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WO2010150558A1 - 糖ペプチドの合成法 - Google Patents

糖ペプチドの合成法 Download PDF

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Publication number
WO2010150558A1
WO2010150558A1 PCT/JP2010/004248 JP2010004248W WO2010150558A1 WO 2010150558 A1 WO2010150558 A1 WO 2010150558A1 JP 2010004248 W JP2010004248 W JP 2010004248W WO 2010150558 A1 WO2010150558 A1 WO 2010150558A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
group
transferase
peptide
sugar
amino acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/004248
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
西村紳一郎
Original Assignee
国立大学法人北海道大学
塩野義製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人北海道大学, 塩野義製薬株式会社 filed Critical 国立大学法人北海道大学
Publication of WO2010150558A1 publication Critical patent/WO2010150558A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C07K1/061—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents using protecting groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing glycopeptides.
  • Non-Patent Document 1 As canceration progresses, it is well known that the sugar chain structure of mucin glycoproteins on the cell surface changes (see Non-Patent Document 1). Research and development of new therapeutic methods such as antibody drugs and cancer vaccines are underway (see Non-Patent Document 2). Currently, antigens of monoclonal antibodies such as CA15-3 and CA125 that are widely used in clinical settings are also expected to have a specific partial structure of the above mucin glycoprotein. Peptides are a group of target compounds that are extremely important in the drug discovery and medical industries. Although it has been reported that these compounds can be prepared by using organic chemical synthesis methods and enzyme synthesis methods in a complementary manner (see Patent Literature 1 and Non-Patent Literature 3), a plurality of complex sugar chains having different structures are reported.
  • mucin-type glycoproteins are originally biosynthesized by many glycosyltransferase reactions in vivo, and an enzyme that transfers N-acetylgalactosamine, the first sugar, to the hydroxyl groups of serine and threonine present in polypeptide chains ( More than a dozen types of UDP-GalNAc: polypeptide N-acetylgalactosamine transferase, hereinafter abbreviated as ppGalNAcTs) have been discovered.
  • Non-Patent Document 2 Non-Patent Document 4
  • Patent Document 2 discloses a glycosyltransferase in which a sugar chain is added to a peptide using a glycosyltransferase and the sugar chain cannot be introduced with the first glycosyltransferase. Discloses a method of introducing a sugar chain using However, this document is based on the premise that it depends only on the substrate specificity of glycosyltransferase, and by designing an artificially designed glycopeptide by blocking amino acids that can be artificially introduced into a sugar chain. It is not intended to produce effectively.
  • An object of the present invention is to provide a method capable of easily and effectively producing a target designed glycopeptide.
  • the present inventors produce a more complex target glycopeptide by adding a glycosylation to the blocked amino acid using the same or different glycosyltransferase as the first time. As a result, the above-mentioned problems have been solved.
  • the hydroxyl group of any serine residue (Ser) and threonine residue (Thr) contained in the peptide chain is converted to a sugar other than N-acetyl- ⁇ -galactosamine ( ⁇ -GalNAc) in advance.
  • a glycopeptide protected with an alternative (protecting group) or the like is prepared and subjected to a glycosyltransferase using N-acetylgalactosamine transferase (GalNAc transferase; ppGalNAcTs) using the glycopeptide as a substrate, other residues are left.
  • ⁇ -GalNAc can be transferred to Ser and Thr.
  • a sugar other than ⁇ -GalNAc or its substitute (protecting group) contained in the product obtained by the above reaction is hydrolyzed using an enzyme (glycosidase) that selectively cleaves, whereby Ser and Thr.
  • the side chain can be converted to a free hydroxyl group.
  • a GalNAc residue is introduced into the side chains of Ser and Thr in advance by ⁇ -type glycoside bonds.
  • the carbohydrate can be selectively hydrolyzed by ⁇ -hexosaminidase.
  • ⁇ -GalNAc ⁇ - or ⁇ -glucose ( ⁇ -Glc or ⁇ -Glc), ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc), N-acetyl- ⁇ -glucosamine ( ⁇ -GlcNAc), etc. are also ⁇ - or Since it can be selectively cleaved using an enzyme such as ⁇ -glucosidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ -hexosaminidase, it can be used for protection against hydroxyl groups of Ser and Thr.
  • an enzyme such as ⁇ -glucosidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ -hexosaminidase
  • Ser and / or Thr other than the residue can transfer ⁇ -GalNAc by ppGalNAcTs.
  • the modification order of ppGalNAcTs can be changed.
  • ⁇ -GalNAc transferred to the peptide chain can be further extended as a parent nucleus, so that a sugar introduced as a protecting group for Ser and / or Thr side chain or its sugar
  • a sugar introduced as a protecting group for Ser and / or Thr side chain or its sugar Designing a series of enzyme reaction protocols using peptide substrates considering the number, position, and type of substitutes (protecting groups) and ppGalNAcTs, glycosidases, and glycosyltransferases, different sugar chain structures can be selected from any serine structure. • Construction of glycopeptides placed on threonine residues is possible.
  • the permissible range (repertoire) of glycopeptide synthesis by the enzymatic method is greatly expanded, and at the same time, it has an advantage over the conventional method in the throughput of library construction.
  • the search for glycopeptide antigen structures (cancer epitopes) and drug discovery research and development will be accelerated.
  • an industrially useful disease-related glycopeptide library can be provided by controlling the glycosylation position and order of peptide chains and proteins.
  • the present invention provides the following. (1) The following steps: (A) a step of obtaining a protected peptide containing two or more amino acid residues having sugar binding ability, wherein at least one of the amino acid residues having sugar binding ability is protected by a protecting group, At least one other amino acid residue having binding ability is not protected; (B) a step of attaching a modifying group to at least one amino acid residue having a sugar-binding ability that is not protected of the protected peptide obtained in step (A); and (C) obtained in step (B). Deprotecting a protecting group of a protected peptide having a modified group. A method for producing a modified peptide, wherein an amino acid residue having at least one sugar-binding ability is modified with the modifying group.
  • Item 2 The production method according to Item 1, wherein the amino acid residue having sugar binding ability is at least one selected from asparagine, serine, threonine, hydroxyproline, hydroxylysine and tyrosine.
  • Item 3 The method according to Item 1 or 2, wherein the amino acid residue having sugar binding ability is serine or threonine.
  • III Item 2. The method according to any one of Items 1-2 and 2A, wherein the protecting group is at least one substituent selected from the group consisting of a sugar chain, a phosphate group, and a sulfate group.
  • the protecting group is selected from the group consisting of ⁇ -glucose, ⁇ -glucose, ⁇ -galactose, ⁇ -mannose, ⁇ -GlcNAc, ⁇ -Fuc and ⁇ -GalNAc, and their disaccharides and modified sugars, The method according to any one of 1 to 2, 2A or 3.
  • Item 5 The method according to any one of Items 1-2, 2A, and 3-4, wherein the modifying group is a sugar chain, and the step (B) is performed using a glycosyltransferase.
  • the protecting group is a sugar chain
  • the step (A) is carried out by a chemical synthesis method
  • a modifying group is bound using a glycosyltransferase in the step (B)
  • a sugar hydrolase in the step (C) 6.
  • the method according to any one of items 1 to 2, 2A, and 3 to 5, wherein the deprotection reaction is performed using (7)
  • the sugar chain is ⁇ -glucose, ⁇ -glucose, ⁇ -galactose, ⁇ -mannose, N-acetyl- ⁇ -glucosamine, ⁇ -fucose, N-acetyl- ⁇ -galactosamine or galactosyl- ⁇ 1,3-N-acetyl.
  • Galactosamine wherein the sugar hydrolase is ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -mannosidase, ⁇ -hexosaminidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ -hexosaminidase or O-glucosidase, respectively.
  • the glycosyltransferase includes ⁇ 1,4-galactose transferase, ⁇ -1,3-galactose transferase, ⁇ 1,4-galactose transferase, ⁇ 1,3-galactose transferase, ⁇ 1,6-galactose transferase, ⁇ 2, 6-sialyltransferase, ⁇ 1,4-galactose transferase, ceramide galactose transferase, ⁇ 1,2-fucose transferase, ⁇ 1,3-fucose transferase, ⁇ 1,4-fucose transferase, ⁇ 1,6-fucose transferase Enzyme, ⁇ 1,3-N-acetylgalactosamine transferase, ⁇ 1,6-N-acetylgalactosamine transferase, ⁇ 1,4-N-acetyl
  • step (B) is performed by a chemical method, and when the protecting group and the modifying group have a hydroxyl group, the hydroxyl group is protected, and after the step (B) is finished, as the step (B2), 9.
  • (10) The following steps: (D) a step of obtaining a protected peptide comprising 3 or more amino acid residues having sugar binding ability, wherein at least two of the amino acid residues having sugar binding ability are protected by a protecting group, At least one other amino acid residue having binding ability is not protected; (E) a step of attaching a modifying group to at least one amino acid residue having a sugar-binding ability that is not protected of the protected peptide obtained in the step (D); (F) a step of deprotecting one of the protecting groups of the protected peptide having a modifying group obtained in the step (E); (G) Modification of the protected peptide having a modifying group obtained in the step (F) to at least one amino acid residue having sugar-binding ability selected from unprotected amino acid residues having sugar-binding ability A step of bonding a group; and (H) a step of deprotecting another type of the protected peptide having a modifying group obtained in (G), which is different from the one in the step (
  • Item 11 The method according to Item 10, wherein the modifying group in the step (E) is different from the modifying group in the step (G). (12) The step (E) and the step (G) are carried out by a chemical method. When the protecting group and the modifying group have a hydroxyl group, the hydroxyl group is protected, and the step (E) and the step (G), respectively.
  • Item 13 The manufacturing method according to any one of Items 10 to 12, which has at least one of the characteristics of Item 2, 2A or 3 to 9. (14) 14.
  • an objectively designed glycopeptide can be obtained by artificially blocking an amino acid capable of introducing a sugar chain, not depending only on the substrate specificity of glycosyltransferase.
  • An excellent method for producing glycopeptides or glycoproteins has been provided in that they can be produced effectively.
  • FIG. 1 shows a reaction step (a) when glycopeptide synthesis was performed using EA2 peptide having Nr-acetyl- ⁇ -galactosamine ( ⁇ -GalNAc) in Thr7 as a substrate, and matrix-assisted laser desorption / ionization flight time measured in each step. It is the figure which showed the type
  • MALDI-TOFMS type
  • FIG. 1 shows a reaction step (a) when glycopeptide synthesis was performed using EA2 peptide having Nr-acetyl- ⁇ -galactosamine ( ⁇ -GalNAc) in Thr7 as a substrate, and matrix-assisted laser desorption / ionization flight time measured in each step. It is the figure which showed the type
  • C-1) and (c-2) are diagrams showing the ECD-MS / MS spectra measured for two types of products produced by the transglycosylation reaction using ppGalNAcT2.
  • (C-1) is the measurement result for the ⁇ -GalNAc mono-transfer glycopeptide
  • (c-2) is the measurement result for the ⁇ -GalNAc bi-transfer glycopeptide
  • the mono-transfer glycopeptide is Thr11
  • the bi-transfer glycopeptide is Thr2. It was revealed that Thr11 was modified with ⁇ -GalNAc.
  • an asterisk (*) given to T (Thr) indicates that Thr is bound to a carbohydrate.
  • (C-1) and (c-2) are diagrams showing the ECD-MS / MS spectra measured for two types of products produced by the transglycosylation reaction using ppGalNAcT2.
  • FIG. 2 shows a reaction step (a) when EA2 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr7 as a substrate was used as a substrate, and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 1 shows a reaction step (a) when EA2 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr7 as a substrate was used as a substrate, and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 2 shows a reaction step (a) when EA2 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr7 as a substrate was used as a substrate, and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. White circles indicate ⁇ -Man, and white squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 3 shows a reaction step (a) when EA2 peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr7 as a substrate was synthesized and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 3 shows a reaction step (a) when EA2 peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr7 as a substrate was synthesized and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 3 shows a reaction step (a) when EA2 peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr7 as a substrate was synthesized and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. Black circles indicate ⁇ -Gal, and white squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 4 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using the EA2 peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 3 shows a reaction step (a) when EA2 peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr7 as a substrate was synthesized and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 4 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using the E
  • FIG. 4 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using the EA2 peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. The black triangle indicates ⁇ -Fuc, and the white square indicates ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 5 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was carried out using MUC1 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr17 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 4 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using the EA2 peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 5 shows the reaction step (a) when the glycopeptide
  • FIG. 5 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was carried out using MUC1 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr17 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. White circles indicate ⁇ -Man, and white squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 6 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was carried out using MUC1 peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr17 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 5 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was carried out using MUC1 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr17 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 6 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was carried out using MUC1 peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr17 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. Black circles indicate ⁇ -Gal, and white squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 7 shows the reaction step (a) when synthesizing the glycopeptide using MUC1 peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 6 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was carried out using MUC1 peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr17 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 7 shows the reaction step (a) when synthesizing
  • FIG. 7 shows the reaction step (a) when synthesizing the glycopeptide using MUC1 peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 8 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using MUC5AC peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr9 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 7 shows the reaction step (a) when synthesizing the glycopeptide using MUC1 peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 8 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using MUC5AC peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr9 as a
  • FIG. 8 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using MUC5AC peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr9 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. White circles indicate ⁇ -Man, and white squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 9 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using the MUC5AC peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr9 as a substrate, and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 8 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using MUC5AC peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr9 as a substrate and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 9 shows the reaction step (a) when the glycopeptide synthesis was performed using the MUC5AC peptide having ⁇ -galactose ( ⁇ -Gal) in Thr9 as a substrate, and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. Black circles indicate ⁇ -Gal, and white squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 10 shows the reaction step (a) when glycopeptide synthesis was performed using MUC5AC peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr9 as a substrate, and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 10 shows the reaction step (a) when glycopeptide synthesis was performed using MUC5AC peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr9 as a substrate, and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. 10 shows the reaction step (a) when glycopeptide synthesis was performed using MUC5AC peptide having ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr9 as a substrate, and the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step.
  • FIG. The black triangle indicates ⁇ -Fuc, and the white square indicates ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 11 is a diagram showing a reaction process when synthesizing a glycopeptide using an EA2 peptide having no carbohydrate as a substrate and four types of glycopeptides obtained.
  • FIG. 12 shows a reaction step (a) when glycopeptide synthesis was carried out using MUC5AC peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) and N-acetyl- ⁇ -galactosamine ( ⁇ -GalNAc) in Thr7 and Thr11 as substrates, It is the figure which showed the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each process.
  • White circles indicate ⁇ -Man
  • white squares indicate ⁇ -GalNAc
  • black squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 12 shows a reaction step (a) when glycopeptide synthesis was carried out using MUC5AC peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) and N-acetyl- ⁇ -galactosamine ( ⁇ -GalNAc) in Thr7 and Thr11 as substrates, It is the figure which showed the spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each process.
  • White circles indicate ⁇ -Man
  • white squares indicate ⁇ -GalNAc
  • black squares indicate ⁇ -GalNAc.
  • FIG. 13 is a production scheme of a glycopeptide library according to the prior art.
  • FIG. 14 is an example of a production scheme for a glycopeptide library according to the present invention. It is an application example of the present invention.
  • FIG. 16 shows a reaction step (a) when a glycopeptide was synthesized using an EA2 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) and ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 and Thr11 as substrates, respectively. It is the figure which showed the spectrum (b) of the measured MALDI-TOFMS. White circles indicate ⁇ -Man, white squares indicate ⁇ -GalNAc, and black triangles indicate ⁇ -Fuc.
  • FIG. 16 shows a reaction step (a) when a glycopeptide was synthesized using an EA2 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) and ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 and Thr11 as substrates, respectively. It is the figure which showed the spectrum (b) of the measured MALDI-TOFMS. White circles indicate ⁇ -Man, white squares indicate ⁇ -GalNAc, and black triangles indicate ⁇ -Fuc.
  • FIG. 16 shows a reaction step (a) when a glycopeptide was synthesized using an EA2 peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) and ⁇ -fucose ( ⁇ -Fuc) in Thr7 and Thr11 as substrates, respectively. It is the figure which showed the spectrum (b) of the measured MALDI-TOFMS.
  • White circles indicate ⁇ -Man
  • white squares indicate ⁇ -GalNAc
  • black triangles indicate ⁇ -Fuc.
  • FIG. 17 shows a reaction step (a) when a glycopeptide was synthesized using a MUC1-like peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr16 as a substrate, and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step. It is a figure. After transferring the modifying group to the peptide chain by the first enzyme, a glycopeptide having the extended modifying group can be produced by allowing the second enzyme to act.
  • White circles indicate ⁇ -Man
  • white squares indicate ⁇ -GalNAc
  • black diamonds indicate ⁇ -Neu5Ac.
  • FIG. 17 shows a reaction step (a) when a glycopeptide was synthesized using a MUC1-like peptide having ⁇ -mannose ( ⁇ -Man) in Thr16 as a substrate, and a spectrum (b) of MALDI-TOFMS measured in each step. It is a figure. After transferring the modifying group to the peptide chain by the first enzyme, a glycopeptide having the extended modifying group can be produced by allowing the second enzyme to act.
  • White circles indicate ⁇ -Man
  • white squares indicate ⁇ -GalNAc
  • black diamonds indicate ⁇ -Neu5Ac.
  • sugar chain refers to a compound formed by linking one or more unit sugars (monosaccharide and / or a derivative thereof) (therefore, a monosaccharide is also within the range of “sugar chain”).
  • unit sugars monosaccharide and / or a derivative thereof
  • a monosaccharide is also within the range of “sugar chain”.
  • sugar chains include sugars (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and complexes and derivatives thereof) contained in the living body.
  • sugar chains examples include, but are not limited to, a wide range of sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, and glycolipids. Therefore, in the present specification, the sugar chain can be used interchangeably with “sugar”, “sugar”, and “carbohydrate”. Further, unless otherwise specified, the “sugar chain” in the present specification may include both sugar chains and sugar chain-containing substances.
  • n 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 are referred to as diose, triose, tetrose, pentose, hexose, heptose, octose, nonose and decourse, respectively.
  • diose 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10
  • tetrose 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10
  • pentose pentose
  • hexose heptose
  • octose nonose and decourse
  • monosaccharide derivative refers to a substance in which one or more hydroxyl groups on a monosaccharide are substituted with another substituent and the resulting substance is not within the range of the monosaccharide.
  • monosaccharide derivatives include sugars having a carboxyl group (for example, aldonic acids converted to carboxylic acids by oxidation at the C-1 position (for example, D-gluconic acids in which D-glucose is oxidized), terminal Uronic acid in which C atom of carboxylic acid becomes carboxylic acid (D-glucuronic acid in which D-glucose is oxidized), sugar having amino group or amino group derivative (for example, acetylated amino group) (for example, N- Acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine, etc.), sugars having both amino and carboxyl groups (eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid
  • galactose refers to any isomer, but is typically ⁇ -D-galactose, and is used to refer to ⁇ -D-galactose unless otherwise specified.
  • acetylgalactosamine refers to any isomer, but is typically N-acetyl- ⁇ -D-galactosamine, and refers to N-acetyl- ⁇ -D-galactosamine unless otherwise specified. Used as a thing.
  • mannose refers to any isomer, but is typically ⁇ -D-mannose, and is used to refer to ⁇ -D-mannose unless otherwise specified.
  • glucose refers to any isomer, but is typically ⁇ -D-glucose, and is used to refer to ⁇ -D-glucose unless otherwise specified.
  • acetylglucosamine refers to any isomer, typically N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine, and unless otherwise specified, refers to N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine. Used as a thing.
  • fucose refers to any isomer, but is typically ⁇ -L-fucose, and is used to refer to ⁇ -L-fucose unless otherwise specified.
  • acetylneuraminic acid refers to any isomer, but is typically N-acetyl- ⁇ -D-neuraminic acid, and N-acetyl- ⁇ -D-neuraminic unless otherwise specified. Used to refer to acid.
  • ⁇ -D-galactose is ⁇ -Gal; N-acetyl- ⁇ -D-galactosamine is ⁇ -GalNAc; ⁇ -D-mannose is ⁇ -Man; ⁇ -D-glucose is ⁇ -Glc; N-acetyl- ⁇ -D-glucosamine is expressed as ⁇ -GlcNAc; ⁇ -L-fucose as ⁇ -Fuc; N-acetyl- ⁇ -D-neuraminic acid as ⁇ -Neu5Ac and the like.
  • Monosaccharides are generally joined by glycosidic bonds to form disaccharides and polysaccharides.
  • the bond orientation with respect to the plane of the ring is indicated by ⁇ and ⁇ .
  • Specific carbon atoms that form a bond between two carbons are also described.
  • the two cyclic anomers are represented by ⁇ and ⁇ .
  • ⁇ and ⁇ For reasons of display, it may be expressed as a or b. Therefore, in the present specification, ⁇ and a, and ⁇ and b are used interchangeably for the anomeric notation.
  • sugar symbols, designations, abbreviations (Glc, etc.) and the like may differ depending on whether they represent a monosaccharide or when used in a sugar chain.
  • the unit sugar exists in a form in which hydrogen or a hydroxyl group is removed from the other side because dehydration condensation occurs between the unit sugar and another unit sugar to be bound. Therefore, these sugar abbreviations, when used to represent a monosaccharide, have all hydroxyl groups present, but when used in a sugar chain, the hydroxyl groups and the hydroxyl group of the linking sugar are dehydrated. It is understood that only oxygen remains after condensation.
  • the reducing end of the sugar is aminated and can be bound to other components such as albumin via its amine group, in which case the hydroxyl group at the reducing end is an amine group. Note that it has been replaced with.
  • sugar chain-containing substance refers to a substance containing a sugar chain and substances other than sugar chains. Many such sugar chain-containing substances are found in the living body. For example, in addition to polysaccharides contained in the living body, complex polysaccharides such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, glycolipids, etc. Examples include, but are not limited to, a wide range of sugar chains that are decomposed or derived from biomolecules.
  • glycoprotein refers to a protein, polypeptide or peptide containing a sugar chain.
  • glycoproteins include various useful functional proteins such as, but not limited to, enzymes, hormones, cytokines, antibodies, vaccines, receptors, serum proteins and the like.
  • the terms “protein”, “polypeptide”, “oligopeptide” and “peptide” are used interchangeably herein and refer to a polymer of amino acids of any length. This polymer may be linear, branched, or cyclic.
  • the amino acid contained in the polypeptide may be a natural amino acid or a non-natural amino acid, and may be a modified amino acid (for example, an amino acid containing a functional group capable of binding a sugar chain).
  • a modified amino acid for example, an amino acid containing a functional group capable of binding a sugar chain.
  • the term can also encompass one assembled into a complex of multiple polypeptide chains.
  • the term also encompasses natural or artificially modified amino acid polymers. Such modifications include, for example, disulfide bond formation, glycosylation, lipidation, acetylation, phosphorylation or any other manipulation or modification (eg, conjugation with a labeling component).
  • This definition also includes, for example, polypeptides containing one or more analogs of amino acids (eg, including unnatural amino acids, etc.), peptide-like compounds (eg, peptoids) and other modifications known in the art. Is included.
  • amino acid is used in the meaning usually used in the art and refers to an organic compound having a carboxyl group and an amino group.
  • the amino acid may be a natural amino acid or a non-natural amino acid.
  • natural amino acid means the L-isomer of a natural amino acid present in the living body.
  • Natural amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, homoserine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, ⁇ -carboxyglutamic acid, Examples include arginine, ornithine, and lysine. Unless otherwise indicated, all amino acids referred to herein are L-forms, but forms using D-form amino acids are also within the scope of the present invention.
  • the term “unnatural amino acid” refers to an amino acid that is not normally found in proteins in nature.
  • non-natural amino acids examples include norleucine, para-nitrophenylalanine, homophenylalanine, para-fluorophenylalanine, 3-amino-2-benzylpropionic acid, homo-arginine D-form or L-form and D-phenylalanine.
  • an amino acid modified based on a natural amino acid falls within the range of non-natural amino acids if it is not a natural amino acid.
  • Amino acid analog refers to a molecule that is not an amino acid but is similar to the physical properties and / or function of an amino acid. Examples of amino acid analogs include ethionine, canavanine, 2-methylglutamine and the like.
  • Amino acid mimetics refers to chemical compounds that have a structure that is different from the general chemical structure of an amino acid, but that functions in a manner similar to a naturally occurring amino acid. As used herein, amino acid analogs or amino acid mimetics can be used in place of amino acids.
  • Amino acids may be referred to herein by either their commonly known three letter symbols or by the one-letter symbols recommended by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nucleotides may also be referred to by a generally recognized one letter code.
  • amino acid is intended to mean any of “amino acid residue”, “N-terminal amino acid residue”, and “C-terminal amino acid residue” unless otherwise specified.
  • amino acid residue is intended to mean either “N-terminal amino acid residue” or “C-terminal amino acid residue” unless there is a particular intention.
  • amino acid residue having a sugar binding ability refers to an amino acid residue to which a sugar (modifying group) may be transferred by an enzyme, for example, serine that undergoes transfer of GalNAc by ppGalNAcT, Threonine is exemplified.
  • a sugar modifying group
  • it is as follows. (1) the modifying group (sugar) can be transferred (by enzymatic method), (2) the protecting group can be introduced (by chemical method), (3) (by enzymatic method) It is advantageous that only the protecting group can be selectively removed (deprotected), and (4) the protecting group is of a different type from the modifying group.
  • sugars (chains) that bind to these amino acids include N-acetylglucosamine (GlcNAc) for Asn; mannose (Man), N-acetylgalactosamine (GalNAc), GlcNAc, for Ser / Thr.
  • GlcNAc N-acetylglucosamine
  • Man mannose
  • GalNAc N-acetylgalactosamine
  • GlcNAc for Ser / Thr.
  • Xyl (xylose) for Ser
  • Glc for Tyr.
  • protected peptide “protected polypeptide” and “protected protein” are used interchangeably to represent the same concept, and one or more amino acid residues, particularly an amino acid residue having a sugar-binding ability.
  • a polymer of amino acids eg, a peptide
  • Such protection may be any treatment as long as it does not substantially occur at the amino acid residue to be protected when a reaction intended for modification is performed, and preferably a protecting group. This is achieved by binding (for example, a sugar chain different from the sugar chain to be modified).
  • the “protecting group” is used in the same meaning as that usually used in the art, and refers to a group that protects a certain functional group.
  • functional groups for example, amino acid residues
  • the first reagent if there are functional groups (for example, amino acid residues) that do not want to interfere with or change under the conditions, such functional groups are pre-reacted with the first reagent.
  • the first functional group is restored again by the third chemical reaction.
  • the atom or group introduced at this time is called a protecting group. Specific examples of preferred protecting groups are described herein in the examples and elsewhere.
  • halogen I, Br, Cl, F, etc.
  • lower here, typically, C1-C6 is shown, but not limited thereto
  • alkoxy typically, halogen (I, Br, Cl, F, etc.)
  • lower here, typically, C1-C6 is shown, but not limited thereto
  • alkoxy typically, C1-C6 is shown, but not limited thereto
  • alkylthio lower alkylsulfonyloxy
  • An appropriate substituent can be protected by a method known in the art. Examples of such protecting groups include Protective Groups in Organic Synthesis, T., such as ethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl, acetyl, and benzyl.
  • W By Green, John Wiley & Sons Inc. (Second Edition, 1991) and the like can be mentioned.
  • each substituent such as a protecting group can be performed by a known method other than the above production method [for example, Comprehensive Organic Transformations, R.C. C. Larock (1989), etc.] may be used as a target protecting group.
  • the protective group in “protected peptide” or the like it is preferable to use a protective group that does not leave by a reaction (such as an enzyme reaction) that mediates a modifying group. Therefore, a group different from the modifying group is usually used.
  • the protecting group in “protected peptide” include ⁇ -glucose, ⁇ -glucose, ⁇ -galactose, ⁇ -mannose, ⁇ -acetylglucosamine, ⁇ -fucose, ⁇ -acetylgalactosamine or galactosyl- ⁇ 1,3-N-acetyl.
  • Galactosamine is preferred and these are deprotected by ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -mannosidase, ⁇ -hexosaminidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ -hexosaminidase or O-glucosidase, respectively. .
  • “Hydroxyl protecting group” refers to a group that protects a hydroxyl group that can be reacted by the protecting group and the hydroxyl group of the modifying group in the “protecting peptide” or the like upon introduction of the modifying group.
  • protecting groups include acyl-type protecting groups such as acetyl group and benzoyl group, ether-type protecting groups such as benzyl group, methyl group and allyl group, acetal-type protecting groups such as isopropylidene group and benzylidene group, etc. Can be mentioned.
  • the term “unprotected” is used in the same meaning as commonly used in the field, and a protective group or the like is not bound, and the intended reaction (for example, glycosyltransferase) is performed.
  • the state that can be received Usually, a functional group such as —OH (hydroxyl group) is in a state capable of reacting, or in a state capable of being transferred by a glycosyltransferase or the like.
  • a protecting group the hydroxyl group may be further protected.
  • the “modifying group” refers to a target substituent to be bonded to a side chain of an amino acid residue in a peptide or the like, for example, a sugar chain (monosaccharide, polysaccharide, complex sugar, etc.). Take as an example.
  • deprotection means to release the protected state and return to the reactive state, and typically means to remove the protecting group.
  • Methods for deprotection are known in the art, such as “Protective Groups in Organic Synthesis”, Theodora W., et al. With reference to Greene (John Wiley & Sons, Inc., New York, 2nd edition, 1991, etc., it can implement suitably by hydrolysis etc.
  • modified peptide modified polypeptide
  • modified protein refers to a polymer of amino acids (peptide, polypeptide, protein or the like) to which a modifying group is bonded.
  • glycosyltransferase refers to a sugar acceptor such as a protein, carbohydrate, lipid, steroid, alcohol, etc., a sugar donor, that is, a sugar nucleotide or a lipid intermediate (sugar-linked dolichol).
  • a sugar acceptor such as a protein, carbohydrate, lipid, steroid, alcohol, etc.
  • a sugar donor that is, a sugar nucleotide or a lipid intermediate (sugar-linked dolichol).
  • lipid intermediate sucrose-linked dolichol
  • the term refers to those which transfer sugars using peptides or proteins as sugar receptors.
  • the glycosyltransferase that can be used in the present invention can be implemented in consideration of the target glycopeptide.
  • glycosyltransferases in addition to those having the function of transferring sugar chains to amino acid residues having sugar-binding ability, those having the function of sugar chain elongation (functional sugar chain formation), and formation of sugar chains or sugar chains of mother nucleus Those responsible for the function of antigen formation are contemplated in the present invention.
  • the distinction between glycosyltransferases is roughly divided into two types depending on the substrate that is the acceptor in the enzyme reaction. The first one uses a peptide as a substrate, and the other uses a sugar chain (including monosaccharides and disaccharides or more oligosaccharides) contained in a glycopeptide as a substrate. “Those having a sugar chain elongation function” correspond to the latter.
  • the sugar chain structure that is considered to form part of the sugar chain structure is the mother sugar chain, It is a chain antigen and is called a functional sugar chain.
  • Some of the mother sugar chains (basic structures of sugar chains widely present in the living body) and sugar chain antigens (sugar chains known to have antigenicity) have overlapping structures.
  • Gal ⁇ 1 ⁇ 3GalNAc ⁇ 1 ( ⁇ Ser / Thr) is a sugar chain antigen known as T antigen, although it is a mother sugar chain called core type 1.
  • a functional sugar chain refers to a sugar chain structure other than the mother nucleus sugar chain, such as a polylactosamine sugar chain that acts as a ligand that binds to a lectin, and that is known to exhibit certain activities and functions.
  • some functional sugar chains and sugar chain antigens have overlapping structures, and examples thereof include sialyl Lewis X antigen having a tetrasaccharide structure. Specific examples of such glycosyltransferases are described in detail herein in the Examples and elsewhere. It is understood that the present invention can be synthesized for any of these types.
  • the “chemical synthesis method” means that a substance is produced by a chemical reaction, and particularly in the present invention, a peptide or a peptide to which a protecting group is bonded is produced by a chemical reaction.
  • Examples of chemical synthesis methods of peptides that can be used in the present invention include liquid phase synthesis and solid phase synthesis. Specific examples of preferred ones that can be used in the present invention are described herein in the Examples and elsewhere.
  • sucrose hydrolase is an enzyme that releases sugar from a substance to which sugar is bound.
  • Enzyme particularly EC. 3.2.1. Glycoside-binding hydrolase or sugar hydrolase. Specific examples of preferred ones that can be used in the present invention are described herein in the Examples and elsewhere.
  • deprotection reaction refers to a reaction for removing a protecting group.
  • the protecting group is a sugar chain, it can be carried out by a biochemical reaction using a sugar hydrolase or the like.
  • library refers to a group including a plurality of similar members within a certain category.
  • a library of glycopeptides refers to a population of multiple, preferably different types of glycopeptides.
  • an amino acid having sugar chain binding ability is typically amino acid having sugar chain binding ability
  • R 1 is in which hydrogen is taken one from the side chain of an amino acid
  • R 2 represents a hydroxyl group, -OR 7, a -NR 8 R 9 or a protecting group
  • R 3 ⁇ R 4 and R 6 are each independently a modifying group such as a protecting group, hydrogen, or a fluorescent group (for example, fluorescent (for detection) or biotin (for binding with avidin or the like) PEG chain (water-soluble) at the N-terminus of the peptide.
  • R 5 represents a group capable of binding to a sugar chain
  • R 7 to R 9 are each independently hydrogen
  • It represents a modifying group such as a protecting group or a fluorescent group.
  • the side chain of an amino acid refers to a group corresponding to R when the amino acid is represented by RCH (NH 2 ) COOH.
  • the amino acid is represented by R a R b CH (NH) COOH (R a and R b are arbitrary groups, and may form a cyclic group together).
  • Contains imino acid Therefore, in the case of imino acid, a group corresponding to R a or R b or both can correspond to a side chain.
  • Examples of individual amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, serine, homoserine, methionine, threonine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, cysteine, proline, histidine, aspartic acid, asparagine, glutamic acid, glutamine, Examples include, but are not limited to, ⁇ -carboxyglutamic acid, arginine, ornithine, and lysine.
  • R 1 may mean a single bond.
  • R 2 to R 4 and R 6 are each independently hydrogen (when not protected), or Fmoc group, acetyl group, benzyl group, benzoyl group, t-butoxycarbonyl group, t-butyl.
  • an oxycarbonyl group is attached as a linker. This is because the oxycarbonyl group intervenes to facilitate the linkage with the amino group.
  • R 5 may be an aminooxy group, an N-alkylaminooxy group, a hydrazide group, an azide group, a thiosemicarbazide group, a cysteine residue, or the like.
  • amino acid having sugar chain binding ability examples include, for example, asparagine (Asn), serine (Ser), threonine (Thr), hydroxyproline (Hyp), hydroxylysine and tyrosine (Tyr). .
  • Ser serine
  • Thr threonine
  • Hyp hydroxyproline
  • Tr hydroxylysine
  • Tyr tyrosine
  • serine (Ser) and threonine (Thr) are preferable.
  • the present invention relates to pharmaceuticals (eg, pharmaceuticals such as vaccines, health foods, residual proteins or lipids having reduced antigenicity) and cosmetics.
  • the medicament and cosmetic may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier and the like.
  • the pharmaceutically acceptable carrier contained in the medicament of the present invention include any substance known in the art.
  • Such suitable formulation materials or pharmaceutically acceptable carriers include antioxidants, preservatives, colorants, flavors, and diluents, emulsifiers, suspending agents, solvents, fillers, bulking agents, buffers. Include, but are not limited to, agents, delivery vehicles, diluents, excipients and / or pharmaceutical adjuvants.
  • the medicament of the present invention is a composition comprising isolated pluripotent stem cells, or a variant or derivative thereof, together with one or more physiologically acceptable carriers, excipients or diluents. It is administered in the form of
  • a suitable vehicle can be water for injection, physiological solution, or artificial cerebrospinal fluid, which can be supplemented with other materials common to compositions for parenteral delivery. .
  • Acceptable carriers, excipients or stabilizers used herein are non-toxic to the recipient and are preferably inert at the dosages and concentrations used and Including: phosphate, citrate, or other organic acids; ascorbic acid, ⁇ -tocopherol; low molecular weight polypeptide; protein (eg, serum albumin, gelatin or immunoglobulin); hydrophilic polymer (eg, polyvinyl Pyrrolidone); amino acids (eg, glycine, glutamine, asparagine, arginine or lysine); monosaccharides, disaccharides and other carbohydrates (including glucose, mannose, or dextrin); chelating agents (eg, EDTA); sugar alcohols (eg, EDTA) Mannitol or sorbitol ); Salt-forming counterions (such as sodium); and / or non-ionic surface-active agents (e.g., Tween, Pluronic (pluronic) or polyethylene glycol (PEG)).
  • Exemplary suitable carriers include neutral buffered saline or saline mixed with serum albumin.
  • the product is formulated as a lyophilizer using a suitable excipient (eg, sucrose).
  • suitable excipient eg, sucrose
  • Other standard carriers, diluents and excipients may be included as desired.
  • Other exemplary compositions include a pH 7.0-8.5 Tris buffer or a pH 4.0-5.5 acetate buffer, which may further include sorbitol or a suitable replacement thereof. .
  • the medicament of the present invention can be administered orally or parenterally.
  • the medicament of the present invention can be administered intravenously or subcutaneously.
  • the medicament used in the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable aqueous solution free of pyrogens.
  • a pharmaceutically acceptable composition can be easily prepared by those skilled in the art by considering pH, isotonicity, stability and the like.
  • the administration method includes oral administration, parenteral administration (for example, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, mucosal administration, intrarectal administration, intravaginal administration, local administration to the affected area, Skin administration, etc.).
  • Formulations for such administration can be provided in any dosage form. Examples of such a pharmaceutical form include a liquid, an injection, and a sustained release agent.
  • the medicament of the present invention may be a physiologically acceptable carrier, excipient or stabilizer (Japanese Pharmacopoeia 15th edition or its latest edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, AR, as required. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990, etc.) can be prepared and stored in the form of a lyophilized cake or aqueous solution by mixing a sugar chain composition having a desired degree of purity.
  • the amount of the glycan composition used in the treatment method of the present invention takes into consideration the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, cell morphology or type, etc. Thus, it can be easily determined by those skilled in the art.
  • the frequency with which the treatment method of the present invention is applied to a subject (or patient) also depends on the purpose of use, target disease (type, severity, etc.), patient age, weight, sex, medical history, treatment course, etc. In view of this, it can be easily determined by those skilled in the art. Examples of the frequency include administration every day—once every several months (for example, once a week—once a month). It is preferable to administer once a week to once a month while observing the course.
  • the cosmetic can be prepared while complying with regulations stipulated by the authorities.
  • composition of the present invention can also be used as an agrochemical component.
  • agrochemical component When formulated as an agrochemical composition, it may contain agriculturally acceptable carriers, excipients, stabilizers and the like, if desired.
  • composition of the present invention when used as an agrochemical, herbicide (such as pyrazolate), insecticide / acaricide (such as diazinon), fungicide (such as probenazole), plant growth regulator (eg, paclobutrazole) ), Nematicides (eg, benomyl), synergists (eg, piperonyl butoxide), attractants (eg, eugenol), repellents (eg, creosote), pigments (eg, , Food Blue No. 1, etc.), fertilizers (eg, urea, etc.), etc. can also be mixed as required.
  • herbicide such as pyrazolate
  • insecticide / acaricide such as diazinon
  • fungicide such as probenazole
  • plant growth regulator eg, paclobutrazole
  • Nematicides eg, benomyl
  • synergists eg, piperonyl butoxide
  • attractants eg,
  • the present invention can also be used in the health / food field.
  • the points to be noted when used as an oral medicine as described above should be considered as necessary.
  • the sugar chain composition of the present invention can also be used as a low allergen food.
  • the present invention provides the following step: (A) a step of obtaining a protected peptide containing two or more amino acid residues having sugar binding ability, and at least one of the amino acid residues having sugar binding ability One of the amino acid residues having a sugar-binding ability is protected by a protecting group, and at least one other amino acid residue is not protected; (B) of the protected peptide obtained in the step (A); A step of attaching a modifying group to an unprotected amino acid residue having at least one sugar-binding ability; and a step of deprotecting the protecting group of the protected peptide having the modifying group obtained in steps (C) and (B).
  • an amino acid to which a sugar is added is bound to a sugar different from a sugar introduced in advance by a glycosyltransferase or an alternative thereof (protecting group, preferably a monosaccharide).
  • protecting group preferably a monosaccharide
  • sugar chain introduction by sugar transfer reaction is blocked, the target sugar chain (including monosaccharide) is added to the amino acid at the target location, and then the sugar or substitute (blocking) introduced to block Group) is selectively removed by hydrolysis or the like.
  • step (A) a step of obtaining a protected peptide containing two or more amino acid residues having sugar binding ability is performed.
  • the protected peptide produced in this step at least one of the amino acid residues having sugar binding ability is protected by a protecting group, and at least one of the other amino acid residues having sugar binding ability is protected. Is not protected.
  • the protecting group is a sugar other than the modifying group, and the hydroxyl group is protected (for example, an acyl type such as an acetyl group or a benzoyl group).
  • a protecting group such as a benzyl group, a methyl group or an allyl group, or an acetal-type protecting group such as an isopropylidene group or a benzylidene group).
  • a protective peptide can be synthesized by any appropriate method, and can be performed, for example, by chemical synthesis (for example, peptide solid phase synthesis) or enzymatic method.
  • chemical synthesis for example, peptide solid phase synthesis
  • enzymatic method for peptide synthesis, any method known in the prior art can be used, and the following can be exemplified: liquid phase method, Merrifield method (solid phase method).
  • Merrifield method solid phase method
  • ⁇ -glucose, ⁇ -glucose, ⁇ -mannose, N-acetyl- ⁇ -glucosamine, ⁇ -fucose, N-acetyl- ⁇ -galactosamine and the like can be introduced, but are not limited thereto.
  • step (B) a step of attaching a modifying group to at least one amino acid residue having an unprotected sugar-binding ability of the protected peptide obtained in the step (A).
  • adding a modifying group to the protective peptide means that when the step of introducing the modifying group is performed by a chemical reaction, for example, as a modifying group, any sugar (natural type or non-natural type is not required), and The hydroxyl group is protected (for example, an acyl-type protective group such as an acetyl group or a benzoyl group, an ether-type protective group such as a benzyl group, a methyl group or an allyl group, or an acetal-type protective group such as an isopropylidene group or a benzylidene group).
  • an acyl-type protective group such as an acetyl group or a benzoyl group
  • an ether-type protective group such as a benzyl group, a methyl group or
  • a glycosyltransferase that can use a glycosylation reaction by a chemical method. This is because a desired sugar chain can be specifically transferred to a specific location.
  • Glycosyltransferases ⁇ 1,4-galactosyltransferase, ⁇ -1,3-galactosyltransferase, ⁇ 1,4-galactosetransferase, ⁇ 1,3-galactosyltransferase, ⁇ 1,6-galactosetransferase, ⁇ 2,6- Sialyltransferase, ⁇ 1,4-galactose transferase, ceramide galactose transferase, ⁇ 1,2-fucose transferase, ⁇ 1,3-fucose transferase, ⁇ 1,4-fucose transferase, ⁇ 1,6-fucose transferase, ⁇ 1,3-N-acetylgalactosamine transferase, ⁇ 1,6-N-acetylgalactosamine transferase, ⁇ 1,4-N-acetylgalactosamine transfera
  • 13no. 1 pp. 1R ⁇ 16R, 2003 can include the following: ppGaNTase-T1 (bovine; GenBank number (hereinafter the same): L07780 / L17437) , PpGaNTase-T1 (rat, Rattusnorvegicus U35890), ppGaNTase-T1 (human Homo sapiensX85018), ppGaNTase-T1 (mouse Musmusculus U73820), ppGaNTase-T1 (pig, D85389), ppGaNTase-T2 ((, HomoXspp, human, HomoTs850) -T3 (human, Homo sapiens X92689), ppGaNTase-T3 (mouse, Musmusculus U70538), ppGaNTase-T4 (mouse, Musmuscu lus), ppGaNTa
  • each glycosyltransferase that can be used in the present invention has specificity or preference for the transfer position (eg, Chem. Biol. 2004, 11, 1009-1016), the position of the sugar in the target glycopeptide. Accordingly, those skilled in the art can appropriately determine the binding position and type of the protecting group, and use a suitable glycosyltransferase to produce a glycopeptide having a modifying group at the target position.
  • the protecting group for the hydroxyl group contained in the sugar is removed as necessary in the next step.
  • a method for deprotecting a sugar hydroxyl group include a chemical method (for example, a base treatment such as NaOH / MeOH).
  • step (C) a step of deprotecting the protective group of the protected peptide having the modifying group obtained in the step (B) is performed.
  • a representative example is removal of the protecting group (sugar) (deprotection).
  • a protective group can be selectively removed with a sugar hydrolase. Such selective removal has been achieved for the first time in the present invention, and such a result could not be achieved by the prior art because selective removal was not possible by the chemical method of the prior art. It can be said that.
  • sugar hydrolase corresponding to the protecting group carbohydrate examples include ⁇ -mannosidase, ⁇ -hexosaminidase, ⁇ -fucosidase, ⁇ - / ⁇ -glucosidase, and the like. Depending on the protecting group, those skilled in the art can select as appropriate.
  • the following table can be given as an example of a combination of a protecting group and a sugar hydrolase (used in deprotection).
  • the chemical synthesis method and the novel glycopeptide synthesis method have a complementary relationship. That is, in the chemical synthesis method, GalNAc is introduced into an amino acid residue (Ser / Thr residue etc.) having an arbitrary sugar binding ability. On the other hand, in the synthesis method of the present invention, an arbitrary sugar binding ability is obtained.
  • any peptide substrate can be used in which the side chain of an amino acid residue (such as a Ser / Thr residue) is a free hydroxyl group.
  • EA2, MUC1, MUC5Ac, etc. can be used.
  • protecting groups ⁇ -Man, ⁇ -Gal, ⁇ -Fuc and the like can be used.
  • ⁇ -GalNAc or the like can be used as the sugar chain to be transferred.
  • glycopeptides that can be produced using a method of protecting / deprotecting with a sugar can be roughly divided into the following two groups depending on the combination of “modifying group and amino acid residue”. it can.
  • Group 1 Glycopeptides in which the combination of modifying group and amino acid residue is a natural type (eg GalNAc ⁇ 1 ⁇ -Ser / Thr-)
  • Group 2 Glycopeptides where the combination of modifying group and amino acid residue is non-natural (eg Gal ⁇ 1 ⁇ -Asn-) It is understood that any pattern can be applied in the present invention.
  • a preferred embodiment is the case of Group 1, and in this case, since it is usually a natural type and the enzyme can be used, the enzyme can be effectively used for the production of glycopeptide.
  • the amino acid residue having a sugar-binding ability that can be used in the present invention preferably satisfies the following conditions: (1) ⁇ Modified by enzymatic method> 2) ⁇ By chemical method> A protecting group can be introduced. (3) ⁇ By enzymatic method> Only the protecting group can be selectively removed. (4) The protecting group is of a different type from the modifying group. Amino acids satisfying one, preferably two, more preferably three, and most preferably all four are preferred, and specific preferred examples include: asparagine, serine, threonine, hydroxyproline, Hydroxylysine and tyrosine.
  • amino acid residue having sugar binding ability examples include asparagine (Asn), serine (Ser), threonine (Thr), hydroxyproline (Hyp), hydroxylysine and tyrosine.
  • sugars (chains) that bind to these amino acids include N-acetylglucosamine (GlcNAc) for Asn; mannose (Man), N-acetylgalactosamine (GalNAc), GlcNAc, for Ser / Thr.
  • the length of the peptide produced in the present invention can be of any length. That is, a protected peptide can be produced by a chemical synthesis method or a method using an enzyme. In principle, there is no upper limit to the length of a peptide that can be produced by these methods. In reality, it is understood that modified peptides of any length can be produced.
  • a chemical synthesis method one having 100 residues is usually provided, and in order to produce a peptide having more than this, a peptide having 100 residues or more is constructed using a technique called ligation that connects the peptides. be able to.
  • ligation that connects the peptides. be able to.
  • a large number of types are provided as a library, it is preferable to provide them in a single method, and in such a case, a library of modified peptides having a length of up to 100 residues is provided.
  • the addition reaction of a modifying group can be performed from an enzymatic method to a chemical method. It is understood that can be substituted. Preferably, it can be said that it is reasonable to carry out under the conditions of ⁇ > in order to complete the protection peptide ⁇ modification group introduction ⁇ deprotection.
  • the addition reaction of a modifying group is performed by a chemical method, first, after protecting each hydroxyl group of the protecting group (sugar) and the modifying group (sugar) with an acetyl group or the like and chemically adding the modifying group to the peptide, Since the step of removing them may occur, the efficiency may decrease.
  • the modification by the enzyme method does not require these complicated steps, and this is preferable because it is efficient.
  • examples of the protecting group that can be used in the present invention include at least one substituent selected from the group consisting of a sugar chain, a phosphate group, and a sulfate group.
  • a sugar chain is a sugar chain, and it is preferable to use a sugar chain different from the modified chain.
  • the protecting groups utilized in the present invention are ⁇ -glucose, ⁇ -glucose, ⁇ -galactose, ⁇ -mannose, N-acetyl- ⁇ -glucosamine, ⁇ -fucose and N-acetyl- ⁇ -. Examples thereof include galactosamine and disaccharides and modified sugars thereof.
  • the protecting group is a monosaccharide.
  • a monosaccharide such as ⁇ -glucose, ⁇ -glucose, ⁇ -galactose, ⁇ -mannose, N-acetyl- ⁇ -glucosamine, ⁇ -fucose or N-acetyl- ⁇ -galactosamine. It is. This is because it is not necessary to perform a complicated reaction and an easily available enzyme can be used.
  • the modifying group used in the present invention is a sugar chain (monosaccharide, polysaccharide, complex sugar, etc.), and step (B) is performed using a glycosyltransferase.
  • the modifying group is a monosaccharide.
  • the glycosyltransferase used an enzyme capable of transferring a sugar chain corresponding to a target modifying group is used.
  • the protecting group used in the present invention is a sugar chain
  • the step (A) is performed by a chemical synthesis method
  • the modifying group is bound using a glycosyltransferase in the step (B)
  • step C the present invention can be carried out by performing a deprotection reaction using a sugar hydrolase.
  • the sugar chain used as a protecting group in the present invention includes ⁇ -glucose, ⁇ -glucose, ⁇ -galactose, ⁇ -mannose, N-acetyl- ⁇ -glucosamine, ⁇ -fucose and N- Acetyl- ⁇ -galactosamine, disaccharide, and the like can be used.
  • ⁇ -glucosidase As the sugar hydrolase used in the present invention, ⁇ -glucosidase, ⁇ -glucosidase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -mannosidase, ⁇ -hexosa, respectively Minidases, ⁇ -fucosidase and ⁇ -hexosaminidase and O-glucosidase can be used.
  • the glycosyltransferase used in the present invention is ⁇ 1,4-galactosyltransferase, ⁇ -1,3-galactosyltransferase, ⁇ 1,4-galactosetransferase, ⁇ 1,3-galactosetransferase, ⁇ 1,6-galactosyltransferase, ⁇ 2,6-sialyltransferase, ⁇ 1,4-galactosetransferase, ceramide galactosetransferase, ⁇ 1,2-fucosetransferase, ⁇ 1,3-fucosetransferase, ⁇ 1,4- Fucose transferase, ⁇ 1,6-fucose transferase, ⁇ 1,3-N-acetylgalactosamine transferase, ⁇ 1,6-N-acetylgalactosamine transferase, ⁇ 1,1,4-
  • the step (B) is performed by a chemical method, and when the protecting group and the modifying group have a hydroxyl group, the hydroxyl group is protected, and after the completion of the step (B), the step (B2)
  • the present invention can be carried out by performing a deprotection step of the hydroxyl group.
  • Such a method for transferring a modifying group by a so-called chemical method has a low specificity when a sugar chain is used as a protecting group and a modifying group, and therefore it is preferable to further protect them with an acetyl group or the like. .
  • a group 2 non-natural bond can be technically produced by replacing the method using an enzyme with a chemical method. This will be specifically described below.
  • step (A) in the step of producing a protected peptide, a protecting group: a sugar other than the modifying group, Is preferably protected (for example, acetyl group).
  • a protecting group for example, a sugar other than the modifying group, Is preferably protected (for example, acetyl group).
  • chemical synthesis for example, peptide solid-phase synthesis
  • the modifying group is any sugar (both natural and non-natural types can be used), and the hydroxyl group is protected.
  • an acetyl group can be used.
  • a glycosylation reaction by a chemical method or the like can be used. Such chemical methods can be carried out with reference to the following: for example, glycosylation method using halogenated sugar, glycosylation method using trichloroacetimidate, glycosylation method using acetylated sugar, thiosaccharide And the like.
  • the protecting group and the modifying group can be deprotected by performing the following step after step (B). . That is, when a sugar is used as a protecting group and a modifying group, the hydroxyl protecting group contained in the sugar is removed. Examples of such a method for deprotecting a sugar hydroxyl group include a chemical method (for example, a reaction using sodium methoxide or anhydrous ammonia in methanol).
  • a protecting group for example, sugar, phosphate group
  • a method for deprotecting such a protected peptide is not limited thereto, although the protective group can be selectively removed by a sugar hydrolase.
  • a disaccharide (Gal ⁇ 1-3GalNAc) is chemically introduced into the peptide chain as a protecting group, and O-glycanase (O-glycosidase) (activity that specifically recognizes and cleaves this disaccharide). ) Can be deprotected.
  • a combination of the modifying group GalNAc and the protecting group Gal ⁇ 1-3GalNAc can also be used.
  • the technology using such a disaccharide is a combination of various protective groups (monosaccharides) in constructing a single protected peptide, and there are no longer any monosaccharide candidates as protective groups. Is particularly effective.
  • it can also be used when GalNAc is added as a modifying group and then further modified with a glycosyltransferase (sialyltransferase etc.) based on GalNAc.
  • Modifying group N-acetyl- ⁇ -galactosamine modifying group introduction enzyme: polypeptide N-acetylgalactosamine transferase protecting group: galactosyl- ⁇ 1,3-N-acetylgalactosamine deprotecting enzyme: O-glycosidase.
  • glycosyltransferases Such types of glycosyltransferases, glycosyl hydrolases, protecting groups, modifying groups, etc. are one of those that those skilled in the art appropriately incorporate into the production method depending on the design, production efficiency, cost, etc. of the glycopeptide to be produced. From this it is understood that any technique can be used.
  • the present invention provides a method for producing a glycopeptide, glycopolypeptide or glycoprotein into which two or more kinds of modifying groups are freely introduced. That is, the present invention provides a method for producing a modified peptide in which at least two amino acid residues having sugar-binding ability are modified with a modifying group.
  • Such a method of the present invention is a step of (D) obtaining a protected peptide containing 3 or more amino acid residues having sugar binding ability, wherein at least two of the amino acid residues having sugar binding ability are protected. An amino acid residue that is protected by a group, and at least one other amino acid residue having the sugar-binding ability is not protected; the steps; (E) and (D) the protected peptide obtained in steps (D) is not protected; A step of attaching a modifying group to at least one amino acid residue having a sugar-binding ability; a step of deprotecting one of the protecting groups of the protected peptide having a modifying group obtained in steps (F) and (E) (G) at least one amino acid residue having a sugar binding ability selected from amino acid residues having a sugar binding ability of the protected peptide having a modifying group obtained in the step (F); Bound modifying group It encompasses and (H) deprotecting the another kind different from the ones of the protecting group of the protected peptide having a
  • the modifying group in step (E) and the modifying group in step (G) may be the same or different.
  • different modifying groups are used, glycopeptides into which a plurality of types of modifying groups are introduced are produced.
  • any specific embodiment described in (Method of introducing a single modifying group) is used alone. Or they can be applied in combination.
  • the method may further include a step of attaching a modifying group to at least one amino acid residue having a sugar binding ability that is not protected.
  • a process provides a method for producing a glycopeptide having a variety of modification groups.
  • the present invention provides a method of producing a library of peptides with attached modifying groups.
  • This method is a method for producing a modified peptide in which at least one amino acid residue having sugar binding ability of the present invention is modified with the modifying group, or at least two amino acid residues having sugar binding ability are modified with a modifying group. This can be realized by including the step of carrying out the method for producing the modified peptide one or more times.
  • the prior art will be described with reference to FIG.
  • a method for synthesizing eight types of glycopeptides in the prior art is described.
  • a solid phase synthesis method using a peptide synthesis resin in the figure, a resin carrying an amino acid in which an amino group is protected by a protecting group (PG) is illustrated. It is necessary to elongate the peptide chain and bind a sugar (protecting group) to an appropriate amino acid (amino acid having a sugar binding ability).
  • PG protecting group
  • 8 batches are necessary and complicated.
  • glycopeptides can be produced using one type of synthetic substrate. That is, in this example, as shown in the left column, a protected peptide (denoted as a substrate in the figure) in which two different types of protecting groups are introduced into a PG-amino acid (PG is an amino acid protecting group) is provided. In Step 1, this is divided into two groups, and a group in which a glycosyltransferase that mediates glycosyltransferase to mediate amino acid having the first sugar-binding ability is reacted and a group that is not treated are prepared.
  • PG an amino acid protecting group
  • step 2 a group in which hydrolase A (which hydrolyzes black circles) and hydrolase B (which hydrolyzes gray) is made to act on the glycosyltransferase-treated group (top). .
  • hydrolase A which hydrolyzes black circles
  • hydrolase B which hydrolyzes gray
  • a group in which both degradation enzymes A and B are allowed to act is created.
  • step 3 a group in which a glycosyltransferase is allowed to act and a group in which the glycosyltransferase is allowed to act are separately prepared for each group.
  • hydrolase B is allowed to act in step 4, and in the step 2, hydrolase B is allowed to act on the group that is subject to hydrolase B in step 2. Act.
  • three types of amino acids having sugar-binding ability at three positions are produced at once: three types, two types, two types, one type three, and one type non-bonded. be able to.
  • FIG. 1 a schematic diagram when the present invention is implemented with a combination of ppGalNAcT and other glycosyltransferases is shown in FIG.
  • a protected peptide into which two types of protecting groups have been introduced is prepared as in FIG. Thereafter, in step 1, saccharide is introduced using ppGalNAcT as glycosyltransferase 1. Thereafter, in Step 2, one of the protecting groups is removed using hydrolase A. Next, when going to step 3 with the arrow on the right side, the same enzyme is treated as glycosyltransferase 1. When this is treated with hydrolase B toward the right side, a glycopeptide having two modified right and left ends is provided.
  • step 2 when treated with glycosyltransferase 2 (for example, SiaT), sugar is further introduced at the site where sugar was introduced with ppGalNAcT, and the sugar chain is elongated.
  • step 3 when performing step 3 and step 4, in step 3, a group treated with glycosyltransferase 1 and a group not treated are created.
  • step 5 by creating a group in which the glycosyltransferase 1 is allowed to act and a group in which the glycosyltransferase 1 is not acted on the group into which the glycosyltransferase has been introduced, the group to which the modifying group is bound is not bound.
  • Step 4 and Step 5 by creating a group that acts and does not act on glycosyltransferase 1, the extended sugar is bound to the left end and the right end, and the amino acid having sugar-binding ability therein is modified. Can produce what is not.
  • examples of the glycosyltransferase that can be used in the sugar chain elongation reaction include ⁇ 1,3-FucT, ⁇ 2,6-SiaT, ⁇ 2,3-SiaT, ⁇ 1,3-GlcNAcT, and ⁇ 1,4-GalT. be able to.
  • ST6GalNAc-III / IV ST, d (ST)
  • ST6GalNAc-I STn
  • C2Gn-T3 Core2
  • C2 / 4Gn-T are those responsible for the functions of mother nucleus sugar chain formation or sugar chain antigen formation.
  • (Core2, 4) C2Gn-T1 (Core2), C1Gal-T1 (Core1), and the like.
  • glycosyltransferase reactions the following are known for the formation of mother sugar chains and sugar chain antigens.
  • Most of the mucin sugar chains are linked to the core protein by ⁇ -O-glycosidic linkages through the linkage of N-acetylgalactosamine with serine and threonine hydroxyl groups.
  • N-acetylgalactosamine fucose, galactose, N-acetylglucosamine, and sialic acid are found in mucin, but the mother sugar chain (mother nucleus region) is directly linked to N-acetylgalactosamine. It consists of sugar.
  • an antigenic sugar chain represented by a cancer-related sugar chain antigen is referred to as a sugar chain antigen.
  • a sugar chain antigen Those having antigenicity to peripheral sugar chains as typified by blood group antigens, mother nucleus structures such as Tn and T, and sialyl Tn, sialyl T, sialyl Lewis A antigen and isomers thereof having sialic acid bound thereto
  • An antigen such as sialyl Lewis X antigen is exemplified.
  • the present invention is also used in the production of glycopeptides used in glycosyltransferases used for the formation of mother sugar chains and sugar antigens.
  • the present invention also provides a method for producing a modified peptide in which at least one amino acid residue having sugar binding ability of the present invention is modified with the modifying group, or at least two amino acid residues having sugar binding ability.
  • amino acid residues may be expressed in the form of an abbreviation with the amino acid position appended.
  • Thr9 means the 9th threonine.
  • Glucosyl transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -GalNAc-added EA2 peptide A chemically synthesized ⁇ -GalNAc-added EA2 peptide (PTTDST T PAPTK (SEQ ID NO: 2), ⁇ -GalNAc added to the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a glycosyltransferase reaction using ppGalNAcT2. The reaction was performed under a constant temperature condition of 37 ° C.
  • a synthetic EA2 peptide (PTTDST T PAPTK (SEQ ID NO: 3), with ⁇ -Man added to the underlined portion) obtained by adding an ⁇ -Man residue in advance to Thr7 as a substrate, followed by a transglycosylation reaction using ppGalNAcT2, followed by Jack bean.
  • the glycopeptide was obtained by subjecting to ⁇ -Man residue hydrolysis using ⁇ -mannosidase. The reaction process is shown in FIG.
  • Glucose transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Man-added EA2 peptide A chemically synthesized ⁇ -Man-added EA2 peptide (PTTDST T PAPTK (SEQ ID NO: 3), ⁇ -Man added to the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a transglycosylation reaction using ppGalNAcT2.
  • the reaction was carried out using a total of 80 ⁇ l of a solution containing 125 ⁇ M substrate, 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 125 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 under constant temperature conditions of 37 ° C. After the reaction for 6 hours, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme to stop the transglycosylation reaction. The product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the middle part of FIG.
  • the enzyme reaction product was concentrated to dryness under reduced pressure, and 30 ⁇ l of 150 mM sodium citrate buffer (pH 4.5) was added to completely dissolve the residue to obtain a substrate solution. After adding ZnCl 2 to the substrate solution to 50 mM and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, 5 ⁇ l of Jack bean ⁇ -mannosidase (20 mU) was added and reacted at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the lower part of FIG. A molecular weight peak from which the ⁇ -Man residue was removed appeared, and it was shown that ⁇ -Man can be removed from the aforementioned glycopeptide using Jack bean ⁇ -mannosidase.
  • Glucose transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Gal-added EA2 peptide A chemically synthesized ⁇ -Gal-added EA2 peptide (PTTDST T PAPTTK (SEQ ID NO: 4), ⁇ -Gal added to the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a glycosyltransferase reaction using ppGalNAcT2.
  • the reaction uses 125 ⁇ M substrate and 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 125 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2) in a total of 80 ⁇ l under a constant temperature of 37 ° C. Carried out. After the reaction for 6 hours, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to deactivate the enzyme, and the reaction was stopped. The product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the middle part of FIG.
  • Glucose transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Fuc-added EA2 peptide A chemically synthesized ⁇ -Fuc-added EA2 peptide (PTTDST T PAPTK (SEQ ID NO: 5), ⁇ -Fuc substituted in the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a glycosyltransferase reaction using ppGalNAcT2.
  • the reaction was carried out using a total of 40 ⁇ l of a solution containing 500 ⁇ M substrate and 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 500 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 at 37 ° C. under constant temperature conditions. After 6 hours, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme and the reaction was stopped. The product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the middle part of FIG.
  • a synthetic MUC1 peptide (AHGVTSAPPDTRPAPS T APP (SEQ ID NO: 7), with ⁇ -Man added to the underlined portion) obtained by adding an ⁇ -Man residue in advance to Thr17 as a substrate, followed by a sugar transfer reaction using ppGalNAcT2, followed by ⁇ -
  • the glycopeptide was obtained by subjecting it to a hydrolysis reaction of Man residues. The reaction process is shown in FIG.
  • Glucose transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Man-added MUC1 peptide A chemically synthesized ⁇ -Man-added MUC1 peptide (AHGVTSAPDTRPAPPS T APP (SEQ ID NO: 7), ⁇ -Man added to the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a transglycosylation reaction using ppGalNAcT2.
  • the reaction was carried out using a total of 80 ⁇ l of a solution containing 125 ⁇ M substrate and 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 125 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 at a constant temperature of 37 ° C. .
  • 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme to stop the transglycosylation reaction.
  • the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the middle part of FIG.
  • the enzyme reaction product was concentrated to dryness under reduced pressure, and 30 ⁇ l of 150 mM sodium citrate buffer (pH 4.5) was added to completely dissolve the residue to obtain a substrate solution. After adding ZnCl 2 to the substrate solution to 50 mM and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, 5 ⁇ l of Jack bean ⁇ -mannosidase (20 mU) was added and reacted at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the lower part of FIG. A molecular weight peak from which the ⁇ -Man residue was removed appeared, and it was shown that ⁇ -Man can be removed from the aforementioned glycopeptide using Jack bean ⁇ -mannosidase.
  • Example B2 Synthetic MUC1 peptide (AHGVTSAPPDTRPAPS T APP (SEQ ID NO: 8), ⁇ -Gal added to underlined portion) with ⁇ -Gal residue added to Thr17 in advance, as a substrate, glycation reaction using ppGalNAcT2, followed by Aspergillus niger ⁇ -Glycopeptides in which ⁇ -GalNAc was introduced into serine / threonine residues other than Thr17 were subjected to hydrolysis reaction of ⁇ -Gal residues using galactosidase. The reaction process is shown in FIG.
  • Glucosyl transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Gal-added MUC1 peptide A chemically synthesized ⁇ -Gal-added MUC1 peptide (AHGVTSAPDTRPAPPS T APP (SEQ ID NO: 8), ⁇ -Gal added to the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a transglycosylation reaction using ppGalNAcT2. The reaction was carried out under a constant temperature of 37 ° C.
  • the reaction was carried out using a total of 80 ⁇ l of a solution containing 500 ⁇ M substrate and 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 500 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 at a constant temperature of 37 ° C. After 6 hours, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme and the reaction was stopped. The product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the middle part of FIG.
  • a glycosyltransferase using ppGalNAcT2 with a synthetic MUC5AC peptide GTTPSPVP T TSTSAP (SEQ ID NO: 11), with ⁇ -Man added to the underlined portion) added with an ⁇ -Man residue in advance to Thr9 as a substrate
  • GTTPSPVP T TSTSAP synthetic MUC5AC peptide
  • the reaction was carried out using a total of 80 ⁇ l of a solution containing 125 ⁇ M substrate, 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 125 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 under constant temperature conditions of 37 ° C. After the reaction for 6 hours, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme to stop the transglycosylation reaction. The product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the middle part of FIG.
  • Serum and threonine residues other than Thr9 can be obtained by using a MUC5AC peptide with ⁇ -Man added as a molecular weight peak, where ⁇ -GalNAc residues are transferred to the peptide chain at one, two, or three positions. It was shown that a glycopeptide introduced with ⁇ -GalNAc can be prepared.
  • the enzyme reaction product was concentrated to dryness under reduced pressure, and 30 ⁇ l of 150 mM sodium citrate buffer (pH 4.5) was added to completely dissolve the residue to obtain a substrate solution. After adding ZnCl 2 to the substrate solution to 50 mM and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, 5 ⁇ l of Jack bean ⁇ -mannosidase (20 mU) was added and reacted at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the lower part of FIG. A molecular weight peak from which the ⁇ -Man residue was removed appeared, indicating that Jack bean ⁇ -mannosidase can be used to remove ⁇ -Man from the resulting glycopeptide.
  • Example C2 Synthetic MUC5AC peptide (GTTPSPVP T TSTSAP (SEQ ID NO: 12), ⁇ -Gal added to the underlined portion) with a ⁇ -Gal residue previously added to Thr9 as a substrate, glycation reaction using ppGalNAcT2, followed by Aspergillus niger ⁇ -Glycopeptides in which ⁇ -GalNAc was introduced into serine / threonine residues other than Thr9 were subjected to hydrolysis reaction of ⁇ -Gal residues using galactosidase. The reaction process is shown in FIG.
  • Glucose transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Gal-added MUC5AC peptide A chemically synthesized ⁇ -Gal-added MUC5AC peptide (GTTPSPVP T TSTSAP (SEQ ID NO: 12), ⁇ -Gal added to the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a transglycosylation reaction using ppGalNAcT2. The reaction was performed under constant temperature conditions of 37 ° C.
  • Glucose transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Fuc-added MUC5AC peptide A chemically synthesized ⁇ -Fuc-added MUC5AC peptide (GTTPSPVP T TSTSAP (SEQ ID NO: 13), ⁇ -Fuc substituted in the underlined portion) was used as a substrate and subjected to a glycosyltransferase reaction using ppGalNAcT2. The reaction was carried out at a constant temperature of 37 ° C.
  • Example D1 When the EA2 peptide (PTTDSTTPAPTTK (SEQ ID NO: 1)) is used as a substrate for the transglycosylation with ppGalNAcT2, ⁇ -GalNAc is first transferred in preference to the 7th threonine (Thr7) from the N-terminal side (non-patented).
  • References 4 and 5 when the reaction is carried out using a large excess of sugar donor, the second, third and fourth ⁇ -GalNAc transitions occur in the order of Thr11, Thr2 and Thr3. Discovered ( Figure 11).
  • ppGalNAcT2 a glycopeptide in which ⁇ -GalNAc is preferentially transferred to serine / threonine residues other than Thr7 and Thr11 cannot be obtained. Therefore, a synthetic EA2 peptide (PTTDST T 7 PAP T 11 TK (SEQ ID NO: 14)) in which ⁇ -Man residue and ⁇ -GalNAc residue (stereoisomer of ⁇ -GalNAc which is a natural type) are added in advance to Thr7 and Thr11, respectively.
  • PTTDST T 7 PAP T 11 TK SEQ ID NO: 14
  • the reaction was carried out using a total of 80 ⁇ l of a solution containing 125 ⁇ M substrate, 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 125 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 under constant temperature conditions of 37 ° C. After the reaction for 6 hours, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme to stop the transglycosylation reaction. The product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the second stage of FIG. A molecular weight peak in which the ⁇ -GalNAc residue is transferred to the peptide chain at one position appears.
  • the reaction was carried out using a total of 80 ⁇ l of a solution containing 125 ⁇ M substrate, 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer pH 7.5, 125 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 under constant temperature conditions of 37 ° C. After the reaction for 6 hours, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme to stop the transglycosylation reaction. The product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the second stage of FIG. A molecular weight peak in which the ⁇ -GalNAc residue is transferred to the peptide chain at one position appears.
  • the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the fourth row of FIG. A molecular weight peak in which the ⁇ -GalNAc residue is transferred to one peptide chain appears, and ⁇ -GalNAc is introduced into serine / threonine residues other than Thr11 by using EA2 peptide added with ⁇ -Fuc as a substrate. It was shown that glycopeptides can be prepared.
  • Glucose transfer reaction using ppGalNAcT2 to ⁇ -Man-added MUC1 peptide A chemically synthesized ⁇ -Man-added EA2 peptide (AHGVTSAPDTTRAHGV T 16 SAPD (SEQ ID NO: 52), ⁇ -Man added at [position 16]) was used as a substrate, and subjected to a transglycosylation reaction using ppGalNAcT2.
  • the reaction was performed using a total of 20 ⁇ l of a solution containing 125 ⁇ M substrate, 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 125 ⁇ M UDP-GalNAc, 120 nM ppGalNAcT2 at a constant temperature of 37 ° C. .
  • 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme to stop the transglycosylation reaction.
  • the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the second row of FIG.
  • the enzyme reaction product was purified by reverse phase HPLC, and a peptide having one ⁇ -GalNAc residue introduced therein was used as a substrate for the reaction.
  • the reaction uses a total of 20 ⁇ l of a solution containing 50 ⁇ M substrate, 10 mM MnCl 2 , 100 mM Tris-HCl buffer (pH 6.5), 2.5 mM CMP-NANA, 2.87 ⁇ g ST6GalNAcI, and constant temperature conditions at 20 ° C. Conducted below. After the reaction after 3 days, 160 ⁇ l of acetonitrile was added to inactivate the enzyme to stop the transglycosylation reaction.
  • the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the third row of FIG. A molecular weight peak in which a Neu5Ac residue is transferred to a peptide chain at one position appears, and a sialyl Tn [Neu5Ac ⁇ (2-6) GalNAc ⁇ 1-Thr / in which a Neu5Ac residue is introduced into an ⁇ -GalNAc residue present in the substrate] Ser] -containing glycopeptides have been shown to be prepared.
  • the product was analyzed by MALDI-TOFMS. The results are shown in the fifth row of FIG. A molecular weight peak in which the ⁇ -GalNAc residue is transferred to the peptide chain at one position appears, and sialyl Tn [Neu5Ac ⁇ (2-6) GalNAc ⁇ 1-Thr / Ser] and Tn [GalNAc ⁇ 1-Thr / Ser] antigen structures are mixed. It has been shown that glycopeptides can be prepared.
  • This is a method that allows simple and effective production of the designed glycopeptide, and can be applied in the fields of pharmaceuticals, agricultural chemicals, foods and the like.
  • Sequence number 1 PTTDSTTPAPTTK (EA2 peptide) SEQ ID NO: 2: PTTDST T 7 PAPTTK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 7]) SEQ ID NO: 3: PTTDST T 7 PAPTTK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -Man added at [position 7]) SEQ ID NO: 4: PTTDST T 7 PAPTTK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -Gal added to [position 7]) SEQ ID NO: 5: PTTDST T 7 PAPTTK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -Fuc added to [position 7]) Sequence number 6: AHGVTSAPDTRPAPGSTAPP (MUC1 peptide) SEQ ID NO: 7: AHGVTSAPDTRPAPGS T 17 APP (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -Man added to [position 17]) SEQ ID NO: 8:
  • SEQ ID NO: 16 P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added at [position 7] and ⁇ -GalNAc added at positions 2 and 11;
  • SEQ ID NO: 17 PTTDSTTPAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 11];
  • SEQ ID NO: 18 P T 2 TDSTTPAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 2, 11]; FIGS.
  • SEQ ID NO: 19 P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added at [position 7] and ⁇ -Man added at positions 2 and 11; FIG. 2) SEQ ID NO: 20 PTTDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -Gal added at [position 7] and ⁇ -GalNAc added at [position 11]; FIG. 3) SEQ ID NO: 21: PTTDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -Fuc added at [position 7] and ⁇ -GalNAc added at position 11; FIG.
  • SEQ ID NO: 22 P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -Fuc added at [position 7] and ⁇ -GalNAc added at positions 2 and 11;
  • SEQ ID NO: 23 AHGV T 5 SAPDTRPAPGS T 17 APP (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 5] and ⁇ -Man added to [position 17];
  • SEQ ID NO: 24 AHGV T 5 SAPDTRPAPGSTAPP (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 5]; FIGS.
  • SEQ ID NO: 25 AHGV T 5 SAPDTRPAPGS T 17 APP (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -GalNAc added at [position 5] and ⁇ -Gal added at [position 17];
  • SEQ ID NO: 26 AHGV T 5 SAPDTRPAPGS T 17 APP (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 5] and ⁇ -Fuc added to [position 17];
  • FIG. 25 AHGV T 5 SAPDTRPAPGS T 17 APP
  • SEQ ID NO: 26 AHGV T 5 SAPDTRPAPGS T 17 APP (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 5] and ⁇ -Fuc added to [position 17];
  • SEQ ID NO: 27 GT T 3 PSPVP T 9 TSTTSAP (synthetic MUC5AC peptide with ⁇ -GalNAc added at [9th position] and ⁇ -Man added at [3rd position];
  • SEQ ID NO: 28 GT T 3 PSPVP T 9 TST T 13 SAP (synthetic MUC5AC peptide in which ⁇ -Man is added to [position 9] and ⁇ -GalNAc is added to [positions 3, 13];
  • FIG. 1 synthetic MUC5AC peptide in which ⁇ -Man is added to [position 9] and ⁇ -GalNAc is added to [positions 3, 13];
  • SEQ ID NO 32 GT T 3 P S 5 PVPTTST T 13 SAP ([3 , 5, 13 of Synthesis was added alpha-GalNAc in MUC5AC peptide; Figure 8-10)
  • SEQ ID NO: 33 GT T 3 PSPVP T 9 TSTTSAP (synthetic MUC5AC peptide with ⁇ -Gal added at [position 9] and ⁇ -GalNAc added at [position 3]; FIG. 9)
  • SEQ ID NO: 34 GT T 3 PSPVP T 9 TST T 13 SAP (synthetic MUC5AC peptide in which ⁇ -Gal is added to [position 9] and ⁇ -GalNAc is added to [positions 3, 13];
  • FIG. 1 synthetic MUC5AC peptide in which ⁇ -Gal is added to [position 9] and ⁇ -GalNAc is added to [positions 3, 13];
  • FIG. 1 synthetic MUC5AC peptide in which ⁇ -Gal is added to [position 9] and ⁇ -
  • SEQ ID NO 35 GT T 3 P S 5 PVP T 9 TST T 13 SAP ([9 -position] to beta-Gal, [3, 5, 13 of Synthesis was added alpha-GalNAc in MUC5AC peptide; Figure 9 )
  • SEQ ID NO: 36 GT T 3 PSPVP T 9 TSTTSAP (synthetic MUC5AC peptide in which ⁇ -Fuc is added to [position 9] and ⁇ -GalNAc is added to position 3; FIG. 10)
  • FIG. 10 SEQ ID NO 35: GT T 3 P S 5 PVP T 9 TST T 13 SAP ([9 -position] to beta-Gal, [3, 5, 13 of Synthesis was added alpha-GalNAc in MUC5AC peptide; Figure 9
  • SEQ ID NO 38 GT T 3 P S 5 PVP T 9 TST T 13 SAP ([9 -position] to alpha-Fuc, [3, 5, 13 of Synthesis was added alpha-GalNAc in MUC5AC peptide; Figure 10 ) SEQ ID NO: 39: PTTDST T 7 PAPTTK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 7]; FIG. 11) SEQ ID NO: 40: PTTDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [positions 7 and 11]; FIG.
  • SEQ ID NO: 41 P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [positions 2, 7, 11]; FIG. 11)
  • SEQ ID NO: 42 P T 2 T 3 DST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide in which ⁇ -GalNAc is added to [positions 2, 3, 7, 11];
  • SEQ ID NO: 44 P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide added with ⁇ -Man at [position 7], ⁇ -GalNAc at [position 2], and ⁇ -GalNAc at [position 11]; ) SEQ ID NO: 45: P T 2 TDSTTPAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 2] and ⁇ -GalNAc added to [position 11]; FIG. 12) SEQ ID NO: 46: P T 2 TDSTTPAPTTK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 2]; FIG.
  • SEQ ID NO: 47 PTTDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -Man added at [position 7] and ⁇ -Fuc added at [position 11];
  • SEQ ID NO: 48 P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added at [position 2], ⁇ -Man added at [position 7], and ⁇ -Fuc added at [position 11];
  • FIG. 16 SEQ ID NO: 48: P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added at [position 2], ⁇ -Man added at [position 7], and ⁇ -Fuc added at
  • SEQ ID NO: 50 P T 2 TDST T 7 PAP T 11 TK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added at [position 2, 7] and ⁇ -Fuc added at [position 11];
  • SEQ ID NO: 51 P T 2 TDST T 7 PAPTTK (synthetic EA2 peptide with ⁇ -GalNAc added to [position 2 and position 7];
  • SEQ ID NO: 53 AHGVTSAPD T 10 RAHGV T 16 SAPD (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -Man added at [position 16] and ⁇ -GalNAc added at [position 10];
  • SEQ ID NO: 54 AHGVTSAPD T 10 RAHGV T 16 SAPD (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -Man added at [position 16] and NeuAc ⁇ 2-6GalNAc ⁇ added at [position 10];
  • SEQ ID NO: 55 AHGVTSAPD T 10 RAHGVTSAPD (synthetic MUC1 peptide with NeuAc ⁇ 2-6GalNAc ⁇ added to [position 10];
  • FIG. 17 SEQ ID NO: 53: AHGVTSAPD T 10 RAHGV T 16 SAPD (synthetic MUC1 peptide with ⁇ -Man added at [position 16] and ⁇ -GalNAc added at [position 10];
  • SEQ ID NO: 54 AHGVTSAPD T 10 RAHGV T 16
  • SEQ ID NO: 56 AHGVTSAPD T 10 RAHGV T 16 SAPD (synthetic MUC1 peptide added with ⁇ -GalNAc at [position 16] and NeuAc ⁇ 2-6GalNAc ⁇ at [position 10]; FIG. 17)

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Abstract

この発明の課題は、目的とするデザインされた糖ペプチドを簡便かつ効果的に製造することができる方法を提供することにある。この課題は（Ａ）糖結合能を有するアミノ酸残基を２以上含む保護ペプチドを得る工程であって、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていない、工程；（Ｂ）（Ａ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；および（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの保護基を脱保護する工程、を包含する、少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基が該修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法により解決される。

Description

糖ペプチドの合成法
　本発明は、糖ペプチドの合成法に関する。
　癌化の進行に伴い、細胞表層のムチン糖タンパク質の糖鎖構造が変化することはよく知られており（非特許文献１参照）、これらをマーカー分子とする新たな癌早期発見・診断技術および抗体医薬・癌ワクチンなどの新治療法の研究開発が進められている（非特許文献２参照）。現在、臨床現場で広く用いられているCA15-3やCA125などのモノクローナル抗体の抗原も上記ムチン糖タンパク質の特定の部分構造であることが予想されているため癌関連マーカー分子としてのムチン型「糖ペプチド」は創薬・医療産業上きわめて重要な標的化合物群である。これらの化合物は有機化学合成法ならびに酵素合成法を相補的に用いることによって作成し得ることが報告されているが（特許文献１、非特許文献３参照）、構造の異なる複雑な糖鎖を複数のアミノ酸残基に配置させるためには個々のコア構造（基本骨格）を含む複数種のアミノ酸誘導体をあらかじめ合成する必要があり、同一のペプチド分子中に付与できる糖鎖構造の種類には限界があるためそれらの糖ペプチドを大量合成することも困難であった。
　一方、ムチン型糖タンパク質は本来生体内では多くの糖転移酵素反応によって生合成されており、ポリペプチド鎖に存在するセリンやスレオニンの水酸基に最初の糖であるN-アセチルガラクトサミンを転移する酵素（UDP-GalNAc:ポリペプチドN-アセチルガラクトサミン転移酵素、以下ppGalNAcTsと略すことがある。）は十数種類発見されている。しかし、それらppGalNAcTsのペプチド鎖あるいは糖ペプチド鎖に対する基質特異性については、ある一定の傾向は散見されるものの一般則（コンセンサス配列）は全く存在しないことを裏付ける実験結果が数多く報告されている（たとえば非特許文献２あるいは非特許文献４参照）。すなわち、いかなるppGalNAcTsによってもペプチド鎖に複数存在するセリンやスレオニンの中で、任意の残基に対してGalNAcを恣意的に修飾することは困難であり、またその序列（修飾反応の順番）を制御することも不可能である。
　特開２００３－２８９９公報（特許文献２）は、糖転移酵素を用いてペプチドに糖鎖を付加し、1つめの糖転移酵素では糖鎖を導入することができなかったアミノ酸に異なる糖転移酵素を用いて糖鎖を導入する、という方法を開示する。しかし、この文献では、糖転移酵素の基質特異性にのみ依存することが前提となっており、人為的に糖鎖導入可能なアミノ酸をブロックしておくことで、目的とするデザインされた糖ペプチドを効果的に製造することはなんら意図されていない。
国際出願公開2006/030840パンフレット 特開２００３－２８９９公報
Nature Rev．Cancer (2004) 4，45-60. Biochim．Biophys．Acta (2008) 1780，564-563. J．Am．Chem．Soc．(2005) 127，11804-11818. Chem．Biol．(2004) 11，1009-1016.
　この発明の課題は、目的とするデザインされた糖ペプチドを簡便かつ効果的に製造することができる方法を提供することにある。
　本発明者らは、鋭意検討した結果、糖が付加されるべきアミノ酸に対し、あらかじめ糖転移酵素で導入される糖とは異なる糖またはその代替物（保護基）と結合させておくことで、糖転移反応による糖鎖導入をブロックし、目的とする場所のアミノ酸に目的とする糖鎖（単糖を含む）を付加させ、その後ブロックするために導入した糖または代替物（保護基）を、加水分解等で選択的に脱離させることによって、目的とする場所に糖鎖が導入された糖ペプチドを製造することができることを見出したことによって上記課題を解決した。加えて、本発明者らは、これらに加え、さらにブロックされていたアミノ酸に、１度目と同じまたは異なる糖転移酵素を用いて糖鎖付加することによって、さらに複雑な目的とする糖ペプチドを製造することができることを見出し、上記課題を解決した。
　本発明は、具体例としては、ペプチド鎖に含まれる任意のセリン残基（Ｓｅｒ）およびスレオニン残基（Ｔｈｒ）の水酸基を、あらかじめＮ－アセチル－α－ガラクトサミン（α－ＧａｌＮＡｃ）以外の糖またはその代替物（保護基）などで保護した糖ペプチドを作製し、該糖ペプチドを基質としてＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素（ＧａｌＮＡｃ転移酵素；ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓ）を用いた糖転移反応に供すると、他の残されたＳｅｒおよびＴｈｒにα－ＧａｌＮＡｃが転移されうる。前記反応にて得られた生成物に含まれるα－ＧａｌＮＡｃ以外の糖またはその代替物（保護基）は、選択的に切断する酵素（グリコシダーゼ）を用いて加水分解することにより、ＳｅｒおよびＴｈｒの側鎖を遊離の水酸基へと変換できる。また、ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓが、ＧａｌＮＡｃとＳｅｒまたはＴｈｒとの間に形成するグリコシド結合の立体化学はα型のみであるため、あらかじめＳｅｒおよびＴｈｒの側鎖にＧａｌＮＡｃ残基をβ型のグリコシド結合にて導入しておけば、該糖質はβ－ヘキソサミニダーゼにより選択的に加水分解することができる。β－ＧａｌＮＡｃと同様にα－あるいはβ－グルコース（α－Ｇｌｃあるいはβ－Ｇｌｃ）、α－フコース（α－Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチル－β－グルコサミン（β－ＧｌｃＮＡｃ）なども、それぞれα－あるいはβ－グルコシダーゼ、α－フコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼなどの酵素を用いて選択的に切断することができるため、ＳｅｒおよびＴｈｒの水酸基に対する保護に用いることができる。ペプチド配列中の任意のＳｅｒおよびＴｈｒの水酸基を複数種の糖またはその代替物（保護基）で保護しておけば、該残基以外のＳｅｒおよび／またはＴｈｒがｐｐＧａｌＮＡｃＴｓによるα－ＧａｌＮＡｃの転移を受けることになるため、ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓの修飾序列を変化させることができる。また、他の糖転移酵素を用いることでペプチド鎖に転移されたα－ＧａｌＮＡｃを母核としてさらに糖鎖伸長することができるため、Ｓｅｒおよび／またはＴｈｒ側鎖の保護基として導入する糖またはその代替物（保護基）の数、位置、種類を考慮したペプチド基質と、ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓ、グリコシダーゼ、糖転移酵素を組み合わせて用いる一連の酵素反応プロトコールをデザインしておけば、異なる糖鎖構造を任意のセリン・スレオニン残基に配置した糖ペプチドの構築が可能である。
　本発明の具体例としては、酵素法による糖ペプチド合成の許容範囲（レパートリー）が大幅に広がると同時にライブラリー構築のスループットにおいて従来法をはるかに上回る優位性を有しているため、癌特異的糖ペプチド抗原構造（癌エピトープ）等の探索と創薬研究開発が加速される。
　たとえば、ｐｐＧａｌＮＡｃＴｓを用いたＧａｌＮＡｃ転移反応において、ペプチド鎖やタンパク質に対する糖鎖修飾位置および序列を制御することによって、産業上有用な疾患関連糖ペプチドライブラリーを提供することができる。
　したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）以下の工程：
　（Ａ）糖結合能を有するアミノ酸残基を２以上含む保護ペプチドを得る工程であって、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていない、工程；
　（Ｂ）（Ａ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；および
　（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの保護基を脱保護する工程、を包含する、
少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基が該修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法。
（２）
前記糖結合能を有するアミノ酸残基は、アスパラギン、セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンおよびチロシンから選択される少なくとも１つである、項目１に記載の製造方法。
（２Ａ）
前記糖結合能を有するアミノ酸残基は、セリンまたはスレオニンである、項目１または２に記載の製造方法。
（３）
前記保護基は、糖鎖、リン酸基および硫酸基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基である、項目１～２または２Ａのいずれかに記載の方法。
（４）
前記保護基は、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、β－ＧｌｃＮＡｃ、α－Ｆｕｃおよびβ－ＧａｌＮＡｃ、ならびにこれらの複糖および修飾糖からなる群より選択される、項目１～２、２Ａまたは３のいずれかに記載の方法。
（５）
前記修飾基は糖鎖であり、前記（Ｂ）工程は、糖転移酵素を用いて行うものである、項目１～２、２Ａまたは３～４のいずれかに記載の方法。
（６）
前記保護基が糖鎖であり、前記（Ａ）工程は化学合成法により行い、前記（Ｂ）工程において糖転移酵素を用いて修飾基を結合させ、前記（Ｃ）工程において、糖加水分解酵素を用いて脱保護反応を行う、項目１～２、２Ａまたは３～５のいずれかに記載の方法。
（７）
前記糖鎖は、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、Ｎ－アセチル－β－グルコサミン、α－フコース、Ｎ－アセチル－β－ガラクトサミンまたはガラクトシル－β１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミンであって、前記糖加水分解酵素は、それぞれα－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－マンノシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、α－フコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼまたはＯ－グルコシダーゼである、項目６に記載の方法。
（８）
前記糖転移酵素は、β１，４－ガラクトース転移酵素、α－１，３－ガラクトース転移酵素、β１，４－ガラクトース転移酵素、β１，３－ガラクトース転移酵素、β１，６－ガラクトース転移酵素、α２，６－シアル酸転移酵素、α１，４－ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２－フコース転移酵素、α１，３－フコース転移酵素、α１，４－フコース転移酵素、α１，６－フコース転移酵素、α１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、α１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，４－マンノース転移酵素、α１，２－マンノース転移酵素、α１，３－マンノース転移酵素、α１，４－マンノース転移酵素、α１，６－マンノース転移酵素、α１，２－グルコース転移酵素、α１，３－グルコース転移酵素、α２，３－シアル酸転移酵素、α２，８－シアル酸転移酵素、α１，６－グルコサミン転移酵素、α１，６－キシロース転移酵素、β－キシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３－グルクロン酸転移酵素、ヒアルロン酸合成酵素；ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン：ポリペプチドーＮ－アセチルグルコサミン転移酵素、プロテインＯ－フコース転移酵素、プロテインＯ－マンノース転移酵素、プロテインＯ－グルコース転移酵素；Ｏ-フコシルペプチド３－β－アセチルグルコサミン転移酵素；およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン　プロテインＯ－マンノースβ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素からなる群より選択される、項目６または７に記載の方法。
（９）
前記（Ｂ）工程は化学的方法により実施し、前記保護基および前記修飾基に水酸基がある場合、該水酸基は保護されており、該（Ｂ）工程の終わった後、（Ｂ２）工程として、該水酸基の保護基の脱保護工程を行う、項目１～２、２Ａまたは３～８のいずれかに記載の方法。
（１０）
以下の工程：
　（Ｄ）糖結合能を有するアミノ酸残基を３以上含む保護ペプチドを得る工程であって、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも２つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていない、工程；
　（Ｅ）（Ｄ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；
　（Ｆ）（Ｅ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの該保護基のうち１種を脱保護する工程；
　（Ｇ）（Ｆ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの、保護されていない該糖結合能を有するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；および
　（Ｈ）（Ｇ）で得られた修飾基を有する保護ペプチドの該保護基のうち（Ｆ）工程のものとは異なる別の一種を脱保護する工程、
を包含する、
少なくとも２つの糖結合能を有するアミノ酸残基が修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法。
（１１）
前記（Ｅ）工程における修飾基と前記（Ｇ）工程における修飾基とは異なる修飾基である、項目１０に記載の製造方法。
（１２）
前記（Ｅ）工程および前記（Ｇ）工程は化学的方法により実施し、前記保護基および前記修飾基に水酸基がある場合、該水酸基は保護されており、それぞれ該（Ｅ）工程および該（Ｇ）工程の終わった後、それぞれ（Ｅ２）工程および（Ｇ２）工程として、該水酸基の保護基の脱保護工程を行う、項目１０～１１のいずれかに記載の方法。
（１３）
項目２、２Ａまたは３～９の特徴を少なくとも１つ有する、項目１０～１２のいずれかに記載の製造方法。
（１４）
さらに、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程を含む、項目１０～１３のいずれかに記載の方法。
（１５）
修飾基が結合したペプチドのライブラリーを生産する方法であって、項目１～２、２Ａまたは３～１４のいずれかに記載に方法を行う工程を包含する、方法。
（１６）
項目１～２、２Ａまたは３～１４のいずれかに記載の方法によって生産される修飾基が結合したペプチド。
（１７）
項目１５に記載の方法によって生産される修飾基が結合したペプチドのライブラリー。
　これらのすべての局面において、本明細書に記載される各々の実施形態は、適用可能である限り、他の局面において適用されうることが理解される。
　癌特異的な抗原である新しい糖ペプチド化合物を用いた癌ワクチンや抗体医薬の開発により、癌の種類はもとより詳細な症状・進行度・転移性などに適応したテーラーメイド医療が実現するとともに、患者が負担する高額の医療費軽減にも資する革新的医療技術開発へと繋がる。
　以上のように、本発明により、糖転移酵素の基質特異性にのみ依存するのではなく、糖鎖導入可能なアミノ酸を人為的にブロックしておくことで、目的とするデザインされた糖ペプチドを効果的に製造することが出来る、という点で優れた糖ペプチドまたは糖タンパク質の製造方法が提供された。
図１はＮ－アセチル－βガラクトサミン（β－ＧａｌＮＡｃ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）スペクトル（ｂ）を示した図である。黒四角はβ－ＧａｌＮＡｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図１はＮ－アセチル－βガラクトサミン（β－ＧａｌＮＡｃ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ）スペクトル（ｂ）を示した図である。黒四角はβ－ＧａｌＮＡｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 （ｃ－１）、（ｃ－２）はｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応により生成した二種類の生成物について測定したＥＣＤ－ＭＳ／ＭＳのスペクトルを示した図である。（ｃ－１）はα－ＧａｌＮＡｃの一転移糖ペプチド、（ｃ－２）はα－ＧａｌＮＡｃの二転移糖ペプチドについての測定結果であり、一転移糖ペプチドはＴｈｒ１１、二転移糖ペプチドはＴｈｒ２とＴｈｒ１１にα－ＧａｌＮＡｃが修飾されていることが明らかになった。これらの図においてＴ（Ｔｈｒ）に付与したアスタリスク（＊）はＴｈｒが糖質と結合していることを示す。 （ｃ－１）、（ｃ－２）はｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応により生成した二種類の生成物について測定したＥＣＤ－ＭＳ／ＭＳのスペクトルを示した図である。（ｃ－１）はα－ＧａｌＮＡｃの一転移糖ペプチド、（ｃ－２）はα－ＧａｌＮＡｃの二転移糖ペプチドについての測定結果であり、一転移糖ペプチドはＴｈｒ１１、二転移糖ペプチドはＴｈｒ２とＴｈｒ１１にα－ＧａｌＮＡｃが修飾されていることが明らかになった。これらの図においてＴ（Ｔｈｒ）に付与したアスタリスク（＊）はＴｈｒが糖質と結合していることを示す。 図２はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図２はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図３はβ－ガラクトース（β－Ｇａｌ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒丸はβ－Ｇａｌを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図３はβ－ガラクトース（β－Ｇａｌ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒丸はβ－Ｇａｌを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図４はα－フコース（α－Ｆｕｃ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒三角はα－Ｆｕｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図４はα－フコース（α－Ｆｕｃ）をＴｈｒ７に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒三角はα－Ｆｕｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図５はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ１７に持つＭＵＣ１ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図５はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ１７に持つＭＵＣ１ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図６はβ－ガラクトース（β－Ｇａｌ）をＴｈｒ１７に持つＭＵＣ１ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒丸はβ－Ｇａｌを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図６はβ－ガラクトース（β－Ｇａｌ）をＴｈｒ１７に持つＭＵＣ１ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒丸はβ－Ｇａｌを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図７はα－フコース（α－Ｆｕｃ）をＴｈｒ７に持つＭＵＣ１ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒三角はα－Ｆｕｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図７はα－フコース（α－Ｆｕｃ）をＴｈｒ７に持つＭＵＣ１ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒三角はα－Ｆｕｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図８はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ９に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図８はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ９に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図９はβ－ガラクトース（β－Ｇａｌ）をＴｈｒ９に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒丸はβ－Ｇａｌを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図９はβ－ガラクトース（β－Ｇａｌ）をＴｈｒ９に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒丸はβ－Ｇａｌを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図１０はα－フコース（α－Ｆｕｃ）をＴｈｒ９に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒三角はα－Ｆｕｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図１０はα－フコース（α－Ｆｕｃ）をＴｈｒ９に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）と各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。黒三角はα－Ｆｕｃを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図１１は糖質をもたないＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程と得られる４種類の糖ペプチドを示した図である。該基質に対するＮ－アセチル－α－ガラクトサミン（α－ＧａｌＮＡｃ）の転移はＴｈｒ７、Ｔｈｒ１１、Ｔｈｒ２、Ｔｈｒ３の順に起こる。白四角はα－ＧａｌＮＡｃを示す。 図１２はα－マンノース（α－Ｍａｎ）、Ｎ－アセチル－β－ガラクトサミン（β－ＧａｌＮＡｃ）をそれぞれＴｈｒ７、Ｔｈｒ１１に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）、各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを、黒四角はβ－ＧａｌＮＡｃを、示す。 図１２はα－マンノース（α－Ｍａｎ）、Ｎ－アセチル－β－ガラクトサミン（β－ＧａｌＮＡｃ）をそれぞれＴｈｒ７、Ｔｈｒ１１に持つＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）、各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを、黒四角はβ－ＧａｌＮＡｃを、示す。 図１３は、従来技術による糖ペプチドライブラリーの製造スキームである。 図１４は、本発明による糖ペプチドライブラリーの製造スキーム例である。 本発明の応用例である。ペプチド鎖に第一の修飾基（糖）を転移する酵素と該修飾基を基質として第二の修飾基（糖）を転移する酵素を組み合わせて用いることにより、複雑な修飾ペプチドを製造できる。 図１６はα－マンノース（α－Ｍａｎ）、α－フコース（α－Ｆｕｃ）をそれぞれＴｈｒ７、Ｔｈｒ１１に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチドの合成を行った際の反応工程（ａ）、各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを、黒三角はα－Ｆｕｃを示す。 図１６はα－マンノース（α－Ｍａｎ）、α－フコース（α－Ｆｕｃ）をそれぞれＴｈｒ７、Ｔｈｒ１１に持つＥＡ２ペプチドを基質として糖ペプチドの合成を行った際の反応工程（ａ）、各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを、黒三角はα－Ｆｕｃを示す。 図１７はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ１６に持つＭＵＣ１様ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）、各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。第一の酵素によりペプチド鎖に修飾基を転移した後、第二の酵素を作用させることにより修飾基が伸長された糖ペプチドを製造できる。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを、黒菱形はα－Ｎｅｕ５Ａｃを示す。 図１７はα－マンノース（α－Ｍａｎ）をＴｈｒ１６に持つＭＵＣ１様ペプチドを基質として糖ペプチド合成を行った際の反応工程（ａ）、各工程において測定したＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳのスペクトル（ｂ）を示した図である。第一の酵素によりペプチド鎖に修飾基を転移した後、第二の酵素を作用させることにより修飾基が伸長された糖ペプチドを製造できる。白丸はα－Ｍａｎを、白四角はα－ＧａｌＮＡｃを、黒菱形はα－Ｎｅｕ５Ａｃを示す。
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現（英語における”ａ”、”ａｎ”、”ｔｈｅ”等）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　（用語の定義）
　以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
　本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう（したがって、単糖も「糖鎖」の範囲内にある）。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「糖」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。
　本明細書において「単糖」とは、特に言及するときは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式ＣｎＨ２ｎＯｎで表される化合物をいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。
　本明細書において「単糖の誘導体」とは、単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ－１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルクロン酸）、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ－アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２－デオキシ－Ｄ－リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。あるいは、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造のグリコシドもまた、単糖の誘導体の範囲内にある。
　本発明において糖を記載するために使用する命名法および略称は、通常の命名法に従う。
　本明細書において、ガラクトースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ－Ｄ－ガラクトースであり、特に言及しないときには、β－Ｄ－ガラクトースを指すものとして使用される。
　本明細書において、アセチルガラクトサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ－アセチル－α－Ｄ－ガラクトサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ－アセチル－α－Ｄ－ガラクトサミンを指すものとして使用される。
　本明細書において、マンノースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα－Ｄ－マンノースであり、特に言及しないときには、α－Ｄ－マンノースを指すものとして使用される。
　本明細書において、グルコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはβ－Ｄ－グルコースであり、特に言及しないときには、β－Ｄ－グルコースを指すものとして使用される。
　本明細書において、アセチルグルコサミンとは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミンであり、特に言及しないときには、Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミンを指すものとして使用される。
　本明細書において、フコースとは、任意の異性体を指すが、代表的にはα－Ｌ－フコースであり、特に言及しないときには、α－Ｌ－フコースを指すものとして使用される。
　本明細書において、アセチルノイラミン酸とは、任意の異性体を指すが、代表的にはＮ－アセチル－α－Ｄ－ノイラミン酸であり、特に言及しないときにはＮ－アセチル－α－Ｄ－ノイラミン酸を指すものとして使用される。
　例えば、β－Ｄ－ガラクトースは、β－Ｇａｌ；Ｎ－アセチル－α－Ｄ－ガラクトサミンは、α－ＧａｌＮＡｃ；α－Ｄ－マンノースは、α－Ｍａｎ；β－Ｄ－グルコースは、β－Ｇｌｃ；Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミンは、β－ＧｌｃＮＡｃ；α－Ｌ－フコースは、α－Ｆｕｃ；Ｎ－アセチル－α－Ｄ－ノイラミン酸は、α－Ｎｅｕ５Ａｃなどと表記する。単糖は一般に、グリコシド結合により結合されて二糖および多糖を形成する。環の平面に関する結合の向きは、αおよびβにより示す。２つの炭素の間の結合を形成する特定の炭素原子も記載する。このように、環状の２つのアノマーは、αおよびβにより表す。表示上の理由により、ａまたはｂと表すことがある。従って、本明細書において、αとａ、βとｂは、アノマー表記については交換可能に使用される。
　本明細書において、糖の表示記号、呼称、略称（Ｇｌｃなど）などは、単糖を表すときと、糖鎖中で使用されるときとは、異なりうることに留意する。糖鎖中、単位糖は、結合先の別の単位糖との間に脱水縮合があるので、相方から水素または水酸基を除いた形で存在することになる。従って、これらの糖の略号は、単糖を表すときに使用されるときは、すべての水酸基が存在するが、糖鎖中で使用されるときは、水酸基と結合先の糖の水酸基とが脱水縮合されて酸素のみが残存した状態を示していることが理解される。
　糖が、アルブミンと共有結合されるときには、糖の還元末端がアミノ化され、そのアミン基を介してアルブミンなどの他の成分に結合することができるが、その場合は還元末端の水酸基がアミン基に置換されたものを指すことに留意する。
　本明細書において「糖鎖含有物質」とは、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において「糖タンパク質」、「糖ポリペプチド」または「糖ペプチド」とは、交換可能に使用され、糖鎖を含むタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをいう。そのような糖タンパク質としては、種々の有用な機能性タンパク質が含まれ、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。
　本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。ポリペプチドに含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよく、改変されたアミノ酸（例えば、糖鎖を結合し得る官能基を含むアミノ酸）であってもよい。本発明が適用される範囲としては、ペプチドの長さについては限定する理由が特にないことから、これらの用語を格別に峻別する意味はないことから用語についても交換可能に使用されるべきである。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。
　本明細書において「アミノ酸」とは、当該分野において通常用いられる意味で用いられ、カルボキシル基とアミノ基とを有する有機化合物をいう。本明細書においてアミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であっても良い。用語「天然のアミノ酸」とは、生体内に存在する天然のアミノ酸のＬ－異性体を意味する。天然のアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ホモセリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ－カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンなどが挙げられる。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ－ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ－フルオロフェニルアラニン、３－アミノ－２－ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ－フェニルアラニンが挙げられる。また、本発明において天然アミノ酸をもとに改変を施したアミノ酸は、天然アミノ酸でない場合は、非天然アミノ酸の範囲に入る。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２－メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。本明細書では、アミノ酸の代わりに、アミノ酸アナログまたはアミノ酸模倣物を使用することができる。
　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。なお、本明細書では「アミノ酸」は、格別の意図を有しない限り、「アミノ酸残基」、「Ｎ末端アミノ酸残基」、「Ｃ末端アミノ酸残基」のいずれをも意味することが意図される。同様に、「アミノ酸残基」は、格別の意図を有しない限り、「Ｎ末端アミノ酸残基」、「Ｃ末端アミノ酸残基」のいずれをも意味することが意図される。
　本明細書において「糖結合能を有するアミノ酸残基」とは、糖（修飾基）が酵素によって転移される可能性のあるアミノ酸残基であって、たとえば、ｐｐＧａｌＮＡｃＴによってＧａｌＮＡｃの転移を受けるセリン、スレオニンが例示される。好ましくは、以下のとおりである。（１）（酵素的方法により）修飾基（糖）が転移されうるものであり、（２）（化学的方法により）保護基が導入されうるものであり、（３）（酵素的方法により）保護基のみが選択的に除去（脱保護）されうるものであり、（４）保護基は修飾基とは異なる種類のものであることが有利である。これらを満たすものとしては、たとえば、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ヒドロキシリジンおよびチロシンを挙げることができる。これらのアミノ酸に結合する糖（鎖）として例示されるものは、Ａｓｎに対してＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対してマンノース（Ｍａｎ），Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ），ＧｌｃＮＡｃ，ガラクトース（Ｇａｌ），フコース（Ｆｕｃ），グルコース（Ｇｌｃ）；Ｈｙｐに対してＡｒａ（アラビノース）、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ；Ｓｅｒに対してＸｙｌ（キシロース）；Ｔｙｒに対してＧｌｃを挙げることができる。
　本明細書において「保護ペプチド」、「保護ポリペプチド」および「保護タンパク質」は、同じ概念を表すために交換可能に使用され、１つ以上のアミノ酸残基、特に、糖結合能を有するアミノ酸残基が少なくとも１つ保護されているアミノ酸の重合体（たとえば、ペプチド）をいう。このような保護は、修飾を目的とする反応を行う際に、その反応が保護されるべきアミノ酸残基において実質的に起こらないような処理であればどのようなものでもよく、好ましくは保護基（たとえば、修飾させる糖鎖とは異なる糖鎖）を結合させることによって達成される。
　本明細書において「保護基」とは、当該分野において通常用いられるのと同様の意味で用いられ、ある官能基を保護する基をいう。化学反応を行なう際に、これを妨害しまたはその条件下で変化が生じることを望まない官能基（たとえば、アミノ酸残基）がある場合、そのような官能基を予め第１の試薬と反応させることにより不活性化しておき、目的とする反応の終了後、改めて第３の化学反応により最初の官能基を復活させることが行なわれる。このときに導入される原子または基を保護基という。保護基として好ましいものの具体的な例は、本明細書において実施例及び他の場所に記載される。たとえば、代表的には、ハロゲン（Ｉ，Ｂｒ，Ｃｌ、Ｆなど）、低級（ここでは、代表的にＣ１－Ｃ６を示すがこれに限定されない。）アルコキシ、低級アルキルチオ、低級アルキルスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ等を表す。）において、適宜の置換基を当該分野で公知の手法により保護することによって製造することができる。このような保護基としては、例えばエトキシカルボニル、ｔ－ブトキシカルボニル、アセチル、ベンジル等の、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎ著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．（第２版、１９９１年）等に記載されている保護基をあげることができる。また、保護基等の各置換基に含まれる官能基の変換は、上記製造法以外にも公知の方法［例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、Ｒ．Ｃ．Ｌａｒｏｃｋ著（１９８９年）等］によって行って目的の保護基としてもよい。
　「保護ペプチド」等における保護基は、修飾基を媒介する反応（酵素反応など）によって脱離しないようなものを使用することが好ましい。したがって、通常修飾基とは異なる基を用いる。「保護ペプチド」等における保護基としては、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、β－アセチルグルコサミン、α－フコース、β－アセチルガラクトサミンまたはガラクトシル－β１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミンが好ましく、これらは、それぞれα－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－マンノシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、α－フコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼまたはＯ－グルコシダーゼにより脱保護される。
　「水酸基の保護基」は、「保護ペプチド」等における保護基および修飾基の水酸基が、修飾基の導入の際に反応しうる水酸基を保護する基をいう。そのような保護基としては、例えば、アセチル基やベンゾイル基等のアシル型保護基、ベンジル基、メチル基やアリル基等のエーテル型保護基、イソプロピリデン基やベンジリデン基等のアセタール型保護基等を挙げることができる。
　本明細書において「保護されていない」とは、当該分野において通常用いられるのと同様の意味で用いられ、保護基などが結合しておらず、目的とする反応（たとえば、糖転移反応）を受けることができる状態をいう。通常、－ＯＨ（水酸基）などの官能基が反応可能な状態となっているか、あるいは糖転移酵素などにより転移可能な状態となっている。保護基として糖等が用いられた場合は、さらにその水酸基が保護されていることがありうる。
　本明細書において「修飾基」とは、ペプチド等において、アミノ酸残基の側鎖に結合されるべき目的とする置換基をいい、たとえば、糖鎖（単糖、多糖、複合糖など）が代表例として挙げられる。
　本明細書において「脱保護」とは、保護処理された状態を解除して、反応性の状態に戻すことをいい、代表的には保護基を脱離させることをいう。脱保護の方法は、当該分野において公知の方法、たとえば「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，第２版、１９９１などを参照して、加水分解などにより適宜実施することができる。
　本明細書において「修飾ペプチド」、「修飾ポリペプチド」および「修飾タンパク質」とは、交換可能に用いられ、修飾基が結合したアミノ酸の重合体（ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質など）をいう。
　本明細書において「糖転移酵素」とは、タンパク質、糖質、脂質、ステロイド、アルコールなどの糖受容体（ｓｕｇａｒ　ａｃｃｅｐｔｏｒ）に糖供与体（ｓｕｇａｒ　ｄｏｎｏｒ）すなわち糖ヌクレオチドや脂質中間体（糖結合ドリコール）から糖を転移し、複合糖質、糖タンパク質、多糖を合成する酵素の総称であり、本発明では、特に、ペプチドまたはタンパク質を糖受容体として糖を転移するものをいう。具体的な例は、本発明において使用されうる糖転移酵素は、目的とする糖ペプチドを考慮して、実施することができる。糖転移酵素としては、糖結合能を有するアミノ酸残基に糖鎖を転移させる機能を担うもののほか、糖鎖伸長（機能性糖鎖形成）の機能を有するもの、および母核糖鎖形成ないし糖鎖抗原形成の機能を担うものが本発明において企図される。糖転移酵素についての区別は、まず酵素反応の際の受容体となる基質によって２つに大別される。一つ目はペプチドを基質とするもので、もう一つは糖ペプチドに含まれる糖鎖（単糖および二糖以上のオリゴ糖を含む）を基質とするものである。「糖鎖伸長の機能を有するもの」が後者に該当する。前者の酵素につづいて後者の酵素を作用させることで製造されうる糖ペプチドがもつ糖鎖構造のうち、その一部を形成する有意義であると思われる糖鎖構造が母核糖鎖であり、糖鎖抗原であり、機能性糖鎖と呼ばれる。母核糖鎖（生体内で広く存在する糖鎖の基本構造）と糖鎖抗原（抗原性があることが知られている糖鎖）は構造が重複するものもあり、例えばＧａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃα１（→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）という二糖構造はコア１型と呼ばれる母核糖鎖でありながら、Ｔ抗原という名で知られる糖鎖抗原でもある。機能性糖鎖はたとえばレクチンと結合するリガンドとして作用するポリラクトサミン糖鎖など母核糖鎖以外の糖鎖構造で、かつある種の活性や機能を発揮することが知られているものを指す。ただし、機能性糖鎖と糖鎖抗原との間にも構造が重複するものがあり、例えば四糖構造からなるシアリルルイスＸ抗原が挙げられる。そのような糖転移酵素の具体例は、本明細書において実施例及び他の場所において詳細に記載する。本発明は、これらのいずれのタイプについても、合成することができることが理解される。
　本明細書において「化学合成法」とは、化学反応によって物質をつくり出すことをいい、本発明では特に、ペプチドまたは保護基が結合したペプチドを化学反応によって製造することをいう。本発明において用いられうるペプチドの化学合成法としては、液相合成、固相合成などを挙げることができる。本発明において用いられうるものとして好ましいものの具体的な例は、本明細書において実施例及び他の場所に記載される。
　本明細書において「糖加水分解酵素」とは、糖が結合した物質から糖を遊離させる酵素であって、概してＥＣ．３．２．に属する酵素をいい、特には、ＥＣ．３．２．１．に属する配糖体結合加水分解酵素または糖加水分解酵素）をさす。本発明において用いられうるものとして好ましいものの具体的な例は、本明細書において実施例及び他の場所に記載される。
　本明細書において「脱保護反応」とは、保護基を脱離させる反応をいう。本発明では、保護基が糖鎖の場合、糖加水分解酵素などを用いた生化学的反応によって実施することができる。
　本明細書において「ライブラリー」とは、あるカテゴリー内の複数の同様のメンバーを含む集団をいう。たとえば、本発明では、糖ペプチドのライブラリーは、複数の、好ましくは異なる種類の糖ペプチドの集団をいう。
　本明細書において「糖鎖結合能を有するアミノ酸」は、代表的に、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
を有し、（式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり、Ｒ２は、水酸基、－ＯＲ７、－ＮＲ８Ｒ９または保護基であり、Ｒ3～Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独
立して保護基、水素、蛍光基などの修飾基（たとえば、ペプチドのＮ末端に蛍光（検出用）やビオチン（アビジン等との結合用）ＰＥＧ鎖（水溶性向上用）等の何らかの機能を持つ修飾基が結合している場合を含む）を表し、Ｒ５は、糖鎖に結合し得る基を表し、Ｒ７～Ｒ９は、それぞれ独立して水素、保護基、蛍光基などの修飾基を表す。）で表わされる、化合物で表され得る。
　本明細書において、アミノ酸の側鎖とは、アミノ酸をＲＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨで表したときに、Ｒに相当する基をいう。本明細書では、アミノ酸には、ＲａＲｂＣＨ（ＮＨ）ＣＯＯＨ（ＲａおよびＲｂは、任意の基であり、一緒になって環状の基を形成していても良い）で示されるイミノ酸を含む。したがって、イミノ酸の場合は、ＲａまたはＲｂはあるいはその両方相当する基が側鎖に該当し得る。個々で例示的なアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ホモセリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ－カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンなどが挙げられるがそれらに限定されない。ここで、プロリンなどの環状イミノ酸の場合は、Ｒ１とＲ３またはＲ４また、アミノ酸がグリシンの場合は、Ｒ１は、単結合を意味し得る。
　ここで、Ｒ２～Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、水素（保護されていない場合）、あるいは、Ｆｍｏｃ基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ－ブトキシカルボニル基、ｔ－ブチルジメチル基、Ｎ－フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２－ニトロ－４，５－ジメトキシベンジル基、２－ニトロ－４，５－ジメトキシベンジルエチレンオキシカルボニル基、アルキレノイル基（例えば、ペンテノイル基）、オキシアルキレノイル基などであり得る。好ましくは、オキシカルボニル基がリンカーとして結合している。オキシカルボニル基が介在することによってアミノ基との連結がスムーズになるからである。
　ここで、Ｒ５は、アミノオキシ基、Ｎ－アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基、システイン残基などであり得る。
　「糖鎖結合能を有するアミノ酸」の好ましい例としては、たとえば、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ヒドロキシリジンおよびチロシン（Ｔｙｒ）を挙げることができる。特に、セリン（Ｓｅｒ）およびスレオニン（Ｔｈｒ）が好ましい。
　（本明細書において用いられる一般技術）
　本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃ　，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７；畑中、西村ら、糖質の科学と工学、講談社サイエンティフィク、１９９７；糖鎖分子の設計と生理機能　日本化学会編、学会出版センター、２００１などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
　（医薬・化粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）
　別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、残さタンパク質又は脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧品に関する。この医薬および化粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。
　そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
　本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α－トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
　例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０－８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０－５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
　本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。
　本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１５版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
　本発明の処置方法において使用される糖鎖組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日－数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回－１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間－１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
　本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。
　（農薬）
　本発明の組成物は、農薬の成分としても用いることができる。農薬組成物として処方される場合、必要に応じて、農学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤などを含み得る。
　本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、除草剤（ピラゾレートなど）、殺虫・殺ダニ剤（ダイアジノンなど）、殺菌剤（プロベナゾールなど）、植物成長調整剤（例、パクロブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、ベノミルなど）、共力剤（例、ピペロニルブトキサイドなど）、誘引剤（例、オイゲノールなど）、忌避剤（例、クレオソートなど）、色素（例、食用青色１号など）、肥料（例、尿素など）などもまた必要に応じて混合され得る。
　（保健・食品）
　本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の糖鎖組成物は、低アレルゲン食品としても用いることができる。
　（具体的な実施形態）
　（単一の修飾基を導入する方法）
　１つの局面において、本発明は、以下の工程：（Ａ）糖結合能を有するアミノ酸残基を２以上含む保護ペプチドを得る工程であって、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていない、工程；（Ｂ）（Ａ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；および（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの保護基を脱保護する工程、を包含する、少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基が該修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法を提供する。このように、本発明は、糖が付加されるであろうアミノ酸に対し、あらかじめ糖転移酵素で導入される糖とは異なる糖またはその代替物（保護基、好ましくは単糖）と結合させておくことで、糖転移反応による糖鎖導入をブロックし、目的とする場所のアミノ酸に目的とする糖鎖（単糖を含む）を付加させ、その後ブロックするために導入した糖または代替物（保護基）を、加水分解等で選択的に脱離させるものである。以下に、各手順を説明する。
　本発明の方法では、まず、（Ａ）工程として、糖結合能を有するアミノ酸残基を２以上含む保護ペプチドを得る工程が実施される。
　この工程において製造される保護ペプチドは、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていないものである。保護ペプチドを製造する工程では、修飾基を導入する工程を化学反応によって行う場合は、保護基は、修飾基以外の糖で、かつその水酸基が保護（例えば、アセチル基やベンゾイル基等のアシル型保護基、ベンジル基、メチル基やアリル基等のエーテル型保護基、イソプロピリデン基やベンジリデン基等のアセタール型保護基等）されていることが好ましい。このような保護ペプチドは、任意の適切な方法により合成することができ、たとえば、化学合成（例えばペプチド固相合成）、酵素法によって実施することができる。ペプチド合成は、従来技術において公知の任意の手法を用いることができるが、以下を例示することができる：液相法、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法（固相法）。これらの実施のために、当該分野において周知の文献、たとえば、固相合成に関するMerrifield,R. B.: J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154、 教科書として、たとえばMethods inEnzymology, Volume 289, Solid-Phase Peptide Synthesis, Edited By Gregg B.Fields, ACADEMIC PRESSなどを参酌することができる。
　この場合は、α－グルコース、β－グルコース、α－マンノース、Ｎ－アセチル－β－グルコサミン、α－フコース、Ｎ－アセチル－β－ガラクトサミンなどを導入することができるがこれに限定されない。
　また、酵素化学的につくれる場合は、これも使用することができ、ペプチド鎖に酵素反応で保護基糖質を導入する場合、以下の修飾基の導入において使用する糖転移酵素「以外」の糖転移酵素を使用することが好ましい。
　本発明の方法では、次に、（Ｂ）工程として、（Ａ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程が実施される。この工程において、修飾基を保護ペプチドに付加することは、修飾基を導入する工程を化学反応によって行う場合は、たとえば、修飾基として、なんらかの糖（天然型・非天然型は不問）で、かつその水酸基が保護（例えば、アセチル基やベンゾイル基等のアシル型保護基、ベンジル基、メチル基やアリル基等のエーテル型保護基、イソプロピリデン基やベンジリデン基等のアセタール型保護基等）されたものを用いて、実施することができる。このような方法としては、糖転移酵素を用いる生化学的方法のほか、化学的方法によるグリコシル化反応を用いることができる、糖転移酵素を用いるほうが好ましい。特異的に特定の場所に所望の糖鎖を転移させることができるからである。
　糖転移酵素：β１，４－ガラクトース転移酵素、α－１，３－ガラクトース転移酵素、β１，４－ガラクトース転移酵素、β１，３－ガラクトース転移酵素、β１，６－ガラクトース転移酵素、α２，６－シアル酸転移酵素、α１，４－ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２－フコース転移酵素、α１，３－フコース転移酵素、α１，４－フコース転移酵素、α１，６－フコース転移酵素、α１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、α１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，４－マンノース転移酵素、α１，２－マンノース転移酵素、α１，３－マンノース転移酵素、α１，４－マンノース転移酵素、α１，６－マンノース転移酵素、α１，２－グルコース転移酵素、α１，３－グルコース転移酵素、α２，３－シアル酸転移酵素、α２，８－シアル酸転移酵素、α１，６－グルコサミン転移酵素、α１，６－キシロース転移酵素、β－キシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３－グルクロン酸転移酵素、ヒアルロン酸合成酵素；ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン：ポリペプチド－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、プロテインＯ－フコース転移酵素、プロテインＯ－マンノース転移酵素、プロテインＯ－グルコース転移酵素；Ｏ-フコシルペプチド３－β－アセチルグルコサミン転移酵素；およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン　プロテインＯ－マンノースβ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、あるいはppGalNAc-Ts（GalNAc転移酵素；　ｐｐＧａＮＴａｓｅ（Glycobiologyvol．13no．1 pp．1R±16R，2003を参照のこと）としては以下を挙げることができる：ppGaNTase-T1（ウシ；ＧｅｎＢａｎｋ番号（以下同様）：L07780/L17437）、ppGaNTase-T1（ラット、Rattusnorvegicus U35890）、ppGaNTase-T1（ヒトHomo sapiensX85018）、ppGaNTase-T1（マウス Musmusculus U73820）、ppGaNTase-T1（ブタ、 D85389）、ppGaNTase-T2（ヒト、Homo sapiens X85019）、ppGaNTase-T3（ヒト、Homo sapiens X92689）、ppGaNTase-T3 （マウス、Musmusculus U70538）、ppGaNTase-T4 （マウス、Musmusculus）、ppGaNTase-T4 （ヒト、Homo sapiensY08564）、ppGaNTase-T5 （ラット、Rattusnoregicus AF049344 ）、ppGaNTase-T6 （ヒト、Homosapiens Y08565）、ppGaNTase-T7 （ラット、Rattusnorvegicus AF076167）、ppGaNTase-T7 （ヒト、Homosapiens AJ002744）、ppGaNTase-T9 （ヒト、Homosapiens AB040672）、ppGaNTase-T10 （ラット、Rattusnorvegicus AF241241）、ppGaNTase-T11 （ヒト、Homosapiens Y12434）、ppGaNTase-T12 （ヒト、Homosapiens AB078146）ppGaNTase-T13（ヒトHomosapiens AB078142）。）；POFUT1（フコース転移酵素）など。好ましい実施形態では、ppGalNAc-Tsを使用することができるが、これに限定されない。
　本発明において使用されうる各糖転移酵素は、転移する位置に特異性ないし優先性がある（たとえば、Chem．Biol．2004，11，1009-1016）ことから、目的とする糖ペプチドにおける糖の位置に応じて、当業者は保護基の結合位置および種類を適宜決定し、適切な糖転移酵素を用いることで目的とする位置に修飾基が入った糖ペプチドを製造することができる。
　本発明の方法では、修飾基を化学的方法によって行う場合などでは、必要に応じて、次の工程において、糖（保護基および修飾基として利用される糖）に含まれる水酸基の保護基を除去する。このような糖水酸基の脱保護方法としては、化学的方法（例えばNaOH/MeOHのような塩基処理）を挙げることができる。
　次に、（Ｃ）工程として、（Ｂ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの保護基を脱保護する工程を実施する。ここでは、代表的には、保護基（糖）を除去する（脱保護）ことが挙げられる。このような保護ペプチドの脱保護方法としては、糖加水分解酵素による保護基の選択的除去を行うことができる。このような選択的除去は本発明において初めて達成したものであって、従来技術である化学的方法では選択的な除去は不可能であったことから、かかる結果は、従来技術では達成できなかったものといえる。この工程において使用されうる保護基糖質に対応した糖加水分解酵素としては、たとえば、α-マンノシダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、α-フコシダーゼ、α-/β-グルコシダーゼ、などを挙げることができ、保護基に応じて当業者は適宜選択することができる。
　たとえば、保護基と糖加水分解酵素（脱保護において使用）との組み合わせについての例としては、以下の表をあげることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　このように、本発明の特徴の一つとしては、糖/切断酵素のバリエーションの多さが保護基として利点であるということができる。
　化学合成法と新規糖ペプチド合成法は相補的な関係にあるといえる。すなわち、化学合成法では、任意の糖結合能を有するアミノ酸残基を（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基など）にＧａｌＮＡｃを導入するものであり、他方、本発明の合成法では、任意の糖結合能を有するアミノ酸残基を（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ残基など）の側鎖を遊離水酸基にするものである　本発明では、いかなるペプチド基質をも用いることができる。たとえば、ＥＡ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５Ａｃなどを利用することができる。また、保護基の例としては、α－Ｍａｎ、β－Ｇａｌ、α－Ｆｕｃなどを利用することができる。転移される糖鎖としては、α－ＧａｌＮＡｃなどを利用することができる。
　本発明は、糖による保護・脱保護という手法を利用して製造されうる糖ペプチドとしては、一つの観点において、「修飾基－アミノ酸残基」の組み合わせにより以下の２グループに大別することができる。
　グループ１：修飾基－アミノ酸残基の組み合わせが天然型である糖ペプチド
　　　　　（例えばGalNAcα１→-Ser/Thr-)
　グループ２：修飾基－アミノ酸残基の組み合わせが非天然型である糖ペプチド　　　　　（例えばGalα１→-Asn-）
　本発明では、いずれのパターンであっても適用することができることが理解される。
　好ましい実施形態は、グループ１の場合であって、この場合は、通常天然型であり、酵素が利用可能といえることから、糖ペプチドの製造に酵素を有効利用することができる。
　１つの実施形態において、本発明において利用可能な糖結合能を有するアミノ酸残基は、好ましくは、以下の条件を満たすものであって
　（１）＜酵素的方法により＞修飾基が転移されうる
　（２）＜化学的方法により＞保護基が導入されうる
　（３）＜酵素的方法により＞保護基のみが選択的に除去されうる
　（４）保護基は修飾基と異なる種類のものであること
　少なくとも１つ好ましくは２つ、さらに好ましくは３つ、もっとも好ましくは４つすべての要件を満たすアミノ酸が好ましく、具体的な好ましい例としては以下を挙げることができる：アスパラギン、セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンおよびチロシン。天然型の場合は、「糖結合能を有するアミノ酸残基」に求められる要件について＜＞内の要件を満たすことが好ましい。たとえば、アスパラギン（Ａｓｎ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ヒドロキシリジンおよびチロシンを挙げることができる。これらのアミノ酸に結合する糖（鎖）として例示されるものは、Ａｓｎに対してＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）；Ｓｅｒ／Ｔｈｒに対してマンノース（Ｍａｎ），Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ），ＧｌｃＮＡｃ，ガラクトース（Ｇａｌ），フコース（Ｆｕｃ），グルコース（Ｇｌｃ）；Ｈｙｐに対してＡｒａ（アラビノース）、Ｇａｌ、ＧｌｃＮＡｃ；Ｓｅｒに対してＸｙｌ（キシロース）；Ｔｙｒに対してＧｌｃを挙げることができる。
　（１）～（４）の４つの要件を考慮した場合、セリンまたはスレオニンが簡便であるが、これに限定されない。その他のアミノ酸についても、制約条件を考慮しながら実施することができる。天然にあるということは（１）が成立し、（２）も合成すればよいので可能であるということができる（Angew.Chem. Int. Ed．2004，43，1516-1520；Angew. Chem. Int. Ed．2004，42，5186-5189などを参照のこと）。（３）についても、当業者は当該分野における公知技術を参酌して実施することができる。
　本発明において製造されるペプチドの長さとしては任意の長さのものを挙げることができる。すなわち、化学合成法または酵素を用いた方法などにより保護ペプチドを製造することができ、原理的にはこれらの方法によって製造されうるペプチドの長さには上限がないことから、理論的にはそして現実にも、任意の長さの修飾ペプチドを製造することができることが理解される。化学合成法を用いる場合は、通常、１００残基のものが提供され、これ以上のペプチドを製造するためには、ペプチド同士をつなぐライゲーションという手法を用いて、１００残基以上のペプチドを構築することができる。ライブラリーとして大量の種類を提供する場合は、単一の方法で提供することが好ましいことから、このような場合は、１００残基までの長さの修飾ペプチドのライブラリーが提供される。
　上記条件については、項目別に考えるならば、当業者は、原理的には＜＞内の条件にとらわれなくとも実施可能な場合を見出すことができ、例えば修飾基の付加反応は酵素法から化学法に置換可能であることが理解される。好ましくは、保護ペプチド→修飾基導入→脱保護を完遂するために＜＞の条件で行うのが合理的であるといえる。例えば、修飾基の付加反応においてを化学法にて行う場合、まず、保護基（糖）および修飾基（糖）それぞれの水酸基をアセチル基等で保護し修飾基をペプチドに化学的に付加した後にそれらを除去する工程が発生することから、効率が落ちる場合があるが、酵素法で修飾するにはそれらの煩雑な工程は必要ないので効率的であることからこの点で好ましい。
　別の実施形態において、本発明において利用されうる保護基としては、糖鎖、リン酸基および硫酸基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基を挙げることができる。１つの例としては、糖鎖を挙げることができ、修飾鎖とは異なる糖鎖を用いることが好ましい。
　１つの実施形態では、本発明において利用される保護基は、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、Ｎ－アセチル－β－グルコサミン、α－フコースおよびＮ－アセチル－β－ガラクトサミン、ならびにこれらの複糖および修飾糖などを挙げることができる。好ましくは、保護基は単糖である。１つの実施形態では、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、Ｎ－アセチル－β－グルコサミン、α－フコースまたはＮ－アセチル－β－ガラクトサミンなどの単糖を用いることが有利である。複雑な反応を行う必要がなく、容易に入手可能な酵素を用いることができるからである。
　１つの実施形態において、本発明において使用される修飾基は、糖鎖（単糖、多糖、複合糖など）であり、（Ｂ）工程は、糖転移酵素を用いて行うものである。好ましくは、修飾基は単糖である。ここで、使用される糖転移酵素として、目的とする修飾基に相当する糖鎖を転移することができる酵素を用いる。
　１つの実施形態において、本発明において使用される保護基は、糖鎖であり、（Ａ）工程は化学合成法により行い、（Ｂ）工程において糖転移酵素を用いて修飾基を結合させ、（Ｃ）工程において、糖加水分解酵素を用いて脱保護反応を行って本発明を実施することができる。Ａ工程を化学合成法によって行うことによって、任意の箇所に保護基を結合させることができる。
　別の実施形態において、本発明において保護基として使用される糖鎖としては、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、Ｎ－アセチル－β－グルコサミン、α－フコースおよびＮ－アセチル－β－ガラクトサミンならびに二糖などを利用することができ、本発明において使用される糖加水分解酵素としては、それぞれα－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－マンノシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、α－フコシダーゼおよびβ－ヘキソサミニダーゼならびにＯ－グルコシダーゼを使用することができる。
　１つの実施形態では、本発明において用いられる糖転移酵素は、β１，４－ガラクトース転移酵素、α－１，３－ガラクトース転移酵素、β１，４－ガラクトース転移酵素、β１，３－ガラクトース転移酵素、β１，６－ガラクトース転移酵素、α２，６－シアル酸転移酵素、α１，４－ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２－フコース転移酵素、α１，３－フコース転移酵素、α１，４－フコース転移酵素、α１，６－フコース転移酵素、α１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、α１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，４－マンノース転移酵素、α１，２－マンノース転移酵素、α１，３－マンノース転移酵素、α１，４－マンノース転移酵素、α１，６－マンノース転移酵素、α１，２－グルコース転移酵素、α１，３－グルコース転移酵素、α２，３－シアル酸転移酵素、α２，８－シアル酸転移酵素、α１，６－グルコサミン転移酵素、α１，６－キシロース転移酵素、β－キシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３－グルクロン酸転移酵素、ヒアルロン酸合成酵素；ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン：ポリペプチド－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、プロテインＯ－フコース転移酵素、プロテインＯ－マンノース転移酵素、プロテインＯ－グルコース転移酵素；Ｏ－フコシルペプチド3－β－アセチルグルコサミン転移酵素；ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン　プロテインＯ－マンノースβ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素などを挙げることができる。当業者は、当該分野において公知の技術を適宜応用して、実施例等において記載される例を参考にして、それ以外の糖転移酵素を用いて別のまたは同じ糖を転移させることができる。
　別の実施形態では、（Ｂ）工程は化学的方法により実施し、保護基および修飾基に水酸基がある場合、該水酸基は保護されており、（Ｂ）工程の終わった後、（Ｂ２）工程として、該水酸基の脱保護工程を行うことによって、本発明を実施することができる。このようないわゆる化学的方法によって修飾基を転移させる方法は、保護基および修飾基として糖鎖を用いる場合に、特異性が低いことから、これらをさらにアセチル基などで保護しておくことが好ましい。
　本発明において、グループ２、すなわち、修飾基－アミノ酸残基の組み合わせが非天然型である糖ペプチドについて考慮する場合、グループ１の修飾基－アミノ酸残基の組み合わせが天然型である糖ペプチドの場合における修飾基を導入する工程において、酵素を用いる方法を化学的方法に替えればグループ２の非天然型の結合であっても技術的に製造可能である。以下に具体的に説明する。
　グループ２、すなわち、修飾基－アミノ酸残基の組み合わせが非天然型である糖ペプチドでは、（Ａ）工程として、保護ペプチドを製造する工程では、保護基：修飾基以外の糖で、かつその水酸基が保護（例えばアセチル基）されたものを用いることが好ましい。そして、このような保護ペプチドの製造方法としては、化学合成（例えばペプチド固相合成）を用いることができる。
　（Ｂ）工程として、修飾基を保護ペプチドに付加する工程では、修飾基としては、なんらかの糖（天然型および非天然型のいずれも使用することができる）であって、かつ、その水酸基が保護（例えばアセチル基）されたものを用いることができる。このような修飾基を導入する場合、化学的方法によるグリコシル化反応などを利用することができる。このような化学的方法は、以下を参酌して実施することができる：例えばハロゲン化糖を用いるグリコシル化法、トリクロロアセトイミデートを用いるグリコシル化法、アセチル化糖を用いるグリコシル化法、チオ糖を用いるグリコシル化法等が挙げられる。
　グループ２、すなわち、修飾基－アミノ酸残基の組み合わせが非天然型である糖ペプチドでは、（Ｂ）工程の後に、次の工程を行うことによって保護基および修飾基の脱保護を行うことができる。すなわち、保護基および修飾基として糖が用いられる場合、その糖に含まれる水酸基の保護基を除去する。そのような糖水酸基の脱保護方法としては、化学的方法（例えばメタノール中、ナトリウムメトキシドや無水アンモニアを用いた反応）を挙げることができる。
　グループ２、すなわち、修飾基－アミノ酸残基の組み合わせが非天然型である糖ペプチドでは、（Ｃ）工程として、保護基（たとえば、糖、リン酸基）を除去する（脱保護）工程を行うことができる。そのような保護ペプチドの脱保護方法としては、糖加水分解酵素による保護基の選択的除去を行うことができるがそれに限定されない。
　ある実施形態では、保護基として二糖体（Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）を化学的にペプチド鎖に導入しておき、Ｏ－グリカナーゼ（Ｏ－グリコシダーゼ）（この二糖体を特異的に認識し切断する活性）という酵素によって脱保護することができる。この場合は修飾基ＧａｌＮＡｃ、保護基Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃの組み合わせで利用することもできる。このような二糖体を用いる技術は、ひとつの保護ペプチドを構築する上で色々な保護基（単糖）を組み合わせていって、もう保護基としての単糖候補がなくなってしまったような場合には特に有効である。あるいは、修飾基としてＧａｌＮＡｃを入れた後に糖転移酵素（シアル酸転移酵素等）でさらにＧａｌＮＡｃをベースに修飾していく場合にも使用することができる。
　すなわち、この場合は、以下の組み合わせで実施することができる：
修飾基：N－アセチル－α－ガラクトサミン
修飾基導入のための酵素：ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素
保護基：ガラクトシル－β１，３－N-アセチルガラクトサミン
脱保護のための酵素：O－グリコシダーゼ。
　このような、糖転移酵素、糖加水分解酵素、保護基、修飾基などの種類については、製造する糖ペプチドのデザイン、製造効率、コスト等に応じ、当業者が製造方法に適宜組み入れるもののひとつであることから、任意の手法を用いることができることが理解される。
　（修飾基を導入する方法を複数回行う方法）
　別の局面において、本発明は、２種類以上の修飾基が自在に導入された糖ペプチド、糖ポリペプチドまたは糖タンパク質を生産する方法を提供する。すなわち、本発明は、少なくとも２つの糖結合能を有するアミノ酸残基が修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法を提供する。
　本発明のこのような方法は、（Ｄ）糖結合能を有するアミノ酸残基を３以上含む保護ペプチドを得る工程であって、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも２つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていない、工程；（Ｅ）（Ｄ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；（Ｆ）（Ｅ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの該保護基のうち１種を脱保護する工程；（Ｇ）（Ｆ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの、保護されていない該糖結合能を有するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；および（Ｈ）（Ｇ）で得られた修飾基を有する保護ペプチドの該保護基のうち（Ｆ）工程のものとは異なる別の一種を脱保護する工程、を包含する。
　ここで、（Ｅ）工程における修飾基と（Ｇ）工程における修飾基とは同じであっても異なっていてもよい。異なる修飾基が用いられる場合は、複数種類の修飾基が導入された糖ペプチドが製造されることになる。
　これらの少なくとも２つの糖結合能を有するアミノ酸残基が修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法では、（単一の修飾基を導入する方法）において説明した任意の特定の実施形態を単独でまたは組み合わせて適用することができる。
　本発明の好ましい実施形態では、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程をさらに包含していてもよい。このような工程によって、さらにバラエティーに富んだ修飾基を有する糖ペプチドを製造する方法が提供されることになる。
　（修飾基が結合したペプチドのライブラリーを生産する方法）　
　別の局面において、本発明は、修飾基が結合したペプチドのライブラリーを生産する方法を提供する。この方法は、本発明の少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基が該修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法または少なくとも２つの糖結合能を有するアミノ酸残基が修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法を実施する工程を１または複数回包含することによって、実現することができる。
　たとえば、従来技術は図１３を参酌して説明される。この図では、従来技術での８種類の糖ペプチドを合成する方法が記載されている。まず、左端の欄にあるように、ペプチド合成用の樹脂（図では保護基（ＰＧ）でアミノ基が保護されたアミノ酸が担持された樹脂を例示している）を用いて固相合成法によりペプチド鎖を伸長して、適宜のアミノ酸（糖結合能を有するアミノ酸）に糖（保護基）を結合させることが必要である。しかし、この場合は、８バッチが必要であり、煩雑である。
　他方、本発明であれば、図１４に記載されるように、１種類の合成基質を用いて多種類の糖ペプチドを生産することができる。すなわち、この例では、左欄にあるように、ＰＧ－アミノ酸（ＰＧはアミノ酸保護基）に２つの異なる種類の保護基を導入した保護ペプチド（図では基質と記載）が提供される。これを、工程１において、２群にわけ、１番目の糖結合能を有するアミノ酸への糖転移を媒介する糖転移酵素を反応させる群とその処理をしない群とを作成する。工程２では、糖転移酵素処理をした群（上）に加水分解酵素Ａ（これは、黒丸を加水分解する）および加水分解酵素Ｂ（これは灰色を加水分解する）を作用させる群を作成する。酵素処理をしていない群についても、加水分解酵素Ａ（これは、黒丸を加水分解する）および加水分解酵素Ｂ（これは灰色を加水分解する）を作用させる群、ならびにこれに加えて、加水分解酵素ＡおよびＢの両方を作用させる群を作成する。さらに、工程３では、糖転移酵素を作用させる群およびさせない群とを分けておのおのの群について作成する。さらに、工程２で加水分解酵素Ａを施した群には、工程４では、加水分解酵素Ｂを作用させ、工程２で加水分解酵素Ｂを作用させた群に、工程４では、加水分解酵素Ａを作用させる。これによって、３箇所の糖結合能を有するアミノ酸について、３つ結合したもの、２つ結合した３種、１つ結合した３種および結合していない１種の８種類のものを一挙に生産することができる。
　次に、ｐｐＧａｌＮＡｃＴおよび他の糖転移酵素の組み合わせで本発明を実施したときの模式図を図１５に示す。
　基質として、図１４と同様に、２種類の保護基が導入された保護ペプチドを調製する。その後、工程１において、糖転移酵素１としてｐｐＧａｌＮＡｃＴを用いて糖を導入する。その後、工程２において加水分解酵素Ａを用いて保護基の１つを除去する。次に右側の矢印で工程３向かうと、糖転移酵素１として同様の酵素を用いて処理する。これを右側に向かって加水分解酵素Ｂで処理すると２箇所が右端及び左端が修飾された糖ペプチドが提供される。
　他方、工程２の後、糖転移酵素２（たとえば、ＳｉａＴ）で処理すると、ｐｐＧａｌＮＡｃＴで糖が導入された部位でさらに糖が導入され糖鎖が伸長する。その後同様に、工程３及び工程４を行うその際、工程３で糖転移酵素１で処理する群及び処理しない群とを作成する。その後、工程５として、糖転移酵素を導入した群について糖転移酵素１を作用させる群及び作用させない群とを作成することによって、３つ目の箇所に修飾基が結合したものと結合していないもの、右端に修飾基がないものの３種類が生産される。さらに、工程３の後、糖転移酵素２を作用させると、右端及び左端の両方の糖が伸長する。その後工程４および工程５として、糖転移酵素１の作用群および作用しない群を作成することによって、伸長した糖が左端および右端に結合し、中の糖結合能を有するアミノ酸が修飾されたものとされていないものとを生産することができる。
　ここで、糖鎖伸長反応に使用されうる糖転移酵素としては、α１，３－ＦｕｃＴ、α２，６－ＳｉａＴ、α２，３－ＳｉａＴ、β１，３－ＧｌｃＮＡｃＴ、およびβ１，４－ＧａｌＴなどを挙げることができる。
　母核糖鎖形成ないし糖鎖抗原形成の機能を担うものとしては、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ－ＩＩＩ／ＩＶ（ＳＴ，ｄ（ＳＴ））、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ－Ｉ（ＳＴｎ）、Ｃ２Ｇｎ－Ｔ３（Ｃｏｒｅ２）、Ｃ２／４Ｇｎ－Ｔ（Ｃｏｒｅ２，４），Ｃ２Ｇｎ－Ｔ１（Ｃｏｒｅ２）、Ｃ１Ｇａｌ－Ｔ１（Ｃｏｒｅ１）などを挙げることができる。
　糖転移反応のうち、母核糖鎖形成、糖鎖抗原形成については以下のことが知られている。ムチンの糖鎖のほとんどがα－Ｏ－グリコシド結合により、Ｎ－アセチルガラクトサミンとセリン、スレオニンの水酸基との結合でコアタンパク質に結合している。一般的に、Ｎ－アセチルガラクトサミンの他に、フコース、ガラクトース、Ｎ－アセチルグルコサミン、シアル酸がムチンに見いだされるが、母核糖鎖（母核領域）はＮ－アセチルガラクトサミンと直接それに結合している糖からなるものをいう。
　また、癌関連糖鎖抗原などに代表される、抗原性を有する糖鎖を糖鎖抗原という。血液型抗原に代表されるような末梢の糖鎖に抗原性を有するもの、Ｔｎ、Ｔのような母核構造及びそれらにシアル酸が結合したシアリルＴｎ、シアリルＴ、シアリルルイスＡ抗原とその異性体であるシアリルルイスＸ抗原のような抗原が例示される。
　これらの母核糖鎖形成、糖鎖抗原形成などに利用される糖転移反応に利用される糖ペプチドの生産においても、本発明が利用されることが理解される。
　（生産物）
　別の局面において、本発明はまた、本発明の少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基が該修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法または少なくとも２つの糖結合能を有するアミノ酸残基が修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法を実施する工程を１または複数回包含することによって生産される修飾基が結合したペプチド、あるいはペプチドのライブラリーを提供する。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、市販されているものを使用した。
　以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは単なる例示であって、本発明の範囲はかかる実施例に何ら限定されるものではない。
　実施例中および明細書中において、アミノ酸の残基は、略号にアミノ酸の位置を付記した形で表すことがある。たとえば、Ｔｈｒ９とは、９番目のスレオニンを意味する。
　（実験例Ａ１）
　ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号１））を基質としてｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応を行うと、Ｎ－末端側から７番目のスレオニン（Ｔｈｒ７）に優先してα－ＧａｌＮＡｃが転移される（非特許文献４、５参照）。従ってｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いる限りはＴｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃを優先的に転移させた糖ペプチドを得ることはできない。そこで本発明を適用し、Ｔｈｒ７にあらかじめβ－ＧａｌＮＡｃ残基を付加した合成ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号２）、下線部にβ－ＧａｌＮＡｃが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くＪａｃｋ　ｂｅａｎ　β－ヘキソサミニダーゼを用いたα－ＧａｌＮＡｃ残基の加水分解反応に供し、Ｔｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図１（ａ）に示す。
　（β－ＧａｌＮＡｃ付加ＥＡ２ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したβ－ＧａｌＮＡｃ付加ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号２）、下線部にβ－ＧａｌＮＡｃが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む）計４０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下で実施した。１２時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所または２箇所転移された分子量ピークが現れており、β－ＧａｌＮＡｃを付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。また、α－ＧａｌＮＡｃ残基が１箇所および２箇所転移されたそれぞれの生成糖ペプチドについて、化学構造とグリコシル化されたアミノ酸残基をＥＣＤ－ＭＳ法により分析した。結果をそれぞれ図１（ｃ－１）および図１（ｃ－２）に示す。α－ＧａｌＮＡｃが転移されたアミノ酸残基は一箇所転移糖ペプチドでＴｈｒ１１、二箇所転移糖ペプチドでＴｈｒ２とＴｈｒ１１であることが判明した。
　（β－ヘキソサミニダーゼによるβ－ＧａｌＮＡｃ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、２０μｌの水を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液１μｌをＺｉｐＴｉｐＣ１８で精製した後、１０μｌの１５０　ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ　５．０）を添加して３７℃で５分間インキュベーションし、５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　β－ヘキソサミニダーゼ（２０ｍＵ）を添加して３７℃で１２　時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１（ｂ）下段に示す。β－ＧａｌＮＡｃ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ　β－ヘキソサミニダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからβ－ＧａｌＮＡｃを除去することができることが示された。
　（実験例Ａ２）
　ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号１））を基質としてｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応を行うと、Ｎ－末端側から７番目のスレオニン（Ｔｈｒ７）に優先してα－ＧａｌＮＡｃが転移される（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）
　２８１，８６１３－８６１８参照）。従ってｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いる限りはＴｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃを優先的に転移させた糖ペプチドを得ることはできない。そこでＴｈｒ７にあらかじめα－Ｍａｎ残基を付加した合成ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号３）、下線部にα－Ｍａｎが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くＪａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いたα－Ｍａｎ残基の加水分解反応に供し、前記糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図２（ａ）に示す。
　（α－Ｍａｎ付加ＥＡ２ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｍａｎ付加ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号３）、下線部にα－Ｍａｎが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図２（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所または２箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｍａｎを付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－マンノシダーゼによるα－Ｍａｎ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液にＺｎＣｌ２を５０ｍＭになるよう添加して３７℃で５分間インキュベーションした後、５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼ（２０　ｍＵ）を添加して３７℃で２４　時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図２（ｂ）下段に示す。α－Ｍａｎ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｍａｎを除去できることが示された。
　（実験例Ａ３）
　Ｔｈｒ７にあらかじめβ－Ｇａｌ残基を付加した合成ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号４）、下線部にβ－Ｇａｌが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼを用いたβ－Ｇａｌ残基の加水分解反応に供し、Ｔｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図３（ａ）に示す。
　（β－Ｇａｌ付加ＥＡ２ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したβ－Ｇａｌ付加ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号４）、下線部にβ－Ｇａｌが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５　μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　緩衝液　ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０　ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む）計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下で実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図３（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、β－Ｇａｌを付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（β－ガラクトシダーゼによるβ－Ｇａｌ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を３７℃で５分間インキュベーションした後、１０μｌのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼ（５０　ｍＵ）　を添加して３７℃で２４　時間反応させた。反応終了後、生成物を　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより分析した。結果を図３（ｂ）下段に示す。β－Ｇａｌ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからβ－Ｇａｌを除去できることが示された。
　（実験例Ａ４）
　Ｔｈｒ７にあらかじめα－Ｆｕｃ残基を付加した合成ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号５）、下線部にα－Ｆｕｃが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くウシ腎臓α－フコシダーゼを用いたα－Ｆｕｃ残基の加水分解反応に供し、Ｔｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図４（ａ）に示す。
　（α－Ｆｕｃ付加ＥＡ２ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｆｕｃ付加ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号５）、下線部にα－Ｆｕｃが置換）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は５００μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５，５００μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０　ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計４０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図４（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基が１箇所または２箇所に転移された分子量ピークが現れており、α－Ｆｕｃを付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－フコシダーゼによるα－Ｆｕｃ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、２０μｌの１５０ｍＭ　クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ　５．０）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を３７℃で５分間インキュベーションした後、１０μｌのウシ腎臓α－フコシダーゼ（５０　ｍＵ）を添加して、３７℃で２０時間反応させた。反応終了後、生成物を　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより分析した。結果を図４（ｂ）下段に示す。α－Ｆｕｃ残基が除去された分子量ピークが現れており、ウシ腎臓α－フコシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｆｕｃを除去できることが示された。
　（実験例Ｂ１）
　ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号６））を基質としてｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応を行うと、Ｎ－末端側から１７番目のスレオニン（Ｔｈｒ１７）に優先してα－ＧａｌＮＡｃが転移される（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）　１２６，９７５－９８５参照）。従ってｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いる限りはＴｈｒ１７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃを優先的に転移させた糖ペプチドを得ることはできない。そこでＴｈｒ１７にあらかじめα－Ｍａｎ残基を付加した合成ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号７）、下線部にα－Ｍａｎが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くα－Ｍａｎ残基の加水分解反応に供し、前記糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図５（ａ）に示す。
　（α－Ｍａｎ付加ＭＵＣ１ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｍａｎ付加ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号７）、下線部にα－Ｍａｎが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭ　の基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０　ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図５（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｍａｎを付加したＭＵＣ１ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ１７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－マンノシダーゼによるα－Ｍａｎ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液にＺｎＣｌ２を５０　ｍＭになるよう添加して３７℃で５分間インキュベーションした後、５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼ（２０　ｍＵ）を添加して３７℃で２４　時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図５（ｂ）下段に示す。α－Ｍａｎ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｍａｎを除去できることが示された。
　（実験例Ｂ２）
　Ｔｈｒ１７にあらかじめβ－Ｇａｌ残基を付加した合成ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号８）、下線部にβ－Ｇａｌが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼを用いたβ－Ｇａｌ残基の加水分解反応に供し、Ｔｈｒ１７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図６（ａ）に示す。
　（β－Ｇａｌ付加ＭＵＣ１ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したβ－Ｇａｌ付加ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号８）、下線部にβ－Ｇａｌが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む）計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下で実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図６（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、β－Ｇａｌを付加したＭＵＣ１ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ１７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（β－ガラクトシダーゼによるβ－Ｇａｌ残基の脱保護）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加え残渣を完全に溶解させて、基質溶液とした。該基質溶液を３７℃で５分間インキュベーションした後、１０μｌのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼ（５０　ｍＵ）を添加して３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図６（ｂ）下段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基が１箇所転移された分子量ピークが現れており、β－Ｇａｌを付加したＭＵＣ１ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ１７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（実験例Ｂ３）
Ｔｈｒ１７にあらかじめα－Ｆｕｃ残基を付加した合成ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号９）、下線部にα－Ｆｕｃが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くウシ腎臓α－フコシダーゼを用いたα－Ｆｕｃ残基の加水分解反応に供し、Ｔｈｒ１７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図７（ａ）に示す。
　（α－Ｆｕｃ付加ＭＵＣ１ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｆｕｃ付加ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号９）、下線部にα－Ｆｕｃが置換）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は５００μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５，５００μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図７（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基が１箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｆｕｃを付加したＭＵＣ１ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ１７以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－フコシダーゼによるα－Ｆｕｃ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、２０μｌの１５０ｍＭ　クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ　５．０）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を３７℃で５分間インキュベーションした後、１０μｌのウシ腎臓α－フコシダーゼ（５０ｍＵ）を添加して、３７℃で２０時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより分析した。結果を図７（ｂ）下段に示す。α－Ｆｕｃ残基が除去された分子量ピークが現れており、ウシ腎臓α－フコシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｆｕｃを除去できることが示された。
　（実験例Ｃ１）
　ＭＵＣ５ＡＣペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡＰ（配列番号１０））を基質としてｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応を行うと、Ｎ－末端側から９番目のスレオニン（Ｔｈｒ９）に優先してα－ＧａｌＮＡｃが転移される（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）　２８１，８６１３－８６１８参照）。従ってｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いる限りはＴｈｒ９以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃを優先的に転移させた糖ペプチドを得ることはできない。そこで本発明を適用し、Ｔｈｒ９にあらかじめα－Ｍａｎ残基を付加した合成ＭＵＣ５ＡＣペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡＰ（配列番号１１）、下線部にα－Ｍａｎが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くＪａｃｋ　ｂｅａｎα－マンノシダーゼを用いたα－Ｍａｎ残基の加水分解反応に供し、前記糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図８（ａ）に示す。
　（α－Ｍａｎ付加ＭＵＣ５ＡＣペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｍａｎ付加ＭＵＣ５ＡＣペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡＰ（配列番号１１）、下線部にα－Ｍａｎが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図８（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所、２箇所、または３箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｍａｎを付加したＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質に用いることでＴｈｒ９以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－マンノシダーゼによるα－Ｍａｎ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液にＺｎＣｌ２を５０ｍＭになるよう添加して３７℃で５分間インキュベーションした後、５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼ（２０　ｍＵ）を添加して３７℃で２４　時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図８（ｂ）下段に示す。α－Ｍａｎ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎα－マンノシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｍａｎを除去できることが示された。
　（実験例Ｃ２）
　Ｔｈｒ９にあらかじめβ－Ｇａｌ残基を付加した合成ＭＵＣ５ＡＣペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡＰ（配列番号１２）、下線部にβ－Ｇａｌが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼを用いたβ－Ｇａｌ残基の加水分解反応に供し、Ｔｈｒ９以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図９（ａ）に示す。
　（β－Ｇａｌ付加ＭＵＣ５ＡＣペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したβ－Ｇａｌ付加ＭＵＣ５ＡＣペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡＰ（配列番号１２）、下線部にβ－Ｇａｌが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む）計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下で実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図９（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所、２箇所、または３箇所転移された分子量ピークが現れており、β－Ｇａｌ付加したＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質に用いることでＴｈｒ９以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（β－ガラクトシダーゼによるβ－Ｇａｌ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を３７℃で５分間インキュベーションした後、１０μｌのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼ（５０　ｍＵ）を添加して３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、生成物を　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより分析した。結果を図９（ｂ）下段に示す。β－Ｇａｌ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ　β－ガラクトシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからβ－Ｇａｌを除去できることが示された。
　（実験例Ｃ３）
　Ｔｈｒ９にあらかじめα－Ｆｕｃ残基を付加した合成ＭＵＣ５ＡＣペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡＰ（配列番号１３）、下線部にα－Ｆｕｃが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くウシ腎臓α－フコシダーゼを用いたα－Ｆｕｃ残基の加水分解反応に供し、Ｔｈｒ９以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図１０（ａ）に示す。
　（α－Ｆｕｃ付加ＭＵＣ５ＡＣペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｆｕｃ付加ＭＵＣ５ＡＣペプチド（ＧＴＴＰＳＰＶＰＴＴＳＴＴＳＡＰ（配列番号１３）、下線部にα－Ｆｕｃが置換）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は５００μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５、５００μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１０（ｂ）中段に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基が１箇所、２箇所または３箇所に転移された分子量ピークが現れており、α－Ｆｕｃを付加したＭＵＣ５ＡＣペプチドを基質に用いることでＴｈｒ９以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－フコシダーゼによるα－Ｆｕｃ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、２０μｌの１５０　ｍＭ　クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ　５．０）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を３７℃で５分間インキュベーションした後、１０μｌのウシ腎臓α－フコシダーゼ（５０　ｍＵ）を添加して、３７℃で２０時間反応させた。反応終了後、生成物を　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより分析した。結果を図１０（ｂ）下段に示す。α－Ｆｕｃ残基が除去された分子量ピークが現れており、ウシ腎臓α－フコシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｆｕｃを除去できることが示された。
　（実験例Ｄ１）
　ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴＰＡＰＴＴＫ（配列番号１））を基質としてｐｐＧａｌＮＡｃＴ２による糖転移反応を行うと、まずＮ－末端側から７番目のスレオニン（Ｔｈｒ７）に優先してα－ＧａｌＮＡｃが転移されるが（非特許文献４、５参照）、大過剰の糖供与体を用いて反応に供した場合はその後に第２、第３、第４のα－ＧａｌＮＡｃ転移がＴｈｒ１１、Ｔｈｒ２、Ｔｈｒ３の順に起こることを本発明者は発見した（図１１）。従ってｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いる限りはＴｈｒ７とＴｈｒ１１以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃを優先的に転移させた糖ペプチドを得ることはできない。そこでＴｈｒ７、Ｔｈｒ１１にそれぞれα－Ｍａｎ残基、β－ＧａｌＮＡｃ残基（天然型であるα－ＧａｌＮＡｃの立体異性体）をあらかじめ付加した合成ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴ ７ ＰＡＰＴ １１ ＴＫ（配列番号１４）、[７位]にα－Ｍａｎ、［１１位］にβ－ＧａｌＮＡｃが付加）を基質として、本発明を適用した糖ペプチドの調製が可能であるか検討した。反応工程を図１２（ａ）に示す。
　（α－Ｍａｎ、β－ＧａｌＮＡｃ付加ＥＡ２ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｍａｎ、β－ＧａｌＮＡｃ付加ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴ ７ ＰＡＰＴ １１ ＴＫ（配列番号１４）、［７位］にα－Ｍａｎ、［１１位］にβ－ＧａｌＮＡｃが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１２（ｂ）二段目に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｍａｎ、β－ＧａｌＮＡｃの二残基を付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ７およびＴｈｒ１１以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－マンノシダーゼによるα－Ｍａｎ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液２５μｌにＺｎＣｌ２を５０　ｍＭになるよう添加して３７℃で５分間インキュベーションした後、１５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼ（２０ｍＵ）を添加して３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１２（ｂ）三段目に示す。α－Ｍａｎ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｍａｎを除去できることが示された。
　（β－ヘキソサミニダーゼによるβ－ＧａｌＮＡｃ残基の除去）
　上記酵素反応液を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ　５．０）で残渣を完全に溶解させた。該基質溶液２０μｌを３７℃で５分間インキュベーションした後、１５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　β－ヘキソサミニダーゼ（３７５ｍＵ）を添加して３７℃で１８時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１２（ｂ）四段目に示す。β－ＧａｌＮＡｃ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ　β－ヘキソサミニダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからβ－ＧａｌＮＡｃを除去できることが示された。
　（実験例Ｄ２）
　Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ１１にあらかじめα－Ｍａｎ、α－Ｆｕｃをそれぞれ付加した合成ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴ ７ ＰＡＰＴ １１ ＴＫ（配列番号４７）、［７位］にα－Ｍａｎ、［１１位］にα－Ｆｕｃが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とそれに続くＪａｃｋ　Ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いたα－Ｍａｎの加水分解反応に供し、その後再びｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応とα－フコシダーゼを用いたα－Ｆｕｃの加水分解反応に供し、Ｔｈｒ２、Ｔｈｒ７にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図１６（ａ）に示す。
　（α－Ｍａｎ、α－Ｆｕｃ付加ＥＡ２ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｍａｎおよびα－Ｆuc付加ＥＡ２ペプチド（ＰＴＴＤＳＴＴ ７ ＰＡＰＴ １１ ＴＫ（配列番号４７）、［７位］にα－Ｍａｎ、［１１位］にα－Ｆucが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液　ｐＨ７．５、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１６（ｂ）二段目に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｍａｎとα－Ｆｕｃが付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ７、１１以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－マンノシダーゼによるα－Ｍａｎ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、３０μｌの１５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液２５μｌにＺｎＣｌ２を５０　ｍＭになるよう添加して３７℃で５分間インキュベーションした後、１５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼ（２０ｍＵ）を添加して３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１６（ｂ）三段目に示す。α－Ｍａｎ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｍａｎを除去できることが示された。
　（α－ＧalＮＡｃ、α－Ｆuc付加ＥＡ２ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　上記酵素反応液を減圧にて濃縮乾固した後、５０μｌの１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で残渣をで残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計８０μｌの溶液に調整し、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１６（ｂ）四段目に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｆucが付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ１１以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－フコシダーゼによるα－Ｆｕｃ残基の除去）
　上記酵素反応生成物を減圧にて濃縮乾固した後、２０μｌの１５０ｍＭ　クエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ　５．０）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を３７℃で５分間インキュベーションした後、１０μｌのウシ腎臓α－フコシダーゼ（５０　ｍＵ）を添加して、３７℃で２０時間反応させた。反応終了後、生成物を　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳにより分析した。結果を図１６（ｂ）五段目に示す。α－Ｆｕｃ残基が除去された分子量ピークが現れており、ウシ腎臓α－フコシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｆｕｃを除去できることが示された。
　（実験例Ｄ３）
　Ｔｈｒ１６にあらかじめα－Ｍａｎを付加した合成ＭＵＣ１ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＡＨＧＶＴ １６ ＳＡＰＤ（配列番号５２）、［１６位］にα－Ｍａｎが付加）を基質として、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２とシアル酸転移酵素ＳＴ６ＧａｌＮＡｃ１を用いた糖転移反応に供した後、Ｊａｃｋ　Ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いたα－Ｍａｎの加水分解反応に供し、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供し、Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ１６にＮｅｕＡｃα（２－６）ＧａｌＮＡｃα１、α－ＧａｌＮＡｃがそれぞれ導入された糖ペプチドを得ることとした。反応工程を図１７（ａ）に示す。
　（α－Ｍａｎ付加ＭＵＣ１ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　化学合成したα－Ｍａｎ付加ＥＡ２ペプチド（ＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＡＨＧＶＴ １６ ＳＡＰＤ（配列番号５２）、［１６位］にα－Ｍａｎが付加）を基質とし、ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応に供した。該反応は１２５μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計２０μｌの溶液を用い、３７℃の恒温条件下において実施した。６時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１７（ｂ）二段目に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、α－Ｍａｎが付加したＥＡ２ペプチドを基質に用いることでＴｈｒ１６以外のセリン・スレオニン残基にα－ＧａｌＮＡｃが導入された糖ペプチドを調製できることが示された。
　（ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを用いたシアル酸転移反応）
　上記酵素反応生成物を逆相ＨＰＬＣにより精製しα－ＧａｌＮＡｃ残基が１箇所導入されたペプチドを該反応の基質とした。該反応は５０μＭの基質のほか、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ　ＣＭＰ－ＮＡＮＡ、２．８７μｇ　ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩを含む計２０μｌの溶液を用い、２０℃の恒温条件下において実施した。３日後反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１７（ｂ）三段目に示す。Ｎｅｕ５Ａｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、基質中に存在するα－ＧａｌＮＡｃ残基にＮｅｕ５Ａｃ残基が導入されたシアリルＴｎ［Ｎｅｕ５Ａｃα（２－６）ＧａｌＮＡｃα１－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ］含有糖ペプチドを調製できることが示された。
　（α－マンノシダーゼによるα－Ｍａｎ残基の除去）
　上記酵素反応液を減圧にて濃縮乾固した後、２０μｌの１５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　４．５）を加えて残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液２５μｌにＺｎＣｌ２を５０　ｍＭになるよう添加して３７℃で５分間インキュベーションした後、１５μｌのＪａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼ（２０ｍＵ）を添加して３７℃で２４時間反応させた。反応終了後、生成物をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１７（ｂ）四段目に示す。α－Ｍａｎ残基が除去された分子量ピークが現れており、Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ　α－マンノシダーゼを用いて前記の生成糖ペプチドからα－Ｍａｎを除去できることが示された。
　（シアリル－Ｔｎ残基付加Ｍｕｃ１ペプチドへのｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を用いた糖転移反応）
　上記酵素反応液を減圧にて濃縮乾固した後、１０μｌの１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で残渣を完全に溶解し、基質溶液とした。該基質溶液を１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１２５μＭ　ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、１２０ｎＭ　ｐｐＧａｌＮＡｃＴ２を含む計２０μｌの溶液に調整し、３７℃の恒温条件下において実施した。１２時間反応後、１６０μｌのアセトニトリルを添加して酵素を失活させ、糖転移反応を停止した。生成物はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳにより分析した。結果を図１７（ｂ）五段目に示す。α－ＧａｌＮＡｃ残基がペプチド鎖に１箇所転移された分子量ピークが現れており、シアリルＴｎ［Ｎｅｕ５Ａｃα（２－６）ＧａｌＮＡｃα１－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ］、Ｔｎ［ＧａｌＮＡｃα１－Ｔｈｒ／Ｓｅｒ］抗原構造が混在する糖ペプチドを調製できることが示された。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
　目的とするデザインされた糖ペプチドを簡便かつ効果的に製造することができる方法であり、医薬品、農薬、食品などの分野で、応用することができる。
配列番号１：PTTDSTTPAPTTK（EA2ペプチド）
配列番号２：PTTDSTT 7 PAPTTK（[7位]にβ-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド）
配列番号３：PTTDSTT 7 PAPTTK（[7位]にα-Manが付加した合成EA2ペプチド）
配列番号４：PTTDSTT 7 PAPTTK（[7位]にβ-Galが付加した合成EA2ペプチド）
配列番号５：PTTDSTT 7 PAPTTK（[7位]にα-Fucが付加した合成EA2ペプチド）
配列番号６：AHGVTSAPDTRPAPGSTAPP（MUC1ペプチド）
配列番号７：AHGVTSAPDTRPAPGST 17 APP（[17位]にα-Manが付加した合成MUC1ペプチド）
配列番号８：AHGVTSAPDTRPAPGST 17 APP（[17位]にβ-Galが付加した合成MUC1ペプチド）
配列番号９：AHGVTSAPDTRPAPGST 17 APP（[17位]にα-Fucが付加した合成MUC1ペプチド）
配列番号１０：GTTPSPVPTTSTTSAP（MUC5ACペプチド）
配列番号１１：GTTPSPVPT 9 TSTTSAP（[9位]にα-Manが付加した合成MUC5ACペプチド）
配列番号１２：GTTPSPVPT 9 TSTTSAP（[9位]にβ-Galが付加した合成MUC5ACペプチド）
配列番号１３：GTTPSPVPT 9 TSTTSAP（[9位]にα-Fucが付加した合成MUC5ACペプチド）
配列番号１４：PTTDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にα-Man、[11位]にβ-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド）
配列番号１５：PTTDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にβ-GalNAc、[11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１）
配列番号１６：PT 2 TDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にβ-GalNAc、[2位,11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１）
配列番号１７：PTTDSTTPAPT 11 TK（[11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１～４）
配列番号１８：PT 2 TDSTTPAPT 11 TK（[2位,11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１、２および４）
配列番号１９：PT 2 TDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にα-GalNAc、[2位,11位]にα-Manが付加した合成EA2ペプチド；図２）
配列番号２０：PTTDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にβ-Gal、[11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図３）
配列番号２１：PTTDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にα-Fuc、[11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図４）
配列番号２２：PT 2 TDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にα-Fuc、[2位,11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図４）
配列番号２３：AHGVT 5 SAPDTRPAPGST 17 APP（[5位]にα-GalNAc、[17位]にα-Manが付加した合成MUC1ペプチド；図５）
配列番号２４：AHGVT 5 SAPDTRPAPGSTAPP（[5位]にα-GalNAcが付加した合成MUC1ペプチド；図５～７）
配列番号２５：AHGVT 5 SAPDTRPAPGST 17 APP（[5位]にα-GalNAc、[17位]にβ-Galが付加した合成MUC1ペプチド；図６）
配列番号２６：AHGVT 5 SAPDTRPAPGST 17 APP（[5位]にα-GalNAc、[17位]にα-Fucが付加した合成MUC1ペプチド；図７）
配列番号２７：GTT 3 PSPVPT 9 TSTTSAP（[9位]にα-GalNAc、[3位]にα-Manが付加した合成MUC5ACペプチド；図８）
配列番号２８：GTT 3 PSPVPT 9 TSTT 13 SAP（[9位]にα-Man、[3位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図８）
配列番号２９：GTT 3 PS 5 PVPT 9 TSTT 13 SAP（[9位]にα-Man、[3位,5位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図８）
配列番号３０：GTT 3 PSPVPTTSTTSAP（[3位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図８～１０）
配列番号３１：GTT 3 PSPVPTTSTT 13 SAP（[3位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図８～１０）
配列番号３２：GTT 3 PS 5 PVPTTSTT 13 SAP（[3位,5位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図８～１０）
配列番号３３：GTT 3 PSPVPT 9 TSTTSAP（[9位]にβ-Gal、[3位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図９）
配列番号３４：GTT 3 PSPVPT 9 TSTT 13 SAP（[9位]にβ-Gal、[3位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図９）
配列番号３５：GTT 3 PS 5 PVPT 9 TSTT 13 SAP（[9位]にβ-Gal、[3位,5位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図９）
配列番号３６：GTT 3 PSPVPT 9 TSTTSAP（[9位]にα-Fuc、[3位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図１０）
配列番号３７：GTT 3 PSPVPT 9 TSTT 13 SAP（[9位]にα-Fuc、[3位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図１０）
配列番号３８：GTT 3 PS 5 PVPT 9 TSTT 13 SAP（[9位]にα-Fuc、[3位,5位,13位]にα-GalNAcが付加した合成MUC5ACペプチド；図１０）
配列番号３９：PTTDSTT 7 PAPTTK（[7位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１１）
配列番号４０：PTTDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位,11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１１）
配列番号４１：PT 2 TDSTT 7 PAPT 11 TK（[2位,7位,11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１１）
配列番号４２：PT 2 T 3 DSTT 7 PAPT 11 TK（[2位,3位,7位,11位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１１）
配列番号４３：PTTDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にα-Man、[11位]にβ-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１２）
配列番号４４：PT 2 TDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にα-Man、[2位]にα-GalNAc、[11位]にβ-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１２）
配列番号４５：PT 2 TDSTTPAPT 11 TK（[2位]にα-GalNAc、[11位]にβ-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１２）
配列番号４６：PT 2 TDSTTPAPTTK（[2位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１２）
配列番号４７：PTTDSTT 7 PAPT 11 TK（[7位]にα-Man、[11位]にα-Fucが付加した合成EA2ペプチド；図１６）
配列番号４８：PT 2 TDSTT 7 PAPT 11 TK（[2位]にα-GalNAc、[7位]にα-Man、[11位]にα-Fucが付加した合成EA2ペプチド；図１６）
配列番号４９：PT 2 TDSTTPAPT 11 TK（[2位]にα-GalNAc、[11位]にα-Fucが付加した合成EA2ペプチド；図１６）
配列番号５０：PT 2 TDSTT 7 PAPT 11 TK（[2位,7位]にα-GalNAc、[11位]にα-Fucが付加した合成EA2ペプチド；図１６）
配列番号５１：PT 2 TDSTT 7 PAPTTK（[2位,7位]にα-GalNAcが付加した合成EA2ペプチド；図１６）
配列番号５２：AHGVTSAPDTRAHGVT 16 SAPD（[16位]にα-Manが付加した合成MUC1ペプチド；図１７）
配列番号５３：AHGVTSAPDT 10 RAHGVT 16 SAPD（[16位]にα-Man、[10位]にα-GalNAcが付加した合成MUC1ペプチド；図１７）
配列番号５４：AHGVTSAPDT 10 RAHGVT 16 SAPD（[16位]にα-Man、[10位]にNeuAcα2-6GalNAcαが付加した合成MUC1ペプチド；図１７）
配列番号５５：AHGVTSAPDT 10 RAHGVTSAPD（[10位]にNeuAcα2-6GalNAcαが付加した合成MUC1ペプチド；図１７）
配列番号５６：AHGVTSAPDT 10 RAHGVT 16 SAPD（[16位]にα-GalNAc、[10位]にNeuAcα2-6GalNAcαが付加した合成MUC1ペプチド；図１７）

Claims (17)

  1. 以下の工程：
    　（Ａ）糖結合能を有するアミノ酸残基を２以上含む保護ペプチドを得る工程であって、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていない、工程；
    　（Ｂ）（Ａ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；および
    　（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの保護基を脱保護する工程、を包含する、
    少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基が該修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法。
  2. 前記糖結合能を有するアミノ酸残基は、アスパラギン、セリン、スレオニン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジンおよびチロシンから選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記保護基は、糖鎖、リン酸基および硫酸基からなる群より選択される少なくとも１つの置換基である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記保護基は、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、β－ＧｌｃＮＡｃ、α－Ｆｕｃおよびβ－ＧａｌＮＡｃ、ならびにこれらの複糖および修飾糖からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  5. 前記修飾基は糖鎖であり、前記（Ｂ）工程は、糖転移酵素を用いて行うものである、請求項１に記載の方法。
  6. 前記保護基が糖鎖であり、前記（Ａ）工程は化学合成法により行い、前記（Ｂ）工程において糖転移酵素を用いて修飾基を結合させ、前記（Ｃ）工程において、糖加水分解酵素を用いて脱保護反応を行う、請求項１に記載の方法。
  7. 前記糖鎖は、α－グルコース、β－グルコース、β－ガラクトース、α－マンノース、Ｎ－アセチル－β－グルコサミン、α－フコース、Ｎ－アセチル－β－ガラクトサミンまたはガラクトシル－β１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミンであって、前記糖加水分解酵素は、それぞれα－グルコシダーゼ、β－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、α－マンノシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼ、α－フコシダーゼ、β－ヘキソサミニダーゼまたはＯ－グルコシダーゼである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記糖転移酵素は、β１，４－ガラクトース転移酵素、α－１，３－ガラクトース転移酵素、β１，４－ガラクトース転移酵素、β１，３－ガラクトース転移酵素、β１，６－ガラクトース転移酵素、α２，６－シアル酸転移酵素、α１，４－ガラクトース転移酵素、セラミドガラクトース転移酵素、α１，２－フコース転移酵素、α１，３－フコース転移酵素、α１，４－フコース転移酵素、α１，６－フコース転移酵素、α１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、α１，６－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素、ポリペプチドＮ－アセチルガラクトサミン転移酵素、β１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，３－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，６－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、α１，４－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、β１，４－マンノース転移酵素、α１，２－マンノース転移酵素、α１，３－マンノース転移酵素、α１，４－マンノース転移酵素、α１，６－マンノース転移酵素、α１，２－グルコース転移酵素、α１，３－グルコース転移酵素、α２，３－シアル酸転移酵素、α２，８－シアル酸転移酵素、α１，６－グルコサミン転移酵素、α１，６－キシロース転移酵素、β－キシロース転移酵素（プロテオグリカンコア構造合成酵素）、β１，３－グルクロン酸転移酵素、ヒアルロン酸合成酵素；ＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン：ポリペプチド－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素、プロテインＯ－フコース転移酵素、プロテインＯ－マンノース転移酵素、プロテインＯ－グルコース転移酵素；Ｏ-フコシルペプチド３－β－アセチルグルコサミン転移酵素；およびＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン　プロテインＯ－マンノースβ１，２－Ｎ－アセチルグルコサミン転移酵素からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
  9. 前記（Ｂ）工程は化学的方法により実施し、前記保護基および前記修飾基に水酸基がある場合、該水酸基は保護されており、該（Ｂ）工程の終わった後、（Ｂ２）工程として、該水酸基の保護基の脱保護工程を行う、請求項１に記載の方法。
  10. 以下の工程：
    　（Ｄ）糖結合能を有するアミノ酸残基を３以上含む保護ペプチドを得る工程であって、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち少なくとも２つは、保護基により保護されており、該糖結合能を有するアミノ酸残基のうち別の少なくとも１つは保護されていない、工程；
    　（Ｅ）（Ｄ）工程で得られた保護ペプチドの、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；
    　（Ｆ）（Ｅ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの該保護基のうち１種を脱保護する工程；
    　（Ｇ）（Ｆ）工程で得られた修飾基を有する保護ペプチドの、保護されていない該糖結合能を有するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程；および
    （Ｈ）（Ｇ）で得られた修飾基を有する保護ペプチドの該保護基のうち（Ｆ）工程のものとは異なる別の一種を脱保護する工程、
    を包含する、
    少なくとも２つの糖結合能を有するアミノ酸残基が修飾基により修飾された修飾ペプチドの製造方法。
  11. 前記（Ｅ）工程における修飾基と前記（Ｇ）工程における修飾基とは異なる修飾基である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 前記（Ｅ）工程および前記（Ｇ）工程は化学的方法により実施し、前記保護基および前記修飾基に水酸基がある場合、該水酸基は保護されており、それぞれ該（Ｅ）工程および該（Ｇ）工程の終わった後、それぞれ（Ｅ２）工程および（Ｇ２）工程として、該水酸基の保護基の脱保護工程を行う、請求項１０に記載の方法。
  13. 請求項２～９の特徴を少なくとも１つ有する、請求項１０に記載の製造方法。
  14. さらに、保護されていない少なくとも１つの糖結合能を有するアミノ酸残基に、修飾基を結合させる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
  15. 修飾基が結合したペプチドのライブラリーを生産する方法であって、請求項１または１０に記載に方法を行う工程を包含する、方法。
  16. 請求項１または１０に記載の方法によって生産される修飾基が結合したペプチド。
  17. 請求項１５に記載の方法によって生産される修飾基が結合したペプチドのライブラリー。
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