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WO2012072055A1 - Uso del pacap para el tratamiento de infecciones virales en organismos acuaticos - Google Patents

Uso del pacap para el tratamiento de infecciones virales en organismos acuaticos Download PDF

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Publication number
WO2012072055A1
WO2012072055A1 PCT/CU2011/000008 CU2011000008W WO2012072055A1 WO 2012072055 A1 WO2012072055 A1 WO 2012072055A1 CU 2011000008 W CU2011000008 W CU 2011000008W WO 2012072055 A1 WO2012072055 A1 WO 2012072055A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pacap
fish
antiviral
combination
virus
Prior art date
Application number
PCT/CU2011/000008
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mario Pablo ESTRADA GARCÍA
Juana María LUGO GONZÁLEZ
Yamila CARPIO GONZÁLEZ
Carolina TAFALLA PIÑEIRO
Original Assignee
Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Priority to MX2013006217A priority patent/MX347844B/es
Priority to KR1020137017000A priority patent/KR101838721B1/ko
Priority to SG2013051289A priority patent/SG191823A1/en
Application filed by Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia filed Critical Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
Priority to JP2013541202A priority patent/JP5997702B2/ja
Priority to AU2011335519A priority patent/AU2011335519B2/en
Priority to BR112013013526A priority patent/BR112013013526B1/pt
Priority to CN201180064517.1A priority patent/CN103298452B/zh
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Priority to CA2819206A priority patent/CA2819206C/en
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Priority to ES11807854.2T priority patent/ES2621332T3/es
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Priority to ZA2013/04025A priority patent/ZA201304025B/en
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    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses

Definitions

  • the present invention relates to the field of aquatic biotechnology, in particular with the use of PACAP and compositions containing PACAP for the treatment of viral infections, or infectious diseases caused by viruses, in aquatic organisms. It is also related to the use of PACAP combined with antivirals for the treatment of such infections. ⁇ o State of the prior art
  • crustaceans represent one of the most important economic sectors in global aquaculture, contributing more than 10 billion dollars annually.
  • Shrimp in culture are susceptible to a wide variety of pathogens that include viruses. It is estimated that in the mid-1990s, approximately 40% of world production (equivalent to 3 billion dollars) product of illness was lost.
  • the main blisters were viral diseases, among which there are five especially important ones: the white spot virus (abbreviated WSSV), the yellow head virus (from English: yellow head virus, abbreviated YHV), Taura syndrome virus (abbreviated TSV), hypodermic and infectious hematopoietic necrosis virus (English: infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, abbreviated IHNNV) and baculovirus monodon : monodon baculovirus, abbreviated MBV) (reviewed by Johnson et al. (2008) Vaccine 26: 4885-4992).
  • WSSV white spot virus
  • YHV yellow head virus
  • TSV Taura syndrome virus
  • IHNNV infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus
  • baculovirus monodon monodon baculovirus, abbreviated MBV
  • Bivalves are an important part of global mollusc production. These organisms, having the characteristic of being filters, are important reservoirs of viruses, so that their culture can face epizootics that put production at risk. Mass mortalities of adult oysters of the species Crassostrea angulata, associated with virus infections similar to iridovirus, have been reported in the literature. Additionally, other viruses of the Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae and Picornaviridae families capable of infecting bivalve cultures have been described.
  • bivalve virology is still a primitive science based primarily on morphological studies and a few experimental studies (reviewed by T. Renault and B. Novoa (2004) Aquat. Living Resour. 17: 397-409).
  • Antivirals are chemical compounds used to treat infections caused by viruses.
  • the first experimental antivirals were discovered in the 1960s. These were developed using the "trial” and "error” methodology. However, after the mid-1980s, the scenario changed dramatically.
  • numerous novel antiviral drugs have been registered, most of them for the treatment of human immunodeficiency virus (HIV). However, there are many aspects that should be improved, because these compounds are not always effective or well tolerated.
  • HCV human immunodeficiency virus
  • some of the main reasons for refining the design and application of these drugs are the emergence of viral resistance or the side effects associated with them (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1: 13-25).
  • the design of antiviral drugs is aimed at viral proteins or host cell proteins.
  • the first strategy gives rise to more specific and less toxic compounds, but with a narrower spectrum of antiviral activity and a greater likelihood of resistance development.
  • the second strategy allows to obtain antiviral compounds with a broader spectrum of activity and a lower probability of developing resistance, but has the disadvantage of a greater probability of cellular toxicity.
  • the strategy of choice depends on the nature of the virus and the possible targets found in the virus or host cell (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1: 13-25).
  • Ribavirin is a broad spectrum antiviral agent, with activity against a wide range of DNA and RNA genome viruses. It is a nucleoside analogue, which after being phosphorylated intracellularly, becomes a competitive inhibitor of cellular inosine monophosphate dehydrogenase (IMPDH) which is an enzyme involved in the synthesis of guanosine monophosphate (GMP) (Graci and Cameron, (2006 ) Reviews in Medical Virology16: 49-63; Parker, (2005) Virus Research 107: 165-171).
  • IMPDH inosine monophosphate dehydrogenase
  • GMP guanosine monophosphate
  • three other mechanisms have been proposed to explain the antiviral activity of this compound: by direct inhibition of viral RNA polymerase (Toltzis et al.
  • the pituitary adenylate cyclase activating polypeptide belongs to the secretin / glucagon / vasoactive intestinal peptide superfamily. This peptide was first isolated in 1989, from bovine hypothalamus, and its ability to stimulate growth hormone secretion through the activation of adenylate cyclase and subsequent production stimulation was demonstrated. of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) (Miyata et al (1989) Biochem Biophys Res Commun 164 567-574). PACAP is a multifunctional neuropeptide that performs important functions as a pituitary and neurotropic factor, as a neurotransmitter, neuromodulator and vasodilator in mammals (Arimura A.
  • PACAP The biological actions of PACAP are mediated by the interaction with two types of receptors that belong to the family of receptors coupled to adenylate cyclase: the type I receptor, which is highly specific for PACAP and named as PAC-1, and type II receptors, which manifest the same affinity for PACAP as for vasoactive intestinal peptide
  • VPAC VPAC 15
  • VPAC-2 Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324
  • PACAP is widely distributed in the brain of mammals, mainly in the hypothalamus, in the paraventricular and dorsamedial nuclei of the thalamus, in the septum, in the cerebral cortex, in the amygdala, in the hippocampus and 0 in the cerebellum (Montero et al. (2000) Journal of Molecular Endocrinology 25: 157-168).
  • the molecular form of the most abundant PACAP is that of 38 amino acids.
  • Studies that have been conducted on different mammalian species show the presence of PACAP in the gonads (Shioda et al.
  • the constitutive expression of the PAC-1 receptor has been observed in rat peritoneal macrophages and in the human myelomonocytic THP-1 cell line. Additionally, PACAP expression has been reported in thymocytes, different subtypes of T cells, B cells, splenocytes and lymph nodes in rats (Delgado et al. (2001) J Biol Chem 276: 369-80; Pozo et al. ( 2003) Trends Mol Med 9: 211-7).
  • PACAP In rats, PACAP inhibits spontaneous thymocyte apoptosis (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161). The fact that PACAP can control the proliferation of thymocytes suggests that it is an important regulator of the maturation of these cells of the immune system (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161).
  • This peptide indirectly intervenes in lymphocyte maturation by stimulating the release of interleukin 6 (IL-6) by the pituitary follicular cells.
  • IL-6 stimulates the growth and differentiation of B cells, and promotes the synthesis and secretion of immunoglobulins by these cells (Tatsuno et al. (1991) Endocrinology 129: 1797-1804; Yada et al. (1993) Peptides 14: 235-239).
  • the peptide also activates and suppresses the inflammatory response by regulating IL-6 and interleukin-10 (IL-10) (Mart ⁇ nez et al. (1996) J Immunol 156 (1): 4128-36; Mart ⁇ nez et al . (1998) J Neuroimmunol 85 (2): 155-67); Mart ⁇ nez et al. (1998) J Leukoc Biol 63 (5): 591-601).
  • IL-6 and interleukin-10 IL-6 and interleukin-10
  • PACAP In activated macrophages, PACAP inhibits the production of pro-inflammatory cytokines and stimulates the production of anti-inflammatory cytokines, allowing homeostasis of the immune system. Additionally, it reduces the expression of costimulatory molecules B7.1 / B7.2 and the subsequent activation of T cells helpers (Th, from English T helper). On the other hand, in previously stimulated macrophages, PACAP inhibits, through its PAC-1 receptors, the production of IL-6, thus suppressing inflammation (Mart ⁇ nez et al. (1998) J Neuroimmunol 85 (2): 155-67 ; Mart ⁇ nez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May; 63 (5): 591-601).
  • PACAP inhibitory action on the transcription of IL-6 against intense inflammatory stimulation or intoxication helps tissue protection and homeostasis of the immune system (Mart ⁇ nez et al. (1998) J Neuroimmunol 85 (2): 155- 67; Mart ⁇ nez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May; 63 (5): 591-601).
  • PACAP induces the expression of B7.2 and promotes cell differentiation towards a Th2 phenotype.
  • Slim and Ganea 2001) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 49 (2): 101-10).
  • PACAP PACAP regulates both the innate and acquired immune systems and modulates the
  • IFN interferon system
  • cytokines produce an antiviral state in the cell by inducing the expression of proteins with antiviral activity such as 2 ', 5' oligoadenylate synthetase, protein kinase R and the group of GTPases called Mx proteins (Goodbourn et al. (2000) Journal of General Virology 81: 2341-2364). From the 0 results of recent research it was established that teleost fish possess an innate IFN system similar to that of mammals (Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172-191; Robertsen (2008) Fish and Shellfish Immunology 25: 351-357).
  • IFNs have been cloned from different species of fish, including the zebrafish (Danio reindeer), the American catfish5 (Ictalurus punctatus) and the Atlantic salmon (Salmo salar) (Altmann et al. (2003) Journal of Virology 77: 1992-2002; Lutfalla et al. (2003) BMC Genomics 4: 29; Robertsen et al. (2003) Journal of Interferon and Citokine Research 23: 601-612; Long et al. (2006) Fish and Shellfish Immunology 21: 42-59). Additionally, several IFN regulatory factors and JAK-STAT signaling pathway molecules have been identified in several fish species, as well as Mx proteins and other IFN stimulated genes. The antiviral activity of Mx proteins in Atlantic salmon and in the Japanese sole (Paraanderys) has also been demonstrated. olivaceus) (reviewed by Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172-191).
  • the present invention solves the aforementioned problem by providing a new alternative for the control of viral infections in aquaculture, through the use of PACAP in the manufacture of compositions for the treatment of viral infections and infectious diseases caused by viruses in aquatic organisms. .
  • treatment refers to any beneficial effect on the regression of the disease that includes attenuation, reduction, decrease or decrease in pathological development after the onset of the disease.
  • antiviral includes any molecule defined as such in the literature, as well as any analog, functional derivatives or active fragments.
  • pituitary adenylate cyclase activating polypeptide includes this molecule in any of its variants (PACAP27 or PACAP38), isolated from its natural source, or of synthetic or produced origin by recombinant DNA technology.
  • variants of the PACAP neuropeptide alone are applied to fish, crustaceans and bivalves through immersion baths at intervals of 2-3 days.
  • PACAP is applied to these organisms as a compound alone or in combination with a molecule of known antiviral activity.
  • the administration of the PACAP and the antiviral molecule can be simultaneous (in a single formulation), sequential or separated over time.
  • the preparations are administered to aquatic organisms orally, by injection or by immersion baths.
  • a subject of this invention is a composition for the treatment of viral infections and infectious diseases caused by viruses in aquatic organisms characterized in that it comprises the "pituitary adenylate cyclase activating polypeptide" (PACAP).
  • PACAP pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
  • the PACAP that is part of said composition is obtained by isolation from its natural source, synthetically, or by recombinant DNA technology. It is administered orally, by injection, or by immersion baths.
  • PACAP is a polypeptide from fish.
  • the present invention also relates to a veterinary combination characterized in that it comprises the "pituitary adenylate cyclase activating polypeptide" (PACAP) and an antiviral molecule.
  • PACAP pituitary adenylate cyclase activating polypeptide
  • the antiviral is ribavirin or an analog of ribavirin.
  • the elements that are part of the combination, the PACAP and the antiviral, are administered simultaneously, separately or sequentially during the same treatment.
  • the combination is used in the treatment of viral infections and infectious diseases caused by viruses in aquatic organisms.
  • the PACAP and the antiviral are administered orally, by injection, or by immersion baths.
  • the PACAP in said combination, is applied as a formulated feed, at a concentration of 50-750 [ig / kg of feed and the antiviral at a concentration of 100 to 2000 mg / kg of feed.
  • the PACAP is applied to the fish by injection at a concentration of 0.1-10 ⁇ g per gram of body weight and the antiviral at a concentration of 1- 50 ⁇ g / g weight, as part of the veterinary combination.
  • PACAP is applied to fish or crustaceans by immersion baths in a concentration of 50-1000 ⁇ 9 per liter of water and the antiviral at a concentration of 100-2000 ⁇ g / L.
  • both PACAP when used as an antiviral and the combination of said peptide with a known antiviral entity, are applied to a variety of aquatic organisms. For example, among them are salmonids, penetrated shrimp, and bivalves.
  • composition comprising PACAP, as well as the combination of said peptide or an antiviral, are useful in the therapeutic treatment of viral infections caused by viruses of the Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae and Picornaviridae families.
  • both PACAP when used as an antiviral, and the combination of said peptide with a known antiviral entity are used for the control of infections caused by IPNV, VHSV and ISAV. They are also used in the therapeutic treatment of viral infections caused by WSSV, YHV, TSV, IHNNV, and MBV.
  • Also part of the present invention is a method for the control of viral infections in aquaculture which comprises the administration of PACAP, or 0 of veterinary combinations comprising PACAP, to aquatic organisms in culture.
  • Figure 1 Analysis of the expression by real-time PCR of the PAC-1 5 receptor in leukocytes of anterior trout of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) treated in vitro with poly l: C (30 ⁇ g / mL) or infected with IPNV (multiplicity of the infection (from English multiplicity of infection, abbreviated moi) from 0.1) at 4, 24 and 48 hours after the experiment began.
  • Leukocyte cultures were treated in duplicate, and PAC-1 receptor expression levels were analyzed by quantitative PCR0 in triplicate.
  • the data are expressed as the mean of the relative expression of PAC-1 with respect to the endogenous gene of constitutive expression EF1 ⁇ ⁇ standard deviation of the mean (DS). * (p ⁇ 0.05) indicates that the relative expression of the PAC-1 was Statistically superior with respect to their relative expression in untreated leukocyte cultures (negative control).
  • FIG. 2 Analysis of real-time PCR expression of the PAC-1 receptor in the rainbow trout macrophage cell line ⁇ Oncorhynchus mykiss) RTS-1 1 infected in vitro with HSVV (moi 0.1) at days 1, 4 and 8 started the experiment. The experiment was performed in duplicate, and the expression levels of the PAC-1 receptor were analyzed by quantitative PCR in triplicate. The data are shown as the mean of the relative expression of PAC-1 with respect to the endogenous gene of constitutive expression EF1 ⁇ ⁇ standard deviation of the mean (SD). * (p ⁇ 0.05) indicates that the relative expression of PAC-1 was statistically lower compared to its relative expression in untreated leukocyte cultures (negative control).
  • FIG. 3 Expression analysis by real-time PCR of the VPAC-1 receptor in leukocytes of anterior trout of rainbow trout ⁇ Oncorhynchus mykiss) treated in vitro with poly l: C (30 ⁇ g / mL) or infected with HSV (moi de 0.1) at 4, 24 and 48 hours after the experiment began. The experiment was performed in duplicate and the expression levels of the PAC-1 receptor were analyzed by triplicate quantitative PCR. The data are shown as the mean of the relative expression of VPAC-1 with respect to the endogenous gene of constitutive expression EF1 ⁇ ⁇ standard deviation of the mean (SD). * (p ⁇ 0.05) indicates that the relative expression of VPAC-1 was statistically higher compared to its relative expression in untreated leukocyte cultures (negative control).
  • Figure 4 Analysis of real-time PCR expression of the PAC-1 receptor in leukocytes of the previous kidney (A) and spleen (B) of rainbow trout ⁇ Oncorhynchus mykiss) infected experimentally in vivo with HSVV (100 ⁇ of 1 x 10 7 TCID 50 (viral titer of the culture supernatant) / mL per fish). Mixtures of five total RNAs from the previous kidney and five total RNAs from the spleen were made, corresponding to 5 fish taken at random from each experimental group on days 3, 7 and 10 of the viral infection. PAC-1 receptor expression levels were analyzed by triplicate quantitative PCR.
  • VPAC-1 receptor expression levels were analyzed by triplicate quantitative PCR. The data are expressed as the mean of the relative expression of the VPAC-1 with respect to the endogenous gene of constitutive expression EF1 ⁇ ⁇ standard deviation of 1 or the mean (SD). * (p ⁇ 0.05).
  • PACAP receptor expression levels were analyzed by triplicate quantitative PCR. The data are expressed as the mean of the relative expression of the PACAP with respect to the endogenous gene of constitutive expression EF1 ⁇ ⁇ standard deviation of the mean (SD). * (p ⁇ 0.05).
  • FIG. 8 Real-time PCR analysis of the effect of PACAP38 in vitro on transcription of IFN ⁇ in peripheral blood leukocytes (A) and anterior kidney (B) of healthy trout.
  • the effect of PACAP38 at concentrations of 10 ⁇ 10 was evaluated, 10 "9 and 10 ⁇ 8 M at 48 hours of treatment. The experiment was repeated 4 times.
  • the leukocyte cultures were treated in duplicate and the PCR reactions were performed in triplicate. Data are expressed as the mean of expression. relative of the gene of interest (IFN ⁇ ) with respect to the endogenous expression gene
  • FIG. 9 Real-time PCR analysis of the effect of PACAP38 in vitro on the transcription of TLR9 in leukocytes (A) of peripheral blood and (B) of the previous kidney of healthy trout.
  • the leukocyte cultures were treated in duplicate and the PCR reactions were performed in triplicate.
  • the data are expressed as the mean of the relative expression of the gene of interest (TLR9) with respect to the endogenous gene of constitutive expression i 5 ⁇ ⁇ standard deviation of the mean (SD). * (p ⁇ 0.05) indicates that the relative expression of the gene of interest was statistically superior with respect to its relative expression in untreated leukocyte cultures (negative control).
  • CPE cytopathic effects
  • Example 1 Expression of the PAC-1 receptor in leukocytes of anterior trout of rainbow trout ⁇ Oncorhynchus mykiss) treated in vitro with Poly: C and IPNV and in the cell line of infected rainbow trout macrophages (Oncorhynchus mykiss) RTS-11 in vitro with HSV Juveniles of rainbow trout (O. mykiss) of 9 to 12 grams of weight and 7 months of age, free of VHSV and IPNV, were used. The fish were kept at 14 ° C with water recirculation. The feed was administered twice daily ad libitum.
  • HSVV strain 0771
  • IPNV strain Sp.
  • the viruses, HSVV (strain 0771) and IPNV Were propagated in the cell line of trout gonads rainbow trout RTG-2 (from Sena and Rio (1975) Infeci Immun 1 1: 815-22).
  • the cells were cultured in minimal essential medium (MEM, Invitrogen, USA) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS, Invitrogen) containing 100 IU / mL of penicillin and 100 pg / mL of streptomycin.
  • FCS fetal calf serum
  • Leukocytes from the previous kidney were isolated from 4 trout following the method described by Graham and Secombes (Graham and Secombes (1998) Immunology 65: 293-7).
  • the anterior kidney was aseptically removed and passed through a 100 ⁇ nylon mesh using Leibov ⁇ tz medium (L-15, Gibco, UK) supplemented with 100 IU / mL penicillin, streptomycin (100 pg / mL), heparin 0 (10 units / mL) and 2% FCS.
  • the resulting cell suspension was carefully placed on a 51% Percoll gradient.
  • the cell ring corresponding to the leukocytes was carefully extracted, washed twice in L-5 containing 0.1% FCS.
  • the cells were resuspended in L-15 with 5% FCS at a concentration of 5x10 6 cells per mL and dispensed in 24-well plates at 1 mL per well.
  • the leukocytes were exposed to 30 ⁇ g / mL of poly 1: C (Sigma) or infected with IPNV at a moi of 0.1 and incubated at 14 ° C for 4 hours, 24 hours and 48 hours.
  • Samples were treated with a deoxyribonucleic acid (DNA) nuclease, specifically with RQ1 RNase-free DNAse (Promega), in order to remove genomic DNA that It could be present in the samples.
  • DNA deoxyribonucleic acid
  • cDNA complementary DNAs
  • qPCR quantitative PCR reactions
  • Example 2 Expression of the VPAC-1 receptor in leukocytes of anterior kidney of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) treated in vitro with Poly: C and HSV To evaluate the expression levels of the VPAC-1 receptor, an experimental design was carried out similar to that described in Example 1.
  • VPAC-1 VPAC-1
  • 1 5 could be associated with a specific effect of the virus as a complete biological entity in infected cells, probably to their benefit.
  • Example 3 Expression of PACAP and PAC-1 and VPAC-1 receptors in spleen and anterior kidney leukocytes of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) infected in vivo with HSVV
  • HSVV HSVV
  • RTG-2 cell line from Sena and Rio (1975) Infect Immun 1 1: 815-22.
  • the viruses were inoculated into the RTG-2 cell line grown in MEM with antibiotics (100 IU / mL penicillin and 100 g / mL streptomycin) and 2% FCS at 14 ° C.
  • antibiotics 100 IU / mL penicillin and 100 g / mL streptomycin
  • FCS 2% FCS at 14 ° C.
  • culture supernatants were harvested and centrifuged to remove cell debris. Clarified culture supernatants were used for trout infection.
  • Viral titers were determined in 96-well plates as reported by Reed and Muench (Reed and Muench (1998) J Hyg 27: 280-9).
  • Juveniles of rainbow trout (O. mykiss) weighing 9 to 12 grams and weighing 7 months of age and free of HSV and IPNV were used. The fish were kept at 14 ° C with water recirculation. The feed was administered twice daily ad libitum. Two experimental groups of 20 trout each group were formed, one group was injected with viral solution (100 ⁇ of 1 x 10 7 TCID 50 / mL per fish) and the another group (used as a negative control) was injected with culture medium of RTG-2 not infected with HSV.
  • RNAs from each selected organ were made, corresponding to the five individuals from each experimental group randomly taken on day 1, 3, 7 and 10 of the experiment.
  • the PAC-1 and VPAC-1 receptors have lower levels of expression than the control group at day 1 and 3, the values of VPAC-1 at day 10 being undetectable.
  • both receptors increase their expression levels with respect to the negative control group. It was also observed that both receptors have a similar expression pattern in the time after viral infection ( Figures 4 and 5).
  • Juveniles of rainbow trout (O. mykiss) of approximately 50 grams in weight, free of VHSV and IPNV, were used.
  • Leukocytes were isolated from peripheral blood and anterior kidney from 5 trout independently, following the method described by Graham and Secombes (Graham and Secombes (1998) Immunology 65: 293-7).
  • peripheral blood of each fish was diluted 4 times in Leibovitz medium (L-15, Gibco, UK) supplemented with 100 IU / mL penicillin, streptomycin (100 pg / mL), heparin (10 units / mL) and 2% FCS , and carefully placed on a 51% Percoll gradient. The cell ring corresponding to the leukocytes was carefully extracted, washed twice in L-15 containing 0.1% FCS.
  • Leibovitz medium L-15, Gibco, UK
  • the anterior kidney was passed through a 100 ⁇ nylon mesh using Leibovitz medium (L-15, Gibco, UK) supplemented with 100 IU / mL penicillin, streptomycin (100 pg / mL), heparin (10 units / mL) and 2% FCS.
  • the resulting cell suspension was brought to a 1: 4 dilution in the same supplemented L-15 medium and carefully placed on a 51% Percoll gradient.
  • the cell ring corresponding to the leukocytes was carefully extracted, washed twice in L-15 containing 0.1% FCS.
  • the cells were resuspended in L-15 with 5% FCS at a concentration of 5x10 6 cells per mL and dispensed in 24-well plates at 1 mL per well.
  • the leukocytes were treated with 3 doses of PACAP38 from Ciar ⁇ as gariepinus obtained by chemical synthesis (10 " ° M, 10 " 9 M and 10 "8 M) in duplicate and untreated leukocytes dispensed in duplicate were used as a negative control.
  • RNA was purified from the cultures of leukocytes controlled and treated with PACAP at the times mentioned above, by the method described by Chomczynski and Sacchi (Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156-9). Taking into account that primers designed to amplify Mx, IFN ⁇ and TLR9 do not discriminate between cDNA and genomic DNA, the purified total RNAs were treated at from the different tissues with a DNA nuclease, specifically with the RQ1 RNase-free DNAse (Promega) with the purpose of eliminating the genomic DNA that could be present in the samples.
  • Mx protein levels increase after 48 hours of treatment in peripheral blood leukocyte cultures treated with 10 " ! ° M of PACAP38.
  • the levels of INF ⁇ went from undetectable values in the cultures of peripheral blood leukocytes negative control to detectable values in the cultures treated with the 3 doses of PACAP38, obtaining the highest levels of expression at the intermediate dose of 10 "9 M ( Figure . 9A) Moreover, it was observed that PACAP38 5 stimulates transcription of ⁇ INF in leucocyte culture prior kidney expression levels of ⁇ INF were statistically higher than the control group at a dose of 10 "9. - 10 ⁇ 8 M, obtaining the best results at the highest dose of 10 "8 M ( Figure 9 B).
  • Example 5 In vitro effect of administration of PACAP in combination with ⁇ or ribavirin on IPNV
  • IPNV supernatant obtained from cell culture As a viral isolate, an IPNV supernatant obtained from cell culture (ATCC strain VR-299) was used. Viral confirmation was performed through a specific PCR.
  • the CHSE-214 cell line Chonook Salmon Embryo (ECACC No. 00 / F / 031) was used. This was maintained at 18 ° C in MEM medium supplemented with salts of
  • the inoculum was grown at 15 ° C and 2% of SFB and prior to the test it was titled by the technique of Reed and Muench, (Reed and Muench (1938) The American Journal of Hygiene 27: 493-497), determining the viral titer of the culture supernatant (TCID 50 ). From the viral inoculum a dilution of 0.1 moi was prepared for the assay.
  • Example 6 Effect of administration of PACAP and the combination PACAP plus ribavirin to rainbow trout (O. mykiss) experimentally infected with IPNV
  • Group 3 Group treated with ribavirin at a dose of 400 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 4 Group treated with ribavirin at a dose of 800 ⁇ g / L of water, exposed to 20 viruses
  • Group 5 Group treated with PACAP at a dose of 00 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 6 Group treated with PACAP at a dose of 200 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 7 Group treated with combination 1 (ribavirin 400 ⁇ g / L-PACAP 100 ⁇ g / L), exposed to the virus
  • Group 8 Group treated with combination 2 (ribavirin 800 ⁇ g / L-PACAP 200 ⁇ g / L), exposed to the virus
  • the fish were fed with an amount of feed equivalent to 3% of the total biomass per group, twice a day.
  • the fish were exposed to the virus by placing them in water at 10-12 ° C containing approximately 10 5 plaque forming units (pfu) / mL of IPNV (ATCC strain VR-299) for 2 h.
  • Fish from Groups 1 and 2 were subjected to the same treatment stress without the compound antiviral or the PACAP-antiviral combination.
  • Group 1 fish were subjected to the same procedure with cell culture medium instead of the virus.
  • the virus was identified by RT-PCR, from the kidney and spleen, according to the method described by López-Lastra et al. (1994) Journal of Fish Diseases 17: 269-282.
  • Treatment with the PACAP or the PACAP-antiviral combination was performed 3 times a week for 20 days. The first time it was performed 2 h after viral infection. Experimental observations were made during the period of 20 days of treatment and 25 days after this. During the 45 days of the experiment, the deaths and abnormal behavior of the fish were recorded.
  • Table 1 shows the average weights at 45 days post-infection. Infected and untreated fish had a lower weight gain compared to uninfected fish. This weight loss was compensated in the treated groups and to a greater extent in the groups treated with the PACAP-ribavirin combination.
  • Table 1 Increase in body weight of rainbow trout fry during the 45 days post-infection.
  • Example 7 Effect of administration of PACAP and the combination PACAP plus ribavirin, formulated in polylactide-co-glycolic acid, to rainbow trout (O. mykiss) experimentally infected with IPNV
  • Group 1 Fish injected with PLGA, not exposed to the virus
  • Group 2 Fish injected with PLGA, exposed to the virus
  • Group 3 Group injected with ribavirin at a dose of 4 ⁇ g / g of water, exposed to the virus
  • Group 4 Group injected with ribavirin at a dose of 8 ⁇ 9 ⁇ of water, exposed to the virus
  • Group 5 Group injected with PACAP at a dose of 0.1 ⁇ g / g of water, exposed to the virus
  • Group 6 Group injected with PACAP at a dose of 0.2 ⁇ g / g of water, exposed to the virus
  • Group 7 Group injected with combination 1 (ribavirin 4 ⁇ g / g-PACAP 0.1 exposed to the virus
  • Group 8 Group injected with combination 2 (ribavirin 8 ⁇ 9 ⁇ - ⁇ 0.2 ⁇ 9 9), exposed to the virus
  • Nanoparticles containing PACAP, or the combination PACAP plus ribavirin were administered by intraperitoneal injection, 2 hours after viral infection. Experimental observations were made for 30 days. Similar survival results were obtained as described in Example 6.
  • Example 8 Effect of administration of PACAP and the combination PACAP plus ribavirin to Atlantic Salmon (Psalm ⁇ experimentally infected with IPNV
  • Group 3 Group treated with ribavirin at a dose of 400 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 4 Group treated with ribavirin at a dose of 800 ⁇ lL of water, exposed to the virus
  • Group 5 Group treated with PACAP at a dose of 100 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 6 Group treated with PACAP at a dose of 200 ⁇ glL of water, exposed to the virus
  • Group 7 Group treated with the combination ribavirin 400 ⁇ g / L-PACAP 100 , ug / L, exposed to the virus
  • Group 8 Group treated with the combination ribavirin 800 ⁇ 9 / 1_- ⁇ 200 ⁇ / ⁇ ,, exposed to the virus
  • the fish were fed with an amount of feed equivalent to 3% of the total biomass per group, twice a day.
  • the fish were exposed to the virus
  • IPNV IPNV
  • the treatment was performed 3 times a week for 20 days. Experimental observations were made during this period and 25 days after treatment. During the 45 days of the experiment, the deaths and abnormal behavior of the fish were recorded.
  • the fish of Groups 1 and 2 were subjected to the same treatment stress without the antiviral compound or the PACAP-antiviral combination.
  • Group 1 fish were subjected to the same procedure with cell culture medium instead of the virus.
  • the virus was identified by RT-PCR, from kidney and spleen, according to the method described by López-Lastra et al. (1994) Journal of Fish Diseases
  • Example 9 Effect of administration of PACAP and the combination PACAP plus ribavirin to Atlantic Salmon (Salmo salai experimentally infected with ISAV
  • Group 3 Group treated with ribavirin at a dose of 400 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 4 Group treated with ribavirin at a dose of 800 ⁇ / L of water, exposed to the virus
  • Group 5 Group treated with PACAP at a dose of 100 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 6 Group treated with PACAP at a dose of 200 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 7 Group treated with the combination ribavirin 400 ⁇ g L-PACAP 100 ⁇ g / L, exposed to the virus
  • Group 8 Group treated with the combination ribavirin 800 ⁇ g / L-PACAP 200 ⁇ g L, ⁇ or exposed to the virus
  • SHK-1 cells infected with the strain Glesvaer were grown in 175 cm 2 bottles for 5 days. The fish were exposed to the virus by cohabitation with injected fish
  • Group 2 Untreated fish, exposed to the virus
  • Group 3 Group treated with amantidine at a dose of 400 ⁇ g / L ⁇ of water, exposed to the virus
  • Group 4 Group treated with amantidine at a dose of 800 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 5 Group treated with PACAP at a dose of 100 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 6 Group treated with PACAP at a dose of 200 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 7 Group treated with combination 1 (amantidine 400 ⁇ g / L-PACAP 100 l or ⁇ g L), exposed to the virus
  • Group 8 Group treated with combination 2 (amantidine 800 ⁇ g / L-PACAP 200 ⁇ g / L), exposed to the virus
  • the experimental conditions were similar to the experiments described in the previous examples.
  • the fish were challenged by immersion with 5.9 X 10 3 pfu / ml
  • Example 11 Effect of administration of PACAP and the combination PACAP plus ribavirin to Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) experimentally infected with the white spot syndrome (WSSV) virus
  • Group 1 Untreated, not exposed to the WSSV virus
  • Group 2 Untreated, exposed to the WSSV virus
  • Group 3 Treated with ribavirin, exposed to the WSSV virus
  • Group 4 Treated with PACAP, exposed to the WSSV virus
  • Group 5 Treated with the combination ribavirin-PACAP, exposed to the WSSV virus
  • the Orconectes limosus crab was used.
  • the WSSV was purified from the newly extracted hemolymph, by sucrose gradient centrifugation, as described by Van Hulten et al. In 2001 (Van Hulten et al. (2001) Virology 285: 228-33). Viral samples were stored at -80 ° C until use.
  • the immersion route was used to cause experimental viral infection. Prior to viral infection, viral titration was carried out and the amount required to cause 75% mortality was determined. For this, the shrimp were experimentally infected with different dilutions of the virus during an incubation period of 7 hours.
  • shrimp were washed with virus-free seawater and placed in new containers to perform the experiment according to the experimental group design described above.
  • the treatments were administered 3 times per week, for 30 days by immersion baths at a dose of the antiviral alone (of 500 ⁇ g / L of water) or in combination with the PACAP, post-infection.
  • a dose of PACAP of 200 ⁇ g / L of water was used.
  • Shrimp from Groups 1 and 2 were subjected to the same stress of the treatment. During the 30 days of the experiment, deaths were recorded in each experimental group.
  • The% mortality in Group 2 was 60%, in Group 1 (untreated, not exposed to the virus) was 0%, in Group 3 (treated with ribavirin, exposed to the virus) the mortality was 16%, while in the group treated with the PACAP the mortality was 26%. In the group treated with the PACAP-ribavirin combination the% mortality was 2%. In the tissue samples of the dead shrimp the presence of the WSSV was detected by RT-PCR.
  • Example 12 Effect of administration of PACAP and the combination PACAP plus ribavirin on scallops of the Pectén maximus species experimentally infected with IPNV
  • Group 3 Group treated with ribavirin at a dose of 400 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 4 Group treated with ribavirin at a dose of 800 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 5 Group treated with PACAP at a dose of 100 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 6 Group treated with PACAP at a dose of 200 ⁇ g / L of water, exposed to the virus
  • Group 7 Group treated with combination 1 (ribavirin 400 ⁇ g / L-PACAP 100 ⁇ g / L), exposed to the virus
  • Group 8 Group treated with combination 2 (ribavirin 800 ⁇ g / L-PACAP 200 ⁇ g / L), exposed to the virus
  • the treatment was performed 3 times a week for 20 days.
  • the oysters were challenged by exposure to 25 L of water containing 10 7 TCID 50 mL ⁇ 1 in 80 L aquariums. After 6 h the water exchange began, at a slow flow of 1 L / min and at 12 h the flow was increased to 3 L / min.

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Abstract

La presente invención está relacionada con el uso del polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP) para el tratamiento de infecciones virales y enfermedades infecciosas causadas por virus, en organismos acuáticos. El PACAP solo, o combinado con una molécula antiviral, administrado por vía oral, inyección o por baños de inmersión, demuestra su efectividad al aumentar la sobrevida de peces o crustáceos infectados por virus. Además, tras su aplicación se observa que el peso corporal de estos organismos se mantiene igual o aumenta en comparación con el de los organismos infectados y no tratados con dichas preparaciones. Mediante reverso transcripción-reacción en cadena de la polimerasa de tejidos y órganos susceptibles a la infección viral se demuestra que el PACAP o las combinaciones que contengan PACAP, disminuyen la carga viral en los organismos infectados.

Description

USO DEL PACAP PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRALES EN ORGANISMOS ACUATICOS
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con el campo de la biotecnología acuática, en 5 particular con el uso del PACAP y de composiciones que contengan PACAP para el tratamiento de infecciones virales, o enfermedades infecciosas causadas por virus, en organismos acuáticos. También se relaciona con el uso del PACAP combinado con antivirales para el tratamiento de dichas infecciones. í o Estado de la técnica anterior
La contribución, anual del cultivo de especies acuáticas a la producción total de peces, moluscos y crustáceos se ha incrementado en épocas recientes. Sin embargo, las altas densidades de los cultivos implican que estos animales vivan en condiciones de estrés, y que generalmente sean más susceptibles a las infecciones. 15 Los brotes de enfermedades causadas por patógenos en la acuicultura resultan en grandes pérdidas económicas e incluso, en ocasiones, producen el cese de los cultivos en determinadas regiones.
En los salmónidos, las infestaciones causadas por el virus de la necrosis pancreática infecciosa (del inglés: infectious pancreatic necrosis virus, abreviado 0 IPNV), el virus de la septicemia hemorrágica viral (del inglés: viral hemorrhagic septicemia virus, abreviado VHSV), el virus de la anemia infecciosa del salmón (del inglés: infectious salmón anemia virus, abreviado ISAV) y el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (del inglés: infectious hematopoietic necrosis virus, abreviado IHNV) son algunas de las causas de enfermedades más importantes en5 su cultivo (Marroquí et al. (2008). Antiviral Research 80: 332-338). Por ejemplo, se ha estimado que la producción del salmón chileno para el cierre del año 2010 caerá en un 38,7% (desde 403 000 toneladas en el año 2009 hasta 245 000 toneladas en el año 2010) como resultado de la mortalidad ocasionada por el ISAV (http://www.aqua.cl).
0 Por otra parte, los crustáceos representan uno de los sectores económicos más importantes en la acuicultura global, aportando más 10 billones de dólares anualmente. Los camarones en cultivo son susceptibles a una amplia variedad de patógenos que incluyen los virus. Se estima que a mediados de los 90, aproximadamente el 40% de la producción mundial (equivalente a 3 billones de dólares) se perdió producto de las enfermedades. Los principales contnbuyentes fueron las enfermedades virales, dentro de las cuales existen cinco especialmente importantes: el virus de la mancha blanca (del inglés: white spot syndrome virus, abreviado WSSV), el virus de la cabeza amarilla (del inglés: yellow head virus, abreviado YHV), virus del síndrome de Taura (del inglés: taura syndrome virus, abreviado TSV), virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (del inglés: infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, abreviado IHNNV) y el baculovirus monodon (del inglés: monodon baculovirus, abreviado MBV) (revisado por Johnson et al. (2008) Vaccine 26: 4885-4992).
Los bivalvos constituyen una parte importante de la producción global de moluscos. Estos organismos al tener la característica de ser filtradores constituyen reservónos importantes de virus, por lo que su cultivo se puede enfrentar a epizootias que pongan en riesgo la producción. Se ha informado en la literatura mortalidades masivas de ostras adultas de la especie Crassostrea angulata, asociadas a infecciones por virus semejantes a iridovirus. Adicionalmente, se han descrito otros virus de las familias Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae y Picornaviridae capaces de infectar cultivos de bivalvos. Sin embargo, debido a la ausencia de líneas celulares derivadas de moluscos y a la limitadas herramientas moleculares existentes para estos organismos, la virología de los bivalvos es todavía una ciencia primitiva basada fundamentalmente en estudios morfológicos y algunos pocos estudios experimentales (revisado por T. Renault and B. Novoa (2004) Aquat. Living Resour. 17: 397-409).
Los antivirales son compuestos químicos utilizados para el tratamiento de infecciones producidas por virus. Los primeros antivirales experimentales se descubrieron en la década de los 60. Estos fueron desarrollados mediante la metodología de "ensayo" y "error". Sin embargo, después de mediados de la década de los 80, el escenario cambió dramáticamente. En los últimos años se han registrado numerosas drogas antivirales novedosas, la mayoría para el tratamiento del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). No obstante, existen muchos aspectos que deben ser mejorados, debido a que estos compuestos no son siempre eficaces o bien tolerados. Por otra parte, algunas de las principales razones para refinar el diseño y aplicación de estas drogas son el surgimiento de la resistencia viral o los efectos secundarios asociados a ellas (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1 : 13-25). El diseño de drogas antivirales tiene como diana las proteínas virales o las proteínas de la célula huésped. La primera estrategia da lugar a compuestos más específicos y menos tóxicos, pero con un espectro más estrecho de actividad antiviral y una mayor probabilidad de desarrollo de resistencia. La segunda estrategia permite obtener compuestos antivirales con un espectro de actividad más amplio y menor probabilidad de desarrollar resistencia, pero tiene como inconveniente una mayor probabilidad de toxicidad celular. La estrategia de elección depende de la naturaleza del virus y de las posibles dianas que se encuentren en el virus o la célula huésped (De Clercq (2002) Nature Reviews Drug Discovery 1 : 13-25).
La ribavirina es un agente antiviral de amplio espectro, con actividad contra un rango amplio de virus de genoma de ADN y ARN. Es un análogo de nucleósido, el cual después de ser fosforilado intracelularmente, se convierte en un inhibidor competitivo de la inosina monofosfato deshidrogenasa (IMPDH) celular que es una enzima involucrada en la síntesis de guanosín monofosfato (GMP) (Graci y Cameron, (2006) Reviews in Medical Virology16: 49-63; Parker, (2005) Virus Research 107: 165-171). Además de la inhibición de esta enzima IMPDH, se han propuesto otros tres mecanismos para explicar la actividad antiviral de este compuesto: mediante la inhibición directa de la ARN polimerasa viral (Toltzis et al. (1988) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 32: 492-497), inhibición de la adición de la caperuza en el extremo 5' del ARN mensajero (ARNm) viral (Goswami et al. (1979) Biochemical and Biophysical Research Communications 89: 830-836) y por la acumulación de mutaciones (Graci y Cameron, (2002) Virology 298: 175-180). Hasta el momento, no existen drogas antivirales específicas aprobadas para el tratamiento de enfermedades virales en organismos acuáticos. En Chile una subsidiaria de Diagnotec S.A. denominada Andrómaco desarrolló un antiviral para su uso en peces, denominado VIROTOP. Este antiviral se encuentra pendiente de aprobación por el Servicio Agrícola y Ganadero del país (SAG) (http://www.aqua.cl). No obstante, un número importante de compuestos han sido evaluados in vitro e in vivo (Hudson et al. (1988) Antiviral Research 9:379-385; Jashés et al. (2000) Antiviral research 45: 9-17; Kamei and Aoki, (2007) Archives of Virology 152: 861- 869; LaPatra et al. (1998) Fish and Shellfish Immunology 8: 435-446; Mas et al. (2006) Antiviral Research 72: 107-115; Micol et al. (2005) Antiviral Research 66: 129-136; Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130), mostrando varios grados de eficacia. La administración de un análogo de la ribavirina, el 5-etinilo-1 -b-D- ribofuranosilimidazol-carboxamida (ElCAR), ha sido evaluada in vivo en larvas de salmón coho {Oncorhynchus kisutch) y trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) infectadas de forma experimental con el IPNV (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130). El tratamiento consistió en baños diarios en una solución de 0,4 y 0,8 μg/mL de ElCAR durante dos horas por 20 días. Los resultados mostraron que la sobrevida de los grupos infectados y tratados con ElCAR fue similar a la sobrevida en los grupos no infectados con el virus. Se realizó un análisis de la carga viral en riñon y bazo, mediante la, técnica de reverso transcripción-reacción en cadena de la polimerasa (def inglés; reverse transcription-polymerase chain reaction, abreviado RT-PCR). Este análisis demostró una disminución de la carga viral en los animales tratados con el antiviral. De este estudio se concluyó que el ElCAR es un inhibidor de la replicación del IPNV, por lo que su uso para disminuir la carga viral y evitar la mortalidad de peces constituye un instrumento beneficioso para incrementar la productividad de los cultivos. Sin embargo, el tratamiento con antivirales no es útil para la selección de reproductores, debido a que los peces infectados y tratados continúan siendo portadores del virus y pueden transmitirlo a la descendencia. No obstante, el uso de antivirales es ventajoso debido a que sin tratamiento los peces mueren y los que sobreviven sin tratamiento antiviral también constituyen portadores del virus.
Por otra parte, se ha observado que uno de los daños producidos por algunas infecciones virales es la pérdida de peso en los peces infectados (Wolf (1986) The fish viruses. En: Espinosa de los Monteros, J., Labarta, U. (Eds.), Patología en Acuicultura. Industrias gráficas, España, SL, pp. 93-95; Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130). Esta pérdida de peso es mucho menor en los peces tratados con antivirales, lo que constituye una ventaja adicional del uso de los mismos. Este efecto ha sido más evidente en la trucha que en el salmón coho (Moya et al. (2000) Antiviral Research 48: 125-130).
El polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP) pertenece a la superfamilía de la secretina/glucagón/péptido intestinal vasoactivo. Este péptido se aisló por primera vez en el año 1989, a partir de hipotálamo bovino, y se demostró su capacidad de estimular la secreción de la hormona de crecimiento a través de la activación de la adenilato ciclasa y de la estimulación subsiguiente de la producción de adenosín monofosfato cíclico (AMPc) (Miyata et al (1989) Biochem Biophys Res Commun 164 567-574). El PACAP es un neuropéptido multifuncional que desempeña importantes funciones como factor hipofisiotrópico y neurotrópico, como neurotransmisor, neuromodulador y vasodilatador en los mamíferos (Arimura A.
5 (1998) Japanese Journal of Physiology 48:301-31). Ha sido demostrada además su función en la regulación de la división celular, de la diferenciación y de la muerte celular (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21 : 619-670). Este péptido existe biológicamente en dos formas moleculares de 38 (PACAP38) y 27 (PACAP27) aminoácidos (Miyata et al. (1990) Biochemical and Biophysical Research i o Communicationsl 70:643-8). Las acciones biológicas del PACAP están mediadas por la interacción con dos tipos de receptores que pertenecen a la familia de los receptores acoplados a la adenilato ciclasa: el receptor de tipo I, que es altamente específico para el PACAP y nombrado como PAC-1 , y los receptores de tipo II, que manifiestan la misma afinidad por el PACAP que por el péptido intestinal vasoactivo
15 (VIP) y que se conocen como VPAC-1 y VPAC-2 (Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324).
El PACAP está ampliamente distribuido en el cerebro de los mamíferos, fundamentalmente en el hipotálamo, en los núcleos paraventricular y dorsamedial del tálamo, en el septum, en la corteza cerebral, en la amígdala, en el hipocampo y 0 en el cerebelo (Montero et al. (2000) Journal of Molecular Endocrinology 25: 157- 168). En los tejidos periféricos al igual que en los tejidos del sistema nervioso central, la forma molecular del PACAP que más abunda es la de 38 aminoácidos. Los estudios que se han realizado en diferentes especies de mamíferos muestran la presencia del PACAP en las gónadas (Shioda et al. (1994) Endocrinology 135: 818-5 825), en las glándulas adrenales (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129: 2787- 2789), en las glándulas paratiroideas (Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 2000;52: 269-324), en el páncreas endocrino (Arimura y Shioda (1995) Neuroendocrinology 16: 53-88) y en el tracto gastrointestinal (Arimura et al. (1991) Endocrinology 129: 2787-2789; Vaudry et al. (2000) Pharmacol Rev 52: 269-324; Hannibal et al. (1998)0 Cell. Tissue. Res. 291 : 65-79). Se ha descrito además la expresión del PACAP en células inmunes, aunque la expresión de este péptido y de sus receptores en células del sistema inmune de los mamíferos ha sido parcialmente esclarecida (Gaytan et al. (1994) Cell Tissue Res 276:223-7; Abad et al. (2002) NeurolmmunoModulation 10:177-86). En mamíferos, entre los tejidos hematopoyéticos se ha observado la expresión constitutiva del receptor VPAC-1 en linfocitos de sangre periférica en humanos y en linfocitos y macrófagos murinos, mientras que la expresión del VPAC-2 es inducible en dichas células. Por otra parte, se ha observado la expresión constitutiva del receptor PAC-1 en macrófagos peritoneales de rata y en la línea celular mielomonocítica humana THP-1. Adicionalmente, se ha reportado la expresión del PACAP en timocitos, diferentes subtipos de células T, en células B, esplenocitos y en linfonodos en rata (Delgado et al. (2001) J Biol Chem 276:369-80; Pozo et al. (2003) Trends Mol Med 9:211-7).
En peces la presencia del PACAP y la expresión de su ácido ribonucleico mensajero (ARNm), se ha informado principalmente en el sistema nervioso central (especialmente en el hipotálamo, cerebro y cordón espinal) y en el sistema nervioso periférico inervando los ojos, la glándula pituitaria, el tracto respiratorio, las glándulas salivales, el tracto gastrointestinal, el tracto reproductivo, el páncreas, y el tracto urinario (Sherwood et al. (2000) Endocrine Review 21 : 619-670).
En ratas, el PACAP inhibe la apoptosis espontánea de timocitos (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161). El hecho de que el PACAP pueda controlar la proliferación de los timocitos sugiere que es un importante regulador de la maduración de estas células del sistema inmunológico (Delgado. (1996) Blood 87: 5152-5161).
Este péptido interviene de forma indirecta en la maduración de los linfocitos mediante la estimulación de la liberación de interleuquina 6 (IL-6) por las células foliculares de la pituitaria. La IL-6 estimula el crecimiento y la diferenciación de células B, y promueve la síntesis y secreción de inmunoglobulinas por estas células (Tatsuno et al. (1991) Endocrinology 129: 1797-1804; Yada et al. (1993) Peptides 14: 235-239).
También el péptido activa y suprime la respuesta inflamatoria mediante la regulación de la IL-6 y de la interleuquina-10 (IL-10) (Martínez et al. (1996) J Immunol 156(1 ):4128-36; Martínez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67); Martínez et al. (1998) J Leukoc Biol 63(5):591-601).
En macrófagos activados, el PACAP inhibe la producción de citoquinas pro- inflamatorias y estimula la producción de citoquinas anti-inflamatorias, permitiendo la homeostasis del sistema inmune. Adicionalmente, reduce la expresión de las moléculas coestimulatorias B7.1/B7.2 y la subsiguiente activación de las células T auxiliadoras (Th, del inglés T helper). Por otra parte, en macrófagos previamente estimulados, el PACAP inhibe, a través de sus receptores PAC-1 la producción de IL-6, suprimiendo así la inflamación (Martínez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155-67; Martínez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591-601 ). La 5 acción inhibidora del PACAP sobre la transcripción de la IL-6 ante una intensa estimulación inflamatoria o una intoxicación ayuda a la protección tisular y a la homeostasis del sistema inmune (Martínez et al. (1998) J Neuroimmunol 85(2): 155- 67; Martínez et al. (1998) J Leukoc Biol. 1998 May;63(5):591-601). En contraste, en macrófagos no estimulados, el PACAP induce la expresión de B7.2 y promueve la í o diferenciación celular hacia un fenotipo Th2. (Delgado y Ganea (2001 ) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 49(2): 101 -10).
De manera general, en años recientes se ha elucidado parcialmente la función del PACAP en la modulación del sistema inmune en mamíferos, demostrándose que el PACAP regula tanto el sistema inmune innato como el adquirido y modula la
15 respuesta inmune pro- y anti-inflamatoria en estos organismos. Sin embargo, la información que existe sobre la posible modulación de la respuesta antiviral por el PACAP en estos organismos es escasa. Recientemente, se demostró que en pacientes crónicos de hepatitis B, los niveles de PACAP-38 en plasma se incrementan una vez eliminada la viremia por el tratamiento con lamivudina 0 (Elefsiniotis et al. (2003) European Journal of Gastroenterology and Hepatology 15:
1209-1216) sugiriéndose una alteración de la respuesta inmune de células T inducida por el péptido que resulta en una remisión bioquímica e histológica de la enfermedad en el hígado de los pacientes.
En peces, los estudios sobre las funciones biológicas del PACAP in vivo publicados 5 hasta el momento están relacionados fundamentalmente con la reproducción (Canosa et al. (2008) American Journal of Physiology (Regul Integr Comp Physiol) 295:1815-21 ), el desarrollo cerebral (Sherwood et al. (2007) Peptides 28:1680-7) y el apetito (Matsuda et al. (2005) Peptides 26:1611-6; Maruyama et al. (2006) Peptides 27:1820-6). Recientemente, se demostró la función biológica de este0 neuropéptido en el crecimiento y el desarrollo de diferentes especies de peces teleósteos en estadio larval (Lugo et al. (2008) Journal of Endocrinology 197:583- El conocimiento sobre la función del PACAP en la modulación del sistema inmune en peces se limita a estudios realizados por nuestro grupo de trabajo en los que se demuestra que la administración mediante baños de inmersión o inyección del PACAP recombinante, aislado a partir de Ciarías gariepinus, promueve no solo el
5 crecimiento, sino que estimula parámetros de la inmunidad innata (producción de lisozima, metabolitos derivados del óxido nítrico y las defensas antioxidantes) y de la inmunidad adquirida (IgM), en las larvas y juveniles de los peces tratados (Carpió et al. (2008) Fish and Shellfish Immunology 25:439-45; Lugo et al. (2010) Fish and Shellfish Immunology 29:513-520). Estas propiedades del péptido se revelaron en la í o solicitud de patente "Neuropéptidos para el cultivo de organismos acuáticos", con número de publicación internacional WO2007/059714.
Una importante primera línea de defensa contra las infecciones virales en vertebrados lo constituye el sistema interferón (IFN) tipo I. Este sistema es activado por la inducción viral de IFNs tipo I (IFNa y IFNp) a través del receptor para IFN-α/β,
15 el cual desencadena la transducción de señales a través de la vía de JAK-STAT.
Estas citoquinas producen un estado antiviral en la célula mediante la inducción de la expresión de proteínas con actividad antiviral como la 2', 5' oligoadenilato sintetasa, la proteína quinasa R y el grupo de GTPasas denominadas proteínas Mx (Goodbourn et al. (2000) Journal of General Virology 81 : 2341-2364). A partir de los 0 resultados de investigaciones recientes se estableció que los peces teleósteos poseen un sistema IFN innato similar al de los mamíferos (Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172-191 ; Robertsen (2008) Fish and Shellfish Immunology 25: 351-357). Los IFNs han sido clonados de diferentes especies de peces, entre los que se encuentra el pez cebra (Danio reno), el pez gato americano5 (Ictalurus punctatus) y el salmón del Atlántico (Salmo salar) (Altmann et al. (2003) Journal of Virology 77: 1992-2002; Lutfalla et al. (2003) BMC Genomics 4: 29; Robertsen et al. (2003) Journal of Interferón and Citokine Research 23: 601-612; Long et al. (2006) Fish and Shellfish Immunology 21 : 42-59). Adicionalmente, se han identificado varios factores reguladores del IFN y moléculas de la vía de0 señalización JAK-STAT en varias especies de peces, así como las proteínas Mx y otros genes estimulados por IFN. También se ha demostrado la actividad antiviral de proteínas Mx en el salmón del Atlántico y en el lenguado japonés (Paralichtys olivaceus) (revisado por Robertsen (2006) Fish and Shellfish Immunology 20: 172- 191 ).
Aunque en crustáceos no se han encontrado genes semejantes a los interferones se ha observado que moléculas como STAT, que son moléculas que se activan
5 durante la respuesta a interferon en vertebrados, se regulan negativamente como respuesta a la infección por WSSV. La regulación negativa de STAT durante la infección viral en mamíferos antagoniza la respuesta de los IFNs tipo I (revisado por Johnson et al. (2008) Vaccine 26: 4885-4992). En bivalvos el conocimiento de la respuesta antiviral es aún más escaso. Existen algunas evidencias de actividad í o antiviral en la hemolinfa y se ha. sugerido la presencia de un mecanismo tipo IFN (Olicarda et al. (2005) Antiviral Research 66(2-3): 147-152; Defer et al., (2009) Aquaculture 293(1-2): 1-7).
En el desarrollo de la acuicultura, es de interés obtener nuevos compuestos o composiciones que puedan ser empleados en el control de las infecciones virales, 1 5 debido a las afectaciones que estas infestaciones traen a esta actividad.
Explicación de la invención
La presente invención resuelve el problema antes mencionado al proveer una nueva alternativa para el control de las infecciones virales en la acuicultura, mediante el uso del PACAP en la fabricación de composiciones para el tratamiento de 0 infecciones virales y enfermedades infecciosas causadas por virus en organismos acuáticos.
El término "tratamiento" dentro del contexto de la presente invención se refiere a cualquier efecto beneficioso en la regresión de la enfermedad que incluye la atenuación, reducción, decremento o disminución del desarrollo patológico después5 del comienzo de la enfermedad.
El término "antiviral", como se usa en la presente invención, incluye cualquier molécula definida como tal en la literatura, así como cualquier análogo, derivados funcionales o fragmentos activos.
El término "polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria (PACAP)", como0 se usa en la presente invención, incluye esta molécula en cualquiera de sus variantes (PACAP27 o PACAP38), aislada de su fuente natural, o de origen sintético o producido mediante la tecnología del ADN recombinante.
En una realización de la presente invención, variantes del neuropéptido PACAP solo (o en combinación con una molécula con actividad antiviral conocida) se aplican a peces, crustáceos y bivalvos mediante baños de inmersión a intervalos de 2-3 días. Como alimento formulado, el PACAP se aplica a estos organismos como compuesto solo o en combinación con una molécula de actividad antiviral conocida. Como resultado principal se encontró que las preparaciones, administradas por baños de
5 inmersión, inyección o por vía oral, fueron efectivas al aumentar la sobrevida de organismos acuáticos infectados con virus y tratados con dichas preparaciones. Se observó además que el peso corporal de estos organismos se mantiene igual o aumenta, en comparación con el de los organismos infectados y no tratados. El análisis de muestras de tejidos y órganos susceptibles a la infección viral mediante í o RT-PCR demostró, además, una disminución de la carga viral en los organismos infectados y tratados.
Hasta el momento de la presente invención no se tenía conocimiento acerca de si el PACAP modulaba o no la respuesta antiviral en peces, crustáceos y bivalvos y de los mecanismos involucrados. En la presente invención se demuestra, por primera
15 vez, tanto in vitro como in vivo una relación entre el PACAP y la respuesta a virus en peces, crustáceos y bivalvos. Adicionalmente, se describe por primera vez un efecto positivo inesperado del PACAP sobre moléculas involucradas en la respuesta antiviral, tales como las proteínas Mx, interferón gamma (IFN y) y TLR9 (del inglés: toll like receptor 9), así como una regulación diferencial de este péptido y sus0 receptores en células del sistema inmune de peces tratadas con virus y/o poli l:C tanto in vitro como in vivo.
El tratamiento de las infecciones virales en los peces, crustáceos y bivalvos mediante la administración del PACAP o de una combinación del PACAP con una molécula antiviral de acción conocida en peces no ha sido revelado ni sugerido5 previamente en el estado de la técnica.
En el contexto de la invención, la administración del PACAP y de la molécula antiviral puede ser simultánea (en una formulación única), secuencial o separada en el tiempo. Las preparaciones se administran a los organismos acuáticos por vía oral, inyección o mediante baños de inmersión.
0 En la presente invención se tratan peces, crustáceos y bivalvos con PACAP y con preparaciones que contienen moléculas antivirales combinadas con PACAP. Inesperadamente se observó que el neuropéptido PACAP tiene actividad antiviral en peces, crustáceos y bivalvos. Por otro lado, se demostró que la combinación del PACAP con sustancias de actividad antiviral conocida reporta una respuesta antiviral superior (sinérgica) a la del PACAP solo, tanto in vitro como in vivo. En peces, hasta el presente, no se le habían asignado funciones biológicas al PACAP en la respuesta antiviral. Por otra parte, hasta el presente no se ha aislado el PACAP en camarones ni bivalvos, ni se ha aislado otro péptido perteneciente a la superfamilia de la secretina y el glucagón. Sólo existen evidencias experimentales informadas, de la estimulación del crecimiento en camarones por la administración exógena del PACAP recombinante de peces (solicitud de patente con número de publicación internacional WO2007/059714). Por lo tanto, hasta la presente invención no se tenía conocimiento alguno' acerca de su posible relación con la respuesta a virus en crustáceos y bivalvos.
Es también objeto de esta invención una composición para el tratamiento de infecciones virales y enfermedades infecciosas causadas por virus en organismos acuáticos caracterizada porque comprende al "polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria" (PACAP). En una materialización de la invención, el PACAP que forma parte de dicha composición se obtiene por aislamiento de su fuente natural, de forma sintética, o mediante la tecnología del ADN recombinante. La misma se administra por vía oral, por inyección, o por baños de inmersión. En una realización de la invención el PACAP es un polipéptido proveniente de peces.
La presente invención también se relaciona con una combinación veterinaria caracterizada porque comprende al "polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria" (PACAP) y una molécula antiviral. En una materialización de la invención el antiviral es la ribavirina o un análogo de la ribavirina. Los elementos que forman parte de la combinación, el PACAP y el antiviral, se administran de forma simultánea, separada o secuencial en el curso de un mismo tratamiento. En una realización de la invención, la combinación se emplea en el tratamiento de infecciones virales y enfermedades infecciosas causadas por virus en organismos acuáticos. En estos, el PACAP y el antiviral se administran por vía oral, por inyección, o por baños de inmersión.
En una realización de la invención, en dicha combinación, el PACAP se aplica como alimento formulado, a una concentración de 50 - 750 [ig/ Kg de pienso y el antiviral a una concentración de 100 a 2000 mg/ Kg de pienso. En una segunda realización de la invención, el PACAP se aplica a los peces por inyección en una concentración de 0.1-10 μg por gramo del peso corporal y el antiviral a una concentración de 1- 50 μg/g de peso, como parte de la combinación veterinaria. En otra realización de la invención, en dicha combinación, el PACAP se aplica a los peces o crustáceos por baños de inmersión en una concentración de 50-1000 μ9 por Litro de agua y el antiviral a una concentración de 100-2000 μg/L.
5 En la invención, tanto el PACAP cuando se utiliza como antiviral, como la combinación de dicho péptido con una entidad antiviral conocida, se aplican a una diversidad de organismos acuáticos. Por ejemplo, entre ellos se encuentran los salmónidos, los camarones peneidos, y los bivalvos.
La composición que comprende PACAP, así como la combinación de dicho péptido í o con un antiviral, son útiles en el tratamiento terapéutico de infecciones virales causadas por virus de las familias Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae y Picornaviridae.
En la invención, tanto el PACAP cuando se utiliza como antiviral, como la combinación de dicho péptido con una entidad antiviral conocida, se utilizan para el 15 control de infecciones causadas por el IPNV, el VHSV y el ISAV. También se emplean en el tratamiento terapéutico de infecciones virales causadas por WSSV, el YHV, el TSV, el IHNNV, y el MBV.
Es también parte de la presente invención un método para el control de las infecciones virales en la acuicultura que comprende la administración del PACAP, o 0 de combinaciones veterinarias que comprendan PACAP, a organismos acuáticos en cultivo.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Análisis de la expresión mediante PCR a tiempo real del receptor PAC-1 5 en leucocitos de riñon anterior de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro con poli l:C (30 μg/mL) o infectados con IPNV (multiplicidad de la infección (del inglés multiplicity of infection, abreviado m.o.i) de 0.1 ) a las 4, 24 y 48 horas de iniciado el experimento. Los cultivos de leucocitos se trataron por duplicado, y los niveles de expresión del receptor PAC-1 se analizaron mediante PCR cuantitativo0 por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del PAC-1 respecto al gen endógeno de expresión constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). * (p<0.05) indica que la expresión relativa del PAC-1 fue estadísticamente superior respecto a su expresión relativa en los cultivos de leucocitos no tratados (control negativo).
Figura 2. Análisis de la expresión mediante PCR a tiempo real del receptor PAC-1 en la línea celular de macrófagos de trucha arcoiris {Oncorhynchus mykiss) RTS-1 1 infectada in vitro con VHSV (m.o.i de 0.1) a los días 1 , 4 y 8 de iniciado el experimento. El experimento se realizó por duplicado, y los niveles de expresión del receptor PAC-1 se analizaron mediante PCR cuantitativo por triplicado. Los datos se muestran como la media de la expresión relativa del PAC-1 respecto al gen endógeno de expresión constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). * (p<0.05) indica que la expresión relativa del PAC-1 fue estadísticamente inferior respecto a su expresión relativa en los cultivos de leucocitos no tratados (control negativo).
Figura 3. Análisis de la expresión mediante PCR a tiempo real del receptor VPAC-1 en leucocitos de riñon anterior de trucha arcoiris {Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro con poli l:C (30 μg/mL) o infectados con VHSV (m.o.i de 0.1) a las 4, 24 y 48 horas de iniciado el experimento. El experimento se realizó por duplicado y los niveles de expresión del receptor PAC-1 se analizaron mediante PCR cuantitativo por triplicado. Los datos se muestran como la media de la expresión relativa del VPAC-1 respecto al gen endógeno de expresión constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). * (p<0.05) indica que la expresión relativa del VPAC-1 fue estadísticamente superior respecto a su expresión relativa en los cultivos de leucocitos no tratados (control negativo).
Figura 4 Análisis de la expresión mediante PCR a tiempo real del receptor PAC-1 en leucocitos de riñon anterior (A) y de bazo (B) de truchas arcoiris {Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente in vivo con VHSV (100 μί de 1 x 107 TCID50 (título viral del sobrenadante del cultivo) / mL por pez). Se realizaron mezclas de cinco ARNs totales de riñon anterior y de cinco ARNs totales de bazo, correspondientes a 5 peces tomados al azar de cada grupo experimental a los días 3, 7 y 10 de la infección viral. Los niveles de expresión del receptor PAC-1 se analizaron mediante PCR cuantitativo por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del PAC-1 respecto al gen endógeno de expresión constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). * (p<0.05). Figura 5. Análisis de la expresión mediante PCR a tiempo real del receptor VPAC- en leucocitos de riñon anterior (A) y de bazo (B) de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente in vivo con VHSV (100 μΐ_ de 1 x 107 TCID50 / mL por pez). Se realizaron mezclas de cinco ARNs totales de riñón anterior y de
5 cinco ARNs totales de bazo, correspondientes a 5 peces tomados al azar de cada grupo experimental, a los días 3, 7 y 10 de la infección viral. Los niveles de expresión del receptor VPAC-1 se analizaron mediante PCR cuantitativo por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del VPAC-1 respecto al gen endógeno de expresión constitutiva EF1 α ± desviación estándar de l o la media (DS). * (p<0.05).
Figura 6. Análisis de la expresión mediante PCR a tiempo real del PACAP en leucocitos de bazo de truchas arcoiris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente in vivo con VHSV (100 μί de 1 x 107 TCID50 / mL por pez). Se realizaron mezclas de cinco ARNs totales de bazo correspondientes a 5 peces
1 5 tomados al azar de cada grupo experimental, a los días 3, 7 y 10 de la infección viral. Los niveles de expresión del receptor PACAP se analizaron mediante PCR cuantitativo por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del PACAP respecto al gen endógeno de expresión constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). * (p<0.05).
20 Figura 7. Análisis por PCR a tiempo real del efecto del PACAP38 in vitro sobre la transcripción de las proteínas Mx en leucocitos de sangre periférica (A) y de riñón anterior (B) de truchas sanas. Se evaluó el efecto del PACAP38 a las concentraciones de 10~10, 0~9 y 10"8 M a las 48 horas de tratamiento. El experimento se repitió 4 veces. Los cultivos de leucocitos se trataron por duplicado y
25 las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del gen de interés (Mx) respecto al gen endógeno de expresión constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). * (p<0.05) indica que la expresión relativa del gen de interés fue estadísticamente superior respecto a su expresión relativa en los cultivos de leucocitos no tratados (control
30 negativo).
Figura 8. Análisis por PCR a tiempo real del efecto del PACAP38 in vitro sobre la transcripción del IFN γ en leucocitos de sangre periférica (A) y de riñón anterior (B) de truchas sanas. Se evaluó el efecto del PACAP38 a las concentraciones de 10~10, 10"9 y 10~8 M a las 48 horas de tratamiento. El experimento se repitió 4 veces. Los cultivos de leucocitos se trataron por duplicado y las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del gen de interés (IFN γ) respecto al gen endógeno de expresión
5 constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). *(p<0.05) indica que la expresión relativa del gen de interés fue estadísticamente superior, respecto a su expresión relativa en los cultivos de leucocitos no tratados (control negativo).
Figura 9. Análisis por PCR a tiempo real del efecto del PACAP38 in vitro sobre la transcripción de TLR9 en leucocitos (A) de sangre periférica y (B) de riñon anterior l o de truchas sanas. Se evaluó el efecto del PACAP38 a las concentraciones de 10"10, 10"9 y 10"8 M a las 48 horas de tratamiento. El experimento se repitió 4 veces. Los cultivos de leucocitos se trataron por duplicado y las reacciones de PCR se realizaron por triplicado. Los datos se expresan como la media de la expresión relativa del gen de interés (TLR9) respecto al gen endógeno de expresión i 5 constitutiva EF1 α ± desviación estándar de la media (DS). * (p<0.05) indica que la expresión relativa del gen de interés fue estadísticamente superior respecto a su expresión relativa en los cultivos de leucocitos no tratados (control negativo).
Figura 10. Ensayo in vitro para determinar la actividad antiviral de las combinaciones PACAP-ribavirina (Rib-PACAP). A las 24 horas previo a la infección,
20 las células fueron tratadas con el antiviral o las combinaciones PACAP-antiviral. Se estableció como control positivo células infectadas con virus, sin tratamiento antiviral (C+) y negativos: células sin infectar y sin tratar con el antiviral (C-) y células tratadas con antiviral (Cn-Av) o las diferentes dosis de PACAP. Las células se infectaron con el inoculo viral por un periodo de 30 minutos de adsorción. Posteriormente, se
25 lavaron con PBS y se agregaron nuevamente los diferentes tratamientos. La evaluación de la inhibición de los efectos citopáticos (CPE) se realizó empleando el método de tinción con cristal violeta (lectura de absorbancia 550 nm).
Exposición detallada de modos de realización/Ejemplos de realización
30 Ejemplo 1. Expresión del receptor PAC-1 en leucocitos de riñon anterior de trucha arcoiris {Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro con Poli l:C e IPNV y en la línea celular de macrófagos de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) RTS-11 infectada in vitro con VHSV Se utilizaron juveniles de trucha arcoiris (O. mykiss) de 9 a 12 gramos de peso y de 7 meses de edad, libres de VHSV e IPNV. Los peces fueron mantenidos a 14°C con recirculación del agua. La alimentación se administró dos veces al día ad libitum. Los virus, VHSV (cepa 0771) e IPNV (cepa Sp.) fueron propagados en la línea 5 celular de gónadas de trucha arcoiris RTG-2 (de Sena y Rio (1975) Infecí Immun 1 1 :815-22). Las células fueron cultivadas en medio mínimo esencial (MEM, Invitrogen, USA) suplementado con 10% de suero fetal de ternero (FCS, Invitrogen) conteniendo 100 UI/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina. Los virus fueron inoculados en células RTG-2 crecidas en MEM con antibióticos y 2% de FCS l o a 14°C. Cuando se observaron efectos citopáticos extensivos, los sobrenadantes de cultivos fueron cosechados y centrifugados para eliminar los restos de células. Para realizar los experimentos se utilizaron los sobrenadantes de cultivo clarificados. Los títulos virales fueron determinados en placas de 96 pocilios según lo reportado por Reed y Muench (Reed y Muench ( 998) J Hyg 27:280-9).
1 5 Se aislaron leucocitos de riñon anterior a partir de 4 truchas siguiendo el método descrito por Graham y Secombes (Graham y Secombes (1998) Immunology 65:293- 7). Resumidamente, se extrajo asépticamente el riñon anterior y se pasó a través de una malla de nylon de 100 μηι utilizando medio Leibovítz (L-15, Gibco, UK) suplementado con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina (100 pg/mL), heparina 0 (10 unidades/mL) y FCS al 2%. La suspensión celular resultante se colocó cuidadosamente sobre un gradiente de Percoll al 51 %. El anillo de células correspondiente a los leucocitos se extrajo cuidadosamente, se lavó dos veces en L- 5 conteniendo FCS al 0.1 %. Las células se resuspendieron en L-15 con un 5% FCS a una concentración de 5x106 células por mL y se dispensaron en placas de 24 5 pocilios a 1 mL por pocilio. Los leucocitos fueron expuestos a 30 μg/mL de poli l:C (Sigma) o infectados con IPNV a una m.o.i de 0.1 e incubados a 14°C por 4 horas, 24 horas y 48 horas.
Finalmente, se purificó ARN total de los cultivos de leucocitos mediante el método descrito por Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi (1987) Anal. Biochem. 0 162:156-9) para evaluar los niveles de expresión del receptor PAC-1 en leucocitos no tratados y tratados con poli l:C o infectados con virus. Se trataron las muestras con una nucleasa de ácido desoxirribonucleico (ADN), específicamente con la RQ1 RNase-free DNAse (Promega), con el propósito de eliminar el ADN genómico que pudiera estar presente en las muestras. Para la síntesis de los ADN complementarios (ADNc) se utilizó un juego de reactivos comercial que emplea la reverso transcriptasa SuperScript III (Invitrogen). Para las reacciones de PCR cuantitativas (qPCR) se utilizó una mezcla de PCR de origen comercial: Power
5 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem). Los resultados de las qPCR se normalizaron contra un gen endógeno de expresión constitutiva, específicamente contra el factor de elongación 1 a (EF 1a) y se realizaron por triplicado. Los resultados se expresaron como 2~ACt, donde el ACt equivale a la resta del valor de Ct del gen evaluado menos el valor de Ct del gen normalizador (EF 1a).
l o Como resultado se obtuvo que los niveles de PAC-1 se sobre-expresan en los cultivos de leucocitos tratados con poli l:C a las 4, 24 y 48 horas del experimento, lo cual sugiere que el receptor PAC-1 está involucrado en la respuesta a virus en peces, teniendo en cuenta que el poli l:C es una molécula que al ser estructuralmente igual a ARN doble cadena, produce un efecto similar al de una i 5 infección viral (muchos virus presentan genoma de ARN). Estos resultados se observan en la Figura 1. Poli l:C interactúa con el receptor tipo toll-3 (TLR3) que se expresa en compartimentos intracelulares de las células B y células dendríticas. El TLR-3 es estimulado en la naturaleza por virus.
Por otra parte, los niveles de expresión del PAC-1 pasaron de valores detectables 0 en los cultivos de leucocitos no tratados a valores indetectables en los cultivos de leucocitos infectados con IPNV a las 4, 24 y 48 horas después de la infección, lo cual confirma una participación de este receptor que une específicamente a PACAP en la respuesta antiviral en peces (Figura 1). Las diferencias observadas entre el efecto del mimético viral poli l:C y el del IPNV pudieran estar asociados con un 5 efecto específico del virus en las células infectadas, probablemente en su beneficio.
Adicionalmente, se evaluaron los niveles de expresión del PAC-1 en la línea celular de macrófagos de trucha (O. mykiss) RTS-1 1 infectada con VHSV, el procedimiento de infección viral de la línea RTS-1 1 fue similar al descrito anteriormente para la línea RTG-2. Igualmente, se observó una regulación negativa de los niveles de 0 expresión del PAC-1 al día 4 y 8 posterior a la infección con VHSV (Figura 2).
Ejemplo 2. Expresión del receptor VPAC-1 en leucocitos de riñon anterior de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) tratados in vitro con Poli l:C y VHSV Para evaluar los niveles de expresión del receptor VPAC-1 se llevó a cabo un diseño experimental igual al descrito en el Ejemplo 1.
Como resultado se obtuvo que los niveles de VPAC-1 se sobre-expresan en los cultivos de leucocitos tratados con poli l:C a las 4, 24 y 48 horas del experimento, lo 5 cual sugiere que el receptor VPAC-1 al igual que el PAC-1 está involucrado en la respuesta a virus en peces, teniendo en cuenta que el poli l:C se considera una molécula mimética viral (Figura 3).
Por otra parte, los niveles de expresión del VPAC-1 fueron indetectables en los cultivos de leucocitos infectados con VHSV a las 4, 24 y 48 horas después de la l o infección, lo cual confirma una participación de este receptor que une a VIP y a PACAP con la misma afinidad en la respuesta antiviral en peces (Figura 3).
Al igual que lo observado con el receptor PAC-1 en cultivo de leucocitos de riñon anterior infectados con IPNV, las diferencias observadas en la regulación del VPAC- 1 por el tratamiento de los leucocitos in vitro con poli l:C y por la infección por VHSV
1 5 pudieran estar asociadas a un efecto específico del virus como entidad biológica completa en las células infectadas, probablemente en su beneficio.
Ejemplo 3. Expresión del PACAP y de los receptores PAC-1 y VPAC-1 en leucocitos de bazo y de riñon anterior de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) infectadas in vivo con VHSV
0 El VHSV (cepa 0771 ) fue propagado en la línea celular RTG-2 (de Sena y Rio (1975) Infect Immun 1 1 :815-22). En resumen, los virus fueron inoculados en la línea celular RTG-2 crecida en MEM con antibióticos (100 UI/mL de penicilina y 100 g/mL de estreptomicina) y 2% de FCS a 14°C. Cuando se observaron efectos citopáticos extensivos, los sobrenadantes de cultivos fueron cosechados y 5 centrifugados para eliminar los restos de células. Para la infección de las truchas se utilizaron los sobrenadantes de cultivo clarificados. Los títulos virales fueron determinados en placas de 96 pocilios según lo reportado por Reed y Muench (Reed y Muench (1998) J Hyg 27:280-9).
Se utilizaron juveniles de trucha arcoiris (O. mykiss) de 9 a 12 gramos de peso y de0 7 meses de edad y libres de VHSV e IPNV. Los peces fueron mantenidos a 14°C con recirculación del agua. La alimentación se administró dos veces al día ad libitum. Se conformaron dos grupos experimentales de 20 truchas cada grupo, un grupo fue inyectado con solución viral (100 μί de 1 x 107 TCID50 / mL por pez) y el otro grupo (utilizado como control negativo) fue inyectado con medio de cultivo de RTG-2 no infectada con VHSV.
A los días 1 , 3, 7 y 10 post-inyección, se tomaron 5 truchas al azar y fueron sacrificadas por sobre-exposición al anestésico MS-22. Posteriormente se extrajo el 5 riñon anterior y el bazo para proceder a la purificación de ARN total de estos órganos, según el método descrito por Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9). La síntesis de ADNc y las reacciones de las PCR cuantitativas se realizaron como se describe en el Ejemplo 1.
Para las reacciones de reverso transcripción (RT), se hicieron mezclas de cinco í o ARNs total de cada órgano seleccionado, correspondiente a los cinco individuos de cada grupo experimental tomados al azar al día 1 , 3, 7 y 10 del experimento.
Como resultado se obtuvo que en el bazo los receptores PAC-1 y VPAC-1 se sobre- expresan al día 3 post-inyección con respecto al control negativo. Los niveles de expresión son inferiores respecto al grupo control al día 10 post:inyección. En riñon
1 5 anterior, los receptores PAC-1 y VPAC-1 presentan niveles de expresión inferior al del grupo control al día 1 y 3, siendo los valores de VPAC-1 al día 10 indetectables. Al día 7 ambos receptores aumentan sus niveles de expresión con respecto al grupo control negativo. Se observó además que ambos receptores presentan un patrón de expresión similar en el tiempo posterior a la infección viral (Figuras 4 y 5).
0 Los valores de expresión del PACAP al día 1 son inferiores respecto a los de su control negativo y al día 7 son superiores. Estos resultados se correlacionan con los de sus dos receptores PAC-1 y VPAC-1 , en el sentido de que los niveles de expresión de los receptores muestran una tendencia a ser inferiores (al día 1) y superiores (al día 7) respecto al grupo control negativo. Al día 10 los valores de 5 expresión del PACAP son inferiores respecto al grupo control negativo (Figuras 4, 5 y 6).
La variación de los niveles de expresión del PACAP y de sus receptores PAC-1 y VPAC-1 en el bazo y el riñon anterior de peces infectados experimentalmente con VHSV e IPNV demuestran la participación de ambos receptores en la respuesta 0 antiviral en peces in vivo. Esto fue corroborado en experimentos de reto en los cuales se observó un efecto positivo del PACAP en la respuesta antiviral en salmónidos, al aumentar la sobrevida de peces infectados, potenciar la respuesta inmune ante la infección viral y aclarar el virus de los órganos y fluidos susceptibles a la infección viral. Ejemplo 4. Efecto del PACAP sobre la transcripción de las proteínas Mx, IFN γ y TLR9 en leucocitos de sangre periférica y de riñon anterior de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) sanas
Se utilizaron juveniles de trucha arcoiris (O. mykiss) de aproximadamente 50 gramos de peso, libres de VHSV e IPNV. Los peces (n=5) fueron anestesiados con sal del ácido metanosulfónico (Sigma, USA) y se les extrajo asépticamente, primero sangre periférica de la vena caudal y posteriormente el riñon anterior.
Se aislaron leucocitos de sangre periférica y de riñon anterior a partir de 5 truchas de forma independiente, siguiendo el método descrito por Graham y Secombes (Graham y Secombes (1998) Immunology 65:293-7).
La sangre periférica de cada pez se diluyó 4 veces en medio Leibovitz (L-15, Gibco, UK) suplementado con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina (100 pg/mL), heparina (10 unidades/mL) y FCS al 2%, y se colocó cuidadosamente sobre un gradiente de Percoll al 51 %. El anillo de células correspondiente a los leucocitos se extrajo cuidadosamente, se lavó dos veces en L-15 conteniendo FCS al 0.1 %.
El riñon anterior se pasó a través de una malla de nylon de 100 μηη utilizando medio Leibovitz (L-15, Gibco, UK) suplementado con penicilina 100 UI/mL, estreptomicina (100 pg/mL), heparina (10 unidades/mL) y FCS al 2%. La suspensión celular resultante se llevó a una dilución 1 :4 en el mismo medio L-15 suplementado y se colocó cuidadosamente sobre un gradiente de Percoll al 51 %. El anillo de células correspondiente a los leucocitos se extrajo cuidadosamente, se lavó dos veces en L- 15 conteniendo FCS al 0.1 %.
Las células se resuspendieron en L-15 con un 5% FCS a una concentración de 5x106 células por mL y se dispensaron en placas de 24 pocilios a 1 mL por pocilio. Los leucocitos fueron tratados con 3 dosis de PACAP38 de Ciarías gariepinus obtenido por síntesis química (10" ° M, 10"9 M y 10"8 M) por duplicado y se utilizó como control negativo leucocitos no tratados dispensados por duplicado.
Los niveles de Mx, IFN γ y TLR9 se evaluaron 48 horas después de los tratamientos. Para ello se purificó ARN total de los cultivos de leucocitos controles y tratados con PACAP a los tiempos mencionados anteriormente, mediante el método descrito por Chomczynski y Sacchi (Chomczynski y Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162:156-9). Teniendo en cuenta que los cebadores diseñados para amplificar Mx, IFN γ y TLR9 no discriminan entre ADNc y ADN genómico, se trataron los ARNs total purificados a partir de los diferentes tejidos con una nucleasa de ADN, específicamente con la RQ1 RNase-free DNAse (Promega) con el propósito de eliminar el ADN genómico que pudiera estar presente en las muestras.
Para la síntesis de los ADNc se utilizó un juego de reactivos comercial que emplea 5 la reverso transcriptasa SuperScrípt /// (Invitrogen). Finalmente para las reacciones de PCR cuantitativas (qPCR) se utilizó una mezcla de PCR de origen comercial: Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystem). Los resultados de las qPCR se normalizaron contra un gen endógeno de expresión constitutiva, específicamente contra el factor de elongación 1 a (EF 1a) y se realizaron por l o triplicado. Los resultados se expresaron como 2"ACt, donde el ACt equivale a la resta del valor de Ct del gen evaluado menos el valor de Ct del gen normalizador (EF 1a).
Los niveles de las proteínas Mx aumentan después de 48 horas de tratamiento en los cultivos de leucocitos de sangre periférica tratados con 10"!° M de PACAP38. A
1 5 la dosis de 10'9 M, se observa también un efecto estimulador de PACAP38 sobre la trascripción de las proteínas Mx respecto al control negativo, pero los niveles de expresión detectados fueron inferiores a los niveles obtenidos con la dosis de 10"10 M. A la dosis de 1 CT8 M no hubo diferencias en los niveles de expresión de las proteínas Mx respecto al control negativo. Estos resultados muestran un efecto 0 positivo de PACAP38 sobre la trascripción de las proteínas Mx a concentraciones bajas en el rango de (10"9 -10"10 M) (Figura 7 A). En leucocitos de riñon anterior, el efecto del PACAP 38 sobre las proteínas Mx es más moderado que en leucocitos de sangre periférica, observándose un efecto estimulador a la dosis de 0"9 M (Figura 7B).
5 Adicionalmente, se observó un efecto estimulador del PACAP38 sobre la expresión del TLR9, pasando de valores indetectables de TLR9 en los cultivos de leucocitos de sangre periférica no estimulados con PACAP a valores detectables en los cultivos estimulados con PACAP38 en el rango (10~10-10~8 M). Se obtuvieron los mayores valores a la dosis de 10"10 M (Figura 8 A). En leucocitos de riñon anterior,0 al igual que lo observado con la expresión de las proteínas Mx, el efecto fue más moderado, observando niveles de expresión de TLR9 estadísticamente superiores al control negativo a la dosis intermedia de 10'9 M (Figura 8 B). Los niveles de INF γ pasaron de valores indetectables en los cultivos de leucocitos de sangre periférica control negativo a valores detectables en los cultivos tratados con las 3 dosis de PACAP38, obteniéndose los mayores niveles de expresión a la dosis intermedia de 10"9 M (Figura 9 A). Por otra parte, se observó que el PACAP38 5 estimula la trascripción del INF γ en cultivo de leucocitos de riñon anterior. Los niveles de expresión de INF γ fueron estadísticamente superiores respecto al grupo control a las dosis de 10"9-10~8 M, obteniéndose los mejores resultados a la dosis mas alta de 10"8 M (Figura 9 B).
Ejemplo 5. Efecto in vitro de la administración del PACAP en combinación con í o la ribavirina sobre el IPNV
Como aislado viral, se utilizó un sobrenadante de IPNV obtenido a partir del cultivo celular (ATCC cepa VR-299). La confirmación viral fue realizada a través de un PCR específico. Se utilizó la línea celular CHSE-214 (Chinook salmón embryo) (ECACC n°00/F/031 ). Ésta fue mantenida a 18°C en medio MEM suplementado con sales de
1 5 Eagle, 10% de suero fetal bovino (SFB), 2 mM de glutamina y antibióticos.
El inoculo se creció a 15°C y 2% de SFB y previo al ensayo fue titulado mediante la técnica de Reed and Muench, (Reed y Muench (1938) The American Journal of Hygiene 27: 493-497), determinándose el título viral del sobrenadante del cultivo (TCID50). Del inoculo viral se preparó una dilución de 0.1 m.o.i. para el ensayo. Se
20 prepararon placas de 96 pocilios sembradas con CHSE-214 mantenida a 18°C en MEM (con sales de Eagle) y suplementada con 10% de SFB, 2 mM de glutamina y antibióticos. Se evaluaron diferentes concentraciones de ribavirina y 3 concentraciones diferentes de PACAP (0.1 , 1 y 10 mM). A las 24 horas previo a la infección, las células fueron tratadas con el antiviral o las combinaciones PACAP-
25 antiviral, estableciendo controles positivos (células infectadas con virus, sin tratamiento antiviral) y negativos (células sin infectar y sin tratar con el antiviral y células tratadas con antiviral o las diferentes dosis de PACAP y no infectadas). Las células se infectaron con el inoculo viral por un período de 30 minutos de adsorción. Posteriormente se lavaron con PBS y se agregaron nuevamente los diferentes
30 tratamientos diluidos en MEM suplementado con SFB al 2% y antibióticos. El ensayo finalizó una vez observado el efecto citopático (CPE) en el control positivo. La evaluación se realizó por microscopía y tinción con cristal violeta (lectura de absorbancia 550 nm). El CPE en el control positivo se observó a los 3 días post- infección, por lo tanto el ensayo se dió por finalizado. Los resultados de la inhibición de los CPE respecto al control infectado y no tratado obtenidos a partir de los valores de absorbancia de la tinción con cristal violeta se muestran en la Figura 10. El análisis de la actividad antiviral de la ribavirina en combinación con el PACAP se 5 realizó utilizando el programa Calcusyn for Windows (Biosoft). El valor del índice de combinación de Chou obtenido mostró sinergismo entre ambas drogas para los valores de concentración ensayados.
Ejemplo 6. Efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP más ribavirina a trucha arcoiris (O. mykiss) infectadas experimentalmente con l o IPNV
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP-ribavirina a trucha arcoiris infectadas experimentalmente con IPNV. Se conformaron 8 grupos experimentales de 50 peces de 1.6 ± 0.4 g cada uno y se mantuvieron en agua a 10-12 °C:
15 Grupo 1 : Peces sin tratar, no expuesto al virus
Grupo 2: Peces sin tratar, expuestos al virus
Grupo 3: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 400 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 4: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 800 μg/L de agua, expuestos al 20 virus
Grupo 5: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 00 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 6: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 200 μg/L de agua, expuestos al virus
25 Grupo 7: Grupo tratado con la combinación 1 (ribavirina 400 μg/L-PACAP 100 μg/L), expuestos al virus
Grupo 8: Grupo tratado con la combinación 2 (ribavirina 800 μg/L-PACAP 200 μg/L), expuestos al virus
Los peces se alimentaron con una cantidad de pienso equivalente al 3% de la 30 biomasa total por grupo, dos veces al día. Los peces fueron expuestos al virus colocándolos en agua a 10-12°C conteniendo aproximadamente 105 unidades formadoras de placas (pfu)/mL de IPNV (ATCC cepa VR-299) por 2 h. Los peces de los Grupos 1 y 2 fueron sometidos al mismo estrés del tratamiento sin el compuesto antiviral o la combinación PACAP-antiviral. Los peces del Grupo 1 fueron sometidos a igual procedimiento con medio de cultivo celular en lugar del virus. La identificación del virus se realizó mediante RT-PCR, a partir de riñón y bazo, de acuerdo al método descrito por López-Lastra et al. (1994) Journal of Fish Diseases 17: 269-282. El tratamiento con el PACAP o la combinación PACAP-antiviral se realizó 3 veces a la semana durante 20 días. La primera vez se realizó 2 h después de la infección viral. Las observaciones experimentales se realizaron durante el período de los 20 días de tratamiento y los 25 días posteriores a este. Durante los 45 días del experimento se registraron las muertes y el comportamiento anormal de los peces.
Como resultado del experimento se observó que los peces infectados con IPNV y que no fueron tratados comenzaron a mostrar signos característicos de la necrosis pancreática infecciosa a partir del día 6 post-infección. La primera muerte ocurrió en el día 7 post-infección, acompañada por el agravamiento de los signos de la enfermedad en todos los peces y una alta mortalidad en los días 11 , 12 y 13 postinfección. En los peces infectados y tratados con ribavirina o PACAP los signos de la enfermedad se detectaron en el día 8. Los grupos tratados con las combinaciones ribavirina-PACAP y expuestos al virus no se registraron signos de la enfermedad durante el tiempo que duró el experimento. Los peces no tratados e infectados recobraron el apetito en el día 15 post-infección. Los peces tratados con el antiviral recobraron el apetito en el día 13, mientras que los peces tratados con el PACAP y las combinaciones PACAP-ribavirina lo hicieron en el día 9 del experimento. Los peces controles no infectados mostraron un comportamiento normal y no se registró mortalidad en este grupo durante el tiempo que duró el experimento. La mortalidad acumulada en los peces no tratados e infectados con IPNV fue de 40 peces de un total de 50 (20% de sobrevida). En los peces tratados con la ribavirina e infectados la sobrevida fue de un 68-70% para los grupos 3 y 4, respectivamente. En los peces tratados con el PACAP e infectados la sobrevida fue de un 50-55% para los Grupos 5 y 6, respectivamente. En los grupos tratados con las combinaciones PACAP-ribavirina la sobrevida fue de un 97 y 99% en los Grupos 7 y 8, respectivamente. En las muestras de tejido de los peces muertos se detectó la presencia del IPNV. No se detectó el virus en las muestras tomadas de los grupos no tratados y en los no infectados. En la Tabla 1 se muestran los pesos promedios a los 45 días post-infección. Los peces infectados y no tratados tuvieron una menor ganancia en peso en comparación a los peces no infectados. Esta pérdida de peso se compensó en los grupos tratados y en mayor medida en los grupos tratados con la combinación PACAP-ribavirina.
Tabla 1. Incremento en el peso corporal de los alevines de trucha arcoiris durante los 45 días post-infección.
Figure imgf000026_0001
Se realizó un ANOVA seguido de un test a posteriori de Tukey. Las letras diferentes representan diferencias estadísticamente significativas.
Ejemplo 7. Efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP más ribavirina, formuladas en ácido poliláctido-co-glicólico, a trucha arcoiris (O. mykiss) infectadas experimentalmente con IPNV
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP-ribavirina formuladas en ácido poliláctido-co-glicólico, Sigma (del inglés: Poly (D-L-lactide-co-glycolic) acid, abreviado PLGA) a truchas arcoiris infectadas experimentalmente con IPNV. Se conformaron 8 grupos experimentales de 30 peces de 30 ± 4 g cada uno y se mantuvieron en agua a 10- 12 °C:
Grupo 1 : Peces inyectados con PLGA, no expuesto al virus
Grupo 2: Peces inyectados con PLGA, expuestos al virus
Grupo 3: Grupo inyectado con ribavirina a una dosis de 4 μg/g de agua, expuestos al virus Grupo 4: Grupo inyectado con ribavirina a una dosis de 8 μ9^ de agua, expuestos al virus
Grupo 5: Grupo inyectado con PACAP a una dosis de 0.1 μg/g de agua, expuestos al virus
Grupo 6: Grupo inyectado con PACAP a una dosis de 0.2 μg/g de agua, expuestos al virus
Grupo 7: Grupo inyectado con la combinación 1 (ribavirina 4 μg/g-PACAP 0.1
Figure imgf000027_0001
, expuestos al virus
Grupo 8: Grupo inyectado con la combinación 2 (ribavirina 8 μ9^-ΡΑΰΑ 0.2 μ9 9), expuestos al virus
Las nanopartículas que contienen PACAP, o la combinación PACAP más ribavirina, fueron administradas mediante inyección intraperitoneal, 2 horas posterior a la infección viral. Las observaciones experimentales se realizaron durante 30 días. Se obtuvieron resultados similares de sobrevida a los descritos en el Ejemplo 6.
Ejemplo 8. Efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP más ribavirina a Salmón del Atlántico (Salmo εβΐθή infectado experimentalmente con IPNV
Se realizó un experimento para evaluar el efecto del la administración del PACAP y de la combinación PACAP-ribavirina a salmones (Salmo salar) infectados experimentalmente con IPNV. Se conformaron 8 grupos experimentales de 50 peces de 1 .2 ± 0.3 g cada uno y se mantuvieron en agua a 10-12 °C:
Grupo 1 : Peces sin tratar, no expuesto al virus
Grupo 2: Peces sin tratar, expuestos al virus
Grupo 3: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 400 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 4: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 800 μ lL de agua, expuestos al virus
Grupo 5: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 100 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 6: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 200 μglL de agua, expuestos al virus
Grupo 7: Grupo tratado con la combinación ribavirina 400 μg/L-PACAP 100 ,ug/L, expuestos al virus Grupo 8: Grupo tratado con la combinación ribavirina 800 μ9/1_-ΡΑΟΑΡ 200 μρ/Ι,, expuestos al virus
Los peces se alimentaron con una cantidad de pienso equivalente al 3% de la biomasa total por grupo, dos veces al día. Los peces fueron expuestos al virus
5 colocándolos en agua a 10-12°C conteniendo aproximadamente 105 pfu/mL de IPNV (ATCC cepa VR-299) por 2 h. El tratamiento se realizó 3 veces a la semana durante 20 días. Las observaciones experimentales se realizaron durante este periodo y los 25 días posteriores al tratamiento. Durante los 45 días del experimento se registraron las muertes y el comportamiento anormal de los peces. Los peces de l o los Grupos 1 y 2 fueron sometidos al mismo estrés del tratamiento sin el compuesto antiviral o la combinación PACAP-antiviral. Los peces del Grupo 1 fueron sometidos a igual procedimiento con medio de cultivo celular en lugar del virus. La identificación del virus se realizó mediante RT-PCR, a partir de riñon y bazo, de acuerdo al método descrito por López-Lastra et al. (1994) Journal of Fish Diseases
1 5 17: 269-282.
Como resultado del experimento se observó que los peces infectados con el IPNV y que no fueron tratados comenzaron a mostrar signos característicos de la necrosis pancreática infecciosa a partir del día 6 post-infección. La primera muerte ocurrió en el día 8 post-infección, acompañada por el agravamiento de los signos de la 0 enfermedad en todos los peces y una alta mortalidad entre los días 11-15 postinfección. El porciento de sobrevida en este grupo fue de un 30%. Se observó una pérdida del apetito en los días 10 y 11 en todos los grupos infectados con el virus, con la excepción de los grupos tratados con el PACAP, la combinación PACAP- ribavirina y el grupo no infectado. En los peces infectados y tratados con ambas
25 dosis de ribavirina los primeros signos de la enfermedad se detectaron en el día 10 y se registró un 70-76% de sobrevida para la dosis menor y mayor respectivamente. En los peces infectados y tratados con el PACAP se registró un 56-60% de sobrevida para la dosis menor y mayor respectivamente. En los grupo tratados con las combinaciones ribavirina-PACAP y expuestos al virus se registró un 96-98% de 0 sobrevida. En el grupo no infectado y no tratado el porciento de sobrevida fue de un 98%. En las muestras de tejido de los peces muertos se detectó la presencia del IPNV. En la Tabla 2 se muestran los pesos promedios a los 45 días post-infección. Los peces infectados y no tratados tuvieron una menor ganancia en peso en comparación a los peces no infectados. Esta pérdida de peso se compensó en los grupos tratados y en mayor medida en los grupos tratados con el PACAP y con las combinaciones PACAP-ribavirina.
Tabla 2. Incremento en el peso corporal de los alevines de salmón del Atlántico durante los 45 días post-infección.
Figure imgf000029_0001
Se realizó un ANOVA seguido de un test a posteriori de Tukey. Las letras diferentes representan diferencias estadísticamente significativas.
Ejemplo 9. Efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP más ribavirina a Salmón del Atlántico (Salmo salai infectados experimentalmente con ISAV
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP-ribavirina a salmones (Salmo salar) infectados experimentalmente con ISAV. Se conformaron 8 grupos experimentales de 25 peces de 50 ± 10 g cada uno y se mantuvieron en agua de mar a 10-12 °C:
Grupo 1 : Peces sin tratar, no expuestos al virus ISA
Grupo 2: Peces sin tratar, expuestos al virus ISA
Grupo 3: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 400 μg/L de agua, expuestos al virus Grupo 4: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 800 μο/L de agua, expuestos al virus
Grupo 5: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 100 μg/L de agua, expuestos al virus
5 Grupo 6: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 200 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 7: Grupo tratado con la combinación ribavirina 400 μg L-PACAP 100 μg/L, expuestos al virus
Grupo 8: Grupo tratado con la combinación ribavirina 800 μg/L-PACAP 200 μg L, í o expuestos al virus
Para obtener suficiente virus para los experimentos de reto se cultivaron células SHK-1 infectadas con la cepa Glesvaer (acceso No. AJ012285, Krossoy et al. (1999) Journal of Virology 73: 2136-2142) en frascos de 175 cm2 durante 5 días. Los peces fueron expuestos al virus mediante cohabitación con peces inyectados
1 5 intraperitonealmente con 0,3 ml_ de medio de cultivo conteniendo aproximadamente 104 pfu/mL de ISAV. Los peces del Grupo 1 recibieron igual volumen de medio de cultivo. El % de mortalidad en el Grupo 1 (sin tratar, no expuesto al virus ISA) fue de un 4% y en el Grupo 2 (sin tratar expuestos al virus) fue de un 92%. En los Grupos 3 y 4 la mortalidad fue de un 52 y 36 %, respectivamente mientras que en los Grupos 0 5 y 6 fue de un 60 y 72% respectivamente. En los Grupos 7 y 8 tratados con la combinación PACAP-ribavirina el % de mortalidad fue de un 8 y 4%, respectivamente. En las muestras de tejido de los peces muertos se detectó la presencia del ISAV. No se detectó el virus en las muestras tomadas de los grupos no tratados y no infectados.
5 Ejemplo 10. Efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP más amantidina a trucha arcoiris (O. mykiss) infectadas experimentalmente con IHNV
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP-amantidina a trucha arcoiris infectadas o experimentalmente con IHNV. Se conformaron 8 grupos experimentales de 50 peces de 50 ± 5 g cada uno y se mantuvieron en agua a 10-12 °C:
Grupo 1 : Peces sin tratar, no expuestos al virus
Grupo 2: Peces sin tratar, expuestos al virus Grupo 3: Grupo tratado con amantidina a una dosis de 400 μg/L· de agua, expuestos al virus
Grupo 4: Grupo tratado con amantidina a una dosis de 800 μg/L de agua, expuestos al virus
5 Grupo 5: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 100 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 6: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 200 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 7: Grupo tratado con la combinación 1 (amantidina 400 μg/L-PACAP 100 l o μg L), expuestos al virus
Grupo 8: Grupo tratado con la combinación 2 (amantidina 800 μg/L-PACAP 200 μg/L), expuestos al virus
Las condiciones experimentales fueron similares a los experimentos descritos en los ejemplos anteriores. Los peces fueron retados por inmersión con 5.9 X 103 pfu/ml
1 5 del virus, en 20 L de agua con aeración durante 1 hora. Como resultado del experimento se obtuvo un 26% de sobrevida de los peces no tratados e infectados con IHNV. En los peces tratados con la amantidina e infectados la sobrevida fue de un 46%. En los peces tratados con el PACAP e infectados la sobrevida fue de un 36%. En los grupos tratados con las combinaciones PACAP-amantidina la sobrevida
20 fue de un 96-98%.
Ejemplo 11. Efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP más ribavirina al camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) infectado experimentalmente con el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV)
25 Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP-ribavirina al camarón blanco del Pacífico Litopenaeus vannamei infectado experimentalmente con el WSSV. Se conformaron 4 grupos experimentales de 50 camarones de 5 ± 0.5 g cada uno y se mantuvieron en agua de mar a 28 °C:
30 Los camarones se alimentaron con una cantidad de alimento equivalente al 8% de la biomasa total por grupo, dos veces al día. Los grupos experimentales fueron los siguientes:
Grupo 1 : Sin tratar, no expuestos al virus WSSV Grupo 2: Sin tratar, expuestos al virus WSSV
Grupo 3: Tratado con ribavirina, expuestos al virus WSSV
Grupo 4: Tratado con PACAP, expuestos al virus WSSV
Grupo 5: Tratado con la combinación ribavirina-PACAP, expuestos al virus WSSV Para el aislamiento y propagación viral se utilizó el cangrejo Orconectes limosus. Se purificó el WSSV a partir de la hemolinfa recién extraída, mediante centrifugación en gradiente de sucrosa, como se describió por Van Hulten y colaboradores en el 2001 (Van Hulten et al. (2001) Virology 285: 228-33). Las muestras virales fueron almacenadas a -80 °C hasta su uso.
Con el objetivo de minimizar las rutas naturales de infección por WSSV y lograr un protocolo reproducible, se utilizó la vía de inmersión para provocar la infección viral experimental. Previo a la infección viral se procedió a la titulación viral y se determinó la cantidad requerida para provocar un 75% de mortalidad. Para ello los camarones fueron experimentalmente infectados con diferentes diluciones del virus durante un periodo de incubación de 7 horas.
Posterior a la infección viral los camarones fueron lavados con agua de mar libre de virus y colocados en contenedores nuevos para realizar el experimento según el diseño de grupos experimentales descrito arriba.
Los tratamientos se administraron 3 veces por semana, durante 30 días por baños de inmersión a una dosis del antiviral solo (de 500 μg/L de agua) o combinado con el PACAP, post-infección. En el caso del grupo tratado con PACAP y con la combinación ribavirina-PACAP se utilizó una dosis de PACAP de 200 μg/L de agua. Los camarones de los Grupos 1 y 2 fueron sometidos al mismo estrés del tratamiento. Durante los 30 días del experimento se registraron las muertes en cada grupo experimental.
El % de mortalidad en el Grupo 2 (sin tratar, expuesto al virus) fue de un 60%, en el Grupo 1 (sin tratar, no expuesto al virus) fue de 0%, en el Grupo 3 (tratado con ribavirina, expuesto al virus) la mortalidad fue de un 16%, mientras que en el grupo tratado con el PACAP la mortalidad fue de un 26%. En el grupo tratado con la combinación PACAP-ribavirina el % de mortalidad fue de un 2%. En las muestras de tejido de los camarones muertos se detectó la presencia del WSSV por RT-PCR. Ejemplo 12. Efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP más ribavirina a ostiones de la especie Pectén maximus infectados experimentalmente con IPNV
Se realizó un experimento para evaluar el efecto de la administración del PACAP y de la combinación PACAP-ribavirina a ostiones de la especie Pectén maximus infectados experimentalmente con IPNV. Se conformaron 8 grupos experimentales de 30 ostiones adultos cada uno y se mantuvieron en acuarios de 250 L con flujo de agua de mar filtrada a una temperatura de 10°C. No se detectó virus en muestras de hepatopáncreas colectadas previo al comienzo del experimento. Los grupos experimentales fueron:
Grupo 1 : sin tratar, no expuestos al virus
Grupo 2: sin tratar, expuestos al virus
Grupo 3: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 400 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 4: Grupo tratado con ribavirina a una dosis de 800 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 5: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 100 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 6: Grupo tratado con PACAP a una dosis de 200 μg/L de agua, expuestos al virus
Grupo 7: Grupo tratado con la combinación 1 (ribavirina 400 μg/L-PACAP 100 μg/L), expuestos al virus
Grupo 8: Grupo tratado con la combinación 2 (ribavirina 800 μg/L-PACAP 200 μg/L), expuestos al virus
El tratamiento se realizó 3 veces a la semana durante 20 días. Los ostiones fueron retados mediante la exposición a 25 L de agua conteniendo 107 TCID50 mL~1 en acuarios de 80 L. Al cabo de 6 h se comenzó el recambio de agua, a un flujo lento de 1 L/min y a las 12 h se aumentó el flujo a 3 L/min.
Dos semanas después del reto se tomaron muestras de hepatopáncreas y se determinó el título viral. Los resultados mostraron una disminución de la carga viral en los animales tratados con la ribavirina y el PACAP. Esta disminución fue mayor en los grupos tratados con la combinación (Tabla 3). Tabla 3. Título viral promedio de IPNV (logi0TCID50 g"1) en el hepatopáncreas de ostiones dos semanas después del reto. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas.
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Claims

REIVINDICACIONES USO DEL PACAP PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES VIRALES EN ORGANISMOS ACUATICOS
1. Uso del "polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria" (PACAP) en la fabricación de una composición para el tratamiento de infecciones virales y enfermedades infecciosas causadas por virus en organismos acuáticos.
2. El uso de la reivindicación 1 caracterizado porque el PACAP se obtiene a) por aislamiento de su fuente natural, b) de forma sintética, o c) mediante la tecnología del ADN recombinante.
3. El uso de la reivindicación 2, caracterizado porque el PACAP es un polipéptido proveniente de peces.
4. El uso de las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque el PACAP se emplea en un organismo acuático seleccionado entre el grupo compuesto por salmónidos, camarones peneidos y bivalvos.
5. El uso de la reivindicación 1 caracterizado porque el PACAP se emplea en el tratamiento terapéutico de infecciones virales causadas por virus de las familias Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae y Picornaviridae.
6. Una composición para el tratamiento de infecciones virales y enfermedades infecciosas causadas por virus en organismos acuáticos caracterizada porque comprende al "polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria" (PACAP).
7. La composición de la reivindicación 6 caracterizada porque el PACAP se obtiene a) por aislamiento de su fuente natural, b) de forma sintética, o c) mediante la tecnología del ADN recombinante.
8. La composición de la reivindicación 6, caracterizada porque se administra por vía oral, por inyección, o por baños de inmersión.
9. La composición de las reivindicaciones 7 y 8, caracterizada porque el PACAP es un polipéptido proveniente de peces.
10. Combinación veterinaria caracterizada porque comprende al "polipéptido activador de la adenilato ciclasa de pituitaria" (PACAP) y una molécula antiviral.
11. La combinación de la reivindicación 10 donde el PACAP se obtiene a) por aislamiento de su fuente natural, b) de forma sintética, o c) mediante la tecnología del ADN recombinante.
12. La combinación de la reivindicación 10 donde el antiviral es la ribavirina o un análogo de la ribavirina.
13. La combinación de la reivindicación 10 donde el PACAP y el antiviral se administran de forma simultánea, separada o secuencial en el curso de un mismo tratamiento.
14. La combinación de las reivindicaciones 10 a la 13 caracterizada porque se emplea en el tratamiento de infecciones virales y enfermedades infecciosas causadas por virus en organismos acuáticos.
15. La combinación de la reivindicación 14 caracterizada porque el PACAP y el antiviral se administran por vía oral, por inyección, o por baños de inmersión.
16. La combinación de la reivindicación 10 donde la molécula antiviral es un compuesto químico aceptado farmacéuticamente para el tratamiento de infecciones virales, un análogo, un derivado funcional o un fragmento activo del mismo.
17. La combinación de la reivindicación 15 caracterizada porque el PACAP se aplica como alimento formulado, a una concentración de 50 - 750 pg/ Kg de pienso y el antiviral a una concentración de 100 a 2000 mg/ Kg de pienso.
18. La combinación de la reivindicación 15 caracterizada porque el PACAP se aplica a los peces por inyección en una concentración de 0.1-10 μg por gramo del peso corporal y el antiviral a una concentración de 1-50 μg/g de peso.
19. La combinación de la reivindicación 15 caracterizada porque el PACAP se aplica a los peces o crustáceos por baños de inmersión en una concentración de 50-1000 g por Litro de agua y el antiviral a una concentración de 100-2000 μg/L.
20. Método para el control de las infecciones virales en la acuicultura caracterizado porque comprende la administración del PACAP, o de combinaciones veterinarias que comprendan PACAP, a organismos acuáticos en cultivo.
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