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WO2012067188A1 - ヒト型抗体を産生するb細胞の作製方法 - Google Patents

ヒト型抗体を産生するb細胞の作製方法 Download PDF

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Publication number
WO2012067188A1
WO2012067188A1 PCT/JP2011/076533 JP2011076533W WO2012067188A1 WO 2012067188 A1 WO2012067188 A1 WO 2012067188A1 JP 2011076533 W JP2011076533 W JP 2011076533W WO 2012067188 A1 WO2012067188 A1 WO 2012067188A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
antibody
human
cell
producing
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/076533
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 金山
齊 大森
Original Assignee
国立大学法人岡山大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人岡山大学 filed Critical 国立大学法人岡山大学
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Priority to US13/885,758 priority patent/US20130244907A1/en
Priority to JP2012544298A priority patent/JP5904468B2/ja
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a B cell producing a human antibody.
  • Antibodies produced by the immune system in the living body have been applied not only to reagents but also to medicines and diagnostic agents recently by utilizing their specific target recognition ability.
  • affinity maturation but in antigen-specific B cells that are activated and actively divide, high-frequency somatic mutations occur in the antibody variable region genes. It progresses by strictly selecting a B cell clone that has acquired sex. Utilizing this principle, it is widely used to produce monoclonal antibodies by repetitive immunization of animals and hybridoma production.
  • the chicken B cell line DT40 that retains the ability to introduce a mutation into an antibody gene is suitable for achieving this purpose in the following points.
  • the antibody is expressed on the cell surface and in the culture supernatant, and a specific clone can be selected based on the binding to the antigen.
  • the present inventors have focused on the characteristics of DT40 and established a cell line DT40-SW capable of arbitrarily turning ON / OFF the mutation function of DT40 and developed a method for producing an introvitro antibody using DT40-SW (Patent Literature) 1 and Non-Patent Document 1) (FIG. 1).
  • Patent Literature Patent Literature 1 and Non-Patent Document 1
  • FIG. 1 antibodies against various antigens including those difficult to obtain by conventional methods have been successfully obtained from antibody libraries obtained by culturing with the mutation function turned ON
  • Non-patent Documents 2 and 3 See.
  • the antibody-producing cells can be diversified by introducing mutations again, and the affinity maturation of antibodies can be achieved by repeating selection. It has also succeeded in improving the efficiency of sexual maturity (see Patent Document 3 and Non-Patent Documents 4 and 5).
  • Conventionally used methods for obtaining human antibodies or humanized antibodies include: (a) a method in which an antibody variable region of a heterologous antibody obtained by a hybridoma method or the like is expressed in a host cell as a chimera with a human antibody constant region (patent Reference 3), (b) CDR transplantation in which the antigen-binding portion of the variable region is transplanted to a human antibody (see Patent Documents 4 and 5), (c) Human antibodies prepared from antibody genes isolated from humans There are a method for obtaining an antibody from a phage display library displaying fragments (see Patent Documents 6 and 7), and a method for obtaining an antibody by a hybridoma method from a mouse into which a human antibody gene has been introduced (Patent Document 8). ⁇ 10).
  • Japanese Patent No.4487068 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2009-60850 U.S. Patent No. 6331415 U.S. Pat.No. 5,225,539 US Pat. No. 5585089 U.S. Pat. No. 5,875793 US Pat. No. 5,837,500 US Patent No. 6150584 U.S. Pat.No. 5,545,806 Japanese Patent No. 3030092
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a B cell capable of producing a human-type antibody and capable of spontaneous mutagenesis.
  • the antibody obtained from the above DT40-SW is a chicken IgM antibody, if it becomes possible to obtain a human IgG1-type antibody by an antibody production system using DT40-SW, in pharmaceutical development I thought it would be a very useful technology.
  • human antibodies or humanized antibodies must be prepared for antibody searches for pharmaceutical applications.
  • the human antibody and humanized antibody acquisition techniques (a) to (d) described above are widely used, but have the following problems.
  • (a), (b), and (d) show that there is a problem of immune tolerance because the production of candidate antibodies is based on a hybridoma method that depends on immunity to mice.
  • (A), (b), and (c) require many gene recombination operations and become complicated when handling a large number of candidate antibodies (FIG. 2).
  • a cell line having a mutation ability such as DT40 has been used as a library by introducing mutation into an antibody gene originally retained (Cumbers, S. J., et al. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 ( 2002); Seo, H., et al. Nat. Biotechnol. 23, 731-735 (2005); Todo, K., et al. J. Biosci. Bioeng. 102, 478-481 (2006)).
  • the present inventors considered that it is important that the antibody production system has the following features (1) to (4) in order to solve the above problems.
  • the antibody gene is secreted and expressed in the culture supernatant.
  • the antibody produced is a chicken-human chimeric antibody, but since the constant region is derived from humans, it can be used directly in various tests for drug candidate search, thus speeding up the candidate search.
  • the human-type antibody produced is preferably IgG1, which can be expected to have various effector functions via the heavy chain constant region in vivo, human IgG1-producing DT40-SW was established this time.
  • the light chain constant region the ⁇ chain having the largest abundance in the human body was used.
  • the antibody gene is composed of an exon encoding a leader peptide containing a signal necessary for targeting to the endoplasmic reticulum downstream of the promoter, an exon encoding a variable region, and an exon encoding a constant region (FIG. 4A).
  • the constant region is composed of a plurality of exons, and whether an antibody is expressed as a secreted or membrane-bound type is determined by the difference in the exons used. Therefore, in order to construct a cell having the characteristics as described in (2) to (4) above, the region from CH1 to the secretory exon of the exons encoding the constant region of the heavy chain is defined as the heavy IgG1 antibody heavy chain.
  • DT40-SW In order to produce DT40-SW, it is necessary to (i) isolate and structurally analyze the chicken antibody gene, and (ii) construct a targeting vector that replaces the constant exon of the chicken antibody gene. With the progress of genome analysis, the nucleotide sequence of the light chain antibody gene region has been clarified. However, there is only partial information on the heavy chain, and the unknown region was isolated and a part of the sequence was clarified. Based on the revealed information, we created targeting vectors for the replacement of the heavy chain and light chain antibody constant region genes, and succeeded in establishing cells that produce chimeric antibodies using these vectors. The cells expressed the chimeric antibody on the cell surface and in the culture supernatant. Attempts were made to introduce mutations into the antibody variable region, and the inventors succeeded in introducing mutations with the same efficiency as when wild-type DT40-SW introduces mutations into endogenous antibody genes, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • the Cre recombinase gene of non-human vertebrate B cells exists in such a form that Cre recombinase expresses a fusion protein with an estrogen receptor, and the extracellular stimulation is stimulation by estrogen or a derivative thereof.
  • the method for producing a B cell producing a human-type antibody according to [1], wherein activation of Cre recombinase is induced in the cell by stimulation with estrogen or a derivative thereof from outside the cell.
  • [3] A method for producing a B cell producing a human-type antibody according to [1] or [2], wherein only the constant part of the antibody gene of the non-human vertebrate B cell is replaced with the constant part of the human antibody gene.
  • B-cell producing human-type antibody contains splicing receptor sequence and splicing branch point sequence contained in intron existing upstream of constant region gene, and those downstream from constant region gene Any one of [1] to [4], including a non-human vertebrate B cell as a poly A addition sequence, and further comprising a drug resistance gene sandwiched between loxP sequences upstream of a human constant region gene including a splicing sequence A method for producing a B cell producing a human-type antibody.
  • [6] The human of any one of [1] to [5], wherein the replacement of the antibody gene of the non-human vertebrate B cell with a human antibody gene is performed using a targeting vector that targets the B cell antibody gene.
  • a targeting vector that targets the B cell antibody gene.
  • [7] A method for producing a B cell that produces the human antibody according to any one of [1] to [6], wherein the non-human vertebrate B cell is derived from a chicken B cell line DT40 cell.
  • a non-human vertebrate-derived B cell producing a human-type antibody obtained by the production method of any one of [1] to [8].
  • Human-type antibody mutation live comprising activating Cre recombinase gene and introducing mutation into antibody variable region gene in non-human vertebrate-derived B cells producing human-type antibody of [9] How to create a rally.
  • Cre recombinase exists in a form that expresses a fusion protein with an estrogen receptor, and stimulates the cell with estrogen or a derivative thereof from the outside of the cell.
  • DT40-SW cells have been improved so that human IgG1-type antibodies can be presented on the cell surface and secreted into the culture supernatant.
  • the ability of this cell line DT40-SW-hg to mutate to the antibody variable region gene is superior to that of DT40-SW, which has already been used for the production of antibodies against various antigens. enable.
  • DT40-SW-hg has useful features of DT40-SW: (i) Mutant and expression can be integrated in one cell, so it is easy to produce mutant antibody. (Ii) Antibody on the cell surface It is easy to select the target antibody based on the binding to the antigen, and it is easy to enhance the function of the target antibody by mutation and selection.
  • the mutation function can be stopped and restarted arbitrarily. It produces a human IgG1-type antibody that retains all that can be modified by immobilizing mutations and remutating, and is easy to handle as an antibody. Since the antibody Fc part is human IgG1, when searching for antibodies useful for medicinal use such as various immune reactions via the Fc part, such as antibody-dependent cytotoxicity and complement-dependent cytotoxicity, The function of an antibody that must be evaluated can be rapidly evaluated by directly using a human IgG1-type complete antibody produced from a clone isolated from the DT40-SW-hg antibody library. Since the antibody production system using the cell line produced in the present invention can avoid various problems that have been a problem with conventional human antibody production methods, the development of antibodies useful for the treatment of intractable diseases such as cancer has been developed. It will be an important basic technology to speed up.
  • the target antibody-producing cells can be isolated from the DT40-SW library (1) and stabilized by turning off the mutation function (3). It is also possible to improve the affinity of the antibody by repeating the cycle of mutagenesis and selection again (2). It is a figure which shows the comparison of the conventional method and the antibody production technique of this invention. It is a figure which shows the functional modification of the antibody as human IgG1 type
  • a chicken antibody constant region gene is replaced with a human antibody constant region gene by gene targeting to modify the antibody gene on the genome of DT40 cells (A), and a chimeric antibody of chicken antibody variable region and human antibody constant region is expressed (B ).
  • A shows the outline of preparation of human IgG1 (kappa) constant region production type DT40.
  • B shows the outline of the replacement method of a chicken antibody constant region gene.
  • 6A shows the structure of the targeting vector
  • FIG. 6B shows the structure of the antibody locus of the cell after targeting
  • FIG. 6C shows that the cell after targeting is treated with 4-hydroxy tamoxifen to activate the Cre recombinase, thereby FIG.
  • FIG. 6D shows an example of a production scheme of a human antibody constant region-producing DT40-SW cell, showing the structure of the antibody locus after removal. It is a figure which shows the method of the introduction
  • A shows Chicken C ⁇ locus
  • B shows Human C ⁇ targeting construct
  • C shows Human C ⁇ targeted locus
  • the left figure of FIG. 7 is a schematic diagram of sIg expression. It is a figure which shows construction of a human kappa chain constant region gene targeting vector. It is a figure which shows the result of confirmation of introduction
  • FIG. 9A shows the selection of sIg-clone by FACS
  • FIG. 9B shows the result of confirmation of targeted locus by genomic PCR. It is a figure which shows selection of a human (kappa) chain high expression clone.
  • FIG. 10A shows the result of sorting (clone 2) of hC ⁇ -expressing cells, and is the result of performing single cell sorting for cells in which sIg was recovered by 4-OHT treatment.
  • FIG. 10B shows selection of clones expressing high hC ⁇ by cell sorting.
  • DT40-SW-hk shows that a chicken-human chimeric light chain antibody gene is transcribed.
  • FIG. 11A shows that a chimeric transcription product of chicken light chain variable region and human ⁇ chain constant region is expressed
  • FIG. 11B shows the result of sequence analysis of the amplified product. It is a figure which shows the strategy of human C ⁇ 1 ⁇ targeting construct and hIgG1-SW establishment.
  • 12A shows Chicken ⁇ C ⁇ locus
  • FIG. 12B shows Human C ⁇ 1 targeting construct
  • FIG. 12C shows Human C ⁇ 1 targeted locus
  • FIG. 16A shows selection of sIg-clone by FACS
  • FIG. 16B shows confirmation of targeted locus by genomic PCR. It is a figure which shows the result of selection of a hIgG1 high expression clone.
  • FIG. 17A shows sorting of hIgG1-expressing cells, and a single cell sorting was performed on cells in which sIg was recovered by 4-OHT treatment.
  • FIG. 17B shows selection of clones with high expression of hIgG1 / hC ⁇ by FACS
  • FIG. 17C shows selection of clones with high antibody secretion by ELISA.
  • Standard Human IgG was serially diluted at 5 to 320 ng / ml, Sample: 1 to 64 times. It is a figure which shows that the growth capability of DT40-SW-hg is equivalent to DT40-SW. It is a figure which shows that DT40-SW-hg transcribe
  • FIG. 19A shows the L chain
  • FIG. 19B shows the H chain.
  • FIG. 20A shows ⁇ -hIgG ( ⁇ 1: protein amount 50 ⁇ g)
  • FIG. 20B shows ⁇ -hC ⁇ ( ⁇ 1: protein amount 150 ⁇ g)
  • FIG. 20C shows ⁇ -cIgM ( ⁇ 1: protein amount 150 ⁇ g).
  • FIG. 21A shows hIgG1 antibody secretion
  • FIG. 21B shows association of L and H chains
  • FIG. 21C shows cIgM antibody secretion.
  • FIG. 23 shows that DT40-SW-hg introduces mutations frequently into the antibody variable region (heavy chain variable region) (continuation of FIG. 23-1A). It is a figure which shows that DT40-SW-hg introduce
  • FIG. 23 shows that DT40-SW-hg introduces mutations frequently into the antibody variable region (heavy chain variable region) (continuation of FIG. 23-1A). It is a figure which shows that DT40-SW-hg introduce
  • FIG. 23 shows that DT40-SW-hg introduces mutations frequently into the antibody variable region (heavy chain variable region) (continuation of FIG. 23-2A). It is a figure which shows that DT40-SW-hg introduce
  • the B cells producing the human antibody of the present invention are prepared as follows using non-human-derived B cells.
  • a non-human-derived B cell for producing a B cell that produces a human-type antibody is constitutive of AID (activation-induced cytidine deaminase), an enzyme having an essential role in somatic hypermutation, or Any cell can be used as long as it has the property of being inducibly expressed and introducing a spontaneous mutation into the antibody gene.
  • Origin animal species and cell line species are not limited. B cells of vertebrates such as mice, sheep, rats, rabbits and chickens, or cell lines thereof or mutants thereof can be used.
  • a DT40 cell line derived from chicken B cells is used.
  • the DT40 cell line is a cell derived from B lymphoma, and the second chromosome is characterized by trisomy (Baba, T.W., Giroir, B.P. and Humphries, E.H.:Virology 144: 139-151,1985).
  • the DT40 strain is a wild-type DT40 strain or the DT40-SW strain originally established by the present inventors (by reversibly switching the expression of the gene AID that controls the mutation function, the antibody mutation function is ON / OFF controlled. Mutants (for details, see Kanayama, N., Todo, K., Reth, M., Ohmori, H. Biochem. Biophys. Res.mnCommn. 327: 70-75 (2005) and JP-A-2006-109711) Described)).
  • the B cell induces expression of an exogenous Cre recombinase gene by extracellular stimulation, and induces AID expression by reversing the direction of the exogenous AID (activation induced cytidine deaminase) gene by the expressed Cre recombinase.
  • AID activation induced cytidine deaminase
  • vertebrate B cells that can be arrested, having the following characteristics: 1) The endogenous AID gene is functionally disrupted, and no AID protein is produced by endogenous AID gene expression.
  • the Cre recombinase gene has been introduced in a form capable of activating Cre recombinase by extracellular stimulation, and the above-mentioned exogenous AID gene is contained by activation of Cre recombinase.
  • B cells having a reversed orientation of the region sandwiched between the two loxP sequences.
  • an AID protein obtained by functionally destroying the endogenous AID gene and expressing the endogenous AID gene in any vertebrate cell that can express the endogenous AID gene. It is recommended to modify the cells so that the production of is not caused.
  • One of the alleles of the endogenous AID gene is disrupted (knocked out) by creating an AID gene targeting vector according to the usual method, and Cre recombinase reverses the direction of the other allele.
  • an AID gene targeting vector containing a DNA construct containing a gene encoding an exogenous AID constructed so as to obtain homologous recombination, the endogenous AID gene is destroyed and the exogenous AID gene A cell capable of controlling the expression of can be produced.
  • An exogenous AID gene constructed so that its direction can be reversed by Cre recombinase is sandwiched between two loxP sequences in opposite directions.
  • a targeting vector is designed so that a promoter that functions in the target animal cell exists upstream of the region sandwiched between the two loxP sequences, and the promoter is also inserted into the genome by homologous recombination. Good.
  • the exogenous AID gene constructed so that its direction can be reversed by Cre recombinase into the genome of the cell, the exogenous AID gene is arranged in the forward direction with respect to the promoter. If present, expression of the AID gene is induced by the promoter. Needless to say, expression of the AID gene does not occur when the AID gene is arranged in the opposite direction to the promoter.
  • a person skilled in the art can conceive various suitable promoters to be used here, and can select an appropriate promoter. For example, ⁇ -actin promoter, immunoglobulin promoter, cytomegalovirus promoter, CAG promoter can be mentioned.
  • Cre recombinase gene exists in such a form that Cre recombinase expresses a fusion protein with an estrogen receptor, and the extracellular stimulation is stimulation by estrogen or a derivative thereof. Stimulation with a derivative induces the activation of Cre recombinase in the cell.
  • estrogen derivative stimulation is applied to cells, activation of Cre recombinase is induced. Therefore, Cre recombinase is activated only when an estrogen derivative is allowed to act from outside the cell (where the fusion protein moves into the nucleus, indicating that Cre recombinase can act on the loxP sequence) and AID The region between the loxP sequences containing the gene is inverted.
  • the region between the two loxP sequences may further include a marker gene in the same direction as the AID gene, where the AID gene is arranged in the forward direction with respect to the promoter. Since the marker gene is also arranged in the forward direction, the marker gene is expressed, and cells in which the AID gene is arranged in the forward direction with respect to the promoter and the AID gene can be expressed can be selected by the marker It becomes.
  • the region sandwiched between the two loxP sequences may further include a marker gene opposite to the AID gene, wherein the AID gene is arranged in the opposite direction with respect to the promoter.
  • the marker gene since the marker gene is arranged in the forward direction, the marker gene is expressed, and a cell in which the AID gene is arranged in the reverse direction with respect to the promoter and cannot express the AID gene can be selected by the marker. Become.
  • Such B cells can be obtained in accordance with the description in Japanese Patent No. 4448708.
  • the antibody gene of the non-human-derived B cell is replaced with a human antibody gene.
  • the gene of the constant region of the antibody possessed by the non-human B cell may be replaced with the gene of the human antibody constant region.
  • the antibody gene can be replaced by homologous recombination.
  • an antibody gene of an animal species of a non-human B cell used for the production of the human antibody-producing cell of the present invention is isolated, the structure is analyzed, and a targeting vector for replacing the constant exon of the antibody gene is constructed. To do. Next, using the thus constructed targeting vector, the antibody gene of the non-human B cell is replaced with a human antibody gene.
  • FIG. 6 The outline of a specific method for introducing a human antibody constant region gene is as follows (FIG. 6). In the following method, a method using a chicken DT40-SW is shown.
  • Targeting vector Approximately 2 kbp upstream and 2 to 5 kbp downstream of the constant region gene are used as regions necessary for homologous recombination.
  • the splicing receptor sequence and splicing branch point sequence contained in the intron upstream of the constant region gene are those of a human antibody gene.
  • the poly A addition sequence downstream of the constant region gene is derived from chicken.
  • the drug resistance gene sandwiched between loxP sequences is placed upstream of the human constant region gene containing the splicing sequence.
  • DT40-SW cells used in this method express Cre recombinase (Mer-Cre-Mer) as a fusion protein with mutant estrogen receptor.
  • Mer-Cre-Mer is usually inactive, but can be activated by adding 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), one of the derivatives of estrogen, to the medium (Zhang, Y . Et al., Nucleic Acids Res. 24 543-548 (1996)). Therefore, when 4-OHT is allowed to act on cells that have lost antibody production once the targeting vector has been introduced (FIG. 6B), Cre recombinase is activated and the drug resistance gene sandwiched between loxP sequences is removed. It changes to such an antibody gene structure.
  • the expression of the antibody gene becomes possible again, so that the expression of the chimeric antibody of the introduced chicken antibody variable region and the human antibody constant region can be expected.
  • Cells that have expressed the chimeric antibody on the cell surface can be isolated by flow cytometry or the like.
  • gene recombination is advanced step by step in the order of light chain ⁇ heavy chain or heavy chain ⁇ light chain as shown in FIG. 6D to produce a chimeric antibody-producing cell.
  • DT40-SW expressing a chimeric antibody with a human IgG1 ⁇ constant region can be produced by this method without impairing the antibody mutation function of DT40.
  • the cell is called DT40-SE-hg.
  • This cell can be used for antibody production just like the conventional DT40-SW, and the resulting human IgG1-type antibody can be used directly for various evaluations of effector functions via the human antibody constant region, This is extremely useful as a technique for rapidly acquiring candidate antibodies for drug development.
  • FIG. 1 A method of substituting the constant part of ⁇ chain is shown in FIG.
  • the targeting arm was designed so as not to modify or delete the matrix attachment region (MAR) or 3 'enhancer (3'E), which are factors involved in gene expression and mutagenesis.
  • the fragment containing the normal (C ⁇ ) gene includes a splicing acceptor sequence and a branch point sequence in the intron of the human C ⁇ upstream part.
  • the human C ⁇ gene fragment incorporated into the vector has a poly A addition sequence. Not included, the poly A sequence on the chicken antibody light chain gene was used.
  • the chicken light chain gene has already been cloned (Reynaud, C.-A., et al., Cell 40, 283-291 (1985)), and genomic analysis has revealed the surrounding nucleotide sequence (International Chicken Genome Sequencing Consortium, Nature 432, 695-716 (2004)).
  • a primer was designed based on the revealed sequence, and the gene fragment was obtained by PCR.
  • the gene fragment used for the 5 ′ targeting arm (IgCL5 ′) upstream of the constant region from the genomic DNA of DT40-SW is expressed by using primers IgLD511 (5′-GAGTCGCTGAACTAGTCTCGGTCTTTCTTCCCCCATCG-3 ′ (SEQ ID NO: 5), ACTAGT is a SpeI site) and cCL5- Amplified by PCR using Bam2 (5'-ACGGATCCATATCTATTTTCATGGATGTTATACGTGTGCG-3 '(SEQ ID NO: 6), GGATCC is the BamHI site) and KOD-Plus DNA polymerase (Toyobo), treated with SpeI and BamHI, then into pBluescriptIISK (-) Built.
  • IgLD511 5′-GAGTCGCTGAACTAGTCTCGGTCTTTCTTCCCCCATCG-3 ′ (SEQ ID NO: 5), ACTAGT is a SpeI site
  • the gene fragment used for the 3′-targeting arm (IgCL3 ′) downstream of the constant region is expressed using primers cCL3-HindIII (5′-CTAAGCTTCCCACTGGGGATGCAATGTGAGGACAGT-3 ′ (SEQ ID NO: 7), AAGCTT is the HindIII site) and cCL3-Kpn2 ( Amplification was performed using 5′-TGCGATCCAGGTACCACGATAGCACTGCCTGCCTCCATC-3 ′ (SEQ ID NO: 8), GGTACC was a KpnI site), and after treatment with HindIII and KpnI, it was incorporated downstream of IgCL5 ′ in pBluescriptIISK ( ⁇ ).
  • hCk5-Bam 5'-CTAAACTCTGAGGGGATCCGATGACGTGGCCATTCTTTGC-3 '(SEQ ID NO: 9), GGATCC is BamHI site
  • hCk-HindIII 5′-GTAAGCTTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGA-3 ′ (SEQ ID NO: 10), AAGCTT was the HindIII site), and after treatment with BamHI and HindIII, it was inserted between IgCL5 ′ and IgCL3 ′.
  • Blasticidin S resistance gene (Arakawa, H., et al. BMC Biotechnol. 1, 7 (2001)) having loxP sequences at both ends was incorporated into the BamHI site immediately above hCk.
  • the cells were suspended in 10 ml of growth medium (PRMI1640, Invitrogen; 10% fetal calf serum, Invitrogen; 1% chicken serum, Sigma), cultured for 24 hours, and then 10 ml of 2 ⁇ selective medium (growth).
  • Growth medium PRMI1640, Invitrogen; 10% fetal calf serum, Invitrogen; 1% chicken serum, Sigma
  • 10 ml of 2 ⁇ selective medium growth.
  • Medium + Blasticidin S (Kaken Pharmaceutical Co., Ltd.) was added, and blastcidin S having a final concentration of 20 ⁇ g / ml was dispensed into two 96-well plates and cultured for 10 to 14 days.
  • 139 clones were selected which were selected by blastcidin S.
  • R-PE R-phycoerythrin
  • genomic DNA was extracted from these cells, and targeting vector integration was performed using primers for the outer region of the targeting vector and primers specific to the vector, i.e., primer LLF1 (5 '-CCATCGGCGTGGGGACACACAGCTGCTGGGATTCC-3' (SEQ ID NO: 11)) and BSR2 (5'- GTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCC -3 '(SEQ ID NO: 12)), and Hck-F2 (5'- GAGAGGCCAAAGTACAGCCGAGATCGTATAACTGCCGAGATCGCATAGC' It was confirmed by PCR using cCL3-dn6 (5′- GGAGCTGTACCATGCGGCCTGCTCTGCTGATGCCATGTCG -3 ′ (SEQ ID NO: 14)) (FIG. 9B). Specific amplification of PCR products was observed, indicating that clones 2 and 3 were targeted as intended. Among these, clone 2 was used for subsequent operations.
  • primer LLF1 5
  • RNA of DT40-SW-hk was extracted with TRIzol® (Invitrogen), and cDNA was synthesized using Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) and oligo dT primer.
  • a sense primer (CLL5-Bam: 5'-CCCGGCGTGGGGATCCACAGCTGCTGGGATTC-3 '(SEQ ID NO: 15)) and an antisense primer (cCMUCLAR: 5'- GGAGCCATCGATCACCCAATCCAC -3' (sequence number) 16)) or (hck-RT2: 5'- CTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCC -3 '(SEQ ID NO: 17)), and the transcription product of ⁇ -actin as an internal standard was used as primer actin3 (5'-CTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGCCAGC-3' (SEQ ID NO: 18 )) And actin4 (5′-TTCATGAGGTAGTCCGTCAGGTCACGGCCA-3 ′ (SEQ ID NO: 19)).
  • DT40-SW-hk did not express a chicken antibody light chain and expressed a chimeric transcription product of a chicken light chain variable region and a human ⁇ chain constant region (FIG. 11A). Further, the sequence analysis of the amplified product revealed that the exon binding was normal and the transcript encoded the antibody light chain protein as intended (FIG. 11B).
  • FIG. 12 shows a method for replacing with a gene.
  • the targeting arm was designed so as not to modify or delete the ⁇ enhancer (E ⁇ ), which is a factor involved in gene expression or mutagenesis.
  • the 5′-side targeting arm was repeated immediately upstream of the constant region.
  • the obtained gene fragment was incorporated into pCR-Blunt (Invitroten), and the nucleotide sequence was confirmed (FIG. 13A). Since the gene information downstream from the secreted C-terminal exon of the chicken C ⁇ gene used for the 3 ′ targeting arm (cIgH3′arm) has not been released, the sequence of the chicken secretory IgM mRNA (Dahan, A. et al Nuclec Acids Res. 11, 5381 (1983); accession no.
  • X01613 designed the sense primer cCmu4-F1 (5'- GGCTCAGCGTCACCTGCATGGCTCAGG-3 '(SEQ ID NO: 22)) for the CH4 domain, transmembrane membrane type IgM Primer mCmyu3 ′ (5′-CCTTGATTTCGAAGTGGAGAAGACGTCGGGAGGTGGAGA-3 ′ (SEQ ID NO: 23); Sayegh, CE, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
  • Human C ⁇ 1 gene fragment was prepared by using primers hIgG1F1 (5'-ACGGATCCTGCAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACC-3 '(SEQ ID NO: 26), GGATCC is BamHI site) and hIgG1R1 (5'-CGGCGGCCGCACTCATTTACCGGGACGAGAGG' SEQ ID NO: 27), GCGGCCGC was amplified using NotI site), cloned into pCR-Blunt, and the sequence was confirmed (FIG. 13C). A NotI fragment containing the hC ⁇ 1 gene was inserted into the NotI site upstream of cIgH3′arm (FIG.
  • FIG. 13D a BamHI-EcoRI fragment linking cIgH3′arm and the hC ⁇ 1 gene was inserted into pBluescriptIISK ( ⁇ ) (FIG. 13E). Furthermore, cIgH5′arm was inserted into the SacI-BamHI region upstream of hC ⁇ 1 (FIG. 13F), and finally a blasticidin resistance gene sandwiched by loxP was inserted into BamHI between cIgH5′arm and hC ⁇ 1 (FIG. 13G). ).
  • the cells are suspended in 10 ml of growth medium, cultured for 24 hours, suspended in 20 ml of growth medium containing blasticidin S at a final concentration of 20 ⁇ g / ml, and dispensed into two 96-well plates. Cultured for 10-14 days. In 17 trials, 207 clones selected by blastcidin S were obtained.
  • genomic DNA was extracted from these cells and targeting vector integration was performed using primers for the outer region of the targeting vector and a primer specific for the vector, i.e. primer JCF5 (5 '-TAATCGGTACTTTTTAATCCTCCATTTTGCCCGAAATCGC-3' (SEQ ID NO: 28)) and BSR3 (5'-CTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAG-3 '(SEQ ID NO: 29)), and hIgGF5 (5'-TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC-3' (SEQ ID NO: 30) It confirmed by PCR using 5'-CCTTGATGAGGGTGACGGTGGCGCTGTAGAAGAGGCTG-3 '(sequence number 31)) (FIG.
  • primer JCF5 5 '-TAATCGGTACTTTTTAATCCTCCATTTTGCCCGAAATCGC-3' (SEQ ID NO: 28)
  • BSR3 5'-CTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACA
  • the clone D2 which is sIg-, showed a specific amplification of the PCR product indicating that it was targeted as intended. In this trial, the efficiency of obtaining the target cells is extremely poor, but an efficient cell line establishment method has been established by optimizing the conditions of subsequent transfection methods.
  • RNA of DT40-SW-hg was extracted with TRIzol, and cDNA was synthesized using Superscript II reverse transcriptase and oligo dT primer.
  • the light chain was amplified using sense primer CLL5-Bam and antisense primer cCMUCLAR or hck-RT2, and the heavy chain was sense primer Chicken LH5-Eco (5′-GCCGGAATTCCGACGGAGGAGCACCAGTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 32 )) And antisense primer cCmu2-R (5'-TTGTACCACGTGACCTCGGTGGGACGGCG-3 '(SEQ ID NO: 33)) or hCg1-1R (5'-CTCTTGGAGGAGGGTGCCAGGGGGAAGACC-3' (SEQ ID NO: 34)).
  • DT40-SW-hg did not express chicken antibody and expressed chimeric transcripts of chicken antibody variable region and human antibody constant region (FIG. 19).
  • the protein concentration of the cell-free extract was determined using BCA Protein Assay Kit (PIERCE), and 50 ⁇ g or 150 ⁇ g of cell-free extract was separated by 12.5% SDS-PAGE. The separated protein was transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Immobilon-P, Millipore), reacted with each antibody, and then detected using an ECL Advance Western Blotting Detection Kit. Chemiluminescence was acquired using the ChemiDoc XRS system (Bio-Rad Laboratory).
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the antibodies are peroxidase labeled goat anti-human IgG Fc diluted 5000 times for detection of human IgG Fc, and biotinylated mouse anti-human Ig k light chain (BD pharmigen) diluted 200 times for detection of human kappa chain. Streptavidin-HRP Conjugate (ZYMED) diluted 100000 times and peroxidase conjugated goat anti-chicken IgM (mu chain) (ROCKLAND) diluted 10,000 times were used for detection of chicken IgM.
  • DT40-SW-hg expressed a heavy chain containing about 55 kDa human IgG1 Fc and a light chain containing about 25 kDa human C ⁇ , and it was shown that chicken IgM was not expressed (Fig. 20).
  • the chicken-human chimeric antibody deduced from the amino acid sequence had a heavy chain molecular weight of 56 kDa and a light chain of 28 kDa, confirming the expression of a protein with a molecular weight almost as expected.
  • DT40-SW-hg is a useful cell line that can express a chimeric antibody in which a chimeric heavy chain and a chimeric light chain of a chicken antibody variable region and a human antibody constant region are stably associated on the cell surface and culture supernatant. It was shown that there is.
  • Genomic DNA was isolated from the cultured cells, and the heavy chain variable region was determined using primers CVH1F2 (5′-GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3 ′ (SEQ ID NO: 35)) and CJH1R2 (5′-GCCGCAAATGATGGACCGAC-3 ′ (SEQ ID NO: 36)).
  • the light chain variable region was amplified by PCR using primers CVLF61 (5'-GGCACGGAGCTCTGTCCCATTGCTG-3 '(SEQ ID NO: 37)) and CVLR31 (5'-CCCCAGCCTGCCGCCAAGTCCAAG-3' (SEQ ID NO: 38)), and the pCR-Blunt vector Cloned into.
  • Plasmid DNA is extracted using High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche), sequenced using ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems), and ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). To analyze the nucleotide sequence. When the base sequence of the sample after 41 days of culture was compared with the original base sequence before the mutation was turned on, the antibody variable region gene of DT40-SW-hg was the original strain in both heavy and light chains. Many mutations were introduced compared to a certain DT40-SW (FIG. 22).
  • DT40-SW-hg has a higher frequency of mutagenesis per base than the DT40-SW in terms of mutagenesis efficiency per base and the proportion of clones with mutations in the analyzed clones. It was suggested that it has sufficient mutation ability. In addition, looking at the distribution of mutations introduced into the variable region genes, mutations were introduced at various sites (FIGS. 23-1 to 23-4).

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Abstract

細胞外刺激により外因性Cre リコンビナーゼ遺伝子の発現が誘導され、発現されたCre リコンビナーゼにより外因性AID(activation induced cytidine deaminase)遺伝子の向きを反転させることにより、AID 発現を誘導することおよび停止させることが可能な非ヒト脊椎動物Ｂ細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換することを含む、ヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。

Description

ヒト型抗体を産生するB細胞の作製方法
　本発明は、ヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法に関する。
　生体内の免疫系による産生される抗体は、その特異的な標的認識能力を利用して試薬のみならず、最近では医薬、診断薬への応用が進んでいる。生体内では、抗原刺激を受けて産生されてくる抗体の親和性が経時的に上昇してくる。これを親和性成熟と呼ぶが、活性化されて盛んに分裂する抗原特異的B細胞において、抗体可変部遺伝子に高頻度体細胞突然変異が起こり、生じた多様な変異B細胞集団から、高親和性を獲得したB細胞クローンが厳密に選択されることにより進行する。この原理を利用して、動物への反復免疫とハイブリドーマ作製によるモノクローナル抗体の作製は広く使われているが、抗体取得には多大な労力と時間がかかり、種間の保存性の高い抗原に対する抗体は免疫寛容のため取得するのが困難であるほか、生理活性のある抗体の取得も難しいといわれている。動物では作製が困難なこれらの抗体が医薬に有用である場合が多く、そのため免疫寛容がないin vitro技術であるファージディスプレー法が現在よく用いられている。ファージディスプレー法では、ハイブリドーマ法に比べて抗体選択の操作を迅速に行えるが、ライブラリーの質に抗体作製の成否が大きく依存し、抗体Fv断片をscFvとして組み換えてファージ上にディスプレーするため完全型抗体に戻して発現させたときに特異性が変わることが多い、といった問題があることも知られている。特に、鍵となる変異ライブラリー作製には多大な労力と高度な遺伝子組換技術が必要である。
　そこで、生体内での抗体産生系をin vitro培養細胞系で再現することが出来れば、迅速かつ効率的に抗体を作製できると考えられる。抗体遺伝子への変異導入能力を保持するニワトリＢ細胞株DT40は、以下の点で、この目的を達成する上で適している。
（1）自発的変異導入能力により培養のみで免疫寛容の影響を受けない多様な抗体ライブラリーを形成する。
（2）細胞表面上と培養上清中に抗体を発現し、抗原への結合に基づく特定のクローンの選択が可能である。
（3）相同組換え効率が非常に高いので、遺伝子ノックアウトなどにより細胞の機能改変が容易である。
　本発明者らは、DT40の特性に着目し、DT40の変異機能を任意にON／OFFできる細胞株DT40-SWを樹立してDT40-SWを用いたin vitro抗体作製法を開発した（特許文献１及び非特許文献１を参照）(図1)。この方法では、変異機能をONにして培養して得られた抗体ライブラリーから、従来法では取得が困難であるものを含む様々な抗原に対する抗体取得に成功している（非特許文献２及び３を参照）。また、この方法では、得られた抗体産生細胞に再度変異を導入することにより多様化させ、選択を繰り返すことにより抗体の親和性成熟が可能であり、特に、変異導入様式を操作することにより親和性成熟を効率化することにも成功している（特許文献３並びに非特許文献４及び５を参照）。
　抗体の医薬への応用においては、ヒト抗体あるいはヒト型化した抗体の使用が必須である。これは、異種由来の抗体を人体に摂取すると、人体にとって異物である摂取抗体に対する免疫反応が人体で起こり、複数回投与すると重篤な副作用を引き起こしたり効果が減弱していったりする問題が発生するからである。このため、抗体医薬開発においては異種由来の候補抗体を初期の評価段階からヒト型化する、あるいはヒト型の構造を有した抗体を候補抗体として取得することが必要となっている。特に、in vitroあるいはin vivoでの試験で効果を評価するためには、抗体定常部がヒトIgG1型であることが必須である。従来用いられているヒト抗体あるいはヒト型化抗体の取得法は、(a)ハイブリドーマ法などにより得られた異種抗体の抗体可変部をヒト抗体定常部とのキメラとして宿主細胞で発現させる方法（特許文献３を参照）、(b)可変部のうち抗原結合部分をヒト抗体に移植するCDR移植（特許文献４及び５を参照）、(c)ヒトから単離した抗体遺伝子群から作製したヒト抗体断片を提示するファージディスプレーライブラリーから抗体を取得する方法（特許文献６及び７を参照）、(d)ヒト抗体遺伝子を導入したマウスよりハイブリドーマ法により抗体を取得する方法などがある（特許文献８～１０を参照）。
特許第4487068号公報 特開2009-60850号公報 米国特許第6331415号明細書 米国特許第5225539号明細書 米国特許第5585089号明細書 米国特許第5885793号明細書 米国特許第5837500号明細書 米国特許第6150584号明細書 米国特許第5545806号明細書 特許第3030092号公報
Kanayama, N., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 327, 70-75 Todo, K., et al. J. Biosci. Bioeng. 102, 478-481 (2006) Kanayama, N., et al. YAKUGAKU ZASSHI 129, 11-17 (2009) Kajita, M., et al. J. Biosci. Bioeng. 110, 351-358 (2010) Kajita, M., J. Biosci. Bioeng. 109, 407-410 (2010)
　本発明は、ヒト型抗体を産生する、自発的変異導入能力を有するB細胞の作製方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、上記のDT40-SWから得られる抗体は、ニワトリIgM抗体であるため、DT40-SWを用いた抗体作製システムによりヒトIgG1型抗体を得ることが可能になれば、医薬開発において非常に有用な技術となると考えた。
　上述のように医薬応用に向けた抗体探索にはヒト抗体あるいはヒト型化抗体の作製が必要である。上記の(a)～(d)のヒト抗体およびヒト型化抗体取得技術は広く用いられているが、潜在的に以下のような問題点がある。例えば、(a)(b)(d)は候補抗体の作製がマウスへの免疫に依存するハイブリドーマ法によるため免疫寛容の問題があること、ファージディスプレーを用いる(c)は得られた抗体を完全抗体に改変する必要があること、(a)(b)(c)は多くの遺伝子組換え操作が必要で多数の候補抗体を扱う場合煩雑なることなどである(図２)。
　また、いったん取得した抗体の親和性や特異性を改良することはDT40-SWシステム以外の従来技術では容易ではない。DT40などの変異能力を有する細胞株は、本来保持する抗体遺伝子に変異を導入してライブラリーとして用いられてきた（Cumbers, S. J., et al. Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002); Seo, H., et al. Nat. Biotechnol. 23, 731-735 (2005); Todo, K., et al. J. Biosci. Bioeng. 102, 478-481 (2006)）。DT40を用いた抗体作製では免疫寛容は問題とならないが、得られた抗体はすべてニワトリIgM抗体であるため、現状では上記の(a)(b)の技術の応用が必要である。DT40-SWシステムを他の従来技術を比較した時、多くの優位性がDT40システムに見いだされることから(図２)、ヒト抗体産生型に改変したDT40-SWシステムの開発の重要性は明らかである。
　本発明者らは、上記の問題を解決するには、抗体作製システムが以下の(1)～(4)の特徴を備えていることが重要であると考えた。
(1)免疫寛容を回避できるin vitro技術である。
(2)抗体可変部遺伝子に変異が効率よく導入される。
(3)抗体遺伝子が細胞表面に提示発現される。
(4)抗体遺伝子が培地上清に分泌発現される。
　上記の(1)及び(2)は、有用な抗体を含む抗体ライブラリーの作製のために重要であり、(3)及び(4)は目的の抗体を産生する細胞をスクリーニングするために重要である。そのため、DT40細胞の特徴の一つである高頻度に起こる相同組換えを用いてニワトリ抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換することにより、DT40-SW細胞をヒト型抗体産生型に変換する方法に思い至った(図３)。特に本発明では、DT40細胞の変異能力を有効に活用して有用な抗体ライブラリーを作製するために、変異導入される可変部領域をニワトリのままにし、定常部をヒト型に置換することが有効であると考えた（図４Ａ）。この場合、産生される抗体は、ニワトリ-ヒトキメラ抗体であるが、定常部はヒト由来であることから医薬候補探索のための様々な試験に直接使用可能であり、候補探索の迅速化が可能となる（図４Ｂ）。産生されるヒト型抗体は、生体内で重鎖定常部を介した様々なエフェクター機能が期待できるIgG1であることが好ましいことから、今回、ヒトIgG1産生型DT40-SWを樹立することとした。また、軽鎖定常部は、ヒト体内で最も存在量の多いκ鎖を用いることとした。
　抗体遺伝子は、プロモーター下流に小胞体へのターゲティングに必要なシグナルを含むリーダーペプチドをコードするエキソン、可変部をコードするエキソン、および定常部をコードするエキソンから構成される（図４Ａ）。重鎖の場合は、定常部は複数のエキソンから構成され、抗体が分泌型あるいは膜結合型として発現されるかは使用するエキソンの違いによって決定される。したがって、上記(2)～(4)のような特徴を備えた細胞を構築するためには、重鎖については定常部をコードするエキソンのうちCH1から分泌エキソンまでの領域をヒト由来IgG1抗体重鎖定常部遺伝子と置換し、軽鎖については定常部エキソンのみをヒト由来κ軽鎖定常部遺伝子と置換することが、最も効率的な方法であるとの着想に至った(図５)。その際、可変部遺伝子と定常部遺伝子の間にあるイントロンには、変異導入に重要な領域があると考えられているため、この領域を改変・除去することなく定常部の置換をすることが重要であると考えた。
　するDT40-SWを作製するためには、(i)ニワトリ抗体遺伝子の単離と構造解析、(ii)ニワトリ抗体遺伝子の定常部エキソンを置換するターゲティングベクターの構築が必要である。ゲノム解析の進展により、軽鎖抗体遺伝子領域は塩基配列が明らかになっていたが、重鎖については部分的な情報しか無く、未知領域を単離し、その配列の一部を明らかにした。明らかにした情報を基に重鎖および軽鎖抗体定常部遺伝子の置換のためのターゲティングベクターを作製しこれらのベクターを用いてキメラ抗体を産生する細胞の樹立に成功した。この細胞は、キメラ抗体を細胞表面および培養上清中に発現した。抗体可変部への変異導入を試みたところ、野生型DT40-SWが内在性の抗体遺伝子に変異導入する場合と同等の効率で変異導入することに成功し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　細胞外刺激により外因性Creリコンビナーゼ遺伝子の発現が誘導され、発現されたCreリコンビナーゼにより外因性AID(activation induced cytidine deaminase)遺伝子の向きを反転させることにより、AID発現を誘導することおよび停止させることが可能な非ヒト脊椎動物Ｂ細胞であって、以下の特徴：
１）内因性のAID遺伝子が機能的に破壊されており、内因性AID遺伝子発現によるAIDタンパク質は産生されないこと、
２）互いに逆方向の2つのloxP配列で挟まれた外因性のAID遺伝子、および該2つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に存在する該動物細胞で機能し得るプロモーターを有し、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には、該プロモーターによるAID遺伝子の発現が可能であり、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には、AID遺伝子の発現は停止すること、および
３）Creリコンビナーゼ遺伝子が、細胞外刺激によりCreリコンビナーゼ活性化が可能な形で導入されており、Creリコンビナーゼ活性化により、上記外因性AID遺伝子を含む2つのloxP配列に挟まれた領域の方向が反転すること、
を有する上記Ｂ細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換することを含む、ヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[２]　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞のCreリコンビナーゼ遺伝子は、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、上記細胞外刺激がエストロゲンまたはその誘導体による刺激であり、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導される、[１]のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[３]　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞の抗体遺伝子の定常部のみをヒト抗体遺伝子の定常部に置換する、[１]又は[２]のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[４]　重鎖については定常部をコードするエキソンのうちCH1領域から分泌エキソンまでの領域をヒト由来IgG抗体重鎖定常領域と置換し、軽鎖については定常部エキソンのみをヒト由来κ軽鎖定常領域遺伝子と置換する、[１]～[３]のいずれかのヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[５]　ヒト型抗体を産生するＢ細胞が定常部遺伝子の上流に存在するイントロンに含まれるスプライシング受容体配列及びスプライシングブランチポイント配列としてヒト抗体遺伝子由来のものを含み、定常部遺伝子の下流にあるポリA付加配列として非ヒト脊椎動物Ｂ細胞のものを含み、さらにスプライシング配列を含むヒト定常部遺伝子の上流にloxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子を含む、[１]～[４]のいずれかのヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[６]　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞の抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子への置換が前記Ｂ細胞の抗体遺伝子をターゲットとするターゲティングベクターを用いて行われる、[１]～[５]のいずれかのヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[７]　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞がニワトリB細胞株DT40細胞に由来する細胞である、[１]から[６]のいずれかのヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[８]　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞がニワトリB細胞株DT40-SW細胞である、[７]のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
[９]　[１]～[８]のいずれかの作製方法により得られた、ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来Ｂ細胞。
[１０]　[９]のヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来Ｂ細胞において、Creリコンビナーゼ遺伝子を活性化させ培養を行い抗体可変部遺伝子に変異を導入することを含む、ヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。
[１１]　ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来Ｂ細胞において、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導され、抗体可変部遺伝子に変異を導入する、[１０]のヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-258404号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明では、DT40-SW細胞を、ヒトIgG1型抗体を細胞表面に提示しかつ培養上清中にも分泌できるよう改良した。この細胞株DT40-SW-hgの抗体可変部遺伝子への変異能力は、すでに様々な抗原に対する抗体の作製に用いられているDT40-SWよりも優れており、より優れた抗体ライブラリーの作製を可能にする。さらに、DT40-SW-hgは、DT40-SWが備える有用な特徴：(i)変異と発現を一細胞内で一体的に行えるので変異抗体の作製が簡便である、(ii)細胞表面に抗体を提示し、抗原への結合に基づいた目的抗体の選択が容易であり、変異と選択による目的抗体の高機能化が簡便である、(iii)変異機能は任意に停止、再開できることから有用な変異の固定や再変異による抗体の改変が可能である、をすべて保持しており、かつ、抗体として取り扱いやすいヒトIgG１型抗体を産生する。抗体Fc部分がヒトIgG1であることから、Fc部分を介した様々な免疫反応、例えば、抗体依存性細胞傷害や補体依存性細胞障害といった、医薬利用を目的として有用な抗体を探索する時、必ず評価しなければならない抗体の機能を、DT40-SW-hgの抗体ライブラリーから単離されたクローンから産生されるヒトIgG１型の完全型抗体を直接用いることで迅速に評価できる。本発明で作製した細胞株を使用した抗体作製システムは、従来のヒト型抗体作製法で問題となっていた様々な問題を回避できることから、癌などの難治性疾患の治療に役に立つ抗体の開発を迅速化する重要な基盤技術となる。
DT40-SWシステムの原理及び有用性を示す図である。DT40-SWライブラリー（１）から目的抗体産生細胞を単離し、変異機能をOFFにして安定化できる（３）。再度の変異導入と選択のサイクルを繰り返して抗体の親和性を改良することも可能である（２）。 従来法及び本発明の抗体作製技術の比較を示す図である。 ヒト型DT40-SWシステムにおけるヒトIgG1型としての抗体の機能改変と、ヒト型抗体ライブラリーからの抗体探索の方法を示す図である。 ヒト型抗体産生型DT40の作製方法の概略を示す図である。ニワトリ抗体定常部遺伝子をジーンターゲティングによりヒト抗体定常部遺伝子に置換してDT40細胞のゲノム上の抗体遺伝子を改変し（A)、ニワトリ抗体可変部とヒト抗体定常部のキメラ抗体を発現させる（B）。 ヒトIgG1κ定常部産生型DT40の作製の概略を示す図である。 ニワトリ抗体定常部遺伝子の置換方法の概略を示す図である。図６Ａはターゲティングベクターの構造を、図６Ｂはターゲティング後の細胞の抗体遺伝子座の構造を、図６Ｃはターゲティング後の細胞を4-ヒドロキシタモキシフェンにより処理し、Creリコンビナーゼを活性化して薬剤耐性遺伝子を除去した後の抗体遺伝子座の構造を、図６Ｄはヒト抗体定常部産生型DT40-SW細胞の作製スキーム例を示す。 ヒトκ鎖定常部遺伝子ターゲティングベクターの構築のDT40-SWへの導入の方法を示す図である。AはChicken Cλ locusを、BはHuman Cκ targeting constructをCはHuman Cκ targeted locusを示し、図７左図はsIg発現の模式図である。 ヒトκ鎖定常部遺伝子ターゲティングベクターの構築を示す図である。 ヒトκ鎖定常部遺伝子の導入の確認の結果を示す図である。図９ＡはFACSによるsIg-クローンの選択を示し、図９Ｂはgenomic PCRによるtargeted locusの確認の結果を示す。 ヒトκ鎖高発現クローンの選択を示す図である。図１０ＡはhCκ発現細胞のsorting(clone2)の結果を示し、4-OHT処理によりsIgを回復させた細胞についてsingle cell sortを行った結果である。図１０ＢはセルソーティングによるhCκ高発現クローンの選択を示す。 DT40-SW-hkはニワトリ-ヒトキメラ軽鎖抗体遺伝子を転写することを示す図である。図１１Aはニワトリ軽鎖可変部とヒトκ鎖定常部のキメラ転写産物を発現していることを示し、図１１Bは増幅産物の配列解析の結果を示す。 ヒトCγ1 targeting constructとhIgG1-SW樹立のストラテジーを示す図である。図１２ＡはChicken Cμ locusを、図１２ＢはHuman Cγ1 targeting constructを、図１２ＣはHuman Cγ1 targeted locusを示し、図１２左図sIg発現の模式図である。 hCγ1 targeting constructの構築を示す図である。 ニワトリ膜型IgMの膜貫通領域の遺伝子配列を示す図である。 IgH3’arm の5’側部分配列を示す図である。 IgH3’arm の3’側部分配列を示す図である。 hCγ1導入の確認の結果を示す図である。図１６ＡはFACSによるsIg-クローンの選択を示し、図１６Ｂはgenomic PCRによるtargeted locusの確認を示す図である。 hIgG1高発現クローンの選択の結果を示す図である。図１７ＡはhIgG1発現細胞のsortingを示し、4-OHT処理によりsIgを回復させた細胞についてsingle cell sortを行った。図１７ＢはFACSによるhIgG1/hCκ高発現クローンの選択を示し、図１７ＣはELISAによる抗体分泌の高いクローンの選択を示す図である。Standard(Human IgG)は、5～320ng/ml、Sample：1～64倍で系列希釈を行った。 DT40-SW-hgの増殖能力がDT40-SWと同等であることを示す図である。 DT40-SW-hgがchicken-human chimeric IgG1抗体遺伝子を転写することを示す図である。図１９ＡはL鎖を、図１９ＢはH鎖を示す。 DT40-SW-hgがヒトIgG1型抗体を発現することを示す図である。図２０Ａはα-hIgG(×1：タンパク量50μg)を、図２０Ｂはα-hCκ(×1：タンパク量150μg)を、図２０Ｃはα-cIgM(×1：タンパク量150μg)を示す。 DT40-SW-hgがヒトIgG1型抗体を分泌することを示す図である。図２１ＡはhIgG1抗体分泌を、図２１ＢはL鎖とH鎖の会合を、図２１ＣはcIgM抗体分泌を示す。 DT40-SW-hgが抗体可変部へ高頻度に変異を導入することを示す図である。 DT40-SW-hgが抗体可変部（重鎖可変部）へ高頻度に変異を導入することを示す図であり（クローン１）、下線部はCDR領域を示す。 DT40-SW-hgが抗体可変部（重鎖可変部）へ高頻度に変異を導入することを示す図である（図２３－１Ａの続き）。 DT40-SW-hgが抗体可変部（重鎖可変部）へ高頻度に変異を導入することを示す図であり（クローン２）、下線部はCDR領域を示す。 DT40-SW-hgが抗体可変部（重鎖可変部）へ高頻度に変異を導入することを示す図である（図２３－２Ａの続き）。 DT40-SW-hgが抗体可変部（軽鎖可変部）へ高頻度に変異を導入することを示す図であり（クローン１）、下線部はCDR領域を示し、欄外は遺伝子変換に用いられたと予想される偽遺伝子を示す。 DT40-SW-hgが抗体可変部（軽鎖可変部）へ高頻度に変異を導入することを示す図であり（クローン２）、下線部はCDR領域を示し、欄外は遺伝子変換に用いられたと予想される偽遺伝子を示す。 DT40-SW-hgが抗体可変部（軽鎖可変部）へ高頻度に変異を導入することを示す図である（図２３－４Ａの続き）。
　本発明のヒト型抗体を産生するＢ細胞は非ヒト由来のＢ細胞を用いて以下のようにして作製する。
　本発明においてヒト型抗体を産生するＢ細胞を作製するための非ヒト由来のＢ細胞は、体細胞超変異に必須の役割を持つ酵素であるAID（activation-induced cytidine deaminase）を構成的、または誘導的に発現し、抗体の遺伝子に自発的な変異を導入する性質を有するものであれば、どのような細胞も用いることができる。由来動物種、細胞株種は限定されない。マウス、ヒツジ、ラット、ウサギ、ニワトリなどの脊椎動物のＢ細胞若しくはその細胞株又はそれらの変異株を用いることができる。好ましくはニワトリＢ細胞由来のDT40細胞株を用いる。DT40細胞株は、Ｂリンパ腫由来の細胞であり、第２染色体がトリソミーという特徴をもつ(Baba, T.W., Giroir, B.P. and Humphries, E.H.:Virology 144 : 139-151,1985)。DT40株としては、野生型DT40株又は本発明者らが独自に樹立したDT40-SW株（変異機能を司る遺伝子AIDの発現を可逆的にスイッチすることにより、その抗体変異機能をON/OFF制御できる変異株（詳細はKanayama, N., Todo, K., Reth, M., Ohmori, H. Biochem. Biophys. Res. Commn. 327:70-75 (2005)及び特開2006-109711号公報に記載されている））を用いることができる。
　該Ｂ細胞は、細胞外刺激により外因性Creリコンビナーゼ遺伝子の発現が誘導され、発現されたCreリコンビナーゼにより外因性AID(activation induced cytidine deaminase)遺伝子の向きを反転させることにより、AID発現を誘導することおよび停止させることが可能な脊椎動物Ｂ細胞であって、以下の特徴：
１）内因性のAID遺伝子が機能的に破壊されており、内因性AID遺伝子発現によるAIDタンパク質は産生されないこと、
２）互いに逆方向の2つのloxP配列で挟まれた外因性のAID遺伝子、および該2つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に存在する該動物細胞で機能し得るプロモーターを有し、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には、該プロモーターによるAID遺伝子の発現が可能であり、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には、AID遺伝子の発現は停止すること、および３）Creリコンビナーゼ遺伝子が、細胞外刺激によりCreリコンビナーゼ活性化が可能な形で導入されており、Creリコンビナーゼ活性化により、上記外因性AID遺伝子を含む2つのloxP配列に挟まれた領域の方向が反転すること、を有するＢ細胞である。
　該細胞を得るためには、まず、内因性のAID遺伝子を発現し得る任意の脊椎動物に由来する細胞の、内因性のAID遺伝子を機能的に破壊して内因性AID遺伝子の発現によるAIDタンパク質の産生が起こらないように細胞を改変するとよい。内因性AID遺伝子の両対立遺伝子の一方は、通常の手法にのっとりAID遺伝子ターゲティングベクターを作製して遺伝子破壊（ノックアウト）を行い、もう一方の対立遺伝子座には、Creリコンビナーゼによりその方向が反転し得るように構築された外因性のAIDをコードする遺伝子を含むDNA構築物を含有するAID遺伝子ターゲティングベクターを作製して、相同組換えを起こすことにより、内因性AID遺伝子は破壊され、外因性AID遺伝子の発現制御が可能な細胞を作製し得る。Creリコンビナーゼによりその方向が反転し得るように構築された外因性のAID遺伝子は、互いに逆方向の2つのloxP配列に挟まれている。さらに、この２つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に、対象とする動物細胞において機能するプロモーターが存在し、相同組換えにより該プロモーターもゲノム上に挿入されるように、ターゲティングベクターを設計するとよい。このようにして、Creリコンビナーゼによりその方向が反転し得るように構築された外因性のAID遺伝子を細胞のゲノムに組込むことにより、該外因性AID遺伝子が上記プロモーターに対して順方向に配置されている場合は、該プロモーターによってAID遺伝子の発現が誘発される。言うまでもなく、該AID遺伝子が上記プロモーターに対して逆方向に配置された場合には、AID遺伝子の発現は起こらない。ここで用いる、適切なプロモーターは当業者であれば、様々なものを想到し得、適切なものを選択することができる。例えば、β-アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、CAGプロモーターが挙げられる。
　例えば、上記のCreリコンビナーゼ遺伝子は、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、上記細胞外刺激がエストロゲンまたはその誘導体による刺激であり、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導される。エストロゲン誘導体刺激を細胞に与えると、Creリコンビナーゼの活性化が誘導される。したがって、細胞外からエストロゲン誘導体を作用させたときにのみ、Creリコンビナーゼが活性化し（ここで、上記融合タンパク質が核内に移行して、CreリコンビナーゼがloxP配列に作用し得ることを指す）、AID遺伝子を含むloxP配列に挟まれた領域が反転される。
　また、上記２つのloxP配列に挟まれた領域内に、AID遺伝子と同じ向きのマーカー遺伝子をさらに含んでいてもよく、ここで、AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には該マーカー遺伝子も順方向に配置されているため該マーカー遺伝子が発現して、AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されてAID遺伝子が発現可能である細胞を該マーカーにより選択可能となる。
　さらに、上記２つのloxP配列に挟まれた領域内に、AID遺伝子とは逆向きのマーカー遺伝子をさらに含んでいてもよく、ここで、AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には該マーカー遺伝子は順方向に配置されているため該マーカー遺伝子が発現して、AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されてAID遺伝子を発現できない細胞を該マーカーにより選択可能となる。
　このようなＢ細胞は、特許第4487068号公報の記載に従って得ることができる。
　本発明のヒト型抗体を産生するＢ細胞を作製するには、上記の非ヒト由来Ｂ細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子で置換する。この際、非ヒト由来Ｂ細胞が有する抗体の定常部の遺伝子をヒト抗体定常部の遺伝子で置換すればよい。
　抗体遺伝子の置換は、相同組換えにより行うことができる。このためには、本発明のヒト型抗体産生細胞の作製に用いる非ヒトＢ細胞の動物種の抗体遺伝子を単離し、構造を解析し、該抗体遺伝子の定常部エキソンを置換するターゲティングベクターを構築する。次いで、このようにして構築したターゲティングベクターを用いて上記非ヒトＢ細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換する。
　ヒト抗体定常部遺伝子の具体的な導入方法の概略は以下の通りである(図６)。以下の方法では、ニワトリDT40-SWを用いる場合の方法を示す。
(1)ターゲティングベクター
　定常部遺伝子の上流約2kbpと下流2～5kbpを相同組換えに必要な領域として使用する。
　定常部遺伝子の上流のイントロンに含まれるスプライシング受容体配列およびスプライシングブランチポイント配列は、ヒト抗体遺伝子のものを使用する。
　定常部遺伝子の下流にあるポリA付加配列はニワトリ由来を使用する。
　loxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子を、スプライシング配列を含むヒト定常部遺伝子の上流に配置する。
(2)キメラ抗体産生細胞の作製
　このターゲティングベクターが抗体定常部遺伝子に正しく導入されると、野生型(図６Ａ)の抗体遺伝子の構造は図６Bのように変化する。薬剤耐性遺伝子により抗体遺伝子を分断しているので抗体遺伝子は不活性化して抗体を産生することはできない。したがって、薬剤耐性に加えて細胞表面上の抗体産生の消失をフローサイトメトリーによって解析することによって、ターゲティングが目的どおりに起こった細胞の候補を絞り込むことが可能である。想定通りの組み込みが起こっているかどうかについては、PCRあるいはサザンブロットによるゲノム遺伝子の解析により確認することができる。
　この方法で用いるDT40-SW細胞には、変異型エストロジェンレセプターとの融合タンパク質としてCreリコンビナーゼ(Mer-Cre-Mer)を発現させている。Mer-Cre-Merは、通常不活性型であるが、エストロジェンの誘導体の一つである4-ヒドロキシタモキシフェン(4-OHT)を培地中に添加することにより活性化させることができる（Zhang, Y. et al., Nucleic Acids Res. 24 543-548 (1996)）。したがって、ターゲティングベクターを導入していったん抗体産生を失った細胞(図６Ｂ)に4-OHTを作用させると、Creリコンビナーゼが活性化してloxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子が除去され、図６Ｃのような抗体遺伝子構造に変化する。この構造では、再度、抗体遺伝子の発現が可能になるので導入されたニワトリ抗体可変部とヒト抗体定常部とのキメラ抗体の発現が期待できる。キメラ抗体を細胞表面に発現するようになった細胞は、フローサイトメトリーなどによって単離することが可能である。
　抗体は、重鎖と軽鎖から構成されるので、図６Ｄのように軽鎖→重鎖あるいは重鎖→軽鎖の順に段階的に遺伝子組換えを進めて、キメラ抗体産生細胞を作製する。
(3)外来抗体可変部遺伝子への変異導入
　ヒトIgG1κ定常部産生型DT40-SWは、これまでに確立しているDT40-SWを用いたin vitro抗体作製方法と同様の操作により抗体可変部遺伝子への変異導入が可能である。この細胞は初期状態では変異導入機構はOFFであるが、4-OHTによる処理により変異をONにスイッチした細胞を作製できる。変異がONの細胞は緑色蛍光タンパク質を発現するのでフローサイトメトリーによるソーティングにより分離することができる。その後、培養を継続するだけで外来抗体可変部に変異が導入された細胞集団が生成する。この変異体ライブラリーから目的の特異性、親和性を有した抗体を産生する細胞を単離する。変異と選択を繰り返すことにより、取得抗体の親和性成熟も可能である。この方法では、細胞自身の保持する変異能力を使うことから、変異と選択の操作の連続化が容易である。取得された抗体の特性は、細胞の変異機能を4-OHTによる処理によりOFFにすることにより可能である。
　以上のようにこの方法により、DT40の抗体変異機能を損なわずにヒトIgG1κ定常部とのキメラ抗体を発現するDT40-SWを作製することができる。該細胞をDT40-SE-hgと呼ぶ。この細胞は従来のDT40-SWと全く同様に抗体作製に使用することが可能であり、得られるヒトIgG1型抗体は、ヒト抗体定常部を介したエフェクター機能について様々な評価に直接使用できることから、医薬開発に向けた迅速な候補抗体の取得のための技術として極めて有用である。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
（A）ニワトリ抗体軽鎖定常部遺伝子のヒト抗体κ鎖定常部遺伝子への置換
１）ヒトκ鎖定常部遺伝子ターゲティングベクターの構築
　図６に示した概略に沿って、ニワトリ軽鎖定常部をヒトκ鎖定常部に置換する方法を図７に示す。ターゲティングベクターの構築にあたって、上述の項目に加えて次の点に特に工夫した。(i) 遺伝子発現や変異導入に関わる因子であるmatrix attachment region (MAR)や3’エンハンサー (3’E)を改変・削除しない様にターゲティングアームを設計した、(ii) ベクターに組み込むヒトκ鎖定常部(Cκ)遺伝子を含む断片にはヒトCκ上流部分のイントロンにスプライシングアクセプター配列およびブランチポイント配列もふくまれるようにした、(iii) ベクターに組み込むヒトCκ遺伝子断片にはポリA付加配列は含ませず、ニワトリ抗体軽鎖遺伝子上のポリA配列が使用されるようにした。
　以下に、ターゲティングベクターの構築手順を示す(図８)。ニワトリ軽鎖遺伝子は、すでにクローニングされており(Reynaud, C.-A., et al., Cell 40, 283-291 (1985))、ゲノム解析により周辺の塩基配列も明らかになっている（International Chicken Genome Sequencing Consortium, Nature 432, 695-716 (2004)）。ニワトリ抗体軽鎖可変部周辺の遺伝子断片を得るために、明らかになっている配列を基にしてプライマーをデザインし、PCRによって遺伝子断片を得た。DT40-SWのゲノムDNAから定常部上流の5’側ターゲティングアーム（IgCL5’）に用いる遺伝子断片を、プライマーIgLD511 (5’-GAGTCGCTGAACTAGTCTCGGTCTTTCTTCCCCCATCG-3’（配列番号５）、ACTAGTはSpeIサイト)とcCL5-Bam2 (5’-ACGGATCCATATCTATTTTCATGGATGTTATACGTGTGCG-3’（配列番号６）、GGATCCはBamHIサイト)およびKOD-Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡)を用いてPCRによって増幅し、SpeIとBamHIで処理した後、pBluescriptIISK(-)に組込んだ。同様にして、定常部下流の3’側ターゲティングアーム(IgCL3’)に用いる遺伝子断片をプライマーcCL3-HindIII (5’-CTAAGCTTCCCACTGGGGATGCAATGTGAGGACAGT-3’（配列番号７）、AAGCTTはHindIIIサイト)とcCL3-Kpn2 (5’-TGCGATCCAGGTACCACGATAGCACTGCCTGCCTCCATC-3’（配列番号８）、GGTACCはKpnIサイト)を用いて増幅し、HindIIIとKpnIで処理した後、pBluescriptIISK(-)中のIgCL5’の下流に組込んだ。さらに、human Burkitt's lymphoma 細胞株 Daudi (Riken cell bankより入手)のゲノムDNAから、hCkを含む遺伝子断片をプライマーhCk5-Bam (5’-CTAAACTCTGAGGGGATCCGATGACGTGGCCATTCTTTGC-3’（配列番号９）、GGATCCはBamHIサイト)とhCk-HindIII(5’-GTAAGCTTCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGA-3’（配列番号１０）、AAGCTTはHindIIIサイト)を用いて増幅し、BamHIとHindIIIで処理した後、IgCL5’とIgCL3’の間に挿入した。さらに、両端にloxP配列を持つBlasticidin S耐性遺伝子(Bsr) (Arakawa, H., et al. BMC Biotechnol. 1, 7 (2001))をhCkの直上部のBamHIサイトに組込んだ。
２）ヒトκ鎖定常部遺伝子ターゲティングベクターを組み込んだDT40-SWの作製
　（A）－１）で作製したヒトCκ遺伝子ターゲティングベクター15μgをNotIで切断して直鎖化し、1×107細胞のDT40-SWと混合して500μlの懸濁液とし、4mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに添加して、550V、25μFの条件で電気穿孔を行った。エレクトロポレーション法にはGene Pulser Xcell (バイオラッド社)を用いた。電気穿孔後、細胞を10mlの増殖培地（PRMI1640、Invitrogen社；10％ウシ胎児血清、Invitrogen社；1％ニワトリ血清、Sigma社）に懸濁して24時間培養後、10mlの2×選択培地(増殖培地+ブラストサイジンS(科研製薬))を添加し、終濃度20μg/mlの濃度のブラストサイジンSとして96穴プレート2枚に分注して10～14日間培養した。4回の試行でブラストサイジンSにより選択されたコロニーが139クローン得られた。
　コロニーを形成した細胞を、R-phycoerythrin (R-PE) labeled mouse anti-chicken IgM mAb (クローンM1、Southern Biotechnology社)で染色し、FACS Calibur (BD Bioscience社)で解析した。目的どおり、ターゲティングされた細胞は、抗体重鎖を発現できることが期待できることから、抗ニワトリIgM抗体で染色されない3クローンを選択した(図９Ａ)。遺伝子レベルでの確認をするために、これらの細胞からゲノムDNAを抽出し、ターゲティングベクターの組み込みを、ターゲティングベクターの外側領域に対するプライマーとベクターに特異的なプライマー、すなわち、上流領域ではプライマーLLF1 (5’- CCATCGGCGTGGGGACACACAGCTGCTGGGATTCC-3’（配列番号１１）)とBSR2 (5’- GTGATGATGAGGCTACTGCTGACTCTCAACATTCTACTCCTCC -3’（配列番号１２）)、下流領域ではHck-F2 (5’- GAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCC -3’（配列番号１３）)とcCL3-dn6 (5’- GGAGCTGTACCATGCGGCCTGCTCTGCTGATGCCATGTCG -3’（配列番号１４）)を用いてPCRにより確認した(図９Ｂ)。クローン2と3で目的どおりターゲティングされたことを示すPCR産物の特異的な増幅が見られた。このうちクローン2を以降の操作に用いた。
３）ヒトκ鎖定常部の発現
　クローン2について、以前に報告したように50 nMの4-OHTで処理(Kanayama, N., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 327, 70-75 (2005))することによって薬剤耐性遺伝子を除去した。薬剤耐性遺伝子が除去された細胞では、抗体の発現が回復していることが期待される。細胞表面の抗体の発現をmouse anti-chicken IgM mAb クローンM1あるいはクローンM4（Riken Cell Bank）およびmouse anti-human Ig k light chain（BD Bioscience社）によって染色し、フローサイトメトリーで解析したところ、細胞表面のIgMとヒトκ鎖の両方を発現する細胞が出現していることが確認された（図１０Ａ）。FACS Ariaを用いてヒトCκを高発現する細胞をsingle cell sortingしたところ、これらはニワトリIgMとヒトCκを細胞表面に高発現していた。また、培養液中にもニワトリμ鎖とヒトκ鎖が会合した抗体が分泌されていることがELISAによって確認され、確認したくクローンはすべて薬剤耐性を失っていた。これらのうち、代表的なクローンをDT40-SW-hkと命名し以降の検討をおこなった。
　DT40-SW-hkに組み込んだヒトCκ遺伝子の転写レベルの発現をRT-PCRによって解析した。DT40-SW-hkの全RNAをTRIzol (Invitrogen社)によって抽出し、Superscript II逆転写酵素(Invitrogen社)とオリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、軽鎖の増幅のためにセンスプライマー(CLL5-Bam: 5’- CGGCGTGGGGATCCACAGCTGCTGGGATTC-3'（配列番号１５）)とアンチセンスプライマー(cCMUCLAR: 5’- GGAGCCATCGATCACCCAATCCAC -3’（配列番号１６）)あるいは(hck-RT2: 5’- CTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCC -3’（配列番号１７）)を用い、また、内部標準としてβアクチンの転写産物をプライマーactin3 (5’-CTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGCCAGC-3’（配列番号１８）)とactin4 (5’-TTCATGAGGTAGTCCGTCAGGTCACGGCCA-3’（配列番号１９）)を用いて増幅した。その結果、DT40-SW-hkはニワトリ抗体軽鎖を発現せず、ニワトリ軽鎖可変部とヒトκ鎖定常部のキメラ転写産物を発現していることが確認された(図１１Ａ)。また、増幅産物の配列解析を行ったところ、エキソンの結合は正常であり、抗体軽鎖タンパク質を目的どおりコードする転写産物であることが確認された(図１１Ｂ)。
（B）ニワトリ抗体μ鎖遺伝子のヒト抗体γ1鎖遺伝子への置換
１）ヒトγ1鎖遺伝子ターゲティングベクターの構築
　図４に示した概略に沿って、ニワトリμ鎖(Cμ)遺伝子をヒトγ1鎖 (Cγ1) 遺伝子に置換する方法を図１２に示す。ターゲティングベクターの構築にあたって、次の点を工夫した。(i) 遺伝子発現や変異導入に関わる因子であるμエンハンサー(Eμ)を改変・削除しないようにターゲティングアームを設計した、(ii) 5’側のターゲティングアームは、定常部のすぐ上流には繰り返し配列の多いスイッチ領域(Sμ)があるためSμの上流領域に設定する、 (ii)ニワトリCμ遺伝子のCH1、CH2、CH3、CH4、分泌型C末端エキソンを、ヒトCγ1遺伝子のうちCH1、ヒンジ、CH2、CH3、分泌型C末端エキソンと置換し、膜貫通ドメインエキソンはニワトリμ鎖遺伝子のものを残す、(iii) ヒトCγ1遺伝子断片にはCγ1上流部分のイントロンにスプライシングアクセプター配列およびブランチポイント配列もふくまれるようにする、(iv) ヒトCγ1遺伝子断片には分泌型C末端下流のポリA付加配列は含ませず、ニワトリCμの分泌型C末端下流のポリA配列が使用されるようにする。以下に、ターゲティングベクターの構築手順を示す(図１３)。Sμの上流領域の5’側ターゲティングアーム（cIgH5’arm）に用いる遺伝子断片をえるために、Sμ付近の塩基配列 (Kitao, H. et al. Int. Immunol. 12, 959 (2000); accession no. AB029075)からプライマーJCF_Sac4 (5’- AAATGGCCGAATTGAGCTCGGCCGTTTTACGGTTGGGTTC -3’（配列番号２０）、GAGCTCはSacIサイト)とJCR_Bam2 (5’- CTCATCATTCAGTATCGATGGATCCTTAATTACTCCCACG -3’（配列番号２１）、GGATCCはBamHIサイト)をデザインし、DT40-SWのゲノムDNAからPCRによって増幅した。得られた遺伝子断片は、pCR-Blunt (Invitroten社)に組込み、塩基配列を確認した(図１３Ａ)。3’側ターゲティングアーム(cIgH3’arm)に用いるニワトリCμ遺伝子の分泌型C末端エキソンより下流の遺伝子情報は公開されていないため、ニワトリ分泌型IgMのmRNAの配列 (Dahan, A. et al
. Nuclec Acids Res. 11， 5381 (1983)； accession no. X01613)からCH4ドメインに対するセンスプライマーcCmu4-F1 (5’- GGCTCAGCGTCACCTGCATGGCTCAGG-3’（配列番号２２）)をデザインし、膜型IgMの膜貫通領域遺伝子の下流の3’UTRに対するプライマーmCmyu3’ (5’-CCTTGATTTCGAAGTGGAGAAGACGTCGGGAGGTGGAGA-3’（配列番号２３）; Sayegh, C. E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 10806 (1999))とともに用いてPCRによって遺伝子断片を増幅し、pCR-BluntにクローニングしてTM1エキソンおよびTM2エキソンにコードされる膜貫通領域遺伝子および3’UTRの一部の配列を明らかにした(図１４)。ニワトリ分泌型IgMの塩基配列と図１４に示したTM1の配列を基にプライマーCH4F4 (5’- TGGATAGGGCTTCGGGTAAAGCAAGTGCTGTCAATGTCTC -3’（配列番号２４）)とTM1R2 (5’-ATGAAGGTGGAGGTGGTGGCCCAAAGGCGTTGGATGTCG-3’（配列番号２５）)をデザインし、これらを用いたPCRによってニワトリCμ遺伝子のCH4とTM1の間のゲノムDNAを用いて増幅した。この断片の増幅にはKOD-FX(東洋紡)を用いた。得られた遺伝子断片をpCR-Bluntにクローニングし、5’側および3’側より部分配列を決定した(図１３Ｂ、図１５)。ヒトCγ1遺伝子断片は、human Burkitt's lymphoma 細胞株 DaudiのゲノムDNAを鋳型としてプライマーhIgG1F1 (5’-ACGGATCCTGCAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACC-3’（配列番号２６）、GGATCCはBamHIサイト)とhIgG1R1 (5’-CGGCGGCCGCACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC-3’（配列番号２７）、GCGGCCGCはNotIサイト)を用いて増幅し、pCR-Bluntにクローニングし、配列を確認した(図１３Ｃ)。cIgH3’armの上流のNotIサイトにhCγ1遺伝子を含むNotI断片を挿入し(図１３Ｄ)、cIgH3’armとhCγ1遺伝子を連結したBamHI-EcoRI断片をpBluescriptIISK(-)に挿入した(図１３Ｅ)。さらに、hCγ1の上流のSacI-BamHI領域にcIgH5’armを挿入し(図１３Ｆ)、最後にcIgH5’armとhCγ1の間のBamHIにloxPで挟まれたブラストサイジン耐性遺伝子を挿入した(図１３Ｇ)。
２）ヒトγ1鎖遺伝子ターゲティングベクターを組み込んだDT40-SWの作製
　（B）－１）で作製したヒトCγ1遺伝子ターゲティングベクター15～40μgをNotIで切断して直鎖化し、1×107細胞のDT40-SWと混合して500μlの懸濁液とし、4mmギャップのエレクトロポレーションキュベットに添加して、550Vまたは700V、25μFの条件で電気穿孔を行った。エレクトロポレーション法にはGene Pulser Xcellを用いた。電気穿孔後、細胞を10mlの増殖培地に懸濁して24時間培養後、終濃度20μg/mlの濃度のブラストサイジンSを含む増殖培地20mlに懸濁し、96穴プレート2枚に分注して10～14日間培養した。17回の試行でブラストサイジンSにより選択されたコロニーが207クローン得られた。
　目的どおりターゲティングされた細胞は、抗体重鎖を発現できなることが期待できることから、コロニーを形成した細胞をR-PE labeled mouse anti-chicken IgM mAbクローンM1で染色し、FACS Caliburで解析した。その結果、抗ニワトリIgM抗体で染色されない1クローンを得た(図１６Ａ)。
　遺伝子レベルでの確認をするために、これらの細胞からゲノムDNAを抽出し、ターゲティングベクターの組み込みを、ターゲティングベクターの外側領域に対するプライマーとベクターに特異的なプライマー、すなわち、上流領域ではプライマーJCF5 (5’-TAATCGGTACTTTTTAATCCTCCATTTTGCCCGAAATCGC-3’（配列番号２８）)とBSR3 (5’-CTGTGGTGTGACATAATTGGACAAACTACCTACAGAG-3’（配列番号２９）)、下流領域ではhIgGF5 (5’-TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGC-3’（配列番号３０）)とTM1R4 (5’-CCTTGATGAGGGTGACGGTGGCGCTGTAGAAGAGGCTG-3’（配列番号３１）)を用いてPCRにより確認した(図１６Ｂ)。sIg- であるクローンD2では目的どおりターゲティングされたことを示すPCR産物の特異的な増幅が見られた。今回の試行では、目的の細胞の取得効率が極めて悪いが、その後のトランスフェクション法の条件の最適化によって効率的な細胞株樹立法を確立している。
３）ヒトIgG1型抗体の発現
　クローンD2を50nMの4-OHTで処理することによって薬剤耐性遺伝子を除去した。剤耐性遺伝子が除去された細胞では、抗体の発現が回復していることが期待される。細胞表面の抗体の発現をbiotin化mouse anti-human IgG1 mAb (ZYMED社)およびPE-CyTM5 Streptavidin (BD Pharmingen社)によって染色し、フローサイトメトリーで解析したところ、細胞表面のヒトIgG1を発現する細胞が出現していることが確認された（図１７Ａ）。FACS Ariaを用いてヒトIgG1を高発現する細胞をsingle cell sortingし、得られたコロニーのフローサイトメトリー解析でヒトIgG1とヒトκ鎖を高発現する3クローンを選択した(クローン25，49，53)(図１７Ｂ)。これらのクローンが薬剤耐性遺伝子を失っていることをPCRで確認し、これらのクローンの培養上清中の抗体分泌をELISAによって検討した。500倍希釈したgoat anti-human IgG Fc (Betyl社)を96ウェルプレート（Greiner社）上に結合させ、系列希釈してプレート上に結合させたサンプル上清中のヒトIgG1型抗体を500倍希釈したperoxidase-conjugated goat anti-human IgG Fc (KPL社)を用いて検出したところ、3クローンとも同等の分泌量が認められ、この方法により作成されたヒトIgG1型抗体産生型DT40が、膜型および分泌型抗体の両方の発現が可能であることが示された(図１７Ｃ)。これらのうち、代表的なクローン25をDT40-SW-hgと命名し詳細な検討をおこなった。
　DT40-SW-hgの増殖能力をDT40-SWと比較したところ、同等の増殖を示した(図１８)。すなわち、ヒト型抗体の発現は、変異をONにして長期に培養した場合も変異導入に重要な増殖過程には影響がないことが確認された。
　DT40-SW-hgに組み込んだヒトCγ1遺伝子およびヒトCκ遺伝子の転写レベルの発現をRT-PCRによって解析した。DT40-SW-hgの全RNAをTRIzolによって抽出し、Superscript II逆転写酵素とオリゴdTプライマーを用いてcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、軽鎖はセンスプライマーCLL5-BamとアンチセンスプライマーcCMUCLARあるいはhck-RT2を用いて増幅し、重鎖はセンスプライマーChicken LH5-Eco (5’-GCCGGAATTCCGACGGAGGAGCACCAGTCG-3’（配列番号３２）)とアンチセンスプライマーcCmu2-R (5’-TTGTACCACGTGACCTCGGTGGGACGGCG-3’（配列番号３３）)またはhCg1-1R (5’-CTCTTGGAGGAGGGTGCCAGGGGGAAGACC-3’（配列番号３４）)を用いて増幅した。その結果、DT40-SW-hgはニワトリ抗体を発現せず、ニワトリ抗体可変部とヒト抗体定常部のキメラ転写産物を発現していることが確認された(図１９)。
　DT40-SW-hgに組み込んだヒトCγ1遺伝子およびヒトCκ遺伝子の発現を、細胞表面および細胞内のタンパク質レベルで確認するためにWestern blotを行った。回収した細胞をPBS(-)で洗浄し0.1%TritonX100および1/100体積のProtease inhibitor（nacalai tesque社）を加えたPBS(-)で5×106cells/200μlの割合で細胞を懸濁し、15秒vortexした後、30min、on iceで静置した。この間、10min毎に撹拌した。12,000rpm、10min遠心分離後、上清を回収し、無細胞抽出液とした。無細胞抽出液のタンパク質濃度をBCA Protein Assay Kit (PIERCE)で決定し、50μgまたは150μgの無細胞抽出液を12.5％SDS-PAGEにて分離した。分離したタンパク質は、polyvinylidene fluoride (PVDF)膜(Immobilon-P, Millipore社)に転写して各抗体と反応させた後、ECL Advance Western Blotting Detection Kitを用いて検出した。化学発光は、ChemiDoc XRS system (Bio-Rad Laboratory 社)でデータを取り込んだ。抗体は、ヒトIgG Fcの検出には5000倍希釈したperoxidase labeled goat anti-human IgG Fc、ヒトκ鎖の検出には200倍希釈したbiotin化mouse anti-human Ig k light chain　(BD pharmigen社)と100000倍希釈したstreptavidin-HRP Conjugate　(ZYMED社)、ニワトリIgMの検出には10000倍希釈したperoxidase conjugated goat anti-chicken IgM (mu chain) (ROCKLAND社)を用いた。その結果、DT40-SW-hgは、約55kDaのヒトIgG1 Fcを含む重鎖と約25kDaのヒトCκを含む軽鎖を発現しており、ニワトリIgMは発現していないことが示された(図２０)。アミノ酸配列から推定されるニワトリ-ヒトキメラ抗体の重鎖の分子量は56kDa、軽鎖鎖は28kDaで、ほぼ予測通りの分子量のタンパク質の発現が確認された。
　さらに、DT40-SW-hgからのヒトIgG1型抗体の分泌をFc部分に対する抗体を用いたELISAで確認しただけでなく、ヒトγ1鎖とヒトκ鎖の会合もそれぞれの特異的抗体を用いてELISAで調査した(図２１)。ヒトγ1鎖とヒトκ鎖の会合は、goat anti-human IgG Fc（500倍希釈）、Biotin化 mouse anti-human Ig k Light Chain (500倍希釈)、Streptavidin-HRP Conjugate　(1000倍希釈)を用いて検出し、ニワトリIgMはgoat anti-chicken IgM (mu chain) (Betyl社)(500倍希釈)とperoxidase-conjugated goat anti-chicken IgM (mu chain) (ROCKLAND)(1,000倍希釈)を用いて検出した。系列希釈した培養上清を用いて分泌抗体の解析を行ったところ、DT40-SW-hgはニワトリIgMを分泌せず（図２１Ｃ）、ヒトIgG1型抗体のみを分泌し(図２１Ａ)、分泌された抗体はヒトγ1鎖とヒトκ鎖が会合した状態であることが確認された(図２１Ｃ)。すなわち、DT40-SW-hgは、ニワトリ抗体可変部とヒト抗体定常部のキメラ重鎖とキメラ軽鎖が安定に会合したキメラ抗体を、細胞表面と培養上清に発現可能な有用な細胞株であることが示された。
（C）ヒトIgG1型抗体産生DT40-SW（DT40-SW-hg）における抗体可変部への変異導入
　DT40-SW-hgの変異機構を以前に報告済みの方法によりONにして抗体可変部への変異導入を解析した(Kanayama, N., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 327, 70-75 (2005))。4-OHTによって細胞を処理後、GFP+の細胞、すなわち、変異導入に必須のAIDの発現がONになった細胞を、FACSAriaを用いたフローサイトメトリーによって単一細胞として単離し、独立した2クローンを5mlスケールで5×105cells以上かつover growthしない状態で維持して41日間培養した。培養した細胞からゲノムDNAを単離し、重鎖可変部はプライマーCVH1F2 (5’- GGCGGCTCCGTCAGCGCTCTCT-3’（配列番号３５）)およびCJH1R2 (5’-GCCGCAAATGATGGACCGAC-3’（配列番号３６）)を用いて、軽鎖可変部はプライマーCVLF61 (5’- GGCACGGAGCTCTGTCCCATTGCTG -3’（配列番号３７）)およびCVLR31 (5’- CCCCAGCCTGCCGCCAAGTCCAAG -3’（配列番号３８）)を用いてPCRによって増幅し、pCR-Bluntベクターにクローニングした。プラスミドDNAは、High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche)を用いて抽出し、ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)を用いてSequence反応をおこない、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて塩基配列を解析した。41日間培養後のサンプルの塩基配列を、変異をONにする前の元の塩基配列と比較したところ、DT40-SW-hgの抗体可変部遺伝子には重鎖および軽鎖の両方においてオリジナル株であるDT40-SWと比べて多数の変異が導入されていた(図２２)。DT40-SW-hgは、塩基あたりの変異導入効率においても解析クローンに占める変異を有するクローンの割合においてもDT40-SWと比べて高い頻度での変異導入が認められ、抗体ライブラリーを作製するのに十分な変異能力を備えていることが示唆された。また、可変部遺伝子に導入された変異の分布をみると、様々な部位に変異が導入されていた(図２３－１～図２３－４)。
　すなわち、これらの結果は、DT40-SW-hgの変異能力をONにして一定期間培養することにより、任意の抗原に対する抗体が含まれた抗体ライブラリーを形成可能であることが示唆しており、DT40-SW-hgが抗体作製において有用な細胞株であること保証するものである。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (11)

  1. 　細胞外刺激により外因性Creリコンビナーゼ遺伝子の発現が誘導され、発現されたCreリコンビナーゼにより外因性AID(activation induced cytidine deaminase)遺伝子の向きを反転させることにより、AID発現を誘導することおよび停止させることが可能な非ヒト脊椎動物Ｂ細胞であって、以下の特徴：
    １）内因性のAID遺伝子が機能的に破壊されており、内因性AID遺伝子発現によるAIDタンパク質は産生されないこと、
    ２）互いに逆方向の2つのloxP配列で挟まれた外因性のAID遺伝子、および該2つのloxP配列で挟まれた領域の上流側に存在する該動物細胞で機能し得るプロモーターを有し、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して順方向に配置されている場合には、該プロモーターによるAID遺伝子の発現が可能であり、上記AID遺伝子が該プロモーターに対して逆方向に配置されている場合には、AID遺伝子の発現は停止すること、および
    ３）Creリコンビナーゼ遺伝子が、細胞外刺激によりCreリコンビナーゼ活性化が可能な形で導入されており、Creリコンビナーゼ活性化により、上記外因性AID遺伝子を含む2つのloxP配列に挟まれた領域の方向が反転すること、
    を有する上記Ｂ細胞の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置換することを含む、ヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  2. 　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞のCreリコンビナーゼ遺伝子は、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、上記細胞外刺激がエストロゲンまたはその誘導体による刺激であり、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導される、請求項１記載のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  3. 　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞の抗体遺伝子の定常部のみをヒト抗体遺伝子の定常部に置換する、請求項１又は２に記載のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  4. 　重鎖については定常部をコードするエキソンのうちCH1領域から分泌エキソンまでの領域をヒト由来IgG抗体重鎖定常領域と置換し、軽鎖については定常部エキソンのみをヒト由来κ軽鎖定常領域遺伝子と置換する、請求項１～３のいずれか１項に記載のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  5. 　ヒト型抗体を産生するＢ細胞が定常部遺伝子の上流に存在するイントロンに含まれるスプライシング受容体配列及びスプライシングブランチポイント配列としてヒト抗体遺伝子由来のものを含み、定常部遺伝子の下流にあるポリA付加配列として非ヒト脊椎動物Ｂ細胞のものを含み、さらにスプライシング配列を含むヒト定常部遺伝子の上流にloxP配列で挟まれた薬剤耐性遺伝子を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  6. 　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞の抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子への置換が前記Ｂ細胞の抗体遺伝子をターゲットとするターゲティングベクターを用いて行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  7. 　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞がニワトリB細胞株DT40細胞に由来する細胞である、請求項１～６のいずれか１項に記載のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  8. 　非ヒト脊椎動物Ｂ細胞がニワトリB細胞株DT40-SW細胞である、請求項７記載のヒト型抗体を産生するＢ細胞の作製方法。
  9. 　請求項１～８のいずれか１項に記載の作製方法により得られた、ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来Ｂ細胞。
  10. 　請求項９記載のヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来Ｂ細胞において、Creリコンビナーゼ遺伝子を活性化させ培養を行い抗体可変部遺伝子に変異を導入することを含む、ヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。
  11. 　ヒト型抗体を産生する非ヒト脊椎動物由来Ｂ細胞において、Creリコンビナーゼがエストロゲンレセプターとの融合タンパク質を発現するような形で存在し、細胞を細胞外からエストロゲンまたはその誘導体で刺激することにより、細胞内でCreリコンビナーゼの活性化が誘導され、抗体可変部遺伝子に変異を導入する、請求項１０記載のヒト型抗体変異ライブラリーを作成する方法。
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