[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2012070965A1 - Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения - Google Patents

Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения Download PDF

Info

Publication number
WO2012070965A1
WO2012070965A1 PCT/RU2010/000691 RU2010000691W WO2012070965A1 WO 2012070965 A1 WO2012070965 A1 WO 2012070965A1 RU 2010000691 W RU2010000691 W RU 2010000691W WO 2012070965 A1 WO2012070965 A1 WO 2012070965A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
complementary oligonucleotides
properties according
oligonucleotides
modified anti
rna
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000691
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФЛРБЕР
Артур Викторович МАРТЫНОВ
Original Assignee
Farber Boris Slavinovich
Farber Sof Ya Borisovna
Martynov Artur Viktorovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farber Boris Slavinovich, Farber Sof Ya Borisovna, Martynov Artur Viktorovich filed Critical Farber Boris Slavinovich
Priority to PCT/RU2010/000691 priority Critical patent/WO2012070965A1/ru
Priority to EA201300489A priority patent/EA025625B1/ru
Priority to US12/931,468 priority patent/US20120130060A1/en
Publication of WO2012070965A1 publication Critical patent/WO2012070965A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised

Definitions

  • the invention relates to medicine, namely to pharmacy and oncology, and is intended for the treatment of human oncological diseases.
  • RNA synthesized DNA
  • Nucleotide sequences associated with the development of prostate and lung cancer are known [ 14 ].
  • the mechanism of action of these miRNAs is associated with suppression of protein synthesis through the blockade of translation of messenger RNA.
  • the authors have patented miRNA sequences, confirmed their effects in cell cultures, showed the specificity of these oligonucleotides for these two types of tumors.
  • the main disadvantages of the patent are that the authors did not show the possible ways of using these microRNAs to fight cancer, did not show how these oligonucleotides can be protected from the action of nucleases in the body, and did not show the anti-cancer effect of drugs based on these microRNAs.
  • oligonucleotides containing modified and unnatural nucleotide bases [ 15 ].
  • the mechanism of action of the patented oligonucleotides was similar to antisense RNA and micro RNA, and drugs could be used in the treatment of, including oncological diseases.
  • the disadvantage of patented oligonucleotides is the use of the natural principle of binding to the target RNA — a hydrogen bond sensitive to nucleases and helicases.
  • a clear static chemical structure was patented, unable to adapt to environmental conditions.
  • the basis of the invention is the task to develop modified anti-complementary oligonucleotides with anticancer properties and a method for their preparation.
  • the problem is solved by obtaining modified anticomplementary oligonucleotides with anticancer properties that differ in that the oligonucleotides use a mixture (ensemble) of products of hydrolysis of polynucleotides, and the modification is carried out by reversing the charges of the nucleotide base molecules, which acquire anticomplementary properties.
  • the problem is also solved by developing a method for producing modified anti-complementary oligonucleotides with anticancer properties, characterized in that to obtain them, partial hydrolysis of the polynucleotides (DNA, RNA or a mixture thereof) of plant, animal, microbial or fungal origin is carried out by chemical or biochemical (enzymatic) way, and then They carry out the process of chemical modification of the sum of the obtained oligonucleotides by replacing the charge of the molecules of their nucleotide bases to the opposite one by alkylation with monochloracetic acid or acylation with succinic anhydride and use as an anticancer agent a mixture (ensemble) of the obtained anti-complementary oligonucleotides.
  • FIG. 1. Specific hybridization of acylated RNAs only with their predecessors (below - the same reaction with DNA plasmids)
  • FIG. 2. Replacing the hydrogen bond with the ionic bond in the formation of hybrids between antican and targets
  • FIG. 3- Sarcoma. Hematoxylin-eosin stain.
  • RNAs acyl DNAs
  • RNAs acyl DNAs
  • tannides proteins, polysaccharides, polynucleotides, and tannides, bacteriophages, immunoglobulins. Based on these studies, a new veterinary antiviral drug was developed and introduced [ 16 ].
  • a certain precision modification of the structure of a biopolymer is capable of either increasing its biological activity, completely changing its properties, or leading to the formation of self-organizing structures.
  • the regularities we discovered were the basis for the principle of obtaining miRNAs with acylated exocyclic amino groups.
  • An ensemble is a term from supramolecular chemistry.
  • the objects of supramolecular chemistry are supramolecular ensembles built spontaneously from complementary, that is, having geometrical and chemical matching fragments, similar to spontaneous assembly of complex spatial structures in a living cell [ 17 , 18 ]
  • antican This drug is called antican.
  • liposomal forms of some promising drugs we studied the liposomal forms of some promising drugs and, based on those data, developed a dosage form for anticans
  • MicroRNA is a new class of non-coding RNAs with a length of 18-25 nucleotides, which negatively regulate post-translational gene expression.
  • the mechanism of action of these small RNA fragments is based on the interaction (hybridization) of microRNA with messenger RNA directly in the polyribosomal complex. Such hybridization leads to a halt in the synthesis of a particular protein.
  • the role of miRNAs in oncogenesis and the prospects for using miRNAs in cancer therapy are presented in a review [ 19 ]. But miRNAs are not able to spontaneously penetrate the cell membrane.
  • studies are underway to create a variety of transport systems for the delivery of microRNAs to target cells. The most promising carriers are liposomes, polymeric nanoparticles, self-organizing polymers.
  • anticans To enhance the accumulation of anticans in the tumor, it was included in monolamellar phosphotidylcholine liposomes.
  • Selective accumulation of an antican in a cancer cell leads to its hybridization with complementary targets in messenger RNA cancer cell and to a gradual stop of protein synthesis, the antican block not only intron, but exon regions in the matrix RNA, which leads to an almost instant stop of protein synthesis.
  • the action of antican is based on the induction of apoptosis through the stop of protein synthesis, antican actually does not affect healthy cells, blocks the synthesis of all cellular proteins, excludes the adaptation of a cancerous tumor to therapy and selection of resistant cells.
  • the molecular mechanism of action of the drug has not been studied.
  • Anticanum In addition to anticancer activity in vitro, Anticanum also showed high in vivo activity in models of benzidine sarcoma in rats and Ehrlich ascites adenocarcinoma in mice (data presented in the report).
  • Example 1 Obtaining an ensemble (mixture) of modified oligonucleotides (Antikan)
  • Microbial biomass contains up to 11% of nucleic acids and can serve as a raw material for the production of microbial RNA, on the basis of which it is possible to obtain derinates, which are a mixture of oligonucleotides.
  • the object of research at this stage of the work was RNA isolated from the biomass of yeast p. Saccharomyces cerevisiae Isolation of total RNA from baker's yeast. 4 kg of pressed yeast were thawed at room temperature, crushed and suspended in 8 l of boiling water containing 300 g of DDS-Na.
  • the suspension was boiled for 40 min with continuous stirring, then it was poured into steel centrifuge cups, they were immediately placed on ice and cooled to 5 ° ⁇ ( ⁇ 15 min), after which they were centrifuged on a 6K15 centrifuge made in Germany (17000 g, 10 min, 4 ° C). The precipitate and part of the jelly-like interphase were discarded, and the RNA transferred to the supernatant was purified. For this, NaCl was added to the supernatant obtained in the previous stage to a final concentration of 3 M. After the salt was dissolved, the suspension was kept for 1 h to form a precipitate, which was then separated by centrifugation at 17000 g for 10 min.
  • the precipitate was washed with two portions of 8 L of 3 M NaCl, suspended in 2 L of ethanol and left overnight. The next day, the suspension was centrifuged at 17,000 g for 10 minutes. The precipitate was dissolved in distilled water to an RNA concentration of 450 D260, units / ml (-1.6 L). The solution was clarified by centrifugation under the same conditions, after which RNA was precipitated from the supernatant by adding NaCl to a final concentration of 0.15 M and an equal volume of ethanol (-2 L). The formed precipitate was separated from the supernatant by centrifugation (17000 g, 10 min), washed with 1 L of ethanol, and dried in a vacuum desiccator over CaCl. All operations were carried out at 0-4 ° C. Isolation of High Polymer RNA from Baker's Yeast
  • RNA extraction 7.5 g of DCS-Na was dissolved in 300 ml of water in a 1 L heat-resistant glass beaker, the solution was brought to a boil and 30 g of dry yeast were poured into it for 5 minutes so that the temperature of the suspension did not drop below 98 ° C. The resulting suspension was boiled for 40 minutes with continuous stirring, and boiling water up to 300 ml was added to it as it was evaporated. At the end of the extraction, the suspension was cooled to ⁇ 60 ° C, freshly boiled water was added to it up to 450 ml, stirred, transferred to a 500 ml measuring cylinder and set to stand at 20 ° C for 22 hours.
  • RNA salting out and washing out salted RNA with 3 M NaCl was transferred to a 500 ml volumetric glass beaker, 81 g of NaCl and water up to 450 ml were added to it, stirred and set to stand at 19 ° ⁇ for 6 h. After 6 h, the formed interphase (250 ml) was removed, and in the divided into 2 fractions (part settled, part emerged) salted RNA was added with 3 M NaCl to 450 ml, mixed and set to stand at 19 ° ⁇ overnight.
  • Interphase 300 ml was taken, and 3 M NaCl was added to salted RNA to 450 ml, stirred and set to stand at 19 ° C for 5 hours. After 5 hours, interphase (280 ml) was removed, and 3 M was added to salted RNA NaCl to 450 ml, stirred and set to stand at 19 ° C for 3 hours. After 3 hours, the interphase (250 ml) was removed, and to the salted out
  • RNA was added with 3 M NaCl to 450 ml, mixed and set to stand at 19
  • RNA suspension was poured in a thin layer into a flat bath and dried in air at room temperature until there was no smell of alcohol. Pure high-polymer RNA from the dried semifinished product was isolated by extraction with water in a cellophane dialysis bag.
  • RNA hydrolysis Enzymatic hydrolysis of the resulting amount of RNA.
  • pancreatic ribonuclease RNAse
  • RNA hydrolysis was carried out for 4 hours. The hydrolyzate was dried in a spray dryer.
  • hydrolyzate oligonucleotides Chemical modification of the hydrolyzate oligonucleotides. A 3.5% aqueous hydrolyzate solution was obtained, succinic anhydride was added in an amount of 10 to 45% of the dry weight of the hydrolyzate, stirred in the cold until the anhydride was completely dissolved. The resulting solution was sterilized for 120 minutes with flowing steam. The finished solution was further examined for anticancer properties.
  • a mid-lethal dose of anticanan was established in 3 animal species: rootless white mice weighing 20-22 g, white rats weighing 190-200 g and guinea pigs weighing 300-400 g of both sexes when administered intravenously.
  • rootless white mice weighing 20-22 g
  • white rats weighing 190-200 g
  • guinea pigs weighing 300-400 g of both sexes when administered intravenously.
  • Taxotere we established a mortal dose of Taxotere also when administered intravenously.
  • XI and X2 the value of the two extreme of the three studied doses, which have an effect in less than or more than 50% of animals, the third dose is an intermediate;
  • Y1 and ⁇ 2 are mortality rates that correspond to doses XI and X2;
  • ⁇ is the sum of the three doses studied
  • Antican mice were injected slowly intravenously (vector liposomes were prepared before use: to a dry lyophilized ANTIKAN powder, which was taken in appropriate doses, a solution of 0.9% sodium chloride was added) in doses of 1000,1500,2000,2500,3500 ⁇ g / kg animal. An analysis of the results indicates that the average lethal dose of the drug for this animal species is 2780 mcg / kg.
  • the study of anticanan in rats at doses of 1000, 2000,2500,3000, 3500, 4000 ⁇ g / kg made it possible to calculate the average lethal dose for this species of animals - 2590 ⁇ g / kg.
  • the average lethal dose of antican for guinea pigs is 2420 mcg / kg.
  • LD 50 120 ⁇ g / kg body weight.
  • the antikan has no species sensitivity or it is slowly expressed.
  • Anticancer anticancer activity in cell culture was determined in a HeLa-2 cell culture. For this, different amounts of antikan from 2 to 12 ⁇ g / ml of medium were added to medium 199, (see table 2) For control, a culture without antikan was used. Cell cultures were monitored for 5 days with daily viewing. The minimum active dose (MAD) of an antikan was considered its minimum amount, which caused the degeneration of 90-95% of cells (Table 2) Table 2 - Comparative characteristics of the sensitivity of the culture of HeLa-2 tumor cells relative to the antican.
  • MAD minimum active dose
  • the effective dose of antican is in the range between 8-12 ⁇ g / ml of solution.
  • the anticanan reduced the mass of experimental animals by 10 g, while in the control animals the body weight continued to grow, and some of them died.
  • the animals treated with antikan had no signs of malignant transformation of the granuloma into sarcoma.
  • n 10, p> 0.05 compared with the control and previous data.
  • the anticanan doubles against the taxotere the life expectancy of animals.
  • Example 5 A study of the antitumor effect of Antikan on Ehrlich ascites adenocarcinoma
  • the antitumor effect of the compositions was studied on Ehrlich ascites carcinoma models in young mppeys of the Barbados line of both sexes weighing 15-17 g (68 pieces), which were kept on the diet of vivarium.
  • mice were inoculated from a mouse with adenocarcinoma with an insulin syringe 0.1 ml ascites fluid in the liver. After 7 days, 42 mppeys showed signs of a tumor (increased body weight and size of the abdomen), 2 mice died on the second day, 1 mouse did not show signs of a tumor.
  • mice Ten mice were injected with anticanin in liposome form (see Tab. 6). Another 10 mice were injected with anticanan substance, ten more - 0.9% sodium chloride solution with lipin. Table 6 - Quantitative biological and statistical characteristics in the study of anticancer activity of antican.
  • n 10, p> 0.05 in comparison with the control and previous data. Anticanum was administered to those mice in which blood was taken. Adenocarcinoma Mice
  • Ehrlich after tumor inoculation and treatment, lived 18 days when using the substance of antican, which is 6 times longer than in the control, and 37 days when using antican in liposomes, which is 12 times longer than in the control. With a reliability of more than 99.5%, it can be argued that the anticancer activity of liposomal antikan against the control — taxotere — is significantly increased. After anatomizing animals, no signs of tumors and metastases were found in animal organs.
  • Example 6 Study of the distribution of Antikan liposomes in animals.
  • a biologically inert 5,6-benzocoumarin was used, which has a lipophilic character and fluorescent properties.
  • the latter was dissolved in alcohol (0.5 M solution), and phospholipid was added to the solution when creating liposomes in the amount of 0.01 ml of coumarin solution per 10 ml of phospholipid solution.
  • the highest fluorescence was observed in the liver and in ascitic fluid, which confirms the tropism of liposomes to the tumor.
  • liposomes were distributed to the spleen, liver and lymph nodes.
  • liposomes were studied in the body of tumor-bearing mice (5 animals) and healthy rats (5 animals) after the infusion of antican.
  • * relative fluorescence is the percentage of fluorescence relative to the fluorescence intensity of the introduced anticanan solution.
  • the invention relates to medicine and veterinary medicine, and in particular to oncology, and can be used in the treatment of cancer infections of animals and humans.
  • the invention relates to medicine and pharmacy, namely to oncology and pharmacy, and can be used to create new, more effective anti-cancer drugs, which are dynamic self-adaptive and self-organizing systems.
  • the preparations obtained in this way are completely environmentally friendly, biodegradable and fully metabolizable both in the patient’s body and in the environment, and the technologies for their preparation are completely waste-free.
  • the production of such drugs is feasible on existing equipment of pharmaceutical enterprises and does not require unique equipment.
  • the raw material base is available and does not require additional efforts for cultivation or production.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для создания препарата, эффективного для лечения онкологических заболеваний человека и животных. Суть изобретения: Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с про- тивораковыми свойствами и способ их получения, отличающиеся тем, что в качестве олигонуклеотидов используют смесь продуктов гидролиза полинуклеотидов, а модифика- цию проводят путем изменения на противоположный знак зарядов молекул нуклеотид- ных оснований, приобретающих при этом антикомплиментарные свойства. Гидролиз по- линуклеотидов проводят с применением природных или синтетических нуклеаз, кислот- ного или щелочного гидролиза, а модификацию структуры - путем ацилирования аминог- рупп мононуклеотидов в структуре олигонуклеотидов ангидридами дикарбоновых кислот или путем алкилирования галогенкарбоновыми кислотами. Разработанная смесь обладает способностью селективно связьшаться с мРНК и останавливать тем самым синтез белка в раковых клетках подобно действию микроРНК. Применение препарата в связи с его способностью адаптироваться к организму позволяет преодолевать превыкание опухоли к препарату. Средство имеет широкий спектр действия, малотоксично и доступно для промышленного производства, эффективно на всех стадиях ракового процесса.

Description

Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно, к фармации и онкологии и предна- значено для лечения онкологических заболеваний человека.
Предшествующий уровень техники
Среди существующих новых направлений в лечении онкологических заболеваний существует ряд весьма перспективных подходов. Одним из таких подходов можно счи- тать разработку препаратов для генной терапии рака [']. В данном подходе основным дей- ствующим началом являются полинуклеотиды. Генную терапию можно разделить на две большие группы: средства для инактивации генов [ ] и средства для внесения генного ма- териала внутрь клетки [3]. Инактиваторы генов еще называют antisense полинуклеотиды [4]. Многочисленные исследования, которые проводятся в данном направлении, реально эффективных in vivo препаратов не выявили. Это связано с целым рядом проблем: синте- зированные ДНК (РНК) быстро разрушались нуклеазами крови [5], не проникали внутрь клеток, разрушались системами репарации генома [6]. Иногда in vitro наблюдалась кратко- временная блокада экспрессии белков-мишеней, накопление в гепатоцитах [7]. Существу- ют разные подходы к проектированию antisense олитонуклеотидов, но принцип их взаи- мо действия с мишенями остается один: образование водородных связей между компле- ментарными нуклеотидами при увеличении степени устойчивости к нуклеазам [ ]. В од- них случаях разработчики защищали от действия нуклеаз 5'- конец олигонуклеотида, в других- модифицировали 3'- конец [9,10]. Исследователи из США заменили дезоксирибо- зильные остатки на фрагменты морфолина с целью создать устойчивые к действию нукле- аз фрагменты ДНК (РНК) [п, 12]. При этом принцип инактивации генов путем их компле- ментарного взаимодействия с antisense-нуклеотидами остался прежним - образование во- дородных связей. Именно эта водородная связь и является основной причиной неэффек- тивности существующих препаратов на основе antisense - ДНК (РНК). Ферменты типа ге- ликаз [13] очень быстро и легко раскручивают гибридизованную с геном-мишенью antisense - ДНК и активность гена снова восстанавливается.
Известны нуклеотидные последовательности, связанные с развитием рака пред- стательной железы и легких [14]. Механизм действия этих микроРНК связан с подавлени- ем синтеза белка, через блокаду трансляции матричной РНК. Авторы запатентовали по- следовательности микроРНК, подтвердили их эффекты в клеточных культурах, показали специфичность данных олигонуклеотидов к этим двум видам опухолей. Основными не- достатками патента является то, что авторы не показали возможные пути применения данных микроРНК для борьбы с онкологическими заболеваниями, не показали, как можно защитить эти олигонуклеотиды от действия нуклеаз в организме, не показали противора- кового эффекта препаратов на основе этих микроРНК.
Наиболее близким прототипом являются олигонуклеотиды содержащие модифи- цированные и неприродные нуклеотидные основания [15]. Механизм действия запатенто- ванных олигонуклеотидов был аналогичен antisense RNA и micro RNA, а препараты могли применяться в лечении, в том числе онкологических заболеваний. Недостатком патентуе- мых олигонуклеотидов является применение природного принципа образования связи с РНК-мишенью - водородной связи, чувствительной к нуклеазам и геликазам. Кроме того, патентовалась четкая статическая химическая структура, не способная адаптироваться к окружающим условиям. Применение объекта данного патента не было эффективным в экспериментах на моделях животных при онкологических заболеваниях, кроме того, дан- ная разработка применима более для диагностических и скрининговых исследований in vitro, чем создание препаратов для лечения животных и человека в связи с тем, что пред- лагаемые модификации нуклеотидных оснований являются новыми ксенобиотиками и не подлежат безопасному метаболизму и биодеградации в организме.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставленная задача разработать модифицированные анти- комплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получе- ния.
Поставленная задача решается путем получения модифицированных антиком- плементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами отличающимися тем, что в качестве олигонуклеотидов используют смесь (ансамбль) продуктов гидролиза по- линуклеотидов, а модификацию проводят путем изменения на противоположный знак зарядов молекул нуклеотидных оснований, приобретающих при этом антикомплиментар- ные свойства.
Также поставленная задача решается путем разработки способа получения моди- фицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами, отличающегося тем, что для их получения сперва проводят частичный гидролиз поли- нуклеотидов ( ДНК, РНК или их смеси) растительного, животного, микробного или гриб- кового происхождения химическим или биохимическим (ферментативным) путем, а затем проводят процесс химической модификации суммы полученных олигонуклеотидов с за- меной заряда молекул их нуклеотидных оснований на противоположный путем алкилиро- ванием монохлоруксусной кислотой или ацилированием янтарным ангидридом и исполь- зуют в качестве противоракового средства смесь (ансамбль) из полученных антикомпле- ментарных олигонуклеотидов.
Краткое описание чертежей Фиг. 1.- Специфичная гибридизация ацилированных РНК только со своими предшествен- никами (ниже - та же реакция с ДНК-плазмидами)
Фиг. 2. - Замена водородной связи на ионную при образовании гибридов между антикан и мишенями
Фиг. 3- Саркома. Окраска гематоксилин - эозин.
Лучший вариант осуществления изобретения
В наших ранних исследованиях при изучении ацилированных полинуклеотидов был выявлен новый феномен: ацилированные по экзоциклическим аминогруппам поли- нуклеотиды селективно гибридизуются только со своими неацилированными предшест- венниками. Плазмида pUC18 гибридизовалась только со своим ацилированным производ- ным, а плазмида pBR322 гибридизовалась соответственно только с ацилированной pBR322 (Фиг.1). При этом образовывались нерастворимые, неплавкие конъюгаты. Именно свойство неплавкости отличало классические двухспиральные ДНК от полученных гиб- ридов. Они не плавились ни при какой температуре и не растворялись ни в чем, кроме концентрированных щелочей. Данное свойство синтезированных ацил-ДНК мы объясня- ем изменением самого принципа образования связи между цепями ДНК: с водородной на ионную и смешанную.
Такая связь (Фиг. 2) абсолютно не предусмотрена природными механизмами репа- рации. Таким образом, клеточные геликазы и нуклеазы будут неэффективными при обра- зовании гибридов между такими ацил-ДНК (РНК) и их неацилированными предшествен- никами. Кроме полинуклеотидов, нами была показаны зависимость заряд-активность и в ряду других ацилированных биополимеров: белков, полисахаридов, полинуклеотидов, з таннидов, бактериофагов, иммуноглобулинов. На основе этих исследований разработан и внедрен новый ветеринарный противовирусный препарат [16]. Нами было установлено, что определенная прецизионная модификация структуры биополимера способна или уве- личить его биологическую активность, полностью изменить свойства или привести к об- разованию самоорганизующихся структур. Обнаруженные нами закономерности были положены в основу принципа получения микроРНК с ацилированными экзоциклическими аминогруппами. Нами использован ансамбль из олигонуклеотидов - продуктов гидролиза полинуклеотидов, но с измененными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии— супрамоле- кулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т. е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сбор- ке сложнейших пространственных структур в живой клетке [17,18]
Данный препарат получил название антикан. Ранее нами были изучены липосо- мальные формы некоторых перспективных препаратов и на основе тех данных разработа- на лекарственная форма для антикан
МикроРНК это новый класс некодирующих РНК длинной 18-25 нуклеотидов, ко- торые негативно регулируют посттрансляционную экспрессию генов. Механизм действия этих малых фрагментов РНК основан на взаимодействии (гибридизации) микроРНК с матричной РНК прямо в полирибосомальном комплексе. Такая гибридизация приводит к остановке синтеза конкретного белка. Роль микроРНК в онкогенезе и перспективы ис- пользования микроРНК в терапии рака представлены в обзоре [19]. Но микроРНК не спо- собны самопроизвольно проникать через клеточную мембрану. В настоящий момент ве- дутся исследования по созданию разнообразных транспортных систем для доставки мик- роРНК в клетки-мишени. Наиболее перспективными носителями являются липосомы, по- лимерные наночастицы, самоорганизующиеся полимеры.
Известна способность многих аденокарцином захватывать из межклеточного мат- рикса посредством пиноцитоза олигонуклеотиды и наночастицы [20,21]. При этом здоро- вые клетки не способны захватывать малые олигонуклеотиды и липосомы [ ]. Это обес- печивает селективность накопления антикан в раковых клеток и отсутствие токсичности у препарата. Для получения антикан нами была использована суммарная дрожжевая РНК, фрагментированная панкреатической нуклеазой до фрагментов размерами от 2 н до 15 н с Затем экзоциклические аминогруппы этих олигонуклеотидов были модифицированы с заменой заряда. Для усиления накопления антикан в опухоли, он был включен в монола- мелярные фосфотидилхолиновые липосомы. Селективное накопление в раковой клетке антикан приводит к его гибридизации с комплементарными мишенями в матричной РНК раковой клетки и к постепенной остановке синтеза белка, антикан блокирует не только интронные, но экзонные области в матричной РНК, что приводит практически к мгновен- ной остановке синтеза белка Действие антикан основано на индукции апоптоза через ос- тановку синтеза белка, антикан фактически не влияет на здоровые клетки, блокирует син- тез всех клеточных белков, исключает адаптацию раковой опухоли к терапии и селекцию устойчивых клеток.
Молекулярный механизм действия препарата не изучался.
Антикан кроме противораковой активности in vitro, также проявил высокую актив- ность in vivo на моделях бензидиновой саркомы у крыс, асцитной аденокарциномы Эрли- ха у мышей (данные представлены в отчете).
Пример 1.- Получение ансамбля (смеси) модифицированных олигонуклеотидов (Ан- тикан)
Микробная биомасса содержит до 11% нуклеиновых кислот и может служить сырьем для получения микробной РНК, на основе которой возможно получение дерина- тов, представляющих собой смесь олигонуклеотидов. Объектом исследований данного этапа работы явилась РНК, выделенная из биомассы дрожжей p. Saccharomyces cerevisiae Выделение суммарной РНК из пекарских дрожжей. Размораживали при ком- натной температуре 4 кг прессованных дрожжей, измельчали их и суспендировали в 8 л кипящей воды, содержащей 300 г ДДС-Na. Суспензию кипятили 40 мин при непрерыв- ном перемешивании, затем разливали по стальным центрифужным стаканам, помещали их немедленно в лед и охлаждали до 5 °С (~15 мин), после чего центрифугировали на центрифуге 6К15 производства Германии (17000 g, 10 мин, 4°С). Осадок и часть желеоб- разной интерфазы отбрасывали, а перешедшую в надосадочную жидкость РНК очищали. Для этого к надосадочной жидкости, полученной на предыдущей стадии, добавляли NaCl до конечной концентрации 3 М. После растворения соли суспензию выдерживали в тече- ние 1 ч для формирования осадка, который далее отделяли центрифугированием при 17000 g, в течение 10 мин. Осадок промывали двумя порциями по 8 л 3 М NaCl, суспенди- ровали в 2 л этанола и оставляли на ночь. На следующий день суспензию центрифугиро- вали при 17000 g, в течение 10 мин. Осадок растворяли в дистиллированной воде до кон- центрации РНК 450 D260 ,ед./мл (-1,6 л). Раствор осветляли центрифугированием при тех же условиях, после чего из надосадочной жидкости РНК осаждали, добавляя NaCl до ко- нечной концентрации 0,15 М и равный объем этанола (-2 л). Сформировавшийся осадок отделяли от супернатанта центрифугированием (17000 g, 10 мин), промывали 1 л этанола и высушивали в вакуум— эксикаторе над СаС1 . Все операции проводили при 0-4 °С. Выделение высокополимерной РНК из пекарских дрожжей
День 1— экстракция РНК. Растворяли 7,5 г ДЦС-Na в 300 мл воды в термостой- ком стеклянном стакане на 1 л, доводили раствор до кипения и высыпали в него в течение 5 мин 30 г сухих дрожжей так, чтобы температура суспензии не опускалась ниже 98 °С. Полученную суспензию кипятили 40 мин при непрерывном перемешивании и по мере упаривания добавляли в нее кипящую воду до 300 мл. По окончании экстракции суспен- зию охлаждали до ~ 60 °С, добавляли в нее свежевскипяченную воду до 450 мл, переме- шивали, переносили в мерный цилиндр на 500 мл и ставили отстаиваться при 20 °С на 22 ч. День 2— высаливание РНК и промывка высоленной РНК 3 М NaCl. Отстоявшийся супернатант (280 мл) переносили в мерный стеклянный стакан объемом 500 мл, добавляли в него 81 г NaCl и воду до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19 °С на 6 ч. Через 6 ч образовавшуюся интерфазу (250 мл) отбирали, а в разделившуюся на 2 фракции (часть осела, часть всплыла) высоленную РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемеши- вали и ставили отстаиваться при 19 °С на ночь.
День 3— промывка высоленной РНК 3 М NaCl.
Интерфазу (300 мл) отбирали, а к высоленной РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19 °С на 5 ч. Через 5 ч интерфазу (280 мл) от- бирали, а к высоленной РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили от- стаиваться при 19 °С на 3 ч. Через 3 ч интерфазу (250 мл) отбирали, а к высоленной
РНК добавляли 3 М NaCl до 450 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19
°С на ночь.
День 4— промывка высоленной РНК спиртом. Верхнего слоя почти нет. Оса- док занимает объем - 100 мл. Супернатант удаляли, а к осадку добавляли этанол до 300 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 18 °С на 5 ч. Через 5 ч супернатант слива- ли, а к осадку (140 мл) добавляли свежую порцию этанола до 320 мл, перемешивали и ставили отстаиваться при 19 °С на 40 мин, после чего супернатант сливали, а к осадку (120 мл) добавляли 120 мл свежего этанола, перемешивали и через 30 мин отстоя суперна- тант сливали. К осадку (110 мл) добавляли 110 мл свежего этанола, перемешивали и через 30 мин отстоя супернатант сливали, а суспензию РНК выливали тонким слоем в плоскую ванночку и сушили на воздухе при комнатной температуре до отсутствия запаха спирта. Чистую высокополимерную РНК из высушенного полуфабриката выделяли экстракцией водой в целлофановом диализном мешке.
Ферментативный гидролиз полученной суммы РНК. В качестве нуклеазы бы- ла выбрана панкреатическая рибонуклеаза (РНК-аза) с активностью 14000 ед./мг в коли- честве 0,4 % от массы РЫК. Гидролиз РНК проводили в течение 4 часов. Гидролизат вы- сушивали в распылительной сушилке.
Химическая модификация олигонуклеотидов гидролизата. Получали 3,5 % водный раствор гидролизата, добавляляли янтарный ангидрид в количестве от 10 до 45% от сухой массы гидролизата, перемешивали на холоде до полного растворения ангидрида. Полученный раствор стерилизовали 120 минут текучим паром. Готовый раствор далее ис- следовали на предмет наличия противораковых свойств.
Пример 2.— Изучение острой токсичности Антикана
Было поставлено 36 серий опытов на 220 животных.
Среднесмертельную дозу антикана устанавливали на 3 видах животных : безпоро- дних белых мышах массой 20-22 г, белых крысах массой 190-200 г и морских свинках массой 300-400 г обоего пола при внутривенном введении. С целью сравнения широты терапевтического действия антикана и препарата сравнения - таксотера - мы устанавлива- ли сруднесмертульную дозу таксотера также при внутривенном введении.
Расчет среднесмертельной дозы проводили по методу Б.М. Штабского с использо- ванием уравнения :
Y - a
Х = (1)
а
Where Y- % of effect
Υι - Υι
a =
Xx - X2 где :
XI и Х2 - значение двух крайних из трех исследованных доз, которые имеют эффект в ме- нее или более 50% животных, третья доза является промежуточной;
Y1 и Υ2- проценты летальности, которые отвечают дозам XI и Х2;
ΣΥ- сумма трех исследованных доз;
количество доз, которые использовались при расчетах равно 3.
При подстановке к формуле (1) значения Υ, которое составляет 50,84,16 процентов смертности, рассчитывали LDso, LD 84 и LD ι6- Потом находили d- среднюю ошибку среднесмертельной дозы, благодаря использованию формулы Миллера-Тейнтера:
2 5
т=
2N
LD 84- LD 16,
Ν-общее количество животных в группах, в которых погибло или выжило хоть од- но животное, и устанавливали доверительные интервалы.
Мышам антикан вводили внутривенно медленно (перед использованием готовили векторные липосомы : к сухому лиофилизированному порошку АНТИКАН, который бра- ли в соответствующих дозах, добавляли раствор 0,9 % натрию хлорида) в дозах 1000,1500,2000,2500,3500 мкг/кг массы животного. Анализ результатов свидетельствует об о том, что среднесмертельная доза препарата для этого вида животных составляет 2780 мкг/кг .
Исследование антикана на крысах в дозах 1000, 2000,2500,3000, 3500, 4000 мкг/кг дало возможность рассчитать среднесмертельную дозу для этого вида животных - 2590 мкг/кг. Среднесмертельная доза антикана для для морских свинок составляет 2420 мкг/кг массы.
При внутривенном пути использования таксотера крысам LD 50 = 120 мкг/кг массы тела.
Сравнительная характеристика Антикана и Таксотера приведена в табл. 5. Таблица 1 - Сравнительные характеристики Антикана и Таксотера.
Figure imgf000011_0001
Анализ полученных данных, которые показаны в таблице 1, приводит к выводу о том, что антикан в липосомах менее токсичен, чем препарат таскотер, и превосходит пре- парат сравнения по эффективной дозе. Терапевтический индекс, который характеризует широту терапевтического действия, у антикана в 151,5 раз больше, чем у препарата срав- нения благодаря липосомальной форме. Для экстраполяции токсичности антикана на че- ловека мы рассчитали коэффициент видовой чувствительности (КВЧ) по формуле :
LD50 (для крыс) 2590
КВЧ— = 0,9
LD50 (для мышей) 2780
Таким образом, антикан не имеет видовой чувствительности или она медленно вы- ражена.
Пример 3- Противораковая активность антикана
Определение противораковой активности антикана в клеточной культуре прово- дили в культуре клеток HeLa-2. Для этого к среде 199 добавляли разное количество анти- кана от 2 до 12 мкг/мл среды, (см.таб 2) Для контроля использовали культуру без антика- на. Наблюдение за культурами клеток вели в течение 5 суток с ежедневным просмотром. Минимальной активной дозой (МАД) антикана считали такое его минимальное количест- во, которое вызывало дегенерацию 90-95% клеток (Таб. 2) Таблица 2 - Сравнительная характеристика чувствительности культуры опухоле- вых клеток HeLa-2 относительно антикана.
Figure imgf000012_0001
Цитопатическое действие;
M i l дегенерация 100% клеток
0 отсутствие дегенерации.
При установлении минимальной концентрации антикана, которая тормозит рост клеток проведено сопоставление количества клеток, которые выжили, и концентрацией антикана в растворе.
Таблиця 3 - Влияние антикана на клетки HeLa
Figure imgf000012_0002
Доза , мкг/мл Количество клеток Количество жи- Количество живых до инкубации, млн вых клеток после клеток после инку- инкубации, млн, бации, %
±1000
анти- таксотер анти- таксотер кан ткан
Как видно из таблицы 3, эффективная доза антикана находится в пределах между 8-12 мкг/мл раствора.
Антикан приводил к 95 % дегенерации опухолевых клеток. Для подтверждения противоопухолевого действия in vivo антикан был исследован на моделях бензидиновой кожной саркомы и перевивной асцитной аденокарциномы у барбадосских мышей. На 5 мышах с аденокарциномой также исследовали распределение липосом антикана по орга- низму животных благодаря флуоресцентному зонду, растворенному в фосфолипидной оболочке. Пример 4.— Изучение противораковой активности антикана на модели бензидино- вой саркомы (Фиг. 3.)
Перед применением к силикагелю добавляли 7 мл раствору 2% бензидина в 0,9 % натрия хлориде до образования опалесцирующей суспензии ( 1 г силикагеля на 5 мл физ. раствора). Двадцати пяти мышам барбадосской линии массой 18-20 г обоего пола, кото- рых удерживали на рационе вивария через каждых 3 суток подкожно вводили возле шеи иммобилизированные на силикагеле бензидин и форболацетат . Через две недели у 18 жи- вотньгх появились опухоли разных размеров в виде небольшого бугра на шее около сили- кагелевой грануломы. Каждой группе животных вводили парентерально соответствующее соединение в дозе 100 мкг/кг массы два раза на сутки два недели, начиная с 16 дня после введения канцерогена.
Таблица 4 - Сравнение противоопухолевого действия антикана против соединения - аналога (таксотера) и липина.
Название препарата Масса животных (г)
До лечения После лечения
Таксотер 28 ±1,2 23± 1,1 (2 мыши погибли)
Антикан 25± 1,7 15± 1,5
Липосомы пустые 26± 2,1 34 ±1,3 (5 мышей погибло) Примечание: n=7, p>0,05 по сравнению с контролем и предыдущими данными.
Как видно из таблицы 4, антикан уменьшал массу подопытных животных на 10 г, при этом у контрольных животных масса тела продолжала расти, и некоторые из них умерли. После анатомического исследования силикагелевой грануломы было установле- но, что животные, которых лечили антиканом не имели признаков злокачественного пре- вращения грануломы в саркому.
Сроки гибели животных приведены в таб 5.
Таблица 5 - Сроки гибели животных с бензидиновой саркомой кожи
Figure imgf000014_0001
Примечание: п=10, р>0,05 по сравнению с контролем и предыдущими данными. Таким образом, антикан увеличивает вдвое против таксотера продолжительность жизни животных.
Пример 5.- Исследование противоопухолевого действия Антикана на асцитной аде- нокарциноме Эрлиха
Противоопухолевое действие композиций исследовали на моделях асцитной кар- циномы Эрлиха у молодых мьппей барбадосской линии обоего пола массой 15-17 г (68 штук), которых выдерживали на рационе вивария.
45 мышам инокулировали от мыши с аденокарциномой инсулиновым шприцем 0,1 мл асцитной жидкости в область печенки. Через 7 суток у 42 мьппей появились при- знаки опухоли (увеличилась масса тела и размеры живота), 2 мыши погибли на второй день, 1 мышь не подала признаки опухоли.
Десяти мышам вводили антикан в липосомальном виде(см. Таб 6) Еще 10 мышам вводили субстанцию антикана, еще десяти - 0,9% раствор натрия хлорида с липином. Таблица 6 - Количественные биологические и статистические характеристики при исследовании противоопухолевой активности антикана.
Figure imgf000015_0001
Примечание: п=10, р>0,05 в сравнении с контролем и предыдущими данными. Антикан вводили тем мышам, в которых брали кровь. Мыши с аденокарциномой
Эрлиха после перевивки опухоли и лечения жили 18 суток при использовании субстан- ции антикана, что в 6 раз дольше, чем в контроле, и 37 суток при использовании антикана в липосомах, что в 12 раз дольше, чем в контроле. При достоверности больше 99,5% мож- но утверждать о значительном усилении противораковой активности липосомального ан- тикана против контроля - таксотера. После анатомирования животных признаков опухо- лей и метастазов в органах животных найдено не было.
Пример 6.- Исследование распределения липосом Антикана по организму живот- пых.
Для исследования распределения липосом по органам животных использовали биологически инертный 5,6- бензокумарин, который имеет липофыильный характер и флюоресцентные свойства. Последний растворяли в спирте (0,5 М раствор), и добавляли к раствору Фосфолипиду при создании липосом в количестве 0,01 мл раствора кумарину на 10 мл раствора фосфолипида. Наибольшая флуоресценция наблюдалась в печени и в ас- цитной жидкости, которая подтверждает тропность липосом к опухоли. В контроле липо- сомы распределялись в селезенку, печень и лимфоузлы.
Распределение липосом изучали в организме мышей- опухоленосителей (5 живот- ных) и здоровых крыс (5 животных) после инфузионного введения антикана. Антикан вводили в дозе 100 мкг/кг. Через 5 часов животных забивали, и исследовали интенсив- ность флюоресценции на флюориметре HP-F-40M.
Таблица 7 - Накопление антикана в зависимости от скорости введения.
Figure imgf000016_0001
Животные Орган Форма введения анти- Флуоресценция, % *
кана
-II- плазма 23,2+0,1
-II- печень 60,2±0,1
-II- легкие 0,2±0,1
-II- селезенка 0,5+0,1
-II- почки 0,3±0,1
-II- асцитная 5,2±0,1
жидкость
* относительная флуоресценция - процент флуоресценции относительно интенсив- ности флуоресценции введенного раствора антикана.
Как видно из таблицы, при наличии опухоли, накопление антикана идет там, но в зависимости от срока инфузии. Чем быстрее вводится антикан, тем больше его накаплива- ется в печени. Поэтому рациональным является введение антикана в виде медленных ин- фузий.
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а конкретно к онкологии, и мо- жет быть использовано в лечение онкологических инфекций животных и человека.
Промышленная применимость
Изобретение относится к медицине и фармации, а именно к онкологии и фармации и может быть использовано для создания новых более эффективных противораковых препаратов, представляющих собой динамические самоадаптирующиеся и самоорганизующиеся системы. Полученные таким образом препараты являются полностью экологически безопасными, биодеградируемыми и полностью метаболизируемыми как в организме пациентов, так и в окружающей среде, а технологии их получения относятся к группе полностью безотходных. Производство подобных препаратов осуществимо на существующем оборудовании фармацевтических предприятий и не требует уникального оборудования. Сырьевая база доступна и не требует дополнительных усилий для выращивания или производства. Использованные источники информации
I Galasso М, Elena Sana М, Volinia S. Non-coding RNAs: a key to future personalized molecu- lar therapy?// Genome Med. 2010 Feb 18;2(2):12.
Jung J, Solanki A, Memoli KA, Kamei K, Kim H, Drahl MA, Williams LJ, Tseng HR, Lee K. Selective inhibition of human brain tumor cells through multifunctional quantum-dot-based siRNA delivery// Angew Chem Int Ed Engl. 2010;49(l):103-7.
3 Li X, Liu Y, Wen Z, Li C, Lu H, Tian M, Jin K, Sun L, Gao P, Yang E, Xu X, Kan S, Wang Z, Wang Y, Jin N. Potent anti-tumor effects of a dual specific oncolytic adenovirus expressing apoptin in vitro and in vivo// Mol Cancer. 2010 Jan 20;9:10.
4 Emmrich S, Wang W, John K, Li W, Ptitzer BM. Antisense gapmers selectively suppress indi- vidual oncogenic p73 splice isoforms and inhibit tumor growth in vivo// Mol Cancer. 2009 Aug 11;8:61.
5 Fisher M, Abramov M, Van Aerschot A, Rozenski J, Dixit V, Juliano RL, Herdewijn P. Bio- logical effects of hexitol and altritol-modified siRNAs targeting B-Raf// Eur J Pharmacol. 2009 Mar 15;606(l-3):38-44
6 Czauderna F, Fechtner M, Dames S, Aygiin H, Klippel A, Pronk GJ, Giese K, Kaufmann J. Structural variations and stabilising modifications of synthetic siRNAs in mammalian cells// Nucleic Acids Res. 2003 Jun 1;31(11):2705-16.
7 Crooke RM, Graham MJ, Martin MJ, Lemonidis KM, Wyrzykiewiecz T, Cummins LL. Me- tabolism of antisense oligonucleotides in rat liver homogenates. J Pharmacol Exp Ther. 2000 Jan;292(l): 140-9.
8 Monia BP, Johnston JF, Sasmor H, Cummins LL.Nuclease resistance and antisense activity of modified oligonucleotides targeted to Ha-ras. J Biol Chem. 1996 Jun 14;271(24):14533-40.
9 Giles RV, Spiller DG, Green JA, Clark RE, Tidd DM. Optimization of antisense oligode- oxynucleotide structure for targeting bcr-abl mRNA. Blood. 1995 Jul 15;86(2):744-54.
10 Xodo L, Alunni-Fabbroni M, Manzini G, Quadrifoglio F. Pyrimidine phosphorothioate oli- gonucleotides form triple-stranded helices and promote transcription inhibition. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 25;22(16):3322-30.
I I Sazani P, Weller DL, Shrewsbury SB. Safety pharmacology and genotoxicity evaluation of AVI-4658.ini J Toxicol. 2010 Mar-Apr;29(2): 143-56.
12 Mourich DV, Jendrzejewski JL, Marshall NB, Hinrichs DJ, Iversen PL, Brand RM. An- tisense targeting of cFLIP sensitizes activated T cells to undergo apoptosis and desensitizes responses to contact dermatitis. J Invest Dermatol. 2009 Aug;129(8):1945-53. Belon CA, Frick DN. Helicase inhibitors as specifically targeted antiviral therapy for hepati- tis C. Future Virol. 2009 May l ;4(3):277-293
14 Патент США j 7709616 «микроРНК и ее использование».
15 Патент США N° 7579451 Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleo- base
16 http://www.agrovet.com.ua/index.php?id=25
17 http://dic.acadernic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240
Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7) 19 Bagnyukoval T.V., Pogribny LP. Chekhun V.F. MicroRNAs in normal and cancer cells: A
New class of gene expression regulators// Experimental Oncology.-2006, N 28.- P. 263-269 Steinhauser I, Langer K, Strebhardt K, Spankuch B. Uptake of plasmid-loaded nanoparticles in breast cancer cells and effect on Plkl expression. J Drug Target. 2009 Sep;17(8):627-37.
Lu JJ, Langer R, Chen J.A novel mechanism is involved in cationic lipid-mediated functional siRNA delivery. Mol Pharm. 2009 May-Jun;6(3):763-71.
22 Moreira JN, Santos A, Moura V, Pedroso de Lima MC, Simoes S. Non- viral lipid-based nanoparticles for targeted cancer systemic gene silencing. J Nanosci Nanotechnol. 2008
May;8(5):2187-204.

Claims

Формула изобретения
1. Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами, отличающиеся тем, что в качестве олигонуклеотидов используют смесь (ан- самбль) продуктов гидролиза полинуклеотидов, а модификацию проводят путем измене- ния на противоположный знак зарядов молекул нуклеотидных оснований, приобретаю- щих при этом антикомплиментарные свойства.
2. Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами по п.1, отличающиеся тем, что заряд молекул нуклеотидных оснований из- меняют на противоположный путем образования амидной группы в результате реакции ацилирования между ангидридами ди- и три-карбоновых кислот с аминогруппами нуклео- тидных оснований с образованием новых карбоксильных групп.
3. Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами по п.1, отличающиеся тем, что заряд молекул нуклеотидных оснований из- меняют на противоположный путем образования замещенной аминной группы в резуль- тате реакции алкилирования между монохлоруксусной кислотой и аминогруппами нук- леотидных оснований с образованием новых карбоксильных групп.
4. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с про- тивораковыми свойствами, отличающийся тем, что для их получения сперва проводят частичный гидролиз полинуклеотидов, а затем проводят процесс химической модифика- ции суммы (ансамбля) полученных олигонуклеотидов с заменой заряда молекул их нук- леотидных оснований на противоположный и используют в качестве противоракового средства композицию из полученных антикомплементарных олигонуклеотидов.
5. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с про- тивораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что в качестве полинуклеотидов используют ДНК.
6. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с про- тивораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что в качестве полинуклеотидов используют РНК.
7 Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с про- тивораковыми свойствами по п.5, отличающиеся тем, что используют ДНК из дрожжей.
8. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с про- тивораковыми свойствами по п.5, отличающиеся тем, что используют ДНК из животно- го сырья.
9. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с про- тивораковыми свойствами по п.5, отличающиеся тем, что используют ДНК из расти- тельного сырья.
10. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.5, отличающиеся тем, что используют ДНК из мик- робного сырья.
11. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.6, отличающиеся тем, что используют РНК из дрожжей.
12. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.6, отличающиеся тем, что используют РНК из жи- вотного сырья.
13. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.6, отличающиеся тем, что используют РНК из рас- тигельного сырья.
14. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.6, отличающиеся тем, что используют РНК из мик- робного сырья.
15. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что используют смесь РНК и
ДНК из дрожжей.
16. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что используют смесь РНК и ДНК из животного сырья.
17. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что используют смесь РНК и ДНК из растительного сырья.
18. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что используют смесь РНК и ДНК из микробного сырья.
19. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что для частичного гидролиза полинуклеотидов используют ферментативный гидролиз.
20. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что для частичного гидролиза полинуклеотидов используют кислотный гидролиз.
21. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что для частичного гидролиза полинуклеотидов используют щелочной гидролиз.
22. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что для частичного гидролиза полинуклеотидов используют синтетические нуклеазы.
23. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что для химической модифи- кации суммы олигонуклеотидов используют янтарный ангидрид.
24. Способ получения модифицированных антикомплементарных олигонуклеотидов с противораковыми свойствами по п.4, отличающиеся тем, что для химической модифи- кации суммы олигонуклеотидов используют монохлоруксусную кислоту.
PCT/RU2010/000691 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения WO2012070965A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000691 WO2012070965A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения
EA201300489A EA025625B1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения
US12/931,468 US20120130060A1 (en) 2010-11-22 2011-02-01 Modified antisense oligopeptides with anticancer properties and method of obtaining them

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000691 WO2012070965A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/931,468 Continuation US20120130060A1 (en) 2010-11-22 2011-02-01 Modified antisense oligopeptides with anticancer properties and method of obtaining them

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012070965A1 true WO2012070965A1 (ru) 2012-05-31

Family

ID=46064949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000691 WO2012070965A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20120130060A1 (ru)
EA (1) EA025625B1 (ru)
WO (1) WO2012070965A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019212377A1 (ru) * 2018-05-04 2019-11-07 Farber Boris Slavinovich Фармацевтическая композиция на основе полимиксина для лечения инфекционных заболеваний
WO2021067825A1 (en) * 2019-10-02 2021-04-08 Sirnaomics, Inc. Oligonucleotides with nucleoside analogs

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018231090A1 (ru) * 2017-06-16 2018-12-20 Борис Славинович ФАРБЕР Комбинаторные производные олигонуклеотидов рнк

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5854224A (en) * 1996-01-05 1998-12-29 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Composition and method for delivery of nucleic acids
US6316426B1 (en) * 1987-10-28 2001-11-13 Pro-Neuron, Inc. Acylated uridine and cytidine and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69126530T2 (de) * 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US6015676A (en) * 1998-07-31 2000-01-18 Epiclone Inc. Method for knocking out gene transcripts by covalently binding of an anti-sense probe
US6617137B2 (en) * 2001-10-15 2003-09-09 Molecular Staging Inc. Method of amplifying whole genomes without subjecting the genome to denaturing conditions

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6316426B1 (en) * 1987-10-28 2001-11-13 Pro-Neuron, Inc. Acylated uridine and cytidine and uses thereof
US5854224A (en) * 1996-01-05 1998-12-29 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Composition and method for delivery of nucleic acids

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTYNOV A. V. ET AL.: "New approach to design and synthesis of therapeutic and preventive drugs, taking into account interspecies polymorphism of receptors (metod of precision partial modification).", ANNALS OF MECHNICOV INSTITUTE, 2007, pages 5 - 13 *
OLIVER C. RICHARDS ET AL.: "Chemical mechanism of sonic, acid, alkaline and enzymic degradation of DNA.", J. MOL. BIOL, vol. 11, 1965, pages 327 - 340 *
ROBERT HANER ET AL.: "The sequence-specific cleavage of RNA by artificial chemical ribonucleases", ANTISENSE & NUCLEIC ACID DRUG DEVELOPMENT, vol. 7, 1997, pages 423 - 430 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019212377A1 (ru) * 2018-05-04 2019-11-07 Farber Boris Slavinovich Фармацевтическая композиция на основе полимиксина для лечения инфекционных заболеваний
WO2021067825A1 (en) * 2019-10-02 2021-04-08 Sirnaomics, Inc. Oligonucleotides with nucleoside analogs

Also Published As

Publication number Publication date
EA025625B1 (ru) 2017-01-30
US20120130060A1 (en) 2012-05-24
EA201300489A1 (ru) 2013-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ding et al. A self-assembled RNA-triple helix hydrogel drug delivery system targeting triple-negative breast cancer
KR102761411B1 (ko) 정의된 다중 접합체 올리고뉴클레오티드
CN104126010B (zh) 嵌合的双链核酸
JP2016028605A (ja) Ｒｎａ干渉効果が高い脂質修飾２本鎖ｒｎａ
JP6457704B2 (ja) 高活性及びオフターゲット削減のためのｓｉＲＮＡ構造
RU2670164C2 (ru) Улучшенная олигонуклеотидная конструкция типа наночастицы, обладающая высокой эффективностью, и способ ее получения
JP2010510964A (ja) 治療的介入の標的としての、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−２６、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４７、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２１６、ｍｉＲ−３３１、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９２−３ｐによって調節される遺伝子および経路
JP2010504350A (ja) 治療的介入の標的としての、ｍｉＲ−２００によって調節される遺伝子および経路
JP2014506789A (ja) ｍｉＲ−１２４の合成模倣体
CN106467915B (zh) 小干扰RNA及其应用和抑制plk1基因表达的方法
WO2012070965A1 (ru) Модифицированные антикомплементарные олигонуклеотиды с противораковыми свойствами и способ их получения
JP2010504349A (ja) 治療的介入の標的としてｍｉＲ−１４３によって調節される遺伝子および経路
Li et al. Advances in structural-guided modifications of siRNA
Saneyoshi et al. Design, synthesis, and cellular uptake of oligonucleotides bearing glutathione-labile protecting groups
CN102533755A (zh) 人miR-328反义核酸及其应用
CN102140468A (zh) 人miR-185*反义核酸及其应用
CN101418293A (zh) 微小rna-21的反义寡聚核苷酸及其应用
Kozuch et al. Enhanced cancer theranostics with self-assembled, multilabeled siRNAs
CN102643810B (zh) 人miR-299-5p的反义寡聚核苷酸及其应用
EP3500673B1 (en) Carboxylated 2'-amino-lna nucleotides and oligonucleotides comprising the same
CN108431224A (zh) 一种小干扰核酸和药物组合物及其用途
Huse et al. Yin and yang: cancer-implicated miRNAs that have it both ways
CN102643809B (zh) 人miR-1274b的反义寡聚核苷酸及其应用
CN102643813B (zh) 人miR-504的反义寡聚核苷酸及其应用
KR101861738B1 (ko) 마이크로 rna를 포함하는 이중나선 올리고 rna 구조체

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10859942

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201300489

Country of ref document: EA

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10859942

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1