurement of the binding between the first, second and / or third antibody and the substance is detected by the label. The method according to [1] or [2], wherein the method is performed by detecting or measuring
[4] The first antibody is immobilized on a solid support,
And a step of contacting and incubating the substance bound to the first antibody and a third antibody that recognizes a non-common site different from the second antibody,
The second antibody and the third antibody are labelably distinguishable from each other;
The method according to [1] or [2] above, wherein the detection or measurement of the binding between the first, second and / or third antibody and the substance is performed by detecting or measuring the label;
[5] The method according to any one of [1] to [4] above, wherein the two substances are fragments generated by processing and / or shedding of proteins;
[6] The method according to [5] above, wherein the recognition site of each antibody is not the end of the fragment;
[7] A kit for detecting or measuring at least one substance in a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part,
A kit comprising: a first antibody that recognizes a common site; and a second antibody that recognizes a non-common site of one substance;
[8] The kit according to [7] above, wherein the first and second antibodies are fluorescently labeled with different colors, respectively.
[9] The kit according to [7] or [8] above, further comprising a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody;
[10] The kit according to [7] or [8] above, further comprising a third antibody that recognizes a non-common site different from the second antibody;
[11] The kit according to [9] or [10], wherein the second and third antibodies are fluorescently labeled with different colors, respectively.
[12] The kit according to any one of [7] to [11], wherein the two kinds of substances are fragments generated by processing and / or shedding of proteins;
[13] A test method for Alzheimer's disease,
Incubating a sample derived from the subject and a first antibody that recognizes
A substance bound to the first antibody; a second
Detecting or measuring the binding between the second antibody and / or the third antibody and the substance;
[14] The method according to [13] above, wherein the second antibody and the third antibody are labeled so as to be distinguishable from each other; and [15] a test kit for Alzheimer's disease,
A first antibody that recognizes
A second antibody that recognizes
About.
本発明によれば、共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料から、少なくとも一方の物質を、簡便且つ高感度に検出又は測定することができる。
特に本発明の方法を、プロセシング断片の検出に用いる場合、ペプチド末端を認識するネオエピトープ抗体を用いる必要がないので、作りやすい抗体を用いることができ、エンドペプチダーゼによる消化の影響も受けない。また、第一の抗体を固相担体に固定しておくことにより、微量の断片を高感度に検出することが可能である。
本発明の方法によれば、プロセシングやシェディングの有無や異常を検出して、診断や治療の奏功の判断を行うことが可能である。 According to the present invention, at least one substance can be detected or measured easily and with high sensitivity from a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part.
In particular, when the method of the present invention is used for detection of a processing fragment, it is not necessary to use a neoepitope antibody that recognizes a peptide end, so that an easy-to-make antibody can be used and is not affected by digestion with endopeptidase. Further, by immobilizing the first antibody on a solid phase carrier, it is possible to detect a minute amount of fragments with high sensitivity.
According to the method of the present invention, it is possible to determine the success of diagnosis or treatment by detecting the presence or absence or abnormality of processing or shedding.
特に本発明の方法を、プロセシング断片の検出に用いる場合、ペプチド末端を認識するネオエピトープ抗体を用いる必要がないので、作りやすい抗体を用いることができ、エンドペプチダーゼによる消化の影響も受けない。また、第一の抗体を固相担体に固定しておくことにより、微量の断片を高感度に検出することが可能である。
本発明の方法によれば、プロセシングやシェディングの有無や異常を検出して、診断や治療の奏功の判断を行うことが可能である。 According to the present invention, at least one substance can be detected or measured easily and with high sensitivity from a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part.
In particular, when the method of the present invention is used for detection of a processing fragment, it is not necessary to use a neoepitope antibody that recognizes a peptide end, so that an easy-to-make antibody can be used and is not affected by digestion with endopeptidase. Further, by immobilizing the first antibody on a solid phase carrier, it is possible to detect a minute amount of fragments with high sensitivity.
According to the method of the present invention, it is possible to determine the success of diagnosis or treatment by detecting the presence or absence or abnormality of processing or shedding.
（検出又は測定方法）
本発明に係る検出又は測定方法の一態様は、同一試料に含まれる２種の物質を検出又は測定するものである。
本明細書において、検出又は測定の対象となる２種の物質は、エピトープとなりうる共通部位と非共通部位とを有するものである限り特に限定されず、ペプチドや核酸などが挙げられるが、典型的にはぺプチドである。特に、同一のタンパク質から、プロセシングやシェディングによって生じた２以上の断片が挙げられる。 (Detection or measurement method)
One aspect of the detection or measurement method according to the present invention is to detect or measure two kinds of substances contained in the same sample.
In the present specification, the two types of substances to be detected or measured are not particularly limited as long as they have a common site and a non-common site that can be epitopes, and examples thereof include peptides and nucleic acids. Is a peptide. In particular, two or more fragments generated from the same protein by processing or shedding can be mentioned.
本発明に係る検出又は測定方法の一態様は、同一試料に含まれる２種の物質を検出又は測定するものである。
本明細書において、検出又は測定の対象となる２種の物質は、エピトープとなりうる共通部位と非共通部位とを有するものである限り特に限定されず、ペプチドや核酸などが挙げられるが、典型的にはぺプチドである。特に、同一のタンパク質から、プロセシングやシェディングによって生じた２以上の断片が挙げられる。 (Detection or measurement method)
One aspect of the detection or measurement method according to the present invention is to detect or measure two kinds of substances contained in the same sample.
In the present specification, the two types of substances to be detected or measured are not particularly limited as long as they have a common site and a non-common site that can be epitopes, and examples thereof include peptides and nucleic acids. Is a peptide. In particular, two or more fragments generated from the same protein by processing or shedding can be mentioned.
例えば、プロセシングの異常やプロセシングによって生じる断片が発症に関与する疾患として、アルツハイマー病が挙げられる。アルツハイマー病は、アミロイド前駆体タンパク質（Amyloid Precursor Protein; ＡＰＰ）のプロセシングによって生じるアミロイドβタンパク質（Ａβ）が脳内に蓄積して老人斑を形成し、老人斑が神経細胞を死滅させることによって発症すると考えられている。
Ｉ型膜貫通タンパク質であるＡＰＰのプロセシングには、Ａβ産生経路と非Ａβ産生経路がある。図１に示されるとおり、Ａβ産生経路では、ＡＰＰがβセクレターゼとγセクレターゼによって切断され、ｓＡＰＰβとＡβとを生じる。一方、非Ａβ産生経路では、ＡＰＰがαセクレターゼとγセクレターゼによって切断され、ｓＡＰＰαとＰ３と呼ばれるフラグメントを生じる。
アルツハイマー病の予防や治療のためにはセクレターゼ制御が重要な課題となっており、βセクレターゼやγセクレターゼを阻害してＡβ産生を抑制する研究が行われている。したがって、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβ、Ａβ、Ｐ３等の断片を検出することができれば、治療薬候補の評価等に用いることが可能である。
また、Ａβにはアミノ酸４０残基で構成されるＡβ４０と、アミノ酸４２残基で構成されるＡβ４２が存在するが、このうちＡβ４２が脳内でアミロイド凝集の核となり、アルツハイマー病の発症の引き金となりうる分子である。したがって、特にＡβ４２を検出することができれば、治療薬候補の評価等に一層有用であると考えられる。
さらに、被検者の血清や脳脊髄液中のＡβとｓＡＰＰをそれぞれ検出することができれば、アルツハイマー病の罹患の有無や罹患可能性の評価に用いることも可能である。 For example, Alzheimer's disease is mentioned as a disease in which abnormalities in processing and fragments generated by processing are involved in the onset. Alzheimer's disease occurs when amyloid β protein (Aβ) produced by processing of amyloid precursor protein (APP) accumulates in the brain to form senile plaques, and senile plaques develop by killing nerve cells. It is considered.
Processing of APP, which is a type I transmembrane protein, has an Aβ production pathway and a non-Aβ production pathway. As shown in FIG. 1, in the Aβ production pathway, APP is cleaved by β secretase and γ secretase to produce sAPPβ and Aβ. On the other hand, in the non-Aβ production pathway, APP is cleaved by α-secretase and γ-secretase, resulting in fragments called sAPPα and P3.
Control of secretase has become an important issue for the prevention and treatment of Alzheimer's disease, and studies have been conducted to inhibit Aβ production by inhibiting β-secretase and γ-secretase. Therefore, if fragments such as sAPPα, sAPPβ, Aβ, and P3 can be detected, they can be used for evaluation of therapeutic drug candidates.
Aβ also includes Aβ40, which consists of 40 amino acids, and Aβ42, which consists of 42 amino acids. Among them, Aβ42 serves as the nucleus of amyloid aggregation in the brain and triggers the onset of Alzheimer's disease. Molecule. Therefore, if Aβ42 can be detected in particular, it is considered more useful for evaluation of therapeutic drug candidates.
Furthermore, if Aβ and sAPP in the serum and cerebrospinal fluid of a subject can be detected, it can be used for the evaluation of the presence or absence of Alzheimer's disease.
Ｉ型膜貫通タンパク質であるＡＰＰのプロセシングには、Ａβ産生経路と非Ａβ産生経路がある。図１に示されるとおり、Ａβ産生経路では、ＡＰＰがβセクレターゼとγセクレターゼによって切断され、ｓＡＰＰβとＡβとを生じる。一方、非Ａβ産生経路では、ＡＰＰがαセクレターゼとγセクレターゼによって切断され、ｓＡＰＰαとＰ３と呼ばれるフラグメントを生じる。
アルツハイマー病の予防や治療のためにはセクレターゼ制御が重要な課題となっており、βセクレターゼやγセクレターゼを阻害してＡβ産生を抑制する研究が行われている。したがって、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβ、Ａβ、Ｐ３等の断片を検出することができれば、治療薬候補の評価等に用いることが可能である。
また、Ａβにはアミノ酸４０残基で構成されるＡβ４０と、アミノ酸４２残基で構成されるＡβ４２が存在するが、このうちＡβ４２が脳内でアミロイド凝集の核となり、アルツハイマー病の発症の引き金となりうる分子である。したがって、特にＡβ４２を検出することができれば、治療薬候補の評価等に一層有用であると考えられる。
さらに、被検者の血清や脳脊髄液中のＡβとｓＡＰＰをそれぞれ検出することができれば、アルツハイマー病の罹患の有無や罹患可能性の評価に用いることも可能である。 For example, Alzheimer's disease is mentioned as a disease in which abnormalities in processing and fragments generated by processing are involved in the onset. Alzheimer's disease occurs when amyloid β protein (Aβ) produced by processing of amyloid precursor protein (APP) accumulates in the brain to form senile plaques, and senile plaques develop by killing nerve cells. It is considered.
Processing of APP, which is a type I transmembrane protein, has an Aβ production pathway and a non-Aβ production pathway. As shown in FIG. 1, in the Aβ production pathway, APP is cleaved by β secretase and γ secretase to produce sAPPβ and Aβ. On the other hand, in the non-Aβ production pathway, APP is cleaved by α-secretase and γ-secretase, resulting in fragments called sAPPα and P3.
Control of secretase has become an important issue for the prevention and treatment of Alzheimer's disease, and studies have been conducted to inhibit Aβ production by inhibiting β-secretase and γ-secretase. Therefore, if fragments such as sAPPα, sAPPβ, Aβ, and P3 can be detected, they can be used for evaluation of therapeutic drug candidates.
Aβ also includes Aβ40, which consists of 40 amino acids, and Aβ42, which consists of 42 amino acids. Among them, Aβ42 serves as the nucleus of amyloid aggregation in the brain and triggers the onset of Alzheimer's disease. Molecule. Therefore, if Aβ42 can be detected in particular, it is considered more useful for evaluation of therapeutic drug candidates.
Furthermore, if Aβ and sAPP in the serum and cerebrospinal fluid of a subject can be detected, it can be used for the evaluation of the presence or absence of Alzheimer's disease.
本明細書において、２種の物質が「共通部位を有する」とは、２種の物質が同一の抗体によって認識されるエピトープを有する状態を意味する。エピトープとなりうる共通部位は、上記物質がペプチドである場合、アミノ酸配列のみが同一な部位であってもよいし、糖鎖や脂質による修飾、リン酸化の有無などまで含めて同一な部位であってもよい。
本明細書において、２種の物質が「非共通部位を有する」とは、２種の物質が、それぞれ異なる抗体によって認識されるエピトープを有する状態を意味する。エピトープとなりうる非共通部位としては、上記物質がペプチドである場合、アミノ酸配列が異なる部位や、アミノ酸配列は同一でも糖質や脂質による修飾が異なる部位、アミノ酸配列は同一でもリン酸化の有無が異なる部位などがあり得る。
このように、本発明に係る方法は、２種の物質がペプチドの場合、共通配列と非共通配列を有する２種の物質；二つの共通配列を有し、そのうち一つの配列における糖鎖修飾が異なる２種の物質；二つの共通配列を有し、そのうち一つの配列における脂質による修飾が異なる２種の物質；二つの共通配列を有し、そのうち一つの配列におけるリン酸化の有無が異なる物質などの検出又は測定することが可能である。 In the present specification, the phrase “two substances have a common site” means a state in which the two substances have an epitope recognized by the same antibody. When the substance is a peptide, the common site that can be an epitope may be the same site only in the amino acid sequence, or it may be the same site including the modification with sugar chains and lipids, the presence or absence of phosphorylation, etc. Also good.
In the present specification, “the two substances have a non-common site” means a state in which the two substances have epitopes recognized by different antibodies. Non-common sites that can be epitopes include, when the substance is a peptide, sites with different amino acid sequences, sites with the same amino acid sequence but different modifications with carbohydrates and lipids, and the same amino acid sequence, but different phosphorylation status There may be a site.
As described above, when the two substances are peptides, the method according to the present invention has two substances having a common sequence and a non-common sequence; two common sequences; Two different substances; two substances that have two common sequences, one of which is different in lipid modification; one that has two common sequences, and one of which differs in the presence or absence of phosphorylation, etc. Can be detected or measured.
本明細書において、２種の物質が「非共通部位を有する」とは、２種の物質が、それぞれ異なる抗体によって認識されるエピトープを有する状態を意味する。エピトープとなりうる非共通部位としては、上記物質がペプチドである場合、アミノ酸配列が異なる部位や、アミノ酸配列は同一でも糖質や脂質による修飾が異なる部位、アミノ酸配列は同一でもリン酸化の有無が異なる部位などがあり得る。
このように、本発明に係る方法は、２種の物質がペプチドの場合、共通配列と非共通配列を有する２種の物質；二つの共通配列を有し、そのうち一つの配列における糖鎖修飾が異なる２種の物質；二つの共通配列を有し、そのうち一つの配列における脂質による修飾が異なる２種の物質；二つの共通配列を有し、そのうち一つの配列におけるリン酸化の有無が異なる物質などの検出又は測定することが可能である。 In the present specification, the phrase “two substances have a common site” means a state in which the two substances have an epitope recognized by the same antibody. When the substance is a peptide, the common site that can be an epitope may be the same site only in the amino acid sequence, or it may be the same site including the modification with sugar chains and lipids, the presence or absence of phosphorylation, etc. Also good.
In the present specification, “the two substances have a non-common site” means a state in which the two substances have epitopes recognized by different antibodies. Non-common sites that can be epitopes include, when the substance is a peptide, sites with different amino acid sequences, sites with the same amino acid sequence but different modifications with carbohydrates and lipids, and the same amino acid sequence, but different phosphorylation status There may be a site.
As described above, when the two substances are peptides, the method according to the present invention has two substances having a common sequence and a non-common sequence; two common sequences; Two different substances; two substances that have two common sequences, one of which is different in lipid modification; one that has two common sequences, and one of which differs in the presence or absence of phosphorylation, etc. Can be detected or measured.
本発明に係る方法は、２種の物質のそれぞれを検出又は測定する方法であり、２種の物質のそれぞれの有無のみを調べるために用いてもよいし、それぞれの量を測定するために用いてもよく、また２種の物質の量の比を求めるために用いてもよい。また、本発明に係る方法は、試料中の３種以上の物質のそれぞれを検出又は測定するために応用することもできる。
The method according to the present invention is a method for detecting or measuring each of two kinds of substances, and may be used for examining only the presence or absence of each of the two kinds of substances, or for measuring the respective amounts. Or may be used to determine the ratio of the amounts of the two substances. The method according to the present invention can also be applied to detect or measure each of three or more substances in a sample.
本発明に係る方法では、まず、２種の物質を含む試料と、共通部位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする。
本明細書において「試料」は、検出又は測定する物質を含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例えば、ヒトや動物に由来する血液、尿、髄液、穿刺液、組織、血清、脳脊髄液などを挙げることができる。これらの試料は、第一の抗体と接触させる工程に先立って、適宜緩衝液等で希釈してもよいし、薬物等による処理を加えてもよい。 In the method according to the present invention, first, a sample containing two kinds of substances and a first antibody that recognizes a common site are brought into contact with each other and incubated.
In the present specification, the “sample” is not particularly limited as long as it may contain a substance to be detected or measured. For example, blood, urine, spinal fluid, puncture fluid, tissue, serum derived from humans or animals And cerebrospinal fluid. These samples may be appropriately diluted with a buffer solution or the like, or may be subjected to treatment with a drug or the like prior to the step of contacting with the first antibody.
本明細書において「試料」は、検出又は測定する物質を含む可能性があるものであれば特に限定されないが、例えば、ヒトや動物に由来する血液、尿、髄液、穿刺液、組織、血清、脳脊髄液などを挙げることができる。これらの試料は、第一の抗体と接触させる工程に先立って、適宜緩衝液等で希釈してもよいし、薬物等による処理を加えてもよい。 In the method according to the present invention, first, a sample containing two kinds of substances and a first antibody that recognizes a common site are brought into contact with each other and incubated.
In the present specification, the “sample” is not particularly limited as long as it may contain a substance to be detected or measured. For example, blood, urine, spinal fluid, puncture fluid, tissue, serum derived from humans or animals And cerebrospinal fluid. These samples may be appropriately diluted with a buffer solution or the like, or may be subjected to treatment with a drug or the like prior to the step of contacting with the first antibody.
試料と第一の抗体を接触させてインキュベートする工程は、公知の方法にしたがって行うことができる。インキュベーションの時間や温度などの条件は、当業者が適宜決定することができる。
この工程により、２種の物質の双方に第一の抗体が結合する。 The step of bringing the sample into contact with the first antibody and incubating can be performed according to a known method. Conditions such as incubation time and temperature can be appropriately determined by those skilled in the art.
By this step, the first antibody binds to both of the two substances.
この工程により、２種の物質の双方に第一の抗体が結合する。 The step of bringing the sample into contact with the first antibody and incubating can be performed according to a known method. Conditions such as incubation time and temperature can be appropriately determined by those skilled in the art.
By this step, the first antibody binds to both of the two substances.
続いて、第一の抗体に結合した物質と、一方の物質にのみ存在する非共通部位を認識する第二の抗体とを接触させてインキュベートする。この工程も公知の方法にしたがって行うことができ、条件は当業者が適宜決定することが可能である。
この工程により、第一の抗体に結合した物質のうち、第二の抗体が認識する非共通部位を有する物質にのみ第二の抗体が結合する。 Subsequently, the substance bound to the first antibody and the second antibody that recognizes a non-common site existing only in one substance are brought into contact with each other and incubated. This step can also be performed according to a known method, and conditions can be appropriately determined by those skilled in the art.
By this step, the second antibody binds only to a substance having a non-common site recognized by the second antibody among substances bound to the first antibody.
この工程により、第一の抗体に結合した物質のうち、第二の抗体が認識する非共通部位を有する物質にのみ第二の抗体が結合する。 Subsequently, the substance bound to the first antibody and the second antibody that recognizes a non-common site existing only in one substance are brought into contact with each other and incubated. This step can also be performed according to a known method, and conditions can be appropriately determined by those skilled in the art.
By this step, the second antibody binds only to a substance having a non-common site recognized by the second antibody among substances bound to the first antibody.
次に、第一の抗体及び／又は第二の抗体と前記物質の結合を検出又は測定する。抗体と物質の結合は、公知の種々の方法に従って検出又は測定することができる。これまでの工程により、２種の物質の一方には第一の抗体と第二の抗体が結合し、一方には第一の抗体のみが結合している。したがって、例えば、第一の抗体と第二の抗体を互いに識別可能に標識しておくことにより、第一及び第二の抗体が結合している物質と、第一の抗体のみが結合している物質を検出又は測定できる。
Next, the binding between the first antibody and / or the second antibody and the substance is detected or measured. The binding between the antibody and the substance can be detected or measured according to various known methods. By the steps so far, the first antibody and the second antibody are bound to one of the two substances, and only the first antibody is bound to one. Therefore, for example, by labeling the first antibody and the second antibody so that they can be distinguished from each other, only the first antibody is bound to the substance to which the first and second antibodies are bound. A substance can be detected or measured.
抗体の標識方法としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ、3Ｈ等の放射性物質、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子などを用いる方法が挙げられるがこれらに限定されない。抗体の標識は公知の方法にしたがって行うことができる。また、抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出してもよい。
例えば、第一の抗体を赤色の蛍光物質で標識し、第二の抗体を緑色の蛍光物質で標識すれば、第一の抗体と第二の抗体の双方が結合している物質は黄色となり、第一の抗体のみ結合している物質は赤となり、両者を識別し、検出又は測定することが可能である。 Antibody labeling methods include enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase, radioactive materials such as 125 I, 131 I, 35 S, and 3 H, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, near red Examples include, but are not limited to, methods using fluorescent materials such as outer fluorescent materials, luminescent materials such as luciferase, luciferin, and aequorin, gold colloids, nanoparticles such as quantum dots, and the like. The labeling of the antibody can be performed according to a known method. Alternatively, the antibody may be labeled with biotin and detected by binding avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like.
For example, if the first antibody is labeled with a red fluorescent substance and the second antibody is labeled with a green fluorescent substance, the substance to which both the first antibody and the second antibody are bound is yellow, A substance bound only to the first antibody is red, and both can be identified and detected or measured.
例えば、第一の抗体を赤色の蛍光物質で標識し、第二の抗体を緑色の蛍光物質で標識すれば、第一の抗体と第二の抗体の双方が結合している物質は黄色となり、第一の抗体のみ結合している物質は赤となり、両者を識別し、検出又は測定することが可能である。 Antibody labeling methods include enzymes such as peroxidase and alkaline phosphatase, radioactive materials such as 125 I, 131 I, 35 S, and 3 H, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dansyl chloride, phycoerythrin, tetramethylrhodamine isothiocyanate, near red Examples include, but are not limited to, methods using fluorescent materials such as outer fluorescent materials, luminescent materials such as luciferase, luciferin, and aequorin, gold colloids, nanoparticles such as quantum dots, and the like. The labeling of the antibody can be performed according to a known method. Alternatively, the antibody may be labeled with biotin and detected by binding avidin or streptavidin labeled with an enzyme or the like.
For example, if the first antibody is labeled with a red fluorescent substance and the second antibody is labeled with a green fluorescent substance, the substance to which both the first antibody and the second antibody are bound is yellow, A substance bound only to the first antibody is red, and both can be identified and detected or measured.
本発明に係る方法の一態様では、第一の抗体を固相担体に固定して用いる。これにより、試料と第一の抗体を結合させる工程で、第一の抗体に結合する２つの物質を固相担体表面に濃縮することができるので、物質が微量である場合にも感度良く検出することができる。
本明細書において、「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられ、抗体は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。 In one embodiment of the method according to the present invention, the first antibody is used by being immobilized on a solid phase carrier. As a result, in the step of binding the sample and the first antibody, the two substances that bind to the first antibody can be concentrated on the surface of the solid phase carrier, so that even if the amount of the substance is very small, it is detected with high sensitivity. be able to.
In the present specification, the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier capable of immobilizing an antibody, glass, metallic, resin-made microtiter plates, substrates, beads, nitrocellulose membranes, nylon membranes, A PVDF membrane etc. are mentioned, An antibody can be fix | immobilized to these solid-phase carriers according to a well-known method.
本明細書において、「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられ、抗体は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。 In one embodiment of the method according to the present invention, the first antibody is used by being immobilized on a solid phase carrier. As a result, in the step of binding the sample and the first antibody, the two substances that bind to the first antibody can be concentrated on the surface of the solid phase carrier, so that even if the amount of the substance is very small, it is detected with high sensitivity. be able to.
In the present specification, the “solid phase carrier” is not particularly limited as long as it is a carrier capable of immobilizing an antibody, glass, metallic, resin-made microtiter plates, substrates, beads, nitrocellulose membranes, nylon membranes, A PVDF membrane etc. are mentioned, An antibody can be fix | immobilized to these solid-phase carriers according to a well-known method.
第一の抗体を固相担体に固定する場合、試料と第一の抗体とを接触させる工程は、例えば、マイクロタイタープレートに第一の抗体を固定して、各ウェルに試料を滴下して行ってもよいし、第一の抗体を固定したビーズを試料中に投入して行ってもよい。
この工程により、試料中の２種類の物質の共通部位が第一の抗体に結合し、固相表面に捕捉される。この後、固相表面を洗浄する工程（例えば、固相担体としてマイクロタイタープレートを用いる場合）や、固相担体を回収する工程（例えば、固相担体としてビーズを用いる場合）を行って、固相担体に捕捉された物質のみを回収してもよい。 When the first antibody is immobilized on the solid phase carrier, the step of bringing the sample and the first antibody into contact is performed, for example, by immobilizing the first antibody on a microtiter plate and dropping the sample in each well. Alternatively, the first antibody-immobilized beads may be introduced into the sample.
By this step, the common site of the two kinds of substances in the sample binds to the first antibody and is captured on the solid surface. Thereafter, a solid phase surface washing step (for example, when a microtiter plate is used as the solid phase carrier) and a solid phase carrier recovery step (for example, when beads are used as the solid phase carrier) are performed to fix the solid phase surface. Only the substance trapped on the phase carrier may be recovered.
この工程により、試料中の２種類の物質の共通部位が第一の抗体に結合し、固相表面に捕捉される。この後、固相表面を洗浄する工程（例えば、固相担体としてマイクロタイタープレートを用いる場合）や、固相担体を回収する工程（例えば、固相担体としてビーズを用いる場合）を行って、固相担体に捕捉された物質のみを回収してもよい。 When the first antibody is immobilized on the solid phase carrier, the step of bringing the sample and the first antibody into contact is performed, for example, by immobilizing the first antibody on a microtiter plate and dropping the sample in each well. Alternatively, the first antibody-immobilized beads may be introduced into the sample.
By this step, the common site of the two kinds of substances in the sample binds to the first antibody and is captured on the solid surface. Thereafter, a solid phase surface washing step (for example, when a microtiter plate is used as the solid phase carrier) and a solid phase carrier recovery step (for example, when beads are used as the solid phase carrier) are performed to fix the solid phase surface. Only the substance trapped on the phase carrier may be recovered.
第一の抗体が固相担体に固定されている場合、第一の抗体に結合した物質と、第二の抗体とを接触させてインキュベートする工程は、第二の抗体と固相担体表面とを接触させてインキュベートすることにより行うことができる。
When the first antibody is immobilized on a solid phase carrier, the step of bringing the substance bound to the first antibody into contact with the second antibody and incubating the second antibody and the solid phase carrier surface It can be performed by contacting and incubating.
この実施態様では、２種の物質を検出又は測定するために、第三の抗体を用いる。第三の抗体は、２種の物質における第一の抗体とは異なる共通部位を認識し、且つ、第二の抗体と識別可能に標識されている。
第一の抗体で、２種の物質を固相担体表面に捕捉し、第二の抗体で非共通部位を、第三の抗体で共通部位を標識することにより、非共通部位を有するものと、共通部位のみ有するもの２つの物質を検出・測定することができる。すなわち、第二の抗体で標識される分子数は非共通部位を有する分子数を表し、第三の抗体で標識される分子数から第二の抗体で標識される分子数を引くと、共通部位のみ有する分子の数を求めることができる（例えば、図２参照）。 In this embodiment, a third antibody is used to detect or measure two substances. The third antibody recognizes a common site different from the first antibody in the two substances and is labeled so as to be distinguishable from the second antibody.
The first antibody captures two kinds of substances on the surface of the solid phase carrier, the non-common site is labeled with the second antibody, and the common site is labeled with the third antibody. Two substances having only a common site can be detected and measured. That is, the number of molecules labeled with the second antibody represents the number of molecules having non-common sites, and the number of molecules labeled with the second antibody is subtracted from the number of molecules labeled with the third antibody. It is possible to determine the number of molecules having only (see FIG. 2 for example).
第一の抗体で、２種の物質を固相担体表面に捕捉し、第二の抗体で非共通部位を、第三の抗体で共通部位を標識することにより、非共通部位を有するものと、共通部位のみ有するもの２つの物質を検出・測定することができる。すなわち、第二の抗体で標識される分子数は非共通部位を有する分子数を表し、第三の抗体で標識される分子数から第二の抗体で標識される分子数を引くと、共通部位のみ有する分子の数を求めることができる（例えば、図２参照）。 In this embodiment, a third antibody is used to detect or measure two substances. The third antibody recognizes a common site different from the first antibody in the two substances and is labeled so as to be distinguishable from the second antibody.
The first antibody captures two kinds of substances on the surface of the solid phase carrier, the non-common site is labeled with the second antibody, and the common site is labeled with the third antibody. Two substances having only a common site can be detected and measured. That is, the number of molecules labeled with the second antibody represents the number of molecules having non-common sites, and the number of molecules labeled with the second antibody is subtracted from the number of molecules labeled with the third antibody. It is possible to determine the number of molecules having only (see FIG. 2 for example).
また、第三の抗体としては、２つの物質における第二の抗体とは異なる非共通部位を認識し、且つ、第二の抗体と識別可能に標識されているものを用いてもよい。
第一の抗体で、２つの物質を固相担体表面に捕捉し、第二の抗体で非共通部位を、第三の抗体で別の非共通部位を標識することにより、２つの物質を検出・測定することができる（図３参照）。 As the third antibody, one that recognizes a non-common site different from the second antibody in the two substances and is labeled so as to be distinguishable from the second antibody may be used.
Two substances can be detected by capturing two substances on the surface of the solid phase carrier with the first antibody, labeling a non-common part with the second antibody, and labeling another non-common part with the third antibody. Can be measured (see FIG. 3).
第一の抗体で、２つの物質を固相担体表面に捕捉し、第二の抗体で非共通部位を、第三の抗体で別の非共通部位を標識することにより、２つの物質を検出・測定することができる（図３参照）。 As the third antibody, one that recognizes a non-common site different from the second antibody in the two substances and is labeled so as to be distinguishable from the second antibody may be used.
Two substances can be detected by capturing two substances on the surface of the solid phase carrier with the first antibody, labeling a non-common part with the second antibody, and labeling another non-common part with the third antibody. Can be measured (see FIG. 3).
本発明の方法に用いられる「抗体」は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、いずれも公知の方法に従って作製することができる。
例えば、第一の抗体がモノクローナル抗体である場合、まず検出・測定の対象となる２つの物質のうち１つの物質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（リンパ節細胞又は脾臓細胞）を単離する。これをミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどを用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを作製する。続いて、コロニーとなったハイブリドーマが所望の抗体、即ち、２つの物質の共通部位に結合する抗体を分泌しているかどうか、培養上清を用いてスクリーニングを行う。所望の抗体を産生している細胞を限界希釈してクローニングし、さらにスクリーニングを行って、２つの物質の共通部位を認識する第一の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを樹立することができるので、これから精製して第一の抗体を得ることができる。
なお、検出・測定対象の物質がペプチドの場合、スクリーニングの際、当該ペプチドの末端ではない部位を認識する抗体を選択することが望ましい。これにより、エンドペプチダーゼによって検出・測定対象のペプチドの末端が分解されても、対象ペプチドに結合できる抗体を得ることができる。
また、上記方法において、非ヒト哺乳動物を免疫する際、２つの物質の共通部位である断片のみを抗原として用いてもよい。 The “antibody” used in the method of the present invention may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and both can be prepared according to known methods.
For example, when the first antibody is a monoclonal antibody, first, a non-human mammal is immunized using one of two substances to be detected and measured, and antibody-producing cells (lymph node cells) are immunized from the immunized animal. Or spleen cells). This is fused with myeloma cells using polyethylene glycol or the like to produce a hybridoma. Subsequently, screening is performed using the culture supernatant to determine whether the hybridoma that has become a colony secretes a desired antibody, that is, an antibody that binds to the common site of the two substances. The cells producing the desired antibody can be cloned by limiting dilution, and further screening can be performed to establish a hybridoma clone that secretes the first antibody that recognizes the common site of the two substances. The first antibody can be obtained by purification.
When the substance to be detected and measured is a peptide, it is desirable to select an antibody that recognizes a site that is not the terminal of the peptide during screening. Thereby, even if the terminal of the peptide to be detected / measured is degraded by endopeptidase, an antibody capable of binding to the peptide of interest can be obtained.
In the above method, when immunizing a non-human mammal, only a fragment that is a common site of two substances may be used as an antigen.
例えば、第一の抗体がモノクローナル抗体である場合、まず検出・測定の対象となる２つの物質のうち１つの物質を用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（リンパ節細胞又は脾臓細胞）を単離する。これをミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどを用いて細胞融合させ、ハイブリドーマを作製する。続いて、コロニーとなったハイブリドーマが所望の抗体、即ち、２つの物質の共通部位に結合する抗体を分泌しているかどうか、培養上清を用いてスクリーニングを行う。所望の抗体を産生している細胞を限界希釈してクローニングし、さらにスクリーニングを行って、２つの物質の共通部位を認識する第一の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを樹立することができるので、これから精製して第一の抗体を得ることができる。
なお、検出・測定対象の物質がペプチドの場合、スクリーニングの際、当該ペプチドの末端ではない部位を認識する抗体を選択することが望ましい。これにより、エンドペプチダーゼによって検出・測定対象のペプチドの末端が分解されても、対象ペプチドに結合できる抗体を得ることができる。
また、上記方法において、非ヒト哺乳動物を免疫する際、２つの物質の共通部位である断片のみを抗原として用いてもよい。 The “antibody” used in the method of the present invention may be either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and both can be prepared according to known methods.
For example, when the first antibody is a monoclonal antibody, first, a non-human mammal is immunized using one of two substances to be detected and measured, and antibody-producing cells (lymph node cells) are immunized from the immunized animal. Or spleen cells). This is fused with myeloma cells using polyethylene glycol or the like to produce a hybridoma. Subsequently, screening is performed using the culture supernatant to determine whether the hybridoma that has become a colony secretes a desired antibody, that is, an antibody that binds to the common site of the two substances. The cells producing the desired antibody can be cloned by limiting dilution, and further screening can be performed to establish a hybridoma clone that secretes the first antibody that recognizes the common site of the two substances. The first antibody can be obtained by purification.
When the substance to be detected and measured is a peptide, it is desirable to select an antibody that recognizes a site that is not the terminal of the peptide during screening. Thereby, even if the terminal of the peptide to be detected / measured is degraded by endopeptidase, an antibody capable of binding to the peptide of interest can be obtained.
In the above method, when immunizing a non-human mammal, only a fragment that is a common site of two substances may be used as an antigen.
第二の抗体も同様に作製することができる。非ヒト哺乳動物を免疫する際、２つの物質のうち１つの物質を用いて行い、スクリーニングの際、２つの物質の一方にしか結合しないものを選択することにより、第二の抗体を得ることができる。
また、非ヒト哺乳動物を免疫する際、２つの物質の一方にしか存在しない非共通部位からなる断片を抗原として用いてもよい。 The second antibody can be similarly produced. When immunizing a non-human mammal, a second antibody can be obtained by selecting a substance that binds to only one of the two substances during screening. it can.
Moreover, when immunizing a non-human mammal, a fragment consisting of a non-common site that exists only in one of the two substances may be used as an antigen.
また、非ヒト哺乳動物を免疫する際、２つの物質の一方にしか存在しない非共通部位からなる断片を抗原として用いてもよい。 The second antibody can be similarly produced. When immunizing a non-human mammal, a second antibody can be obtained by selecting a substance that binds to only one of the two substances during screening. it can.
Moreover, when immunizing a non-human mammal, a fragment consisting of a non-common site that exists only in one of the two substances may be used as an antigen.
第三の抗体も、第一の抗体と同様に作製することができる。スクリーニングの際、第一の抗体と異なるエピトープを認識し、且つ２つの物質の双方に結合するものを選択すればよい。
The third antibody can be prepared in the same manner as the first antibody. At the time of screening, a substance that recognizes an epitope different from that of the first antibody and binds to both of the two substances may be selected.
抗体はポリクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体の場合は、適宜選択した抗原で非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫動物の血清から得ることができる。
The antibody may be a polyclonal antibody. In the case of a polyclonal antibody, a non-human mammal can be immunized with an appropriately selected antigen and obtained from the serum of the immunized animal.
（検出又は測定用キット）
本発明に係るキットは、エピトープとなりうる共通部位と非共通部位とを有する２の物質を含む試料において、それぞれの物質を検出又は測定するためのものである。
本発明に係る検出又は測定方法で用いられた用語は、キットについても同義で用いられる。 (Detection or measurement kit)
The kit according to the present invention is for detecting or measuring each substance in a sample containing two substances having a common site that can be an epitope and a non-common site.
The terms used in the detection or measurement method according to the present invention are also used synonymously for the kit.
本発明に係るキットは、エピトープとなりうる共通部位と非共通部位とを有する２の物質を含む試料において、それぞれの物質を検出又は測定するためのものである。
本発明に係る検出又は測定方法で用いられた用語は、キットについても同義で用いられる。 (Detection or measurement kit)
The kit according to the present invention is for detecting or measuring each substance in a sample containing two substances having a common site that can be an epitope and a non-common site.
The terms used in the detection or measurement method according to the present invention are also used synonymously for the kit.
本発明に係るキットの一態様は、第一の抗体と第二の抗体を含む。第一の抗体と第二の抗体は、互いに識別可能に標識されていてもよいし、抗体とは別に標識するために必要な試薬がキットに備えられていてもよい。ほかに、本発明に係る検出又は測定方法に必要な、緩衝液や試薬、マイクロタイタープレート、マイクロプレートリーダやビーズなどの固相担体、使用説明書等を備えていてもよい。
One embodiment of the kit according to the present invention includes a first antibody and a second antibody. The first antibody and the second antibody may be labeled so as to be distinguishable from each other, or a reagent necessary for labeling separately from the antibody may be provided in the kit. In addition, a buffer solution, a reagent, a microtiter plate, a solid phase carrier such as a microplate reader and beads, an instruction manual, and the like necessary for the detection or measurement method according to the present invention may be provided.
本発明に係るキットの別の態様は、第一から第三の抗体を含む。各抗体は、互いに識別可能に標識されていてもよいし、抗体とは別に標識するために必要な試薬がキットに備えられていてもよい。ほかに、本発明に係る検出又は測定方法に必要な、緩衝液や試薬、マイクロタイタープレート、マイクロプレートリーダやビーズなどの固相担体、使用説明書等を備えていてもよい。
Another embodiment of the kit according to the present invention includes first to third antibodies. Each antibody may be labeled so as to be distinguishable from each other, or a reagent necessary for labeling separately from the antibody may be provided in the kit. In addition, a buffer solution, a reagent, a microtiter plate, a solid phase carrier such as a microplate reader and beads, an instruction manual, and the like necessary for the detection or measurement method according to the present invention may be provided.
（アルツハイマー病の検査方法）
本発明に係るアルツハイマー病の検査方法は、
被検者に由来する試料と、配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
第一の抗体に結合した物質と、配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体とを接触させてインキュベートする工程と、
第二の抗体及び／又は第三の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む。 (Testing method for Alzheimer's disease)
The method for examining Alzheimer's disease according to the present invention includes:
Incubating a sample derived from the subject and a first antibody that recognizespositions 672 to 687 of SEQ ID NO: 1 in contact;
A substance bound to the first antibody, a secondantibody recognizing positions 1 to 671 of SEQ ID NO: 1, and / or a third antibody recognizing positions 688 to 711 of SEQ ID NO: 1 Incubating with contact, and
Detecting or measuring the binding between the second antibody and / or the third antibody and the substance.
本発明に係るアルツハイマー病の検査方法は、
被検者に由来する試料と、配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
第一の抗体に結合した物質と、配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体とを接触させてインキュベートする工程と、
第二の抗体及び／又は第三の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む。 (Testing method for Alzheimer's disease)
The method for examining Alzheimer's disease according to the present invention includes:
Incubating a sample derived from the subject and a first antibody that recognizes
A substance bound to the first antibody, a second
Detecting or measuring the binding between the second antibody and / or the third antibody and the substance.
本明細書において、被検者に由来する試料とは、被検者から採取された血液、尿、髄液、穿刺液、組織、血清、脳脊髄液とすることができ、特に血清や脳脊髄液が好ましい。試料は、適当な緩衝液で希釈してもよいし、薬物等による処理を加えてもよい。
配列番号：１は、ヒトアミロイドβ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。図１に示されるとおり、αセクレターゼによる正常なシェディングでは、配列番号：１の１位から６８７位までの断片である分泌型ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）が生じる。一方、β及びγセクレターゼにより、６７２位から７１１位までの断片であるＡβ４０や、６７２位から７１３位までの断片であるＡβ４２、６７２位から７１４位間での断片であるＡβ４３等が生じる。
ｓＡＰＰαと、Ａβ４０、４２又は４３とを検出する場合、配列番号：１の６７２位から６８７位が共通部位となり、１位から６７１位と、６８８位から７１１～７１３位が非共通部位となる。 In this specification, the sample derived from the subject can be blood, urine, spinal fluid, puncture fluid, tissue, serum, cerebrospinal fluid collected from the subject, particularly serum or cerebrospinal fluid. Liquid is preferred. The sample may be diluted with an appropriate buffer or may be treated with a drug or the like.
SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of human amyloid β precursor protein. As shown in FIG. 1, normal shedding with α-secretase results in secreted APPα (sAPPα), which is a fragment fromposition 1 to position 687 of SEQ ID NO: 1. On the other hand, by β and γ secretase, Aβ40 which is a fragment from positions 672 to 711, Aβ42 which is a fragment from positions 672 to 713, Aβ43 which is a fragment between positions 672 and 714, and the like are generated.
When detecting sAPPα and Aβ40, 42 or 43,positions 672 to 687 of SEQ ID NO: 1 are common sites, positions 1 to 671, and positions 688 to 711 to 713 are non-common sites.
配列番号：１は、ヒトアミロイドβ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を示す。図１に示されるとおり、αセクレターゼによる正常なシェディングでは、配列番号：１の１位から６８７位までの断片である分泌型ＡＰＰα（ｓＡＰＰα）が生じる。一方、β及びγセクレターゼにより、６７２位から７１１位までの断片であるＡβ４０や、６７２位から７１３位までの断片であるＡβ４２、６７２位から７１４位間での断片であるＡβ４３等が生じる。
ｓＡＰＰαと、Ａβ４０、４２又は４３とを検出する場合、配列番号：１の６７２位から６８７位が共通部位となり、１位から６７１位と、６８８位から７１１～７１３位が非共通部位となる。 In this specification, the sample derived from the subject can be blood, urine, spinal fluid, puncture fluid, tissue, serum, cerebrospinal fluid collected from the subject, particularly serum or cerebrospinal fluid. Liquid is preferred. The sample may be diluted with an appropriate buffer or may be treated with a drug or the like.
SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of human amyloid β precursor protein. As shown in FIG. 1, normal shedding with α-secretase results in secreted APPα (sAPPα), which is a fragment from
When detecting sAPPα and Aβ40, 42 or 43,
そこで、共通部位を認識する抗体を第一の抗体とし、例えば固相に固定して試料と接触させてインキュベートすると、ｓＡＰＰα、Ａβ４０、４２又は４３が固相表面に捕捉される。適宜洗浄した後、配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体を、固相表面に接触させてインキュベートすると、ｓＡＰＰαが存在すれば、これに結合する。また、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体を、固相表面に接触させてインキュベートすると、Ａβ４０、４２又は４３が存在すれば、これに結合する。
Therefore, when the antibody recognizing the common site is used as the first antibody and, for example, immobilized on a solid phase and brought into contact with a sample and incubated, sAPPα, Aβ40, 42 or 43 is captured on the surface of the solid phase. After washing appropriately, when a second antibody that recognizes positions 1 to 671 of SEQ ID NO: 1 is incubated in contact with the solid surface, it binds to sAPPα if present. In addition, when a third antibody that recognizes positions 688 to 711 of SEQ ID NO: 1 is brought into contact with the solid phase surface and incubated, if Aβ40, 42, or 43 is present, it binds thereto.
第二及び第三の抗体とのインキュベートは、同時に行ってもよいし、別々に行ってもよい。第二及び第三の抗体をそれぞれ識別可能に標識しておけば、同一サンプルで、ｓＡＰＰαと、Ａβ４０等の比を簡便に求めることができる。第二、第三の抗体は、それぞれ標識されたものを用いてもよいし、二次抗体を用いて検出してもよい。
ｓＡＰＰαとＡβ４０等の変化を経時的に測定すれば、アルツハイマー病の進行等を評価することが可能であり、また、治療薬や治療法の効果を評価することも可能である。 Incubation with the second and third antibodies may be performed simultaneously or separately. If the second and third antibodies are labeled in a distinguishable manner, the ratio of sAPPα and Aβ40 can be easily determined from the same sample. The second and third antibodies may be labeled, or may be detected using a secondary antibody.
By measuring changes in sAPPα and Aβ40 over time, it is possible to evaluate the progression of Alzheimer's disease and the like, and it is also possible to evaluate the effects of therapeutic agents and treatment methods.
ｓＡＰＰαとＡβ４０等の変化を経時的に測定すれば、アルツハイマー病の進行等を評価することが可能であり、また、治療薬や治療法の効果を評価することも可能である。 Incubation with the second and third antibodies may be performed simultaneously or separately. If the second and third antibodies are labeled in a distinguishable manner, the ratio of sAPPα and Aβ40 can be easily determined from the same sample. The second and third antibodies may be labeled, or may be detected using a secondary antibody.
By measuring changes in sAPPα and Aβ40 over time, it is possible to evaluate the progression of Alzheimer's disease and the like, and it is also possible to evaluate the effects of therapeutic agents and treatment methods.
第一乃至第三の抗体は、市販のものを用いてもよいし、上述した方法で作製してもよい。これらの抗体は、各断片の末端ではない部位を認識するものが好ましい。
The first to third antibodies may be commercially available or may be prepared by the method described above. These antibodies preferably recognize sites that are not at the end of each fragment.
本明細書において、「検査」とは、診断に必要な情報を得るために、被検者から採取した試料を調べることを意味し、本発明の検出方法は、例えば検査会社等で実施され得る。
また、本発明において、「検査」は、アルツハイマー病に罹患しているか否かを確認する検査に加え、アルツハイマー病に罹患しやすいかどうかのリスクを調べること、症状が現れない段階でアルツハイマー病の可能性をスクリーニングすること、アルツハイマー病に罹患していることが明らかになった後で、その進行度、予後、治療効果などを調べることのいずれも含んでいる。
本発明に係る検査方法は、アルツハイマー病の他の検査方法と組み合わせてもよい。 In the present specification, “examination” means examining a sample collected from a subject in order to obtain information necessary for diagnosis, and the detection method of the present invention can be carried out, for example, by an examination company or the like. .
In addition, in the present invention, the “test” is a test for confirming whether or not Alzheimer's disease is caused, in addition to a test for confirming whether or not Alzheimer's disease is likely to occur. This includes screening the possibility and examining the degree of progression, prognosis, therapeutic effect, etc. after it has been revealed that the patient has Alzheimer's disease.
The test method according to the present invention may be combined with other test methods for Alzheimer's disease.
また、本発明において、「検査」は、アルツハイマー病に罹患しているか否かを確認する検査に加え、アルツハイマー病に罹患しやすいかどうかのリスクを調べること、症状が現れない段階でアルツハイマー病の可能性をスクリーニングすること、アルツハイマー病に罹患していることが明らかになった後で、その進行度、予後、治療効果などを調べることのいずれも含んでいる。
本発明に係る検査方法は、アルツハイマー病の他の検査方法と組み合わせてもよい。 In the present specification, “examination” means examining a sample collected from a subject in order to obtain information necessary for diagnosis, and the detection method of the present invention can be carried out, for example, by an examination company or the like. .
In addition, in the present invention, the “test” is a test for confirming whether or not Alzheimer's disease is caused, in addition to a test for confirming whether or not Alzheimer's disease is likely to occur. This includes screening the possibility and examining the degree of progression, prognosis, therapeutic effect, etc. after it has been revealed that the patient has Alzheimer's disease.
The test method according to the present invention may be combined with other test methods for Alzheimer's disease.
また本発明は、上記アルツハイマー病の検査方法を実施することを含むアルツハイマー病の診断方法も包含する。
The present invention also includes a method for diagnosing Alzheimer's disease, including performing the above-described method for testing Alzheimer's disease.
（アルツハイマー病の検査用キット）
本発明に係るアルツハイマー病の検査用キットは、上記アルツハイマー病の検査方法に用いられる第一の抗体と、第二の抗体及び／又は第三の抗体とを含む。第二の抗体と第三の抗体の双方を備えていることが好ましい。
本発明に係るアルツハイマー病の検査用キットでは、各抗体は、互いに識別可能に標識されていてもよいし、抗体とは別に標識するために必要な試薬がキットに備えられていてもよい。捕捉用の第一の抗体は標識されていなくてもよい。また、第二又は第三の抗体は標識されておらず、これらを検出するための標識された二次抗体が備えられていてもよい。
ほかに、本発明に係る検出又は測定方法に必要な、緩衝液や試薬、マイクロタイタープレート、マイクロプレートリーダやビーズなどの固相担体、使用説明書等が備えられていてもよい。 (Test kit for Alzheimer's disease)
The test kit for Alzheimer's disease according to the present invention includes a first antibody, a second antibody, and / or a third antibody used in the Alzheimer's disease test method. It is preferable to have both the second antibody and the third antibody.
In the test kit for Alzheimer's disease according to the present invention, each antibody may be labeled so as to be distinguishable from each other, or a reagent necessary for labeling separately from the antibody may be provided in the kit. The first antibody for capture may not be labeled. The second or third antibody is not labeled, and a labeled secondary antibody for detecting them may be provided.
In addition, a buffer solution, a reagent, a microtiter plate, a solid phase carrier such as a microplate reader and beads, instructions for use, and the like necessary for the detection or measurement method according to the present invention may be provided.
本発明に係るアルツハイマー病の検査用キットは、上記アルツハイマー病の検査方法に用いられる第一の抗体と、第二の抗体及び／又は第三の抗体とを含む。第二の抗体と第三の抗体の双方を備えていることが好ましい。
本発明に係るアルツハイマー病の検査用キットでは、各抗体は、互いに識別可能に標識されていてもよいし、抗体とは別に標識するために必要な試薬がキットに備えられていてもよい。捕捉用の第一の抗体は標識されていなくてもよい。また、第二又は第三の抗体は標識されておらず、これらを検出するための標識された二次抗体が備えられていてもよい。
ほかに、本発明に係る検出又は測定方法に必要な、緩衝液や試薬、マイクロタイタープレート、マイクロプレートリーダやビーズなどの固相担体、使用説明書等が備えられていてもよい。 (Test kit for Alzheimer's disease)
The test kit for Alzheimer's disease according to the present invention includes a first antibody, a second antibody, and / or a third antibody used in the Alzheimer's disease test method. It is preferable to have both the second antibody and the third antibody.
In the test kit for Alzheimer's disease according to the present invention, each antibody may be labeled so as to be distinguishable from each other, or a reagent necessary for labeling separately from the antibody may be provided in the kit. The first antibody for capture may not be labeled. The second or third antibody is not labeled, and a labeled secondary antibody for detecting them may be provided.
In addition, a buffer solution, a reagent, a microtiter plate, a solid phase carrier such as a microplate reader and beads, instructions for use, and the like necessary for the detection or measurement method according to the present invention may be provided.
本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。
The disclosures of all patent documents and non-patent documents cited in this specification are incorporated herein by reference in their entirety.
（実施態様１）
ＡＰＰのプロセシングプロダクトを検出する方法を例にとって本発明の実施態様を説明する。
上述のとおり、ＡＰＰは、Ａβ産生経路と非Ａβ産生経路によってプロセシングを受け、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβ、Ａβ、Ｐ３が生じる。したがって、例えば、ｓＡＰＰαとｓＡＰＰβを本発明にいう「２つの物質」とすれば、それぞれの産生経路によるプロセシングを定量的に評価することができる。この態様を図２に示す。
図２の方法では、共通部位認識する第一の抗体、非共通部位を認識する第二の抗体、第一の抗体とは別の共通部位を認識する第三の抗体を用いる。第二、第三の抗体は、例えば、それぞれ赤と緑の蛍光物質で標識しておく。 (Embodiment 1)
The embodiment of the present invention will be described by taking a method of detecting an APP processing product as an example.
As described above, APP is processed by the Aβ production pathway and the non-Aβ production pathway to produce sAPPα, sAPPβ, Aβ, and P3. Therefore, for example, if sAPPα and sAPPβ are the “two substances” referred to in the present invention, the processing by each production pathway can be quantitatively evaluated. This embodiment is shown in FIG.
In the method of FIG. 2, a first antibody that recognizes a common site, a second antibody that recognizes a non-common site, and a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody are used. For example, the second and third antibodies are labeled with red and green fluorescent substances, respectively.
ＡＰＰのプロセシングプロダクトを検出する方法を例にとって本発明の実施態様を説明する。
上述のとおり、ＡＰＰは、Ａβ産生経路と非Ａβ産生経路によってプロセシングを受け、ｓＡＰＰα、ｓＡＰＰβ、Ａβ、Ｐ３が生じる。したがって、例えば、ｓＡＰＰαとｓＡＰＰβを本発明にいう「２つの物質」とすれば、それぞれの産生経路によるプロセシングを定量的に評価することができる。この態様を図２に示す。
図２の方法では、共通部位認識する第一の抗体、非共通部位を認識する第二の抗体、第一の抗体とは別の共通部位を認識する第三の抗体を用いる。第二、第三の抗体は、例えば、それぞれ赤と緑の蛍光物質で標識しておく。 (Embodiment 1)
The embodiment of the present invention will be described by taking a method of detecting an APP processing product as an example.
As described above, APP is processed by the Aβ production pathway and the non-Aβ production pathway to produce sAPPα, sAPPβ, Aβ, and P3. Therefore, for example, if sAPPα and sAPPβ are the “two substances” referred to in the present invention, the processing by each production pathway can be quantitatively evaluated. This embodiment is shown in FIG.
In the method of FIG. 2, a first antibody that recognizes a common site, a second antibody that recognizes a non-common site, and a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody are used. For example, the second and third antibodies are labeled with red and green fluorescent substances, respectively.
第一の抗体をマイクロタイタープレートに固定し、適宜処理した患者由来の試料をウェルに滴下すると、ｓＡＰＰβとｓＡＰＰαが第一の抗体に捕捉される。いったんマイクロタイタープレートを洗浄し、第二、第三の抗体を加える。抗体を加える順序は特に限定されない。その後、洗浄処理、発色処理等を行って検出すると、ｓＡＰＰαには第二及び第三の抗体が結合しているので、黄色に観察される。一方、ｓＡＰＰβには第三の抗体のみ結合しているので、緑に観察され、これにより双方を定量することが可能である。
When the first antibody is fixed to the microtiter plate and a sample derived from a patient appropriately treated is dropped into the well, sAPPβ and sAPPα are captured by the first antibody. Once the microtiter plate is washed, the second and third antibodies are added. The order in which the antibodies are added is not particularly limited. Thereafter, when detection is performed by washing treatment, color development treatment, and the like, since the second and third antibodies are bound to sAPPα, they are observed in yellow. On the other hand, since only the third antibody is bound to sAPPβ, it is observed in green, and both can be quantified.
また、例えば、ｓＡＰＰαとＡβを本発明にいう「２つの物質」としても、それぞれの産生経路によるプロセシングを定量的に評価することができる。この態様を図３に示す。 図３の方法では、共通部位認識する第一の抗体、非共通部位を認識する第二の抗体、第二の抗体とは別の非共通部位を認識する第三の抗体を用いる。第二、第三の抗体は、例えば、それぞれ赤と緑の蛍光物質で標識しておく。
Also, for example, even when sAPPα and Aβ are “two substances” according to the present invention, the processing by each production pathway can be quantitatively evaluated. This embodiment is shown in FIG. In the method of FIG. 3, a first antibody that recognizes a common site, a second antibody that recognizes a non-common site, and a third antibody that recognizes a non-common site different from the second antibody are used. For example, the second and third antibodies are labeled with red and green fluorescent substances, respectively.
第一の抗体をマイクロタイタープレートに固定し、適宜処理した患者由来の試料をウェルに滴下すると、ｓＡＰＰαとＡβが第一の抗体に捕捉される。いったんマイクロタイタープレートを洗浄し、第二、第三の抗体を加える。抗体を加える順序は特に限定されない。その後、洗浄処理、発色処理等を行って検出すると、ｓＡＰＰαは第二の抗体が結合しているので、赤色に観察される。一方、Ａβには第三の抗体のみ結合しているので、緑に観察される。これにより双方を定量することが可能である。
When the first antibody is immobilized on a microtiter plate and a sample derived from a patient treated appropriately is dropped into a well, sAPPα and Aβ are captured by the first antibody. Once the microtiter plate is washed, the second and third antibodies are added. The order in which the antibodies are added is not particularly limited. Thereafter, when sAPPα is detected by performing washing treatment, color development treatment, etc., the second antibody is bound, and therefore, it is observed in red. On the other hand, since only the third antibody is bound to Aβ, it is observed in green. This makes it possible to quantify both.
図２、図３の方法を、経時的に繰り返すことにより、Ａβ産生経路と非Ａβ産生経路のいずれが優勢かの変化を見ることができるので、疾患の悪化や、治療の効果を評価することも可能である。
By repeating the method of FIG. 2 and FIG. 3 over time, a change in which of the Aβ production pathway and the non-Aβ production pathway is dominant can be seen, so that the disease worsening and the effect of treatment can be evaluated. Is also possible.
以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。
EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated concretely based on an Example, this invention is not limited to this at all. Those skilled in the art can change the present invention into various modes without departing from the meaning of the present invention, and such changes are also included in the scope of the present invention.
図４に本実施例における、ＡＰＰ／Ａβの検出法の概略を示す。アミロイド前駆体タンパク質（配列番号：１）の６７２位から６８７位の領域に特異的に結合する抗体を捕捉用抗体として用い、１位から６７１位の領域に特異的に結合する抗体、及び６８８位から７１３位の領域に特異的に結合する抗体を検出用抗体として用いた。
試料としては、ヒト正常血清に、ｓＡＰＰαとＡβ４０を添加したものを用いた。
用いた材料を下表に示す。
FIG. 4 shows an outline of the APP / Aβ detection method in this example. An antibody that specifically binds to the region from position 672 to position 687 of the amyloid precursor protein (SEQ ID NO: 1) as a capture antibody, and an antibody that specifically binds to the region from position 1 to position 671, and position 688 The antibody specifically binding to the region at position 713 was used as a detection antibody.
As a sample, human normal serum added with sAPPα and Aβ40 was used.
The materials used are shown in the table below.
試料としては、ヒト正常血清に、ｓＡＰＰαとＡβ４０を添加したものを用いた。
用いた材料を下表に示す。
As a sample, human normal serum added with sAPPα and Aβ40 was used.
The materials used are shown in the table below.
実験の手順を下表に示す。
The experimental procedure is shown in the table below.
ヒト正常血清に、様々な濃度のｓＡＰＰαとＡβ４０を添加し、上記実験を行った結果を図５に示す。ＩＢＬ（＃２８０５３）により、ｓＡＰＰαを定量的に検出できた。一方、Ａｂｃａｍ（＃６２６５８）により、Ａβを定量的に検出できた。
FIG. 5 shows the results of the above experiment in which various concentrations of sAPPα and Aβ40 were added to normal human serum. SAPPα could be detected quantitatively by IBL (# 28053). On the other hand, Abcam (# 62658) was able to detect Aβ quantitatively.
図５の結果をもとに、それぞれ横軸に濃度の対数を、縦軸に蛍光強度をとってプロットしたところ、Ａβは１０ｎｇ／ｍｌ以上、ｓＡＰＰαは１００ｎｇ／ｍｌ以上で有意に検出が可能であった。
Based on the results shown in FIG. 5, the logarithm of concentration is plotted on the horizontal axis and the fluorescence intensity is plotted on the vertical axis. Aβ is 10 ng / ml or more, and sAPPα is 100 ng / ml or more. there were.
上記実験で用いた抗体の反応性の確認を、Ａβ、ｓＡＰＰαを用いたダイレクトＥＬＩＳＡで確認した結果を図７に示す。捕捉用抗体は両者に結合し、検出用抗体はそれぞれの抗原に特異的に結合することが確認された。
FIG. 7 shows the result of confirming the reactivity of the antibody used in the above experiment by direct ELISA using Aβ and sAPPα. It was confirmed that the capture antibody bound to both, and the detection antibody specifically bound to each antigen.
上記実験で用いた抗体の反応性の確認を、Ａβ、ｓＡＰＰαを用いたサンドイッチＥＬＩＳＡで確認した結果を図７に示す。捕捉用抗体は両者に結合し、検出用抗体はそれぞれの抗原に特異的に結合することが確認された。
FIG. 7 shows the result of confirming the reactivity of the antibody used in the above-mentioned experiment by sandwich ELISA using Aβ and sAPPα. It was confirmed that the capture antibody bound to both, and the detection antibody specifically bound to each antigen.
Claims (15)
- 共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料において、少なくとも一方の物質を検出又は測定する方法であって、
前記試料と、共通部位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一の抗体に結合した物質と、一方の物質の非共通部位を認識する第二の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一及び／又は第二の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む方法。 A method for detecting or measuring at least one substance in a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part,
Contacting the sample with a first antibody that recognizes a common site and incubating;
Incubating the substance bound to the first antibody and the second antibody recognizing a non-common site of one substance in contact with each other;
Detecting or measuring the binding between the first and / or second antibody and the substance. - 前記第一の抗体と、前記第二の抗体が、互いに識別可能に標識されている、請求項１に記載の方法。 The method according to claim 1, wherein the first antibody and the second antibody are labeled so as to be distinguishable from each other.
- 前記第一の抗体が固相担体に固定されており、
さらに、前記第一の抗体と結合した物質と、前記第一の抗体とは異なる共通部位を認識する第三の抗体と、を接触させてインキュベートする工程を含み、
前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されており、
前記第一、第二及び／又は第三の抗体と前記物質との結合の検出又は測定を、該標識を検出又は測定することによって行う、請求項１又は２に記載の方法。 The first antibody is immobilized on a solid support;
And a step of contacting and incubating the substance bound to the first antibody and a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody,
The second antibody and the third antibody are labelably distinguishable from each other;
The method according to claim 1 or 2, wherein the detection or measurement of the binding between the first, second and / or third antibody and the substance is performed by detecting or measuring the label. - 前記第一の抗体が固相担体に固定されており、
さらに、前記第一の抗体と結合した物質と、前記第二の抗体とは異なる非共通部位を認識する第三の抗体と、を接触させてインキュベートする工程を含み、
前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されており、
前記第一、第二及び／又は第三の抗体と前記物質との結合の検出又は測定を、該標識を検出又は測定することによって行う、請求項１又は２に記載の方法。 The first antibody is immobilized on a solid support;
And a step of contacting and incubating the substance bound to the first antibody and a third antibody that recognizes a non-common site different from the second antibody,
The second antibody and the third antibody are labelably distinguishable from each other;
The method according to claim 1 or 2, wherein the detection or measurement of the binding between the first, second and / or third antibody and the substance is performed by detecting or measuring the label. - 前記２種の物質は、タンパク質がプロセシング及び／又はシェディングによって生じた断片である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the two kinds of substances are fragments produced by processing and / or shedding of proteins.
- 各抗体の認識部位が、前記断片の末端ではない、請求項５に記載の方法。 The method according to claim 5, wherein the recognition site of each antibody is not the end of the fragment.
- 共通部位と非共通部位とを有する２種の物質を含む試料において、少なくとも一方の物質を検出又は測定するためのキットであって、
共通部位を認識する第一の抗体と、一方の物質の非共通部位を認識する第二の抗体と、を含むキット。 A kit for detecting or measuring at least one substance in a sample containing two kinds of substances having a common part and a non-common part,
A kit comprising: a first antibody that recognizes a common site; and a second antibody that recognizes a non-common site of one substance. - 前記第一と第二の抗体は、それぞれ異なる色で蛍光標識されている、請求項７に記載のキット。 The kit according to claim 7, wherein the first and second antibodies are fluorescently labeled with different colors.
- さらに、前記第一の抗体とは異なる共通部位を認識する第三の抗体を含む、請求項７又は８に記載のキット。 The kit according to claim 7 or 8, further comprising a third antibody that recognizes a common site different from the first antibody.
- さらに、前記第二の抗体とは異なる非共通部位を認識する第三の抗体を含む、請求項７又は８に記載のキット。 The kit according to claim 7 or 8, further comprising a third antibody that recognizes a non-common site different from the second antibody.
- 前記第二と第三の抗体は、それぞれ異なる色で蛍光標識されている、請求項９又は１０に記載のキット。 The kit according to claim 9 or 10, wherein the second and third antibodies are fluorescently labeled with different colors.
- 前記２種の物質は、タンパク質がプロセシング及び／又はシェディングによって生じた断片である、請求項７から１１のいずれか１項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 7 to 11, wherein the two kinds of substances are fragments generated by processing and / or shedding of proteins.
- アルツハイマー病の検査方法であって、
被検者に由来する試料と、配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、を接触させてインキュベートする工程と、
前記第一の抗体に結合した物質と、配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体とを接触させてインキュベートする工程と、
前記第二の抗体及び／又は第三の抗体と前記物質との結合を検出又は測定する工程と、を含む方法。 A test method for Alzheimer's disease,
Incubating a sample derived from the subject and a first antibody that recognizes positions 672 to 687 of SEQ ID NO: 1 in contact;
A substance bound to the first antibody; a second antibody recognizing positions 1 to 671 of SEQ ID NO: 1; and / or a third antibody recognizing positions 688 to 711 of SEQ ID NO: 1. And incubating with, and
Detecting or measuring the binding between the second antibody and / or the third antibody and the substance. - 前記第二の抗体と、前記第三の抗体が、互いに識別可能に標識されている、請求項１３に記載の方法。 The method according to claim 13, wherein the second antibody and the third antibody are labeled so as to be distinguishable from each other.
- アルツハイマー病の検査用キットであって、
配列番号：１の６７２位から６８７位を認識する第一の抗体と、
配列番号：１の１位から６７１位を認識する第二の抗体、及び／又は、配列番号：１の６８８位から７１１位を認識する第三の抗体と、を含むキット。 A test kit for Alzheimer's disease,
A first antibody that recognizes positions 672 to 687 of SEQ ID NO: 1;
And a second antibody that recognizes positions 1 to 671 of SEQ ID NO: 1 and / or a third antibody that recognizes positions 688 to 711 of SEQ ID NO: 1.
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