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WO2013047798A1 - 糖鎖の精製方法 - Google Patents

糖鎖の精製方法 Download PDF

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Publication number
WO2013047798A1
WO2013047798A1 PCT/JP2012/075180 JP2012075180W WO2013047798A1 WO 2013047798 A1 WO2013047798 A1 WO 2013047798A1 JP 2012075180 W JP2012075180 W JP 2012075180W WO 2013047798 A1 WO2013047798 A1 WO 2013047798A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sugar chain
well
labeled
purifying
filter plate
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/075180
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
碧 阪口
秀行 島岡
Original Assignee
住友ベークライト株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 住友ベークライト株式会社 filed Critical 住友ベークライト株式会社
Publication of WO2013047798A1 publication Critical patent/WO2013047798A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13B—PRODUCTION OF SUCROSE; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED THEREFOR
    • C13B20/00—Purification of sugar juices

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying a sugar chain possessed by a glycoprotein.
  • a sugar chain is a general term for molecules in which monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid and their derivatives are linked in a chain by glycosidic bonds. .
  • Sugar chains are very diverse and are substances involved in various functions of naturally occurring organisms. Sugar chains often exist as complex carbohydrates bound to proteins, lipids, and the like in vivo, and are one of the important components in vivo. It is becoming clear that sugar chains in living organisms are deeply involved in cell-to-cell information transmission, protein function and interaction regulation.
  • biopolymers having sugar chains include proteoglycans on the cell walls of plant cells that contribute to cell stabilization, cell differentiation, cell proliferation, cell adhesion, cell migration, and the like, and Examples thereof include glycoproteins involved in cell-cell interaction and cell recognition.
  • the mechanisms by which these high-molecular sugar chains control sophisticated and precise biological reactions while substituting, assisting, amplifying, regulating, or inhibiting each other's functions are gradually being clarified.
  • this sugar chain engineering and medicine, cell engineering, or organ engineering are closely related. It can be expected that a new development will be made in relation to (Non-patent Document 1).
  • sugar chains present on the cell surface play an important role as scaffolds for various biological reactions.
  • sugar chains are said to be involved in the occurrence of diseases due to abnormal interaction with receptors, infection with AIDS virus, influenza virus, etc., and the entry of pathogenic E. coli O157 toxin and cholera toxin into cells.
  • specific sugar chains appear on the cell surface.
  • sugar chains on the cell surface are considered to be important molecules that give the cells individuality.
  • sugar chain structure analysis techniques In order to analyze the occurrence of these diseases, sugar chain structure analysis techniques have been developed. These techniques combine processes such as excision of sugar chains from complex carbohydrates, separation and purification of sugar chains, and labeling of sugar chains. However, these processes are extremely complicated.
  • gel filtration is performed using the difference in molecular weight between the labeled sugar chain and the contaminants to remove the contaminants from the labeled sugar chains.
  • this method uses many instruments and requires a lot of time for operation.
  • Patent Documents 1, 2, and 3 various methods for applying fluorescent labels to sugar chains have been developed (for example, Patent Documents 1, 2, and 3).
  • the labeling efficiency was not 100%, and a labeled sugar chain and an unlabeled sugar chain were mixed in one sample. This situation does not pose a major problem when the sugar chain is detected by fluorescence using high performance liquid chromatography (HPLC) or capillary electrophoresis (CE method).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • CE method capillary electrophoresis
  • mass spectrometry there is a problem that the peaks of mass spectra and mass chromatograms become complicated.
  • the labeling efficiency to the sugar chain is poor, there is a possibility that the sensitivity for detecting the sugar chain may be lowered in the analysis by HPLC or CE.
  • An object of the present invention is to provide a method for purifying a sugar chain, which allows simple separation and purification of multiple sugar chains at the same time with a large amount of excellent accuracy.
  • Such an object is achieved by the present invention described in the following (1) to (12).
  • the multiwell filter plate is used, and a pressure difference is generated above and below each well of the multiwell filter plate containing the capture carrier and the labeled sugar chain.
  • a microwell plate having a plurality of wells is disposed below the multiwell filter plate, and the label is provided in each well of the microwell plate corresponding to each well of the multiwell filter plate.
  • the fluorescent substance includes 2-aminobenzomide, 2-aminobenzoic acid, 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate, 8-aminophathalene-1,3,6-trisulfonate, 2-amino9 (10H) -acridone, 5-Aminofluorescein, dansylethylenediamine, 7-Amino-4-methylcoumarin, 3-Aminobenzoic acid, 7-Amino-1-naphthol, 3- (Acetylamino) -6-aminoacidine. Purification method for sugar chain.
  • the re-released sugar chain is labeled with the labeling reagent in a solution containing at least the re-released sugar chain and the fluorescent substance,
  • the labeled sugar chain is further removed from the labeling reagent not used for labeling.
  • a multiwell silica gel plate having a plurality of wells provided with silica gel is used, and the labeled sugar chain and the label for the silica gel in each well of the multiwell silica gel plate.
  • sugar chains can be separated and purified with excellent accuracy by simple operations. Furthermore, since the processing solutions supplied to a plurality of wells can be processed in a lump, a large amount (plural types) of sugar chains can be purified by a single purification process.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view taken along line AA of the purification apparatus shown in FIG.
  • FIG. 4 is a longitudinal sectional view for explaining the method for purifying a sugar chain of the present invention for purifying a sugar chain from a glycoprotein.
  • FIG. 5 is a longitudinal sectional view for explaining the method for purifying a sugar chain of the present invention for purifying a sugar chain from a glycoprotein.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view taken along line AA of
  • FIG. 6 is a longitudinal sectional view for explaining the method for purifying a sugar chain of the present invention for purifying a sugar chain from a glycoprotein.
  • FIG. 7 is a longitudinal sectional view for explaining the method for purifying a sugar chain of the present invention for purifying a sugar chain from a glycoprotein.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention.
  • FIG. 2 is a perspective view showing an example of a purification apparatus used in the sugar chain purification method of the present invention.
  • 3 is a cross-sectional view taken along the line AA of the purification apparatus shown in FIG. 2 (FIG. 3 (a) shows a case where a microwell plate is mounted on the purification apparatus, and FIG. 3 (b) shows a tray mounted on the purification apparatus. Represents the case of wearing.).
  • FIGS. 1 to 5 the upper side in FIGS. 1 to 5 is referred to as “upper” and the lower side is referred to as “lower”.
  • the purification apparatus 1 shown in FIGS. 1 to 3 includes a multiwell filter plate 100, a first support base 400 that supports the multiwell filter plate 100, a microwell plate 200, a tray 300, and these microwell plates. 200 or the second support base 500 that supports the tray 300.
  • the multi-well filter plate 100 has a plate shape as a whole, and includes a plurality (96 in this embodiment) of wells (holes) 101 provided in the thickness direction (vertical direction).
  • each of these wells 101 has a bottom portion 103 on the lower side, and further, a through-hole 104 penetrating through the bottom portion 103 is provided corresponding to substantially the center of the bottom portion 103. .
  • the diameter of the through hole 104 is preferably set to about 0.1 mm to 1 mm, more preferably about 0.2 mm to 0.7 mm.
  • a filter 105 is disposed below the well 101 (on the bottom 103 side) so as to close the through hole 104. Due to the relationship between the filter 105 and the hole diameter of the through hole 104, when the multiwell filter plate 100 is left standing, the liquid supplied to the well 101 is prevented from flowing out to the outside through the through hole 104 ( Blocked).
  • the multiwell filter plate 100 is attached to the purification apparatus 1 and the inside of the concave portion 505 of the second support base 500 is sucked using a suction pump, the liquid Transmission (passage) of the filter 105 is allowed. Therefore, the liquid flows out of the well 101 from the bottom 103 side through the through hole 104.
  • the material of the filter 105 is not particularly limited, and examples thereof include a porous film and a nonwoven fabric.
  • examples of the constituent material include polytetrafluoroethylene, cellulose ester, vinylidene fluoride, polycarbonate, polyethylene, polypropylene, nylon, and the like, and one or more of these can be used in combination.
  • the filter 105 is preferably subjected to a hydrophilic treatment.
  • This hydrophilic treatment can be performed by, for example, applying (applying) a surfactant, water-soluble silicon, polypropylene glycol, or the like to the filter 105.
  • the pore diameter of the pores provided in the filter 105 is preferably set to about 0.1 to 50 ⁇ m, more preferably about 0.2 to 20 ⁇ m, and still more preferably 0.4 to 10 ⁇ m. Thereby, the permeation of the liquid component contained in the liquid is allowed, and the permeation of the polymer particles 20 as will be described later is definitely not allowed (blocked).
  • each part except the filter 105 of the multiwell filter plate 100 does not specifically limit as a constituent material of each part except the filter 105 of the multiwell filter plate 100.
  • a constituent material of each part except the filter 105 of the multiwell filter plate 100 For example, a polypropylene, polyethylene, a polystyrene, a polyvinyl chloride, polytetrafluoroethylene (PTFE) etc. are mentioned, These One or two or more of them can be used in combination.
  • the constituent material is preferably polypropylene, vinyl chloride, PTFE or the like. Thereby, the solvent resistance and heat resistance of the multiwell filter plate 100 can be improved.
  • the first support base 400 is a member for supporting the multiwell filter plate 100.
  • the first support base 400 has a flat plate shape and includes a bottom portion 401 having an opening 402 that opens at the center thereof, and an upper outer wall 403 provided so as to protrude upward along the outer edge of the bottom portion 401. And a lower outer wall 404 provided so as to protrude downward along the outer edge of the bottom portion 401.
  • a recess 405 is formed on the inner side.
  • the multiwell filter plate 100 is supported by the first support base 400 by inserting the multiwell filter plate 100 into the recess 405.
  • a groove is provided along the edge of the opening 402 of the bottom 401.
  • a packing (seal member) 407 is disposed so as to correspond to the groove.
  • the upper outer wall 403 has an opening 408 in a direction perpendicular to the thickness direction (vertical direction) at the center of two opposing long sides.
  • the multiwell filter plate 100 inserted (placed) in the recess 405 can be easily taken in and out. Further, when the multiwell filter plate 100 is inserted into the recess 405 and the upper end of the multiwell filter plate 100 protrudes from the recess 405, the formation of the opening 408 can be omitted.
  • a recess 406 is formed inside thereof.
  • the first support base 400 is fixed on the second support base 500 by inserting a protrusion 502 included in the second support base 500 described later along the inner peripheral surface of the recess 406.
  • the outer peripheral surface of the upper outer wall 403 and the outer peripheral surface of the lower outer wall 404 are integrally formed to form a single flat surface.
  • the constituent material of the first support base 400 is not particularly limited.
  • a resin material such as polycarbonate, acrylic resin, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer (ABS resin), Fe such as stainless steel, etc.
  • Metal alloys such as Al alloys, Cu or Cu alloys, Al or Al alloys, ceramic materials such as alumina, apatite, aluminum nitride, etc., and one or more of these may be combined Can be used.
  • the microwell plate 200 is used by being inserted into a recess 505 provided in the second support base 500. Similar to the multiwell filter plate 100, the microwell plate 200 has a flat shape as a whole and a plurality of (in this embodiment, 96) wells (96 in this embodiment) provided in the thickness direction (vertical direction) ( Hole part) 201 is provided. Each of these wells 201 is provided with a bottom 203 on the lower side thereof, and does not penetrate on the bottom 203 side. Thereby, the liquid supplied (stored) to the well 201 is stored therein.
  • Each well 101 provided in the multi-well filter plate 100 and each well 201 provided in the microwell plate 200 are arranged corresponding to the vertical direction when the plates 100 and 200 are overlapped in the vertical direction. Is set to Therefore, as will be described in detail later, the liquid that has passed through the through-hole 104 provided in each well 101 and has flowed out of the multi-well filter plate 100 from the bottom 103 side is arranged so as to correspond to each well 101.
  • Each well 201 is selectively supplied.
  • the microwell plate 200 includes a well forming part 202 in which a plurality of wells 201 are formed, and a frame part 204 arranged so as to surround the well forming part 202.
  • the thickness of the well forming portion 202 is thicker than the thickness of the frame portion 204. As a result, the upper surface of the well forming portion 202 protrudes from the upper surface of the frame portion 204.
  • the well forming portion 202 is set to a size that can be inserted into the opening 402 of the first support base 400 in a plan view. Therefore, when the first support base 400 is placed on the second support base 500 in a state where the microwell plate 200 is disposed in the recess 505 of the second support base 500, as shown in FIG. In addition, the well forming part 202 can be inserted into the opening 402.
  • the separation distance between the upper surface of the well forming portion 202 and the bottom surface of the multiwell filter plate 100 (the lower surface of the bottom portion 103) can be set small. For this reason, the liquid that has flowed out from the well 101 of the multi-well filter plate 100 through the through hole 104 can be efficiently supplied into the well 201 of the microwell plate 200 corresponding to the well 101. it can.
  • the thing similar to what was mentioned as a constituent material of each part except the filter 105 of the multiwell filter plate 100 is mentioned, for example.
  • the tray 300 is used by being inserted into the concave portion 505 provided in the second support base 500 in the same manner as the microwell plate 200. That is, the tray 300 or the microwell plate 200 is inserted into the recess 505 in accordance with the type of treatment performed by the sugar chain purification method using the purification apparatus 1.
  • the tray 300 has the same configuration as the microwell plate 200 described above except that one recess 301 is provided at a position corresponding to the well forming portion 202 in which a plurality of wells 201 are formed.
  • the second support is provided with the tray 300 disposed in the recess 505 of the second support base 500.
  • the liquid that has flowed out from each well 101 of the multiwell filter plate 100 through the through hole 104 is collectively stored in the recess 301 of the tray 300. Will be able to.
  • the tray 300 has a convex portion that protrudes at a position corresponding to the frame portion 204 of the microwell plate 200, as shown in FIG.
  • the tray 300 is not limited to such a configuration, and as long as the concave portion 301 is formed on the center side thereof, the formation of the convex portion may be omitted.
  • the constituent material of the tray 300 for example, the same materials as those described as the constituent materials of each part excluding the filter 105 of the multi-well filter plate 100 can be cited.
  • the adjustment plate 600 Prior to the tray 300 or the microwell plate 200, the adjustment plate 600 is used by being inserted into the recess 505 provided in the second support base 500.
  • the adjustment plate 600 has a flat plate shape, and a plurality of plates having different thicknesses are prepared.
  • the upper surface of the microwell plate 200 (well forming portion 202) and the multiwell filter plate 100 can be easily set small.
  • the adjustment plate 600 As a constituent material of the adjustment plate 600, the thing similar to what was mentioned as a constituent material of each part except the filter 105 of the multiwell filter plate 100 is mentioned, for example.
  • the second support base 500 is a member for supporting the microwell plate 200 or the tray 300, and has a flat bottom 501 and an outer wall 503 provided so as to protrude upward along the outer edge of the bottom 501. And have.
  • a recess 505 is formed inside thereof.
  • the outer wall 503 has a protruding portion 502 that protrudes upward along the inner edge of the outer wall 503.
  • the protrusion 502 is set so that it can be inserted along the inner peripheral surface of the recess 406 provided in the first support base 400.
  • the protrusion 502 is inserted into the concave portion 406 of the first support base 400, whereby the second support base 500.
  • the first support base 400 is fixed on the top.
  • a groove is provided on the upper surface of the outer wall 503 so as to surround the protruding portion 502.
  • a packing (seal member) 507 is disposed so as to correspond to the groove. Accordingly, when the first support base 400 is placed on the second support base 500, communication between the support bases 400 and 500 is not permitted (blocked).
  • the outer wall 503 has a through hole 506 that penetrates the outer wall 503 and communicates with the recess 505 on the side surface of the outer wall 503.
  • the second support base 500 is configured so that a suction pump (not shown) can be connected to the through hole 506. Therefore, the inside of the recessed part 505 can be pressure-reduced by operating this suction pump.
  • a suction pump not shown
  • the inside of the recessed part 505 can be pressure-reduced by operating this suction pump.
  • the thing similar to what was mentioned as a constituent material of the 1st support stand 400 is mentioned, for example.
  • the refining device 1 composed of each member as described above includes a first usage method in which the microwell plate 200 is inserted into the concave portion 505 of the second support base 500. As shown in FIG. 3 (b), it is used in two usage methods including the second usage method in which the tray 300 is inserted into the concave portion 505 of the second support base 500. Hereinafter, these usage methods are used. Will be described.
  • the multiwell filter plate 100 is inserted into the recess 405 of the first support base 400, and the adjustment plate 600 and the microwell plate 200 are inserted into the recess 505 of the second support base 500.
  • the first support base 400 is placed on the second support base 500 (see FIGS. 2 and 3A).
  • the multiwell filter plate 100 is inserted into the recess 405 and the microwell plate 200 is inserted into the recess 505. Further, the well forming portion 202 of the microwell plate 200 is inserted into the opening 402 of the first support base 400, and the protruding portion 502 of the second support base 500 is inserted into the recess 406 of the first support base 400. Is done. As a result, the first support base 400 is fixed on the second support base 500 in a state where the wells 201 of the microwell plate 200 are arranged corresponding to the wells 101 of the multiwell filter plate 100.
  • the packing 507 does not permit (blocks) communication between the inside and the outside between the support bases 400 and 500. Further, the packing 407 does not permit (blocks) communication between the first support base 400 and the multiwell filter plate 100. Therefore, the internal space formed by the multiwell filter plate 100, the first support base 400, and the second support base 500 can be a closed space that is closed to the outside.
  • the closed space can be made negative with respect to the outside by operating the suction pump connected to the through-hole 506 to depressurize the recess 505. Therefore, a pressure difference is generated between the upper and lower sides of the well 101 of the multi-well filter plate 100 via the filter 105, so that the liquid in the well 101 passes through the filter 105 based on the pressure difference. Therefore, the liquid can flow out from each well 101 through the through hole 104, and as a result, the liquid is selectively supplied into the well 201 of the microwell plate 200 corresponding to the well 101.
  • the multiwell filter plate 100 is inserted into the recess 405 of the first support base 400, and the adjustment plate 600 and the tray 300 are inserted into the recess 505 of the second support base 500, In this state, the first support base 400 is placed on the second support base 500 (see FIGS. 2 and 3B).
  • the second usage method is the same as the first usage method except that the adjustment plate 600 and the tray 300 are inserted into the concave portion 505 of the second support base 500. Also in such a second usage method, the internal space formed by the multiwell filter plate 100, the first support base 400, and the second support base 500 is closed with respect to the outside. It can be.
  • the suction pump connected to the through hole 506 is operated to decompress the concave portion 505, so that the liquid can flow out from each well 101 through the through hole 104. .
  • the liquid flowing out from each well 101 can be stored together in the recess 301 of the tray 300 located below the multiwell filter plate 100.
  • the liquid flowing out from each well 101 may be stored in the recess 301 in a lump, so that the distance between the opening of the recess 301 and the through hole 104 is more than necessary. There is no need to make it smaller. Therefore, the insertion of the adjustment plate 600 into the recess 505 of the second support base 500 may be omitted.
  • the purification apparatus 1 is configured such that the liquid passes through the filter 105 by setting the lower side of the filter 105 included in each well 101 of the multiwell filter plate 100 to a negative pressure from the upper side.
  • the purification apparatus is not limited to such a configuration, and may have a configuration in which liquid is allowed to pass through the filter 105 by setting the upper side of the filter 105 to a positive pressure from the lower side.
  • sugar chains can be purified from glycoproteins having sugar chains as follows.
  • ⁇ Purification method> 4 to 7 are longitudinal sectional views for explaining the method for purifying a sugar chain of the present invention for purifying a sugar chain from a glycoprotein.
  • the upper side in FIGS. 4 to 7 is referred to as “upper” and the lower side is referred to as “lower”.
  • the glycoprotein purification method described below a case where a sugar chain is purified from a glycoprotein in a gel separated by electrophoresis will be described.
  • a step of obtaining a gel retaining glycoprotein [1] a step of obtaining a gel retaining glycoprotein, [2] a step of releasing the sugar chain by treating the gel with a sugar chain releasing means, [3] A step of eluting the released sugar chain from the gel to obtain a solution containing the sugar chain; and [4] contacting the solution containing the sugar chain with a capture carrier that specifically binds to the sugar chain, A step of capturing a sugar chain, [5] a step of removing substances other than the sugar chain that did not bind to the capture carrier, [6] a step of deactivating functional groups of the capture carrier, [7] The method includes the step of re-releasing the sugar chain bound to the capture carrier, labeling this sugar chain with another compound, and [8] purifying the labeled sugar chain.
  • the sample containing the prepared glycoprotein is not particularly limited, and examples thereof include biological samples such as whole blood, serum, plasma, urine, saliva, cells, and tissues.
  • biological samples such as whole blood, serum, plasma, urine, saliva, cells, and tissues.
  • glycoproteins that have been purified in advance using a predetermined method or that have not been purified can also be used.
  • this sample may be pretreated by the methods of degreasing, desalting, and protein fractionation sugar.
  • the sample is subjected to predetermined processing such as SDS-PAGE (SDS-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis) or two-dimensional electrophoresis in which isoelectric focusing and SDS-PAGE are combined.
  • predetermined processing such as SDS-PAGE (SDS-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis) or two-dimensional electrophoresis in which isoelectric focusing and SDS-PAGE are combined.
  • the glycoprotein contained in the sample is separated in the gel.
  • the gel after electrophoresis is stained with a staining agent such as Coomassie Brilliant Blue, for example. Thereby, a gel in which the stained glycoprotein is retained can be obtained.
  • a staining agent such as Coomassie Brilliant Blue
  • the method for releasing the sugar chain is not particularly limited, and for example, methods such as glycosidase treatment using N-glycosidase or O-glycosidase, hydrazine decomposition, and ⁇ elimination by alkali treatment can be used.
  • N-glycosidase treatment using N-glycosidase is preferable as a method for releasing sugar chains.
  • the glycoprotein Prior to the N-glycosidase treatment, the glycoprotein may be treated with protease using trypsin, chymotrypsin or the like.
  • cleaning liquid For example, water, various buffer solutions, various organic solvents, etc. are mentioned, Among these, it can use 1 type or in combination of 2 or more types. In addition, you may make it increase the content rate of the sugar chain in a solution by concentrating this solution as needed.
  • the separation of glycoprotein from the glycoprotein-containing sample and the release of the sugar chain from the glycoprotein in the above steps [1] to [3] are carried out from the gel obtained by performing the electrophoresis treatment. We decided to do this by releasing the chains.
  • the present invention is not limited to this case, and the sugar chain may be released from the purified glycoprotein by subjecting the sample to affinity chromatography or ion exchange chromatography.
  • a treatment for releasing the sugar chain directly from the glycoprotein contained in the sample may be performed.
  • a solution containing a sugar chain is brought into contact with a capture carrier that specifically binds to the sugar chain, and the sugar chain is captured on the capture carrier (second step).
  • the sugar chain is the only substance having an aldehyde group among in-vivo substances. That is, a sugar chain is a substance in which a cyclic hemiacetal structure and an acyclic aldehyde structure exist in an equilibrium state in an aqueous solution or the like.
  • a hydrazide group, an oxylamino group, an amino group, a semithiocarbazide group, and derivatives thereof are preferable, and a hydrazide group or an oxylamino group is more preferably used.
  • the oxime bond generated by the reaction between the oxylamino group and the aldehyde group and the hydrazone bond generated by the reaction between the hydrazide group and the aldehyde group are easily cleaved by acid treatment or the like. Therefore, after the sugar chain is captured by the capture carrier, the sugar chain can be easily separated from the capture carrier.
  • amino groups are often used to capture and support physiologically active substances, but bonds (Schiff bases) produced by the reaction of amino groups and aldehyde groups are weak in binding force, so reducing agents are used. Secondary processing was required. For this reason, amino groups are not preferred for capturing sugar chains.
  • polymer particles are preferably solid particles or gel particles having a functional group that specifically reacts with an aldehyde group of a sugar chain on at least a part of the surface.
  • the particles can be easily recovered using the well 101 provided in the multiwell filter plate 100 after capturing the sugar chains in the polymer particles.
  • Examples of the polymer constituting such polymer particles include those represented by the following general formula (1).
  • the polymer particles 20 are dispersed in pure water 21 to obtain a particle dispersion 22 in which the polymer particles are dispersed.
  • the shape of the polymer particle 20 is not particularly limited, but for example, a spherical shape or a similar shape is preferable.
  • the average particle size is preferably about 0.05 to 1000 ⁇ m, more preferably about 0.05 to 200 ⁇ m, still more preferably about 0.1 to 200 ⁇ m, and most preferably 0.1 to 100 ⁇ m. Set to degree. If the average particle size is less than the lower limit, it may be difficult to collect the polymer particles 20 by centrifugation or filtration. On the other hand, when the average particle diameter exceeds the upper limit, the contact area between the polymer particles 20 and a sample solution described later decreases, and the sugar chain capture efficiency may be reduced.
  • the multiwell filter plate 100 is inserted into the recess 405 of the first support base 400, and the adjustment plate is further inserted into the recess 505 of the second support base 500. 600 and the tray 300 are inserted.
  • the first support base 400 is placed on the second support base 500. That is, in this step, the second usage method of the purification apparatus 1 is applied.
  • the pure water 21 in the particle dispersion liquid 22 passes through each filter 105.
  • the polymer particle 20 cannot pass through each filter 105. Therefore, the pure water 21 that has passed through each filter 105 is selectively supplied into the tray 300 located below the multiwell filter plate 100 through the through hole 104. As a result, as shown in FIG. 4C, the polymer particles 20 remain alone in each well 101 of the multiwell filter plate 100.
  • the solution containing the sugar chain obtained in the step [3] (hereinafter referred to as “sugar chain-containing solution 23”) is polymerized. 20 is supplied into each well 101 of the multi-well filter plate 100 containing the same.
  • the pH of the reaction solution is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6.
  • the pH adjustment can be performed, for example, by adding various buffers or organic solvents to the sugar chain-containing seats 23 of each well 101 after the step [4-3].
  • the temperature of the reaction solution at the time of sugar chain capture is preferably kept in a temperature range of about 4 to 100 ° C., more preferably about 20 to 90 ° C., further preferably about 30 to 80 ° C., and most preferably about 40 to 80 ° C. Set to sag.
  • reaction time that is, the time until the solution (sugar chain-containing solution 23) is dried is usually about 0.1 to 3 hours, preferably 0.6 to 2 hours, when set in such a temperature range. Set to degree.
  • the sugar chain is surely captured on the polymer particle 20.
  • the reaction rate of the polymer particle 20 and the sugar chain can be reliably improved by heating the sugar chain-containing liquid 23 until the sugar chain-containing liquid 23 is dried as in the present embodiment.
  • the method for heating the sugar chain-containing liquid 23 is not particularly limited.
  • the entire purification apparatus 1 may be heated, or the multiwell filter plate 100 may be selectively heated. Also good.
  • the purification apparatus 1 including the multi-well filter plate 100 As described above, by using the purification apparatus 1 including the multi-well filter plate 100, the reaction of the supplied liquid can be advanced in each well 101 when the multi-well filter plate 100 is allowed to stand. Furthermore, by aspirating the multi-well filter plate 100 using the purification apparatus 1, it is possible to easily separate the fixed component and the liquid component contained in the liquid supplied to each well 101.
  • substances other than the sugar chain captured by the capture carrier are removed (third step).
  • the polymer particle 20 is used as the capture carrier as described above, the substance other than the sugar chain captured (bound) by the polymer particle 20 is not captured (bound) by the polymer particle 20, for example.
  • impurities proteins, lipids, etc.
  • other than sugar chains adsorbed nonspecifically on the surface of the polymer particles 20 can be mentioned.
  • the target sugar chain is bonded to the polymer particle 20 and a substance other than the sugar chain is supported by adsorption or the like. That is, a capture carrier having the target sugar chain and unnecessary substances can be obtained. Therefore, in this step [5], these substances are removed by washing.
  • cleaning substance a substance other than the sugar chain captured by the polymer particles 20 using the well 101 provided in the multiwell filter plate 100 (hereinafter, this substance may be referred to as “cleaning substance”). .) Will be described.
  • a washing solution is applied to the polymer particles 20 dried in each well 101 of the multiwell filter plate 100 obtained in the step [4-4].
  • Add 24 Although it does not specifically limit as the washing
  • the purification apparatus 1 is kept in the state described in the above step [4-2], that is, the suction pump of the purification apparatus 1 is applied by applying the second usage method of the purification apparatus 1. Is activated. As a result, the internal space formed by the multi-well filter plate 100, the first support base 400, and the second support base 500 is set to a negative pressure, and the cleaning liquid 24 in each well 101 is sucked (FIG. 5 ( See b).).
  • the cleaning liquid 24 passes through each filter 105.
  • the cleaning liquid 24 can be selectively removed from the multiwell filter plate 100 to the tray 300 while the polymer particles 20 remain on the multiwell filter plate 100. . Therefore, the cleaning substance dissolved in the cleaning liquid 24 can also be removed.
  • the cleaning substance is placed in the tray 300 in a state where the cleaning substance is dissolved in the cleaning liquid 24. Can be separated. Therefore, it is possible to reliably remove the cleaning substance from the polymer particles 20 in which the sugar chains are captured.
  • 24 is supplied to the polymer particles 20 in each well 101, and then a pressure difference is generated between the upper and lower sides of each well 101 by setting the lower side of each filter 105 to a negative pressure.
  • the cleaning liquid 24 and the polymer particles 20 are separated by each filter 105.
  • the polymer particles 20 are sufficiently washed with water or a buffer solution as the washing solution 24, and then the polymer particles 20 are washed with the washing solution 24 of an organic solvent, and the washing with the washing solution 24 is performed as necessary. It is preferable that the polymer particles 20 be washed repeatedly with an organic solvent washing solution 24 lastly. Thereby, it becomes possible to more reliably remove the cleaning substance, in particular, impurities adsorbed nonspecifically on the surface of the polymer particle 20.
  • the functional group included in the capture carrier is deactivated.
  • the functional group (functional group that reacts specifically with the aldehyde group of the sugar chain) provided in the capture carrier, which was not used for capturing the sugar chain in the step [4]
  • the functional group is deactivated.
  • the sugar chain bound to the capture carrier polymer particle 20
  • the sugar chain is reliably prevented from being captured again by the capture carrier. Can do.
  • the deactivation of the functional group provided in the capture carrier can be performed, for example, by bringing a deactivation liquid having a function of deactivating the functional group into contact with the capture carrier. Further, the contact of the deactivation liquid with the capture carrier may be performed by using the deactivation liquid instead of the cleaning liquid 24 in the washing operation constituted by the steps [5-1] and [5-2]. The step [5-1] and the step [5-2] may be performed.
  • the deactivation liquid is not particularly limited, but when the functional group is a hydrazide group, for example, acid anhydrides such as acetic anhydride and succinic anhydride can be mentioned. Thereby, a functional group can be deactivated easily.
  • a labeling reagent including a labeling substance such as a fluorescent substance, a light absorbing substance and a radioactive substance is preferably used.
  • a labeling substance such as a fluorescent substance, a light absorbing substance and a radioactive substance
  • the amount of compound A added to each well 101 of the multiwell filter plate 100 is preferably excessive with respect to the polymer particles 20 in which the sugar chains are captured. As a result, the substitution rate of compound A with respect to the sugar chain in the next step [7-2] can be improved.
  • the amount of compound A added is preferably 1.5 times or more, more preferably 3 times or more, more preferably 3 times or more the amount of the functional group specifically reacting with the sugar chain of the polymer particle 20.
  • the amount is preferably 5 times or more, and most preferably 10 times or more.
  • the pH of the reaction solution is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6.
  • the pH adjustment can be performed, for example, by adding various buffer solutions to the compound-containing solution 25 in each well 101 after the step [7-1].
  • the temperature of the reaction solution at the time of labeling is preferably kept in a temperature range of about 4 to 100 ° C., more preferably about 20 to 90 ° C., further preferably about 30 to 80 ° C., and most preferably about 40 to 80 ° C.
  • reaction time that is, the time until the solution (compound-containing liquid 25) is dried is usually about 0.1 to 3 hours, preferably about 0.6 to 2 hours, when set in such a temperature range. Set to By performing labeling under such conditions, the sugar chain is surely labeled with Compound A.
  • carbohydrate and the compound A can be aimed at reliably by heating the compound containing liquid 25 until the compound containing liquid 25 dries like this embodiment.
  • the sugar chain is labeled with the compound A.
  • a compound having an aminooxy group or a hydrazide group is preferably used as the compound A.
  • N-aminooxyacetyl-tryptophanyl (arginine methyl ester) represented by the following chemical formula (3) is particularly preferably used as the compound A.
  • the fluorescent substance comprised with an aromatic amine other than the said compound can be used.
  • an aromatic amine used as the compound A, the captured sugar chain is first separated from the polymer particle 20 and re-released, and then labeled with the compound A.
  • the pH of the reaction solution is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6.
  • This pH adjustment is performed by adding the sugar chain free solution into each well 101 in the above step [7-1 '], and various buffer solutions are used as the sugar chain free solution.
  • the temperature of the reaction solution at the time of sugar chain release is preferably kept in the temperature range of about 4 to 100 ° C, more preferably about 25 to 90 ° C, still more preferably about 30 to 80 ° C, and most preferably about 60 to 80 ° C. Set to sag.
  • reaction time that is, the time until the solution (sugar chain free solution) is dried is usually about 0.1 to 3 hours, preferably about 0.6 to 2 hours, when set in such a temperature range.
  • the sugar chain free solution is heated until the sugar chain free solution is dried, so that the sugar chain release rate can be reliably improved.
  • the compound-containing liquid 25 containing an aromatic amine as the compound A is added to each of the multiwell filter plates 100 in which the polymer particles 20 and sugar chains released from the polymer particles 20 are stored. Add into well 101.
  • the aromatic amine is not particularly limited, and examples thereof include 2-aminobenzoamide, 2-aminobenzoic acid, 8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate, 8-aminophenylene-1,3,6-trisulfonate, 2-Amino9 (10H) -acridone, 5-Aminofluorescein, dansylethylenediamine, 7-Amino-4-methylcoumarin, 3-Aminobenzoic acid, 7-Amino-1-naphthol, 3- (Acetylamino) -6-acidolamino-6-acidolamino-6-acidolamino Of these, 2-aminobenzoamide or 2-aminobenzoic acid is preferable. These compounds are preferably used because of their availability as reagents and the convenience of the reaction.
  • the concentration of the aromatic amine in the solution in each well 101 after addition of the compound-containing solution 25, that is, the solution containing the re-released sugar chain is preferably 0.5 mol / L or more, more preferably It is set to 1.4 mol / L or more.
  • concentration of the aromatic amine is 3 mol / L or more, it may be difficult to remove the aromatic amine (compound A) that has not been used in the reaction in the subsequent step [8]. Therefore, the most preferable concentration of the aromatic amine is set to 1.4 mol / L or more and 3 mol / L or less.
  • the liquid amount of the compound-containing liquid 25 when the liquid amount of the compound-containing liquid 25 is defined by the polymer particles 20 accommodated in each well 101, the liquid amount is usually a liquid that can be immersed in the polymer particles 20.
  • the amount for example, about 50 ⁇ L is set for 5 mg of polymer particles 20.
  • the liquid volume may exceed 100 ⁇ L, but if it exceeds a certain volume, it is difficult to remove the aromatic amine (compound A) that has not been used in the sugar chain labeling reaction in the subsequent step [8]. There is a risk of becoming. Therefore, the most preferable amount of liquid is set between 100 ⁇ L and 200 ⁇ L.
  • the compound-containing liquid 25 is heated to keep the compound-containing liquid 25 in a certain temperature range. Thereby, the sugar chain re-released from the polymer particle 20 reacts with the compound A, and as a result, the sugar chain is labeled with the compound A.
  • the pH of the reaction solution (compound-containing solution 25) at this time is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and further preferably 2 to 6.
  • the temperature of the reaction solution at the time of labeling is preferably set so as to be maintained in a temperature range of about 0 to 100 ° C., more preferably about 4 to 95 ° C., and still more preferably about 30 to 90 ° C.
  • the reaction time is usually set to about 0.1 to 20 hours, preferably about 0.6 to 12 hours when set in such a temperature range. More specifically, when 2-aminobenzamide is used as the aromatic amine, the reaction solution (compound-containing solution 25) is heated in the temperature range of 30 to 70 ° C. and reacted for about 1 to 10 hours. By performing labeling under such conditions, the sugar chain is surely labeled with Compound A.
  • the sugar chain is labeled with compound A (labeling reagent), whereby the labeling efficiency of the sugar chain with compound A can be further improved. Furthermore, in this step, when it is not necessary to label the sugar chain, substitution of the sugar chain with Compound A can be omitted.
  • the sugar chain labeled with Compound A (hereinafter sometimes referred to as “labeled sugar chain”) is purified (fifth step).
  • labeled sugar chain is obtained by re-releasing the sugar chain captured by the polymer particle 20 as described above
  • the multiwell filter plate 100 Examples of the substance contained in each well 101 include polymer particles 20 from which sugar chains are released and compound A that has not been used for labeling sugar chains (hereinafter also referred to as “unused compound A”). It is done.
  • the labeled sugar chain is purified by removing the polymer particles 20 and the unused compound A.
  • the case where the labeled sugar chain is purified using the well 101 provided in the multi-well filter plate 100 will be described.
  • the dried labeled sugar chains and polymer particles 20 obtained in the step [7-2] were stored in each well 101.
  • the multiwell filter plate 100 is inserted into the recess 405 of the first support base 400, and the adjustment plate 600 and the microwell plate 200 are inserted into the recess 505 of the second support base 500.
  • the first support base 400 is placed on the second support base 500. That is, in this step, the first usage method of the purification apparatus 1 is applied.
  • the lysis solution 26 is added into each well 101 provided in the multi-well filter plate 100.
  • the solution 26 is not particularly limited as long as it is a solution capable of dissolving the labeled sugar chain, and examples thereof include water, various buffer solutions, and various organic solvents.
  • the polymer particles 20 are not dried by heating the compound-containing solution 25 in the step [7-2], the addition of the solution 26 into each well 101 in the step [8-1]. Can be omitted.
  • the solution 26 permeates each filter 105.
  • the polymer particles 20 remain in each well 101 of the multi-well filter plate 100.
  • the lysate 26 is selectively stored in each well 201 provided in the microwell plate 200 at a position corresponding to each well 101 from each well 101 of the multiwell filter plate 100. Therefore, the labeled sugar chain dissolved in the dissolving solution 26 also moves to each well 201 of the microwell plate 200. As a result, the labeled sugar chain and the polymer particle 20 are separated.
  • step [8-2] the lysate 26 is supplied into each well 101 using the multi-well filter plate 100 having a plurality of wells 101 including the filter 105, and then the negative pressure is applied to the lower side of each filter 105 As a result, a pressure difference is generated above and below each well 101, and as a result, the labeled sugar chain and the polymer particle 20 are separated.
  • the unused compound A also usually shows solubility in the solution 26, it moves to the well 201 side of the microwell plate 200 in a state dissolved in the solution 26.
  • the well forming portion 202 of the microwell plate 200 is set so that it can be inserted into the opening 402 of the first support base 400. ing. Therefore, the separation distance between the upper surface of the well forming portion 202 and the bottom surface of the multiwell filter plate 100 (the lower surface of the bottom portion 103) can be set small. Thereby, even if the solution 26 that has passed through the through-holes 104 scatters, the solution 26 can be supplied into each well 201 of the microwell plate 200 corresponding to each well 101 with high efficiency.
  • such a separation distance is preferably set to 10 mm or less, more preferably 0.5 mm to 10 mm, and further preferably 0.5 mm to 3 mm. By setting the separation distance within such a range, the effect can be exhibited more remarkably.
  • (Multiwell silica gel plate) 100 ′ is prepared. Then, the multiwell filter plate 100 ′ is inserted into the recess 405 of the first support base 400, and the adjusting plate 600 and the tray 300 are inserted into the recess 505 of the second support base 500. The first support base 400 is placed on the support base 500.
  • the lysate 26 containing labeled sugar chains separated in each well 201 of the microwell plate 200 is treated with a non-aqueous solution such as acetonitrile. Dilute with solvent and feed into each well 101 with silica gel 106 of multiwell filter plate 100 ′.
  • each solution 106 diluted with a nonaqueous solvent such as acetonitrile permeates each silica gel 106, the labeled sugar chain and the unused compound A contained in the solution 26 are adsorbed on each silica gel.
  • a nonaqueous solvent such as acetonitrile is supplied into each well 101 of the multiwell filter plate 100 ′ to wash each silica gel 106. .
  • the adsorptive power to the silica gel 106 is higher in the labeled sugar chain than in the unused compound A. Therefore, at least a part of the unused compound A can be removed from the silica gel 106 by supplying the nonaqueous solvent into each well 101 and washing each silica gel 106.
  • the microwell plate 200 is inserted in the recess 505 of the second support base 500 in place of the tray 300, and in this state, the second support The first support base 400 is placed on the base 500.
  • each silica gel 106 is permeated.
  • the labeled sugar chain dissolved in the water 27 is purified (separated) in each well 201 of the microwell plate 200.
  • the silica gel 106 is washed with a non-aqueous solvent, and the unused compound A is removed from the silica gel 106 in advance. Therefore, mixing (mixing) of the unused compound A into the water 27 is prevented or suppressed accurately.
  • the labeled sugar chain was purified using the multi-well filter plate 100 ′ with the protruding portion 107 formed.
  • the labeled sugar chain can be purified in the same manner as described above also by the multiwell filter plate 100 ′ in which the formation of the protruding portion 107 is omitted.
  • the labeled sugar chain is purified using the microwell plate 200 in which the upper surface of the well forming portion 202 protrudes from the upper surface of the frame portion 204.
  • the upper surface of the well forming portion 202 does not need to protrude from the upper surface of the frame portion 204. That is, the labeled sugar chain can be purified in the same manner as described above using a microwell plate in which a continuous surface (flat surface) that is continuous between the upper surface of the well forming portion 202 and the upper surface of the frame portion 204 is formed. .
  • any compound that has higher adsorption power to the labeled sugar chain than the unused compound A can be used in place of the silica gel 106.
  • An example of such a compound is graphite carbon.
  • the labeled sugar for the silica gel 106 is used. Based on the difference in adsorption force between the chain and the unused compound A, the labeled sugar chain is separated from the unused compound A.
  • the sugar chain labeled with the compound A is purified using the purification apparatus 1.
  • the step [6] may be omitted.
  • the step [8-3] may be omitted.
  • the sugar chain labeled with Compound A can be analyzed by a technique such as mass spectrometry represented by MALDI-TOF MS, and high performance liquid chromatography (HPLC).
  • mass spectrometry represented by MALDI-TOF MS
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • sugar chains can be separated and purified with excellent accuracy by simple operations. Furthermore, since the processing solutions supplied to the plurality of wells can be processed at once, a large amount of sugar chains can be purified by a single purification process.
  • each part of the purification apparatus used in the method for purifying a sugar chain of the present invention can be replaced with an arbitrary one that can exhibit the same function, or an arbitrary configuration can be added. it can.
  • the present invention is not limited to this, and the permeation of the liquid in the filter may be performed by the centrifugal force applied to the multiwell filter plate.
  • the present invention provides a first step of preparing a solution containing a sugar chain, contacting the solution with a capture carrier that specifically binds to the sugar chain, and the sugar chain bound to the capture carrier and the bound sugar A second step of obtaining the capture carrier having a substance other than a chain; a third step of removing the substance from the capture carrier; and the sugar chains bound to the capture carrier were re-released from the capture carrier.
  • a fourth step of labeling the re-released sugar chain with a labeling reagent and a fifth step of separating and purifying the labeled sugar chain and the capture carrier
  • a multi-well filter plate having a plurality of wells with filters is used, and the capture is carried in each well of the multi-well filter plate containing the capture carrier having the sugar chain and the substance.

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Abstract

　本発明は、糖鎖を含有する溶液を用意する第１の工程と、溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、これに結合した糖鎖および結合した糖鎖以外の物質を有する捕捉担体を得る第２の工程と、物質を捕捉担体から除去する第３の工程と、捕捉担体に結合した糖鎖を捕捉担体から再遊離させた後、再遊離した糖鎖をラベル化試薬でラベル化する第４の工程と、ラベル化された糖鎖と捕捉担体とを分離して精製する第５の工程とを有し、第３の工程において、フィルターを備えるウェルを複数有するマルチウェルフィルタープレートが用いられ、糖鎖および物質を有する捕捉担体を収納したマルチウェルフィルタープレートの各ウェル内に、捕捉担体から物質を除去する洗浄液を供給した後、各ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、各フィルターにより洗浄液と捕捉担体とを分離する。これにより、簡単な作業でかつ多量に優れた精度で糖鎖を分離精製することができる。

Description

糖鎖の精製方法
　本発明は、糖タンパク質が有する糖鎖の精製方法に関する。
　糖鎖とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸等の単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に複数結合した分子の総称である。
　糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能に関与する物質である。糖鎖は、生体内でタンパク質や脂質等に結合した複合糖質として存在することが多く、生体内の重要な構成成分の一つである。生体内の糖鎖は、細胞間情報伝達、タンパク質の機能や相互作用の調整等に深く関わっていることが明らかになりつつある。
　糖鎖を有する生体高分子としては、例えば、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、細胞の増殖、細胞の接着、細胞の移動等に影響を与える糖脂質、および細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの高分子の糖鎖が、互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害し合いながら、高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。さらに、このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、および細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる（非特許文献１）。
　特に細胞表面に存在する糖鎖は、様々な生体反応の足場として重要な役割をしている事が明らかとなってきた。例えば、糖鎖は、レセプターとの相互作用異常による疾病の発生、あるいはエイズウイルスやインフルエンザウイルス等の感染、病原性大腸菌Ｏ１５７の毒素やコレラ毒素の細胞への侵入に関わるとされている。また、ある種の癌細胞では、特異的な糖鎖が細胞表面に現れる。このように、細胞表面の糖鎖は、細胞に個性をあたえる重要な分子とされている。
　これら疾病の発生などの解析のため、糖鎖構造解析の技術が開発されている。これらの技術は、複合糖質からの糖鎖の切り出し、糖鎖の分離精製、糖鎖の標識化等の工程を組み合わせたものである。しかしながら、これらの工程はきわめて煩雑である。
　さらに、糖鎖の分離精製には、例えば、イオン交換樹脂を用いる方法、逆相クロマトグラフィ、活性炭を用いる方法、ゲル濾過クロマトグラフィ等の手法が用いられる。しかしながら、これらの分離手法は、糖を特異的に認識する方法ではないので、分離された糖鎖への夾雑物（ペプチド、タンパク質等）の混入が避けられない。また、糖鎖の構造によって、糖鎖の回収率に差異が生じることが多い。
　また、クロマトグラフィで糖鎖を高精度に分離する場合には、糖鎖にピリジルアミノ化等の蛍光標識を施す必要があり、煩雑な操作が必要となる。そして、蛍光標識した糖鎖を分析するには、標識後の反応液中より未反応の２－アミノピリジン等の夾雑物を除き、この標識化糖鎖を精製することが必要である。
　一般には、標識化糖鎖と夾雑物の分子量の差を利用してゲルろ過を行い、標識化糖鎖から夾雑物を除去する。しかしながら、この方法は器具を多く用いる点と、操作に多くの時間を要する点から、多数の試料を短時間に処理するのは困難である。
　また、簡易な方法として共沸により標識化糖鎖から夾雑物を留去する方法も試みられているが、十分に夾雑物を除去するのは難しい。
　さらに、糖鎖構造と各種疾患の関係を調べるためには、その関係の統計的処理ができるように、多数の検体の糖鎖構造を調べる必要がある。
　上述したような従来法では、糖鎖を分離するために、煩雑な工程を経る必要があり、膨大なコストと時間が必要となる。そのため、簡単な作業でかつ多量に優れた精度で糖鎖を分離精製する手段が求められていた。
　さらに、糖鎖に蛍光標識を施す方法は、種々開発されている（例えば、特許文献１、２、３）。しかしながら、その標識化効率は１００％ではなく、１つのサンプルに、標識された糖鎖と、標識されていない糖鎖とが混在していた。この状況は、高速液体クロマトグラフィ(ＨＰＬＣ)や、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）を用いて糖鎖を蛍光検出している際には大きな問題とならない。しかしながら、質量分析法により糖鎖を分析する際に、マススペクトルやマスクロマトグラムのピークが複雑化するという問題点があった。また、糖鎖への標識化効率が悪い場合、ＨＰＬＣやＣＥによる分析においても、糖鎖を検出する感度が低下するという問題が生じる可能性があった。
特開平７－２０１３１号公報 特開２００６－０９８３６７号公報 特開２００８－３０９５０１号公報
糖鎖生物学入門 化学同人 ２００５年１１月１日発行 第１版
　本発明の目的は、簡単な作業でかつ多量に優れた精度で糖鎖を多検体同時に分離精製することができる糖鎖の精製方法を提供することにある。
　このような目的は、下記（１）～（１２）に記載の本発明により達成される。
　（１）糖鎖を含有する溶液を用意する第１の工程と、
　前記溶液を前記糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、これに結合した前記糖鎖および該結合した糖鎖以外の物質を有する前記捕捉担体を得る第２の工程と、
　前記物質を前記捕捉担体から除去する第３の工程と、
　前記捕捉担体に結合した前記糖鎖を前記捕捉担体から再遊離させた後、該再遊離した糖鎖をラベル化試薬でラベル化する第４の工程と、
　前記ラベル化された糖鎖と前記捕捉担体とを分離して精製する第５の工程とを有する糖鎖の精製方法であって、
　前記第３の工程において、フィルターを備えるウェルを複数有するマルチウェルフィルタープレートが用いられ、前記糖鎖および前記物質を有する前記捕捉担体を収納した前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に、前記捕捉担体から前記物質を除去する洗浄液を供給した後、各前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、各前記フィルターにより前記洗浄液と前記捕捉担体とを分離することを特徴とする糖鎖の精製方法。
　（２）前記第３の工程において、各前記フィルターの下側を負圧にすることで、各前記フィルターの下側に、前記洗浄液を透過させる上記（１）に記載の糖鎖の精製方法。
　（３）前記第５の工程において、前記マルチウェルフィルタープレートが用いられ、前記捕捉担体および前記ラベル化された糖鎖を収納した前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、各前記フィルターにより、前記ラベル化された糖鎖と前記捕捉担体とを分離する上記（１）に記載の糖鎖の精製方法。
　（４）前記第５の工程において、各前記フィルターの下側を負圧にすることで、各前記フィルターの下側に、前記ラベル化された糖鎖を透過させる上記（３）に記載の糖鎖の精製方法。
　（５）前記マルチウェルフィルタープレートの下側に、複数のウェルを有するマイクロウェルプレートが配置され、前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェルに対応する、前記マイクロウェルプレートの各前記ウェルに、前記ラベル化された糖鎖が選択的に供給される上記（４）に記載の糖鎖の精製方法。
　（６）前記マルチウェルフィルタープレートの底面と、前記マイクロウェルプレートの上面との離間距離は、１０ｍｍ以下である上記（５）に記載の糖鎖の精製方法。
　（７）前記ラベル化試薬は、芳香族アミンで構成される蛍光物質である上記（１）に記載の糖鎖の精製方法。
　（８）前記蛍光物質は、２－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、８－Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ－１，３，６－ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、８－Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１，３，６－ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ、２－Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）－ａｃｒｉｄｏｎｅ、５－Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、７－Ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、３－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、７－Ａｍｉｎｏ－１－ｎａｐｈｔｈｏｌ、３－（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－６－ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅから選ばれる少なくとも１種である上記（７）に記載の糖鎖の精製方法。
　（９）前記第４の工程において、前記再遊離した糖鎖の前記ラベル化試薬によるラベル化は、少なくとも前記再遊離した糖鎖および前記蛍光物質を含む溶液中で行われ、
　該溶液における前記蛍光物質の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上である上記（７）に記載の糖鎖の精製方法。
　（１０）前記第５の工程において、前記ラベル化された糖鎖と前記捕捉担体とを分離した後、さらに、前記ラベル化された糖鎖を、ラベル化に使用されなかった前記ラベル化試薬から分離する上記（１）に記載の糖鎖の精製方法。
　（１１）前記第５の工程において、シリカゲルを備えるウェルを複数有するマルチウェルシリカゲルプレートが用いられ、該マルチウェルシリカゲルプレートの各前記ウェル内で、前記シリカゲルに対する前記ラベル化された糖鎖と前記ラベル化試薬との吸着力の差に基づいて、前記ラベル化された糖鎖を、ラベル化に使用されなかった前記ラベル化試薬から分離する上記（１０）に記載の糖鎖の精製方法。
　（１２）前記捕捉担体は、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基を有するポリマー粒子である上記（１）に記載の糖鎖の精製方法。
　本発明によれば、簡単な作業で優れた精度で糖鎖を分離精製することができる。さらに、複数のウェルに供給された処理液を一括して処理することができるため、一度の精製処理で、多量（複数種）の糖鎖を精製することができるようになる。
図１は、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の一例を示す分解斜視図である。 図２は、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の一例を示す斜視図である。 図３は、図２に示す精製装置のＡ－Ａ線断面図である。 図４は、糖タンパク質から糖鎖を精製する本発明の糖鎖の精製方法を説明するための縦断面図である。 図５は、糖タンパク質から糖鎖を精製する本発明の糖鎖の精製方法を説明するための縦断面図である。 図６は、糖タンパク質から糖鎖を精製する本発明の糖鎖の精製方法を説明するための縦断面図である。 図７は、糖タンパク質から糖鎖を精製する本発明の糖鎖の精製方法を説明するための縦断面図である。
　以下、本発明の糖鎖の精製方法について、好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
　なお、以下では、本発明の糖鎖の精製方法の説明を行うのに先立って、まず、糖タンパク質が有する糖鎖の精製方法（本発明の糖鎖の精製方法）に用いられる精製装置の一例について説明する。
　＜精製装置＞
　図１は、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の一例を示す分解斜視図、図２は、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の一例を示す斜視図、図３は、図２に示す精製装置のＡ－Ａ線断面図（なお、図３（ａ）は、精製装置にマイクロウェルプレートを装着した場合を表し、図３（ｂ）は、精製装置にトレイを装着した場合を表す。）である。なお、説明の都合上、以下の説明では、図１～図５中の上側を「上」、下側を「下」と言う。
　図１～図３に示す精製装置１は、マルチウェルフィルタープレート１００と、このマルチウェルフィルタープレート１００を支持する第１の支持台４００と、マイクロウェルプレート２００と、トレイ３００と、これらマイクロウェルプレート２００またはトレイ３００を支持する第２の支持台５００とを有している。
　マルチウェルフィルタープレート１００は、その全体形状が平板状をなし、その厚さ方向（上下方向）に設けられた、複数（本実施形態では９６個）のウェル（穴部）１０１を備えている。
　これらのウェル１０１は、それぞれ、図３に示すように、その下側に底部１０３を備え、さらに、この底部１０３のほぼ中心に対応して当該底部１０３を貫通する貫通孔１０４が設けられている。これにより、この貫通孔１０４を介して、ウェル１０１に供給（収納）された液体が底部１０３からウェル１０１の外部へ流出され得る。
　貫通孔１０４の孔径は、好ましくは０．１ｍｍ～１ｍｍ程度、より好ましくは０．２ｍｍ～０．７ｍｍ程度に設定される。
　さらに、ウェル１０１の下側（底部１０３側）には、貫通孔１０４を塞ぐようにフィルター１０５が配置されている。このフィルター１０５と貫通孔１０４の孔径との関係により、マルチウェルフィルタープレート１００の静置時には、ウェル１０１に供給された液体が貫通孔１０４を介して、その外部へ流出することが阻害される（阻止される）。
　これに対して、後述するように、マルチウェルフィルタープレート１００を精製装置１に装着して、吸引ポンプを用いて、第２の支持台５００が有する凹部５０５内を吸引した際には、前記液体のフィルター１０５の透過（通過）が許容される。そのため、前記液体が貫通孔１０４を介して、底部１０３側からウェル１０１の外部に流出される。
　フィルター１０５の素材としては、特に限定されないが、例えば、多孔性フィルムおよび不織布等が挙げられる。また、その構成材料としては、ポリテトラフルオロエチレン、セルロースエステル、フッ化ビニリデン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびナイロン等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　なお、このフィルター１０５には親水処理が施されているのが好ましい。これにより、前記液体の透過性の向上を図ることができる。
　この親水処理は、例えば、界面活性剤、水溶性シリコン、ポリプロピレングリコール等をフィルター１０５に付与（塗布）等することにより行うことができる。
　フィルター１０５が備える細孔の孔径は、好ましくは０．１～５０μｍ程度、より好ましくは０．２～２０μｍ程度、さらに好ましくは０．４～１０μｍに設定される。これにより、前記液体に含まれる液状成分の透過は許容されるとともに、後述するようなポリマー粒子２０の透過は確実に許容されなくなる（阻止される）。
　なお、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料としては、特に限定されないが、例えば、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、その構成材料としては、ポリプロピレン、塩化ビニル、ＰＴＦＥ等であるのが好ましい。これにより、マルチウェルフィルタープレート１００の耐溶剤性や耐熱性を向上させることができる。
　第１の支持台４００は、マルチウェルフィルタープレート１００を支持するための部材である。この第１の支持台４００は、平板状をなし、その中央部で開口する開口部４０２を備える底部４０１と、底部４０１の外縁に沿って上方に突出するように設けられた上側外壁４０３と、底部４０１の外縁に沿って下方に突出するように設けられた下側外壁４０４とを有している。
　このような上側外壁４０３で取り囲まれることにより、その内側に凹部４０５が形成される。この凹部４０５内にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入することで、マルチウェルフィルタープレート１００が第１の支持台４００により支持される。
　また、底部４０１の開口部４０２の縁部に沿って溝が設けられている。この溝に対応するようにパッキン（シール部材）４０７が配置されている。これにより、凹部４０５内にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入した際に、開口部４０２と精製装置１の外部との連通が許容されなくなる（遮断される）。
　なお、上側外壁４０３は、対向する２つの長辺の中央部において、厚さ方向（上下方向）に直交する方向に開口部４０８を有する。これにより、凹部４０５内に挿入（載置）されたマルチウェルフィルタープレート１００の出し入れを容易に行うことができるようになる。また、マルチウェルフィルタープレート１００を凹部４０５内に挿入した際に、その上端部が凹部４０５から突出する場合には、開口部４０８の形成を省略することができる。
　さらに、下側外壁４０４で取り囲まれることにより、その内側に凹部４０６が形成される。この凹部４０６の内周面に沿って、後述する第２の支持台５００が有する突出部５０２を挿入することで、第２の支持台５００上に第１の支持台４００が固定される。
　なお、本実施形態では、上側外壁４０３の外周面と下側外壁４０４の外周面とが、一体的に形成されていることで、１つの平坦面により構成されている。
　なお、第１の支持台４００の構成材料としては、特に限定されないが、例えば、ポリカーボネート、アクリル系樹脂、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体（ＡＢＳ樹脂）のような樹脂材料、ステンレス鋼等のＦｅ系合金、ＣｕまたはＣｕ系合金、ＡｌまたはＡｌ系合金のような金属系材料、アルミナ、アパタイト、窒化アルミのようなセラミックス系材料等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　マイクロウェルプレート２００は、第２の支持台５００が備える凹部５０５内に挿入して用いられるものである。
　このマイクロウェルプレート２００は、マルチウェルフィルタープレート１００と同様に、その全体形状が平板状をなし、その厚さ方向（上下方向）に設けられた、複数（本実施形態では９６個）のウェル（穴部）２０１を備えている。
　これらのウェル２０１は、それぞれ、その下側に底部２０３を備え、この底部２０３側で貫通していない。これにより、ウェル２０１に供給（収納）された液体がその内部に貯留される。
　なお、マルチウェルフィルタープレート１００が備える各ウェル１０１と、マイクロウェルプレート２００が備える各ウェル２０１とは、プレート１００、２００同士を上下方向に重ね合わせたとき、それぞれ、上下方向に対応して配置するように設定されている。そのため、後に詳述するように、各ウェル１０１が備える貫通孔１０４を通過して底部１０３側からマルチウェルフィルタープレート１００の外部へ流出された液体は、各ウェル１０１に対応するように配置された各ウェル２０１に対して、選択的に供給されることとなる。
　また、マイクロウェルプレート２００は、複数のウェル２０１が形成されたウェル形成部２０２と、このウェル形成部２０２の周囲を取り囲むように配置されたフレーム部２０４とを有する。ウェル形成部２０２の厚さは、フレーム部２０４の厚さより厚くなっている。これにより、ウェル形成部２０２の上面は、フレーム部２０４の上面から突出する。
　このウェル形成部２０２は、その平面視形状で、第１の支持台４００の開口部４０２に挿入可能な大きさに設定されている。したがって、第２の支持台５００の凹部５０５内にマイクロウェルプレート２００を配置した状態で、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置すると、図３（ａ）に示すように、ウェル形成部２０２を、開口部４０２内に挿入させることができる。
　そのため、ウェル形成部２０２の上面と、マルチウェルフィルタープレート１００の底面（底部１０３の下面）との離間距離を小さく設定することができる。このようなことから、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１から貫通孔１０４を介して流出された液体を、このウェル１０１に対応する、マイクロウェルプレート２００のウェル２０１内に高効率に供給することができる。
　なお、マイクロウェルプレート２００の構成材料としては、例えば、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
　トレイ３００は、マイクロウェルプレート２００と同様に第２の支持台５００が備える凹部５０５内に挿入して用いられるものである。すなわち、精製装置１を用いた糖鎖の精製方法で施される処理の種類に応じて、トレイ３００またはマイクロウェルプレート２００が凹部５０５内に挿入される。
　このトレイ３００は、複数のウェル２０１が形成されたウェル形成部２０２に対応する位置に、１つの凹部３０１を備えていること以外は、上述したマイクロウェルプレート２００と同様の構成をなしている。
　トレイ３００を、このような凹部３０１を備える構成とすることで、図３（ｂ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５内にトレイ３００を配置した状態で、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置した際に、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１から貫通孔１０４を介して流出された液体を、トレイ３００の凹部３０１内に一括して貯留することができるようになる。
　なお、トレイ３００は、図１等に示すように、マイクロウェルプレート２００のフレーム部２０４に対応する位置で突出する凸部を有する。しかしながら、トレイ３００は、かかる構成に限らず、その中心部側に凹部３０１が形成されている限りにおいて、凸部の形成が省略されたものであってもよい。
　なお、トレイ３００の構成材料としては、例えば、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
　調整板６００は、トレイ３００またはマイクロウェルプレート２００に先立って、第２の支持台５００が備える凹部５０５内に挿入して用いられるものである。
　この調整板６００は、平板状をなしており、その厚さの異なるものが複数枚用意されている。
　そして、凹部５０５内に挿入するマイクロウェルプレート２００の種類に応じて、適切な厚さのものを選択することで、マイクロウェルプレート２００（ウェル形成部２０２）の上面と、マルチウェルフィルタープレート１００の底面（底部１０３の下面）との離間距離を容易に小さく設定することができるようになる。
　なお、調整板６００の構成材料としては、例えば、マルチウェルフィルタープレート１００のフィルター１０５を除く各部の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
　第２の支持台５００は、マイクロウェルプレート２００またはトレイ３００を支持するための部材であり、平板状をなす底部５０１と、底部５０１の外縁に沿って上方に突出するように設けられた外壁５０３とを有している。
　このような外壁５０３で取り囲まれることにより、その内側に凹部５０５が形成される。この凹部５０５内にマイクロウェルプレート２００またはトレイ３００を挿入することで、マイクロウェルプレート２００またはトレイ３００が第２の支持台５００により支持される。
　また、外壁５０３は、外壁５０３の内縁に沿って上方に突出する突出部５０２を有している。この突出部５０２は、第１の支持台４００が備える凹部４０６の内周面に沿って、挿入し得るように設定されている。これにより、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置した際に、突出部５０２が第１の支持台４００の凹部４０６に挿入されることで、第２の支持台５００上に第１の支持台４００が固定される。
　外壁５０３の上面には、突出部５０２を取り囲むように溝が設けられている。この溝に対応するようにパッキン（シール部材）５０７が配置されている。これにより、第２の支持台５００上に第１の支持台４００を載置した際に、支持台４００、５００同士間での外部との連通が許容されなくなる（遮断される）。
　さらに、外壁５０３は、外壁５０３の側面に、外壁５０３を貫通して凹部５０５に連通する貫通孔５０６を有している。第２の支持台５００は、この貫通孔５０６に吸引ポンプ（図示せず）を連結し得るように構成されている。そのため、かかる吸引ポンプを作動させることで、凹部５０５内を減圧することができる。
　なお、第２の支持台５００の構成材料としては、例えば、第１の支持台４００の構成材料として挙げたものと同様のものが挙げられる。
　以上のような各部材で構成される精製装置１は、図３（ａ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５にマイクロウェルプレート２００を挿入して用いる第１の使用方法と、図３（ｂ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５にトレイ３００を挿入して用いる第２の使用方法との２つの使用方法で用いられるが、以下、これらの使用方法について説明する。
　まず、第１の使用方法では、第１の支持台４００の凹部４０５にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびマイクロウェルプレート２００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する（図２、図３（ａ）参照。）。
　これにより、マルチウェルフィルタープレート１００が凹部４０５内に挿入され、マイクロウェルプレート２００が凹部５０５内に挿入される。また、マイクロウェルプレート２００のウェル形成部２０２が第１の支持台４００の開口部４０２に挿入され、さらに、第２の支持台５００の突出部５０２が第１の支持台４００の凹部４０６に挿入される。その結果、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１に対応して、マイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１が配置された状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００が固定される。
　また、かかる状態では、パッキン５０７により、支持台４００、５００同士間で、その内部と外部との連通が許容されていない（遮断されている）。また、パッキン４０７により、第１の支持台４００とマルチウェルフィルタープレート１００との間での連通が許容されていない（遮断されている）。そのため、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を、外部に対して閉鎖された閉鎖空間とすることができる。
　したがって、貫通孔５０６に連結された吸引ポンプを作動させて、凹部５０５を減圧することで、前記閉鎖空間をその外部に対して負圧とすることができる。そのため、マルチウェルフィルタープレート１００のウェル１０１内ではフィルター１０５を介して、その上下で圧力差が生じることから、この圧力差に基づいて、ウェル１０１内の液体がフィルター１０５を透過する。したがって、各ウェル１０１から貫通孔１０４を介して液体を流出させることができ、その結果、これらのウェル１０１に対応する、マイクロウェルプレート２００のウェル２０１内に選択的に液体が供給される。
　次に、第２の使用方法では、第１の支持台４００の凹部４０５にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する（図２、図３（ｂ）参照。）。
　第２の使用方法では、第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入すること以外は、第１の使用方法と同様である。
　このような第２の使用方法によっても、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を、外部に対して閉鎖された閉鎖空間とすることができる。
　したがって、第１の使用方法と同様に、貫通孔５０６に連結された吸引ポンプを作動させて、凹部５０５を減圧することで、各ウェル１０１から貫通孔１０４を介して液体を流出させることができる。その結果、各ウェル１０１から流出した液体を、マルチウェルフィルタープレート１００の下側に位置するトレイ３００が有する凹部３０１に一括して貯留することができる。
　なお、この第２の使用方法では、各ウェル１０１から流出した液体を、一括して凹部３０１に貯留すれば良いことから、凹部３０１の開口部と、貫通孔１０４との離間距離を必要以上に小さくさせる必要がない。そのため、第２の支持台５００の凹部５０５に対する調整板６００の挿入を省略するようにしてもよい。
　また、本実施形態では、精製装置１において、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１が有するフィルター１０５の下側を、その上側より負圧とすることでフィルター１０５に液体を透過させる構成とした。しかしながら、精製装置は、かかる構成に限らず、フィルター１０５の上側を、その下側より正圧とすることでフィルター１０５に液体を透過させる構成のものであってもよい。
　以上のような精製装置（マニホールド）１を用いて、例えば、以下のようにして、糖鎖を備える糖タンパク質から糖鎖を精製することができる。
　＜精製方法＞
　図４～７は、糖タンパク質から糖鎖を精製する本発明の糖鎖の精製方法を説明するための縦断面図である。また、以下の説明では、図４～７中の上側を「上」、下側を「下」という。
　なお、以下に示す糖タンパク質の精製方法では、電気泳動により分離されたゲル中の糖タンパク質から糖鎖を精製する場合について説明する。
　以下に示す糖鎖の精製方法では、［１］糖タンパク質が保持されたゲルを得る工程と、［２］ゲルを糖鎖遊離手段で処理することで糖鎖を遊離させる工程と、［３］遊離した糖鎖をゲルから溶出させて糖鎖を含有する溶液を得る工程と、［４］糖鎖を含有する溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、この捕捉担体上に糖鎖を捕捉する工程と、［５］上記捕捉担体に結合しなかった糖鎖以外の物質を除去する工程と、［６］捕捉担体が備える官能基を失活させる工程と、［７］捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離するとともに、この糖鎖を他の化合物でラベル化する工程と、［８］ラベル化された糖鎖を精製する工程とを有する。
　以下、各工程について詳述する。
　［１］まず、糖タンパク質を含有する試料を用意し、この試料に対して所定の処理を施す。これにより、糖タンパク質が保持されたゲルを得る。
　用意する糖タンパク質を含む試料としては、特に限定されないが、例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、細胞、組織等の生体試料が挙げられる。また、予め所定の方法を用いて精製された、または未精製の糖タンパク質をも用いることができる。
　なお、この試料は、脱脂、脱塩、タンパク質分画糖の方法により前処理されていてもよい。
　次いで、試料に対して、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動）や、等電点電気泳動とＳＤＳ－ＰＡＧＥを組み合わせた二次元電気泳動等の所定の処理を施す。これにより、ゲル中において試料に含まれる糖タンパク質を分離する。
　次いで、泳動後のゲルを、例えば、クーマシーブリリアントブルー等の染色剤を用いて染色する。これにより、染色された糖タンパク質が保持されたゲルを得ることができる。
　［２］次に、染色された糖タンパク質を備える電気泳動後のゲルにおいてバンドを確認し、このバンドを、刃物等を用いて切り出す。そして、これを刃物等で細片化し、染色剤を洗浄除去したのち、ゲル内に保持されている糖タンパク質から、糖鎖遊離方法を用いて糖鎖を遊離させる。
　糖鎖を遊離させる方法としては、特に限定されないが、例えば、Ｎ－グリコシダーゼまたはＯ－グリコシダーゼを用いたグリコシダーゼ処理、ヒドラジン分解、アルカリ処理によるβ脱離等の方法を用いることができる。
　なお、Ｎ型糖鎖の分析を行う場合は、糖鎖を遊離させる方法としては、Ｎ－グリコシダーゼを用いるＮ－グリコシダーゼ処理が好ましい。また、Ｎ－グリコシダーゼ処理に先立って、糖タンパク質には、トリプシンやキモトリプシン等を用いてプロテアーゼ処理を行ってもよい。
　［３］次に、糖鎖遊離処理後のゲルを取り出し、このゲルを、洗浄液を用いてリンスする。そうすることで、遊離された糖鎖をゲルから洗浄液中に溶出させる。そして、洗浄液中においてゲルを沈殿させ、上清を得た後、この上清を回収することで、糖鎖を含有する溶液を得る（第１の工程）。
　洗浄液としては、特に限定されないが、例えば、水、各種緩衝液、各種有機溶媒等が挙げられ、これらのうちの１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　なお、この溶液は、必要に応じて濃縮することで、溶液中における糖鎖の含有率を増大させるようにしてもよい。
　また、前記工程［１］～［３］における、糖タンパク質を含有する試料からの糖タンパク質の分離および糖タンパク質からの糖鎖の遊離は、電気泳動処理を施すことにより得られたゲル中から糖鎖を遊離することにより行うこととした。しかしながら、この場合に限定されず、アフィニティークロマトグラフィー処理やイオン交換クロマトグラフィ処理を前記試料に施すことにより精製された糖タンパク質から糖鎖を遊離するようにしてもよい。さらに、前記試料からの糖タンパク質の精製を省略してもよい場合には、前記試料に含まれる糖タンパク質に対して直接糖鎖を遊離させる処理を施すようにしてもよい。
　［４］次に、糖鎖を含有する溶液を糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、この捕捉担体上に糖鎖を捕捉する（第２の工程）。
　ここで、糖鎖は、生体内物質のなかで唯一、アルデヒド基をもつ物質である。すなわち、糖鎖は、水溶液等の状態で、環状のヘミアセタール型構造と、非環状型のアルデヒド型構造とが平衡で存在する物質である。
　これに対して、タンパク質、核酸および脂質等の糖鎖以外の生体内物質には、通常、アルデヒド基が含まれていない。
　このことから、アルデヒド基と特異的に反応して、安定な結合を形成する官能基を有する捕捉担体を利用すれば、糖鎖のみを選択的に捕捉することが可能である。
　アルデヒド基と特異的に反応する官能基としては、例えば、ヒドラジド基、オキシルアミノ基、アミノ基、セミチオカルバジド基およびそれらの誘導体が好ましく、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基がより好ましく用いられる。オキシルアミノ基とアルデヒド基との反応によって生じるオキシム結合、およびヒドラジド基とアルデヒド基との反応によって生じるヒドラゾン結合は、酸処理等によって容易に切断される。そのため、糖鎖を捕捉担体に捕捉させたのち、糖鎖を捕捉担体から簡単に切り離すことができる。
　なお、一般的に，生理活性物質の捕捉・担持にはアミノ基が多用されているが、アミノ基とアルデヒド基の反応によって生じる結合（シッフ塩基）は結合力が弱いため、還元剤等を用いた二次処理が必要である。このことから、アミノ基は糖鎖の捕捉には好ましくない。
　糖鎖を捕捉するための担体としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。さらに、このポリマー粒子は、少なくとも表面の一部に糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基を有した固体粒子またはゲル粒子であることが好ましい。
　ポリマー粒子が固体粒子またはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させた後に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、かかる粒子を容易に回収することができる。
　このようなポリマー粒子を構成するポリマーとしては、例えば、下記一般式（１）で表されるものが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　以下、捕捉担体としてポリマー粒子２０を用い、ポリマー粒子２０上に糖鎖を捕捉する方法について説明する。
　［４－１］まず、ポリマー粒子２０を、純水２１中に分散させて、ポリマー粒子が分散された粒子分散液２２を得る。
　このポリマー粒子２０の形状は、特に限定されないが、例えば、球状またはそれに類する形状が好ましい。
　ポリマー粒子２０が球状の場合、平均粒径は、好ましくは０．０５～１０００μｍ程度、より好ましくは０．０５～２００μｍ程度、さらに好ましくは０．１～２００μｍ程度、最も好ましくは０．１～１００μｍ程度に設定される。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子２０を遠心分離やろ過で回収することが困難となるおそれがある。また、平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子２０と、後述する試料溶液との接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下するおそれがある。
　［４－２］次に、図４（ａ）に示すように、第１の支持台４００の凹部４０５にマルチウェルフィルタープレート１００を挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入する。この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。すなわち、本工程では、精製装置１の第２の使用方法が適用される。
　そして、この状態で、前記工程［４－１］で予め調製した粒子分散液２２をマルチウェルフィルタープレート１００が備える各ウェル１０１内に供給した後、精製装置１の吸引ポンプを作動させる。これにより、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を負圧とし、各ウェル１０１内の粒子分散液２２を吸引する（図４（ｂ）参照。）。
　このとき、各ウェル１０１では、粒子分散液２２中の純水２１は各フィルター１０５を透過する。これに対して、各フィルター１０５の細孔径と、ポリマー粒子２０の粒径との関係により、ポリマー粒子２０は各フィルター１０５を透過することができない。そのため、各フィルター１０５を透過した純水２１が、貫通孔１０４を介して、マルチウェルフィルタープレート１００の下側に位置するトレイ３００内に選択的に供給される。
　その結果、図４（ｃ）に示すように、ポリマー粒子２０がマルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１内に単独で残存する。
　［４－３］次に、図４（ｄ）に示すように、前記工程［３］で得られた糖鎖を含有する溶液（以下、「糖鎖含有液２３」という。）を、ポリマー粒子２０を収納したマルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１内に供給する。
　［４－４］次に、糖鎖含有液２３を加熱することで、供給した糖鎖含有液２３が乾燥するまで、糖鎖含有液２３を一定の温度範囲に保つ（図４（ｅ）参照。）。
　これにより、ポリマー粒子２０と、糖鎖含有液２３中に含まれる糖鎖とが反応し、ポリマー粒子２０上に糖鎖が捕捉される。
　この際の反応液（糖鎖含有液２３）のｐＨは、好ましくは２～９、より好ましくは２～７であり、さらに好ましくは２～６である。なお、ｐＨ調整は、例えば、前記工程［４－３］の後に、各ウェル１０１の糖鎖含有席２３に、各種緩衝液または有機溶媒を添加することにより行うことができる。
　糖鎖捕捉時の反応液の温度は、好ましくは４～１００℃程度、より好ましくは２０～９０℃程度、さらに好ましくは３０～８０℃程度、最も好ましくは４０～８０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。
　また、反応時間、すなわち、溶液（糖鎖含有液２３）が乾燥するまでの時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１～３時間程度、好ましくは、０．６～２時間程度に設定される。
　かかる条件で、ポリマー粒子２０と糖鎖とを反応させることで、ポリマー粒子２０上に糖鎖が確実に捕捉されることとなる。
　なお、本実施形態のように、糖鎖含有液２３が乾燥するまで、糖鎖含有液２３を加熱することにより、ポリマー粒子２０と糖鎖との反応率の向上を確実に図ることができる。
　なお、糖鎖含有液２３を加熱する方法としては、特に限定されず、例えば、精製装置１の全体を加熱するようにしてもよいし、マルチウェルフィルタープレート１００を選択的に加熱するようにしてもよい。
　以上のような工程［４－１］～［４－４］を経ることで、ポリマー粒子２０上に糖鎖が捕捉される。
　なお、ポリマー粒子２０がヒドラジド基を有するものである場合、ヒドラジド基と、糖鎖が有する還元末端との間で、下記式（２）で表される反応が進行することで、ポリマー粒子２０上に糖鎖が捕捉される（ポリマー粒子２０に糖鎖が結合する）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　以上のように、マルチウェルフィルタープレート１００を備える精製装置１を用いることで、マルチウェルフィルタープレート１００の静置時には、各ウェル１０１において、供給された液体の反応を進行させることができる。さらに、精製装置１を用いてマルチウェルフィルタープレート１００を吸引することにより、各ウェル１０１に供給した液体中に含まれる固定成分と、液状成分との分離を容易に行うことができる。
　［５］次に、捕捉担体に捕捉された糖鎖以外の物質を除去する（第３の工程）。
　ここで、上記のように捕捉担体としてポリマー粒子２０を用いた場合、ポリマー粒子２０に捕捉された（結合した）糖鎖以外の物質としては、例えば、ポリマー粒子２０に捕捉（結合）されなかった糖鎖の他、ポリマー粒子２０の表面に、非特異的に吸着している糖鎖以外の夾雑物（タンパク質、脂質等）が挙げられる。
　このように、前記工程［４］において、ポリマー粒子２０には、目的の糖鎖が結合するとともに、この糖鎖以外の物質が吸着等により担持される。すなわち、目的の糖鎖および不要な物質を有する捕捉担体が得られる。
　そのため、本工程［５］では、これらの物質を洗浄することで除去する。
　以下、前記工程［４］と同様に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、ポリマー粒子２０に捕捉された糖鎖以外の物質（以下、この物質を「洗浄物質」ということもある。）を洗浄除去する場合について説明する。
　［５－１］まず、図５（ａ）に示すように、前記工程［４－４］において得られた、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１中で乾燥したポリマー粒子２０に対して、洗浄液２４を添加する。
　洗浄液２４としては、特に限定されないが、水、各種緩衝液、各種有機溶媒等が挙げられ、これらを適宜組み合わせて用いることができる。
　［５－２］次に、精製装置１を前記工程［４－２］で説明した状態を維持したまま、すなわち、精製装置１の第２の使用方法を適用して、精製装置１の吸引ポンプを作動させる。これにより、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を負圧とし、各ウェル１０１内の洗浄液２４を吸引する（図５（ｂ）参照。）。
　その結果、洗浄液２４が各フィルター１０５を透過する。これにより、図５（ｃ）に示すように、マルチウェルフィルタープレート１００にポリマー粒子２０を残存させた状態で、マルチウェルフィルタープレート１００から選択的に洗浄液２４を、トレイ３００に除去することができる。そのため、洗浄液２４中に溶解した洗浄物質も除去することができる。
　これら工程［５－１］および工程［５－２］で構成される洗浄作業を、複数回（繰り返して）行うことで、洗浄物質を洗浄液２４中に溶解させた状態で、トレイ３００に洗浄物質を分離することができる。そのため、洗浄物質を糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０から確実に除去することができる。
　すなわち、工程［５－１］および工程［５－２］において、フィルター１０５を備えるウェル１０１を複数有するマルチウェルフィルタープレート１００を用いて、ポリマー粒子２０に結合した糖鎖以外の物質を除去する洗浄液２４を、各ウェル１０１中のポリマー粒子２０に供給した後、各フィルター１０５の下側を負圧にすることで各ウェル１０１の上下で圧力差が生じる。その結果、各フィルター１０５により洗浄液２４とポリマー粒子２０とが分離されることとなる。
　なお、この場合、まず水または緩衝液を洗浄液２４として用いて十分にポリマー粒子２０を洗浄したのち、さらに有機溶媒の洗浄液２４でポリマー粒子２０を洗浄し、必要に応じてこれら洗浄液２４による洗浄を繰り返し行い、最後に有機溶媒の洗浄液２４でポリマー粒子２０を洗浄するのが好ましい。これにより、洗浄物質、特に、非特異的にポリマー粒子２０の表面に吸着する夾雑物をより確実に除去することができるようになる。
　［６］次に、捕捉担体が備える官能基を失活させる。
　本工程では、前記工程［４］において、糖鎖の捕捉に用いられなかった、捕捉担体が備える官能基（糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基）を失活させる。
　これにより、次工程［７］において、捕捉担体（ポリマー粒子２０）に結合した糖鎖を再遊離させた際に、この糖鎖が再度捕捉担体に捕捉されてしまうのを、確実に防止することができる。
　捕捉担体が備える官能基の失活は、例えば、前記官能基を失活させる機能を有する失活液を、捕捉担体に接触させることにより行うことができる。
　また、このような失活液の捕捉担体への接触は、前記工程［５－１］および前記工程［５－２］で構成される洗浄操作における洗浄液２４に代えて失活液を用い、前記工程［５－１］および前記工程［５－２］を施すようにすればよい。
　さらに、失活液としては、特に限定されないが、官能基がヒドラジド基である場合、例えば、無水酢酸、無水コハク酸等の酸無水物が挙げられる。これにより、官能基を容易に失活させることができる。
　［７］次に、捕捉担体に結合した糖鎖を再遊離させるとともに、この糖鎖を他の化合物（以下、「化合物Ａ」と言うこともある。）で置換する（第４の工程）。すなわち、化合物Ａで糖鎖をラベル化する。
　なお、この化合物Ａとしては、蛍光物質、吸光物質および放射性物質等のラベル化物質を備えるラベル化試薬が好ましく用いられる。
　以下、前記工程［４］、［５］と同様に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、化合物Ａで糖鎖をラベル化する場合について説明する。
　［７－１］まず、図５（ｄ）に示すように、化合物Ａを含有する化合物含有液２５を、糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０を収納したマルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１内に添加する。
　マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１内に添加する化合物Ａの添加量は、糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０に対して、過剰量となっているのが好ましい。これにより、次工程［７－２］における糖鎖に対する化合物Ａの置換率の向上を図ることができる。
　具体的には、化合物Ａの添加量は、ポリマー粒子２０が有する糖鎖と特異的に反応する官能基量に対して、好ましくは１．５倍量以上、より好ましくは３倍量以上、さらに好ましくは５倍量以上であり、最も好ましくは１０倍量以上に設定される。
　［７－２］次に、化合物含有液２５を加熱することで、添加した化合物含有液２５が乾燥するまで、化合物含有液２５を一定の温度範囲に保つ（図５（ｅ）参照。）。
　これにより、捕捉された糖鎖はポリマー粒子２０から切り離され、それとほぼ同時に糖鎖に化合物Ａが付加することとなる。そのため、糖鎖は化合物Ａでラベル化されることとなる。
　この際の反応液（化合物含有液２５）のｐＨは、好ましくは２～９、より好ましくは２～７であり、さらに好ましくは２～６である。なお、ｐＨ調整は、例えば、前記工程［７－１］の後に、各ウェル１０１の化合物含有液２５に、各種緩衝液を添加することにより行うことができる。
　ラベル化時の反応液の温度は、好ましくは４～１００℃程度、より好ましくは２０～９０℃程度、さらに好ましくは３０～８０℃程度、最も好ましくは４０～８０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。
　また、反応時間、すなわち、溶液（化合物含有液２５）が乾燥するまでの時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１～３時間程度、好ましくは、０．６～２時間程度に設定される。
　かかる条件で、ラベル化を行うことで、糖鎖が確実に化合物Ａによりラベル化される。
　なお、本実施形態のように、化合物含有液２５が乾燥するまで、化合物含有液２５を加熱することにより、糖鎖と化合物Ａとの反応率の向上を確実に図ることができる。
　以上のような工程［７－１］、［７－２］を経ることで、糖鎖が化合物Ａでラベル化される。
　なお、化合物Ａとしては、アミノオキシ基またはヒドラジド基を有する化合物が好ましく用いられる。ポリマー粒子２０がヒドラジド基を有するものである場合、化合物Ａとしては、特に、下記化学式（３）で表されるN-aminooxyacetyl-tryptophanyl（arginine methyl ester）が好ましく用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　また、この化合物Ａとしては、前記化合物の他、芳香族アミンで構成される蛍光物質を用いることができる。
　化合物Ａとして、このような芳香族アミンを用いた場合、捕捉された糖鎖は、まずポリマー粒子２０から切り離されて再遊離した後に、化合物Ａによりラベル化されることとなる。
　以下、化合物Ａとして芳香族アミンを用いて、糖鎖を化合物Ａでラベル化する場合について説明する。
　［７－１’］まず、糖鎖を再遊離させる糖鎖遊離液を、糖鎖が捕捉されたポリマー粒子２０を収納したマルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１内に添加する。
　［７－２’］次に、糖鎖遊離液を加熱することで、添加した糖鎖遊離液が乾燥するまで、糖鎖遊離液を一定の温度範囲に保つ。
　これにより、捕捉された糖鎖がポリマー粒子２０から切り離されることで、糖鎖は再遊離する。
　この際の反応液（糖鎖遊離液）のｐＨは、好ましくは２～９、より好ましくは２～７であり、さらに好ましくは２～６である。このｐＨ調整が、前記工程［７－１’］における糖鎖遊離液の各ウェル１０１内への添加により行われ、各種緩衝液が糖鎖遊離液として用いられる。
　糖鎖遊離時の反応液の温度は、好ましくは４～１００℃程度、より好ましくは２５～９０℃程度、さらに好ましくは３０～８０℃程度、最も好ましくは６０～８０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。
　また、反応時間、すなわち、溶液（糖鎖遊離液）が乾燥するまでの時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１～３時間程度、好ましくは、０．６～２時間程度に設定される。
　かかる条件で、糖鎖の再遊離を行うことで、糖鎖がポリマー粒子２０から確実に切り離される。
　なお、本実施形態のように、糖鎖遊離液が乾燥するまで、糖鎖遊離液を加熱することにより、糖鎖の遊離率の向上を確実に図ることができる。
　［７－３’］次に、化合物Ａとして芳香族アミンを含有する化合物含有液２５を、ポリマー粒子２０と、このポリマー粒子２０から遊離した糖鎖とが収納されたマルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１内に添加する。
　芳香族アミン（化合物Ａ）としては、特に限定されないが、例えば、２－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、８－Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ－１，３，６－ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、８－Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１，３，６－ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ、２－Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）－ａｃｒｉｄｏｎｅ、５－Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、７－Ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、３－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、７－Ａｍｉｎｏ－１－ｎａｐｈｔｈｏｌおよび３－（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－６－ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅ等が挙げられる。中でも２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅまたは２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄであるのが好ましい。これらの化合物は、試薬としての入手、反応の簡便性から好適に用いられる。
　また、芳香族アミンとして２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅまたは２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄを用いる場合、一般的な条件では、それらは０．３５ｍｏｌ／Ｌで使用される。しかしながら、本工程では、化合物含有液２５添加後の各ウェル１０１内の溶液、すなわち、再遊離した糖鎖を含む溶液における芳香族アミンの濃度は、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１．４ｍｏｌ／Ｌ以上に設定される。これにより、化合物Ａによる糖鎖の標識効率を向上させることが可能となる。ただし、芳香族アミンの濃度が３ｍｏｌ／Ｌ以上になると、後工程［８］において、反応に使用されなかった芳香族アミン（化合物Ａ）を除去するのが困難となるおそれがある。そのため、最も好ましい芳香族アミンの濃度は、１．４ｍｏｌ／Ｌ以上３ｍｏｌ／Ｌ以下に設定される。
　また、化合物含有液２５の液量に関して、各ウェル１０１内に収納されたポリマー粒子２０で化合物含有液２５の液量を規定する場合、その液量は、通常はポリマー粒子２０が浸る程度の液量、例えば、５ｍｇのポリマー粒子２０に対して５０μＬ程度に設定される。しかしながら、本実施形態では、化合物含有液２５の液量（容量）を倍量の１００μＬ程度に設定するのが好ましい。これにより、化合物Ａによる糖鎖の標識効率を向上させることが可能となる。ただし、液量は１００μＬを超えても良いが、一定量を超えると、後工程［８］において、糖鎖のラベル化反応に使用されなかった芳香族アミン（化合物Ａ）を除去するのが困難となるおそれがある。そのため、最も好まし液量は１００μＬ～２００μＬの間に設定される。
　より具体的には、芳香族アミンとして２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅを用いる場合、各ウェル１０１内に、1.4 M 2-Aminobenzamid, 1 M sodium cyanoborohydrideの濃度になるように、３０％酢酸／ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた溶液１００μＬを化合物含有液２５として添加する。
　［７－４’］次に、化合物含有液２５を加熱することで、化合物含有液２５を一定の温度範囲に保つ。
　これにより、ポリマー粒子２０から再遊離している糖鎖は化合物Ａと反応し、その結果、糖鎖は化合物Ａでラベル化されることとなる。
　この際の反応液（化合物含有液２５）のｐＨは、好ましくは２～９、より好ましくは２～７であり、さらに好ましくは２～６である。
　ラベル化時の反応液の温度は、好ましくは０～１００℃程度、より好ましくは４～９５℃程度、さらに好ましくは３０～９０℃程度の温度範囲に保たれるように設定する。
　また、反応時間は、かかる温度範囲に設定した場合、通常、０．１～２０時間程度、好ましくは、０．６～１２時間程度に設定される。
　より具体的には、芳香族アミンとして２－ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅを用いた場合、反応液（化合物含有液２５）を３０～７０℃の温度範囲で加熱して、１～１０時間程度、反応する。
　かかる条件で、ラベル化を行うことで、糖鎖が確実に化合物Ａによりラベル化される。
　なお、化合物Ａとして芳香族アミンを用いた場合、前記工程［７－２］で説明したような、化合物含有液２５の乾燥を省略することができる。
　以上のような工程［７－１’］～［７－４’］によっても、糖鎖が化合物Ａでラベル化される。
　このように、糖鎖を捕捉担体から再遊離させた後、糖鎖を化合物Ａ（ラベル化試薬）でラベル化することにより、糖鎖の化合物Ａによる標識効率をより向上させることができる。
　さらに、本工程において、糖鎖のラベル化が必要ない場合には、糖鎖の化合物Ａによる置換を省略することができる。
　［８］次に、化合物Ａでラベル化された糖鎖（以下、「ラベル化糖鎖」と言うこともある。）を精製する（第５の工程）。
　ここで、上記のようにポリマー粒子２０に捕捉された糖鎖を再遊離させることで、ラベル化糖鎖を得た場合、化合物Ａでラベル化された糖鎖以外に、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１中に含まれる物質としては、糖鎖が遊離したポリマー粒子２０および糖鎖のラベル化に使用されなかった化合物Ａ（以下、「未使用化合物Ａ」と言うこともある。）が挙げられる。
　そのため、本工程［８］では、これらポリマー粒子２０および未使用化合物Ａを除去することで、ラベル化糖鎖の精製を行う。
　以下、前記工程［４］～［７］と同様に、マルチウェルフィルタープレート１００が備えるウェル１０１を用いて、ラベル化糖鎖を精製する場合について説明する。
　［８－１］まず、図６（ａ）に示すように、前記工程［７－２］において得られた、乾燥したラベル化糖鎖と、ポリマー粒子２０とが各ウェル１０１中に収納されたマルチウェルフィルタープレート１００を第１の支持台４００の凹部４０５に挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびマイクロウェルプレート２００を挿入する。この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。すなわち、本工程では、精製装置１の第１の使用方法が適用される。
　そして、この状態で、溶解液２６をマルチウェルフィルタープレート１００が備える各ウェル１０１内に添加する。
　溶解液２６としては、ラベル化糖鎖を溶解し得る液剤であればよく、特に限定されるものではないが、水、各種緩衝液、各種有機溶媒等が挙げられる。
　なお、前記工程［７－２］における化合物含有液２５の加熱によっても、ポリマー粒子２０が乾燥していない場合には、本工程［８－１］における各ウェル１０１内への溶解液２６の添加を省略することができる。
　さらに、化合物Ａとして、芳香族アミンで構成される蛍光物質を用いた場合には、前記工程［７－１’］～［７－４’］で得られる化合物Ａでラベル化された糖鎖が乾燥していない。そのため、この場合についても、本工程［８－１］における各ウェル１０１内への溶解液２６の添加を省略することができる。
　［８－２］次に、精製装置１の吸引ポンプを作動させる。これにより、マルチウェルフィルタープレート１００と、第１の支持台４００と、第２の支持台５００とで形成される内部空間を負圧とし、各ウェル１０１内の溶解液２６を吸引する（図６（ｂ）参照。）。
　このとき、図６（ｃ）に示すように、溶解液２６が各フィルター１０５を透過する。これにより、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１にポリマー粒子２０が残存する。一方、マルチウェルフィルタープレート１００の各ウェル１０１から選択的に溶解液２６が、各ウェル１０１に対応する位置のマイクロウェルプレート２００が備える各ウェル２０１内に貯留される。そのため、この溶解液２６中に溶解したラベル化糖鎖もマイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１に移動する。その結果、ラベル化糖鎖とポリマー粒子２０とが分離される。
　すなわち、工程［８－２］において、フィルター１０５を備えるウェル１０１を複数有するマルチウェルフィルタープレート１００を用いて、溶解液２６を各ウェル１０１中に供給した後、各フィルター１０５の下側を負圧にすることで各ウェル１０１の上下で圧力差を生じさせ、その結果、ラベル化糖鎖とポリマー粒子２０とが分離される。
　なお、この際、未使用化合物Ａも、通常、溶解液２６に対して溶解性を示すため、溶解液２６に溶解した状態で、マイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１側に移動する。
　なお、精製装置１の第１の使用方法では、前述したように、マイクロウェルプレート２００のウェル形成部２０２を、第１の支持台４００の開口部４０２内に挿入させることができるように設定されている。そのため、ウェル形成部２０２の上面と、マルチウェルフィルタープレート１００の底面（底部１０３の下面）との離間距離を小さく設定することができる。これにより、貫通孔１０４を通過した溶解液２６がたとえ飛散したとしても、各ウェル１０１に対応する、マイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１内に溶解液２６を高効率に供給することができる。
　このような離間距離は、具体的には、好ましくは１０ｍｍ以下、より好ましくは０．５ｍｍ以上、１０ｍｍ以下、さらに好ましくは０．５ｍｍ以上、３ｍｍ以下に設定される。離間距離をかかる範囲内に設定することにより、前記効果をより顕著に発揮させることができる。
　［８－３］次に、フィルター１０５に代えて、シリカゲル１０６が各ウェル１０１の下側に配置され、各底部１０３の貫通孔１０４に対応する位置に突出部１０７が設けられたマルチウェルフィルタープレート（マルチウェルシリカゲルプレート）１００’を用意する。そして、このマルチウェルフィルタープレート１００’を第１の支持台４００の凹部４０５に挿入し、さらに第２の支持台５００の凹部５０５に調整板６００およびトレイ３００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。
　そして、図７（ａ）に示すように、前記工程［８－２］において、マイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１に分離された、ラベル化糖鎖を含有する溶解液２６をアセトニトリル等の非水溶媒で希釈し、マルチウェルフィルタープレート１００’のシリカゲル１０６を備える各ウェル１０１内に供給する。
　これにより、図７（ｂ）に示すように、各ウェル１０１のシリカゲル１０６を透過した溶解液２６が貫通孔１０４を介して、各ウェル１０１に対応するトレイ３００の凹部３０１に液滴として流出することとなる。
　この際、各シリカゲル１０６をアセトニトリル等の非水溶媒で希釈した溶解液２６が透過するため、溶解液２６に含まれるラベル化糖鎖と未使用化合物Ａとは、各シリカゲルに吸着する。
　［８－４］次に、図７（ｂ）の状態を維持したまま、さらに、マルチウェルフィルタープレート１００’の各ウェル１０１内にアセトニトリル等の非水溶媒を供給し、各シリカゲル１０６を洗浄する。
　ここで、シリカゲル１０６への吸着力は、未使用化合物Ａよりもラベル化糖鎖の方が高い。したがって、各ウェル１０１内に非水溶媒を供給して各シリカゲル１０６を洗浄することで、未使用化合物Ａの少なくとも一部をシリカゲル１０６から除去することができる。
　［８－５］次に、図７（ｃ）に示すように、第２の支持台５００の凹部５０５に、トレイ３００に代えてマイクロウェルプレート２００を挿入し、この状態で、第２の支持台５００上に、第１の支持台４００を載置する。
　その後、マルチウェルフィルタープレート１００’内に水２７を加え、各シリカゲル１０６を透過させる。これにより、図７（ｄ）に示すように、マイクロウェルプレート２００の各ウェル２０１に、水２７中に溶解したラベル化糖鎖が精製（分離）されることとなる。なお、本実施形態では、非水溶媒でシリカゲル１０６を洗浄して、未使用化合物Ａを予めシリカゲル１０６から除去している。そのため、水２７中への未使用化合物Ａの混在（混入）が的確に防止または抑制される。
　なお、本工程［８－３］～［８－５］では、突出部１０７が形成されたマルチウェルフィルタープレート１００’を用いて、ラベル化糖鎖を精製することとした。しかしながら、この突出部１０７の形成が省略されたマルチウェルフィルタープレート１００’によっても、前記と同様にしてラベル化糖鎖を精製することができる。
　さらに、本工程［８－３］～［８－５］では、ウェル形成部２０２の上面がフレーム部２０４の上面から突出するマイクロウェルプレート２００を用いて、ラベル化糖鎖を精製することとした。しかしながら、各ウェル２０１の開口部に各突出部１０７を挿入させることができる場合には、ウェル形成部２０２の上面がフレーム部２０４の上面から突出する必要はない。すなわち、ウェル形成部２０２の上面とフレーム部２０４の上面とで連続する連続面（平坦面）を形成しているマイクロウェルプレートによっても、前記と同様にしてラベル化糖鎖を精製することができる。
　また、シリカゲル１０６に代えて、未使用化合物Ａよりもラベル化糖鎖に対する吸着力が高い如何なる化合物も用いることができる。かかる化合物としては、例えば、グラファイトカーボン等が挙げられる。
　以上のように工程［８－３］～［８－５］において、シリカゲル１０６を備えるウェル１０１を複数有するマルチウェルフィルタープレート（マルチウェルシリカゲルプレート）１００’を用いることで、シリカゲル１０６に対するラベル化糖鎖と未使用化合物Ａとの吸着力の差に基づいて、ラベル化糖鎖が未使用化合物Ａから分離される。
　以上のような工程を経ることで、精製装置１を用いて、化合物Ａでラベル化された糖鎖が精製される。
　なお、捕捉担体の官能基を失活する必要がない場合には、前記工程［６］を省略するようにしてもよい。さらに、未使用化合物Ａを除去する必要がない場合には、前記工程［８－３］を省略するようにしてもよい。
　また、化合物Ａでラベル化された糖鎖は、MALDI-TOF MSに代表される質量分析、さらに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の手法で分析することができる。
　特に、糖鎖が前述した化学式（３）で表されるN-aminooxyacetyl-tryptophanyl(arginine methyl ester)でラベル化されている場合、MALDI-TOF MSを用いて高感度分析を行うことができる。
　このような糖鎖の精製方法によれば、簡単な作業で優れた精度で糖鎖を分離精製することができる。さらに、複数のウェルに供給された処理液を一括して処理することができるため、一度の精製処理で、多量の糖鎖を精製することができるようになる。
　以上、本発明の糖鎖の精製方法を図示の実施形態に基づいて説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。
　例えば、本発明の糖鎖の精製方法では、必要に応じて、１以上の任意の目的の工程を追加してもよい。
　また、本発明の糖鎖の精製方法に用いられる精製装置の各部の構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、または、任意の構成のものを付加することもできる。
　さらに、前記実施形態では、精製装置において、マルチウェルフィルタープレートの各ウェルが有するフィルターの下側を、その上側より負圧とすることでフィルターに液体を透過させる構成とした。しかしながら、かかる場合に限らず、フィルターにおける液体の透過は、マルチウェルフィルタープレートに付与された遠心力によって行われるようにしてもよい。
　本発明は、糖鎖を含有する溶液を用意する第１の工程と、前記溶液を前記糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、これに結合した前記糖鎖および該結合した糖鎖以外の物質を有する前記捕捉担体を得る第２の工程と、前記物質を前記捕捉担体から除去する第３の工程と、前記捕捉担体に結合した前記糖鎖を前記捕捉担体から再遊離させた後、該再遊離した糖鎖をラベル化試薬でラベル化する第４の工程と、前記ラベル化された糖鎖と前記捕捉担体とを分離して精製する第５の工程とを有し、前記第３の工程において、フィルターを備えるウェルを複数有するマルチウェルフィルタープレートが用いられ、前記糖鎖および前記物質を有する前記捕捉担体を収納した前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に、前記捕捉担体から前記物質を除去する洗浄液を供給した後、各前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、各前記フィルターにより前記洗浄液と前記捕捉担体とを分離する。これにより、簡単な作業でかつ多量に優れた精度で糖鎖を多検体同時に分離精製することができる。したがって、本発明は、産業上の利用可能性を有する。
１　　　　　　　　精製装置
２０　　　　　　　ポリマー粒子
２１　　　　　　　純水
２２　　　　　　　粒子分散液
２３　　　　　　　糖鎖含有液
２４　　　　　　　洗浄液
２５　　　　　　　化合物含有液
２６　　　　　　　溶解液
２７　　　　　　　水
１００、１００’　　マルチウェルフィルタープレート
１０１　　　　　　ウェル
１０３　　　　　　底面
１０４　　　　　　貫通孔
１０５　　　　　　フィルター
１０６　　　　　　シリカゲル
１０７　　　　　　突出部
２００　　　　　　マイクロウェルプレート
２０１　　　　　　ウェル
２０２　　　　　　ウェル形成部
２０３　　　　　　底面
２０４　　　　　　フレーム部
３００　　　　　　トレイ
３０１　　　　　　凹部
４００　　　　　　第１の支持台
４０１　　　　　　底部
４０２　　　　　　開口部
４０３　　　　　　上側外壁
４０４　　　　　　下側外壁
４０５　　　　　　凹部
４０６　　　　　　凹部
４０７　　　　　　パッキン
４０８　　　　　　開口部
５００　　　　　　第２の支持台
５０１　　　　　　底部
５０２　　　　　　突出部
５０３　　　　　　外壁
５０５　　　　　　凹部
５０６　　　　　　貫通孔
５０７　　　　　　パッキン
６００　　　　　　調整板

Claims (12)

  1. 　糖鎖を含有する溶液を用意する第１の工程と、
    　前記溶液を前記糖鎖と特異的に結合する捕捉担体に接触させて、これに結合した前記糖鎖および該結合した糖鎖以外の物質を有する前記捕捉担体を得る第２の工程と、
    　前記物質を前記捕捉担体から除去する第３の工程と、
    　前記捕捉担体に結合した前記糖鎖を前記捕捉担体から再遊離させた後、該再遊離した糖鎖をラベル化試薬でラベル化する第４の工程と、
    　前記ラベル化された糖鎖と前記捕捉担体とを分離して精製する第５の工程とを有する糖鎖の精製方法であって、
    　前記第３の工程において、フィルターを備えるウェルを複数有するマルチウェルフィルタープレートが用いられ、前記糖鎖および前記物質を有する前記捕捉担体を収納した前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェル内に、前記捕捉担体から前記物質を除去する洗浄液を供給した後、各前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、各前記フィルターにより前記洗浄液と前記捕捉担体とを分離することを特徴とする糖鎖の精製方法。
  2. 　前記第３の工程において、各前記フィルターの下側を負圧にすることで、各前記フィルターの下側に、前記洗浄液を透過させる請求項１に記載の糖鎖の精製方法。
  3. 　前記第５の工程において、前記マルチウェルフィルタープレートが用いられ、前記捕捉担体および前記ラベル化された糖鎖を収納した前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェルの上下で圧力差を生じさせることで、各前記フィルターにより、前記ラベル化された糖鎖と前記捕捉担体とを分離する請求項１に記載の糖鎖の精製方法。
  4. 　前記第５の工程において、各前記フィルターの下側を負圧にすることで、各前記フィルターの下側に、前記ラベル化された糖鎖を透過させる請求項３に記載の糖鎖の精製方法。
  5. 　前記マルチウェルフィルタープレートの下側に、複数のウェルを有するマイクロウェルプレートが配置され、前記マルチウェルフィルタープレートの各前記ウェルに対応する、前記マイクロウェルプレートの各前記ウェルに、前記ラベル化された糖鎖が選択的に供給される請求項４に記載の糖鎖の精製方法。
  6. 　前記マルチウェルフィルタープレートの底面と、前記マイクロウェルプレートの上面との離間距離は、１０ｍｍ以下である請求項５に記載の糖鎖の精製方法。
  7. 　前記ラベル化試薬は、芳香族アミンで構成される蛍光物質である請求項１に記載の糖鎖の精製方法。
  8. 　前記蛍光物質は、２－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚａｍｉｄｅ、２－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、８－Ａｍｉｎｏｐｙｒｅｎｅ－１，３，６－ｔｒｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ、８－Ａｍｉｎｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ－１，３，６－ｔｒｉｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ、２－Ａｍｉｎｏ９（１０Ｈ）－ａｃｒｉｄｏｎｅ、５－Ａｍｉｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ｄａｎｓｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ、７－Ａｍｉｎｏ－４－ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎｅ、３－Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ、７－Ａｍｉｎｏ－１－ｎａｐｈｔｈｏｌ、３－（Ａｃｅｔｙｌａｍｉｎｏ）－６－ａｍｉｎｏａｃｒｉｄｉｎｅから選ばれる少なくとも１種である請求項７に記載の糖鎖の精製方法。
  9. 　前記第４の工程において、前記再遊離した糖鎖の前記ラベル化試薬によるラベル化は、少なくとも前記再遊離した糖鎖および前記蛍光物質を含む溶液中で行われ、
    　該溶液における前記蛍光物質の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ以上である請求項７に記載の糖鎖の精製方法。
  10. 　前記第５の工程において、前記ラベル化された糖鎖と前記捕捉担体とを分離した後、さらに、前記ラベル化された糖鎖を、ラベル化に使用されなかった前記ラベル化試薬から分離する請求項１に記載の糖鎖の精製方法。
  11. 　前記第５の工程において、シリカゲルを備えるウェルを複数有するマルチウェルシリカゲルプレートが用いられ、該マルチウェルシリカゲルプレートの各前記ウェル内で、前記シリカゲルに対する前記ラベル化された糖鎖と前記ラベル化試薬との吸着力の差に基づいて、前記ラベル化された糖鎖を、ラベル化に使用されなかった前記ラベル化試薬から分離する請求項１０に記載の糖鎖の精製方法。
  12. 　前記捕捉担体は、ヒドラジド基またはオキシルアミノ基を有するポリマー粒子である請求項１に記載の糖鎖の精製方法。
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