WO2010008100A1 - 骨格筋細胞又は骨細胞の誘導法 - Google Patents

Abstract

　この発明は、多能性幹細胞から、無血清培地中で骨細胞、軟骨細胞又は筋肉細胞を分化誘導する方法に関し、具体的には、哺乳動物由来の多能性幹細胞をBMP4含有無血清培地で培養してPDGFRα陽性中胚葉前駆細胞を誘導し、骨細胞又は軟骨細胞へ分化する方法、並びに、多能性幹細胞をBMP4含有無血清培地で培養したのち、BMP4非存在、LiCl存在下の無血清培地で培養しPDGFRα陽性骨格筋前駆細胞へ分化誘導することを含む骨格筋細胞の形成方法に関する。

Description

細胞 胞の 術分野

本 、 来の 能性 細胞から B P4 有無血清 地にてPD F 胚葉前 胞を誘導し、 この 胞 ら らに 細胞、 は、 分化させる方法に関する。 (E ) 、 細胞などの 能性 細胞の 見により、 これらの 能性 細胞を再生 療に利用するための 究が活発化して る。 特に、 ヒ ト ES ( emo ・ e a ・ ・ d B・ophys ca esea ・ ・ ・ B che ca an ch o Ca s (2００6) 345 926 932 の 立が可能にな たために、 この 細胞 ら の 、 例えば 筋細胞( ange a Na e (2００8) 22 453(7194) 524 528) 管内 ( e a o e a ・ S em 。 ・ (2００8 26(2) 372 38０)、 神経細胞 (Ueno e a P oc Na ca Sc US (2００6) ０3(25) 9554 9559)

(J a e a e 。 s (2００7) 25(8 94０ 953)などに分化 導するこ とが報告 れて るが、 実用化するには多 の 題が解決されねばならな 。 その として、 これらの 究では、 細胞の 導に際して培地に牛 清が使用 れることが多 。 この 合、 病などの感 、 再現性などの 題が 生じると予測される。 さらに血清の ットの差による誘導 率の も大き 、 再現性のある分化 導が出来な 。 また、 別の問題として、 E 胞を含む 能性 細胞の ( ) 成の 題 在する。

このよ 状況にお て、 多能性 細胞から日的の 分化させる きに、 血清を使用しな が望まし 考えられるし、 また、 成を起こさな 安全性の 分化 胞の 望まし はずである。

らは、 無血清 地を使用して多能性 細胞 ら 、 胞の前 、 前 骨格 胞を分化 導する方法に て検討して きた。

来、 に存在する 細胞が 分化する際に B P 成 因子) などの 子の 摘されてきたが(F edma e a ・ J e B。。he (2００6 98(3 538 54 、 このよ 内因性の 細胞は 髄などに非常に 微量にし 存在しな ため 離が難し ため、 実用的な面で問題がある。 また、 ES 胞などの 能性 細胞 ら、 、 、 細胞を分化 導 することに関しては、 十分な知見がな よ である。 明の

、 来の 能性 細胞 ら無血清 件下で骨 胞及び 胞の 分化させる方法を提供するこ を目的とする。

はまた、 来の 能性 細胞 ら無血清 件下で骨格 前 胞及び 細胞 分化 る方法を提供するこ を目的とする。

、 要約すると、 以下の 徴を包含する。

、 の 様にお て、 来の 能性 細胞をB P4 有無血 清 地で 養して PD F 胚葉前 胞を誘導し、 前 胞を回 収するこ を含む、 PD F 胚葉前 胞の 製方法を提供する。

その 態にお て、 明で使用され得る多能性 細胞は、 (ES である。

別の実 態にお て、 地中の B P4 度が、 n 又はそれ以上であ る。

別の実 態にお て、 多能性 細胞の 、 X ０ 2X ０5である。 別の実 態にお て、 間が 4 7 日の間である。

別の実 態にお て、 PD F 胚葉前 、 PD F ECU 性 細胞 比 て gr Tbx6 伝子をよ 多 発現する。

別の実 態にお て、 P F 胚葉前 、 E F 2 E D、 T ad 伝子をさらに発現する。

別の実 態にお て、 PD F 胚葉前 、 、

分化する能力を有する。 別の実 態にお て、 である。

明は更に、 2の 様にお て、 上記 義の 法によって作製され得る、 、 P FR u F D 性細胞 比 て r、 Tbx6 伝子をよ 多 発現するこ を特徴とする P F f 胚葉前 胞を提供する。

その 態にお て、 P F m 胚葉前 、 E F 2 g D、 T

伝子をさらに発現する。

、 3の 様にお て、 上記 義の P F 胚葉前 胞 ら 、 分化 導することを含む、

胞の 法を提供する。

明は更に、 4の 様にお て、 上記 義の PD FR 胚葉前 胞 を含む、 骨組織 組成 を提供する。

その 態にお て、上記 、骨髄 位 の である。

明は更に、 5の 様にお て、 来の 能性 細胞をB P4 有 無血清 地で 養したのち、 地 ら P4を除去し、 さらに、 L を含有す る無血清 地で 養し、これによ て骨格 前 分化 導するこ を含む、 骨格 細胞の 法を提供する。

その 態にお て、 多能性 細胞が、 ( 胞である。

別の実 態にお て、 上記 義の 法が、 有無血清 地で 、 生 じた細胞群から PD F 性骨格 前 胞を選抜することをさらに含む。

別の実 態にお て、 上記 義の 法が、 PD FR 性骨格 前 胞を、 F 、 H F F Fを含む無血清 地で 養したのち、 地から H Fと FGFを取 り除き F 独で 養し、 その 、 F H Fの 養し、 これに よ て骨格 細胞を誘導することをさらに含む。

別の実 態にお て、上記P F 性骨格 前 、 y 5 性及び yoD 性の である。

別の実 態にお て、 上記 細胞が、 ( yogen n) 性及び 4 性である。

定義

明細書で使用する用語は、 以下の 味を包含する。 明細書で使用する 能性 細胞 と 、 の 胞に分化する能 力 自己 力を有する 化な 胞を指し、多分化 とも呼ばれる。 このよ 細胞には、 例えば 細胞 ( E (e b on c S e oe ) )、 生殖 ( E (e b yon cge mCe ) )、精子 細胞 ( S (ge e s e Ce ) 、 人工 能性 ( P )、 ク ン 細 胞 ( n E ) などが含まれる。

明細書で使用する B P4 、 タ ク (bone o phogene c p o e n) を指し、 T F 8ス ァ に属し、 他の骨 タ ク と同様に、 軟骨の 、 特に歯や の 、 骨折の 復に関 与して ると われて る。

明細書で使用する PD F 、 血小板 容体 (p a。。 de vedg o h ac o ece o を指し、 の 胞に発現 して る分子 8万の膜 タ ク質で ンキナ ゼ 性をも PD F 容体(PD FR)の である。

明細書で使用する 胚葉前 と 、 構成する 3 の ( 葉、 中胚葉及び ) の ちの である中胚葉の中の沿 胚 葉に由来の、 胞に分化 能な 胞を指す。

明細書で使用する 又は と 、 細胞 面に発現する 特定の 伝子 カ の 在に て使用される。 伝子 カ が 存在するとき 、 一方、 遺伝子 カ が存在しな とき であると 。

書で使用する 血清 と 、 血清を含まな 動物 の 地を意味する。 の わ に、 成長 子などのホ 類、 結合タ ク 、 細胞 子などを含み、 これによ て細胞の 増殖を良好にする 地である。

明細書で使用する 、 ヒ ト、 サ 、 チン ンジ な どの 、 イヌ、 ネ などの 類、 ウシ、 ウ 、 ブタ、 ヒツジ、 ヤギなど の 畜類、 ウス、 ラッ 、 ムスタ 、 ウサギなどの他の動物などを 定的 に包含する。 まし である。 また、 、 ヒ ト を含む 物を指す。

明細書は本願の 先権の である日本国 2００8 86348号の明細書 および または図面に記載される内容を包含する。 面の 単な説明

、 ウス E PD F 胚葉前 胞を分化 導するため の 件の 討及 果を示す。 aは、 PD F 胚葉前 胞の 合 に及ぼす、 地に添加する B P4の 度の 響を表す図である。 bは、 P F 前 胞の 合に及 、 ES 胞の の 度の 響を表す 図である。 c 、 E 胞 と増殖 と 係を示す図であり、 白の 、 期 を表し 黒の 、 の を表す。

、 PD F 胚葉前 胞の 合に及ぼす、 養日数の 響を表す ( )、 胞の 状を示す ( ) である。 、 中胚葉 生に関わる遺 伝子 現の 的変化を表す。 ０ Se um は 表す。 T g Tbx6 Pax3 c 3 4 、 遺伝子 カ であ 、 アクチ ( c )は ト である。 は、 F Sによ て分離したPD F 性細胞分 (フラク ョ 2 3 4) ( ) 伝子 析の ( ) を示す図である。

2は、 B P4によ 導された中胚葉前 胞の 、 胞 の を示 す。 (a) V o での 前 (pa ax a e de a P o en o ce P P。) 化、 内 (E PD F a ) の 成能の であ る。 地で誘導 28 後に力 ウムを する za n edにて 色 した。 (b) nV o での 前 (P Pc) 化、内 (E PD F a ) の 成能の である。 地で誘導 2 後にム 糖 を する c an B euにて 色した。 どちらも中胚葉前 高 形成能を 示す。 スケ は ００ を示す。 (c) E nLac ES 来の 胚葉前 胞 を免疫不全 ウスの 移植し28 後にLac 色を行 析した。 で示 す 色の E 来の である。 の 縁に多 置するのが分 る また 段ではLac 色に加え、 胞を める P 色も行 た。 E 来 の 胞にも分化して るのが分 る。 ( ) ネ のスケ は ００ 、 パネ のスケ は ０ m を示す。 ( ) E nLac E 来の 胚葉前 胞を免疫不全 ウスの さ た骨格 に移植し28 後にLa。 色を行 析した。 ネ で緑に光る細胞が ES 来の である。 骨と 骨に分化して るのが分かる。 スケ は ００ m を示す。

3は、 (a) 形成に関わる遺伝子の 現を表した図である。 P4を初期 に加え、 後期にL を加えることで、 y。D と た骨格 伝子が発現す ることが分かる。 アクチン( c n)は ト である。 (b) 伝子 現によ 、 最適な 間を解析した。 この 果 ら B P4を3 間、 L を 4 間加えたものが最適であると考える。 (。) 前 導によ て得られ た ラク ョン ( 、 1 2 3) びその 伝子 示す ( )。 (d) 血清 導による 導のプ ト を表した図である。 (e) F H F F Fの み合わ により、 ン( yoge n) F4 た骨格 化遺伝 子の 現が増加することを示して る。 ( ) ン ( )およ び アクチン( ) 性細胞の 。 スケ は 5０ mを示す。 明を実施するための

明に て、 以下でさらに詳細に説明する。

PD F 胚葉前 胞の

、 来の 能性 細胞を B 4 有無血清 地で 養して PD FR 胚葉前 胞を誘導し、 胚葉前 胞を回収することを含む、 PD FR 胚葉前 胞の作製方法を提供する。

明の 、 無血清 地を使用して、 (E ) 胞などの 能性 細胞 から にして P F 胚葉前 胞を誘導するこ ができるか 題を解決する。 これまで、 F k 性の 前 胞が、 ac v n B P4 を無血清 地に加える 、 は低 濃度のB P4で誘導することによ ES 胞 から分化する こ と が報告 れて る (E a e a ・ (2００8) e e s 26(2 4０ 411)が、 胚葉前 胞の 血清 に関する はほとんど な 。

らは、意外にも B P4を含有する無血清 地にお て効率よ PD F 胚葉前 胞を誘導できることを見出した。 この 導の 率には、 以下に 述 るよ に、 B P4の 度、 出発 胞の 度などが大き 影響する。 られ た PD F 胚葉前 、 、 胞及び 胞に分化する能 力を有すること、 並びに、 前 胞からさらに、 骨格 前 、 らに

胞を形成するこ ができることが今回 明した。

下に、 PD FR 胚葉前 胞の 製に て説明する。

能性 細胞

法では、 多能性 細胞が出発 として使用される。 能性 細胞に は、 上記 義の お 、 細胞 ( ES )、 生殖 ( E )、 精 子 細胞 ( S )、 人工 能性 細胞 ( PS 、

細胞 ( n E ) などが含まれる。 まし 多能性 細胞は、 ヒ ト 来 の 能性 、 例えば ES 、 ヒ ト P 胞などである。

ES 、 期発生にお て主要な場を形成する の 由来 する幹細胞であり、 生殖 胞を含むあらゆる を構成する細胞に分化する 能力を内在して る。 もとも ウス ES 胞が 9 年に発見、 立された( ・J・ Evans ・H Kau man ( 98 ) Na e 292 54 56)が、 その 、 ヒ ト、 サ な どの 来の E 立された 言われて る (J・ ・ Tho son e a ・ ( 99(9 Sc e ce282 45 47 Tho so e a ( 995) P oc Na cad Sc US 92 7844 7848 Thomson e a ( 996) B o ep od 55 254 259 J Tho son と ・ a sha ( 998) C Top Dev B o 38 33 65)。 E 、 ウス E 同様に、 ア カ オス ァタ ゼ T 3 4を発現する以外に、 ヒ ト の 発現する SE 3 SSE 4などの 原も発現するこ が示 れて る (J・ ・ Hende sone a ・ (2００2) S e e s 2０ 329 337)

E 胞は、 対象 物の 精卵の 胞 ら を取出し、 クス

胞をフィ ダ にして 立し維持するこ ができる。ヒ ト E 胞の 立と 持の 法に ては、例えばH・ e o e a ・ (2００6) B oche B ophys es o 345 926 932 Ueno e a (2００6) P oc Na cad Sc US ０3 9554 9559などに記載されて る。サ E 胞の樹立 持の 法に て は、 例えばH e o e a (2００ ) Dev Dyn 222 73 27 H Kawasak e ・ (2００2 P oc Na ca Sc U 99: 58０ 585などに記載されて る。 ヒ ト ES 、 ヒ ト 精卵の 胞から を取出し、 イト イ

ウス (オ タ ( 京、 日本)などから入手 ) のフィ ダ 上で 養し 立、 持することができる。 地として、 例えば ０・ 2 メ カプト タノ 、 ０・ ア ノ 、 2 L グ タ 、 2０ KS 4ng j F Fを補充した E F 地を使用し、37C 2 ０ 98 気の 囲気 E 胞を維持するこ ができる (０ Fu aka e a ・ (2００8 Na B o echno ・ 26 2 5 224 。 また、 ES 、 3～4 おきに する必要があり、 このとき、 、 例えば m Ca 2０ KSRを含有する PB 中の０・25 ト プ ン 0・ g ゲナ ゼ を用 て行 ことがで きる。

E 胞の 、 般に、 ア ス ァタ ゼ、 c 3 4 Na og ox2 などの 伝子 カ の 現を指標にしてRea T eP R法で行 こ ができる。 特に、 ヒ ES 胞の 択では、 CT 3 4 N N S０ 2 E などの 伝子 カ の 現を指標とするこ ができる (E K oone a ・ (2００8) Na B o echno ・，

c 3 4 は、 生殖 特異 に発現する 子である (H N a (2００ Ce c F nc 26 37 48 pesce H・ R cho e (2００ ) S e e s 9 7 278) Na og は、 桑実胚の で発現し始め、 その 、 の 最大の 現を示し、 分化 でほ 現が認められな 。 Sox2 は、 転写 子の であ 、受精卵、内部 、生殖 発現が認められて る。

細胞の に ては、 山中伸 ， 化学 78:27 33 (2００6)( ) などに記載されて る。

細胞は、精巣由来の 能性 胞である。この 、E 同様に、 Nanog などの 伝子を発現し、 の 列の 胞に分化 能であ 、 ウス に移植する キメラ ウスを作出できるなどの 質をも (K Sh noha a e a (2００4) e : ００ ０ 2)

生殖 、 生期の 原生殖 胞 ら 立される、 ES 同様な 性をも 細胞である ( a su e a ( 992) Ce 7０ 84 847 J L Res ck e a ( 992 Na u e 359 5０ 5 )

能性 細胞は、特定の プログラ グ ( えば、０ T3 4 S０ 2 KLF4 C の 合わ ０ T3 4 ０ 2 KLF4の 合わ ０ T3 4 ０ 2 N N L N の せなど) を、 N 又はタン ク質の形態で体 胞に導入することによ て作製することができる、 E 同様の 能性と増殖 を有する人工 細 胞である (K Takahash and a anaka(2００6) e 26:663 676 K Takahash e a (2００7 e 31 861 872 u e a (2００7) c e ce 3 8 9 7 192０ 際公開 0 2００7 ０69666)

n S 、 術によ て作製されたク 来のES であり、 受精卵 来のES ほぼ同じ 性を有して る (T・ kaya ae a (2００ ) Sc e ce 292 74０ 743 J By e e a (2００7) Na u e 45０ 97 5０2) すな わち、 精卵の核を体 胞の 置換することによ て得られたク 胚の 内部 塊 ら 立された ES ES( uc ea a s e ES) である。

ES 胞の 製のためには、 (J・B・ C be e ・ ( 998) Na e B o echno ・ 16 642 646) ES ( )の み合わせが利用される。 B P4 有無血清 地

本 明の 法では、無血清 地を使用すること、 地にB P4を添加することを 特徴とする。

B P4 (bo e mmO ho ene c P o e n 4) は T ス ァ に属す るタ ク質であり、 他の骨 タ ク と同様に、 軟骨の 、 特に歯 や の 、 骨折の 復に関与して ると われて る。 B P4はまた、 筋肉の 、 骨の鉱 にも関与して ると われる。 ヒ ト胚の発生の際に、 B P4は胚 の初 化に必要な重要な グナ 子であ 、 また 織の 化を刺 激する。 B P4のクロ ング 性に ては、 例え J ozneye a ・ ( 989) Sc e ce 242 528 534 da e a 1995) DN Seq 5(5):273 275 BL osenz e g e a ( 995) P oc Na cad c U g2( 7): 632 7636 等 に記載されて る。

明で使用し得る B P4は、 来の B P4、 その 異体、 びその 修飾 導体の ずれ である。 明細書で単に B P4 記載する場合は、 特 別の がな 限 、 来のB P4、 その 異体、 びその 学修飾 導 体の ずれをも指すもの する。

来のB P4の 基配 及びア ノ 、N B ( )の ebサイ ト にアクセスするこ によ て入手し得る。 えばヒ ト B P4 の 、 N ００ 2０ 3０85０ N 3０85 などであ 、 ウス 来のB P4の 、 N ００7554などである。 異体は、多能性 細胞 ら PD F 前 胞を誘導する能力を有し、か 、天然 B P4のア ノ 8０ 上、 85 上、 好まし は9０ 上、 95 上、 98 上の同一性を有するア ノ 列 を含むものである。 ここで、 一性は、 2 のア ノ 列のアラインメ ト にお て、 を導入する はギャッ を導入しな で 列を整 さ たときに、 ア ノ (ギャッ 数も含む)に対する同一ア ノ の 分率 ( ) を意味する。 一性は、 例えばBL Tア ズム (N B ) を利用して 決定するこ ができるし、 また ア ムを利用する 、遺伝子 ク (N B など) ら同一性のある グ 列を検索することができる。BMP4の 異体( 然の 然変異体、 遺伝子 来の 異体、 選択的スプライス 異体、 人工 異 体などを含む)は、 し は複数の( まし は、 し は数個の)ア ノ酸の 欠 、置換、付加 入を含み、例えば 換として、電気 ( 性、塩 )、 極性 性、 構造的 ( の 、 ) などの 質が 似したア ノ の 換が含まれる。 異体は、 天然 B P4 同様に、 N ク ング、 遺 伝子組 え技術、 ボ メラ ゼ 鎖反応(PCR)、 部位 然変異 、 P 用の 然変異 法などの の 術を利用して作製することがで きる (J ammb OOk e a ・ eCU a O ng LabO a。 y a a 3 d ed・ o d p ng Ha bo Labo a o y P ess (2００ ) F us be e a Sho P o oco s n o ec a B o ogy 5 ed John ey ons nc 2００2 な ど)。 B P4 の化学修飾 導体は、 、 水溶性ボリ ( えば チ グリ ) 、 、 ア キ アシ 体などを含むことができる。 B P4タン ク質は、 以下に限定されな が、 例え ば D Sys ems社 ら入手 能である。

０ 明で好まし 使用 能な無血清 、 タ ク 成分 してイ スリン トランス のみ らなる無血清 地に、最終 度で０・2 ア 、 ０・ 2 メ カプト タノ 、 又はそれ以上のB P4を添加して 調製される 地である。 血清 地としては、 例えば P 4０ D E Du becco S od ed Ea e ed u ) Ham S F 2などの

地を、 必要に応じて改変し、 又は任意に組み合わ て使用することができ る。 地には、 上記タ ク 成分の他に セ ナト リ ク 、 タノ ア などを含有 ることができる。 適な 地の 体例は、 S C ne SF０3 ( 、 東京、 日本) であり、 P 4０ ( に改変 、 D E F の 地からなる。 この 、 ウス 血幹細胞の して開発され たものであ 、 明における分化の 導に際して他のホ ン、 成長 子など の 分なタ ク質による影響を回避するこ ができる 点を有する。 し し、 必要であれば、 成長 子などのホ ン類を適 、 地に添加するこ が できる。 明の 法では、 無血清 地中の B P4 度、 E 胞などの 能性 細胞の 、 並びに 間が重要である。

地中のB P4 、 g m 又はそれ以上、 好まし は ～ ng m 又はそれ 以上である。 この 囲である g では、 P FR 胚葉前 胞 の 34 5０ 向上する。

ES 胞などの 能性 細胞の な 、 X ０～2X ０ である。 PD FR 胚葉前 胞 の 、 細胞 X ０ の 5 であり、 細胞 2 ０ の 34 であ 、 細胞 5

０ の 5 激減する。

間ほ、 4 ～7 はそれ以上、 好まし 5 ～7 、 より好まし は 5 日である。

F 胚葉前 胞の づけ

上記の によ てE 胞などの 能性 胞から られる PD F 胚 葉前 、 、 分化する能力を有して る。 こ の 性によ 、 前 、 骨の 生のために使用することができる。 P F 胚葉前 胞をさらに、発現 伝子 カ に て特徴 ける と、この 、P F E 性細胞 比 て sgn ( ００ ０5569・ 、 Tbx6(N ００5442など) De a k。 (DLL N ００56 8 3) 伝子をよ 多 発 現する 徴を有して る ( )。 また、 E3 の カ の他に、 前 駆 E F (N ００2253 など) E D(N ０ 4237 など) B achy y (T N ００93０9) ad (N ００ 797など) 伝子をさらに発現して る ( )。 方、 PD F F 性細胞は、 g Tbx6 伝子をほ んど又は全 発現しな し、 、 胞 の を有して な こ ら、 s n Tbx6 伝子の 現を カ とすることによ て

分化する ど を判定することができる。

P F E D 細胞に ても発現 伝子 カ を調 る 、 、 T 伝子が弱 発現して るこ ら、 胚葉前 胞が含ま れて る 考えられる ( )。 この点では、 胞や軟骨 胞に分化する

前 胞に て、PD F mは必ずしも 性である必要はな もしれな したが て、 、 上記 義の 法によ て作製され得る、 か 、 PD F 性細胞 比 て Tbx6 伝子をよ 多 発現するこ とを特徴 する P F 胚葉前 胞を提供する。

この 、 E F 2 E 、 d 伝子をさらに発現するこ を特 徴として る。

胞の

、 上記 P F m 胚葉前 胞 ら 、

分化 導するこ を含む、 胞の 法を提供する。

明の P F 胚葉前 胞を患者の 位に移植する と、 前 、 、 特に 、 又は軟 胞に分化し、 非常に強 、 骨組織 成能をも ( 2C )。 しかしながら、 この 、 骨格 細胞 の を有して な た。

年、 幹 胞を用 た 療に対する要望が増大してお 、 この 野の 究 も活発化して る。 細胞や、 骨髄 血から 離された内在 分化 前 、 から 導される 細胞 ( 血幹細胞、 細胞、 細胞、 神経 細胞、 上皮 細胞、 血管内 細胞など) は、 対応する の 胞に分化する能力を有して る。 えば、 細胞は、 、

( )、 筋肉細胞、 心筋細胞、 、 胞などに分化すると わ れて る。 の 細胞は、 胞の０・００～０・０ 非常 な た め、 幹細胞の には過度の 担を要すると思われる。

これに対して、 明の 、例えばE 胞などの 能性 細胞 ら容易な 作で、 、 胞に分化する能力をも PD F 胚葉前 胞を 得ることができると 点を提供する。

細胞の

上で説明した PD FR 胚葉前 、 胞及び 胞 の を有して るが筋肉細胞 の をもたな 。 そこで、 多能性 胞 ら 肉 細胞 の 化を誘導する方法を研究した結果、 前 胞をB P4 存在 、L ( リチウム) を含有させた無血清 地で することによ て骨格 細胞 分化 導することが見出された。

したが て、 はさらに、 来の 能性 細胞をB P4 有無血清 地で 養したのち、 地 ら B P4を除去し、 さらに、 L を含有する無血 清 地で 養し、 これによ て骨格 細胞 分化 導することを含む、 骨格 細 胞の 法を提供する。

、 初め、 上記 B P4 有無血清 の項で記載したよ 地中で 養し、 その 、 B P4を除去し、 L を含有する無血清 地中で 養を継続する。 体的には、 B P4 での E 胞などの 能性 細胞の 、 3～5 目で B P4を除去し、か 適には 2・ 5 ～ 5 を添加した以外には上記 同 様の 血清 地にてさらに ～4 養をさらに 続する。 このとき、 より好適 には、 B P4を 3 日で取 除き、 2・ 5 L を4 加する。 これによ て、 胞の 75 P F 性骨格 前 胞に分化 導 れる ( 3b) この 、 L 有無血清 地で 、 生じた細胞群から PD F 性骨 格 前 胞を選抜するこ をさらに含むことができる。PD F 性骨格 前 、 y 5 性及び yo 性の であるので、 これらの 伝子 カ の 現を指標にして上記前 胞の 抜を行 こ ができる。 また、 このとき、 の 者での 成を回避するために、 胞を、 例え ソ タ を使用して分離 去するこ が重要である。

次に、 上記のよ にして得られた PD F 性骨格 前 胞 ら 細胞 を誘導する。 そのための 態によれば、 PD FR 性骨格 前 胞を 4x cm2の 度で、 ラ ゲ タイプ トディッ 上で F ( nsu n ke o hFac o ) 2 ０ g H F (Hep oc e o hFac o ) 5～2０ ng F F (F b ob as o h Fac o ) ～5 を含む無血清 (イ スリ トランスフ リ のみ らなる無血清 ( えば F ０3) に、 最終 度で 0・ 2 ア ブ ン、 0・ 2 メ カプト タノ を加 えたもの) で ( 3 )したのち、 地 ら H Fと F Fを取 除き F 独で 養し ( えば4 ) 、 らに F H Fの ( 7 ) する。 には、 この 法の 順が経時的に例示されて る。

記の 法によ て、 多能性 細胞 ら、 成熟した骨格 細胞を誘導するこ ができる。 細胞は、 ン( yo e n) 性及び F4 性であるので、 これらの 伝子 カ の 現を指標にし、 RT P 法で確認することができる。 明の 法で作製された上記の PD F m 胚葉前 、 患部にお て 骨組織を修復、 形成するために使用することができる。 この 、 例えば 、 骨折、 関節 ウ チを含む 、 先天性骨 成不全症、

症などの 療のために使用することができる。

様に、 明の 法で作製 れた上記の 細胞 、 患部にお て 織を修復、 形成するために使用することができる。 この 、 例えばDuchenne 型 ジス ト フィ 、 福山 ジス ト フィ 、 候群などの 療のために 使用することができる。

ずれの 合にも、 患者の 、 骨、 又は筋肉の 位、 欠損 位、 炎症 位などに上記 胞を移植することによ て組織の 部を修復するために使用でき 。 えば、 PD F 胚葉前 胞を、骨髄 位もし は

移植することができる。

P F 胚葉前 細胞は、 物 らト プシ で細胞を 収し、 生体 合性の 体に浮遊させ、 患部 直接 入することができ 。 5

る 植に要するこれら 胞の 、 X ０～ 7

０ 度であるが、 この 囲に限定されな 。

ある は、 前 である PD F 胚葉前 、 三次元 的組織構造を形成するための 場となるよ イド ゲ ( えばア ギネ )、 イド タイ トなどと組み合わ た組成 となして、それを患 部に充填してもよ 。

明を 下の 、 ウス E 胞を例示しながらさらに 体的に説明す るが、 明の はこれらの 体例によ て限定されな ものとする。 ES 胞の n V o

E E LacZ 伝子を発現して る( E L。Z)ES 西川 一博士 ( 生研、 兵庫、 日本) よ 分与される。 肉、 骨、 骨のもととなる ( ) 胚葉 (Pa ax a mesode )に分化さ るため、 E 胞をタイ 4 ラ ゲ ( ゼラチン 、 大阪、 日本) で トした ０cm ヤ 養し、 F ０3 ( ( 京、 日本) F ０3は、タ ク 分として、イ ス 、 トランス のみ らなる無血清 地であ 、 京都大学医学部分子

究室( 都、 日本) ( 化学研究所 学研究センタ 細胞 グ プ( 庫、 日本)) における ウス 前 胞を対象とした研究成果 に づ て開発されたもの ) に最終 ０・ 2 ア ブ 、 ０・ 2 me cap oe hano g B P4 ( 伝子組み換え R Sys e ) を加えて培 養した。 4～7 、 前 PD F 性細胞として現れ、 これを ソ タ で分離してさらに 養した。 前 胞 の 3 上 P4 を含油 地で 、 地を変えて、 2・ 5 を含む F０3 地でさらに4 養した。 らに筋肉細胞に分化さ るため、 細胞を ソ タ で分離し、 タイプ ラ ゲンで トした 24 プ トで2ng F ( Sys e s) と ng H F ( D Sys ems) 2ng bF F (R Sys e s)を加えた F ０3 地で 養した。 そして3 後さらに 地を2 g F を含む F ０3 地に変換 し、 5 2 g F ng H Fを含む F ０3 地で7 養した。

および に ては、 ak a e a ・ S e e s (2００ 24 3) 575 86を参照して こ ができる。

体、 細胞 、 F

P 5(an PD FR ) E D2(an E )は西川 究室 ( ) より分与、 ビオチン P 5 は フ ィ ト ス ト プ ト ア ビジ (Phycoe y h n s ep av d n) (B Pha ngeめで染色した。 ノ ク ナ 2 ィ ア ン(a ophycocyan ( P )) 結合させた。

0・０5 ト リプ EDT で分離さ 、 F a で解析し、 F a age HG (Bec o D ck son)で細胞分離を行 た。 2０００

ク ト ( HE N) 2００ サギ

( yo e ) (San aC uz) ００ ウサギ アクチン( ke e a sc e c b a で 、 ０ ク ト exa488 ウサ ギ g ( nv o en)で yoge n と c H P g CHE C N) でそれぞれ二次 色した。

ES 胞の ウス の移

らは ウスの 験を名古屋大学 知、 日本) 針に従 て行 。

た。 PD FR E D ( )と D F E D。( e 3 4) の 5x 5 上の細" ソ タ を用 て"分離し、最終 2・ 5x ０ ce S

E ( ０ Fe a Bov ne e u (FBS) ００はM 2 E) で浮遊させ KSN ヌ ド ウス(N hon L )の (大 頭筋) を させ、 筋肉 に注射した。 また 胞 の 化を行 ため、 関節から 骨の 2 射針で移入した。 RT P T P は常法に従 て行 た。 用したプライ は に示す。 T P Rの 、 変性(Dena u a on) 94C3０ 、 ア ング( nea ng) 62C3０ 、 伸長(Ex ens on) 72C 分を サイク し、3０ ら35サイク のP を行 た。 P で使用したプライ

伝子

5 T TT T C T 3

aC n

5 C CTC T T C C 3

5 TT T TCTC T 3 3

PD FR

5 T T TCTC T 3 4

5 C T C TTT C 3 5 E F 2

5 T T T T TT 3 6

5 CT T T T 3

B achyu y T)

5 GAC TT 3 8

5 T TT GTT TT 3 9 esogennMsgn

5 TC C C TCTT 3 0

5 T T C T 3

Tbx 6

5 T T T TC T T C T 3 2

5 C T T G AC 3 3

D

5 T ATCA 3 4

5 T T T G 3 5 c 3 4

5 CC TC C T A T 3 6

5 A T CCTC CCTCC 3 7

Na o

5 C T G T TCC 3 8

5 CT CT ACT CT 3 9

Pax 3

5 TT CT CTT TT 3 20

5 C T TTT C T TT T 3 2

Pax 7

5 T CT C T T 3 22

5 TTT CC TTT 3 23 y 5

5 T TT TTTT CT 3 24

5 T T 3 25 yo D

5 T GTT C T TT TGT T 3 26

5 A T T 3 27 yogen

5 TT TT T TG T 3 28

5 T T C T CCC T C 3 29 F4

5 TT TCCT TT TT A 3 30

5 T T T 3 3

Foxa2

5 T A T 3 32

5 T 3 33 ox

5 C T TT 3 34

5 TC T T C 3 35

Cadhe Cad

5 TT T T T T C TC 3 36 P4 がPD F 胚葉前 胞をE 胞 ら 率的に誘導する B P4による 胞の 胚葉 化をP FR の 現を指標にして調 た。その 果、 6 、 B P4なしでは 3 であ たが g B P4で 34 化し、 その や に増加した。 このあと g B P4に固定して実験を行 た ( a)。 度がPD F 性細胞分 5

化に与える影響を調 た。 x 胞を ０c で 養した場合P FR 胞が5 増加した。2x ０ では34 それ以上ではP F 胞の割合が減少した( b)。そして、 どの 合が最 も細胞 が増加する 調 た こ 2x ０ 最も効率よ 5 5倍 に増加した( c 。 それで2x ０ 胞を 養して、 何日後に最も多 のPD F 性細胞が現れる を調 たところ、 4日にPD F 性細胞が現れ、 5日 に45 ビ クに達した( d， 。 態も E 胞の 形 ら cobb eS one 様に変化した ( )

胚葉 生に関わる遺伝子 現を経時的に解析する 、 児の 生と同じよ 序で 伝子 現が移り変わ て こ が確認された( )。 最も初期の 胚葉 カ である Tが分化3 日から発現しており、 その後は分化が進むほ ど 現が減少する。 わ て 胚葉 ら (So e) 成に関わる分子であ る s n Tbx6の 現が分化4 日 ら強 認められ、 分化6 日には減少する。 さらに (So e ら (De o y o めが形成されるための 要な分子 Pax3が分化5 目 ら強 現れ・ 7 日には減少する。 また カ である 0。 4は分化が進むに れて に発現が減少してゆ 。これらの 化か ら考えると、このBMP4を添加した ステム 際の 生を忠実に再現し た デ であると考えられる。 さらにこの よ 導されたP F 性細胞 が 確 に 胚葉 であるの を確認するため、 ラク ョンを F にて分離し 伝子 現を解析した ( ) P F 性分 であるフラク ショ は予想通 Tbx6 sgn D などの 胚葉 カ を強 発現して た 。 ま た ( esenchyma Ce ) の カ で あ る ad ( s eob as cadhe n)もこのフラク ョ に強 発現して る。

カ である ０c 3 4 Nano はPD FR EC 性及び 性の ( ラク ョン 3 4)に強 発現してお 、 また カ である Foxa もこの で強 発現して た。 このこと ら E と 化及び

カ で分離された F 性及び 性の 、やはり 化な 葉の 胞を多 であり、 胚葉 カ である G によ て分離された n F 性分 胚葉の である ことがわ った。さらにPD F E D である ラク ョ 2はTbx6 s n などの 胚葉 カ を弱 発現してお 、 この にも 胚葉の 存在すると考えられる。 このフラク ョン2をフラク ョ 合わ て 胚葉の 考えると、 P4 加の 導にお て分化6 日では 胚葉前 胞は実に8０ もの 率で誘導されると考えられる( o 次に示す 、 胞 の を評価する実験では、 この ラク ョン ラク ョ 2 を合わせた細胞 胚葉前 (p""x a 。。d。 o en o Ce s (P Pc)) して扱 て る。

MP で誘導した 胚葉前 胞は軟骨 骨に分化する

次に、 らは、 P4によ 導 れた 胚葉前 、 胚 葉 織である 、 分化する能力を有するかど を V o n 方で解析した。 6 目の 胚葉前 n V oの 導にお て、 性の 分な力 ウム ト ック を 一に形成す る 分化した( 2a)。 方で 化な 胞を多 PD F E D 胞は一部の でのみ a Red 性の ウム 着を認めた。 これは 化な 胞の 部が骨 導に反応して ウム 性にな たと考 えられる。 しかしながら 胚葉前 ウ 体に 一に力 ウム ト リック を形成してお 、 胚葉前 胞の が 導に反応する 較 的 一な である 考えられる。

次に、 導にお ては、 胚葉前 微小 ( c o ass cu u e)によ て 成された 度の の 心に、 c a B ue 性 の 胞の 成を認めた( 2b 。 方、 PD F ECD 性細胞は同じ高 度の を形成するものの c an B ue であ 、 胞の 認められな た(n 4)。 上の結果 ら、 B P4 によ 導された 前 v にお て 胞及び 胞 の 分化 を有するこ とが明ら とな た。

次に P によ 導された 胚葉前 胞の nV voでの 胞 の を解析するため、免疫不全 ウスの 直接 6 日の 胞を移植した。

4週に 骨の 織を観察すると a。 性の 来の 中 心に認、められた( 2。 )。 質の中にも 在したが、 特に の 縁 の 分に多 認められた( 2。 )。この 胞の 在する 非 常に近 と考えられ、 また 胚葉前 胞の でもある

1 を特異 に発現して るため ( ) P 色を行 分 化して る ど かを解析した( ? ， )。 想通 の 縁に P 性の 域が多 認められたが、 この中の 部には 性の核を持 ものも 在した ( )。 上によ 、 P によ 導された 胚葉前 、 nV vo にお て 胞 の を有するこ が明ら とな た。

さらに、 この 胚葉前 軟骨 成を促進しな 環境でも細胞 律的 (ce a ono o s)に 軟骨 と分化する能力を有して る ( 2d)。 させた 疫不全 ウスの大 頭筋に分化6 日の 胚葉前 胞を直接 植し、 4 間後に組織を解析した。 その 果、 再生中の 組織の中に異 および 組織の 成を認めた( d ) 3)。 この 骨及び 組 織は皮膜で われており、他の組 含まれておらず、奇形 ではなか た。 またこれら 性であ 、移植された細胞 来であることが確 認、された( 。 これらの 果によ 、 P4によ 導された 胚葉前 非常に強 、 骨組織 成能を持 と考えられた。

し しながら 滅した骨格 に移植したにも わらず、 B P4によ 導され た 胚葉前 細胞 分化して なか た(デ タ さず， n 8) P ウスの 生にお て、 V 5や yo と た 伝子 Vo en c egu a o ene)の 現を抑制することが知られて る ( eshe e a e es and Deve o e 998) 2(3) 29０ 3０3)。 また 伝子の 進には グナ が深 関わ て ること 知られて る (Pa ke e a Na e ev e ene cs 2００3) 4(7) 497 5０7) そこで次に、 骨格 細胞

2０ 導のためB P4を取 除き、 グナ を代用して、 ca en nを 移行き る作用を持 L を 地に加える実験を行 た。

L は筋肉細胞をE ら 導する

ウス E 胞を骨格 細胞 分化させるため、 これまでのB P4 加での 導と比 、 B P4を 3 日で取 除 たもの B P4を3 日で取 除 と同時 にL を ～ の 囲 加した条件での 化を試みた。 7 養し た P にて遺伝子 現を解析した( 3a) B P4 独で誘導した細胞は分化 7 目で ( e O yo o e)の カ である Pax3の 認めるものの、筋 原 ( yogen c eg a o y ac o )である yoDの 認められ な た。し しながら分化3 目でB P4を除 た 常にわず では あるが y 5の 現が認められた。 さらにL を添加した では全てでMy 5 の 現を認め、 2・ 5 5 の 度では yoDの 現も強 確認 れた。 これら の 果 ら、 B P4 を分化の 期に取 除 こ によ り、 筋原 (myogen c ac o )の 現が誘導され、 さらにL 加による グナ により 子 現が元 することが明ら とな た。 降の 験ではL の 2・ 5 を 度として実験して る。 B P4を用 ずに最初 ら L Lのみで誘導 した場合には、 y yo のみならず Pax3の 現もほ んど 、められな た。

胞分化の 究にお ても B P4が初期のp m veS eak ypeの 胚葉 導を促進する 告もあり (P cke a ・ S emCe s (2００7) 25(9) 22０6 4) これらの ES 分化 にお て初期のB P4 激が中胚葉 成には必要で あることを示唆して る。

次にB P4を除きL 加する最も適切な期間を解析した( 3b )。 この yoDの 現が最も強 見られたのはB P4を3 目で取 除きL を4 加したも 、 B P4を4 目で取 除きL を3 加した 件であ た。 B P4 間が長 ほど y 5の 現が減少し、 L C 導の 間が長 ほど yo の 現が増加した。 この 果 ら、 な B P4を 3 日で 取 除きL を4 加する 件として、以降の 験を行 た。 B P4を 3 日で取 除き 2・ のL を添加した場合の PD F 低の経時的な発現

F にて解析した( 3b ) PD F は時間とともに発現が増加する傾向を 、 L 4 目にほ74 もの P F 性であ た。 B P4 で 分化 導した場合 比較してP F E 2 半分程度であ 、 PD FR E D 性分 はわず 5 極めて少な な て た( 3c)。 これ らの の 伝子 現を RT P 解析すると、 予想通 P F 性分 Pax3 Pax7 性の 胚葉 であ 、 y yoD も特異 に発現して た。PD F E D 性にお ても Pax7の 現が認められたが、神経細胞の カ であ る ox がこの で特異 に発現してお 、 Pax7は神経系の 胞にも発現して ることから、 このPax7の 神経細胞 化を現して ると考えられる。

カ である ０c 3 4および Na o カ である Foxa は P FR E 性分 に強 発現しており、 P4 導 同様の 果であ た。 しかしながら PD F E の 伝子 B P4 導と は異な 、 中胚葉 カ の はな 、 カ カ が 弱 発現して るのみであ た ( 3c)。 上の結果 ら B P4を 3 目で取り除 きL を4 加した骨格 細胞の にお ては、PD FR 性分 が骨格 前 胞を含むPop a onであることが分か た。

次に 得られたP FR 性細胞を n V oで成熟した骨格 分化する 方法を試みた( 3d) 。 ウスの 体にお て骨格 の 細胞である (5 a e e Ce )が骨格 と分化する際に F H F F F が重要な役割を果たす 事が知られて る ( ha g。 。 a Phys o og ca ev e s 2００4) 84( 2０9 38)。 3dは、 y 5 yoD 性の ( yob as )が ン( yoge ) F4 性の ( yo be ) と 合する際の成 子を n V oで再現した 法である。 B P4を 3 日で取 除きL を 4 加する によ 導された y yoD 性細胞を P F を カ に分離し これを o agen Ty e ディッシ 上に再 養し、 初期には H F bF Fを全て える。

増殖する際にはこれらの 全て 進的に働 が、 増殖した 胞が

F4 性とな 、融合する際にはH F bF Fは抑制的に働 ( ha e a Phys o og ca ev e s (2００4 84( ): 2０9 38)。 そのため一定期間で H F bF Fを取 除き F するこ で ， F4 性細胞 が誘導される ど を解析した( 3e)。 めから F 独で誘導した細胞で も は 性となるが、 も発現するのは初めの 3 H Fおよび を添加した 導方法であ た。 この めの 3 間ほ F に加えH Fおよび を添加し、その 4 間ほ nP 独で再 養した細胞の の 現 を ベ でも確認した( F )。核が 性 な て る の が か確認 れた。 になって るものも認、められた。 またこの 性細胞を成熟した骨格 細胞 と分化さ るため、さらに F と F で誘導を試みた。 7 後に アクチ 性の 細胞が められ た( ， 。 上の結果 ら、 らは、 無血清 ES 胞 ら成熟 した骨格 細胞 と誘導する方法を確立した。 上の利用 能性

明によ て、 無血清 で中胚葉前 胞を誘導し、 さらに

分化さ るこ 、 は 前 胞 ら 細胞 分化さ る ことが可能にな た。 成された細胞を患者の 筋肉の 位に移植するこ とによって、 位を修復するこ が可能になる。 特に、 多能性 細胞として 患者 来の 胞を使用するときには、 免疫学的 絶反応を誘発しな 上記 胞を作製することができると 別な利益が提供される。

明によ 、 骨、 織の 傷、 欠損 位の 復と治療 を可能 するので、 細胞を利用した 療のために有用である。

明細書で引用した全ての 行物、 特許および 願をそのまま して 木明細書にと 入れるものとする。

Claims

求の

・ 来の 能性 細胞をB P4 有無血清 地で 養してPD FR 前 胞を誘導し、 胚葉前 胞を回収することを含む、 PD FR 胚葉前 胞の 製方法。

2・ 能性 細胞が、 (E ) である、 請求 載の 。

3・ B P4 度が、 ～ n 1又はそれ以上である、 請求 1又は2 載の 。

4・ 能性 細胞の 、 5

０～2X ０ である、 請求 ～3の ずれ 1 載の 。

5・ 間が 4 ～7 日の間である、 請求 ～4の ずれ 1 載の 。

6・ PD F 胚葉前 、PD F E D 性細胞 比 て r、 Tbx6 D 伝子をよ 多 発現する、請求 ～5の ずれ 載の 。

7・ P F 胚葉前 、 E F 2 E 、 T ad 伝子をさ らに発現する、 請求 6 載の 。

8・ P F 胚葉前 、 、 分化す る能力を有する、 請求 ～7の ずれ 1 載の 。

9・ 物が である、 請求 ～8の ずれ 載の 。

０・ ～9の ずれ 1 載の 法によ て作製され得る、 、 PD F E D 性細胞 比 て sg Tbx6 D 伝子をよ 多 発現す るこ を特徴とする PD F 胚葉前 。

・ E F 2 E 、 T ad 伝子をさらに発現する、 請求 1０ 載 のP F 胚葉前 。

2・ 1０又は 1 載の PD F 胚葉前 胞 ら 、 分化 導することを含む、 I 胞の 。 3・ ０又は 載の PD F 胚葉前 胞を含む、 骨組織 組成 。 A・ 位 の である、 請求 3 載の 。 F・ 来の 能性 細胞を P4 有無血清 地で 養したのち、 地 ら P4 除去し、 さらに、 を含有する無血清 地で 養し、 これ によ て骨格 前 分化 導することを含む、 骨格 細胞の 。

・ 能性 細胞が、 (E ) である、 請求 5 載の 。

1 有無血清 地で 、 生じた細胞群から PD F 性骨格 前 胞を選抜することをさらに含む、 請求 6 載の 。

R v 性骨格 前 胞を、 F 、 H F F Fを含む無血清 地で 養したのち、 地 ら F F Fを取り除き F 独で 養し、その 、 n の 養し、 これによ て骨格 細胞を誘導することをさ らに含む、 請求 載の方 。

rnFR 性骨格 前 、 V 5 性及び yo 性の である、 請求 7 載の 。

n・ 細胞が、 性及び F4 性である、 請求 5 9 の ずれ 載の 。