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WO2012042903A1 - 試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法 - Google Patents

試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法 Download PDF

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Publication number
WO2012042903A1
WO2012042903A1 PCT/JP2011/005544 JP2011005544W WO2012042903A1 WO 2012042903 A1 WO2012042903 A1 WO 2012042903A1 JP 2011005544 W JP2011005544 W JP 2011005544W WO 2012042903 A1 WO2012042903 A1 WO 2012042903A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
reagent composition
group
sensor
composition according
reagent
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/005544
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
素記 内山
拓生 河野
Original Assignee
パナソニック株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by パナソニック株式会社 filed Critical パナソニック株式会社
Priority to US13/821,365 priority Critical patent/US9594044B2/en
Priority to CN201180046816.2A priority patent/CN103154717B/zh
Priority to JP2012536223A priority patent/JPWO2012042903A1/ja
Priority to EP11828468.6A priority patent/EP2623974B1/en
Publication of WO2012042903A1 publication Critical patent/WO2012042903A1/ja
Priority to US15/251,418 priority patent/US10571424B2/en
Priority to US16/682,655 priority patent/US10761045B2/en

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3271—Amperometric enzyme electrodes for analytes in body fluids, e.g. glucose in blood
    • G01N27/3272—Test elements therefor, i.e. disposable laminated substrates with electrodes, reagent and channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/006—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes for glucose
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    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/05—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a quinone or similar compound as acceptor (1.1.5)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/904—Oxidoreductases (1.) acting on CHOH groups as donors, e.g. glucose oxidase, lactate dehydrogenase (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a reagent composition, a sensor, a sensor system, and a sensor manufacturing method.
  • a sensor for detecting a target substance in a liquid sample has been proposed.
  • the liquid sample is blood
  • the target substance is glucose
  • An electrochemical blood glucose sensor includes an enzyme and an electron acceptor. This enzyme oxidizes glucose by specifically reacting with glucose in the blood (enzyme-substrate reaction).
  • the electron acceptor changes from an oxidant to a reductant by accepting electrons generated by oxidation.
  • the electron acceptor that has become a reductant is electrochemically oxidized at, for example, an electrode. From the magnitude of the electric current obtained by this oxidation, the glucose concentration in the blood, that is, the blood glucose level is easily detected.
  • an enzyme and an electron acceptor are applied on a substrate in a state of being dissolved in a reagent solution.
  • the reagent layer is formed by drying the reagent solution. As the formed reagent layer dissolves in the liquid sample, the enzyme-substrate reaction proceeds.
  • a reagent composition containing an oxidoreductase such as glucose dehydrogenase, an electron acceptor such as a quinone compound, and histidine or imidazole as an additive is known (for example, Patent Document 1). 2 and 4).
  • a reagent composition a reagent composition containing a transition metal complex having an oxidation-reduction enzyme such as glucose dehydrogenase dependent on PQQ (pyrroloquinoline quinone) and a pyridylimidazole ligand is known (for example, (See Patent Document 3).
  • a reagent composition containing a transition metal complex having an oxidation-reduction enzyme such as glucose dehydrogenase dependent on PQQ (pyrroloquinoline quinone) and a pyridylimidazole ligand
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • a pyridylimidazole ligand for example, (See Patent Document 3).
  • the inventors have found that the current value when a voltage is applied can change before and after the reagent solution or reagent layer passes through the storage period. Such a change in the current value reduces the measurement accuracy of the sensor. That is, the conventional reagent solution and reagent layer have room for improvement in storage stability.
  • an object of the present invention is to provide a new reagent composition in which a change in current value before and after a storage period is suppressed, and a sensor and a sensor system including the reagent composition.
  • the present invention has the following configuration.
  • R 1 to R 5 each independently represents a hydrogen atom, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group or a hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms, and the hydrocarbon group is an amino group May have at least one substituent selected from the group consisting of a hydroxyl group and a carboxyl group, two or three of A 1 to A 5 are nitrogen atoms, and the others are carbon atoms And when two of A 1 to A 5 are nitrogen atoms, A 1 is a nitrogen atom, and A 2 and A 5 are carbon atoms.
  • the electron acceptor is at least one selected from the group of quinone compounds comprising naphthoquinone, anthraquinone, phenanthrenequinone, phenanthrolinequinone, and quinone derivatives thereof.
  • the heterocyclic compound does not contain histidine and two of A 1 to A 5 in the formula (I) are nitrogen atoms, R 1 to R 5 Of these, at least one group is a substituent other than a hydrogen atom.
  • R 1 to R 5 is represented by C n H m- (a + b + c) (R 6 ) a (R 7 ) b (R 8 ) c
  • n represents a natural number of 2 or less
  • m represents a natural number of n + 1 or more and 2n + 1 or less
  • a, b and c each independently represents a natural number of n or less
  • R 6 to R 8 each independently represents a hydroxyl group, a carboxyl group or an amino group.
  • [6] as the heterocyclic compound imidazole, histamine, histidine, 2-amino-imidazole, 4,5-bis (hydroxymethyl) imidazole, 2-methylimidazole, 1,2-dimethylimidazole, 1,2,4 At least one selected from the group consisting of triazole, 3-amino-1,2,4-triazole, 4-amino-1,2,4-triazole and 3,5-diamino-1,2,4-triazole.
  • the reagent composition according to any one of [1] to [5], comprising a compound (excluding imidazole and histidine when the second requirement is satisfied).
  • heterocyclic compound histamine, histidine, 2-amino-imidazole, 4,5-bis (hydroxymethyl) imidazole, 2-methylimidazole, 1,2-dimethylimidazole, 1,2,4-triazole At least one compound selected from the group consisting of 3-amino-1,2,4-triazole, 4-amino-1,2,4-triazole and 3,5-diamino-1,2,4-triazole ( However, when the second requirement is satisfied, the reagent composition according to any one of [1] to [6], which contains histidine).
  • the quinone compound has a quinone and a substituent, and the substituent has an optionally substituted benzene ring and the hydrophilic functional group added to the benzene ring. 12].
  • the quinone compound has at least one functional group selected from the group consisting of a sulfo group, a carboxyl group, and a phosphate group as the hydrophilic functional group, according to [12] or [13].
  • Reagent composition has at least one functional group selected from the group consisting of a sulfo group, a carboxyl group, and a phosphate group as the hydrophilic functional group, according to [12] or [13].
  • the quinone compounds include the following (a) to (c): (A) the sulfo group is 1-sulfonic acid, 2-sulfonic acid, 3-sulfonic acid, 4-sulfonic acid, and 2,7-disulfonic acid; The reagent composition according to [14], wherein (b) the carboxyl group is 2-carboxylic acid, and (c) the phosphoric acid group is 2-phosphoric acid.
  • a sample chamber formed to receive a liquid sample; At least a pair of electrodes disposed in the sample chamber; A sensor layer comprising a reagent layer formed of the reagent composition according to any one of [1] to [19], which is disposed in contact with at least both of the pair of electrodes in the sample chamber.
  • a measuring unit for measuring a current value between the at least one pair of electrodes A sensor system comprising: a calculation unit that calculates a concentration of a target substance in the liquid sample based on a measurement result by the measurement unit.
  • the heterocyclic compound suppresses changes in the current value before and after the storage period.
  • This reagent composition is preferably applied to the reagent layer of the sensor.
  • FIG. 2 is a cyclic voltammogram for a reagent solution containing imidazole and sodium 9,10-phenanthrenequinone-2-sulfonate (PQSA), with the reagent solution immediately after preparation (initial) as a dotted line, and a reagent 21 hours after preparation
  • the liquid is represented by a solid line.
  • the reagent composition contains a heterocyclic compound, an electron acceptor, and an oxidoreductase.
  • the reagent composition can contain at least one compound selected from the compounds described below as the heterocyclic compound.
  • the heterocyclic compound is represented by the following formula (I).
  • the heterocyclic compound represented by the formula (I) can suppress the shift of the oxidation potential of the electron acceptor to the positive side in the presence of the oxidoreductase.
  • R 1 to R 5 each independently represents a hydrogen atom, an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, or a hydrocarbon group having 1 to 12 carbon atoms.
  • R 1 to R 5 are preferably a substituent capable of retaining the water solubility of the heterocyclic ring, and an additional group (at least one substituent selected from the group consisting of an amino group, a hydroxyl group and a carboxyl group, which will be described later). If it is a hydrocarbon that does not have it, it preferably has 1 to 4 carbon atoms, and if it is a hydrocarbon having an additional group, it preferably has 1 to 12 carbon atoms.
  • the hydrocarbon group may have at least one substituent selected from the group consisting of an amino group, a hydroxyl group, and a carboxyl group.
  • the hydrocarbon group may be either chain or cyclic.
  • the chain hydrocarbon group may be branched or linear.
  • the chain hydrocarbon group may be either a saturated hydrocarbon group or an unsaturated hydrocarbon group.
  • R 1 to R 5 is represented by a chain formula represented by C n H m- (a + b + c) (R 6 ) a (R 7 ) b (R 8 ) c It may be a hydrocarbon group.
  • n represents a natural number of 2 or less
  • m represents a natural number of n + 1 or more and 2n + 1 or less
  • a, b and c each independently represents a natural number of n or less
  • R 6 to R 8 each independently represent hydroxyl Represents a group, a carboxyl group, or an amino group.
  • m is represented by 2n + 1.
  • R 1 to R 5 are each independently a hydrogen atom, —NH 2 , —CH 3 , —CH 2 OH, —C 2 H 4 NH 2, or —CH 2 —CH (NH 2 ) —. COOH may also be used.
  • two or three of A 1 to A 5 may be nitrogen atoms and the others may be carbon atoms.
  • the heterocyclic compound may be an optionally substituted imidazole or triazole.
  • a 1 is a nitrogen atom
  • a 2 and A 5 are carbon atoms.
  • at least one group of R 1 to R 5 is preferably a substituent other than a hydrogen atom.
  • the heterocyclic compound may contain at least 3 nitrogen atoms. That is, the total number of nitrogen atoms contained in the heterocyclic ring and the substituent may be 3 or more. In this case, for example, when the number of nitrogen atoms contained in the heterocyclic ring is 2, one or more substituents are bonded to the heterocyclic ring, and the number of nitrogen atoms contained in all the substituents is The sum is 1 or more. Further, when the number of nitrogen atoms contained in the heterocycle is 3, the heterocycle may not have a substituent, or may have a substituent that may contain nitrogen. Regardless of the number of nitrogen contained in the heterocyclic ring, the heterocyclic compound may have a substituent not containing nitrogen.
  • the heterocyclic ring may be a five-membered ring, more specifically, a five-membered heterocyclic ring containing two or more, preferably two or three nitrogen atoms.
  • the five-membered heterocyclic ring may be, for example, imidazole or triazole.
  • the triazole 1,2,4-triazole is preferably used.
  • a substituent containing a nitrogen atom is a substituent containing an amino group.
  • Substituents containing amino groups include the amino group itself and hydrocarbon groups substituted with one or more amino groups.
  • the heterocyclic compound having an amino group exhibits the above-described shift suppressing effect even in a high-temperature and high-humidity environment, in addition to suppressing the shift of the oxidation potential of the electron acceptor to the positive side in the presence of oxidoreductase. .
  • the heterocyclic compound having an amino group is excellent in environmental stability.
  • heterocyclic compound represented by the formula (I) examples include imidazole, histamine, histidine, 2-amino-imidazole, 4,5-bis (hydroxymethyl) imidazole, 2-methylimidazole, 1,2- Examples include dimethylimidazole, 1,2,4-triazole, 3-amino-1,2,4-triazole, 4-amino-1,2,4-triazole and 3,5-diamino-1,2,4-triazole. It is done. These heterocyclic compounds are preferable from the viewpoint of suppressing the shift of the oxidation potential of the electron acceptor to the positive side.
  • histamine, histidine, 2-amino-imidazole, 4,5-bis (hydroxymethyl) imidazole, 2-methylimidazole, 1,2-dimethylimidazole, 1,2,4-triazole, 3-amino-1 , 2,4-triazole, 4-amino-1,2,4-triazole and 3,5-diamino-1,2,4-triazole are more preferable from the viewpoint of further excellent environmental stability.
  • Electron acceptor may be rephrased as an electron transfer substance or a mediator.
  • the electron acceptor can reversibly become an oxidant and a reductant.
  • An electron acceptor can mediate the transfer of electrons between materials, either directly or in cooperation with another electron acceptor.
  • One or more electron acceptors may be used.
  • Examples of the electron acceptor include quinone compounds, iron cyano complexes, phenazine methosulfate and derivatives thereof, methylene blue and derivatives thereof, and ferrocene and derivatives thereof.
  • iron cyano complex examples include ferricyanide complex salts.
  • ferricyanide complex salts include potassium ferricyanide.
  • the quinone compound is a compound containing quinone.
  • the quinone compounds include quinones and quinone derivatives.
  • Examples of the quinone derivative include compounds in which various functional groups (which may be referred to as substituents) are added to quinone.
  • Examples of the quinone in the quinone compound include (a) benzoquinone, (b) naphthoquinone, (c) anthraquinone, (d) phenanthrenequinone, and (e) phenanthroline quinone.
  • Specific examples of phenanthrenequinone include 9,10-phenanthrenequinone.
  • Specific examples of the structural formula of each quinone are shown below. In the following formulas, isomers are omitted, but quinones include quinone isomers represented by the following formulas.
  • One kind of quinone derivative may have two or more kinds of functional groups.
  • a hydrophilic functional group is mentioned as an example of the addition functional group (substituent) in a quinone derivative.
  • the hydrophilic functional group include a sulfo group (—SO 3 H), a carboxyl group (—COOH), and a phosphoric acid group (—PO 4 H 2 ).
  • these salts sodium salt, potassium salt, calcium salt, etc.
  • the substituent may be an optionally substituted hydrocarbon group having 1 to 16 carbon atoms.
  • the substituent added to the hydrocarbon group the above-mentioned hydrophilic functional group is preferable.
  • the hydrocarbon group include alkyl groups such as a methyl group and an ethyl group, vinyl groups, and aryl groups such as a phenyl group, a naphthyl group, a phenanthryl group, an anthryl group, and a pyrenyl group.
  • the quinone derivative may have a substituent containing a benzene ring.
  • the above-mentioned hydrophilic functional groups may be added to the benzene ring in the substituent.
  • the hydrophilic functional group may be bonded to the quinone via a benzene ring.
  • the sulfo group is 1-sulfonic acid, 2-sulfonic acid, 3-sulfonic acid, 4-sulfonic acid, and 2,7-disulfonic acid.
  • the carboxyl group may satisfy at least one item of 2-carboxylic acid, and
  • the phosphoric acid group is 2-phosphoric acid.
  • at least one of the following substituents may be added to the quinones (a) to (e) described above.
  • the “substituent” also includes the following positional isomers of substituents.
  • two or more functional groups may be added to one benzene ring, or two or more types of functional groups may be added to one benzene ring.
  • Another atom may be interposed between the above-mentioned hydrophilic functional group and the benzene ring.
  • electron acceptors include the following compounds A, B, H ', I, I', and J.
  • P-TsOH in the following scheme means p-toluenesulfonic acid.
  • Compound A can be obtained by refluxing 9,10-phenanthrenequinone in 65% nitric acid.
  • Compound B is obtained by reducing Compound A with sodium thiosulfate in the presence of sodium hydroxide.
  • Compound B becomes Compound C by replacing the amino group with iodine through diazonium chloride with sodium nitrite.
  • Compound C is converted to Compound D by substituting iodine for lithium with butyllithium and then reacting with 2-isopropoxy-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaborolane.
  • Compound H ′ is obtained by reacting compound D with sodium 4-iodobenzenesulfonate.
  • Compound I is obtained by reacting compound D with sodium 4-iodobenzoate.
  • Compound J is obtained by reacting Compound D with disodium 5-iodoisophthalate.
  • Compound I ' is obtained by a condensation reaction between Compound I and aminoethanesulfonic acid.
  • the substituent in the compound I ′ has a sulfo group, a benzene ring, and an amino carboxyl (—CONH—) between the sulfo group and the benzene ring.
  • Table 1 shows the solubility of compounds A, B, H ′, I, I ′, and J, and disodium 9,10-phenanthrenequinone-2,7-disulfonate in water.
  • the oxidation-reduction potential of each compound is as shown in Table 2.
  • the oxidation-reduction potential (E0 ′) was calculated as follows. That is, cyclic voltammetry was performed using Ag
  • the oxidation-reduction potential (E0 ′) is calculated as an average value [(Ered + Eox) / 2] of a potential value (Eox) when the oxidation current shows a peak and a potential value (Ered) when the reduction current shows a peak. It was.
  • these compounds exhibit a relatively low redox potential.
  • Such an electron acceptor exhibiting a low redox potential is preferably used for the sensor.
  • the position of the substituent in the quinone is not particularly limited.
  • at least one of positions 1, 2, 3, 4, and 7 is preferably selected as a substituent position.
  • the reagent composition is a quinone derivative, specifically, 9,10-phenanthrenequinone-2-sulfonic acid, 9,10-phenanthrenequinone-1-sulfonic acid, 9,10-phenanthrenequinone-3-sulfonic acid, 9,10-phenanthrenequinone-4-sulfonic acid, 9,10-phenanthrenequinone-2,7-disulfonic acid, 9,10-phenanthrenequinone-2-carboxylic acid, and 9,10-phenanthrenequinone-2-phosphoric acid It may contain at least one compound selected from the group consisting of
  • a manufacturing method of a quinone compound a conventional method is preferably used.
  • Quinones are conventionally used in the fields of medicine, agricultural chemicals and industry. Quinones can be produced, for example, from aromatic hydrocarbons. Specifically, anthraquinone is easily produced by oxidation of anthracene.
  • the manufacturing method of the quinone compound which has a hydrophilic functional group may also include the process of introduce
  • the volatility of a quinone compound having a hydrophilic functional group tends to be lower than that of a quinone which is a main element of the quinone compound. Therefore, when a quinone compound is added with a hydrophilic functional group, the quinone compound is advantageous in that it functions as an electron acceptor by being contained in the reagent layer 4.
  • the reagent composition may contain one or more kinds of enzymes.
  • An oxidoreductase is used as the enzyme.
  • the oxidoreductase includes an oxidase and a dehydrogenase.
  • Glucose oxidase and glucose dehydrogenase are preferred as the enzyme using glucose as a substrate;
  • the lactate substrate is preferably lactate oxidase or lactate dehydrogenase;
  • the cholesterol-based enzyme is preferably cholesterol esterase or cholesterol oxidase;
  • -Alcohol oxidase is preferred as the enzyme with alcohol as substrate; -As the enzyme using bilirubin as a substrate, bilirubin oxidase is preferable;
  • the reagent composition may contain a coenzyme that matches the enzyme.
  • the enzyme is not particularly limited with respect to its coenzyme dependency.
  • the enzyme may have NAD (nicotinamide adenine dinucleotide), NADP (nicotinamide adenine phosphate), PQQ (Pyrroquinoline quinone), or FAD (flavin uid).
  • the enzyme coenzyme is preferably FAD or PQQ.
  • the coenzyme binds to or is contained in the enzyme protein. Therefore, it is not necessary to add a coenzyme separately from the enzyme when the sensor is manufactured and measured. As a result, the sensor configuration, manufacturing process, and measurement process are simplified.
  • NAD and NADP-dependent enzymes for example, coenzymes NAD and NADP that function in a state in which they are not bound to enzyme proteins may be added separately.
  • the enzyme may be a FAD-dependent oxidase, NAD-dependent, PQQ-dependent, FAD-dependent dehydrogenase, or the like. Specific examples of the oxidase and dehydrogenase are as described above.
  • the present invention satisfies any of the following first and second requirements among these combinations.
  • the oxidoreductase and the compound of the formula (1) are not particularly limited.
  • the oxidoreductase and the electron acceptor are not particularly limited.
  • the electron acceptor is at least one selected from the group of quinone compounds consisting of naphthoquinone, anthraquinone, phenanthrenequinone, phenanthroline quinone, and quinone derivatives thereof.
  • the heterocyclic compound does not contain histidine; When two of A 1 to A 5 in formula (I) are nitrogen atoms, at least one group of R 1 to R 5 is a substituent other than a hydrogen atom.
  • the reagent composition may contain other components other than the heterocyclic compound, oxidoreductase, and electron acceptor as long as the effects of the present invention are obtained.
  • Such other components include, for example, when a reagent composition is applied to the sensor, -Increase the storage stability of enzymes or electron acceptors, -Increase the reactivity between the enzyme and the target substance, A substance exhibiting an effect of increasing the responsiveness to the target substance or increasing the linearity of the response current value with respect to the concentration of the target substance is preferably used.
  • Examples of the other components include sugar alcohol.
  • sugar alcohols include sorbitol, maltitol, xylitol, mannitol, lactitol, reduced palatinose, arabinitol, glycerol, ribitol, galactitol, sedheptitol, perseitol, boremitol, sfurtaitol, polygallitol, iditol, tallitol, allitol, icilitol, reduced.
  • Examples include saccharified starch, chain polyhydric alcohols such as isilitol, and cyclic sugar alcohols.
  • the stereoisomer of these sugar alcohol, a substituted body, and a derivative are also mentioned.
  • examples of the other component include organic acids or organic acid salts having at least one amino group or carbonyl group in the molecule.
  • organic acids and salts thereof include amino acids, substituted products thereof, derivatives thereof, and salts thereof.
  • the amino acid include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, threonine, methionine, asparagine, glutamine, arginine, lysine, phenylalanine, proline, sarcosine, betaine, and taurine.
  • amino acids and salts thereof glycine, serine, proline, threonine, lysine, and taurine are particularly preferable because of their high crystallization inhibitory effects. These compounds are preferable from the viewpoint of improving the final response.
  • the reagent composition may further contain a buffer.
  • the reagent composition may be sodium phosphate such as NaH 2 PO 4 and Na 2 HPO 4 , potassium phosphate such as KH 2 PO 4 and K 2 HPO 4 , N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfone.
  • An acid (ACES), trishydroxymethylaminomethane (tris (hydroxymethyl) aminomethane: Tris), and the like may be included.
  • the buffer includes a buffer. That is, the reagent composition may contain a buffer solution such as a sodium phosphate buffer solution, an ACES buffer solution, or a Tris buffer solution.
  • a buffer solution such as a sodium phosphate buffer solution, an ACES buffer solution, or a Tris buffer solution.
  • the reagent composition may further contain an additive such as one or both of citric acid-3Na and calcium chloride (CaCl 2 ). Citrate-3Na and calcium chloride can further improve the linearity of the sensor response current to glucose concentration when the reagent composition is used in the sensor.
  • an additive such as one or both of citric acid-3Na and calcium chloride (CaCl 2 ). Citrate-3Na and calcium chloride can further improve the linearity of the sensor response current to glucose concentration when the reagent composition is used in the sensor.
  • the reagent composition may further contain a hydrophilic polymer.
  • a hydrophilic polymer When the reagent composition contains a hydrophilic polymer, peeling of the reagent layer from the electrode surface is suppressed when the reagent composition is applied to the reagent layer of the sensor.
  • the hydrophilic polymer further has an effect of suppressing cracking of the reagent layer surface.
  • hydrophilic polymers examples include carboxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, methyl cellulose, ethyl cellulose, ethyl hydroxyethyl cellulose, carboxymethyl ethyl cellulose, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, polylysine and other polyamino acids, polystyrene sulfonic acid Gelatin and its derivatives, polymers of acrylic acid and its salts, polymers of methacrylic acid and its salts, starch and its derivatives, polymers of maleic anhydride and its salts, agarose gel and its derivatives are preferably used.
  • the reagent composition may be a liquid or a solid.
  • examples of the medium contained in the reagent composition include water (including buffer solution), alcohol (including ethanol, methanol, propanol, etc.), organic solvent (including benzene, toluene, xylene, etc.), etc. Is mentioned.
  • the liquid reagent composition may be referred to as “reagent liquid”.
  • the medium is preferably water from the viewpoint of compatibility with a biological sample.
  • the concentration of the heterocyclic compound in the reagent solution is preferably 0.001 mM or more, more preferably 0.01 mM or more, and further preferably 0.1 mM or more. Preferably, it is 1 mM or more.
  • the concentration of the heterocyclic compound in the reagent solution can be set to 10 mM or less, 5 mM or less, or 4 mM or less.
  • the molecular ratio of the electron acceptor to the heterocyclic compound is preferably 10,000: 1 to 1: 1,000, more preferably 1,000: 1 to 1: 100, More preferably, it is ⁇ 1: 10.
  • the amount of the heterocyclic compound per 1U of the enzyme is preferably 0.005 to 250 nmol, more preferably 0.1 to 40 nmol.
  • the amount of electron acceptor per 1U of enzyme is preferably 0.05 to 2,500 nmol, more preferably 1 to 400 nmol.
  • some diamine compounds suppress the positive shift of the electron acceptor oxidation potential in the presence of an oxidoreductase.
  • some of such diamine compounds can be used in place of the heterocyclic compounds.
  • the partial diamine compound include ethylenediamine, ornithine, lysine, and arginine.
  • the sensor according to the present invention is disposed so as to be in contact with at least the pair of electrodes in the sample chamber, a sample chamber formed so that a liquid sample can enter, at least a pair of electrodes disposed in the sample chamber, and the sample chamber. And a reagent layer.
  • the reagent layer is formed from the reagent composition of the present invention described above.
  • the sensor of the present invention can be configured in the same manner as a known sensor that electrochemically detects a target substance in a liquid sample, except that the reagent layer is formed of the reagent composition of the present invention.
  • the sensor of the present invention (A) providing at least a pair of electrodes on a substrate; (B) Applying the above-described reagent composition of the present invention on a substrate so as to contact both of the pair of electrodes; and (c) drying the reagent composition applied in (b).
  • the method for producing the sensor of the present invention can be carried out in the same manner as the known method for producing a sensor for electrochemically detecting a target substance in a liquid sample, except that the reagent composition of the present invention is used for forming a reagent layer. it can.
  • the above-described reagent composition of the present invention is used.
  • This reagent composition contains the heterocyclic compound described above.
  • the components in the reagent composition may temporarily become a high concentration and inactivate the enzyme.
  • enzyme deactivation due to a change in the concentration of components in the composition can be suppressed. .
  • FIG. 1 (2-1) Schematic Configuration of Sensor
  • a sensor 1 shown in FIG. 1 is an example of a sensor that detects and / or quantifies a target substance in a liquid sample.
  • the sensor 1 includes a substrate 2, a conductive layer 3, a reagent layer 4, a spacer 5, and a cover 6.
  • the substrate 2 is a plate-like member.
  • the substrate 2 has an insulating property.
  • -Resins such as polyethylene terephthalate, vinyl polymers, polyimides, polyesters, and styrenics; -Glass; and-Ceramics;
  • the dimensions of the substrate 2 are not limited to specific numerical values.
  • the width of the substrate 2 is preferably 3 to 20 mm, more preferably 5 to 10 mm.
  • the length of the substrate 2 is preferably 20 to 40 mm.
  • the thickness of the substrate 2 is preferably 0.1 to 1 mm. It is preferable that the width, length, and thickness of the substrate 2 are all within the above range.
  • the conductive layer 3 is formed on the substrate 2 with a substantially uniform thickness.
  • the conductive layer 3 includes three electrodes 31 to 33.
  • the electrode 31 may be referred to as a working electrode, the electrode 32 as a counter electrode, and the electrode 33 as a detection electrode.
  • the detection electrode 33 can be omitted.
  • the conductive layer 3 may be composed of four electrodes provided with Hct electrodes (not shown) for measuring a hematocrit value in addition to the three electrodes.
  • each of the electrodes 31 to 33 is disposed so as to face the capillary 51.
  • Other portions of the electrodes 31 to 33 are exposed at the end opposite to the introduction port 52 of the sensor 1 without being covered with the spacer 5 and the cover 6. These exposed portions function as leads. That is, these exposed portions correspond to connection portions that receive voltage application from the measuring device 101 and transmit current to the measuring device 101.
  • the conductive layer 3 can be formed by sputtering palladium on the substrate 2, and the nonconductive track can be formed by laser ablation.
  • the non-conductive track preferably has a width of 0.01 to 0.5 mm, more preferably 0.05 mm to 0.3 mm.
  • the constituent material of the conductive layer 3 should just be an electroconductive material (electroconductive substance), and is not specifically limited.
  • conductive materials include -Inorganic conductive materials such as metals, metal mixtures, alloys, metal oxides and metal compounds; Organic conductive materials such as hydrocarbon-based conductive polymers and heteroatom-containing conductive polymers; or a combination of these materials.
  • a constituent material of the conductive layer 3 palladium, gold, platinum, carbon and the like are preferable, and palladium is particularly preferable.
  • the thickness of the conductive layer 3 can be changed depending on its formation method and constituent materials.
  • the thickness of the conductive layer 3 is preferably 0.1 to 20 nm, more preferably 1 to 10 nm.
  • the thickness of the conductive layer 3 is preferably 0.1 to 50 ⁇ m, more preferably 1 to 30 ⁇ m.
  • the reagent layer 4 is arranged in contact with the electrodes 31 to 33.
  • the reagent layer 4 functions as an active part of the sensor 1 together with the electrodes 31 and 32.
  • the active portion is an electrochemically active region that reacts with a specific substance in the liquid sample and generates an electric signal.
  • the reagent layer 4 includes an enzyme and an electron acceptor.
  • the reagent layer 4 should just be arrange
  • the reagent layer 4 contains an electron acceptor, a heterocyclic compound, and an enzyme. Specifically, the reagent layer 4 may contain the reagent composition of the present invention.
  • the content of the electron acceptor in the reagent layer 4 can be set to such an amount that the sensor can function, and is preferably about 1 to 500 nmol, more preferably about 10 to 200 nmol per measurement or per sensor.
  • the content of the enzyme in the reagent layer 4 is set to such an extent that the target substance can be detected, and is preferably 0.2 to 20 U (unit), more preferably 0.2 per unit of measurement or per sensor. It is set to about 5-10U.
  • the amount of electron acceptor per 1U of enzyme and the amount of heterocyclic compound are preferably the same values as the amount of each component in the reagent composition.
  • the electron acceptor is included in the reagent layer 4, but the electron acceptor may be included in the electrode.
  • the electron acceptor contained in the electrode compounds exemplified as the electron acceptor that can be contained in the reagent composition described above are preferably used.
  • the function of the electron acceptor when the reagent layer 4 contains an enzyme that oxidizes the substrate will be described.
  • the enzyme receives electrons from the substrate by oxidizing the substrate and gives electrons to the coenzyme.
  • the coenzyme changes from an oxidant to a reductant.
  • the electron acceptor that is an oxidant receives electrons from the coenzyme that has been reduced, and returns the coenzyme to the oxidant.
  • the electron acceptor itself becomes a reductant.
  • the electron acceptor that has become a reductant gives electrons to the electrode 31 or 32, and itself becomes an oxidant. In this way, the electron acceptor mediates electron transfer between the enzyme and the electrode.
  • the coenzyme may be retained in the enzyme protein by binding to the enzyme protein (enzyme molecule).
  • the coenzyme may be present in a state separated from the enzyme protein.
  • the reagent layer 4 can be formed by various methods. Examples of the forming method include a printing method and a coating method.
  • a certain amount of the liquid reagent composition described above is dropped on the electrodes 31 and 32 using a microsyringe or the like, and then, the reagent layer 4 is left to stand in an appropriate environment and dried. Can be formed.
  • an aqueous solution may be dropped on the electrode 33 as necessary.
  • the dropping amount of the aqueous solution is not limited to a specific value, but is preferably 0.1 to 20 ⁇ L, more preferably 0.5 to 5 ⁇ L.
  • the shape of the reagent layer 4 is not limited to a specific shape. This shape may be rectangular or circular.
  • the area of the reagent layer 4 (the area in the plane direction of the substrate 2) is determined according to the characteristics and size of the device. This area may be preferably 1 to 25 mm 2 , more preferably 2 to 10 mm 2 .
  • the content of the enzyme, electron acceptor and other components contained in the applied aqueous solution is selected according to the required device characteristics and size.
  • the spacer 5 is a member for providing a gap between the cover 6 and the conductive layer 3 formed on the substrate 2.
  • the spacer 5 is a plate-like member and covers the entire conductive layer 3 except for the lead portions of the electrodes 31 to 33 and the later-described capillary 51 portion.
  • the spacer 5 is provided with a rectangular notch that exposes the end opposite to the lead portions of the electrodes 31 to 33.
  • the spacer 5 is provided with this notch so that the spacer 5, the conductive layer 3, and the cover 6 An enclosed capillary 51 is formed.
  • the spacer 5 provides the side wall of the capillary 51 and can further define the length, width, height, etc. of the capillary 51.
  • the capacity of the capillary 51 is set to about 0.05 to 5.0 ⁇ L (microliter), preferably about 0.1 to 1.0 ⁇ L (microliter).
  • the thickness of the spacer 5 is 0.02 to 0.00.
  • the thickness is about 5 mm, preferably about 0.1 to 0.2 mm.
  • the length of the notch provided in the spacer 5 is preferably 1 to 5 mm.
  • the width of the spacer 5 is about 0.25 to 4 mm, preferably about 0.5 to 2 mm. In addition, what is necessary is just to select these dimensions suitably so that the capillary 51 may become a desired capacity
  • the spacer 5 having a length of 3.4 mm and a notch having a width of 1.2 mm and having a thickness of 0.145 mm is used, the length is 3.4 mm, the width is 1.2 mm, and the height is 0.8.
  • a capillary 51 with a capacity of 145 mm and a capacity of 0.6 ⁇ L is provided.
  • the capillary 51 is an example of a sample chamber.
  • the capillary 51 sucks the liquid sample from the inlet 52 which is the opening thereof by capillary action and holds it on the electrodes 31 to 33.
  • the cover 6 is a plate-like member that covers the entire spacer 5.
  • the cover 6 includes a hole penetrating from the front surface to the back surface. This hole functions as a vent 61 communicating from the capillary 51 to the outside.
  • the vent 61 is an exhaust hole for discharging the air in the capillary 51 out of the capillary when the liquid sample is sucked into the capillary 51. By discharging the air in this way, the liquid sample is easily sucked into the capillary 51.
  • the vent 61 is preferably provided at a position away from the inlet 52, that is, at the back of the capillary 51 as viewed from the inlet 52.
  • vent 61 is disposed on the back side of the reagent layer 4 placed on the conductive layer of the sensor 1.
  • the sensor system of the present invention includes the above-described sensor of the present invention, a measurement unit that measures a current value between the at least one pair of electrodes, and a concentration of a target substance in the liquid sample based on a measurement result by the measurement unit. And a calculation unit for calculating.
  • the sensor system of the present invention can be configured in the same manner as a known sensor system that electrochemically detects a target substance in a liquid sample, except that the sensor of the present invention is used.
  • the sensor system of the present invention will be described based on an example including the sensor 1 described above.
  • the sensor 1 described above is used in the sensor system 100 shown in FIG.
  • the sensor system 100 includes a sensor 1 and a measuring device 101.
  • the measuring instrument 101 includes a display unit 102, a mounting unit 103, a switching circuit 107, a reference voltage source 108, a current / voltage conversion circuit 109, an A / D conversion circuit 110, a calculation unit 111, An operation unit 113 and a power supply unit 112 are provided.
  • the measuring instrument 101 corresponds to the aforementioned measuring unit.
  • the measuring instrument 101 further has a connector corresponding to each electrode of the sensor 1. In FIG. 3, connectors 104 to 106 provided in the mounting portion 103 are depicted.
  • the display unit 102 displays the state of the measuring instrument 101, measurement results, operation details, and the like. Specifically, the display unit 102 is realized by a liquid crystal display panel.
  • the senor 1 is detachably inserted into the mounting portion 103.
  • the connectors 104 to 106 are connected to the electrodes 31 to 33 of the sensor 1 when the sensor 1 is attached to the attachment portion 103, respectively.
  • the switching circuit 107 can connect the connectors 104 to 106 to the reference voltage source 108 or to the current / voltage conversion circuit 109.
  • the reference voltage source 108 applies a voltage to the electrodes 31 to 33 via the connectors 104 to 106.
  • the current / voltage conversion circuit 109 receives the current from the sensor 1 via the connectors 104 to 106, converts it into a voltage, and outputs it to the A / D conversion circuit 110.
  • the A / D conversion circuit 110 converts a voltage value (analog value) that is an output from the current / voltage conversion circuit 109 into a digital value.
  • the calculation unit 111 includes a recording medium such as a CPU (Central Processing Unit), a ROM (Read Only Memory), and a RAM (Random Access Memory).
  • the calculation unit 111 calculates the concentration of the target substance and controls the operation of each unit in the measuring instrument 101.
  • the calculation unit 111 corresponds to the calculation unit described above.
  • the concentration calculation function of the calculation unit 111 will be described.
  • the storage medium of the calculation unit 111 stores a conversion table used for determining the concentration of the target substance in the sample, a correction amount table used for determining the concentration correction amount, and the like.
  • the computing unit 111 calculates the temporary concentration of the target substance by referring to the conversion table based on the pulse from the A / D conversion circuit 110.
  • the calculation unit 111 further determines the final concentration of the target substance using the correction amount in the correction amount table. The density thus calculated is displayed on the display unit 102.
  • the calculation unit 111 performs switching control of the switching circuit 107, voltage control of the reference voltage source 108, measurement of time during concentration measurement and correction amount selection (timer function), and display on the display unit 102. It has data output and communication functions with external devices. Various functions of the calculation unit 111 are realized by the CPU reading and executing a program stored in a ROM (not shown) or the like.
  • the operation unit 113 is provided on the surface of the measuring instrument 101.
  • the operation unit 113 includes operation buttons used when the user refers to measurement data and setting data.
  • the power supply unit 112 includes a battery that supplies power to each of the electric circuits, the display unit, the calculation unit, and the like.
  • the sensor system of the present invention can be suitably used for a target substance concentration measurement method.
  • the concentration measurement method includes (a) bringing a reagent composition containing at least an electron acceptor and an enzyme into contact with a liquid sample, (b) detecting the current generated by (a), and ( c) measuring the concentration of the target substance in the liquid sample based on the detection result of (b) above.
  • the reagent composition of the present invention described above is used for the reagent composition.
  • the concentration measurement method of the present invention since the reagent composition described above is used as the material for the reagent layer, a reagent layer that does not cause enzyme deactivation due to moisture absorption of the reagent layer described above is used. Therefore, the concentration measurement method of the present invention can measure the concentration of the target substance with higher measurement accuracy.
  • the connectors 104 to 106 are connected to the electrodes 31 to 33, respectively. Further, when the sensor 1 is mounted on the mounting unit 103, a switch (not shown) in the mounting unit 103 is pressed. When pressed, the switch is turned on, and the calculation unit 111 determines that the sensor 1 is mounted, and puts the measuring instrument 101 in a sample standby state. In the sample standby state, the reference voltage source 108 starts to apply a voltage between the working electrode 31 and the detection electrode 33 via the connectors 104 and 106 under the control of the calculation unit 111, and the current / voltage conversion circuit 109. Is after the current measurement is started, and the liquid sample has not yet been subjected to the measurement.
  • the liquid sample is drawn from the introduction port 52 into the capillary 51 by capillary action.
  • a liquid sample derived from a living body such as blood, sweat or urine
  • a liquid sample derived from the environment a liquid sample derived from food, or the like
  • the sensor 1 punctures his / her finger, palm, arm, etc., squeezes a small amount of blood, and uses this blood as a liquid sample for measurement by the sensor 1. .
  • the current value received by the computing unit 111 via the current / voltage conversion circuit 109 changes. From this change, the calculation unit 111 determines that the liquid sample has been correctly sucked into the sensor 1. Thus, measurement is started when the suction of the liquid sample is detected.
  • the liquid sample In the sensor 1, components such as enzymes and electron acceptors in the reagent layer 4 are dissolved in the liquid sample. In this way, the liquid sample, the enzyme, and the electron acceptor come into contact with each other on the electrodes 31 and 32 of the sensor 1.
  • the control circuit 111 controls the switching circuit 107 to connect the connector 104 and the connector 105 to the reference voltage source 108 and the current / voltage conversion circuit 109.
  • a voltage is applied between the working electrode 31 and the counter electrode 32, and the current generated between the working electrode 31 and the counter electrode 32 is transmitted to the current / voltage conversion circuit 109.
  • the current flowing into the current / voltage conversion circuit 109 is converted into voltage. This voltage is further converted into a digital value by the A / D conversion circuit 110.
  • the calculation unit 111 calculates the concentration of the specific component from this digital value. The value calculated by the calculation unit 111 is displayed on the display unit 102. At that time, other information to the user can be displayed together.
  • the user can remove the sensor 1 from the mounting portion 103.
  • the reference voltage source 108 can apply a voltage sufficient to cause a target electrochemical reaction between the two electrodes 31 and 32. This voltage is mainly set according to the chemical reaction and electrode used.
  • the sensor system 100 in the case of targeting a liquid sample such as blood, in the sensor system 100, (I) dissolving the electron acceptor and an enzyme that donates electrons to the electron acceptor using the target substance as a substrate in the liquid sample; (Ii) detecting a current generated in the solution obtained by (i), and (iii) measuring the concentration of the target substance based on the detection result of (ii). The method is executed.
  • the quinone compound having a hydrophilic functional group is particularly preferably used when the reagent composition is applied to a sensor whose detection target is a sample (for example, blood) using water as a medium.
  • a sample for example, blood
  • the electron acceptor is a quinone compound having a hydrophilic functional group
  • the chance of collision between the electron acceptor molecule and the enzyme molecule in the sample is increased.
  • the reaction rate increases, the amount of current derived from the target substance increases, and the time required for measurement can be shortened.
  • the electron acceptor is a quinone compound having a hydrophilic functional group
  • the electron acceptor is simply arranged on the electrode by dropping and drying a solution containing the electron acceptor on the electrode. be able to.
  • the electron acceptor is preferably disposed so as to be in contact with at least a part of the pair of electrodes constituting the sensor, that is, at least a part of the first electrode and at least a part of the second electrode.
  • the first electrode and the second electrode correspond to a working electrode and a counter electrode.
  • quinone to which a hydrophilic functional group is not added is preferably contained in the electrode. That is, the electrode is preferably formed from a mixture of a quinone and a conductive material.
  • a method of immobilizing an electron acceptor molecule in or on a working electrode by blending a filler component or a binder component is known.
  • an interfering substance that interferes with the accurate detection of the target substance by the sensor 1 may be contained in the sample.
  • Interfering substances are sometimes referred to as interfering substances. Examples of interfering substances include ascorbic acid, uric acid, and acetaminophen.
  • the measurement target is a non-biological sample (a sample other than a biological sample such as blood and urine)
  • the interfering substance is an easily oxidizable substance contained in the non-biological sample.
  • the interfering substance affects the measurement result of the sensor. As a result, an error occurs in the measurement result.
  • the potential of the electrode necessary for oxidizing the electron acceptor is significantly higher than the potential of the electrode necessary for oxidizing ascorbic acid or the like contained in the blood (positive) ) Introduces an error.
  • the electrode potential required to oxidize the electron acceptor depends on the redox potential of the electron acceptor itself. Therefore, it is preferable that the redox potential of the electron acceptor is more negative in terms of reducing the influence of interfering substances. Even if the influence of the interfering substance is more positive than the oxidation potential of the interfering substance, it can be reduced by using an electron acceptor having an oxidation-reduction potential as close as possible to the oxidation potential. In order to further reduce the influence, it is preferable to use an electron acceptor having a redox potential that is more negative than the oxidation potential of the interfering substance.
  • the redox potential of the electron acceptor is preferably more positive than that of the coenzyme.
  • the electron acceptor can easily accept electrons from the coenzyme.
  • the redox potential of the electron acceptor is preferably more negative than that of the coenzyme. This allows the electron acceptor to easily donate electrons to the coenzyme.
  • the relationship between the potentials of the coenzyme, electron acceptor, and interfering substance (reducible substance) is opposite to that when the target substance is detected by oxidation. .
  • the specific redox potential of the coenzyme is as follows.
  • the coenzymes FAD and PQQ typically function in cooperation with the enzyme protein while bound to the enzyme protein.
  • the redox potentials of these coenzymes are about -300 and about -200 mV, respectively.
  • NAD functions without binding to an enzyme protein.
  • the redox potential of NAD is about -520 mV.
  • the electron accepting ability of the electron acceptor tends to increase as the redox potential of the electron acceptor is more positive than that of the coenzyme. That is, the greater the difference between the redox potential of the electron acceptor and that of the coenzyme, the greater the difference in energy level. Therefore, the electron accepting speed of the electron acceptor is increased. Therefore, it is preferable that the redox potential of the electron acceptor is high on the positive side in terms of increasing the sensitivity and speed of measurement of the sensor.
  • the positive side of the redox potential of the electron acceptor is related to the redox potential of the interfering substance, and the negative side is related to the electron accepting ability. It is limited by the redox potential of the coenzyme. This range may be very narrowly limited.
  • Patent Document 2 discloses a sensor having an NAD-dependent enzyme and having a phenanthroline quinone that is a heterocyclic compound containing a nitrogen atom as an electron acceptor.
  • the redox potential of phenanthroline quinone is about 0 mV and that of NAD is about -520 mV. That is, in the sensor of this document, there is a potential difference of about 520 mV between the electron acceptor and the coenzyme. Since the oxidation potential of ascorbic acid is about ⁇ 140 mV, when the electron acceptor is phenanthroline quinone, the influence of interfering substances cannot be completely avoided for the above reason.
  • a sensor having a PQQ-dependent or FAD-dependent enzyme has an advantage that it can be manufactured at a low manufacturing cost.
  • PQQ and FAD have a higher redox potential than NAD, it is not easy to search for an electron acceptor having a low potential applicable to PQQ-dependent and FAD-dependent enzymes.
  • an electron acceptor having a low redox potential that can be applied to PQQ-dependent and FAD-dependent enzymes in order to reduce the influence of interfering substances and to suppress production costs.
  • the coenzyme is FAD or PQQ
  • the above range is particularly narrow because their potential is more positive.
  • electron acceptors are 9,10-phenanthrenequinone, 9,10-phenanthrenequinone-2-sulfonic acid, 1,2-naphthoquinone-4-sulfonic acid, and 2,5-dimethyl-1,4-benzoquinone.
  • the oxidation-reduction potential is ⁇ 180 mV, ⁇ 140 mV, ⁇ 16 mV, and ⁇ 5 mV, respectively. These redox potentials are more negative than 0 mV, more positive than the potential of NAD, and more positive than the potentials of FAD and PQQ.
  • the oxidation-reduction potentials of 9,10-phenanthrenequinone and 9,10-phenanthrenequinone-2-sulfonic acid are more negative than the oxidation potential of ascorbic acid (about ⁇ 140 mV). That is, these electron acceptors are applicable to sensors having PQQ-dependent or FAD-dependent enzymes. Moreover, these electron acceptors can also reduce the influence of interfering substances on detection results.
  • the electron accepting ability from the coenzyme is not determined only by the potential relationship.
  • the electron accepting ability of quinone compounds affects, for example, the relationship between the charge of the quinone compound and the charge near the active site of the enzyme and the relationship between the molecular size of the quinone compound and the size of the active site space of the enzyme. receive.
  • the electron acceptor is preferably 9,10-phenanthrenequinone (including derivatives thereof).
  • 9,10-phenanthrenequinone does not have an aromatic ring linked in a horizontal row like anthraquinone, and has a compact molecular size. Therefore, 9,10-phenanthrenequinone is presumed to easily enter the active site space of the enzyme.
  • 9,10-phenanthrenequinone since 9,10-phenanthrenequinone has no charge, it is expected to be hardly affected by the charge of the active site of the enzyme.
  • PQSA showed a high solubility of 80 mM in water.
  • Reagent Composition (Reagent Solution) Reagent solutions A and B having the following composition were prepared.
  • composition is the same as composition A except that it does not contain imidazole.
  • sensor electrode for measuring the characteristics of the reagent solutions A and B was produced. This electrode has the same configuration as that shown in FIG. 1 except that the reagent layer 4 is not included. Details are as follows.
  • a conductive layer 3 having a thickness of 8 nm was formed by sputtering palladium on a substrate 2 containing polyethylene terephthalate having a length of 30 mm, a width of 7 mm, and a thickness of 0.2 mm as a main component. Thereafter, non-conductive tracks having a width of 0.1 mm were formed by laser ablation to form the electrodes 31 and 32.
  • the electrode 31 corresponds to a working electrode
  • the electrode 32 corresponds to a counter electrode.
  • a spacer 5 (thickness 0.145 mm) having a notch having a length of 3.4 mm and a width of 1.2 mm and a cover 6 are sequentially pasted on a substrate on which an electrode is formed, so that 0.6 ⁇ L is obtained.
  • a sensor electrode including a capillary 51 having a capacity was produced.
  • the potential applied to the working electrode was scanned linearly with respect to time.
  • the sweep rate was set to 0.1 V / sec.
  • a first potential was applied to the working electrode, and the electrode potential was swept to the negative side from the potential to a more negative second potential.
  • sweeping was performed to turn the electrode potential back to the positive side from the second potential to the first potential.
  • the first potential and the second potential were 0.2V and 0.5V.
  • the relationship between the oxidation potential and the oxidation current when the reagent solution A immediately after preparation (initial) is swept to the positive side by the above cyclic voltammetry is shown by a dotted line in FIG.
  • the results for the reagent solution A) stored for 21 hours at a humidity (RH) of 5% are shown by a solid line in FIG.
  • the results obtained by cyclic voltammetry for the reagent solution B immediately after preparation are shown by a dotted line in FIG. 5 and are stored for 21 hours at 21 hours after the reagent solution B (25 ° C., humidity (RH) 5%).
  • the results for the reagent solution B) are shown by a solid line in FIG.
  • a conductive layer 3 having a thickness of 8 nm was formed by sputtering palladium on a substrate 2 containing polyethylene terephthalate having a length of 30 mm, a width of 7 mm, and a thickness of 0.2 mm as a main component.
  • electrodes 31 to 33 were formed by forming non-conductive tracks having a width of 0.1 mm by laser ablation.
  • the electrode 31 was designed to function as a working electrode, the electrode 32 as a counter electrode, and the electrode 33 as a detection electrode.
  • Reagent liquids C and D having the following composition were prepared.
  • composition is the same as composition C except that it does not contain imidazole.
  • the reagent layer 4 was formed by applying 1.2 ⁇ L of each reagent solution in a circular shape with a diameter of 2.2 mm using a microsyringe. After the reagent layer 4 is formed, a spacer 5 (thickness 0.145 mm) having a notch having a length of 3.4 mm and a width of 1.2 mm, and a cover 6 are sequentially attached to the substrate on which the electrodes are formed. Thus, a sensor including a capillary having a capacity of 0.6 ⁇ L was produced.
  • reagent solutions C and D Two types of sensors were prepared: a reagent solution immediately after preparation, and a reagent solution that had been used for 21 hours in an environment of 25 ° C. and 5% humidity after preparation.
  • FIG. 6 shows the divergence of the response current value of the sensor manufactured using the reagent solution C after 21 hours from the response current value of the sensor manufactured using the reagent solution C immediately after preparation.
  • FIG. 7 shows the divergence degree of the response current value of the sensor manufactured using the reagent solution D after 21 hours from the response current value of the sensor manufactured using the reagent solution D immediately after preparation. The degree of divergence is based on the response current value of the sensor prepared using the reagent solution immediately after preparation (that is, 0%), and the response current value of the sensor manufactured using the reagent solution after 21 hours. The rate of change (%).
  • reagent solutions were prepared by adding diamine compounds (ethylenediamine, butanediamine, pentanediamine, hexanediamine, ethyleneamine, ornithine, lysine, arginine) in place of the heterocyclic compounds.
  • diamine compounds ethylenediamine, butanediamine, pentanediamine, hexanediamine, ethyleneamine, ornithine, lysine, arginine
  • Fig. 8 shows the fluctuation rate of the response current value before and after storage.
  • the response current value of the sensor produced using the reagent solution immediately after preparation is 0%
  • the change rate of the response current value of the sensor due to storage is shown as the variation rate.
  • the effect of improving the stability of the reagent solution was observed by adding the heterocyclic compound over the entire concentration range (0.01 to 6 mM) examined. In particular, a remarkable effect was observed at 1 to 6 mM.
  • a sensor was prepared using a reagent solution having the same composition and immediately after preparation. The sensor was subjected to an exposure experiment under the conditions of 30 ° C., 80% humidity and 24 hours. Measure the response current value for a glucose solution of a predetermined concentration using an unexposed sensor (ie, a sensor that has been stored for 24 hours under normal conditions (25 ° C., 5% humidity)) and an exposed sensor. did.
  • Figure 9 shows the fluctuation rate of the response current value before and after exposure.
  • the response current value of the sensor not exposed is set to 0%, and the change rate of the response current value due to exposure is shown as the variation rate.
  • the effect of suppressing the decrease in response current value due to exposure was observed particularly at 0.1 to 6 mM.
  • ⁇ Reagent liquid F> The composition is the same as that of the reagent solution E except that 2,6-dimethylbenzoquinone is used as the electron acceptor.
  • ⁇ Reagent liquid G> The set is the same as that of the reagent solution E, except that potassium ferricyanide is used as the electron acceptor.
  • the reagent composition containing the oxidoreductase and the electron acceptor further contains a heterocyclic compound, thereby suppressing a change in current value before and after the storage period.
  • This reagent composition is preferably applied to the reagent layer of the sensor. Therefore, a more accurate detection result can be obtained in the electrochemical detection of the target substance.
  • the present invention is expected to contribute to further development in the field of electrochemical detection of target substances.

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Abstract

　本発明は、より高い保存安定性を有する試薬組成物及びそれを備えるセンサ等を提供する。本発明によれば、特定の複素環式化合物を試薬組成物に添加することで、試薬組成物の保存安定性が向上し、センサに適用したときの電流値の変動率を低く抑えることができる。

Description

試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法
　本発明は、試薬組成物、センサ、センサシステム及びセンサの製造方法に関する。
　従来、液体試料中の標的物質を検出するセンサが提案されている。センサの一例である血糖センサにおいては、液体試料は血液であり、標的物質はグルコースである。
　血糖センサのうち、特に多く提案されているのは、電気化学式の血糖センサである。電気化学式の血糖センサは、酵素及び電子受容体を備える。この酵素は、血液中のグルコースと特異的に反応（酵素－基質反応）することでグルコースを酸化する。電子受容体は、酸化によって発生した電子を受容することで、酸化体から還元体になる。還元体となった電子受容体は、例えば電極で電気化学的に酸化される。この酸化によって得られる電流の大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。
　一般的なセンサの製造では、酵素及び電子受容体は、試薬液中に溶解した状態で基板上に塗布される。試薬液が乾燥することで、試薬層が形成される。形成された試薬層が液体試料中に溶解することで、酵素－基質反応が進行する。
　このような試薬組成物として、グルコースデヒドロゲナーゼ等の酸化還元酵素、キノン類化合物等の電子受容体、及び添加剤としてのヒスチジンやイミダゾールを含有する試薬組成物が知られている（例えば、特許文献１、２、４参照。）。また、試薬組成物としては、ＰＱＱ（ピロロキノリンキノン）依存性のグルコースデヒドロゲナーゼ等の酸化還元酵素、及びピリジルイミダゾール配位子を有する遷移金属錯体を含有する試薬組成物が知られている（例えば、特許文献３参照。）。また、キノン化合物とイミダゾールとを含有する溶液において、キノン化合物の電位が特定のｐＨで負側にシフトすることが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
特開２０００－１７１４２８号公報 特開２００１－３４３３５０号公報 特表２００６－５０９８３７号公報 特開２００９－２４７２８９号公報
Bioelectrochemistry, 64, (2004), p.7 - 13
　発明者らは、試薬液又は試薬層が保存期間を経る前と後とでは、電圧を印加したときの電流値が変化し得ることを見出した。このような電流値の変化は、センサによる測定精度を低下させる。つまり、従来の試薬液及び試薬層は、保存安定性に改善の余地がある。
　本発明は、この問題点に鑑みて、保存期間の前後での電流値の変化が抑制される新たな試薬組成物、並びにそれを備えるセンサ及びセンサシステムを提供することを目的とする。
　上記の目的を達成するための手段として、本発明は以下の構成を有する。
［１］　酸化還元酵素と、電子受容体と、下記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物と、を含有し、下記第一の要件又は第二の要件を満足する、試薬組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
　式（Ｉ）中、Ｒ１～Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基又は炭素数１～１２の炭化水素基を表し、前記炭化水素基は、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、Ａ１～Ａ５のうちの２個又は３個が窒素原子であって、他は炭素原子であり、Ａ１～Ａ５のうちの２個が窒素原子であるときは、Ａ１が窒素原子であり、Ａ２及びＡ５が炭素原子である。
（第一の要件）
　［１］の試薬組成物において、前記電子受容体が、ナフトキノン、アントラキノン、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノン並びにこれらのキノン誘導体からなるキノン類化合物の群から選択される一以上である。
（第二の要件）
　［１］の試薬組成物において、前記複素環式化合物がヒスチジンを含まず、式（Ｉ）中のＡ１～Ａ５のうちの２個が窒素原子であるときは、Ｒ１～Ｒ５のうち、少なくとも１個の基が水素原子以外の置換基である。
［２］　前記複素環式化合物が窒素原子を３個以上有する、［１］に記載の試薬組成物。
［３］　前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１～Ｒ５の少なくとも１つの基が、ＣｎＨｍ－（ａ＋ｂ＋ｃ）（Ｒ６）ａ（Ｒ７）ｂ（Ｒ８）ｃで表される鎖式炭化水素基であり、ｎは２以下の自然数を表し、
　ｍはｎ＋１以上２ｎ＋１以下の自然数を表し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立してｎ以下の自然数を表し、Ｒ６～Ｒ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基を表す、［１］又は［２］に記載の試薬組成物。
［４］　前記複素環式化合物は、アミノ基を含有する置換基を有する、［１］～［３］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［５］　前記複素環式化合物の五員複素環がトリアゾールである、［１］～［４］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［６］　前記複素環式化合物として、イミダゾール、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノ－イミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、２－メチルイミダゾール、１，２－ジメチルイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール及び３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾールからなる群より選択される少なくとも一種の化合物（ただし第二の要件を満たす場合では、イミダゾール及びヒスチジンを除く）を含有する、［１］～［５］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［７］　前記複素環式化合物として、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノ－イミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、２－メチルイミダゾール、１，２－ジメチルイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール及び３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾールから成る群より選択される少なくとも一種の化合物（ただし第二の要件を満たす場合では、ヒスチジンを除く）を含有する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［８］　前記第二の要件を満足する場合において、前記電子受容体として鉄シアノ錯体を含有する、［１］～［７］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［９］　前記第二の要件を満足する場合において、前記電子受容体としてキノン類化合物を含有する［１］～［８］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［１０］　前記キノン類化合物として、フェナントレンキノン及びフェナントレンキノンの誘導体の一方又は両方を含有する、［１］～［９］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［１１］　前記キノン類化合物として、９，１０－フェナントレンキノン及び９，１０－フェナントレンキノンの誘導体の一方又は両方を含有する、［１０］に記載の試薬組成物。
［１２］　前記キノン類化合物は、親水性官能基を有する、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［１３］　前記キノン類化合物は、キノンと置換基とを有し、前記置換基は、置換されていてもよいベンゼン環と、前記ベンゼン環に付加された前記親水性官能基とを有する、［１２］に記載の試薬組成物。
［１４］　前記キノン類化合物は、前記親水性官能基として、スルホ基、カルボキシル基、及びリン酸基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を有する、［１２］又は［１３］に記載の試薬組成物。
［１５］　前記キノン類化合物は、下記（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）前記スルホ基は、１－スルホン酸、２－スルホン酸、３－スルホン酸、４－スルホン酸、及び２，７－ジスルホン酸である、
　（ｂ）前記カルボキシル基は、２－カルボン酸である、及び
　（ｃ）前記リン酸基は、２－リン酸である、の少なくとも一項目を満たす［１４］に記載の試薬組成物。
［１６］　前記酸化還元酵素として、グルコース脱水素酵素を含有する、［１］～［１５］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［１７］　前記酸化還元酵素に合う補酵素をさらに含有する、［１６］に記載の試薬組成物。
［１８］　前記酸化還元酵素は、ＰＱＱ依存性酵素又はＦＡＤ依存性を有する、［１６］又は［１７］に記載の試薬組成物。
［１９］　媒体として水を含有する液体をさらに含有する、［１］～［１８］のいずれか一項に記載の試薬組成物。
［２０］　液体試料が入るように形成された試料室と、
　前記試料室内に配置された少なくとも一対の電極と、
　前記試料室内において、少なくとも前記一対の電極の両方に接するように配置された［１］～［１９］のいずれか一項に記載の試薬組成物から形成される試薬層と、を有するセンサ。
［２１］　［２０］に記載のセンサと、
　前記少なくとも一対の電極間の電流値を測定する測定部と、
　前記測定部による測定結果に基づいて、前記液体試料中の対象物質の濃度を算出する算出部と、を有するセンサシステム。
［２２］　下記（ａ）～（ｃ）：
　（ａ）基板上に、少なくとも一対の電極を設けること、
　（ｂ）基板上に、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の試薬組成物を、前記一対の電極の両方に接触するように塗布すること、及び
　（ｃ）前記（ｂ）で塗布された試薬組成物を乾燥させること、を含むセンサの製造方法。
［２３］　（ａ）少なくとも電子受容体及び酵素を含む試薬組成物と、液体試料と、を接触させること、
　（ｂ）上記（ａ）によって生じた電流を検出すること、及び
　（ｃ）上記（ｂ）の検出結果に基づいて、液体試料中の標的物質の濃度を測定すること、を含み、
　前記試薬組成物に、［１］～［１９］のいずれか一項に記載の試薬組成物を用いる、標的物質の濃度測定方法。
　本発明の試薬組成物においては、複素環式化合物により、保存期間の前後での電流値の変化が抑制される。この試薬組成物は、センサの試薬層に好ましく適用される。
センサの概略構成を示す分解斜視図。 センサシステムの概略構成を示す斜視図。 センサシステムの概略構成を示すブロック図。 イミダゾール及び９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ）を含有する試薬液についてのサイクリックボルタモグラムであり、調製直後（初期）の試薬液については点線で、調製から２１時間後の試薬液については実線で表す。 イミダゾールを含まずＰＱＳＡを含有する試薬液についてのサイクリックボルタモグラムであり、調製直後（初期）の試薬液については点線で、調製から２１時間後の試薬液については実線で表す。 イミダゾールを含有する調製直後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値（初期）からの、同組成を有し調製から２１時間保存された後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値の乖離度を示すグラフ。 イミダゾールを含まない調製直後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値（初期）からの、同組成を有し調製から２１時間保存された後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値の乖離度を示すグラフ。 調製直後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値に対する、２５℃、湿度５％で２４時間保存した試薬液で作製されたセンサの応答電流値の変化率を示すグラフである（添加剤：３－アミノ－１，２，４－トリアゾール）。 ２５℃、湿度５％で２４時間保存したセンサの応答電流値に対する、３０℃、湿度８０％の環境に２４時間暴露させたセンサの応答電流値の変化率を示すグラフである（添加剤：３－アミノ－１，２，４－トリアゾール）。 ３－アミノ－１，２，４－トリアゾール存在下及び非存在下でのＰＱＳＡのサイクリックボルタモグラム。 ３－アミノ－１，２，４－トリアゾール存在下及び非存在下での２，６－ジメチルベンゾキノンのサイクリックボルタモグラム。 ３－アミノ－１，２，４－トリアゾール存在下及び非存在下でのフェリシアン化カリウムのサイクリックボルタモグラム。
　＜１．試薬組成物＞
　試薬組成物は、複素環式化合物と、電子受容体と、酸化還元酵素と、を含有する。
　（１－１）複素環式化合物
　試薬組成物は、複素環式化合物として、以下に説明される化合物から選択される少なくとも一種の化合物を含有することができる。複素環式化合物は、下記式（Ｉ）で表される。式（Ｉ）で表される複素環式化合物は、酸化還元酵素の存在下における電子受容体の酸化電位の正側へのシフトを抑制することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
　式（Ｉ）中、Ｒ１～Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基又は炭素数１～１２の炭化水素基を表す。Ｒ１～Ｒ５は、複素環の水溶性を保持できる置換基であることが好ましく、付加基（後述のアミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基）を有しない炭化水素であれば炭素数１～４であることが好ましく、付加基を有する炭化水素であれば炭素数１～１２であることが好ましい。
　また式（Ｉ）中、前記炭化水素基は、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよい。
　炭化水素基は、鎖式、環式のいずれであってもよい。鎖式炭化水素基は、分岐していても、直鎖であってもよい。鎖式炭化水素基は、飽和炭化水素基、不飽和炭化水素基のいずれであってもよい。
　例えば、一般式（Ｉ）において、Ｒ１～Ｒ５の少なくとも１つの基が、ＣｎＨｍ－（ａ＋ｂ＋ｃ）（Ｒ６）ａ（Ｒ７）ｂ（Ｒ８）ｃで表される鎖式炭化水素基であってもよい。ｎは２以下の自然数を表し、ｍはｎ＋１以上２ｎ＋１以下の自然数を表し、ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立してｎ以下の自然数を表し、Ｒ６～Ｒ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基を表す。飽和炭化水素基においては、ｍは２ｎ＋１で表される。
　具体例として、Ｒ１～Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子、－ＮＨ２、－ＣＨ３、－ＣＨ２ＯＨ、－Ｃ２Ｈ４ＮＨ２及び－ＣＨ２－ＣＨ（ＮＨ２）－ＣＯＯＨであってもよい。
　また式（Ｉ）中、Ａ１～Ａ５のうちの２個又は３個が窒素原子であって、他は炭素原子であってもよい。具体的には、複素環式化合物は、置換されていてもよいイミダゾール又はトリアゾールであってもよい。Ａ１～Ａ５のうちの２個が窒素原子であるときは、Ａ１が窒素原子であり、Ａ２及びＡ５が炭素原子である。Ａ１～Ａ５のうちの２個が窒素原子であるときは、Ｒ１～Ｒ５のうち、少なくとも１個の基が水素原子以外の置換基であることが好ましい。
　前記複素環式化合物は、少なくとも３個の窒素原子を含有してもよい。つまり、複素環及び置換基に含まれる窒素原子の数の合計は、３個以上であってもよい。この場合、例えば、複素環中含まれる窒素原子の数が２であるときは、その複素環には１個以上の置換基が結合しており、全ての置換基に含まれる窒素原子の数の合計は１以上である。また、複素環中に含まれる窒素原子の数が３であるときは、その複素環は置換基を有していなくてもよいし、窒素を含んでいてもよい置換基を有することもできる。複素環に含まれる窒素の数に関わらず、複素環式化合物は、窒素を含まない置換基を有していてもよい。
　また、複素環は五員環であってもよく、より具体的には２個以上、好ましくは２個又は３個の窒素原子を含有する五員複素環であってもよい。五員複素環は、例えば、イミダゾール、トリアゾールであってもよい。トリアゾールとしては、１，２，４－トリアゾールが好ましく用いられる。
　窒素原子を含む置換基の一例として、アミノ基を含有する置換基が挙げられる。アミノ基を含有する置換基は、アミノ基自体、及び１個以上のアミノ基で置換された炭化水素基を包含する。アミノ基を有する前記複素環式化合物は、酸化還元酵素の存在下における電子受容体の酸化電位の正側へのシフトの抑制に加えて、高温高湿環境下においても上記のシフト抑制効果を奏する。このように、アミノ基を有する前記複素環式化合物は、環境安定性にも優れている。
　式（Ｉ）で表される前記複素環式化合物としては、例えば、イミダゾール、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノ－イミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、２－メチルイミダゾール、１，２－ジメチルイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール及び３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾールが挙げられる。これらの複素環式化合物は、電子受容体の酸化電位の正側へのシフトを抑制する観点から好ましい。
　これらの中でも、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノ－イミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、２－メチルイミダゾール、１，２－ジメチルイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール及び３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾールは、さらに環境安定性にも優れている観点からより好ましい。
　（１－２）電子受容体
　電子受容体は、電子伝達物質またはメディエータと言い換えられてもよい。電子受容体は、可逆的に酸化体及び還元体となることができる。電子受容体は、直接、または別の電子受容体と協働して、物質間における電子の移動を媒介することができる。電子受容体は一種でも二種以上でもよい。
　前記電子受容体としては、例えばキノン類化合物、鉄シアノ錯体、フェナジンメトサルフェート及びその誘導体、メチレンブルー及びその誘導体、及び、フェロセン及びその誘導体、が挙げられる。
　前記鉄シアノ錯体としては、例えばフェリシアン化錯塩が挙げられる。フェリシアン化錯塩としては、例えばフェリシアン化カリウムが挙げられる。
　キノン類化合物とは、キノンを含有する化合物である。キノン類化合物には、キノン及びキノン誘導体が含まれる。キノン誘導体としては、キノンに種々の官能基（置換基と言い換えてもよい）が付加された化合物が挙げられる。
　キノン類化合物におけるキノンとしては、（ａ）ベンゾキノン、（ｂ）ナフトキノン、（ｃ）アントラキノン、（ｄ）フェナントレンキノン、及び（ｅ）フェナントロリンキノン等が挙げられる。フェナントレンキノンとして、特に具体的には、９，１０－フェナントレンキノンが挙げられる。各キノンの構造式の具体例を、以下に示す。なお、下記式では異性体の表示を省略しているが、キノンには、下記式に示されるキノンの異性体も包含される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
　一種のキノン誘導体が、２種類以上の官能基を有していてもよい。
　また、キノン誘導体における付加官能基（置換基）の一例として、親水性官能基が挙げられる。親水性官能基としては、スルホ基（－ＳＯ３Ｈ）、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）、リン酸基（－ＰＯ４Ｈ２）等が挙げられる。なお、スルホ基、カルボキシル基、及びリン酸基には、これらの塩（ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等）も含まれる。
　なお、置換基は、置換されていてもよい炭素数１～１６の炭化水素基であってもよい。炭化水素基に付加される置換基としては、上述の親水性官能基が好適である。また、炭化水素基としては、メチル基、エチル基等のアルキル基、ビニル基、及びフェニル基、ナフチル基、フェナントリル基、アントリル基、ピレニル基等のアリール基などがある。
　キノン誘導体は、ベンゼン環を含む置換基を有していてもよい。上述の親水性官能基（塩を含む）は、置換基中のベンゼン環に付加されていてもよい。言い換えると、親水性官能基は、ベンゼン環を介してキノンに結合していてもよい。
　例えば、前記キノン類化合物は、（ａ）前記スルホ基は、１－スルホン酸、２－スルホン酸、３－スルホン酸、４－スルホン酸、及び２，７－ジスルホン酸である、（ｂ）前記カルボキシル基は、２－カルボン酸である、及び（ｃ）前記リン酸基は、２－リン酸である、の少なくとも一項目を満たしてもよい。例えば、上述のキノン（ａ）～（ｅ）に、下記の置換基の少なくとも１つが付加されていてもよい。なお、“置換基”には、以下に示す置換基の位置異性体も包含される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
　置換基において、１つのベンゼン環に２つ以上の官能基が付加されていてもよいし、１つのベンゼン環に２種類以上の官能基が付加されていてもよい。
　さらに、上述の親水性官能基とベンゼン環との間に、他の原子が介在していてもよい。そのような電子受容体の例として、下記化合物Ａ、Ｂ、Ｈ’、Ｉ、Ｉ’、及びＪが挙げられる。下記のスキームには、各化合物の合成スキームが示されている。下記スキーム中のｐ－ＴｓＯＨは、ｐ－トルエンスルホン酸を意味する。
　化合物Ａは、９，１０－フェナントレンキノンを６５％硝酸中で還流することによって得られる。化合物Ｂは、水酸化ナトリウム存在化においてチオ硫酸ナトリウムで化合物Ａを還元することによって得られる。化合物Ｂは、亜硝酸ナトリウムによるジアゾニウム塩化を経てアミノ基をヨウ素へ置換することにより化合物Ｃとなる。化合物Ｃは、ブチルリチウムによってヨウ素をリチウムへ置換した後に２－イソプロポキシ－４，４，５，５－テトラメチル－１，３，２－ジオキサボロランと反応させることによって化合物Ｄとなる。化合物Ｈ’は、化合物Ｄに４－ヨードベンゼンスルホン酸ナトリウムを反応させて得られる。化合物Ｉは、化合物Ｄに４－ヨード安息香酸ナトリウムを反応させて得られる。化合物Ｊは、化合物Ｄに５－ヨードイソフタル酸ジナトリウムを反応させて得られる。化合物Ｉ’は、化合物Ｉとアミノエタンスルホン酸との縮合反応によって得られる。化合物Ｉ’における置換基は、スルホ基と、ベンゼン環と、スルホ基とベンゼン環との間のアミノカルボキシル（－ＣＯＮＨ－）と、を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
　化合物Ａ、Ｂ、Ｈ’、Ｉ、Ｉ’、及びＪ、並びに９，１０－フェナントレンキノン－２，７－ジスルホン酸ジナトリウムの水への溶解度を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　各化合物の酸化還元電位は、表２に示す通りである。酸化還元電位（Ｅ０’）は、次のように算出された。すなわち、後述の実施例と同条件で、Ａｇ｜ＡｇＣｌを基準電極としたサイクリックボルタンメトリーを行った。酸化還元電位（Ｅ０’）は、酸化電流がピークを示すときの電位値（Ｅｏｘ）と還元電流がピークを示すときの電位値（Ｅｒｅｄ）との平均値［（Ｅｒｅｄ＋Ｅｏｘ）／２］として算出された。
　表２に示すように、これらの化合物は比較的低い酸化還元電位を示す。このように低い酸化還元電位を示す電子受容体は、センサに好ましく用いられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　キノンにおける置換基の位置は、特に限定されるものではない。例えば、９，１０－フェナントレンキノンにおいては、１、２、３、４、及び７位のうちの少なくとも１つの位が、置換基の位置として好ましく選択される。
　試薬組成物は、キノン誘導体として、具体的には、９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸、９，１０－フェナントレンキノン－１－スルホン酸、９，１０－フェナントレンキノン－３－スルホン酸、９，１０－フェナントレンキノン－４－スルホン酸、９，１０－フェナントレンキノン－２，７－ジスルホン酸、９，１０－フェナントレンキノン－２－カルボン酸、及び９，１０－フェナントレンキノン－２－リン酸からなる群より選択される少なくとも一種の化合物を含有していてもよい。
　なお、キノン類化合物の製造方法としては、従来の方法が好適に用いられる。
　キノンは従来、医薬、農薬、工業の分野で使用されている。キノンは、例えば芳香族炭化水素から製造可能である。具体的には、アントラキノンはアントラセンの酸化により容易に製造される。
　また、親水性官能基を有するキノン類化合物の製造方法は、キノンに親水性官能基を導入する工程を含んでもよい。例えば、キノンに親水性官能基としてスルホ基を付加する方法としては、キノンと発煙硫酸とを反応させる方法などがある。
　また、親水性官能基を有するキノン類化合物の揮発性は、そのキノン類化合物の主要素であるキノンよりも低い傾向がある。よって、キノン類化合物が親水性官能基を付加されている場合、キノン類化合物は、試薬層４中に含まれることで、電子受容体として機能する点において有利である。
　（１－３）酵素
　試薬組成物は、一種類以上の酵素を含有していてもよい。酵素としては、酸化還元酵素が用いられる。酸化還元酵素は、酸化酵素及び脱水素酵素を包含する。酸化還元酵素の例として、
　　－グルコースを基質とする酵素としては、グルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼが好ましく；
　　－乳酸を基質とする酵素としては、乳酸オキシダーゼ、又は乳酸デヒドロゲナーゼが好ましく、；
　　－コレステロールを基質とする酵素としては、コレステロールエステラーゼ、又はコレステロールオキシダーゼが好ましく；
　　－アルコールを基質とする酵素としては、アルコールオキシダーゼが好ましく；
　　－ビリルビンを基質とする酵素としては、ビリルビンオキシダーゼが好ましく；挙げられる。
　試薬組成物は、酵素に合う補酵素を含有していてもよい。
　酵素は、その補酵素依存性について、特に限定されるものではない。例えば、酵素は、ＮＡＤ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ＮＡＤＰ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＱＱ（Ｐｙｒｒｏｌｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ　ｑｕｉｎｏｎｅ）、又はＦＡＤ（ｆｌａｖｉｎ　ａｄｅｎｉｎｅ　ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）等の補酵素に対して依存性を有してもよい。
　酵素の補酵素は、ＦＡＤ又はＰＱＱであることが好ましい。これらの補酵素に対応する酵素において、補酵素は、その酵素タンパク質に結合するか、又は含有される。よって、センサの作製及び測定の実行時に、酵素とは別途に補酵素を添加する必要がない。その結果、センサの構成、製造工程及び測定工程が簡素化される。
　ＮＡＤ及びＮＡＤＰ依存性酵素を用いる場合は、例えば、酵素蛋白質に結合しない状態で機能する補酵素ＮＡＤ及びＮＡＤＰを、別途に添加してもよい。例えば、酵素は、ＦＡＤ依存性酸化酵素、ＮＡＤ依存性、ＰＱＱ依存性、又はＦＡＤ依存性脱水素酵素等であってもよい。酸化酵素及び脱水素酵素の具体例は、上述したとおりである。
（１－４）組み合わせの要件
　なお、前述した全ての複素環式化合物はそれぞれ、前述した電子受容体のそれぞれと組み合わせることによって、少なくとも前述の電子受容体のシフト抑制効果を得ることが可能である。本発明は、これらの組み合わせのうち、以下の第一及び第二の要件のいずれかの要件を満足する。第一の要件では、酸化還元酵素と式（１）の化合物は特に限定されない。第二の要件では、酸化還元酵素と電子受容体は特に限定されない。
（第一の要件）
　前記電子受容体が、ナフトキノン、アントラキノン、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノン並びにこれらのキノン誘導体からなるキノン類化合物の群から選択される一以上である。
（第二の要件）
　前記複素環式化合物がヒスチジンを含まず、
　式（Ｉ）中のＡ１～Ａ５のうちの２個が窒素原子であるときは、Ｒ１～Ｒ５のうち、少なくとも１個の基が水素原子以外の置換基である。
　（１－５）その他の成分
　試薬組成物は、本発明の効果が得られる範囲において、複素環式化合物、酸化還元酵素、及び電子受容体以外の他の成分を含んでいてもよい。このような他の成分としては、例えば試薬組成物がセンサに適用されたときに、
　　－酵素又は電子受容体の保存性を高める、
　　－酵素と標的物質との反応性を高める、
　　－標的物質に対する応答性を高める、又は
　　－標的物質の濃度に対する応答電流値の直線性を高める、といった効果を示す物質が好ましく用いられる。
　前記他の成分としては、例えば糖アルコールが挙げられる。糖アルコールとしては、例えばソルビトール、マルチトール、キシリトール、マンニトール、ラクチトール、還元パラチノース、アラビニトール、グリセロール、リビトール、ガラクチトール、セドヘプチトール、ペルセイトール、ボレミトール、スチラシトール、ポリガリトール、イジトール、タリトール、アリトール、イシリトール、還元澱粉糖化物、イシリトールなどの鎖状の多価アルコールや、環式糖アルコールが挙げられる。また、前記他の成分としては、これらの糖アルコールの立体異性体、置換体、及び誘導体も挙げられる。
　さらに前記他の成分としては、分子内に少なくとも一つのアミノ基、あるいはカルボニル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩が挙げられる。このような有機酸及びその塩としては、アミノ酸、その置換体、その誘導体、及びそれらの塩が挙げられる。前記アミノ酸としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リシン、フェニルアラニン、プロリン、サルコシン、ベタイン、及びタウリンが挙げられる。前記アミノ酸及びその塩等の中でも、グリシン、セリン、プロリン、トレオニン、リシン、タウリンは、特に結晶化阻害の効果が高く好適である。これらの化合物は、最終的な応答性の向上の観点から好ましい。
　試薬組成物は、緩衝剤をさらに含有していてもよい。例えば、試薬組成物は、ＮａＨ２ＰＯ４及びＮａ２ＨＰＯ４等のリン酸ナトリウム、ＫＨ２ＰＯ４及びＫ２ＨＰＯ４等のリン酸カリウム、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ：Ｔｒｉｓ）等を含んでいてもよい。
　また、緩衝剤には、緩衝液が含まれる。つまり、試薬組成物は、リン酸ナトリウム緩衝液、ＡＣＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等の緩衝液を含有していてもよい。
　また、試薬組成物は、クエン酸－３Ｎａ及び塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）の一方又は両方等の添加剤をさらに含有していてもよい。クエン酸－３Ｎａ及び塩化カルシウムは、試薬組成物がセンサに用いられたときに、グルコース濃度に対するセンサの応答電流の直線性をより向上させることができる。
　また、試薬組成物は、親水性高分子をさらに含有してもよい。試薬組成物が親水性高分子を含有することで、試薬組成物がセンサの試薬層に適用されたときに、電極表面からの試薬層の剥離が抑制される。親水性高分子は、さらに、試薬層表面の割れを抑制する効果も有している。このような親水性高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチン及びその誘導体、アクリル酸及びその塩の重合体、メタクリル酸及びその塩の重合体、スターチ及びその誘導体、無水マレイン酸及びその塩の重合体、アガロースゲル及びその誘導体が好適に用いられる。
　（１－６）試薬組成物の形状
　試薬組成物は、液体であってもよいし、固体であってもよい。液体である場合、試薬組成物が含有する媒体としては、例えば、水（緩衝液を含む）、アルコール（エタノール、メタノール、プロパノール等を含む）、有機溶媒（ベンゼン、トルエン、キシレン等を含む）等が挙げられる。液状の試薬組成物を、「試薬液」と称することがある。前記媒体は水であることが、生体試料への適合性の観点から好ましい。
　（１－７）各成分の量
　試薬液における複素環式化合物の濃度は、０．００１ｍＭ以上であることが好ましく、０．０１ｍＭ以上であることがより好ましく、０．１ｍＭ以上であることがさらに好ましく、１ｍＭ以上であることがさらに好ましい。また、試薬液における複素環式化合物の濃度は、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、又は４ｍＭ以下に設定可能である。
　電子受容体と複素環式化合物との分子比率は、１０，０００：１～１：１，０００であることが好ましく、１，０００：１～１：１００であることがより好ましく、１００：１～１：１０であることがさらに好ましい。
　酵素１Ｕ当たりの複素環式化合物の量は、好ましくは０．００５～２５０ｎｍｏｌであり、より好ましくは０．１～４０ｎｍｏｌである。
　酵素１Ｕ当たりの電子受容体の量は、好ましくは０．０５～２，５００ｎｍｏｌであり、より好ましくは１～４００ｎｍｏｌである。
　なお、本発明においては、一部のジアミン系化合物が、本発明における前記複素環式化合物と同様に、酸化還元酵素の存在かにおける電子受容体の酸化電位の正側へのシフトを抑制する効果を有する。本発明では、このような一部のジアミン系化合物を複素環式化合物に代えて用いることも可能である。前記一部のジアミン系化合物としては、例えばエチレンジアミン、オルニチン、リシン、アルギニンなどが挙げられる。
　＜２．センサ＞
　本発明のセンサは、液体試料が入るように形成された試料室と、前記試料室内に配置された少なくとも一対の電極と、前記試料室内において、少なくとも前記一対の電極の両方に接するように配置された試薬層と、を有する。前記試薬層は、前述した本発明の試薬組成物から形成される。本発明のセンサは、前記試薬層を本発明の試薬組成物で形成する以外は、液体試料中の標的物質を電気化学的に検出する公知のセンサと同様に構成することができる。
　また、本発明のセンサは、
　（ａ）基板上に、少なくとも一対の電極を設けること、
　（ｂ）基板上に、前述した本発明の試薬組成物を、前記一対の電極の両方に接触するように塗布すること、及び
　（ｃ）前記（ｂ）で塗布された試薬組成物を乾燥させること、を含む方法によって製造することができる。
　本発明のセンサの製造方法は、本発明の試薬組成物を試薬層の形成に用いる以外は、液体試料中の標的物質を電気化学的に検出する公知のセンサの製造方法と同様に行うことができる。
　本発明のセンサでは、前述した本発明の試薬組成物を用いる。この試薬組成物は前述した複素環式化合物を含有する。前記センサでは、乾燥している試薬層中の成分が雰囲気中の湿気によりわずかに溶解したときに、試薬組成物中における成分が一時的に高濃度になり、酵素を失活させることがある。しかしながら、本発明のセンサやその製造方法では、前記複素環式化合物を含有する試薬組成物を用いることによって、このような組成物中の成分の濃度変化による酵素の失活を抑制することができる。
　以下、本発明のセンサを、図示の一例に基づいて説明する。
　（２－１）センサの概略構成
　図１に示すセンサ１は、液体試料中の標的物質を検出すること及び／又は定量するセンサの一例である。センサ１は、図１に示すように、基板２、導電層３、試薬層４、スペーサ５、カバー６を有する。
　（２－２）基板
　図１に示すように、基板２は板状の部材である。基板２は絶縁性を有する。基板２を構成する材料としては、例えば、
　　－ポリエチレンテレフタレート、ビニルポリマー、ポリイミド、ポリエステル、及びスチレニクス等の樹脂；
　　－ガラス；並びに
　　－セラミックス；等が挙げられる。
　基板２の寸法は、具体的な数値に限定されない。例えば、基板２の幅は、好ましくは３～２０ｍｍ、より好ましくは５～１０ｍｍである。また、基板２の長さは、好ましくは２０～４０ｍｍである。また、基板２の厚みは、好ましくは０．１～１ｍｍである。基板２の幅、長さ及び厚みの全てが、上記範囲内にあることが好ましい。
　（２－３）導電層
　図１に示すように、導電層３は、基板２上に略均一な厚みに形成されている。導電層３は、３つの電極３１～３３を含む。電極３１は作用電極、電極３２は対電極、電極３３は検知電極と称されることがある。なお、検知電極３３は省略可能である。
　また、導電層３は、上記３電極の他に、ヘマトクリット値を測定するためのＨｃｔ電極（図示せず）を設けた４つの電極から構成される場合もある。
　電極３１～３３のそれぞれの一部分は、キャピラリ５１に面するように配置される。電極３１～３３の他の一部分は、センサ１の導入口５２とは逆の端部において、スペーサ５及びカバー６で覆われずに露出している。これらの露出部分は、リードとして機能する。つまり、これらの露出部分は、測定器１０１から電圧の印加を受けたり、電流を測定器１０１に伝えたりする接続部分にあたる。
　各電極は、
　　－導電性材料を用いた印刷等；又は
　　－基板２を導電性材料で覆った後、レーザアブレーション等で非導電トラックを形成すること；で形成されてもよい。例えば、基板２にパラジウムをスパッタリングすることによって導電層３を形成し、レーザアブレーションにより、非導電トラックを形成することができる。非導電トラックは、好ましくは０．０１～０．５ｍｍ、より好ましくは０．０５ｍｍ～０．３ｍｍの幅を有する。
　なお、導電層３の構成材料は、導電性材料（導電性物質）であればよく、特に限定されるものではない。導電性材料の例としては、
　　－金属、金属混合物、合金、金属酸化物、及び金属化合物に代表される無機導電性物質等；
　　－炭化水素系導電性ポリマー及びヘテロ原子含有系導電性ポリマー等の有機導電性物質；又は
　　－これらの物質の組み合わせ；が挙げられる。導電層３の構成材料としては、パラジウム、金、白金、炭素などが好ましく、パラジウムが特に好ましい。
　導電層３の厚さは、その形成方法及び構成材料により変更可能である。例えば、スパッタリングによって導電層３が形成された場合、導電層３の厚さは、好ましくは０．１～２０ｎｍであり、より好ましくは１～１０ｎｍである。印刷により導電層３が形成された場合、導電層３の厚さは、好ましくは０．１～５０μｍであり、より好ましくは１～３０μｍである。
　（２－４）試薬層
　図１に示すように、試薬層４は、電極３１～３３に接するように配されている。試薬層４は、電極３１及び３２と共に、センサ１の活性部として機能する。活性部とは、電気化学的に活性な領域であって、液体試料中の特定の物質に反応し、電気信号を生じる部分である。具体的には、試薬層４は、酵素及び電子受容体を含む。
　試薬層４は、少なくとも電極３１及び３２（第１の電極及び第２の電極）の一部に接触するように配置されていればよい。また、試薬層４は、さらに電極３３に接触するように配置されていてもよい。
　試薬層４は、電子受容体、複素環式化合物及び酵素を含有する。具体的には、試薬層４は、本発明の試薬組成物を含有していてもよい。
　試薬層４における電子受容体の含有量は、センサが機能できる程度の量に設定可能であり、１回の測定当たり又はセンサ１個当たりにつき、好ましくは１～５００ｎｍｏｌ、より好ましくは１０～２００ｎｍｏｌ程度に設定される。
　試薬層４における酵素の含有量は、標的物質の検出が可能な程度に設定され、１回の測定当たり又はセンサ１個当たりにつき、好ましくは０．２～２０Ｕ（ユニット）、より好ましくは０．５～１０Ｕ程度に設定される。
　酵素１Ｕ当たりの電子受容体の量及び複素環式化合物の量については、試薬組成物における各成分の量と同様の値が好ましい。
　なお、本実施形態では電子受容体は試薬層４中に含まれるが、電子受容体は電極に含有されていてもよい。電極に含有される電子受容体としては、上述の試薬組成物に含有され得る電子受容体として挙げられた化合物が好適に用いられる。
　試薬層４が基質を酸化する酵素を含む場合における、電子受容体の働きについて説明する。酵素は、基質を酸化することで、基質からの電子を受け取り、補酵素に電子を与える。その結果、補酵素は、酸化体から還元体になる。酸化体である電子受容体は、還元体になった補酵素から電子を受け取って、補酵素を酸化体に戻す。その結果、電子受容体自身は還元体となる。還元体となった電子受容体は、電極３１又は３２に電子を与えて、自身は酸化体となる。このようにして、電子受容体は、酵素と電極間の電子移動を媒介する。
　上記補酵素は、酵素タンパク質（酵素分子）に結合することで、酵素タンパク質に保持されてもよい。また、補酵素は、酵素タンパク質から分離した状態で存在していてもよい。
　試薬層４は、種々の方法によって形成可能である。形成方法としては、例えば印刷法、塗布法等が挙げられる。
　具体的な方法として、液状の上述の試薬組成物を、マイクロシリンジなどを用いて、電極３１及び３２上に一定量滴下した後、適切な環境に静置して乾燥させることにより、試薬層４を形成することができる。なお、必要に応じて、電極３３上にも水溶液を滴下してもよい。水溶液の滴下量は特定の数値に限定されないが、好ましくは０．１～２０μＬ、より好ましくは０．５～５μＬである。
　試薬層４の形状は、具体的な形状に限定されない。この形状は、矩形状や円形状などであってもよい。試薬層４の面積（基板２の平面方向における面積）は、デバイスの特性及びサイズに応じて決定される。この面積は、好ましくは１～２５ｍｍ２、より好ましくは２～１０ｍｍ２であってもよい。
　塗布される水溶液が含む、酵素及び電子受容体並びにその他の成分の含有量は、必要とされるデバイスの特性やサイズに応じて選択される。
　（２－５）スペーサ５及びキャピラリ５１
　図１に示すように、スペーサ５は、カバー６と基板２上に形成された導電層３との間に空隙を設けるための部材である。
　具体的には、スペーサ５は、板状の部材であって、電極３１～３３のリード部分及び後述のキャピラリ５１部分を除いて、導電層３の全体を覆うようになっている。スペーサ５は、電極３１～３３のリード部分とは逆の端部を露出させる矩形の切り欠きを備える、スペーサ５がこの切り欠きを備えることで、スペーサ５、導電層３、及びカバー６とで囲まれたキャピラリ５１が形成される。このように、スペーサ５は、キャピラリ５１の側壁を提供し、さらにキャピラリ５１の長さ、幅、高さ等を規定することができる。
　キャピラリ５１の容量は、０．０５～５．０μＬ（マイクロリットル）程度で、好ましくは０．１～１．０μＬ（マイクロリットル）程度に設定される、スペーサ５の厚みは０．０２～０．５ｍｍ程度であり、好ましくは０．１～０．２ｍｍ程度である。スペーサ５が備える切り欠きの長さは、好ましくは１～５ｍｍである。スペーサ５が備える幅は、０．２５～４ｍｍ程度であり、好ましくは０．５～２ｍｍ程度である。なお、これらの寸法は、キャピラリ５１が所望の容量になるように適宜選択されればよい。例えば、長さが３．４ｍｍ、幅が１．２ｍｍの切り欠きを備える厚さ０．１４５ｍｍのスペーサ５を用いた場合、長さが３．４ｍｍ、幅が１．２ｍｍ、高さが０．１４５ｍｍ、容量が０．６μＬのキャピラリ５１が提供される。
　キャピラリ５１は、試料室の一例である。キャピラリ５１は、その開口部である導入口５２から毛細管現象によって液体試料を吸引し、電極３１～３３上に保持する。
　（２－６）カバー
　図１に示すように、カバー６はスペーサ５全体を覆う板状の部材である。カバー６は、表面から裏面まで貫通する孔を備える。この孔は、キャピラリ５１から外部に通じる通気口６１として機能する。通気口６１は、液体試料がキャピラリ５１に吸引されるとき、キャピラリ５１内の空気をキャピラリ外へ排出するための排気孔である。このように空気が排出されることで、液体試料がキャピラリ５１内に容易に吸引されやすい。
　通気口６１は、導入口５２から離れた位置に、つまり、導入口５２から見てキャピラリ５１の奥に設けられることが好ましい。導入口５２がこのように配置されることで、液体試料が、導入口５２からキャピラリ５１の奥まで、速やかに移動することができる。
　また、通気口６１は、センサ１の前記導電層に載置された試薬層４よりも奥側に配置されていることが好ましい。
　＜３．センサシステム＞
　本発明のセンサシステムは、前述した本発明のセンサと、前記少なくとも一対の電極間の電流値を測定する測定部と、前記測定部による測定結果に基づいて、前記液体試料中の対象物質の濃度を算出する算出部と、を有する。本発明のセンサシステムは、本発明のセンサを用いる以外は、液体試料中の標的物質を電気化学的に検出する公知のセンサシステムと同様に構成することができる。
　以下、本発明のセンサシステムを、前述したセンサ１を含む一例に基づいて説明する。
　上述のセンサ１は、図２に示すセンサシステム１００で用いられる。センサシステム１００は、センサ１及び測定器１０１を有する。
　図２及び図３に示すように、測定器１０１は、表示部１０２、装着部１０３、切替回路１０７、基準電圧源１０８、電流／電圧変換回路１０９、Ａ／Ｄ変換回路１１０、演算部１１１、操作部１１３及び電源部１１２を備える。測定器１０１は前述の測定部に相当する。測定器１０１は、さらに、センサ１の各電極に対応するコネクタを有する。図３には、前記装着部１０３内に設けられているコネクタ１０４～１０６が描かれている。
　表示部１０２は、測定器１０１の状態、測定結果、操作内容等を表示する。表示部１０２は、具体的には液晶表示パネルによって実現される。
　図２に示すように、装着部１０３には、センサ１が着脱可能に挿入される。図３に示すように、コネクタ１０４～１０６は、センサ１が装着部１０３に装着されることで、それぞれセンサ１の電極３１～３３に接続される。
　切替回路１０７は、コネクタ１０４～１０６を、基準電圧源１０８に接続することも、電流／電圧変換回路１０９に接続することもできる。基準電圧源１０８は、コネクタ１０４～１０６を介して、電極３１～３３に電圧を印加する。
　電流／電圧変換回路１０９は、センサ１からの電流を、コネクタ１０４～１０６を介して受け取り、電圧に変換して、Ａ／Ｄ変換回路１１０に出力する。
　Ａ／Ｄ変換回路１１０は、電流／電圧変換回路１０９からの出力である電圧値（アナログ値）をデジタル値に変換する。
　演算部１１１は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）並びにＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）及びＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）等の記録媒体を有する。演算部１１１は、標的物質の濃度算出を行ったり、測定器１０１内の各部の動作を制御したりする。演算部１１１は前述の算出部に相当する。
　演算部１１１の濃度算出機能について説明する。演算部１１１の記憶媒体中には、試料中の標的物質の濃度の決定に用いられる換算テーブル、この濃度の補正量の決定に用いられる補正量テーブル等が記憶される。演算部１１１は、Ａ／Ｄ変換回路１１０からのパルスに基づいて、換算テーブルを参照することにより、標的物質の仮の濃度を算出する。演算部１１１は、さらに、補正量テーブル中の補正量を用いて、標的物質の最終的な濃度を決定する。こうして算出された濃度は、表示部１０２に表示される。
　また、演算部１１１は、濃度算出機能以外に、切換回路１０７の切替制御、基準電圧源１０８の電圧制御、濃度測定や補正量選択時の時間の測定（タイマ機能）、表示部１０２への表示データ出力、及び外部機器との通信機能等を有する。演算部１１１の各種機能は、ＣＰＵが、図示しないＲＯＭ等に格納されたプログラムを読み出して実行することにより実現される。
　操作部１１３は、測定器１０１の表面部に設けられる。操作部１１３は、使用者が測定データや設定データを参照する時などに使用する操作ボタンなどから構成される。
　電源部１１２は、上記の各電気回路、表示部、演算部などへ電源を供給する電池等から構成される。
　＜４．センサシステムの使用＞
　本発明のセンサシステムは、標的物質の濃度測定方法に好適に用いることができる。この濃度測定方法は、（ａ）少なくとも電子受容体及び酵素を含む試薬組成物と、液体試料と、を接触させること、（ｂ）上記（ａ）によって生じた電流を検出すること、及び、（ｃ）上記（ｂ）の検出結果に基づいて、液体試料中の標的物質の濃度を測定すること、を含む。そして前記試薬組成物には、前述した本発明の試薬組成物を用いる。
　本発明の濃度測定方法では、前述した試薬組成物を試薬層の材料に用いることから、前述した試薬層の吸湿による酵素の失活が生じない試薬層が用いられる。よって、本発明の濃度測定方法は、より高い測定精度で標的物質の濃度を測定することができる。
　以下、センサシステム１００による濃度測定について説明する。
　センサ１が装着部１０３に差し込まれると、コネクタ１０４～１０６が、電極３１～３３にそれぞれ接続される。また、センサ１が装着部１０３へ装着されることによって、装着部１０３内のスイッチ（図示せず）が押下される。押下されることでスイッチがＯＮとなり、演算部１１１はセンサ１が装着されたと判断し、測定器１０１を試料待機状態とする。試料待機状態とは、演算部１１１の制御の下、基準電圧源１０８がコネクタ１０４及び１０６を介して、作用電極３１及び検知電極３３間への電圧印加を開始し、かつ電流／電圧変換回路１０９が電流測定を開始した後であって、液体試料がまだ測定に供されていない状態である。
　使用者が、センサ１の導入口５２に液体試料を点着させると、毛細管現象によって、導入口５２からキャピラリ５１に液体試料が引き込まれる。液体試料としては、例えば、血液、汗、尿等の生体由来の液体試料や、環境由来の液体試料、食品由来の液体試料等が用いられる。例えば、センサ１を血糖値センサとして用いる場合、使用者は、自身の指、掌、又は腕等を穿刺して、少量の血液を搾り出し、この血液を液体試料として、センサ１での測定に供する。
　液体試料が作用電極３１及び検知電極３３に到達すると、演算部１１１が、電流／電圧変換回路１０９を介して受け取る電流値が変化する。この変化から、演算部１１１は、液体試料がセンサ１に正しく吸引されたと判断する。こうして液体試料の吸引が検知されることにより、測定が開始される。
　センサ１内では、液体試料中に試薬層４中の酵素及び電子受容体等の成分が溶解する。こうして、センサ１の電極３１及び３２上で、液体試料、酵素、及び電子受容体が互いに接触する。
　演算部１１１の制御により、切替回路１０７は、コネクタ１０４とコネクタ１０５とを基準電圧源１０８及び電流／電圧変換回路１０９に接続する。こうして、作用電極３１と対電極３２との間に電圧が印加され、作用電極３１と対電極３２との間に生じた電流が、電流／電圧変換回路１０９に伝達される。
　電流／電圧変換回路１０９へ流れた電流は電圧へ変換される。そして、この電圧はＡ／Ｄ変換回路１１０によりさらにデジタル値へと変換される。演算部１１１は、このデジタル値から、特定成分の濃度を算出する。演算部１１１により算出された値は、表示部１０２に表示される。その際、使用者へのその他の情報が共に表示することができる。
　測定終了後は、使用者はセンサ１を装着部１０３から取り外すことができる。
　なお、基準電圧源１０８は、２つの電極３１及び３２間に、目的の電気化学反応を起こすのに十分な電圧を与えられるようになっている。この電圧は主に、利用する化学反応及び電極に応じて設定される。
　以上の説明から明らかなように、センサシステム１００を用いることで、
　（ａ）液体試料と、電子受容体と、酵素と、を接触させること、
　（ｂ）上記（ａ）によって生じた電流を検出すること、及び
　（ｃ）上記（ｂ）の検出結果に基づいて、標的物質の濃度を測定すること、を含む濃度測定方法が実行される。
　また、血液などの液体試料を対象とする場合、センサシステム１００において、
　（ｉ）上記液体試料に、上記標的物質を基質とし、電子受容体と、上記電子受容体に電子を供与する酵素と、を溶解させること、
　（ｉｉ）上記（ｉ）により得られた溶液において生じた電流を検出すること、及び
　（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の検出結果に基づいて、上記標的物質の濃度を測定すること、を含む濃度測定方法が実行される。
　［親水性官能基を有するキノン類化合物の利点］
　親水性官能基を有するキノン類化合物は、試薬組成物が、水を媒体とする試料（例えば血液）を検知対象とするセンサに適用される場合に、特に好ましく用いられる。
　電子受容体が親水性官能基を有するキノン類化合物である場合、電子受容体の分子と酵素分子とが、試料中で衝突する機会が増大する。その結果、反応の速度が増大し、標的物質に由来する電流量が増大すると共に、測定に要する時間も短縮され得る。
　また、電子受容体が親水性官能基を有するキノン類化合物である場合、作用電極中又は作用電極上に、電子受容体を固定化するために必要な充填剤成分又は結合剤成分を配合する必要がない。すなわち、電子受容体が試料に溶解して機能する場合には、前述したように、電子受容体を含む溶液を電極上に滴下及び乾燥させることによって、簡単に電極上に電子受容体を配置することができる。
　電子受容体は、センサを構成する一対の電極の少なくとも一部、すなわち第１の電極の少なくとも一部及び第２の電極の少なくとも一部に共に接するように配置されることが好ましい。第１の電極及び第２の電極は、作用極及び対極に相当する。電子受容体がこのように配置されることで、各電極の電位が安定するので、測定の精度が向上する。第１及び第２の電極間に電圧が印加されることにより電気化学反応が進行して測定が実施されるので、電子受容体が両極の一部に接している場合、対極として機能する側の電極では電子受容体の還元反応により電極には安定した電子受容体の還元電位が与えられる。一方、作用極として機能する側の電極の電位は、上記電子受容体の還元電位に上記印加電圧を加えたものとなり、電位が安定する。
　センサの長期的な安定性等を考慮すると、親水性官能基が付加されていないキノンは、電極中に含まれることが好ましい。すなわち、キノンと導電性材料との混合物により、電極が形成されることが好ましい。充填剤成分や結合剤成分を配合して電子受容体分子を作用電極中又は作用電極上に固定化する方法が知られている。
　［電子受容体の酸化還元電位の好ましい範囲及びその利点］
　センサ１による標的物質の検出では、センサ１による標的物質の正確な検出を妨害する妨害物質が試料中に含有されることがある。妨害物質は干渉物質と称されることもある。妨害物質としては、アスコルビン酸、尿酸、及びアセトアミノフェン等が挙げられる。測定の対象が非生体試料（血液及び尿等の生体試料以外の試料）である場合、妨害物質とは、その非生体試料に含まれる易酸化性物質である。
　背景技術において前述したとおり、妨害物質の酸化に必要な電位が、電子受容体の酸化に必要な電位よりも低い場合に、妨害物質はセンサの測定結果に影響を与える。その結果、測定結果に誤差が生じる。例えば、試料が血液である場合、電子受容体を酸化するために必要な電極の電位が血液中に含まれるアスコルビン酸等を酸化するために必要な電極の電位よりも有意に高い（正である）ことによって、誤差がもたらされる。
　電子受容体を酸化するために必要な電極の電位は、電子受容体自身の酸化還元電位に依存する。よって、電子受容体の酸化還元電位がより負であることは、妨害物質の影響を軽減するという点において好ましい。妨害物質の影響は、妨害物質の酸化電位よりも正であっても、その酸化電位になるべく近い酸化還元電位を持つ電子受容体を用いることによって軽減できる。影響をより低減するには、妨害物質の酸化電位よりも負の酸化還元電位を持つ電子受容体を用いることが好ましい。
　また、酵素が標的物質を酸化する場合、電子受容体の酸化還元電位は、補酵素のそれよりも正であることが好ましい。これによって、電子受容体は、補酵素から電子を容易に受容することができる。
　なお、酵素が標的物質を還元する場合、電子受容体の酸化還元電位は、補酵素のそれよりも負であることが好ましい。これによって、電子受容体は、補酵素へ電子を容易に供与できる。このように標的物質を還元反応によって検出する場合には、補酵素、電子受容体、妨害物質（易還元性物質）の電位の関係は、標的物質を酸化によって検出する場合と逆の関係になる。
　以下では、標的物質が酸化によって検出される場合について説明する。
　補酵素の具体的な酸化還元電位は以下の通りである。補酵素であるＦＡＤ及びＰＱＱは、酵素タンパク質に結合した状態で、酵素タンパク質と協働して典型的に機能する。これらの補酵素の酸化還元電位は、それぞれ約－３００及び約－２００ｍＶである。また、ＮＡＤは、酵素蛋白に結合せずに機能する。ＮＡＤの酸化還元電位は、約－５２０ｍＶである。
　さらには、一般に、電子受容体の電子受容能は、電子受容体の酸化還元電位が補酵素のそれに対してより正であるほど、大きくなる傾向がある。すなわち、電子受容体の酸化還元電位と補酵素のそれとの差が大きいほど、エネルギーレベルの差が大きい。よって、電子受容体の電子受容速度は大きくなる。したがって、センサの測定高感度化及び迅速化の点においては、電子受容体の酸化還元電位が正側に高いことが好ましい。
　以上のように、誤差が少なくかつ感度が良いセンサ及び測定方法を実現するためには、電子受容体の酸化還元電位の正側は妨害物質の酸化還元電位によって、負側は電子受容能に関連する補酵素の酸化還元電位によって、制限される。この範囲は、非常に狭く制限されることがある。
　例えば、特許文献２では、ＮＡＤ依存性酵素を有すると共に、電子受容体として、窒素原子を含む複素環化合物であるフェナントロリンキノンを有するセンサが開示されている。フェナントロリンキノンの酸化還元電位は約０ｍＶであり、ＮＡＤのそれは約－５２０ｍＶである。つまり、この文献のセンサにおいて、電子受容体と補酵素との間には、約５２０ｍＶの電位差がある。なお、アスコルビン酸の酸化電位は約－１４０ｍＶであるので、電子受容体がフェナントロリンキノンである場合、上記理由により、妨害物質の影響を完全に回避することはできない。
　ところで、上述したように、ＰＱＱ依存性又はＦＡＤ依存性酵素を有するセンサは、低い製造コストで製造可能であるという利点を有する。しかしながら、ＰＱＱ及びＦＡＤはＮＡＤと比べて酸化還元電位が高いために、ＰＱＱ依存性及びＦＡＤ依存性酵素に適用できる電位が低い電子受容体の探索は容易ではない。現在、妨害物質の影響を低減させるために、かつ、製造コストの抑制のために、ＰＱＱ依存性及びＦＡＤ依存性酵素にも適用できる酸化還元電位が低い電子受容体が望まれている。
　しかし、補酵素がＦＡＤ又はＰＱＱである場合、それらの電位はより正側にあるので、上記範囲は特に狭い。
　電子受容体の例である、９，１０－フェナントレンキノン、９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸、１，２－ナフトキノン－４－スルホン酸、２，５－ジメチル－１，４－ベンゾキノンの酸化還元電位は、それぞれ順に、－１８０ｍＶ、－１４０ｍＶ、－１６ｍＶ、－５ｍＶである。これら酸化還元電位は０ｍＶよりも負であり、ＮＡＤの電位よりも正、さらにはＦＡＤ及びＰＱＱの電位よりも正である。特に、９，１０－フェナントレンキノン、９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸の酸化還元電位は、アスコルビン酸の酸化電位（約－１４０ｍＶ）よりも負である。すなわち、これらの電子受容体は、ＰＱＱ依存性又はＦＡＤ依存性酵素を有するセンサに適用可能である。また、これらの電子受容体は、妨害物質が検出結果に与える影響を低減することもできる。
　ただし、電位の関係だけで補酵素からの電子受容能が決まるわけではない。キノン類化合物の電子受容能は、例えば、キノン類化合物の電荷と酵素の活性部位付近の電荷との関係、及びキノン類化合物の分子サイズと酵素の活性部位空間の大きさとの関係などに影響を受ける。
　酵素がＦＡＤ依存性酵素又はＰＱＱ依存性酵素である場合、電子受容体は９，１０－フェナントレンキノン（その誘導体を含む）であることが好ましい。９，１０－フェナントレンキノンは、アントラキノンのように芳香環が横１列に連結しておらず、コンパクトな分子サイズを有している。よって、９，１０－フェナントレンキノンは、酵素の活性部位空間に侵入しやすいものと推測される。また、９，１０－フェナントレンキノンは、電荷も有していないため、酵素の活性部位の電荷の影響も受けにくいものと予想される。
　［１］複素環式化合物による電子受容体の酸化電位の変動抑制
　以下に示すように、複素環式化合物は、保存期間の前後での電子受容体の酸化電位の変動を抑制すると共に、電子受容体の電位を負側にシフトさせるという効果を示す。以下では特に、電子受容体としてキノン類化合物を例に挙げて実験を行った結果を示す。
　［１－１］９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ）の調製
　下記式（ｉ）で表される９，１０－フェナントレンキノン－２－スルホン酸ナトリウム（ＰＱＳＡ）を、次の操作によって得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
　すなわち、市販の９，１０－フェナントレンキノンを発煙硫酸にてスルフォニル化後、異性体の分取を行い、さらにＮａ塩化して、目的化合物であるＰＱＳＡを得た。反応式は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
　ＰＱＳＡは、水に対して８０ｍＭという高い溶解度を示した。
　［１－２］試薬組成物（試薬液）の調製
　下記組成を有する試薬液Ａ及びＢを調製した。
　　　＜試薬液Ａ＞
　添加剤：イミダゾール（下記式に示す）　７．５ｍＭ
　電子受容体：ＰＱＳＡ　７．５ｍＭ
　酵素：ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ（ＦＡＤ－ＧＤＨ）　３．５ＭＵ／Ｌ（リットル）
　緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
　　　＜試薬液Ｂ＞
　イミダゾールを含まない以外は組成Ａと同様の組成である。
　［１－３］センサ電極の作製
　試薬液Ａ及びＢの特性を測定するためのセンサ電極を作製した。この電極は、試薬層４が含まれていないこと以外は図１に示す構成と同様である。詳細は次の通りである。
　まず、長さが３０ｍｍ、幅が７ｍｍ、厚みが０．２ｍｍのポリエチレンテレフタレートを主成分として含む基板２に、パラジウムをスパッタリングすることにより、厚みが８ｎｍの導電層３を形成した。その後、レーザアブレーションにより、幅が０．１ｍｍの非導電トラックを形成することで、電極３１及び３２を形成した。電極３１は作用電極、電極３２は対電極に相当する。３．４ｍｍの長さ及び１．２ｍｍの幅を有する切り欠きを備えるスペーサ５（厚さ０．１４５ｍｍ）と、カバー６とを、電極を形成した基板に順に貼付することで、０．６μＬの容量を有するキャピラリ５１を備えるセンサ電極を作製した。
［１－４］サイクリックボルタンメトリー
　得られた試薬液について、上記センサ電極を用いてサイクリックボルタンメトリーを行った。参照電極として、銀／塩化銀（飽和塩化カリウム）電極（以下Ａｇ｜ＡｇＣｌと記載する）を用いた。参照電極は、塩橋を介してセンサ電極の通気口６１に連結された。測定にはポテンショスタットを用いた。各種電極及びポテンショスタットは、電気化学で一般的に用いられるものを使用した。これらの設備は、例えばビー・エー・エス社などから入手することが可能である。
　サイクリックボルタンメトリーにおいては、作用極に印加する電位を、時間に対して線形に走査した。掃引速度は０．１Ｖ／秒に設定された。まず、第１の電位を作用極に与え、その電位からより負の第２の電位まで、電極電位を負側に掃引した。続いて、第２の電位から第１の電位まで電極電位を正側に折り返す掃引を行った。第１の電位及び第２の電位は、０．２Ｖ及び０．５Ｖであった。
　調製直後（初期）の試薬液Ａについての上記のサイクリックボルタンメトリーで正側に掃引した場合の酸化電位と酸化電流の関係を図４に点線で示し、２１時間後の試薬液Ａ（２５℃、湿度（ＲＨ）５％で２１時間保存された試薬液Ａ）についての同結果を図４に実線で示す。また、同様に調製直後の試薬液Ｂについてのサイクリックボルタンメトリーで得られた結果を図５に点線で示し、２１時間後の試薬液Ｂ（２５℃、湿度（ＲＨ）５％で２１時間保存された試薬液Ｂ）についての結果を図５に実線で示す。
　［１－５］センサの作製
　図１に示す構成を有するセンサを作製した。詳細は次の通りである。
　まず、長さが３０ｍｍ、幅が７ｍｍ、厚みが０．２ｍｍのポリエチレンテレフタレートを主成分として含む基板２に、パラジウムをスパッタリングすることにより、厚みが８ｎｍの導電層３を形成した。その後、レーザアブレーションにより、幅が０．１ｍｍの非導電トラックを形成することで、電極３１～３３を形成した。電極３１は作用電極、電極３２は対電極、電極３３は検知電極として機能するよう設計した。
　下記の組成を有する試薬液Ｃ及びＤを調製した。
　　　＜試薬液Ｃ＞
　　添加剤：イミダゾール　７．５ｍＭ
　　酵素：ＦＡＤ－ＧＤＨ　４Ｕ／センサ
　　電子受容体：ＰＱＳＡ　０．４６ｗｔ％（１５ｍＭ）
　　高分子：カルボキシメチルセルロース　０．２５ｗｔ％
　　緩衝液：リン酸バッファー（濃度：０．２ｗｔ％，ｐＨ　６．５）
　　　ＮａＨ２ＰＯ４　　　　０．１１ｗｔ％（９ｍＭ）
　　　ＫＨ２ＰＯ４　　　　　０．０４ｔ％（３ｍＭ）
　　　Ｋ２ＨＰＯ４　　　　　０．０５ｗｔ％（３ｍＭ）
　　　＜試薬液Ｄ＞
　イミダゾールを含有しない以外は組成Ｃと同様の組成である。
　各試薬液１．２μＬを、マイクロシリンジを用いて直径２．２ｍｍの円形状に塗布することにより、試薬層４を形成した。試薬層４を形成した後、３．４ｍｍの長さ及び１．２ｍｍの幅を有する切り欠きを備えるスペーサ５（厚さ０．１４５ｍｍ）と、カバー６とを、電極を形成した基板に順に貼付することで、０．６μＬの容量を有するキャピラリを備えるセンサを作製した。
　なお、下記の試薬液Ｃ及びＤのそれぞれについて、
　　－調製した直後の試薬液を用いた場合、及び
　　－調製してから２５℃、湿度５％の環境下で２１時間経過した後の試薬液を用いた場合の２種類のセンサを作製した。
　［１－６］応答電流値の測定
　所定の濃度を有するグルコース溶液を用いて、各センサの応答電流値を測定した。
　調製直後の試薬液Ｃを用いて作製されたセンサの応答電流値からの、２１時間後の試薬液Ｃを用いて作製されたセンサの応答電流値の乖離度を、図６に示す。
　調製直後の試薬液Ｄを用いて作製されたセンサの応答電流値からの、２１時間後の試薬液Ｄを用いて作製されたセンサの応答電流値の乖離度を、図７に示す。乖離度は、調製直後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値を基準に（つまり０％としたときの）、２１時間後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値の変化率（％）で示している。
　［１－７］結果
　［サイクリックボルタンメトリー］
　図５に示すように、試薬液Ｂ（イミダゾールを含まない）において、ＰＱＳＡの酸化電位は、初期測定時から２１時間経過したときには、正側にシフトした。このような電位の変化は、電子受容体と酵素とが水溶液中で共存することによって生じると考えられる。
　図４と図５とを比較すると、複素環式化合物が試薬液にイミダゾール（７．５ｍＭ）が添加されたことで、ＰＱＳＡの電位のピークが負側にシフトしたことが分かる。また、図４の点線と実線とを比べると、酸化電位のピークの正側へのシフトが抑制されたことが分かる。
　他の複数種類の複素環式化合物についても同様の効果が得られることを、発明者らは確認した。
　［センサの応答電流値］
　図６と図７とを比較すると、試薬液が複素環化合物を含有することで、初期の応答電流値からの、２１時間経過後の応答電流値の乖離が抑制され、複素環化合物を含まない場合と比較して、改善していることが分かる。
　［２］種々の複素環式化合物を用いた実験
　［２－１］試薬液の調製
　添加剤として、イミダゾール、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノイミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール、３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾール、２－メチルイミダゾール、又は１，２－ジメチルイミダゾールを添加することで、添加剤の種類及び濃度以外は試薬液Ｃと同様の組成を有する試薬液をそれぞれ調製した。各添加剤の濃度は、後述の図及び表に示すとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
　また、複素環式化合物に代えて、ジアミン系化合物（エチレンジアミン、ブタンジアミン、ペンタンジアミン、ヘキサンジアミン、エチレンアミン、オルニチン、リシン、アルギニン）をそれぞれ添加した試薬液を調製した。
　［２－２］試薬液の保存安定性
　調製された試薬液を用いて、［１－５］と同様の操作により、センサを作製した。また、調製後に２５℃、湿度５％で２４時間保存した試薬液を用いてセンサを作製した。
　［２－３］センサの安定性試験（暴露試験）
　調製された直後の試薬液を用いて、［１－５］と同様の操作により、センサを作製した。作製されたセンサを、高温多湿環境下（３０℃８０％ＲＨ，２４時間）で暴露放置した。
　暴露前のセンサと暴露後のセンサとを用いて、所定の濃度を有するグルコース溶液に対する応答電流値を測定した。
　［２－４］結果
　表３に示すように、他の複素環式化合物も、電子受容体の酸化電位の正側へのシフトを防止する効果、すなわち試薬液の安定性を高める効果、を示した。また、いくつかのジアミン系化合物は、試薬液の安定性を高める効果を示した。
　しかしながら、表３に示すように、ジアミン系化合物が試薬層に添加されたセンサの電流値は、センサが暴露を経ることで、応答電流値が大きく低下した。ジアミン系化合物が添加された場合と、添加されなかった場合とで比較すると、ジアミン系化合物が添加された方が、アルギニンを除き、電流値の低下率が大きかった。
　このような電流値の低下が起きるのは、添加剤は溶液内において低濃度で共存する場合はメディエータの安定性に寄与するが、乾燥した試薬層が湿気によってわずかに溶解した場合、すなわち高濃度で共存した場合には、酵素を失活させてしまうためと推測される。
　これに対して、表３に示すように、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノイミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール又は３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾールが添加された試薬層を有するセンサでは、暴露試験後も応答電流値の変動が比較的低く抑えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　［３］添加物の濃度
　異なる濃度（０．０１～６ｍＭ）の３－アミノ－１，２，４－トリアゾールを含有する試薬液をそれぞれ調製した。また３－アミノ－１，２，４－トリアゾールを含有しない以外は同じ組成の試薬液も調製した。調製直後の各試薬液を用いてセンサを作製し、一方で、調製後２５℃、湿度５％で２４時間保存した試薬液でセンサを作製した。それぞれのセンサを用いて、所定の濃度のグルコース溶液についての応答電流値を測定した。
　保存前後での応答電流値の変動率を、図８に示す。図８では、調製直後の試薬液を用いて作製されたセンサの応答電流値を０％として、保存によるセンサの応答電流値の変化率が前記変動率として示されている。図８に示すように、検討した濃度範囲（０．０１～６ｍＭ）の全体において、複素環式化合物の添加により、試薬液の安定性向上の効果が見られた。特に、１～６ｍＭにおいて、顕著な効果が見られた。
　同じ組成を有し、かつ調製直後の試薬液を用いてセンサを作製した。センサについて、３０℃、湿度８０％、２４時間の条件で暴露実験を行った。暴露させていないセンサ（すなわち、通常の条件（２５℃、湿度５％）で２４時間保存されていたセンサ）と暴露させたセンサとを用いて、所定の濃度のグルコース溶液について応答電流値を測定した。
　暴露前後での応答電流値の変動率を、図９に示す。図９では、暴露させていないセンサの応答電流値を０％として、暴露による応答電流値の変化率が前記変動率として示されている。図９に示すように、特に０．１～６ｍＭにおいて、暴露による応答電流値の低下の抑制効果が見られた。
　［４］酸化還元電位への影響
　下記組成を有する試薬液Ｅ、Ｆについて、サイクリックボルタンメトリーを行った。用いた電極は以下の通りであった。
　　－作用極：グラッシーカーボン電極、
　　－対極：白金ワイヤー、
　　－参照電極：Ａｇ｜ＡｇＣｌ
　　　＜試薬液Ｅ＞
　　　添加剤：３－アミノ－１，２，４－トリアゾール　５ｍＭ
　　　電子受容体：ＰＱＳＡ　２ｍＭ
　　　緩衝液：１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
　　　＜試薬液Ｆ＞
　電子受容体として２，６－ジメチルベンゾキノンを用いた以外は試薬液Ｅと同様の組成である。
　　　＜試薬液Ｇ＞
　電子受容体として、フェリシアン化カリウムを用いた以外は試薬液Ｅと同様の組である。
　図１０～図１２に示すように、全ての試薬液Ｅ、Ｆ、Ｇについて、酸化電位の負側への移行が見られた。
　以上のことから、本発明のトリアゾールなどの特定の含窒素化合物を添加剤として、酸化還元酵素と電子受容体を含有する試薬に添加することにより、ＰＱＳＡ、２，６－ジメチルベンゾキノンなどのキノン系化合物、またはフェリシアン化カリウムなどの鉄シアノ錯体などの電子受容体の多くに、酸化電位の負側への移行の効果が見られた。本発明をセンサに応用することにより、生体試料の特定成分の測定などにおいて、妨害物質等の影響を抑制することができる。
　本出願は、２０１０年９月３０日出願の特願２０１０－２２２１４２に基づく優先権を主張する。当該出願明細書に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
　本発明では、酸化還元酵素及び電子受容体を含有する試薬組成物において、複素環式化合物がさらに含有されることにより、保存期間の前後での電流値の変化が抑制される。この試薬組成物は、センサの試薬層に好ましく適用される。したがって、標的物質の電気化学的な検出において、より精度の高い検出結果を得ることができる。本発明は、標的物質の電気化学的な検出の分野におけるさらなる発展に寄与することが期待される。
　１　　センサ
　２　　基板
　３　　導電層
　３１　作用電極
　３２　対電極
　３３　検知電極
　４　　試薬層
　５　　スペーサ
　５１　キャピラリ
　５２　導入口
　６　　カバー
　６１　通気口
　１００　センサシステム
　１０１　測定器
　１０２　表示部
　１０３　装着部
　１０４～１０６　コネクタ
　１０７　切替回路
　１０８　基準電圧源
　１０９　電流／電圧変換回路
　１１０　Ａ／Ｄ変換回路
　１１１　演算部
　１１２　電源部
　１１３　操作部
 

Claims (23)

  1. 酸化還元酵素と
    　電子受容体と、
    　下記一般式（Ｉ）で表される複素環式化合物と、を含有し、下記第一の要件又は第二の要件を満足する、試薬組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
      （Ｒ１～Ｒ５は、それぞれ独立して、水素原子、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシル基又は炭素数１～１２の炭化水素基を表し、
    　前記炭化水素基は、アミノ基、ヒドロキシル基及びカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも一種の置換基を有していてもよく、
    　Ａ１～Ａ５のうちの２個又は３個が窒素原子であって、他は炭素原子であり、
    　式（Ｉ）中のＡ１～Ａ５のうちの２個が窒素原子であるときは、Ａ１が窒素原子であり、Ａ２及びＡ５が炭素原子である。）
    （第一の要件）
    　前記電子受容体が、ナフトキノン、アントラキノン、フェナントレンキノン、フェナントロリンキノン並びにこれらのキノン誘導体からなるキノン類化合物の群から選択される一以上である。
    （第二の要件）
    　前記複素環式化合物がヒスチジンを含まず、
    　式（Ｉ）中のＡ１～Ａ５のうちの２個が窒素原子であるときは、Ｒ１～Ｒ５のうち、少なくとも１個の基が水素原子以外の置換基である。
  2. 　前記複素環式化合物が窒素原子を３個以上有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  3. 　前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１～Ｒ５の少なくとも１つの基が、ＣｎＨｍ－（ａ＋ｂ＋ｃ）（Ｒ６）ａ（Ｒ７）ｂ（Ｒ８）ｃで表される鎖式炭化水素基であり、
    　ｎは２以下の自然数を表し、
    　ｍはｎ＋１以上２ｎ＋１以下の自然数を表し、
    　ａ、ｂ及びｃはそれぞれ独立してｎ以下の自然数を表し、
    　Ｒ６～Ｒ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基を表す、請求項１に記載の試薬組成物。
  4. 　前記複素環式化合物は、アミノ基を含有する置換基を有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  5. 　前記複素環式化合物の五員複素環がトリアゾールである、請求項１に記載の試薬組成物。
  6. 　前記複素環式化合物として、イミダゾール、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノ－イミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、２－メチルイミダゾール、１，２－ジメチルイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール及び３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾールからなる群より選択される少なくとも一種の化合物（ただし第二の要件を満たす場合では、イミダゾール及びヒスチジンを除く）を含有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  7. 　前記複素環式化合物として、ヒスタミン、ヒスチジン、２－アミノ－イミダゾール、４，５－ビス（ヒドロキシメチル）イミダゾール、２－メチルイミダゾール、１，２－ジメチルイミダゾール、１，２，４－トリアゾール、３－アミノ－１，２，４－トリアゾール、４－アミノ－１，２，４－トリアゾール及び３，５－ジアミノ－１，２，４－トリアゾールから成る群より選択される少なくとも一種の化合物（ただし第二の要件を満たす場合では、ヒスチジンを除く）を含有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  8. 　前記第二の要件を満足する場合において、前記電子受容体として鉄シアノ錯体を含有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  9. 　前記第二の要件を満足する場合において、前記電子受容体としてキノン類化合物を含有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  10. 　前記キノン類化合物として、フェナントレンキノン及びフェナントレンキノンの誘導体の一方又は両方を含有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  11. 　前記キノン類化合物として、９，１０－フェナントレンキノン及び９，１０－フェナントレンキノンの誘導体の一方又は両方を含有する、請求項１０に記載の試薬組成物。
  12. 　前記キノン類化合物は、親水性官能基を有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  13. 　前記キノン類化合物は、キノンと置換基とを有し、
    　前記置換基は、置換されていてもよいベンゼン環と、前記ベンゼン環に付加された前記親水性官能基とを有する、請求項１２に記載の試薬組成物。
  14. 　前記キノン類化合物は、前記親水性官能基として、スルホ基、カルボキシル基、及びリン酸基からなる群より選択される少なくとも一種の官能基を有する、請求項１２に記載の試薬組成物。
  15. 　前記キノン類化合物は、下記（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）前記スルホ基は、１－スルホン酸、２－スルホン酸、３－スルホン酸、４－スルホン酸、及び２，７－ジスルホン酸である、
    　（ｂ）前記カルボキシル基は、２－カルボン酸である、及び
    　（ｃ）前記リン酸基は、２－リン酸である、の少なくとも一項目を満たす請求項１４に記載の試薬組成物。
  16. 　前記酸化還元酵素として、グルコース脱水素酵素を含有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  17. 　前記酸化還元酵素に合う補酵素をさらに含有する、請求項１６に記載の試薬組成物。
  18. 　前記酸化還元酵素は、ＰＱＱ依存性酵素又はＦＡＤ依存性を有する、請求項１７に記載の試薬組成物。
  19. 　媒体として水を含有する液体をさらに含有する、請求項１に記載の試薬組成物。
  20. 　液体試料が入るように形成された試料室と、
    　前記試料室内に配置された少なくとも一対の電極と、
    　前記試料室内において、少なくとも前記一対の電極の両方に接するように配置された請求項１に記載の試薬組成物から形成される試薬層と、を有するセンサ。
  21. 　請求項２０に記載のセンサと、
    　前記少なくとも一対の電極間の電流値を測定する測定部と、
    　前記測定部による測定結果に基づいて、前記液体試料中の対象物質の濃度を算出する算出部と、を有するセンサシステム。
  22. 　下記（ａ）～（ｃ）：
    　（ａ）基板上に、少なくとも一対の電極を設けること、
    　（ｂ）基板上に、請求項１に記載の試薬組成物を、前記一対の電極の両方に接触するように塗布すること、及び
    　（ｃ）前記（ｂ）で塗布された試薬組成物を乾燥させること、を含むセンサの製造方法。
  23. 　（ａ）少なくとも電子受容体及び酵素を含む試薬組成物と、液体試料と、を接触させること、
    　（ｂ）上記（ａ）によって生じた電流を検出すること、及び
    　（ｃ）上記（ｂ）の検出結果に基づいて、液体試料中の標的物質の濃度を測定すること、を含み、
    　前記試薬組成物に、請求項１に記載の試薬組成物を用いる、標的物質の濃度測定方法。
     
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