WO2012016753A1

WO2012016753A1 - Autofokussystem

Info

Publication number: WO2012016753A1
Application number: PCT/EP2011/060081
Authority: WO
Inventors: Markus Sticker
Original assignee: Carl Zeiss Microimaging Gmbh
Priority date: 2010-08-03
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2012-02-09
Also published as: EP2601551A1; DE102010033249A1

Abstract

Mikroskopische Einrichtung zur Abbildung einer Probensubstanz (1), umfassend: - ein mikroskopisches Abbildungssystem, und - Mittel zur automatischen Verschiebung der Fokusebene entlang der optischen Achse (4) des Abbildungssystems in eine Z-Position, in der sich die abzubildende Probensubstanz (1) befindet, gekennzeichnet durch - einen von einem Interferometer ausgehenden Probenstrahl (10), der in Z-Richtung durch die Probensubstanz (1) hindurch gerichtet ist, wobei die durch Interferenz des von optisch wirksamen Grenzflächen und/oder Strukturen reflektierten oder rückgestreuten Lichtes des Probenstrahles (10) mit dem Referenzstrahl des Interferometers entstehenden Interferenzsignale zur Bestimmung der Z-Positionen der Grenzflächen und/oder Strukturen der Probe vorgesehen sind, - eine Auswerteeinrichtung zur Bestimmung der Z-Position der Probensubstanz (1), - eine Verstelleinrichtung, ausgebildet zur Verschiebung der Fokusebene und der Probensubstanz (1) relativ zueinander, bis sich die Probensubstanz (1) der Fokusebene befindet, und - eine mit der Auswerteeinrichtung und der Verstelleinrichtung verbundene Ansteuereinheit zum Generieren von Stellbefehlen zur automatischen Verschiebung der Fokusebene in die bestimmte Z-Position.

Description

Titel

Autofokussystem

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Einrichtung zur Bestimmung der Z- Position in Richtung der optischen Achse eines mikroskopischen Abbildungssystems, in der sich eine abzubildende Probensubstanz befindet, sowie zur automatischen Fokussierung des Abbildungssystems auf diese Z-Position.

Stand der Technik

Mikroskopische Abbildungssysteme werden häufig dazu genutzt, eine Probensubstanz, beispielsweise einen Gewebeschnitt, der von einem Deckglas geschützt auf einem Objektträger abgelegt ist, digital aufzunehmen. Ist die laterale Ausdehnung der aufzunehmenden Proben- Substanz größer als das Bildfeld des Abbildungssystems bzw. größer als ein unmittelbar mit einer Kamera aufnehmbarer Bereich, so ist es notwendig, zunächst zeitlich nacheinander mehrere sich senkrecht zur optischen Achse des Abbildungssystems erstreckende, beispielsweise 220 μιη x 165 μιη große Bereiche einer Probensubstanz aufzunehmen. Im Stand der Technik erfolgt dies mit Hilfe eines so genannten digitalen„Slide-Scanners". Die Aufnahmen der einzelnen Bereiche werden anschließend zu einem so genannten „Tiled- Image" als Gesamtbild zusammengefügt.

Problematisch ist dabei, dass sich mit zunehmender lateraler optischer Auflösung die Tiefenschärfe des optischen Abbildungssystems verringert. Ist die Probe an einem Ort in Bezug auf einen ersten aufzunehmenden Bereich fokussiert, so ist mit hoher Wahrscheinlichkeit die Fokusposition nach Verschiebung der Probe zwecks Aufnahme eines benachbarten Bereiches eine andere, das heißt die Probe ist dort defokussiert, sofern nicht eine Anpassung der Tiefenposition bzw. eine erneute Fokussierung vorgenommen wird. Ursachen für die Änderung der Fokusposition können z.B. eine nicht-senkrechte Ausrichtung des Objektträgers zur optischen Achse, Dickenschwankungen im Objektträger oder im Deckglas, Durchbiegungen des Objektträgers oder auch Dickenschwankungen des Einbettmediums zwischen Deckglas und Probensubstanz sein. Möglich ist auch, dass der Abstand der aufzunehmenden Probensubstanz über dem Objektträger bei lateraler Verschiebung variiert.

Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, die z-Position der Probe während des Aufnahme- Scans von Bereich zu Bereich anzupassen, um die Probe in den Fokus zu bringen.

Es ist bekannt, zu diesem Zweck vor dem Scannen eine auf die Probe bezogene, so genannte„Fokus-Map" zu erzeugen und dann während des Scannens die Probe oder das Objektiv unter Berücksichtigung der Anweisungen dieser„Fokus-Map" in axialer Richtung zu verfahren, um die Fokussierung beizubehalten.

Zur Erzeugung der„Fokus-Map" werden nach Stand der Technik mehrere Orte auf der Probe angefahren, und es wird mit Hilfe eines Software-Autofokus die Fokusposition bestimmt. Dabei werden mehrere Bilder in unterschiedlichen Tiefen der Probe aufgenommen und, beispielsweise iterativ, die beste Fokusposition anhand des Bildkontrastes bestimmt.

Eine andere bekannte Verfahrensweise sieht vor, in vorgegebenen Zeitabständen während des Scannens mit Hilfe jeweils eines Software-Autofokus die Fokusposition zu bestimmen und dabei festgestellte Abweichungen zu korrigieren. Beide Verfahrensweisen haben den Nachteil, dass sie unerwünscht viel Zeit in Anspruch nehmen.

Eine weitere bekannte Methode zur Fokussierung der Probe ist der so genannte Hardware- Autofokus, bei dem die Z-Positionen reflektierender Grenzflächen bestimmt werden, wie etwa die der Deckglasoberseite oder der Objektträgerunterseite. Hierbei besteht jedoch der Nachteil, dass Tiefenpositionen, z.B. die Position der abzubildenden Probensubstanz, nicht direkt gemessen werden können, weil die zurückgestreute Menge an Licht dafür nicht ausreichend ist. Die Informationen über die Lage zum Beispiel der Deckglasoberseite oder der Objektträgerunterseite sind häufig nicht ausreichend als Voraussetzung für eine Fokussierung der Probensubstanz, da der Abstand der Probensubstanz zu diesen Grenzflächen nicht konstant ist. Bei einem Verfahren mittels konfokaler Detektion muss durch die Probe hindurchfokussiert werden, wozu eine mechanische Bewegung notwendig ist, was wiederum unerwünscht viel Zeit in Anspruch nimmt und wodurch es außerdem aufgrund der erforderlichen mechanischen Stellbewegungen zu Ungenauigkeiten im Messergebnis kommen kann.

Beschreibung der Erfindung

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Einrichtung der eingangs genannten Art so weiterzubilden, dass mit höherer Effizienz als im Stand der Technik eine Bestimmung der Z-Position der Probensubstanz mit anschließender automatischer Fokussierung auf diese Z-Position gewährleistet ist.

Erfindungsgemäß erfolgt die Bestimmung der Z-Position einer abzubildenden Probensubstanz in einem mikroskopischen Abbildungssystem und die automatische Fokussierung auf die Probensubstanz in folgenden Verfahrensschritten:

Ausführen eines Tiefenscans in Z-Richtung durch die Probensubstanz hindurch mittels eines Interferometers, wobei

das von optisch wirksamen Grenzflächen und/oder Strukturen reflektierte oder rückgestreute Licht eines Interferometer-Probenstrahles mit dem Referenzstrahl des Inter- ferometers zur Interferenz gebracht wird,

anhand der dabei entstehenden Interferenzsignale eine Bestimmung der Z-Positionen der Grenzflächen und/oder Strukturen der Probe vorgenommen wird,

daraus die Z-Position bestimmt wird, die der Position der Probensubstanz in Richtung der optischen Achse entspricht,

- die Fokusebene und die abzubildende Probensubstanz in Z-Richtung relativ zueinander verschoben werden, bis sich die Probensubstanz der Fokusebene befindet, und dann die Probensubstanz abgebildet wird.

Als Probe im Sinne der Erfindung ist beispielsweise die Gesamtheit aus einem Objektträger, einem Deckglas und der dazwischen eingeschlossenen Probensubstanz zu verstehen. Bevorzugt wird die Probensubstanz digital aufgenommen. Als Interferometer wird bevorzugt ein Kurzkohärenzinterferometer genutzt.

Die Kurzkohärenzinterferometrie ist eine verhältnismäßig junge, optisch hochgenau mes- sende Methode zur Untersuchung von Oberflächen und dünnen Schichten und streuenden Medien, wie z.B. Netzhaut des Auges, Haut, Gewebe usw. Sie befindet die sich derzeit noch in der Phase der Erschließung für medizinische und industrielle Anwendungen. Das zugrunde liegende Meßprinzip beruht beispielsweise auf einem faseroptischen Michelson- Interferometer; die wesentlichen Komponenten sind eine kurzkohärente Lichtquelle, ein fa- seroptischer Strahlteiler und ein Detektor. Ein vom Strahlteiler austretender Probenstrahl gelangt zum Messobjekt, und mit dem Detektor wird die Interferenz des vom Messobjekt reflektierten oder gestreuten Lichtes des Probenstrahls mit dem Licht aus dem Referenzarm nachgewiesen. Durch Verschieben eines in den optischen Weg eingefügten Spiegels erge- ben sich unterschiedliche optische Weglängen, und in Abhängigkeit davon zeichnen sich auf dem Detektor Interferenzen in Form unterschiedlicher Intensitäten ab.

Das detektierte Signal wird in Bezug auf Informationen über die Tiefe und Reflexions- oder Rückstreupotenzial einer reflektierenden oder rückstreuenden Grenzfläche oder Struktur in der Probe analysiert.

Als Lichtquellen sind insbesondere Weißlichtquellen oder Superlumineszenzdioden geeignet. Die Wellenlängenbereiche liegen typischerweise im Bereich von 400 nm bis 1600 nm. Die zeitliche Kohärenz der Lichtquelle hängt mit der spektralen Leistungsdichte über eine Fourier-Transformation zusammen, was bei einer großen spektrale Bandbreite zu einer kurzen Kohärenzlänge führt. Die Größe der möglichen Weglängenunterschiede von Referenz- und Objektlicht, die noch eine Interferenz erkennen lassen, hängt von der Kohärenzlänge ab. Somit lassen sich bei kurzer Kohärenzlänge hohe axiale Auflösungen auch bei großer Tiefenschärfe der Optik erreichen.

So erhält man beispielsweise bei einer Bandbreite von 30 nm bis 50 nm axiale Auflösungen von 3 μιη bis 10 μιη. Neuere Lichtquellen mit mehr als 100 nm Bandbreite ermöglichen axiale Auflösungen nahe 1 μιη.

Der Probenstrahl des Kurzkohärenzinterferometers wird bevorzugt parallel zum Strahlengang für die Bildaufnahme in das mikroskopische Abbildungssystem eingekoppelt, so dass er durch das Mikroskopobjektiv hindurch auf die Probensubstanz gerichtet ist. Dabei ist es von Vorteil, wenn der Probenstrahl nur einen geringen Anteil der Apertur des Objektivs aus- nutzt, so dass die laterale Ausdehnung und die Tiefenschärfe des Fokus in der Probensubstanz möglichst groß sind. Eine Erhöhung der Tiefenschärfe kann zusätzlich mit einer Axi- conlinse erzielt werden.

Die Interferenzsignale werden in Bezug auf die verschiedenen Grenzflächen und rückstreu- enden Strukturen sowie auf die Tiefenposition der Probensubstanz analysiert, und anhand des Analyseergebnisses wird die Z-Position der Probensubstanz bestimmt.

Wird dazu die an sich bekannte Fourier-Domain-Methode verwendet, kann eine Wiederholrate von 20 kHz des Tiefenscans erreicht werden. Da die Genauigkeit der so ermittelten Tiefenposition um ein vielfaches höher ist als die Kohärenzlänge, kann anhand der Kenntnis der Tiefenposition der Probensubstanz die Fokusposition in der Probe so angepasst werden, dass sich die Probensubstanz oder auch bestimmte Strukturen der Probensubstanz in der Fokusebene befinden.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich sehr schnell die Fokusposition auch während des Scannens bestimmen. Eine vorherige Generierung einer Fokus-Map ist nicht mehr notwendig. Die Zeit für die Bestimmung der Fokusposition sowie die nachfolgende Fokussierung können sich bei vorteilhafter Nutzung der Erfindung zeitlich auf die Dauer der Bildaufnahme beschränken, wie weiter unten noch näher erläutert wird.

Die Erfindung kann mit weiteren Verfahrensschritten dahingehend ausgestaltet sein, dass auch noch nach der Ausrichtung der Fokusposition auf die aufzunehmende Probensubstanz von dieser ausgehende optische Informationen genutzt werden, um die korrekte Fokussierung zu kontrollieren und beizubehalten.

Zur Fokussierung können entweder die Probe oder das Objektiv bewegt werden, oder es wird eine interne Fokussierung genutzt, wobei die Strahldivergenz vor dem Objektiv geändert wird. Zur Bildaufnahme lassen sich sowohl 2D-Sensoren (Tile Scan), TDI Sensoren (Line Scan), 1 D-Sensoren (Line Scan) oder auch Einzelsensoren (Point Scan) verwenden. Als Kontrastverfahren sind im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Hellfeld, Fluoreszenz, Phasenkontrast, DIC und Dunkelfeld anwendbar.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine Einrichtung zur automatischen Verschiebung der Fokusebene eines mikroskopischen Abbildungssystems in eine Z-Position, in der sich eine abzubildende Probensubstanz befindet. Erfindungsgemäß ist bei dieser Einrichtung ein von einem Interferometer ausgehender Probenstrahl in Z-Richtung durch die Pro- bensubstanz hindurch gerichtet,

das durch Interferenz des von optisch wirksamen Grenzflächen und/oder Strukturen reflektierten oder rückgestreuten Lichtes des Probenstrahles mit dem Referenzstrahl des Interferometers entstehende Interferenzsignal zur Bestimmung der Z-Positionen der Strukturen und/oder Grenzflächen vorgesehen,

- eine Auswerteeinrichtung vorhanden, die zur Bestimmung der Z-Position der Probensubstanz aus der Menge der ermittelten Z-Positionen ausgebildet ist,

eine Versteileinrichtung vorgesehen, die zur Verschiebung der Fokusebene in Z- Richtung bis zur Z-Position der abzubildenden Probensubstanz ausgebildet ist, eine mit der Auswerteeinrichtung und der Versteileinrichtung verbundene Ansteuer- einheit vorhanden, die zum Generieren von Stellbefehlen zur automatischen Verschiebung der Fokusebene in die bestimmte Z-Position ausgebildet ist, und eine mit der Ansteuereinheit verbundene Kamera vorhanden, ausgebildet zur Auf- nähme der Probensubstanz nach der automatischen Fokussierung.

In einer ersten bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung treten der Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang des Abbildungssystems gemeinsam mit den Strahlengängen des Interferometers durch das Objektiv des Abbildungssystems hindurch. Bildseitig vom Objektiv ist ein Strahlteiler zur Ein- und Auskopplung der Interferometerstrah- lengänge aus dem Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang vorgesehen. Wenn der Probenstrahl außerhalb des Bildfeldes liegt, kann die Ein- und Auskopplung der Interferome- terstrahlengänge auch mittels Spiegel vorgenommen werden. Dabei wird für die Interferometerstrahlengänge ein geringerer Anteil an der Apertur des Objektivs zur Verfügung gestellt als für den Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang, was vorteilhaft zur Folge hat, dass die laterale Ausdehnung der Fokusebene und die Tiefenschärfe des Fokusbereiches verhältnismäßig groß sind. Zur Erhöhung der Tiefenschärfe des Fokus kann eine Axiconlinse in den Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang eingeordnet sein. Dabei wird die Axiconlinse außerhalb des zur Bildaufnahme vorgesehenen Strahlengangs eingeordnet.

Als Interferometer ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein Kurzkohärenzin- terferometer mit einer Superlumineszenzdiode als Lichtquelle vorgesehen. Die Wellenlänge des von der Lichtquelle abgestrahlten Lichtes liegt im Bereich von 750 nm bis 1600 nm.

Zur Bestimmung der Z-Positionen wird bevorzugt das Fourier-Domain-Verfahren angewendet, wobei die Abtast- bzw. Wiederholrate des Tiefenscans beispielsweise 20 kHz beträgt.

Ist die Probensubstanz von einem Objektträger und einem Deckglas eingeschlossen, so sind bezüglich der Ermittlung der Z-Positionen in der Tiefe der Probe insbesondere die Objektträgeroberfläche, die Deckglasrückfläche, die abzubildende Probensubstanz und die Deckglasoberfläche von Interesse. Bei ausreichend hoher axialer Auflösung des Interferometers sind auch die Ermittlung von Z-Positionen von Strukturen innerhalb der Probensubstanz und die automatische Fokussierung auf diese Strukturen möglich.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Einrichtung wird, wie eingangs bereits beschrieben, ein Gesamtbild der Probensubstanz gewonnen, indem mehrere senkrecht zur optischen Achse des Abbildungssystems nebeneinander liegende Bereiche der Probensubstanz aufgenommen und dann zu einem Gesamtbild zusammengefügt werden. Die Abbildung der Probensubstanz bzw. der einzelnen Bereiche der Probensubstanz erfolgt vorteilhaft auf einen ortsauflösenden digitalen Bildsensor.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert, das auch zusätzliche erfindungswesentliche Merkmale offenbaren kann. In den zugehörigen Zeichnungen zeigen: den prinzipiellen Aufbau der erfindungsgemäßen Einrichtung zur Abbildung einer Probensubstanz oder eines Teilbereiches der Probensubstanz, Beispiele für Interferenzsignale, die mit der Einrichtung nach Fig.1 bei einem Tiefenscan durch die Probe gewonnenen werden.

Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen

In Fig.1 ist eine Probensubstanz 1 , beispielsweise ein Gewebeschnitt, auf einem Objektträger 2 abgelegt und mit einem Deckglas 3 überdeckt. Die Probensubstanz 1 erstreckt sich in einer Ebene X,Y senkrecht zur optischen Achse 4 des Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengangs 5 eines im Detail nicht näher dargestellten mikroskopischen Abbildungssystems.

In der Darstellung nach Fig.1 befindet sich die Probensubstanz 1 in der Fokusebene eines Objektivs 6, welches Teil des Abbildungssystems ist.

Die Beleuchtung für die mikroskopische Bildaufnahme erfolgt in dem hier gewählten Beispiel nach der Methode der Fluoreszenzmikroskopie in Auflicht. Abweichend davon ist jedoch auch die Anwendung der Hellfeldmikroskopie denkbar, wobei dann die Beleuchtung in Durchlicht im sichtbaren Wellenlängenbereich erfolgt.

Das von der Probensubstanz 1 reflektierte bzw. gestreute Beleuchtungslicht wird durch das Objektiv 6 hindurch über das Abbildungssystem, zu dem weiterhin eine Tubuslinse 7 gehört, auf die zweidimensionale, pixelaufgelöste Sensorfläche des Bildsensors 8 einer Digitalkamera abgebildet. Der Übersichtlichkeit halber wurde in Fig.1 auf die Darstellung der Lichtquelle und eines Strahlteilers zur Einkopplung des Beleuchtungslichtes in den Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang 5 verzichtet. Die Verfahrensweise zur Einkopplung ist aus dem Stand der Technik bekannt und muß deshalb hier nicht näher erläutert werden.

Im Unterschied zum Stand der Technik jedoch ist erfindungsgemäß ein Kurzkohärenzinterfe- rometer 9 vorgesehen, von dem ein Probenstrahl 10 ausgeht und über einen Strahlteiler 1 1 so in den Beleuchtungs- und Abbildungsstrahlengang 5 eingekoppelt wird, dass er ebenso wie das Beleuchtungslicht in Z-Richtung durch das Objektiv 6 hindurch auf das Deckglas 3, die Probensubstanz 1 und den Objektträger 2 gerichtet ist.

Das Kurzkohärenzinterferometer 9 ist erfindungsgemäß dafür vorgesehen, zeitlich vor der Aufnahme der Probensubstanz 1 bzw. der Aufnahme eines Teilbildes der Probensubstanz 1 einen Tiefenscan durchzuführen, der dazu dient, die Z-Position der Probensubstanz 1 bzw. eines aufzunehmenden Bereiches der Probensubstanz 1 exakt zu bestimmen, um anschließend die Fokusebene entsprechend ausrichten zu können.

Dies geschieht in der Weise, dass das von Grenzschichten und Strukturen innerhalb bzw. außerhalb der Probe reflektierte Licht des Probenstrahls 10 wieder durch das Objektiv 6 hindurch auf den Stahlteiler 1 1 gelangt und dort in Richtung des Kurzkohärenzinterferome- ters 9 abgelenkt wird. Dieses Licht wird mit dem Referenzstrahl des Kurzkohärenzinterfero- meters 9 zur Interferenz gebracht, und das sich dabei ergebende Interferenzsignal wird im Hinblick auf die Tiefen- bzw. Z-Positionen der Grenzschichten bzw. Strukturen der Probe analysiert.

In dem hier ausgeführten Beispiel entstehen vor allem Interferenzen durch die der Probensubstanz 1 zugewandte Oberseite des Objektträgers 2, durch die Probensubstanz 1 selbst, durch die der Probensubstanz 1 zugewandte Unterseite des Deckglases 3 sowie durch die der Probensubstanz 1 abgewandte Oberseite des Deckglases 3.

Ein Beispiel für die Interferenzsignale, die sich dabei ergeben, ist in Fig.2 dargestellt. Aus Fig.2 ist ersichtlich, dass sich die von Grenzschichten oder Strukturen verursachten Interferenzen bezüglich ihrer Amplituden unterscheiden und unterschiedlichen Tiefen in der Probe in Z-Richtung zugeordnet sind.

So ist beispielsweise eine Interferenz 12 durch die Objektträgeroberseite verursacht, sie entspricht der Tiefenposition Z1 . Von der Probensubstanz 1 ist eine Interferenz 13 verursacht, die der Tiefenposition Z2 entspricht. Die Interferenzen 14 und 15, die von der Deck- glasrückfläche und der Deckglasvorderfläche verursacht sind, definieren die Tiefenpositionen Z3 und Z4.

Die Amplitude gibt au ßerdem auch Auskunft über die optischen Eigenschaften der betref- fenden reflektierenden oder rückstreuenden Grenzfläche bzw. Struktur. Diese sollen hier jedoch nicht weiter betrachtet werden.

Nach Zuordnung der durch die Probensubstanz 1 verursachten Interferenz 13 zu der Tiefenposition Z2 wird eine diesbezügliche Information über eine Ansteuereinheit an Stellantriebe weitergegeben, um entweder durch Bewegung des Objektivs 6 oder des Objektträgers 2 eine Verschiebung der Fokusebene in Z-Richtung soweit zu veranlassen, dass sich diese in der Tiefenposition Z2 und damit in der Ebene X,Y befindet, in welcher sich die aufzunehmende Probensubstanz 1 erstreckt. Sobald dies erfolgt ist, wird von der Ansteuereinheit ein Auslösebefehl an die Kamera übermittelt und ein Bild der Probensubstanz 1 aufgenommen.

Soll, wie bereits erwähnt, eine Probensubstanz 1 aufgenommen werden, deren laterale Ausdehnung größer ist als das Bildfeld des Abbildungssystems bzw. größer ist als ein unmittelbar mit einem Kamerabild aufnehmbarer Bereich, so ist es notwendig, mehrere sich senk- recht zur optischen Achse 4 des Abbildungssystems erstreckende Bereiche n, n+1 , n+2 usw. der Probensubstanz 1 aufzunehmen und anschließend die Aufnahmen dieser einzelnen Bereiche zu einem Gesamtbild zusammenzufügen.

Diesbezüglich besteht eine sehr vorteilhafte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfah- rens und der erfindungsgemäßen Einrichtung darin, mittels des Probenstrahles 10 des Kurz- kohärenzinterferometers 9 den Tiefenscan in einem Bereich n+1 durchzuführen, die Z- Position der Probensubstanz 1 in diesem Bereich n+1 zu bestimmen und diese Z-Position dem Bereich n+1 zugeordnet zu speichern, während die Kamera noch auf den vorhergehenden Bereich n gerichtet ist und den Bereich n aufnimmt.

Dabei wird die Probensubstanz 1 kontinuierlich unter dem Objektiv 6 in X- und/oder Y- Richtung fortbewegt, und zwar mit einer der Kamerabildwiederholrate entsprechenden Geschwindigkeit, so dass bei der nächsten Bildaufnahme sich der Bereich n+1 im Bildfeld der Kamera befindet, und die diesem Bereich n+1 zugeordnete Z-Position der Probensubstanz 1 bereits angefahren wurde, während schon der Tiefenscan in dem nachfolgend aufzunehmenden Bereich n+2 durchgeführt, die Z-Position der Probensubstanz 1 in dem Bereich n+2 bestimmt, dem Bereich n+2 zugeordnet gespeichert und für die automatische Fokussierung bei der nachfolgenden Aufnahme des Bereiches n+2 bereitgestellt wird. Dieser Ablauf wird fortgesetzt, bis alle Bereiche der Probensubstanz aufgenommen sind.

Zu diesem Zweck ist die erfindungsgemäße mikroskopische Einrichtung so ausgeführt, dass der Probenstrahl 10 des Kurzkohärenzinterferometers 9 au ßerhalb des Bildfeldes der Kame- ra auf die Probensubstanz 1 gerichtet ist. Dies wird erreicht, indem der Probenstrahl 10 unter einem Winkel in das Objektiv 6 eingekoppelt wird.

Damit ist die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe gelöst und ein Autofokussystem geschaffen, das im Zusammenhang mit einer mikroskopischen Einrichtung zur Abbildung ins- besondere von Gewebeschnitten eine schnelle und hochgenaue Fokussierung gewährleistet.

Bezugszeichenliste

1 Probensubstanz

2 Objektträger

3 Deckglas

4 optische Achse

5 Beleuchtungs- und Abbildungsstrahl gang

6 Objektiv

7 Tubuslinse

8 Bildsensor

9 Kurzkoharenzinterferometer

10 Probenstrahl

1 1 Strahlteiler

12, 13,

14, 15 Interferenz

I Intensitäten

Z1 , Z2,

Z3, Z4 Tiefenpositionen

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur automatischen Verschiebung der Fokusebene eines mikroskopischen Abbildungssystems in Z-Richtung entlang der optischen Achse in eine Z-Position, in der sich eine abzubildende Probensubstanz befindet,

mit folgenden Verfahrensschritten:

Ausführen eines Tiefenscans in Z-Richtung durch die Probensubstanz (1 ) hindurch mittels eines Interferometers, wobei

das von optisch wirksamen Grenzflächen und/oder Strukturen reflektierte oder rückgestreute Licht eines Interferometer-Probenstrahles (10) mit dem Referenzstrahl des Interferometers zur Interferenz gebracht wird,

anhand der dabei entstehenden Interferenzsignale eine Bestimmung der Z-Positionen der Grenzflächen und/oder Strukturen der Probensubstanz (1 ) vorgenommen wird, daraus die Z-Position der Probensubstanz (1 ) bestimmt wird,

die Fokusebene und die abzubildende Probensubstanz (1 ) in Z-Richtung relativ zueinander verschoben werden, bis sich die Probensubstanz (1 ) der Fokusebene befindet, und

dann die Probensubstanz (1 ) abgebildet wird.

Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem die Probensubstanz von einem Objektträger und einem Deckglas eingeschlossen ist, der Tiefenscan mittels eines Kurzkohärenzinterfe- rometers (9) ausgeführt wird und/oder die Probensubstanz (1 ) digital aufgenommen wird.

Mikroskopische Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, bei der nach der Ausrichtung der Fokusposition auf die aufzunehmende Probensubstanz von der Probensubstanz ausgehende optische Informationen genutzt werden, um die korrekte Fokussierung zu kontrollieren und beizubehalten.

Mikroskopische Einrichtung zur Abbildung einer Probensubstanz (1 ), umfassend: ein mikroskopisches Abbildungssystem, und

Mittel zur automatischen Verschiebung der Fokusebene entlang der optischen Achse (4) des Abbildungssystems in eine Z-Position, in der sich die abzubildende Probensubstanz (1 ) befindet,

dadurch gekennzeichnet, dass

ein von einem Interferometer ausgehender Probenstrahl (10) in Z-Richtung durch die Probensubstanz (1 ) hindurch gerichtet ist, die durch Interferenz des von optisch wirksamen Grenzflächen und/oder Strukturen reflektierten oder rückgestreuten Lichtes des Probenstrahles (10) mit dem Referenzstrahl des Interferometers entstehenden Interferenzsignale zur Bestimmung der Z- Position der Probensubstanz (1 ) vorgesehen sind,

eine Auswerteeinrichtung vorhanden ist, ausgebildet zur Bestimmung der Z-Position der Probensubstanz (1 ),

eine Versteileinrichtung vorgesehen ist, ausgebildet zur Verschiebung der Fokusebene und der Probensubstanz (1 ) relativ zueinander, bis sich die Probensubstanz (1 ) der Fokusebene befindet, und

eine mit der Auswerteeinrichtung und der Versteileinrichtung verbundene Ansteuer- einheit vorhanden ist, ausgebildet zum Generieren von Stellbefehlen zur automatischen Verschiebung der Fokusebene in die bestimmte Z-Position, und

eine mit der Ansteuereinheit verbundene Kamera vorhanden ist zur Aufnahme der Probensubstanz (1 ) anschließend an die automatische Fokussierung.

Mikroskopische Einrichtung nach Anspruch 4, bei welcher die Strahlengänge des Interferometers durch das Objektiv (6) des Abbildungssystems hindurch gerichtet sind und bildseitig des Objektivs (6) ein Strahlteiler (1 1 ) zur Ein- und Auskopplung der In- terferometerstrahlengänge vorgesehen ist.

Mikroskopische Einrichtung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, bei der für die Interferometerstrahlengange ein geringerer Anteil an der Apertur des Objektivs (6) zur Verfügung gestellt ist als für die Strahlengänge des Abbildungssystems, so dass die laterale Ausdehnung der Fokusebene und die Tiefenschärfe des Fokusbereiches verhältnismäßig groß sind.

Mikroskopische Einrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, bei der zur Erhöhung der Tiefenschärfe des Fokus eine Axiconlinse in das Abbildungssystem eingeordnet ist.

Mikroskopische Einrichtung nach Anspruch 4 bis 7, bei der

die Aufnahme der Probensubstanz (1 ) mit der Methode Fluoreszenzmikroskopie erfolgt, und

für die Interferometerstrahlengänge Licht mit Wellenlängen im Bereich von 750 nm bis 1600 nm vorgesehen ist.

Mikroskopische Einrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, bei der als Interfero- meter ein Kurzkohärenzinterferometer (9) vorgesehen ist. Mikroskopische Einrichtung nach Anspruch 9, bei der zur Ermittlung der Z-Positionen das Fourier-Domain-Verfahren vorgesehen ist, wobei die Wiederholrate des Tiefenscans bevorzugt 20 kHz beträgt.

Mikroskopische Einrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 10, wobei die Probensubstanz von einem Objektträger (2) und einem Deckglas (3) eingeschlossen ist und insbesondere die Ermittlung der Z-Positionen der Objektträgeroberfläche, der Deckglasrückfläche, der Probensubstanz (1 ) und der Deckglasoberfläche vorgesehen ist.

Mikroskopische Einrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 1 1 , bei der die Aufnahme der Probensubstanz (1 ) auf einen ortsauflösenden digitalen Bildsensor (8) der Kamera vorgesehen ist.

Mikroskopische Einrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 12, wobei die Aufnahme mehrerer in X- oder Y-Richtung aneinandergereihter Bereiche n, n+1 , n+2, ... der Probensubstanz (1 ) sowie die anschließende Zusammenfügung dieser Aufnahmen zu einem Gesamtbild vorgesehen ist.

Mikroskopische Einrichtung nach Anspruch 13, wobei

die automatische Bestimmung der Z-Position der Probensubstanz (1 ) in einem Bereich n+1 vorgesehen ist, während der Bereich n aufgenommen wird,

die Verschiebung der Probensubstanz (1 ) relativ zum Objektiv (6) vorgesehen ist, bis sich der Bereich n+1 im Bildfeld für die Aufnahme befindet,

für den Bereich n+1 die Fokusposition automatisch in die Z-Position der Probensubstanz (1 ) gebracht wird,

die automatische Bestimmung der Z-Position der Probensubstanz (1 ) in einem Bereich n+2 vorgesehen ist, während der Bereich n+1 aufgenommen wird, usw.