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WO2013168438A1 - ラクターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、形質転換体、及びその製造方法並びに用途 - Google Patents

ラクターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、形質転換体、及びその製造方法並びに用途 Download PDF

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Publication number
WO2013168438A1
WO2013168438A1 PCT/JP2013/050559 JP2013050559W WO2013168438A1 WO 2013168438 A1 WO2013168438 A1 WO 2013168438A1 JP 2013050559 W JP2013050559 W JP 2013050559W WO 2013168438 A1 WO2013168438 A1 WO 2013168438A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
seq
lactase activity
dna
gene
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/050559
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
公安 礒部
芳彦 廣瀬
貴史 小山
Original Assignee
国立大学法人岩手大学
天野エンザイム株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人岩手大学, 天野エンザイム株式会社 filed Critical 国立大学法人岩手大学
Priority to JP2014514391A priority Critical patent/JP6096179B2/ja
Publication of WO2013168438A1 publication Critical patent/WO2013168438A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/195—Proteins from microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a protein having lactase activity. More specifically, an acid-resistant protein having lactase activity, a gene encoding the protein, a recombinant vector containing the gene, a transformant, an enzyme preparation using the protein, a pharmaceutical composition, a quasi-drug composition, The present invention also relates to a food composition and a method for producing an acid-resistant protein having lactase activity.
  • Lactase is a kind of ⁇ -galactosidase and is an enzyme that hydrolyzes lactose (lactose) into glucose and galactose. Industrially, it is also used to produce low-lactose milk, ice cream, and other syrups from whey. In humans, it is present in a large amount in epithelial cells of the small intestine and functions as a digestive enzyme for breaking down lactose contained in dairy products into glucose and galactose and absorbing them in the small intestine.
  • Lactose is a disaccharide and cannot be absorbed as it is, but can only be absorbed in the small intestine by being decomposed into glucose and galactose by lactase.
  • lactase decreases in activity at the weaning stage in mammals. Even in humans, the activity is high in the perinatal period, but the activity naturally decreases around the age of 5. In general, as you finish the lactation period and become an adult from an infant, you will not consume large amounts of milk containing lactose, so even if you lose a lactase activity, There are often no health problems.
  • lactose intolerance Lactose intolerance that occurs after the lactation period is called late-onset lactose intolerance, and although rare, there are cases in which lactase is congenitally deficient. being called.
  • lactose intolerance lactose that was not decomposed in the small intestine is not absorbed in the small intestine and reaches the large intestine as it is. Lactose that reaches the large intestine increases the osmotic pressure in the large intestine. When the osmotic pressure in the large intestine increases, the absorption of water in the large intestine is hindered, resulting in osmotic diarrhea. In addition, lactose that has reached the large intestine is fermented by microorganisms and the like present in the large intestine, and gas such as lactic acid and carbon dioxide is generated, resulting in symptoms such as discomfort, abdominal pain, and diarrhea.
  • lactose in milk is decomposed by lactose-degrading enzyme, and then sugar is converted into alcohol and carbon dioxide by ethanol fermentation, followed by drying to produce powdered milk, thereby obtaining low lactose powdered milk.
  • Patent Document 2 discloses a technique related to Lactobacillus lactic acid bacteria having an ability to improve lactose intolerance, in which both intestinal adhesion and lactose-degrading enzyme activity are enhanced.
  • Patent Document 3 discloses a lactase composition containing ⁇ -galactosidase, an excipient, and less than about 10% reducing sugar, and having improved stability by avoiding the use of a deliquescent excipient. ing.
  • the method of ingesting a lactase preparation is a method in which lactase is administered directly, so that a high effect can be expected.
  • lactase preparations have a problem that their stability under acidic conditions is extremely low.
  • the stomach pH during fasting is 1 to 2, and therefore, when a lactase preparation is ingested during fasting, it is deactivated in the stomach. Therefore, in practice, a method of taking a lactase preparation at the time of eating together with the first mouth or after the first mouth is taken.
  • Non-Patent Document 1 discloses a technique relating to acid-resistant lactase derived from Bisporapsp. And having high stability at pH 1-2.
  • the preparation uses acid-resistant lactase having high stability at the same pH 1-2 as that in the fasting stomach, a method of taking the lactase preparation in advance before meals can be realized.
  • Non-Patent Document 1 As described above, in recent years, a technique relating to acid-resistant lactase having high stability at pH 1 to 2 has been developed. However, although the lactase of Non-Patent Document 1 is certainly stable at pH 1-2, the optimum pH is also on the acidic side, and the activity value at pH 4-5 is only about 30% of the optimum pH (non- (See Patent Document 1 Figure 3. a).
  • Non-Patent Document 1 The stomach pH during fasting is 1-2, but it rises to pH 4-5 by eating. Therefore, when lactose is actually decomposed after a meal, the lactase of Non-Patent Document 1 has a problem that it cannot exhibit its original activity.
  • the main object of the present invention is to provide a novel protein having lactase activity that is stable at pH 1-2 and has high activity at pH 4-5.
  • the present invention first provides a protein having the following physicochemical properties.
  • the protein according to the present invention is stable in the stomach on an empty stomach and after a meal, and also exhibits high activity in the stomach after a meal.
  • the protein according to the present invention is not particularly limited as long as it has the physicochemical properties described above, and (6) Km value: 2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside It is preferable that it is about 0.19 mM with respect to.
  • the origin of the protein according to the present invention is not particularly limited as long as it is a protein specified by the above physicochemical properties. Examples thereof include those derived from microorganisms belonging to the genus Teratosphaeria. In this case, examples of microorganisms belonging to the genus Teratosphaeria include Teratosphaeria acidotherma.
  • the present invention provides the following protein (a), (b) or (c).
  • A a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17;
  • B A protein having a lactase activity, comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • C A protein having a lactase activity, comprising an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the present invention also provides a gene encoding the protein. As a specific example, the gene consisting of DNA described in the following (a), (b) or (c) can be mentioned.
  • A DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 20.
  • a DNA encoding a protein having a lactase activity comprising a base sequence in which one to several bases are deleted, substituted and / or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 20.
  • C DNA encoding a protein having a lactase activity, comprising a base sequence having 90% or more homology with the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or 20.
  • the protein according to the present invention can be suitably used as an enzyme preparation by containing it as an active ingredient.
  • the protein and enzyme preparation according to the present invention can be suitably used for a pharmaceutical composition, a quasi-drug composition, or a food composition.
  • the method for producing a protein according to the present invention is not particularly limited.
  • a protein having lactase activity is collected from a culture obtained by culturing the microorganism capable of producing the protein or the transformant in a nutrient medium. Can be manufactured.
  • the protein according to the present invention is stable in the stomach on an empty stomach and exhibits high activity in the stomach after a meal, so that an enzyme preparation, a pharmaceutical composition, or a quasi-drug containing this as an active ingredient
  • the composition or the food composition can be ingested before a meal, and can also realize a very high lactose decomposition action even after a meal.
  • the range of options for taking an enzyme preparation or the like in lactose intolerance is widened, and symptoms can be effectively suppressed by lactose intolerance.
  • FIG. 4 is a graph instead of a drawing showing the relative activity (%) with respect to pH in Example 3.
  • FIG. 6 is a drawing-substituting graph showing residual activity (%) relative to pH in Example 4.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting graph showing relative activity (%) with respect to temperature in Example 5.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting graph showing remaining activity (%) with respect to time in Example 6.
  • FIG. 10 is a drawing-substituting graph showing the residual activity (%) with respect to temperature in Example 6.
  • FIG. 6 is a drawing-substituting photograph showing the results of sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis in Example 7.
  • the protein according to the present invention is a protein having physicochemical properties and lactase activity described below.
  • the method for measuring lactase activity is not particularly limited, and any known method can be freely selected.
  • lactase activity was measured by the method described in Examples described later.
  • lactose acts on lactose (lactose) and hydrolyzes it into glucose and galactose.
  • lactose and lactose are used in the same meaning.
  • Lactose is a kind of disaccharide having a chemical formula of C12H22O11 and a molecular weight of 342.3 in which D-galactose and D-glucose are linked by ⁇ -1,4 galactosides.
  • the protein according to the present invention decomposes lactose into glucose and galactose by hydrolyzing the ⁇ -1,4 galactosidic bond of lactose.
  • the protein according to the present invention has the highest lactase activity at pH around 3.0 to 4.0 under the reaction conditions of 37 ° C. for 15 minutes and 3 hours, and has an activity of 80% or more at the optimum pH at pH 4 to 5. This is shown (see Example 3 described later).
  • lactose lactose
  • the protein according to the present invention exhibits a lactase activity of 40% or more at the optimum pH at pH 1.0 and 7.0 under the reaction conditions of 37 ° C. for 15 minutes and 3 hours (see Example 3 described later). ). Therefore, even if the stomach pH is more acidic or neutral than usual due to the contents of food and drinks or for some reason, it is possible to maintain a certain level of lactose decomposition action.
  • the protein according to the present invention is stable at pH 1.5 to 7 (see Example 4 described later). That is, the protein of the present invention is stable both in the fasting stomach and in the stomach after a meal. Therefore, the enzyme preparation, pharmaceutical composition, quasi-drug composition or food composition containing the protein according to the present invention as an active ingredient can be taken before meals in addition to conventional ingestion.
  • the protein according to the present invention has the highest lactase activity at around 70 ° C. under the reaction conditions of pH 4.5 for 15 minutes (see Example 5 described later).
  • the protein according to the present invention has a molecular mass of about 140 kDa as determined by gel filtration, and a submass of about 86 kDa and about 50 kDa as measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Separated into units (see Example 7 described below).
  • Km value (Michaelis constant) of the protein of the present invention is about 0.19 mM with respect to 2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside, 4-nitrophenyl- ⁇ -D-galacto
  • the Km value for pyranoside is about 1.2 mM
  • the Km value for lactose (measured using Glucose oxidase) is about 170 mM (see Example 8 described later).
  • a specific method for calculating the Km value is not particularly limited, and a known method can be freely selected and calculated. In the present invention, in particular, the Km value was calculated by the method described in Example 8 described later.
  • the protein according to the present invention does not decrease lactase activity for 3 hours or more at 37 ° C. at pH 4.5 and 7.0 (see Example 6 described later). That is, high lactase activity is maintained while digesting food and drink.
  • the protein according to the present invention does not show inactivation at pH 1.5 at 37 ° C. for 90 minutes, and remains about 70% active even after heating for 3 hours (see Example 6 described later). That is, high lactase activity is retained even when an enzyme preparation, pharmaceutical composition, quasi-drug composition or food composition containing the protein according to the present invention as an active ingredient is taken or ingested before a meal. .
  • the activity when heating for 60 minutes, at pH 2.0, the activity does not decrease up to 40 ° C., and 90% or more of the activity remains even at 50 ° C. (see Example 6 described later). Moreover, in pH 5.0, activity does not fall to 60 degreeC (refer Example 6 mentioned later). Furthermore, in the case of pH 7.0, the activity does not decrease up to 40 ° C., and about 60% of the activity remains even at 50 ° C. (see Example 6 described later).
  • the protein according to the present invention described above has characteristics unprecedented in the above-described physicochemical properties, so the origin is not particularly limited as long as it is a protein specified by the above-described physicochemical properties.
  • Examples of the present invention include those derived from microorganisms belonging to the genus Teratosphaeria. In this case, examples of microorganisms belonging to the genus Teratosphaeria include Teratosphaeria acidotherma.
  • Teratosphaeria acidotherma is a kind of fungus belonging to the Capnodiales family of Ascomycota (Ascomycota), and many exist as acidophilic bacteria in the soil of hot springs.
  • Ascomycota Capnodiales family of Ascomycota
  • Teratosphaeria acidotherma was isolated and purified from soil at a high temperature (approximately 40 ° C.) in acidic hot springs in Akita Prefecture and Iwate Prefecture. A specific screening method will be described in Example 1 described later.
  • amino acid structure is not limited as long as it is a protein specified by the above-mentioned physicochemical properties.
  • it can be specified by the following amino acid sequence.
  • the protein according to the present invention can be identified by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17.
  • the modified protein when a part of the amino acid sequence of a certain protein is modified, the modified protein may have a function equivalent to that of the protein before modification. That is, the modification of the amino acid sequence does not substantially affect the function of the protein, and the protein function may be maintained before and after the modification. Therefore, the present invention provides, as another aspect, a protein having an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17, and having lactase activity. . “Deletion, substitution and / or addition of one to several amino acids constituting an amino acid sequence” typically refers to a difference in a part of the amino acid sequence.
  • the positions where the amino acid sequences are different are not particularly limited, and differences may occur at a plurality of positions.
  • the term “plurality” as used herein refers to, for example, a number corresponding to less than about 30% of the entire amino acid sequence, preferably a number corresponding to less than about 20%, and more preferably a number corresponding to less than about 10%. Even more preferably a number corresponding to less than about 5%, most preferably a number corresponding to less than about 1%. That is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, even more preferably about 95% or more, and most preferably about 99% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17. It means having.
  • a method of obtaining a protein by causing a conservative amino acid substitution at an amino acid residue that is not essential for lactase activity is preferred.
  • conservative amino acid substitution refers to substitution of a certain amino acid residue with an amino acid residue having a side chain having the same properties.
  • the amino acid residue is composed of a basic side chain (for example, lysine, arginine, histidine), an acidic side chain (for example, aspartic acid, glutamic acid), an uncharged polar side chain (for example, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, Tyrosine, cysteine), nonpolar side chains (eg alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched side chains (eg threonine, valine, isoleucine), aromatic side chains (eg tyrosine, phenylalanine) , Tryptophan, and histidine).
  • a conservative amino acid substitution is preferably a substitution between amino acid residues within the same family.
  • the protein according to the present invention may be a part of a larger protein (for example, a fusion protein).
  • a fusion protein for example, a fusion protein
  • sequences added in the fusion protein include sequences useful for purification, such as multiple histidine residues, and additional sequences that ensure stability during recombinant production.
  • Gene, Recombinant Vector, Transformant> (1) Gene in the present invention, a gene encoding the protein is provided.
  • the gene of the present invention comprises DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17.
  • a specific example of this aspect is DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20.
  • the protein encoded by the modified DNA may have the same function as the protein encoded by the DNA before modification. That is, the modification of the DNA sequence does not substantially affect the function of the encoded protein, and the function of the encoded protein may be maintained before and after the modification.
  • a DNA encoding a protein having a base sequence equivalent to the base sequence of SEQ ID NO: 16 or 20 and having lactase activity hereinafter also referred to as “equivalent DNA”.
  • the “equivalent base sequence” here is partly different from the nucleic acid shown in SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20, but the function of the protein encoded by the difference (in the present invention, lactase activity) is substantially reduced. This means a base sequence that is not affected by any significant influence.
  • a specific example of equivalent DNA is DNA that hybridizes under stringent conditions to a base sequence complementary to the base sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20.
  • the “stringent conditions” here are conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • Such stringent conditions are known to those skilled in the art, for example, Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring Harbor Press, New York, Current Protocols in Molecular Biological. Can be set with reference to.
  • a hybridization solution (50% formamide, 10 ⁇ SSC (0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / Incubate at about 42 ° C. to about 50 ° C. with ml of denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), and then at about 65 ° C. with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS.
  • the conditions for washing at about 70 ° C. can be mentioned.
  • More preferable stringent conditions include, for example, 50% formamide, 5 ⁇ SSC (0.15M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 1 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate as a hybridization solution.
  • the conditions using 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)) can be mentioned.
  • equivalent DNA include substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or more (preferably 1 to several) bases based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20.
  • Examples thereof include DNA encoding a protein having a base sequence and having lactase activity. Base substitution or deletion may occur at a plurality of sites.
  • the term “plurality” as used herein refers to, for example, 2 to 40 bases, preferably 2 to 20 bases, more preferably 2 to 10 bases, although it depends on the position and type of amino acid residues in the three-dimensional structure of the protein encoded by the DNA It is.
  • Such equivalent DNAs include, for example, restriction enzyme treatment, treatment with exonuclease, DNA ligase, etc., position-directed mutagenesis (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Press, New York, suddenly) Including base substitution, deletion, insertion, addition, and / or inversion using mutation introduction methods (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Press, New York), etc. using mutation introduction methods (Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Press, New York).
  • DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20 is modified. It can be obtained by Rukoto.
  • the equivalent DNA can also be obtained by other methods such as ultraviolet irradiation.
  • DNA in which a difference in base as described above is recognized due to a polymorphism represented by SNP (single nucleotide polymorphism).
  • the gene of the present invention was isolated by using standard genetic engineering techniques, molecular biological techniques, biochemical techniques, etc. with reference to the sequence information disclosed in this specification or the attached sequence listing. Can be prepared in a state. Specifically, an oligonucleotide probe / primer capable of specifically hybridizing to the gene of the present invention from an appropriate Teratosphaeria ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ acidotherma genomic DNA library or cDNA library, or from an intracellular extract of Teratosphaeria acidotherma. It can be prepared using as appropriate. Oligonucleotide probes and primers can be easily synthesized using a commercially available automated DNA synthesizer. For the method of preparing the library used for preparing the gene of the present invention, for example, Molecular Cloning, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York can be referred to.
  • a gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20 can be isolated using a hybridization method using the whole or a part of the nucleotide sequence or its complementary sequence as a probe. Further, it can be amplified and isolated using a nucleic acid amplification reaction (for example, PCR) using a synthetic oligonucleotide primer designed to specifically hybridize to a part of the base sequence. Further, based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 and the information on the base sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20, a target gene can also be obtained by chemical synthesis (Reference: Gene, 60 (1), 115-127 (1987)).
  • a protein according to the present invention (protein having lactase activity) is isolated and purified from Teratosphaeria® acidotherma, and information on the partial amino acid sequence is obtained.
  • an amino acid sequence analysis [protein-sequencer 476A] is performed by the Edman degradation method [Journal of Biological Chemistry, Vol. 256, pp. 7990-7997 (1981)] according to a conventional method. , Applied Biosystems, etc.). It is effective to carry out limited hydrolysis with the action of a protein hydrolase, separate and purify the obtained peptide fragment, and perform amino acid sequence analysis on the obtained purified peptide fragment.
  • the gene encoding the protein according to the present invention is cloned.
  • cloning can be performed using a hybridization method or PCR.
  • the hybridization method for example, the method described in Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York) can be used.
  • a genomic DNA of a microorganism that produces the protein according to the present invention is used as a template, and a PCR reaction is performed using a synthetic oligonucleotide primer designed based on partial amino acid sequence information to obtain a target gene fragment.
  • the PCR method can be performed, for example, according to the method described in PCR technology [PCR Technology, Erlich HA editing, Stocktonpress, 1989].
  • the base sequence is determined by a method usually used for this amplified DNA fragment, for example, the dideoxy chain terminator method
  • the partial amino acid sequence of the protein according to the present invention is included. The corresponding sequence is found and a part of the gene of interest can be obtained.
  • the gene encoding the protein according to the present invention can be cloned by further performing a hybridization method or the like using the obtained gene fragment as a probe.
  • the whole or part of the gene according to the present invention (SEQ ID NO: 16 or 20) whose entire base sequence has been clarified is used as a probe for hybridization, whereby a genomic DNA of a microorganism that produces a protein having other lactase activity. It is also possible to select DNA having high homology with the gene of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20 from the library or cDNA library.
  • PCR primers can be designed. By performing a PCR reaction using this primer, a gene fragment highly homologous to the gene of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 20 can be detected, and further the entire gene can be obtained.
  • the gene according to the present invention can be used by inserting it into an appropriate vector.
  • the type of vector that can be used in the present invention refers to a nucleic acid molecule that can transport a nucleic acid molecule inserted therein into a target such as a cell, and the type and form thereof are not particularly limited.
  • the vector of the present invention can take the form of a plasmid vector, a cosmid vector, a phage vector, or a viral vector (an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a retrovirus vector, a herpes virus vector, etc.).
  • An appropriate vector is selected according to the purpose of use (cloning, protein expression) and in consideration of the type of host cell.
  • specific examples of the vector include vectors having E. coli as a host (M13 phage or a variant thereof, ⁇ phage or a variant thereof, pBR322 or a variant thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.)), and yeast as a host.
  • Vectors pYepSec1, pMFa, pYES2, etc.
  • vectors using insect cells as hosts pAc, pVL, etc.
  • vectors using mammalian cells as hosts pCDM8, pMT2PC, etc.
  • the recombinant vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • “Expression vector” refers to a vector capable of introducing a nucleic acid inserted therein into a target cell (host cell) and allowing expression in the cell.
  • Expression vectors usually contain a promoter sequence necessary for expression of the inserted nucleic acid, an enhancer sequence that promotes expression, and the like.
  • An expression vector containing a selectable marker can also be used. When such an expression vector is used, the presence or absence of the expression vector (and the degree thereof) can be confirmed using a selection marker.
  • Insertion of the gene of the present invention into a vector, insertion of a selectable marker gene (if necessary), insertion of a promoter (if necessary), etc. are performed using standard recombinant DNA techniques (for example, Molecular Cloning, Third Edition, 1. 84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, etc.).
  • Transformant A transformant can be prepared by introducing the recombinant vector according to the present invention into an appropriate host.
  • the gene of the present invention exists as an exogenous molecule.
  • the transformant of the present invention is preferably prepared by transfection or transformation using the vector of the present invention.
  • transfection and transformation calcium phosphate coprecipitation method, electroporation (Potter, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161-7165 (1984)), lipofection (Felner) , P.L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
  • the host cell that can be used in the present invention is not particularly limited as long as the protein having lactase activity of the present invention is expressed.
  • yeasts it is more preferable to select yeasts belonging to the genus Saccharomyces, Schizosaccharomyces, and Pichia.
  • An example is Pichia pastoris.
  • filamentous fungi it is more preferable to select filamentous fungi belonging to the genus Aspergillus, and examples of the genus Aspergillus include Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus awamori.
  • Enzyme preparation, pharmaceutical composition, quasi-drug composition> The protein according to the present invention can be suitably used for enzyme preparations, pharmaceutical compositions and quasi-drug compositions by utilizing its excellent lactase activity.
  • the specific dosage form is not particularly limited as long as it is a dosage form taken internally or orally, and can be applied to any dosage form. .
  • it can be applied to oral preparations such as powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts and pills.
  • one or more pharmacologically acceptable additives can be freely selected and contained.
  • excipients binders, disintegrants, surfactants, preservatives, colorants, flavoring agents, fragrances, stabilizers, preservatives, antioxidants, etc.
  • Additives can be included.
  • a sustained-release preparation can be obtained using a drug delivery system (DDS).
  • DDS drug delivery system
  • the enzyme preparation, the pharmaceutical composition and the quasi-drug composition according to the present invention can be used as a mixture by freely selecting any one or more existing drugs.
  • drugs such as antacids, gastric agents, digestive agents, intestinal regulating agents, H2 blockers, proton pump inhibitors, antipruritic agents, analgesic / spasmodic agents, laxatives, laxatives, and the like can be added.
  • the protein which concerns on this invention can be used suitably for a food composition using the outstanding lactase activity.
  • milk, juice, sports drinks, beverages such as tea, coffee, tea, seasonings such as soy sauce, soups, creams, various dairy products, ice cream and other frozen desserts, various powdered foods (including beverages),
  • beverages such as tea, coffee, tea, seasonings such as soy sauce, soups, creams, various dairy products, ice cream and other frozen desserts, various powdered foods (including beverages)
  • It can be used for all foods and beverages such as processed foods such as foods for preservation, frozen foods, breads and confectionery.
  • health functional foods including specific health functional foods, nutritional functional foods and beverages
  • so-called health foods including beverages
  • concentrated nutrients liquid foods, infant and infant foods.
  • livestock mammals such as cattle, horses and pigs, poultry such as chickens and quails, pets such as reptiles, birds and small mammals, and farmed fish.
  • the food composition according to the present invention in addition to the protein according to the present invention, it is possible to freely select one or two or more components that can be usually used in foods and drinks and mix them.
  • various seasonings, excipients, buffers, suspending agents, preservatives, emulsifiers, stabilizers, fragrances, fats and oils, brighteners, thickeners, colorants, preservatives, binders, binder reinforcing agents , Emulsion additives, pH adjusters, and the like which can be used in the food field.
  • excipient for example, starch, dextrin, maltose, trehalose, lactose, D-glucose, sorbitol, D-mannitol, sucrose, glycerol and the like can be used.
  • buffer for example, phosphate, citrate, acetate and the like can be used.
  • stabilizer for example, propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • Examples of the pH adjuster include organic acids such as itaconic acid, succinic acid, tartaric acid, fumaric acid, citric acid, malic acid, adipic acid, gluconic acid, pyrophosphoric acid, acetic acid, lactic acid, ⁇ -ketoglutaric acid, phytic acid, and the like.
  • Organic acid salts; inorganic acids such as carbonic acid or inorganic acid salts; acidic amino acids such as aspartic acid and glutamic acid; basic amino acids such as arginine, lysine and histidine can be used.
  • fragrance examples include animal fragrances such as musk, civet, castorium and ambergris; anise essential oil, angelica essential oil, ylang ylang essential oil, iris essential oil, fennel essential oil, orange essential oil, caranga essential oil, caraway essential oil, cardamom essential oil, guayakwood essential oil , Cumin essential oil, black letter essential oil, cinnamon essential oil, cinnamon essential oil, geranium essential oil, copaiba balsam essential oil, coriandel essential oil, perilla essential oil, cedarwood essential oil, citronella essential oil, jasmine essential oil, gingergrass essential oil, cedar essential oil, spearmint essential oil, western peppermint essential oil , Otsuka perfume essential oil, tuberose essential oil, clove essential oil, orange flower essential oil, winter green essential oil, trout balsam essential oil, buttery essential oil, rose essential oil, palmarosa essential oil, persimmon essential oil, hiba essential oil, sandalwood essential oil, petitgren essential oil, bay
  • natural polymers or starch-based or cellulose-based natural polymer derivatives can be used.
  • natural polymer include seaweed extracts such as fucoidan and carrageenan, seed exudates such as guar gum, resin-like adhesives such as gum arabic, and microorganism-generated adhesive substances such as xanthan gum.
  • starch-based or cellulose-based natural polymer derivative include starch-based starch-based starch-based or cellulose-based natural polymer derivatives such as methylcellulose.
  • oils and fats include avocado oil, linseed oil, almond oil, fennel oil, sesame oil, olive oil, orange oil, orange rafa oil, cacao oil, chamomile oil, carrot oil, cucumber oil, coconut oil, sesame oil, rice oil, Safflower oil, shea fat, liquid shea fat, soybean oil, camellia oil, corn oil, rapeseed oil, persic oil, castor oil, sunflower oil, camellia seed oil, cottonseed oil, peanut oil, turtle oil, mink oil, egg yolk oil, Palm oil, palm kernel oil, owl, coconut oil, beef tallow, lard, etc. can be used.
  • oils and fats modified by hydrogenation, fractionation, transesterification and the like can be used.
  • brighteners include waxes such as beeswax, carnauba wax, whale wax, lanolin, liquid lanolin, reduced lanolin, hard lanolin, candelilla wax, montan wax, shellac wax, rice wax, squalene, squalane, pristane and the like (vegetable, animal It does not matter)
  • Mineral oils such as liquid paraffin, petrolatum, paraffin, ozokelide, ceresin, and microcristan wax can be used.
  • the binder for example, soy protein, egg protein, milk protein, casein, starch, transglutaminase and the like can be used.
  • additives include, for example, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, docosahexaenoic acid, eicosapentaenoic acid, 12-hydroxystearic acid, undecylenic acid, tall oil Natural fatty acids such as lanolin fatty acid; fatty acids such as isononanoic acid, caproic acid, 2-ethylbutanoic acid, isopentanoic acid, 2-methylpentanoic acid, 2-ethylhexanoic acid, isopentanoic acid and the like.
  • the production method according to the present invention is a method for collecting a protein having lactase activity from a culture obtained by culturing a microorganism capable of producing the protein according to the present invention or a transformant according to the present invention in a nutrient medium. is there.
  • the microorganism that can be used in the production method according to the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism having the above-described physicochemical properties and the ability to produce a protein having lactase activity, and a known microorganism can be freely selected and used. be able to.
  • a microorganism belonging to the genus Teratosphaeria can be mentioned.
  • examples of microorganisms belonging to the genus Teratosphaeria include Teratosphaeria acidotherma.
  • the microorganism used in the production method according to the present invention is not limited to wild strains, even if the wild strain is a mutant strain mutated by artificial mutation means using ultraviolet rays, X-rays, radiation, various drugs, etc. It can be used as long as it has the ability to produce an acid-resistant enzyme having the aforementioned lactase activity.
  • lactose is preferably used as an inducer.
  • the carbon source of the culture medium which can be used is not specifically limited,
  • the carbon source used for a well-known culture medium can be freely selected 1 type or 2 types or more and can be used.
  • the nitrogen source is not particularly limited, and one or more nitrogen sources used in a known medium can be freely selected and used.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonium sulfate, ammonium nitrate, phosphate-ammonium phosphate, diammonium phosphate, ammonium chloride, corn gluten meal, soy flour, casamino acid, coffee lees, cottonseed oil lees, yeast extract, malt extract, corn steep liquor
  • organic nitrogen raw materials such as casein hydrolyzate, bran, meat extract, amino acid, and peptone can be used.
  • the inorganic nutrient source is not particularly limited, and one or more inorganic nutrient sources used in known media can be freely selected and used.
  • one or more inorganic nutrient sources used in known media can be freely selected and used.
  • in addition to sodium, magnesium, potassium, iron, zinc, calcium, manganese salts, vitamins and the like can be mentioned.
  • the specific temperature for culturing in the production method according to the present invention is not particularly limited, and can be freely set as long as the effects of the present invention are not impaired. In the present invention, it is particularly preferably carried out in a temperature range of 25 to 45 ° C., more preferably in a temperature range of 28 to 32 ° C., and most preferably at 30 ° C.
  • the pH of the medium is not particularly limited and can be freely set as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the pH is preferably set to 3.0 to 5.0, more preferably set to pH 3.8 to 4.2, and most preferably set to pH 4.0.
  • the culture period in the production method according to the present invention is not particularly limited, and can be freely set according to the bacterial cell concentration, the medium pH, the medium temperature, the structure of the medium and the like as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • the culture period is preferably set to 2 to 5 days, more preferably 3 to 4 days.
  • the culture method for example, stationary culture, shaking culture, and aerobic deep culture using jar fermenter can be used.
  • the protein of the present invention is purified and recovered.
  • the protein purification / recovery method is not particularly limited, and any known method can be freely selected. For example, after culturing the microbial cells, the microbial cells are collected by filtration, etc., crushed, etc. to prepare a crude enzyme solution, concentrated and desalted, and then subjected to various chromatography (ion exchange column chromatography). Chromatography, brine column chromatography, affinity column chromatography, gel filtration column chromatography, etc.) can be performed sequentially to obtain the protein of the present invention.
  • the transformant is cultured under conditions where a protein encoded by the gene introduced into the transformant is produced.
  • Culture conditions for transformants are known for various vector host systems, and those skilled in the art can easily set appropriate culture conditions.
  • the produced protein is recovered. About collection
  • the lactase activity was measured by the following method. After 2 mL of 12.3 mM 2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (ONPG) solution was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes, 0.5 mL of the sample solution was added and immediately mixed. This solution was allowed to stand at 37 ° C. for exactly 15 minutes, and then 2.5 mL of 10 g / dL sodium carbonate solution was added and mixed to stop the reaction. Further, 20 mL of water was added and mixed. For the prepared mixed solution, the absorbance at an absorption wavelength of 420 nm was measured using water as a control.
  • ONPG 2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside
  • A1 Absorbance of sample A2: Absorbance of blank n: Dilution factor
  • Example 1 Cell separation> Diluted suspension of soil at high temperature (approximately 40 ° C) in acid hot springs in Akita and Iwate Prefectures was applied to glucose-containing agar medium at pH 1 or pH 2.5 and cultured at 42-45 ° C for 10 days. . Thereafter, the grown strain was isolated.
  • the isolated strain was cultured at 30 ° C. using a lactose-containing medium having a pH of 4.5.
  • the cultured cells were crushed to prepare a crude enzyme solution.
  • the lactase activity of the crude enzyme solution was measured at pH 1.5, pH 4.5, and pH 7.0, and then the activity ratio at each pH was determined.
  • the crude enzyme solution was heated at 37 ° C. for 3 hours at pH 1.5 and pH 5.0 to examine acid resistance.
  • the strain selected as an excellent strain as described above was subjected to liquid culture, disrupted with bacterial cells, and a crude enzyme solution was prepared.
  • This crude enzyme solution was partially purified by DEAE-Toyopearl (registered trademark, manufactured by Tosoh Corporation) column chromatography.
  • the lactase activity of each fraction of column chromatography was measured at pH 1.5, pH 4.5 and pH 7.0, and the pH activity ratios were summarized.
  • the acid resistance was examined by heating at 37 ° C. for 3 hours at pH 1.5 and pH 5.0.
  • the rRNA of the strain obtained by screening was extracted and the strain was identified.
  • the strain obtained by screening was identified as Teratosphaeria acidotherma.
  • the gene sequence of the D2 region of the obtained strain is shown in SEQ ID NO: 1
  • the gene sequence of the ITS region is shown in SEQ ID NO: 2
  • the gene sequence of the D2 region of Teratosphaeria acidotherma is shown in SEQ ID NO: 3
  • the gene sequence of the ITS region is shown in SEQ ID NO: 4, respectively. .
  • Example 2 Purification of acid-resistant protein having lactase activity> (1) Culture First, in order to culture Teratosphaeria acidotherma obtained in Example 1, liquid media shown in Table 1 below were prepared.
  • the 500 mL Sakaguchi flask liquid medium prepared as described above was inoculated with the Teratosphaeria acidotherma spore suspension obtained in Example 1 and precultured. After culturing at 30 ° C. and a rotation speed of 120 rpm for 2 days, 100 mL of the preculture solution was inoculated into a new 3 L flat bottom flask liquid medium to perform main culture. After culturing at 30 ° C. and a rotation speed of 115 rpm for 4 days, the cells were collected by filtration with filter paper.
  • Example 3 Examination of optimum pH> The protein solution purified in Example 2 and the following pH buffer solutions were mixed in equal amounts, reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and lactase activity was measured. pH 1.0 to pH 4.5: 0.1 M sodium acetate-hydrochloric acid buffer pH 4.0 to pH 5.5: 0.1 M sodium acetate-acetic acid buffer pH 5.5 to pH 8.0: 0.1 M potassium phosphate buffer
  • the protein according to the present invention was found to have the highest lactase activity around pH 3.0 to 4.0. It was also confirmed that the lactase activity was at least 80% at the optimum pH at pH 4 to 5, and at least 40% at the optimum pH at pH 1.0 and pH 7.0.
  • Example 4 Examination of stable pH range> The protein solution purified in Example 2 and each pH buffer solution used in Example 3 were mixed in equal amounts and incubated at 50 ° C. for 60 minutes, and then the remaining lactase activity was measured at pH 4.5.
  • the protein according to the present invention was confirmed to be stable at pH 1.5 to 7.0.
  • Example 5 Examination of optimum temperature> Equal amounts of the protein solution purified in Example 2 and 0.1M sodium acetate-acetate buffer at pH 4.5 were mixed and reacted at 30-80 ° C. and pH 4.5 for 15 minutes, and lactase activity was measured.
  • the protein according to the present invention was found to have the highest lactase activity around 70 ° C.
  • Example 6 Examination of stable temperature range> The protein solution purified in Example 2 above, a pH 1.5 0.1M sodium acetate-hydrochloric acid buffer solution, a pH 4.5 0.1M sodium acetate-acetic acid buffer solution, and a pH 7.0 0.1M potassium phosphate buffer solution. After mixing in equal amounts and incubating at 37 ° C. for 0-3 hours, the remaining lactase activity was measured at pH 4.5. Similarly, the protein solution purified in Example 2 above, 0.1M sodium acetate-hydrochloric acid buffer solution at pH 2.0, 0.1M sodium acetate-acetic acid buffer solution at pH 5.0, 0.1M phosphoric acid solution at pH 7.0. The remaining lactase activity after mixing each with an equal amount of potassium buffer and heating at 0 to 60 ° C. for 60 minutes was also examined.
  • Results are shown in FIG. 4 and FIG. As shown in FIG. 4, it was found that the protein according to the present invention did not decrease lactase activity for 3 hours or more at 37 ° C. at pH 4.5 and pH 7.0. That is, it was found that high lactase activity was maintained during digestion of food and drink.
  • the protein according to the present invention was not inactivated for 90 minutes at 37 ° C. at pH 1.5, and about 70% of the activity remained even after heating for 3 hours. That is, high lactase activity is retained even when an enzyme preparation, pharmaceutical composition, quasi-drug composition or food composition containing the protein according to the present invention as an active ingredient is taken or ingested before a meal. I understood that.
  • Example 7 Measurement of molecular mass> The protein purified in Example 2 was calculated to have a molecular mass of about 140 kDa by gel filtration. In addition, when the protein purified in Example 2 was subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), two bands indicating the protein appeared (FIG. 6), and the protein according to the present invention was found to consist of two subunits. Furthermore, from the results of SDS-PAGE, it was confirmed that the molecular masses of the two subunits were about 86 kDa and about 50 kDa.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • Example 8 Measurement of Km value>
  • the concentrations of 2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (ONPG), 4-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside (PNPG), and lactose were changed. Lactase activity was measured, and each Michaelis constant (Km) was determined from the Hanes-Woolf plot.
  • Km Michaelis constant
  • the Km value for 2-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside was 0.19 mM
  • the Km value for 4-nitrophenyl- ⁇ -D-galactopyranoside was 1.2 mM
  • lactose Glucose oxidase was used. The Km value for the measurement was found to be 170 mM.
  • Example 9 Examination of effects of various chemical substances and metals on enzymes>
  • various chemical substances and metals shown in Table 2 below were added to the reaction solution so as to be 1 mM, and reacted at 37 ° C. for 15 minutes at pH 4.5 to measure lactase activity. .
  • the results are shown in Table 2.
  • Example 10 Examination of substrate specificity> Regarding the substrate specificity of the protein purified in Example 2, 2-nitrophenyl-bD-galactopyranoside (ONPG), 4-nitrophenyl-bD-galactopyranoside, 4-nitrophenyl-bD-fucopyranoside, 4-nitrophenyl-bD-glucopyranoside, 4 -Nitrophenyl-bD-xylopyranoside, 4-nitrophenyl-bD-mannopyranoside, 4-nitrophenyl-bD-galactopyranoside, 4-nitrophenyl-bD-glucopyranoside, 4-nitrophenyl-bL-arabinofuranoside, and 4-nitrophenyl-bD-mannopyranoside were studied. The results are shown in Table 3.
  • Example 11 Determination of Partial Amino Acid Sequence>
  • the protein purified in Example 2 was subjected to SDS-PAGE, and the internal amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the band of about 86 kDa and the N-terminal sequence (SEQ ID NO: 6) of about 50 kDa were analyzed.
  • Example 2 The protein purified in Example 2 was subjected to SDS-PAGE and then blotted onto a PVDF membrane. A protein band of about 86 kDa confirmed by CBB staining was treated with trypsin. Protein digests were separated by HPLC, and the amino acid sequence of one part of the obtained protein peak was analyzed (SEQ ID NO: 5). Further, the N-terminal amino acid sequence of the approximately 50 kDa protein band confirmed by CBB staining was analyzed (SEQ ID NO: 6).
  • Example 12 Acquisition of cDNA Fragment> Using the amino acid sequence information obtained in Example 11, cDNA encoding the protein purified in Example 2 was obtained.
  • SEQ ID NO: 5 Based on the internal amino acid sequence (SEQ ID NO: 5) of the band of about 86 kDa, a Degenerate Primer (Primer (1)) of SEQ ID NO: 7 was prepared.
  • the template was prepared from Teratosphaeria acidotherma.
  • the cells of Teratosphaeria acidotherma obtained by liquid culture were collected and frozen, and then dried by lyophilization. Beads were added to the dried cells, and the cells were crushed with a bead shocker. Genomes were collected from the crushed cells using DNeasy Plant Mini Mini Kit (manufactured by QIAGEN). This Genome was used as a template.
  • the PCR reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplified DNA band was confirmed under UV.
  • a DNA band of about 1,600 bp was cut out and DNA was extracted from an agarose gel.
  • the extracted DNA was TA cloned using pGEM-T-Easy Vector Systems (manufactured by Promega).
  • E. coli JM109 was transformed with the TA cloning reaction solution to obtain a plasmid introduced with the target DNA.
  • the base sequence of the DNA introduced into the plasmid was decoded, and the partial base sequence of the gene encoding the protein purified in Example 2 was revealed.
  • Teratosphaeria acidotherma was cultured as follows using the medium shown in Table 1 above.
  • the prepared 500 mL Sakaguchi flask liquid medium was inoculated with Teratosphaeria acidotherma spore suspension and precultured. After culturing at 30 ° C. and a rotation speed of 120 rpm for 2 days, 100 mL of the preculture solution was inoculated into a new 3 L flat bottom flask liquid medium to perform main culture. After culturing at 30 ° C. and a rotation speed of 115 rpm for 1 day, the cells were collected by filtration with filter paper.
  • reaction compositions shown in Table 6 below were prepared, and reacted at 65 ° C. for 5 minutes. After the reaction, it was cooled to 4 ° C.
  • PCR was performed using Primer (3) and Primer (4) under the composition shown in Table 9 below and the reaction conditions shown in Table 10 below. Amplified.
  • DNA-Polymerase TaKaRa-Taq manufactured by Takara Bio was used.
  • the PCR reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the amplified DNA band was confirmed under UV.
  • a DNA band of about 2,000 bp was cut out and DNA was extracted from an agarose gel.
  • the extracted DNA was TA cloned using pGEM-T-Easy Vector Systems (manufactured by Promega).
  • E. coli JM109 was transformed with the TA cloning reaction solution to obtain a plasmid introduced with the target DNA. Decoding the base sequence of the DNA introduced into the plasmid, revealing that the introduced DNA is a partial fragment of the cDNA containing the 3 ′ end region of the gene encoding the protein purified in Example 2 above. did.
  • 5′-RACE method was used to determine the 5 ′ terminal nucleotide sequence further upstream from the obtained gene partial sequence.
  • 5′-Full RACE Core Set manufactured by Takara Bio Inc.
  • reaction was carried out under the reaction composition A shown in Table 11 below and the reaction conditions shown in Table 12 below.
  • Reaction composition B shown in Table 13 below was prepared using the reaction composition A after the reaction. About this reaction composition B, reaction was performed at 30 degreeC for 1 hour.
  • Reaction composition C shown in Table 14 below was added to the DNA recovered by ethanol precipitation, and the reaction was carried out at 15 ° C. for 15 hours.
  • PCR was carried out under the reaction conditions shown in Table 15 below and the reaction conditions shown in Table 16 below using Primer® (6) and Primer® (7) with the reaction composition C after the completion of the reaction as a template.
  • Primer® (6) and Primer® (7) for DNA-Polymerase, TaKaRa-LA-Taq manufactured by Takara Bio was used.
  • PCR was further performed under the reaction conditions shown in Table 17 below and the reaction conditions shown in Table 18 below, using Primer D (8) and Primer (9) using the reaction composition D after the reaction as a template.
  • Primer D (8) and Primer (9) using the reaction composition D after the reaction as a template.
  • primer D (8) and Primer (9) using the reaction composition D after the reaction as a template.
  • TaKaRa-LA-Taq manufactured by Takara Bio was used.
  • the PCR reaction solution with the above reaction composition E was subjected to agarose electrophoresis, stained with ethidium bromide, and the DNA band amplified under UV was confirmed. An approximately 1,800 bp DNA band was cut out and DNA was extracted from an agarose gel. The extracted DNA was TA cloned using pGEM-T-Easy Vector Systems (Promega). E. coli JM109 was transformed with the TA cloning reaction solution to obtain a plasmid introduced with the target DNA. The base sequence of the DNA introduced into the plasmid is decoded, and it is revealed that the introduced DNA is a partial fragment of cDNA containing the 5 ′ end region of the gene encoding the protein purified in Example 2 above. did.
  • the base sequences of the gene encoding the protein obtained above were aligned, and the full-length base sequence (SEQ ID NO: 16) of the gene encoding the protein and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) of the protein were determined.
  • ⁇ Experimental Example 14 Determination of nucleotide sequence in Genome> Based on the information of the full-length base sequence (SEQ ID NO: 16) obtained in Experimental Example 13, Primer (10) of SEQ ID NO: 18 and Primer (11) of SEQ ID NO: 19 were designed. Using the Teratosphaeria acidotherma Genemo as a template, PCR was performed using Primer (10) (SEQ ID NO: 18) and Primer (11) (SEQ ID NO: 19) to determine the nucleotide sequence of the gene encoding the protein in the genome. (SEQ ID NO: 20).
  • the protein according to the present invention is stable in the stomach on an empty stomach and exhibits high activity in the stomach after a meal. Therefore, it is possible to take an enzyme preparation, pharmaceutical composition, quasi-drug composition or food composition containing this as an active ingredient before meals, and also has a very high lactose-degrading action even after meals. Can be realized. As a result, the range of options for taking an enzyme preparation or the like in lactose intolerance is widened, and symptoms can be effectively suppressed by lactose intolerance.

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Abstract

ｐＨ１～２においても安定であり、かつ、ｐＨ４～５における活性の高い新規なラクターゼ活性を有するタンパク質を提供すること。 本発明では、ｐＨ３．０～４．０付近で最も活性が高く、安定ｐＨ範囲がｐＨ１．５～７．０であるラクターゼ活性を有するタンパク質を提供する。本発明に係るタンパク質は、空腹時における胃内において安定であり、かつ、食中食後の胃内において、高い活性を示すため、これを有効成分とする酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物は、食前に摂取することが可能であり、さらに、食中食後においても非常に高い乳糖分解作用を実現することができる。

Description

ラクターゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、形質転換体、及びその製造方法並びに用途
　本発明は、ラクターゼ活性を有するタンパク質に関する。より詳しくは、ラクターゼ活性を有する耐酸性タンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組み換えベクター、形質転換体、前記タンパク質を用いた酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物、および食品組成物、並びに、ラクターゼ活性を有する耐酸性タンパク質の製造方法に関する。
　ラクターゼは、β－ガラクトシダーゼの１種であり、ラクトース（乳糖）をグルコースとガラクトースに加水分解する酵素である。工業的には、低乳糖乳の製造やアイスクリームの製造、その他、乳清からシロップを製造する際にも用いられている。ヒトでは、小腸の上皮細胞に多く存在し、乳製品中などに含有される乳糖をグルコースとガラクトースに分解して小腸で吸収させるための消化酵素として機能している。
　乳糖は、二糖類であり、このままでは吸収することができず、ラクターゼによってグルコースとガラクトースに分解されることによって、はじめて小腸で吸収することができる。しかし、ラクターゼは、一般に、哺乳類では離乳期に至ると活性が低下すると言われている。ヒトでも、周産期には活性が高くなっているが、５歳ころになると自然に活性が低下してくる。一般に、授乳期を終え、幼児から大人になるにつれて、乳糖を含む牛乳などを大量に摂取することは少なくなるため、ラクターゼの活性が低下しても、常識的な量を摂取している限り、健康上の問題は生じない場合が多い。
　しかし、小腸内にラクターゼが全く存在しなかったり、存在してもその量が十分でなかったり、あるいは、ラクターゼの活性が極端に低下している場合などにおいては、乳糖をうまく吸収できないために、腹部の不快感や下痢などの症状を起こす場合があり、この症状は、乳糖不耐症と呼ばれている。授乳期を過ぎてから起こる乳糖不耐症は遅発性の乳糖不耐症と呼ばれており、稀ではあるものの、先天的にラクターゼが欠損する例もあり、先天性の乳糖不耐症と呼ばれている。
　乳糖不耐症の場合、小腸内で分解されなかった乳糖は、小腸では吸収されず、そのまま大腸へ達する。大腸に達した乳糖は、大腸内の浸透圧を上昇させる。大腸内での浸透圧が上昇すると、大腸における水分の吸収が妨げられ、その結果、浸透圧性の下痢が発生する。また、大腸に達した乳糖は、大腸内に存在する微生物などによって発酵され、乳酸や二酸化炭素などのガスが発生し、その結果、不快感、腹痛、下痢などの症状が発生する。
　このような症状を緩和する方法として、乳糖を含む飲食品の摂取を制限する方法がある。牛乳などの乳製品の摂取自体を避けるという方法もあるが、それでは乳製品などに含まれる乳糖以外の栄養素（例えば、カルシウムなど）の摂取も損なわれてしまうため、最近では、食品中に含まれる乳糖の量を低下させる技術が開発されつつある。
　例えば、特許文献１では、乳中の乳糖を乳糖分解酵素により分解し、次いでエタノール発酵により糖質をアルコールと二酸化炭素に変換した後乾燥させて粉乳を製造することにより、低乳糖粉乳を得る技術が開示されている。
　また、乳糖不耐症の対処方法としては、乳酸菌を含有する乳酸発酵された食品などを摂取し、乳酸菌の持つ乳糖分解酵素を小腸内に補給するという方法もある。例えば、特許文献２には、腸管付着性およびラクトース分解酵素活性が共に増強された、乳糖不耐症の改善能を有するラクトバチルス属乳酸菌に関する技術が開示されている。
　一方、乳糖不耐症の対処方法として、特に欧米などにおいては、ラクターゼ製剤をサプリメントなどとして摂取する方法も行われている。例えば、特許文献３では、β－ガラクトシダーゼと賦形剤と約１０％未満の還元糖とを含有し、潮解性賦形剤の使用を避けることにより安定性を向上させたラクターゼ組成物が開示されている。
　確かにラクターゼ製剤を摂取する方法は、ラクターゼをダイレクトに投与する方法であるため、高い効果が期待できる。しかし、現在使用されているラクターゼ製剤は、酸性条件下における安定性が極めて低いという問題がある。通常、空腹時の胃内のｐＨは１～２であるため、ラクターゼ製剤を空腹時に摂取すると、胃内において失活してしまう。そのため、実際には、食事の際、一口目と一緒か、あるいは一口目の後にラクターゼ製剤を服用するという方法がとられている。
　ラクターゼの酸性条件下における安定性の問題に対し、近年、耐酸性ラクターゼに関する技術が開発されつつある。例えば、非特許文献１には、Bispora sp.由来であって、ｐＨ１～２において安定性の高い耐酸性ラクターゼに関する技術が開示されている。
　このように、空腹時の胃内と同様のｐＨ１～２において安定性の高い耐酸性ラクターゼを用いた製剤であれば、食事前にあらかじめラクターゼ製剤を服用しておくという方法も実現可能である。
特開平８－２５６６８２号公報 ＷＯ２００８／００１６７６パンフレット 特開２００２－１８７８５４号公報
J. Agric. Food Chem., 57(12), 5535-5541(2009)
　上述のように、近年においては、ｐＨ１～２において安定性の高い耐酸性ラクターゼに関する技術が開発されつつある。しかしながら、非特許文献１のラクターゼは、確かに、ｐＨ１～２において安定であるものの、至適ｐＨも酸性側にあり、ｐＨ４～５における活性値は、至適ｐＨの３０％程度しかない（非特許文献１Figure 3. a　参照）。
　空腹時の胃内のｐＨは、１～２であるが、食事をすることでｐＨ４～５へと上昇する。そのため、食中食後の実際に乳糖の分解が行われる際において、非特許文献１のラクターゼは、本来の活性を発揮することができないという問題があった。
　そこで、本発明では、ｐＨ１～２においても安定であり、かつ、ｐＨ４～５における活性の高いラクターゼ活性を有する新規なタンパク質を提供することを主目的とする。
　本願発明者らは、耐酸性ラクターゼについて鋭意研究を行った結果、ｐＨ１～２においても安定であり、かつ、ｐＨ４～５における活性の高いラクターゼ活性を有するタンパク質の生産に成功し、本発明を完成させるに至った。
　即ち、本発明ではまず、次の理化学的性質を有するタンパク質を提供する。
（１）作用：ラクトースをグルコースとガラクトースに加水分解する。
（２）至適ｐＨ：ｐＨ３．０～４．０。
（３）安定ｐＨ範囲：ｐＨ１．５～７．０。
（４）至適温度：７０℃。
（５）分子質量：約１４０ｋＤａ（ゲル濾過法）。
　本発明に係るタンパク質は、空腹時および食中食後における胃内において安定であり、かつ、食中食後の胃内においても、高い活性を示す。
　本発明に係るタンパク質は、前記の理化学的性質を有するものであれば、その他の性質については特に限定されないが、さらに、（６）Ｋｍ値：２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドに対して約０．１９ｍＭ、であることが好ましい。
　本発明に係るタンパク質は、前記の理化学的性質で特定されるタンパク質であれば、その由来は特に限定されないが、例えば、Teratosphaeria属に属する微生物に由来するものが挙げられる。この場合、Teratosphaeria属に属する微生物としては、Teratosphaeria acidothermaが挙げられる。
　本発明では次に、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質を提供する。
（ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質。
　また、本発明では、前記タンパク質をコードする遺伝子を提供する。具体的な一例としては、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号１６または２０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１６または２０で表される塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１６または２０で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　これらの本発明に係る遺伝子は、これを含有する組み換えベクターとして用いることができる。
　また、本発明に係る組み換えベクターは、該組み換えベクターにより宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体として用いることも可能である。
　本発明に係るタンパク質は、これを有効成分として含有させることにより酵素製剤として好適に用いることができる。
　また、本発明に係るタンパク質および酵素製剤は、医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物に好適に用いることができる。
　本発明に係るタンパク質の製造方法は特に限定されないが、例えば、前記タンパク質の生産能を有する微生物または前記形質転換体を栄養培地で培養して得られる培養物から、ラクターゼ活性を有するタンパク質を採取することにより製造することが可能である。
　本発明に係るタンパク質は、空腹時における胃内において安定であり、かつ、食中食後の胃内において、高い活性を示すため、これを有効成分とする酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物は、食前に摂取することが可能であり、さらに、食中食後においても非常に高い乳糖分解作用を実現することができる。その結果、乳糖不耐症における酵素製剤等の服用方法の選択の幅が広がり、かつ、乳糖不耐症により症状を効果的に抑制することが可能となる。
実施例３におけるｐＨに対する相対活性（％）を示す図面代用グラフである。 実施例４におけるｐＨに対する残存活性（％）を示す図面代用グラフである。 実施例５における温度に対する相対活性（％）を示す図面代用グラフである。 実施例６における時間に対する残存活性（％）を示す図面代用グラフである。 実施例６における温度に対する残存活性（％）を示す図面代用グラフである。 実施例７におけるドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の結果を示す図面代用写真である。
　以下、本発明を実施するための好適な形態について、詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　＜１．ラクターゼ活性を有するタンパク質＞
　本発明に係るタンパク質は、後述する理化学的性質およびラクターゼ活性を有するタンパク質である。
　本発明において、ラクターゼ活性の測定方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して行うことができる。本発明では、特に、後述する実施例に記載の方法によって、ラクターゼ活性を測定した。
　（１）作用
　本発明に係るタンパク質は、ラクトース（乳糖）に作用して、グルコースとガラクトースに加水分解する。以下、本明細書において、ラクトースと乳糖は、同一の意味で用いる。ラクトースは、化学式Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１、分子量３４２．３で、Ｄ－ガラクトースとＤ－グルコースが、β－１，４ガラクシド結合した二糖類の一種である。本発明に係るタンパク質は、ラクトースのβ－１，４ガラクシド結合を加水分解することにより、ラクトースをグルコースとガラクトースに分解する。
　（２）至適ｐＨ
　本発明に係るタンパク質は、３７℃で１５分間および３時間の反応条件において、ｐＨ３．０～４．０付近で最もラクターゼ活性が高く、ｐＨ４～５において至適ｐＨ時の８０％以上の活性を示す（後述する実施例３参照）。通常、食中食後の胃内のｐＨは、４～５であるため、本発明に係るタンパク質は、飲食物に含まれる乳糖（ラクトース）を実際に加水分解する際に、高い活性を示す。即ち、従来の耐酸性ラクターゼに比べて、食中食後における乳糖分解作用が高い。
　また、本発明に係るタンパク質は、３７℃で１５分間および３時間の反応条件において、ｐＨ１．０およびｐＨ７．０において至適ｐＨ時の４０％以上のラクターゼ活性を示す（後述する実施例３参照）。そのため、飲食物の内容や何らかの原因により、胃内のｐＨが通常よりも酸性若しくは中性側に傾いた場合であっても、一定以上の乳糖分解作用を保持することが可能である。
　（３）安定ｐＨ範囲
　本発明に係るタンパク質は、ｐＨ１．５～７において安定である（後述する実施例４参照）。即ち、本発明に係るタンパク質は、空腹時の胃内においても、食中食後の胃内においても安定である。そのため、本発明に係るタンパク質を有効成分とする酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物は、従来の食中摂取に加え、食前においても摂取することが可能である。
　（４）至適温度
　本発明に係るタンパク質は、ｐＨ４．５で１５分間の反応条件において、７０℃付近で最もラクターゼ活性が高い（後述する実施例５参照）。
　（５）分子質量
　本発明に係るタンパク質は、ゲル濾過法による分子質量が約１４０ｋＤａであり、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）における分子質量が約８６ｋＤａと約５０ｋＤａのサブユニットに分離される（後述する実施例７参照）。
　（６）Ｋｍ値
　本発明に係るタンパク質のＫｍ値（ミカエリス定数）は、２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドに対して約０．１９ｍＭ、４－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドに対するＫｍ値は約１．２ｍＭ、ラクトース（Glucose oxidaseを使用して測定）に対するＫｍ値は約１７０ｍＭである（後述する実施例８参照）。本発明において、Ｋｍ値の具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。本発明では、特に、後述する実施例８に記載の方法によって、Ｋｍ値を算出した。
　（７）安定温度範囲
　本発明に係るタンパク質は、ｐＨ４．５およびｐＨ７．０において３７℃で３時間以上、ラクターゼ活性が低下しない（後述する実施例６参照）。即ち、飲食物を消化する間、高いラクターゼ活性が保持される。
　また、本発明に係るタンパク質は、ｐＨ１．５において３７℃で９０分間失活は認められず、３時間加熱しても約７０％の活性が残存する（後述する実施例６参照）。即ち、本発明に係るタンパク質を有効成分とする酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物を、食前に服用または摂取した場合であっても、高いラクターゼ活性が保持される。
　更に、６０分加熱する場合、ｐＨ２．０の場合は４０℃までは活性が低下せず、５０℃でも９０％以上の活性が残存する（後述する実施例６参照）。また、ｐＨ５．０の場合は、６０℃までは活性が低下しない（後述する実施例６参照）。更に、ｐＨ７．０の場合は、４０℃までは活性が低下せず、５０℃でも約６０％の活性が残存する（後述する実施例６参照）。
　（８）由来について
　以上説明した本発明に係るタンパク質は、前述の理化学的性質に従来にない特徴を持つため、前述の理化学的性質で特定されるタンパク質であれば、その由来は特に限定されない。本発明においては、例えば、Teratosphaeria属に属する微生物に由来するものが挙げられる。この場合、Teratosphaeria属に属する微生物としては、Teratosphaeria acidothermaが挙げられる。
　Teratosphaeria acidothermaは、Ascomycota（子嚢菌）類のCapnodiales目に属する真菌の一種であり、多くは、温泉の土壌中などに、好酸性菌として存在する。本発明においては、秋田県および岩手県内の酸性温泉における高温（概ね４０℃）の場所の土壌から、Teratosphaeria acidothermaを分離・精製した。具体的なスクリーニング方法は、後述の実施例１で述べる。
　（９）アミノ酸配列
　本発明に係るタンパク質は、前述の理化学的性質に従来にない特徴を持つため、前述の理化学的性質で特定されるタンパク質であれば、そのアミノ酸構造は限定されないが、一例を挙げると、以下のアミノ酸配列により特定することができる。
　具体的には、本発明に係るタンパク質は、配列番号１７で表されるアミノ酸配列で特定することができる。
　ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、アミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで、本発明は他の態様として、配列番号１７で表されるアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質を提供する。「アミノ酸配列を構成する１から数個のアミノ酸の欠失、置換および／または付加」とは、典型的にアミノ酸配列の一部の相違のことをいう。
　ここでのアミノ酸配列の相違は、ラクターゼ活性が保持されうる限り許容される（活性の多少の変動があってもよい）。この条件を満たす限り、アミノ酸配列が相違する位置は特に限定されず、また複数の位置で相違が生じていてもよい。ここでの複数とは、例えば、全アミノ酸配列の約３０％未満に相当する数であり、好ましくは約２０％未満に相当する数であり、さらに好ましくは約１０％未満に相当する数であり、より一層好ましくは約５％未満に相当する数であり、最も好ましくは約１％未満に相当する数である。
　即ち、配列番号１７のアミノ酸配列と、例えば約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、より一層好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９９％以上の同一性を有することを指す。
　また、好ましくは、ラクターゼ活性に必須でないアミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を生じさせることによって、タンパク質を得る方法がよい。ここでの「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基は、その側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。保存的アミノ酸置換は好ましくは、同一のファミリー内のアミノ酸残基間の置換である。
　本発明に係るタンパク質は、より大きいタンパク質（例えば融合タンパク質）の一部であってもよい。融合タンパク質において付加される配列としては、例えば、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、組み換え生産の際の安定性を確保する付加配列等が挙げられる。
　　＜２．遺伝子、組み換えベクター、形質転換体＞
　（１）遺伝子
　本発明では、前記タンパク質をコードする遺伝子を提供する。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号１７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む。当該態様の具体例は、配列番号１６または配列番号２０の塩基配列からなるＤＮＡである。
　ところで、一般に、あるタンパク質をコードするＤＮＡの一部に改変を施した場合において、改変後のＤＮＡがコードするタンパク質が、改変前のＤＮＡがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち、ＤＮＡ配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。そこで、本発明では他の態様として、配列番号１６または配列番号２０の塩基配列と等価な塩基配列を有し、ラクターゼ活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、「等価ＤＮＡ」ともいう）を提供する。ここでの「等価な塩基配列」とは、配列番号１６または配列番号２０に示す核酸と一部で相違するが、当該相違によってそれがコードするタンパク質の機能（本発明ではラクターゼ活性）が実質的な影響を受けていない塩基配列のことをいう。
　等価ＤＮＡの具体例は、配列番号１６または配列番号２０の塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである。ここでの「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）やＣｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ　Ｍ．　Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，　１９８７）を参照して設定することができる。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（５０％ホルムアミド、１０×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，　１５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，　ｐＨ　７．０）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％　ＳＤＳ、１０％　デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いて約４２℃～約５０℃でインキュベーションし、その後０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを用いて約６５℃～約７０℃で洗浄する条件を挙げることができる。更に好ましいストリンジェントな条件として、例えば、ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ，　１５ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｃｉｔｒａｔｅ，　ｐＨ　７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる条件を挙げることができる。
　等価ＤＮＡの他の具体例として、配列番号１６または配列番号２０に示す塩基配列を基準として１若しくは複数（好ましくは１～数個）の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含む塩基配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。塩基の置換や欠失などは複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは、当該ＤＮＡがコードするタンパク質の立体構造におけるアミノ酸残基の位置や種類によっても異なるが例えば２～４０塩基、好ましくは２～２０塩基、より好ましくは２～１０塩基である。以上のような等価ＤＮＡは例えば、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１３　，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｈａｐｔｅｒ　１３　，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）による変異の導入などを利用して、塩基の置換、欠失、挿入、付加、及び／又は逆位を含むように、配列番号１６または配列番号２０に示す塩基配列を有するＤＮＡを改変することによって得ることができる。また、紫外線照射など他の方法によっても等価ＤＮＡを得ることができる。
　等価ＤＮＡの更に他の例として、ＳＮＰ（一塩基多型）に代表される多型に起因して上記のごとき塩基の相違が認められるＤＮＡを挙げることができる。
　本発明の遺伝子は、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報を参考にし、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって単離された状態に調製することができる。具体的には、適当なTeratosphaeria acidothermaのゲノムＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリー、或はTeratosphaeria acidothermaの菌体内抽出液から、本発明の遺伝子に対して特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ・プライマーを適宜利用して調製することができる。オリゴヌクレオチドプローブ・プライマーは、市販の自動化ＤＮＡ合成装置などを用いて容易に合成することができる。尚、本発明の遺伝子を調製するために用いるライブラリーの作製方法については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照できる。
　例えば、配列番号１６または配列番号２０の塩基配列を有する遺伝子であれば、当該塩基配列又はその相補配列の全体又は一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用して単離することができる。また、当該塩基配列の一部に特異的にハイブリダイズするようにデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた核酸増幅反応（例えばＰＣＲ）を利用して増幅及び単離することができる。また、配列番号１７に示すアミノ酸配列や配列番号１６または配列番号２０の塩基配列の情報を元にして、化学合成によって目的とする遺伝子を得ることもできる(参考文献：Ｇｅｎｅ，６０（１），　１１５－１２７　（１９８７）)。
　以下、本発明の遺伝子の取得法の具体例を示す。まず、Teratosphaeria acidothermaから本発明に係るタンパク質（ラクターゼ活性を有するタンパク質）を単離・精製し、その部分アミノ酸配列に関する情報を得る。部分アミノ酸配列決定方法としては、例えば、精製したタンパク質を直接常法に従ってエドマン分解法〔ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー、第256巻、第７９９０～７９９７頁（１９８１）〕によりアミノ酸配列分析〔プロテイン―シーケンサー４７６Ａ、アプライド　バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製等〕に供する方法が挙げられる。タンパク質加水分解酵素を作用させて限定加水分解を行い、得られたペプチド断片を分離精製し、得られた精製ペプチド断片についてアミノ酸配列分析を行うのが有効である。
　このようにして得られる部分アミノ酸配列情報を基に、本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子をクローニングする。例えば、ハイブリダイゼーション法又はＰＣＲを利用してクローニングを行うことができる。ハイブリダイゼーション法を利用する場合、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に記載の方法を用いることができる。
　ＰＣＲ法を利用する場合、以下の方法を用いることができる。まず、本発明に係るタンパク質を産生する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とし、部分アミノ酸配列の情報を基にデザインした合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、目的の遺伝子断片を得る。ＰＣＲ法は、例えば、ＰＣＲテクノロジー〔ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、エルリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）ＨＡ編集、ストックトンプレス社（Ｓｔｏｃｋｔｏｎｐｒｅｓｓ）、１９８９年発行〕に記載の方法に準じて行うことができる。更に、この増幅ＤＮＡ断片について通常用いられる方法、例えば、ジデオキシチェーンターミネーター法で塩基配列を決定すると、決定された配列中に合成オリゴヌクレオチドプライマーの配列以外に、本発明に係るタンパク質の部分アミノ酸配列に対応する配列が見出され、目的の遺伝子の一部を取得することができる。得られた遺伝子断片をプローブとして更にハイブリダイゼーション法等を行うことによって本発明に係るタンパク質をコードする遺伝子をクローニングすることができる。
　また全塩基配列が明らかにされた本発明に係る遺伝子（配列番号１６または２０）の全体あるいは一部分をハイブリダイゼーション用のプローブとして用いることによって、他のラクターゼ活性を有するタンパク質を産生する微生物のゲノムＤＮＡライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１６または配列番号２０の遺伝子と相同性の高いＤＮＡを選別することも可能である。
　同様に、ＰＣＲ用のプライマーをデザインすることができる。このプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことによって、配列番号１６または配列番号２０の遺伝子と相同性の高い遺伝子断片を検出し、さらにはその遺伝子全体を得ることもできる。
　（２）組み換えベクター
　本発明に係る遺伝子は、適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明において用いることができるベクターの種類は、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子をいい、その種類、形態は特に限定されるものではない。従って、本発明のベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）の形態をとり得る。
　使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例を挙げれば、大腸菌を宿主とするベクター（Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）、酵母を宿主とするベクター（ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等、昆虫細胞を宿主とするベクター（ｐＡｃ、ｐＶＬなど）、哺乳類細胞を宿主とするベクター（ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣなど）等である。
　本発明の組換えベクターは好ましくは発現ベクターである。「発現ベクター」とは、それに挿入された核酸を目的の細胞（宿主細胞）内に導入することができ、且つ当該細胞内において発現させることが可能なベクターをいう。発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。
　本発明の遺伝子のベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は、標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，　１．８４，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋなどに記載された方法など）を用いて行うことができる。
　（３）形質転換体
　本発明に係る組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。本発明の形質転換体では、本発明の遺伝子が外来性の分子として存在することになる。本発明の形質転換体は、好ましくは、上記本発明のベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。トランスフェクション、トランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション（Ｐｏｔｔｅｒ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８１，　７１６１－７１６５（１９８４））、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒ，　Ｐ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８４，７４１３－７４１７（１９８４））、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，　Ｍ．　＆　Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ，Ａ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　７３，３６６－３７０（１９７６））、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａｈａｎ，　Ｄ．，　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６６，　５５７－５８０（１９８３））、酢酸リチウム法（Ｓｃｈｉｅｓｔｌ，　Ｒ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．　１６，　３３９－３４６（１９８９））、プロトプラスト－ポリエチレングリコール法（Ｙｅｌｔｏｎ，　Ｍ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　８１，　１４７０－１４７４（１９８４））等によって実施することができる。
　本発明において用いることができる宿主細胞は、本発明のラクターゼ活性を有するタンパク質が発現する限りにおいて特に限定されない。例えば、大腸菌、Bacillus属、Lactococcus属、Lactobacillus属、Streptococcus属、Leuconostoc属、Bifidobacterium属、Streptomyces属などに属する細菌：Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Kluyberomyces属、Candida属、Pichia属、Torula属、Torulopsis属に属する酵母：Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属、Fusarium属に属する糸状菌などが挙げられる。この中でも本発明では特に、酵母または糸状菌から選択することが好ましい。酵母の中では特に、Saccharomyces属、Schizosaccharomyces属、Pichia属に属する酵母を選択することがより好ましく、Saccharomyces属としては、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces属としては、例えば、Schizosaccharomyces pombe、Pichia属としては、例えば、Pichia pastorisが挙げられる。糸状菌の中では特に、Aspergillus属に属する糸状菌を選択することがより好ましく、Aspergillus属としては、例えば、Aspergillus oryzae、Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Aspergillus terreus、Aspergillus awamoriが挙げられる。
　＜３．酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物＞
　本発明に係るタンパク質は、その優れたラクターゼ活性を利用して、酵素製剤、医薬品組成物および医薬部外品組成物に好適に用いることができる。本発明に係る酵素製剤、医薬品組成物および医薬部外品組成物において、具体的な剤型は、内服または経口摂取する剤型であれば特に限定されず、あらゆる剤型に適用することができる。例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、丸剤、などの経口剤に適用することができる。
　本発明に係る酵素製剤、医薬品組成物および医薬部外品組成物には、薬理学的に許容される添加剤を１種または２種以上自由に選択して含有させることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、保存剤、着色剤、矯味剤、香料、安定化剤、防腐剤、酸化防止剤等の、医薬製剤の分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。また、ドラックデリバリーシステム（ＤＤＳ）を利用して、徐放性製剤等にすることもできる。
　本発明に係る酵素製剤、医薬品組成物および医薬部外品組成物は、既存のあらゆる薬剤を１種または２種以上自由に選択して、合剤とすることもできる。例えば、制酸剤、健胃剤、消化剤、整腸剤、Ｈ２ブロッカー、プロトンポンプ阻害剤、止瀉剤、鎮痛鎮痙剤、緩下剤、下剤など、あらゆる薬剤を配合することも可能である。
　＜３．食品組成物＞
　本発明に係るタンパク質は、その優れたラクターゼ活性を利用して、食品組成物に好適に用いることができる。例えば、牛乳、ジュース、スポーツ飲料、お茶、コーヒー、紅茶などの飲料、醤油などの調味料、スープ類、クリーム類、各種乳製品類、アイスクリームなどの冷菓、各種粉末食品（飲料を含む）、保存用食品、冷凍食品、パン類、菓子類などの加工食品など、あらゆる飲食物に用いることができる。また、保健機能食品（特定保健機能食品、栄養機能食品、飲料を含む）や、いわゆる健康食品（飲料を含む）、濃厚栄養剤、流動食、乳児・幼児食にも用いることができる。更に、牛、馬、豚などの家畜用哺乳類、鶏、ウズラなどの家禽類、爬虫類、鳥類あるいは小型哺乳類などのペット類、養殖魚類などの飼料にも使用することが可能である。
　本発明に係る食品組成物には、本発明に係るタンパク質に加え、通常飲食物に用いることができる成分を、１種または２種以上自由に選択して配合することが可能である。例えば、各種調味料、賦形剤、緩衝剤、懸濁剤、保存剤、乳化剤、安定剤、香料、油脂、光沢剤、増粘剤、着色剤、防腐剤、結着剤、結着補強剤、乳化安定剤、ｐＨ調整剤などの、食品分野で通常使用し得る全ての添加剤を含有させることができる。
　賦形剤としては、例えば、デンプン、デキストリン、マルトース、トレハロース、乳糖、Ｄ－グルコース、ソルビトール、Ｄ－マンニトール、白糖、グリセロール等を用いることができる。
　緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。
　安定剤としては、例えば、プロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。
　ｐＨ調製剤としては、例えば、イタコン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、アジピン酸、グルコン酸、ピロリン酸、酢酸、乳酸、α－ケトグルタル酸、フィチン酸等の有機酸又は有機酸塩；炭酸等の無機酸又は無機酸塩；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；アルギニン、リジン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等を用いることができる。
　香料としては、例えば、ジャコウ、シベット、カストリウム、アンバーグリス等の動物性香料；アニス精油、アンゲリカ精油、イランイラン精油、イリス精油、ウイキョウ精油、オレンジ精油、カナンガ精油、カラウェー精油、カルダモン精油、グアヤクウッド精油、クミン精油、黒文字精油、ケイ皮精油、シナモン精油、ゲラニウム精油、コパイババルサム精油、コリアンデル精油、シソ精油、シダーウッド精油、シトロネラ精油、ジャスミン精油、ジンジャーグラス精油、杉精油、スペアミント精油、西洋ハッカ精油、大茴香精油、チュベローズ精油、丁字精油、橙花精油、冬緑精油、トルーバルサム精油、バチュリー精油、バラ精油、パルマローザ精油、桧精油、ヒバ精油、白檀精油、プチグレン精油、ベイ精油、ベチバ精油、ベルガモット精油、ペルーバルサム精油、ボアドローズ精油、芳樟精油、マンダリン精油、ユーカリ精油、ライム精油、ラベンダー精油、リナロエ精油、レモングラス精油、レモン精油、ローズマリー精油、和種ハッカ精油等の植物性香料；その他合成香料等を用いることができる。
　増粘剤としては、例えば、天然高分子またはデンプン系もしくはセルロース系天然高分子誘導体等を用いることができる。天然高分子としては、例えば、フコイダン、カラギーナン等の海藻抽出物、グァーガム等の種子粘出物、アラビアガム等の樹脂様粘着物、またはキサンタンガム等の微生物産生粘着物質等を挙げることができる。デンプン系もしくはセルロース系天然高分子誘導体としては、例えば、リン酸デンプン等のデンプン系またはメチルセルロースなどのセルロース系の天然高分子誘導体が挙げられる。
　油脂としては、例えば、アボガド油、アマニ油、アーモンド油、ウイキョウ油、エゴマ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラファー油、カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、ココナッツ油、ゴマ油、コメ油、サフラワー油、シア脂、液状シア脂、大豆油、ツバキ油、トウモロコシ油、ナタネ油、パーシック油、ヒマシ油、ヒマワリ油、葡萄種子油、綿実油、落花生油、タートル油、ミンク油、卵黄油、パーム油、パーム核油、モクロウ、ヤシ油、牛脂、豚脂等を用いることができる。また、これらの油脂に水素添加、分別、エステル交換等の処理をして改質された油脂も利用できる。
　光沢剤としては、例えば、ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス、スクワレン、スクワラン、プリスタン等のロウ類（植物性、動物性を問わない。）；流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等の鉱物油を用いることができる。
　結着剤としては、例えば、大豆蛋白質、卵蛋白質、乳蛋白質、カゼイン、デンプン、ト
ランスグルタミナーゼ等を用いることができる。
　その他添加物として、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、1 2-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸；イソノナン酸、カプロン酸、2 -エチルブタン酸、イソペンタン酸、2-メチルペンタン酸、2-エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸等の脂肪酸を含有しても良い。
　また、本発明に係る食品組成物には、本発明に係るタンパク質に加え、他の有効成分を必要に応じて自由に配合することができる。
　＜４．ラクターゼ活性を有するタンパク質の製造方法＞
　本発明に係る製造方法は、本発明に係るタンパク質の生産能を有する微生物または本発明に係る形質転換体を栄養培地で培養して得られる培養物から、ラクターゼ活性を有するタンパク質を採取する方法である。
　本発明に係る製造方法において、用いることができる微生物は、前述した理化学的性質およびラクターゼ活性有するタンパク質の生産能を有する微生物であれば、特に限定されず、公知の微生物を自由に選択して用いることができる。例えば、Teratosphaeria属に属する微生物を挙げることができる。この場合、Teratosphaeria属に属する微生物としては、Teratosphaeria acidothermaが挙げられる。
　本発明に係る製造方法における培養には、公知の手法を適宜採用することができ、例えば液体培養及び固体培養の何れも任意に用いることができる。
　また、本発明に係る製造方法において使用する前記微生物は、野生株に限らず、上記野生株を紫外線、エックス線、放射線、各種薬品などを用いる人工的変異手段で変異した変異株であっても、前記のラクターゼ活性を有する耐酸性酵素の生産能を有する限り、使用することが可能である。
　本発明に係る製造方法における培養に際し、誘導剤として、好ましくは乳糖が用いられる。その他、用いることができる培地の炭素源は特に限定されず、公知の培地に用いられる炭素源を、１種または２種以上自由に選択して用いることができる。
　また、窒素原も特に限定されず、公知の培地に用いられる窒素源を、１種または２種以上自由に選択して用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸‐アンモニウム、リン酸二アンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機窒素源や、コーングルテンミール、大豆粉、カザミノ酸、コーヒー粕、綿実油粕、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス、アミノ酸、ペプトンなどの有機窒素原など、いずれも用いることが可能である。
　更に、無機栄養源も特に限定されず、公知の培地に用いられる無機栄養源を、１種または２種以上自由に選択して用いることができる。例えば、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、カルシウム、マンガンの塩類の他、ビタミンなどを挙げることができる。
　本発明に係る製造方法における培養を行う具体的温度は特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。本発明においては特に、２５～４５℃の温度範囲で行うことが好ましく、２８～３２℃の温度範囲で行うことがより好ましく、３０℃で行うことが最も好ましい。
　また、培地のｐＨも特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、自由に設定することができる。本発明においては特に、ｐＨ３．０～５．０に設定することが好ましく、ｐＨ３．８～４．２に設定することがより好ましく、ｐＨ４．０に設定することが最も好ましい。
　本発明に係る製造方法における培養期間も特に限定されず、本発明の効果を損なわない限り、菌体濃度、培地ｐＨ、培地温度、培地の構成などに応じて自由に設定することができる。本発明においては特に、培養期間を２～５日に設定することが好ましく、３～４日に設定することがより好ましい。培養法としては例えば静置培養、振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
　このようにして、菌体を培養した後、本発明のタンパク質を精製・回収する。タンパク質の精製・回収方法は、特に限定されず、公知の方法を自由に選択して行うことができる。例えば、菌体を培養した後、濾過などにより菌体を回収し、菌体破砕などを行なって粗酵素液を調製し、濃縮・脱塩などを行った後、各種クロマトグラフィー（イオン交換カラムクロマトグラフィー、疏水カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなど）を順次行うことで、本発明のタンパク質を得ることができる。
　本発明に係る形質転換体を用いる製造方法では、まず、形質転換体に導入された遺伝子によってコードされるタンパク質が産生される条件下にて、前記形質転換体を培養する。様々なベクター宿主系に関して形質転換体の培養条件が公知であり、当業者であれば適切な培養条件を容易に設定することができる。培養ステップに続き、産生されたタンパク質を回収する。回収及びその後の精製については、前記の微生物を用いた製造方法の場合と同様に行うことができる。
　以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するとともに、本発明の効果を検証する。なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
　なお、本実施例において、特に記載しない限り、ラクターゼ活性の測定は、以下の方法で行った。
　12.3mMの２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ONPG）溶液2mLを37℃で10分間放置した後、試料溶液0.5mLを添加し、直ちに混合した。この液を、37℃で正確に15分間放置した後、10g/dL炭酸ナトリウム溶液2.5mLを加え、混合して反応を停止させた。
さらに水20mLを加え混合した。調整した混合液について、水を対照として、吸収波長420nmにおける吸光度を測定した。
　ブランクとしては、試料溶液の代わりに水0.5mLを用い、同様に吸光度を測定した。
　下記の数式（１）を用いて、得られた吸光度からラクターゼ活性値を算出した。
　なお、1分間に1μmolの２－ニトロフェノールを遊離する酵素量を1Uとした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 　Ａ１：試料の吸光度
　Ａ２：ブランクの吸光度
　ｎ：希釈倍率
　＜実施例１：菌体分離＞
　秋田県および岩手県内の酸性温泉で高温（概ね４０℃）の場所の土壌の希釈懸濁液を、pH1またはpH2.5のグルコース含有寒天培地に塗沫し、42～45℃で１０日間培養した。その後、生育した菌株を単離した。
　単離した菌株を、pH4.5のラクトース含有培地を用いて30℃で培養した。
　培養した菌体を破砕し、粗酵素液を調製した。粗酵素液のラクターゼ活性を、pH1.5、pH4.5、pH7.0で測定した後、各pHの活性比率を求めた。また、粗酵素液をpH1.5およびpH5.0で37℃、3時間加熱し耐酸性を検討した。
　前記で優良菌株として選抜した株を液体培養し、菌体破砕を行ない、粗酵素液を調製した。この粗酵素液をDEAE-Toyopearl（登録商標、東ソー株式会社製）カラムクロマトグラフィーにより部分精製した。カラムクロマトグラフィーの各フラクションのラクターゼ活性をpH1.5、pH4.5、pH7.0で測定し、pH活性比率をまとめた。また、pH1.5およびpH5.0で37℃、3時間加熱し耐酸性を検討した。
　以上の方法で強酸性（pH2.0以下）～中性付近（pH7.0付近）までラクターゼ活性を示し、かつ、高い安定性を有するラクターゼを生産する菌株をスクリーニングした。
　スクリーニングにより得られた菌株のrRNAを抽出し、菌株の同定を行った。糸状菌の同定指標となるD2領域及びITS領域の遺伝子配列を解析した結果、スクリーニングにより得られた菌株は、Teratosphaeria acidothermaであることが同定された。得られた菌株のD2領域の遺伝子配列を配列番号１、ITS領域の遺伝子配列を配列番号２、Teratosphaeria acidothermaのD2領域の遺伝子配列を配列番号３、ITS領域の遺伝子配列を配列番号４にそれぞれ示す。
　＜実施例２：ラクターゼ活性を有する耐酸性タンパク質の精製＞
　（１）培養
　まず、前記実施例１で得られたTeratosphaeria acidothermaを培養するために、下記表１に示す液体培地を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表１の（１）～（７）を含有する液体培地を、pH4.0±0.1に調整後、液体培地80mLを、500mL容坂口フラスコへあるいは、液体培地800mLを3L平底フラスコへ入れて、オートクレーブにより蒸気殺菌を行なった。その後、終濃度2.0%となるように、0.45μmのフィルターで除菌した10%Lactose溶液20mLまたは200mLを坂口フラスコまたは平底フラスコにそれぞれ添加した。
　以上のように調製した500mL容坂口フラスコ液体培地へ、前記実施例１で得られたTeratosphaeria acidotherma胞子懸濁液を接種し、前培養を行なった。30℃、回転数120rpmで2日間培養した後、前培養液100mLを新たな3L容平底フラスコ液体培地へ接種し、本培養を行なった。30℃、回転数115rpmで4日間培養した後、ろ紙ろ過により菌体を回収した。
　（２）粗酵素液の調整
　前記で培養・回収した菌体を、10mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5に懸濁し、ガラスビーズを添加した。マルチビーズショッカーで菌体を破砕した後、遠心上清を回収し、粗酵素液とした。また、破砕後の沈殿に緩衝液を加え再度マルチビーズショッカーで破砕を行なった。この操作を合計3回繰り返し、粗酵素液を回収した。
　（３）硫安塩析
　前記で回収した粗酵素液に、硫酸アンモニウムを添加して45%飽和濃度にし、生じた沈殿を遠心分離で除去した。上清に硫酸アンモニウムを追加して80%飽和濃度にし、生じた沈殿を遠心分離で回収した。沈殿は40mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5に懸濁した。
　（４）イオン交換カラムクロマトグラフィー
　80%塩析沈殿懸濁液を、40mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5に対して透析を行なった。この透析液を、40mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5で平衡化したDEAE-Toyopearl（登録商標、東ソー株式会社製）カラムに供し、0.1MNaCl含有40mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
　（５）疎水カラムクロマトグラフィー
　前記のイオン交換カラムクロマトグラフィーで分取した目的画分に終濃度1.2Mとなるように硫酸アンモニウムを添加した。この目的画分を、1.2M硫酸アンモニウム含有20mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5で平衡化したPhenyl-Toyopearl（登録商標、東ソー株式会社製）カラムに供し、吸着した酵素を20mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
　（６）前記の疎水カラムクロマトグラフィーで分取した目的画分を、40mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5で透析した後、40mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5で平衡化したDEAE-Toyopearl（登録商標、東ソー株式会社製）カラムに供し、0.1MNaCl含有40mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
　（７）アフィニティーカラムクロマトグラフィー
　前記の疎水カラムクロマトグラフィーで分取した目的画分を、10mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5で透析した後、10mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5で平衡化したToyoperalAF-Epoxy-650（登録商標、東ソー株式会社製）に4-aminophenyl β-D-galactopyranosideを結合させた樹脂カラムに供し、0.2M塩化ナトリウム含有10mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5を用いて直線濃度勾配法で溶出した。
　（７）ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
　前記のアフィニティーカラムクロマトグラフィーで分取した目的画分を濃縮し、50mMリン酸カリウム緩衝液pH6.5で平衡化したToyopearl HW-55（登録商標、東ソー株式会社製）カラムに供し、ゲルろ過を行い、ラクターゼ活性を有する耐酸性タンパク質を精製した。
　＜実施例３：至適ｐＨの検討＞
　前記実施例２で精製したタンパク質溶液と、下記の各pH緩衝液を等量混合し、37℃で15分間反応させ、ラクターゼ活性を測定した。
　pH1.0～pH4.5：0.1M酢酸ナトリウム－塩酸緩衝液
　pH4.0～pH5.5：0.1M酢酸ナトリウム－酢酸緩衝液
　pH5.5～pH8.0：0.1Mリン酸カリウム緩衝液
　結果を図１に示す。図１に示す通り、本発明に係るタンパク質は、pH3.0～4.0付近で最もラクターゼ活性が高いことが分かった。
　また、pH4～5において至適pH時の80％以上、pH1.0およびpH7.0において至適pH時の40％以上のラクターゼ活性を示すことも確認できた。
　＜実施例４：安定ｐＨ範囲の検討＞
　前記実施例２で精製したタンパク質溶液と、前記実施例３で用いた各pH緩衝液を等量混合し、50℃で60分間インキュベートした後、残存するラクターゼ活性を、pH4.5で測定した。
　結果を図２に示す。図２に示す通り、本発明に係るタンパク質は、pH1.5～7.0において安定であることが確認できた。
　＜実施例５：至適温度の検討＞
　前記実施例２で精製したタンパク質溶液と、pH4.5の0.1M酢酸ナトリウム－酢酸緩衝液とを等量混合し、30～80℃、pH4.5で15分間反応させ、ラクターゼ活性を測定した。
　結果を図３に示す。図３に示す通り、本発明に係るタンパク質は、70℃付近で最もラクターゼ活性が高いことが分かった。
　＜実施例６：安定温度範囲の検討＞
　前記実施例２で精製したタンパク質溶液と、pH1.5の0.1M酢酸ナトリウム－塩酸緩衝液、pH4.5の0.1M酢酸ナトリウム－酢酸緩衝液、pH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液とを、それぞれ等量で混合し、37℃で0～3時間インキュベートした後、残存するラクターゼ活性を、pH4.5で測定した。
　また、同様に、前記実施例２で精製したタンパク質溶液と、pH2.0の0.1M酢酸ナトリウム－塩酸緩衝液、pH5.0の0.1M酢酸ナトリウム－酢酸緩衝液、pH7.0の0.1Mリン酸カリウム緩衝液とを、それぞれ等量で混合し、0～60℃で60分間加熱した後の残存するラクターゼ活性も調べた。
　結果を図４および図５に示す。図４に示す通り、本発明に係るタンパク質は、pH4.5およびpH7.0において37℃で3時間以上、ラクターゼ活性が低下しないことが分かった。即ち、飲食物を消化する間、高いラクターゼ活性が保持されることが分かった。
　また、本発明に係るタンパク質は、pH1.5において37℃で90分間失活は認められず、3時間加熱しても約70％の活性が残存することが分かった。即ち、本発明に係るタンパク質を有効成分とする酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物を、食前に服用または摂取した場合であっても、高いラクターゼ活性が保持されることが分かった。
　更に、図５に示す通り、60分加熱する場合、pH2.0の場合は40℃までは活性が低下せず、50℃でも90％以上の活性が残存することが分かった。また、pH5.0の場合は、60℃までは活性が低下しないことが分かった。更に、pH7.0の場合は、40℃までは活性が低下せず、50℃でも約60％の活性が残存することが分かった。
　＜実施例７：分子質量の測定＞
　前記実施例２で精製したタンパク質について、ゲル濾過法により分子質量を算出した結果、約140kDaであることが分かった。
　また、前記実施例２で精製したタンパク質について、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）に供したところ、タンパク質を示す２つのバンドが現れ（図６）、本発明に係るタンパク質が、２つのサブユニットからなることが分かった。更に、SDS-PAGEの結果から、２つのサブユニットの分子質量は、約86kDaと約50kDaであることが確認できた。
　＜実施例８：Ｋｍ値の測定＞
　前記実施例２で精製したタンパク質について、２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ONPG）、４－ニトロフェニル－β－D－ガラクトピラノシド（PNPG）、ラクトース濃度を変化させてラクターゼ活性測定を行い、Hanes-Woolfプロットから、それぞれのミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。この結果、２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドに対するＫｍ値は0.19mM、４－ニトロフェニル－β－D－ガラクトピラノシドに対するＫｍ値は1.2mM、ラクトース（Glucose oxidaseを使用して測定）に対するＫｍ値は170mMであることが判明した。
　＜実施例９：各種化学物質・金属の酵素への影響の検討＞
　前記実施例２で精製したタンパク質について、下記表２に示す各種化学物質および金属を、1mMになるように反応液に添加し、pH4.5で37℃、15分間反応させ、ラクターゼ活性を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜実施例１０：基質特異性の検討＞
　前記実施例２で精製したタンパク質の基質特異性について、2-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside（ONPG）、4-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside、4-nitrophenyl-b-D-fucopyranoside、4-nitrophenyl-b-D-glucopyranoside、4-nitrophenyl-b-D-xylopyranoside、4-nitrophenyl-b-D-mannopyranoside、4-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside、4-nitrophenyl-b-D-glucopyranoside、4-nitrophenyl-b-L-arabinofuranoside、4-nitrophenyl-b-D-mannopyranosideについて検討した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　＜実験例１１：部分アミノ酸配列の決定＞
　前記実施例２で精製したタンパク質をSDS-PAGEに供し、約86kDaのバンドの内部アミノ酸配列（配列番号５）および約50kDaのN末端配列（配列番号６）を解析した。
　前記実施例２で精製したタンパク質をSDS-PAGEに供した後、PVDF膜へブロッティングした。CBB染色により確認された約86kDaのタンパク質バンドについて、トリプシン処理を行った。HPLCによりタンパク質消化物を分離し、得られたタンパク質ピークの1部のアミノ酸配列について、解析を行った（配列番号５）。また、CBB染色により確認された約50kDaのタンパク質バンドについて、N末端アミノ酸配列を解析した（配列番号６）。
　＜実験例１２：ｃＤＮＡ断片の取得＞
　前記実施例１１で得られたアミノ酸配列情報を用いて、前記実施例２で精製したタンパク質をコードするcDNAの取得を行った。
　約86kDaのバンドの内部アミノ酸配列（配列番号５）を元に、配列番号７のDegenerate Primer（Primer (1)）を作製した。
　一方、約86kDaタンパク質のアミノ酸配列をBLASTサーチしたところ、β-ガラクトシダーゼBがヒットした。そこで、β-ガラクトシダーゼB遺伝子で保存されているアミノ酸配列を元に、配列番号８のDegenerate Primer（Primer (2)）を作製した。
　また、テンプレートはTeratosphaeria acidothermaより調製した。液体培養により得られたTeratosphaeria acidothermaの菌体を回収し凍結した後、凍結乾燥により乾燥した。乾燥菌体にビーズを添加し、ビーズショッカーにより菌体を粉砕した。粉砕した菌体について、DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN製)を使用しGenomeを回収した。このGenomeをテンプレートとして使用した。
　プライマーとして前記で作製した配列番号７のPrimer (1)及び配列番号８のPrimer (2)を、テンプレートとして前記で調製したTeratospharia acidothermaのGenomeを用いて、PCRにより遺伝子の増幅を行なった。DNA Polymeraseはタカラバイオ製のTaKaRa Taqを使用した。なお、反応は下記表４に示す組成及び下記表５に示す条件で行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　PCR反応液をアガロース電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色して、UV下で増幅したDNAバンドの確認を行なった。約1,600bpのDNAバンドを切り出し、アガロースゲルからDNAを抽出した。抽出したDNAをpGEM-T Easy Vector Systems（プロメガ製）を使用してTAクローニングした。TAクローニング反応液でE. coli JM109を形質転換し、目的DNAが導入されたプラスミドを獲得した。プラスミドへ導入されたDNAの塩基配列を解読し、前記実施例２で精製したタンパク質をコードする遺伝子の一部の塩基配列を明らかにした。得られた塩基配列情報を元に目的遺伝子全長配列の決定を試みた。得られた塩基配列を元に、配列番号９～１５のPrimer (3)～(9)（primer (5)の5’末端はリン酸化）を設計した。
　［3’末端塩基配列の決定］
　次に、前記で明らかにした遺伝子部分配列よりさらに下流の3’末端塩基配列について、決定を行なった。3’末端塩基配列を得るにあたり、まず、前記実施例２で精製したタンパク質をコードする遺伝子のcDNAの取得を行なった。
　Teratosphaeria acidothermaを、前記表１に示す培地を用いて、以下のように培養した。調製した500mL容坂口フラスコ液体培地へ、Teratosphaeria acidotherma胞子懸濁液を接種し、前培養を行なった。30℃、回転数120rpmで2日間培養した後、前培養液100mLを新たな3L容平底フラスコ液体培地へ接種し、本培養を行なった。30℃、回転数115rpmで1日間培養した後、ろ紙ろ過により菌体を回収した。
　回収した菌体はすぐに液体窒素により凍結を行なった。凍結した菌体から、RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN製）を使用してTotal RNAを抽出した。得られたTotal RNAをテンプレートとして、cDNAの合成を行なった。cDNAの合成は、Prime Script（登録商標）RT-PCR Kit（タカラバイオ製）を使用し、以下の方法で行った。
　まず、下記表６に示す反応組成を調製し、65℃で5分間反応を行なった。反応後、4℃に冷却した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　次いで、反応の終了した前記表６に示す反応組成に、下記表７に示す反応組成を添加し、下記表８に示す反応条件下で反応を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　合成したcDNAをテンプレートとして、Primer (3)及びPrimer (4)を用いて、下記表９に示す組成及び下記表１０に示す反応条件でPCRを行い、目的酵素遺伝子の3’末端部分のDNAを増幅した。なお、DNA Polymeraseはタカラバイオ製のTaKaRa Taqを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　PCR反応液をアガロース電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色して、UV下で増幅したDNAバンドの確認を行なった。約2,000bpのDNAバンドを切り出し、アガロースゲルからDNAを抽出した。抽出したDNAを、pGEM-T Easy Vector Systems（プロメガ製）を使用してTAクローニングした。TAクローニング反応液でE. coli JM109を形質転換し、目的DNAが導入されたプラスミドを獲得した。プラスミドへ導入されたDNAの塩基配列を解読し、導入されたDNAが、前記実施例２で精製したタンパク質をコードする遺伝子の3'末端領域を含むcDNAの一部の断片であることを明らかにした。
　［5’末端塩基配列の決定］
　一方、得られた遺伝子部分配列よりさらに上流の5’末端塩基配列の決定には5’-RACE法を用いた。5’-Full RACE Core Set（タカラバイオ製）を用い、前記で得たTotal RNAから目的DNAの取得を試みた。
　まず、下記表１１に示す反応組成A及び下記表１２に示す反応条件で、反応を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　反応を終了した前記反応組成Aを用いて、下記表１３に示す反応組成Bを調製した。この反応組成Bについて、30℃で1時間の反応を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　前記反応終了後、エタノール沈殿によりDNAの回収を行なった。エタノール沈殿により回収したDNAに、下記表１４に示す反応組成Cを添加し、15℃で15時間の反応を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　前記反応が終了した反応組成Cをテンプレートとして、Primer (6)及びPrimer (7)を用いて、下記表１５に示す反応組成D及び下記表１６に示す反応条件下にて、PCRを実施した。なお、DNA Polymeraseはタカラバイオ製のTaKaRa LA Taqを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　前記反応が終了した反応組成Dをテンプレートとして、Primer (8)及びPrimer (9)を用いて、下記表１７に示す反応組成E及び下記表１８に示す反応条件下にて、更にPCRを行った。なお、DNA Polymeraseはタカラバイオ製のTaKaRa LA Taqを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　前記反応組成EでのPCR反応液をアガロース電気泳動に供し、エチジウムブロマイドで染色して、UV下で増幅したDNAバンドの確認を行なった。約1,800bpのDNAバンドを切り出し、アガロースゲルからDNAを抽出した。抽出したDNAを、pGEM-T Easy Vector Systems（プロメガ製）を使用して、TAクローニングした。TAクローニング反応液でE. coli JM109を形質転換し、目的DNAが導入されたプラスミドを獲得した。プラスミドへ導入されたDNAの塩基配列を解読し、導入されたDNAが、前記実施例２で精製したタンパク質をコードする遺伝子の5’末端領域を含むcDNAの一部の断片であることを明らかにした。
　以上で獲得した前記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を整列化し、前記タンパク質をコードする遺伝子の全長塩基配列（配列番号１６）および前記タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）を決定した。
　＜実験例１４：Genome中での塩基配列の決定＞
　　前記実験例１３で得た全長塩基配列（配列番号１６）の情報を元に、配列番号１８のPrimer (10)及び配列番号１９のPrimer(11)を設計した。Teratosphaeria acidothermaのGenemoをテンプレートとし、Primer (10)（配列番号１８）及びPrimer(11)（配列番号１９）を用いてPCRを行い、前記タンパク質をコードする遺伝子のGenome中での塩基配列を決定した（配列番号２０）。
　本発明に係るタンパク質は、空腹時における胃内において安定であり、かつ、食中食後の胃内において、高い活性を示す。そのため、これを有効成分とする酵素製剤、医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物を、食前に摂取することを可能とし、さらに、食中食後においても非常に高い乳糖分解作用を実現することができる。その結果、乳糖不耐症における酵素製剤等の服用方法の選択の幅が広がり、かつ、乳糖不耐症により症状を効果的に抑制することが可能となる。

Claims (14)

  1. 　次の理化学的性質を有するタンパク質。
    （１）作用：ラクトースをグルコースとガラクトースに加水分解する。
    （２）至適ｐＨ：ｐＨ３．０～４．０。
    （３）安定ｐＨ範囲：ｐＨ１．５～７．０。
    （４）至適温度：約７０℃。
    （５）分子質量：約１４０ｋＤａ（ゲル濾過法）。
  2. 　さらに次の理化学的性質を有する請求項１に記載のタンパク質。
    （６）Ｋｍ値：２－ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシドに対して約０．１９ｍＭ。
  3. 　Teratosphaeria属に属する微生物に由来する請求項１または２に記載のタンパク質。
  4. 　前記微生物が、Teratosphaeria acidothermaである請求項３記載のタンパク質。
  5. 　以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （ｂ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質。
    （ｃ）配列番号１７で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質。
  6. 　請求項５に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
  7. 　以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子。
    （ａ）配列番号１６で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）配列番号１６で表される塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｃ）配列番号１６で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  8. 　以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる遺伝子。
    （ａ）配列番号２０で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
    （ｂ）配列番号２０で表される塩基配列において、１から数個の塩基が欠失、置換および／または付加された塩基配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    （ｃ）配列番号２０で表される塩基配列と９０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、ラクターゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  9. 　請求項６から８のいずれか一項に記載の遺伝子を含有する組み換えベクター。
  10. 　請求項９に記載の組み換えベクターにより宿主細胞が形質転換されてなる形質転換体。
  11. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質を有効成分とする酵素製剤。
  12. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質、または請求項１１に記載の酵素製剤を含有する医薬品組成物、医薬部外品組成物又は食品組成物。
  13. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のタンパク質の生産能を有する微生物を栄養培地で培養して得られる培養物から、請求項１から５のいずれか一項に記載のタンパク質を採取するラクターゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
  14. 　請求項１０記載の形質転換体を培地で培養し、培養物からラクターゼ活性を有するタンパク質を採取するタンパク質の製造方法。
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