[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2009008529A1 - Ｔｄｐ－４３凝集物に特異的に結合する抗体 - Google Patents

Ｔｄｐ－４３凝集物に特異的に結合する抗体 Download PDF

Info

Publication number
WO2009008529A1
WO2009008529A1 PCT/JP2008/062650 JP2008062650W WO2009008529A1 WO 2009008529 A1 WO2009008529 A1 WO 2009008529A1 JP 2008062650 W JP2008062650 W JP 2008062650W WO 2009008529 A1 WO2009008529 A1 WO 2009008529A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
amino acid
tdp
acid sequence
phosphorylated
Prior art date
Application number
PCT/JP2008/062650
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Masato Hasegawa
Tetsuaki Arai
Takashi Nonaka
Fuyuki Kametani
Haruhiko Akiyama
Original Assignee
Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research filed Critical Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Priority to US12/667,624 priority Critical patent/US8940872B2/en
Priority to EP08778121.7A priority patent/EP2189526B1/en
Priority to JP2009522694A priority patent/JP5439176B2/ja
Publication of WO2009008529A1 publication Critical patent/WO2009008529A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to an abnormal aggregate of TDP-43 protein, a detection agent and a detection method for a TDP-43 protein lesion containing the antibody, and a pharmaceutical composition for treating TDP-43 protein About.
  • TDP-43 (TAE DNA-binding protein of 43 kDa) binds to TAE (trans activation responsive region) DNA and is known to be a nuclear factor involved in transcriptional regulation and alternative splicing .
  • TDP-43 is a form of ubiquitin-positive intracellular inclusions (NCI) and degenerative protrusion-like structures, such as frontotemporal lobar degeneration (FTLD), including frontotemporal dementia.
  • NCI intracellular inclusions
  • FTLD frontotemporal lobar degeneration
  • a protein that aggregates and accumulates in degenerative neurons Arai T et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Dec 22; 351 (3): 602-11. Epub 2006 Oct 30, Neumann M et al., Science. 2006 Oct 6; 314 (5796): 130-3).
  • TDP-43 can also accumulate in neurons such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Guam Parkinson dementia complex, and Kii Peninsula Parkinson dementia complex. These diseases are known collectively as TDP-43 proteinosis (TDP-43 protein accumulation disease). Abnormal accumulation of TDP-43 is observed at the lesion site of each disease and is considered to be closely related to the cause of neurodegeneration in these diseases.
  • TDP-43 In addition to binding to TDP-43 that is normally present in the brain or spinal cord, it was also known to stain normal TDP-43 present in the nucleus by immunostaining of brain or spinal cord specimens. . On the other hand, TDP-43 was found to be highly phosphorylated and accumulated in the brain or spinal cord of patients (Arai T et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Dec 22; 351 (3): 602- 11. Epub 2006 Oct 30, Neumann M et al., Science. 2006 Oct 6; 314 (5796): 130-3). However, there have been no reports on phosphorylation sites or enzymes involved in phosphorylation. Disclosure of the invention
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the problem to be solved is an antibody that specifically binds to an abnormal TDP-43 protein aggregate, and a TDP- containing the antibody. It is intended to provide a detection agent and detection method for 43 proteinosis lesions, and a pharmaceutical composition for treating TDP-43 proteinosis.
  • TDP-43 which constitutes a ubiquitin-positive inclusion body
  • TDP-43 abnormally accumulated in degenerated neurons is partially phosphorylated.
  • an antibody prepared using a synthetic peptide containing this phosphorylated amino acid as an antigen specifically binds to an abnormal aggregate of TDP-43 protein, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • a protein having TDP-43 activity wherein at least one amino acid residue in the mutant amino acid sequence is phosphorylated.
  • At least one amino acid residue is at least one selected from the group consisting of a serine residue, a threonine residue, and a tyrosin residue.
  • At least one amino acid residue is selected from the group consisting of amino acid residues 393, 403, 404, 409 and 410 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the antibody according to (1) or (2) which is at least one selected.
  • a TDP-43 prosthesis comprising the antibody according to any one of (1) to (11) Tinopatitis lesion detection drug.
  • a diagnostic agent for TDP-43 protein comprising the antibody according to any one of (1) to (11).
  • a pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of (1) to (11) as an active ingredient.
  • a method for detecting a TDP-43 proteinosis lesion which comprises reacting the antibody according to any one of (1) to (11) with the collected test sample.
  • TDP-43 protein abnormality observed in patients who develop TDP-43 proteinopathy such as FTLD and ALS? Since it can bind specifically to dishes, it is useful for the diagnosis and treatment of these diseases.
  • FIG. 1 is a diagram showing the results of analyzing the specificity of the antibody of the present invention by Western plotting.
  • FIG. 2 shows the results of examination of the reactivity (specificity) of anti-pSer409 phosphorylated peptide antibodies by ELISA.
  • FIG. 3 shows the results of examination of the reactivity (specificity) of anti-pSer410 phosphorylated peptide antibodies by ELISA.
  • FIG. 4 shows the results of examination of the reactivity (specificity) of anti-pSer409,410 phosphopeptide antibody by ELISA.
  • FIG. 5 shows the results of immunostaining of FTLD brain tissue using commercially available TDP-43 antibody and pS409 antibody.
  • FIG. 6 is a diagram showing the detection result of abnormal TDP-43 by ELISA.
  • FIG. 7 is a diagram showing the detection result of abnormal TDP-43 by Western blotting.
  • FIG. 8 is a diagram showing the detection result of abnormal TDP-43 by Western plotting method. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the present invention relates to an antibody that specifically binds to phosphorylated TDP-43, a detection agent and a detection method for TDP-43 proteinosis containing the antibody, a therapeutic pharmaceutical composition for TDP-43 proteinosis, and the like. . '
  • TDP-43 accumulates abnormally in neurons of the brain or spinal cord of patients with TDP-43 proteinosis, and TDP-43 proteins such as ubiquitin positive intracellular inclusion bodies (NCI) and denatured protrusion-like structures Abnormal aggregates are formed. TDP-43 protein abnormal aggregates are highly phosphorylated. In addition, aggregated and accumulated DP-43 has a fibrous structure, and TDP-43 has changed its original structure by phosphorylation. It is done.
  • NCI ubiquitin positive intracellular inclusion bodies
  • the present inventors focused on the fact that a part of the constituent amino acids of abnormally accumulated TDP-43 is phosphorylated, and further, an antibody prepared by using a synthetic peptide having this phosphorylated amino acid as an antigen.
  • the present inventors have found that the TDP-43 protein specifically binds to the abnormal protein of TDP-43 and have completed the present invention.
  • phosphorylation It has been found that the antibody of the present invention also binds to a portion where the structure of TDP-43 has changed.
  • TDP-43 is a substrate for casein kinase 1 (CK1), and that many of its substrate binding sites are also phosphorylated in the patient brain.
  • CK1 binds to the site that matches the phosphorylation consensus sequence of CK1 (pS / "XXS / T, pS /" XXXS), that is, the amino acid sequence of TDP-43.
  • the site where phosphorylation occurs is considered to be a site where the antibody of the present invention binds well.
  • the antibody of the present invention does not bind to non-phosphorylated TDP-43, but can specifically bind to phosphorylated TDP-43 and a peptide having a part thereof. Therefore, the antibody of the present invention is useful for diagnosis and treatment of DP-43 proteinases such as FTLD and ALS.
  • the “antibody” of the present invention means an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the phosphorylated TDP-43, and may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. In this specification! Therefore, an antibody or fragment thereof that specifically binds to phosphorylated TDP-43 or phosphorylated TDP-43 partial peptide is referred to as “anti-phosphorylated TDP-43 antibody”.
  • the antibody of the present invention also includes an antibody that binds to an antigenic determinant (epitope) to which the antibody of the present invention binds.
  • Antigenic determinants are all or a part of phosphorylated TDP-43, for example, the site that matches the phosphorylated consensus sequence of CK1 (pS / T ⁇ XXS / T, pS / TXXXS), that is, the amino acid of TDP-43 Among the acid sequence sites, CK1 binds and phosphorylates.
  • “specifically binds” means to bind to (react with) a phosphorylated TDP-43 protein or TDP-43 peptide (including a site whose structure has been changed by phosphorylation). Force Does not bind (does not react) to unphosphorylated protein or peptide. Whether the binding is specific or not can be confirmed by an immunological method such as ELISA, Western plotting, or immunohistological staining.
  • the antibody of the present invention includes an antibody fragment.
  • antibody fragments include Fab (antigen-binding fragment) F (ab ') 2, Fab ⁇ Fv, diabody (dibodies) dsFv, linear antibody, scFv (single chain Fv), complementarity determining region (CDR) Examples thereof include peptides. Even if the amino acid sequence of the antibody is modified, such an antibody is within the scope of the present invention as long as it can specifically bind to the phosphorylated TDP-43 or the phosphorylated TDP-43 partial peptide. included.
  • the antibody of the present invention includes chimeric antibodies, humanized antibodies, and humanized antibodies. 3. Antibody production
  • Phosphorylated TDP-43 is used as an immunogen for producing the antibodies of the present invention.
  • a peptide containing a partial amino acid sequence of the full-length sequence of phosphorylated TDP-43 can be used as the antigen.
  • the following protein (a) or (b) can be mentioned.
  • a protein having a TDP-43 activity including a mutant amino acid sequence in which one or several amino acid residues are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1; And the protein wherein at least one amino acid residue of the mutant amino acid sequence is phosphorylated.
  • phosphoric acid TDP-43 used as an antigen the amino acid sequence portion is shown in SEQ ID NO: 1, but in addition, the following mutant amino acid sequences of ⁇ ( ⁇ ) It is also possible to use TDP-43 phosphate.
  • amino acid sequence is a combination of the above (i) to (iii), and has the above TDP-43 activity.
  • ⁇ -43 activity means binding activity with a nucleic acid having a repetition of TG (thymine-guanine) or UG (uracil-guanine). Such binding activity is
  • the TDP-43 used in the present invention may be a protein having homology with the amino acid sequence as long as it has TDP-43 activity.
  • Examples of such a protein include an amino acid sequence having 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the DNA encoding the amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted, inserted or added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is TDP.
  • Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92 Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6 etc. and can be prepared according to a method such as site-directed mutagenesis.
  • mutation introduction kits using site-specific mutagenesis methods such as Kunkel method and Gapped duplex method, such as QuitChange TM Site-Dii-ected Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagene) ), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan_K, Mutan-Super Express Km: Takara Bio) and the like.
  • Kunkel method and Gapped duplex method such as QuitChange TM Site-Dii-ected Mutagenesis Kit (manufactured by Stratagene) ), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System (manufactured by Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan_K, Mutan-Super Express Km: Takara Bio) and the like.
  • the target TDP-43 protein can then be obtained by a host-expression system using conventional genetic engineering techniques (Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Haroor Laboratory Press U989)).
  • the amino acid residue to be phosphorylated is not particularly limited, but serine
  • it is at least one selected from the group consisting of a (Ser) residue, a threonine (hr) residue and a tyrosine (IVr) residue.
  • a (Ser) residue is at least one selected from the group consisting of a (Ser) residue, a threonine (hr) residue and a tyrosine (IVr) residue.
  • the phosphorylation consensus sequence (pSer / Thr-XX-Ser / hr (SEQ ID NO: 12) or pSer / ThrX-XX-Ser (SEQ ID NO: 13)) (X represents any amino acid sequence, pSer Examples of the site containing / Thr represents serine or threonine that is phosphorylated in the sequence include the following amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1.
  • Thr25 refers to the 25th Thr. The same shall apply hereinafter), Ser29, Thrl41, hrl53, Ser 180, Ser254, Ser347, Ser369, Ser373, Ser375, Ser389, Ser403, Ser404, Ser407 o
  • SEQ ID NO: 1 Phosphorylation of one or more amino acid residues of the amino acid sequences (Ser or Thr) at positions 393, 403, 404, 409 and 410 in the amino acid sequence shown in FIG. Is preferred.
  • the position corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, ie, the amino acid residue before mutation is the above-mentioned 393rd, 403rd, 404th, 409th and
  • the antigen obtained by phosphorylating one or more amino acid residues of the 410th amino acid sequence (Ser or Thr) can be used.
  • the three-letter code or single-letter code of amino acid may be used after the position.
  • the 393rd amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is serine, it is displayed as “Ser393” or “S393”.
  • the 403rd amino acid residue is serine, it is displayed as “Ser403” or “S403”. Even if it is in the same position as other amino acid residues, it is displayed according to this notation.
  • Phosphorylation to an amino acid residue was carried out by adding a casein kinase 1 (CK1), casein kinase 2 (CK2), other phosphorylase, or a crude enzyme solution containing these and ATP to a substrate solution containing TDP-43.
  • TDP-43 can be phosphorylated by incubating for several minutes to several tens of hours.
  • a substrate solution containing DP-43 can be used to grow cells in which E. coli or a plasmid containing TDP-43 is introduced into cultured cells. In addition, it can be synthesized in a test tube or prepared from raw materials. In addition to the full-length TDP-43, partially decomposed products and partial peptides are used as substrates. It is also possible to phosphorylate using such an enzyme.
  • a partial fragment of a part of the length can be used as an antigen as long as it contains not only the full length of phosphate TDP-43 but also a phosphorylation site (phosphorylated amino acid residue). Is possible.
  • this partial fragment of a length is referred to as a “partial peptide”.
  • the peptide regardless of the length of the amino acid sequence, the peptide has a partial sequence of phosphate TDP-43 and at least one amino acid residue. As long as the group is phosphorylated, it is collectively referred to as a “partial peptide”.
  • the amino acid sequence of a partial peptide preferable for use as an antigen is phosphorylated in the amino acid sequence of the protein (a) or (b) described in the above section (1-1). It is a partial amino acid sequence containing an amino acid residue, and preferably contains four or more consecutive amino acid sequences. More preferably, the length of the partial peptide is 8 to 15 sequences of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, more preferably 10 to 1 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Is an array of According to the results of neuropathology and biochemical analysis, the partial peptide preferably has a partial sequence on the C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Examples of such a partial sequence include those shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 below.
  • Peptide 388-397 ASNAGSGSGF (SEQ ID NO: 2)
  • Peptide 398-408 NGGFGSSMDSK (SEQ ID NO: 3)
  • Peptide 405-414 MDSKSSGWGM (SEQ ID NO: 4)
  • the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2, 3, and 4 are the amino acid sequences of positions 388 to 397, 398 to 408, and 405 to 414 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, respectively.
  • the partial sequence can be partially modified and used.
  • a carrier protein such as Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) or Thyroglobulia
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • Thyroglobulia a cysteine residue is added to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 above. be able to.
  • the amino acid sequence at the site where CK1 binds and phosphorylates in the phosphorylation consensus sequence of CK1 (pS / -XXS / T, pS / TXXXS) in the amino acid sequence of TDP-43, It can be used as a partial peptide in the present invention.
  • the above protein and partial peptide may be natural TDP-43 and its partial peptide purified from tissues and cells such as brain and spinal cord of mice, humans, etc., or have been genetically produced. It can be TDP-43 or its partial peptide.
  • it can be synthesized using a known protein synthesis method such as a solid phase method or a commercially available protein synthesizer.
  • amino acid residue to be phosphorylated examples include Ser, Thr and Ttyr residues, preferably Ser and Thr residues. If the amino acid residue after substitution is Ser, Thr or 1> 1, the amino acid residue is also subject to phosphorylation. .
  • examples of the phosphorylated partial peptide include those shown in SEQ ID NOs: 5 to L 1 below.
  • (PO 3 H 2 ) means that the amino acid residue described above was phosphorylated.
  • S (P0 3 H 2 ) means that Ser is phosphorylated.
  • amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is obtained by phosphorylating the sixth Ser residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and adding Cys at the N-terminus.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is obtained by phosphorylating the sixth Ser residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and adding Cys to the N-terminus.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 is obtained by phosphorylating the seventh Ser residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and adding Cys to the N-terminus.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is obtained by phosphorylating the 6th and 7th Ser residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and adding Cys to the N-terminus.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 is obtained by phosphorylating the fifth Ser residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and adding Cys at the N-terminus.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 is obtained by phosphorylating the sixth Ser residue of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and attaching Cys to the N-terminus.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 is obtained by phosphorylating the 5th and 6th Ser residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and adding Cys to the N-terminus.
  • phosphorylated TDP-43 or partial peptides may be natural phosphorylated TDP-43 purified from tissues or cells such as brain and spinal cord of mice, humans, etc. in which TDP-43 proteinosis is observed.
  • phosphorylated TDP-43 produced by genetic engineering may be used.
  • tissue such as brain and spinal cord in which TDP-43 proteinopathy is observed is fractionated into a soluble fraction and an insoluble fraction using various surfactants such as Triton_X and Sarkosyl.
  • phosphorylated TDP-43 can be obtained by dissolving the insoluble fraction in urea, guanidine hydrochloride or the like and binding it to various rams such as a heparin column or a binding resin.
  • Phosphorylated TDP-43 used as an antigen can also be synthesized using a known protein synthesis method such as a solid phase method or a commercially available protein synthesizer by designating its amino acid sequence.
  • the synthesized peptide can be combined with a carrier protein such as Keyhole Iimpet Hemocyanin (KLH) or Thyroglobulin and used as an immunogen.
  • KLH Keyhole Iimpet Hemocyanin
  • Thyroglobulin used as an immunogen.
  • a carrier or diluent such as a rabbit, inu, guinea pig, mouse, rat, goat, etc.
  • the dose of antigen per animal is 1 to: Omg when no adjuvant is used, and 5 to 500 g when adjuvant is used.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant (FCA), Freund's incomplete adjuvant (FIA), and aluminum hydroxide adjuvant. Immunization is performed mainly by injecting intravenously, subcutaneously or intraperitoneally.
  • the immunization interval is not particularly limited, and immunization is performed 2 to 10 times, preferably 3 to 5 times at intervals of several days to several weeks, preferably at intervals of 1 to 2 weeks.
  • the immunization interval is If so, it can be set in consideration of the antibody titer obtained. It is preferable to test the antibody titer after 3 to 4 subcutaneous immunizations and measure the antibody titer.
  • the antibody titer in serum can be measured by ELISA (enzvme-linked immunosorbent assay), EIA (enzyme immunoassay), radioimmunoassay (RIA), or the like.
  • non-phosphate TDP-43J non-phosphorylated synthetic peptide
  • Immunization is performed by administering the phosphoric acid TDP-43 or partial peptide prepared as described above to a warm-blooded animal by itself or together with a carrier and a diluent.
  • the dose of antigen per animal is 1 to: LOmg when no adjuvant is used, and 5 to 500 ⁇ g when adjuvant is used.
  • the type of adjuvant used, the immunity method, and the immunization interval are the same as in the production of polyclonal antibodies.
  • an individual with an antibody titer is selected and antibody-producing cells are collected. Examples of antibody-producing cells include spleen cells, lymph node cells, and peripheral blood cells, but spleen cells or lymph node cells are preferred.
  • Cell fusion between antibody-producing cells and myeloma cells is performed in order to obtain a hybridoma.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler et al.
  • myeloma cells to be fused with antibody-producing cells generally available strain cells of animals such as mice can be used.
  • the cell line used has drug selectivity and cannot survive in HAT selection medium (including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine) in an unfused state, but can survive only in a state fused with antibody-producing cells.
  • HAT selection medium including hypoxanthine, aminopterin, and thymidine
  • myeloma cells include mouse myeloma cell lines such as PAI, P3U1, NSI / l-Ag4-l and NSO / 1, and rat myeloma cell lines such as YB2 / 0. It is done.
  • Ixl0 8 ⁇ 5xl0 8 pieces of antibody-producing cells 2xl0 7 ⁇ 10xl0 7 amino and myeloma cells were mixed (cell ratio of 1 of antibody-producing cells to myeloma cells: 1 ⁇ : I: 10), performs the fusion reaction in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 6000 danoleton, Sendai virus, or the like can be used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells can be fused using a commercially available cell fusion device that utilizes electrical stimulation (for example, electroporation).
  • the cell suspension is appropriately diluted with, for example, EPMI-1640 medium containing 10 to 20% ushi fetal serum, and then plated on a microtiter plate at about 5xl0 7 / well.
  • Add a selective medium such as HAT medium to the culture medium, and then replace the selective medium appropriately.
  • a selective medium such as HAT medium
  • the grown hyperidoma is further screened.
  • the screening of the hyperidoma may be performed according to a usual method, and is not particularly limited.
  • a part of the culture supernatant contained in the well in which the hybridoma is cultured can be collected and screened by an enzyme immunoassay method, a radioimmunoassay method or the like. Specifically, after the antigen is adsorbed on a 96-well plate, it is blocked with calf serum.
  • a normal cell culture method As a method for collecting monoclonal antibodies from the established hyperidoma, a normal cell culture method, ascites formation method, or the like can be employed.
  • the hybridoma is cultured in an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium, or serum-free medium containing 10% ushi fetal serum under normal culture conditions (for example, 37 ° C, 5% C0 Incubate at 2 concentrations for 7 to 14 days and obtain antibodies from the culture supernatant.
  • an animal cell culture medium such as RPMI-1640 medium, MEM medium, or serum-free medium containing 10% ushi fetal serum under normal culture conditions (for example, 37 ° C, 5% C0 Incubate at 2 concentrations for 7 to 14 days and obtain antibodies from the culture supernatant.
  • the humanized antibody can be obtained by immunizing a human antibody-producing transgenic non-human mammal with an immunogen (antigen) and using an existing general antibody production method.
  • Methods for producing humanized antibody-producing non-human mammals, especially humanized antibody-producing transgenic mice are known (Nature Genetics 7: 13-21 (1994); Nature Genetics 15: 146-156 (1997). ) etc).
  • Hypridoma producing the monoclonal antibody of the present invention (indication for identification: TDP43_pS409 / 410) was issued on July 3, 2008 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Tsukuba City East 1-chome It is deposited internationally under the Budapest Treaty as FERM ABP-1098 at address 1 center 6).
  • One preferred embodiment of the anti-phosphate TDP-43 antibody of the present invention is a recombinant antibody.
  • the recombinant antibody include, but are not limited to, chimeric antibodies, humanized antibodies, and humanized antibodies.
  • a chimeric antibody ie, human chimeric antibody
  • CDR grafting refers to grafting the complementarity-determining region (CDR) from the variable region of a mouse antibody into the human variable region, the framework region (FR) is derived from human and the CDR is derived from mouse. This is a method for producing a reconstructed variable region. Next, these humanized reshaped human variable regions are linked to human constant regions. Methods for producing such humanized antibodies are well known in the art (Nature, 321, 522-525 (1986); J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987); Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989); see Japanese Patent No. 2828340).
  • Humanized antibodies (fully human antibodies) generally have the same structure as the human antibody in the hypervariable region (HV), the other part of the V region, and the constant region. Is. However, the hypervariable site may be derived from another animal. Techniques for producing humanized antibodies are also known, and methods for producing gene sequences common to humans by genetic engineering techniques have been established.
  • the humanized antibody is, for example, a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosomal fragment containing the H chain and L chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977) 16 , 133-143; Kuroi a, Y. et.al., Nuc.
  • antibody fragment of the present invention examples include Fab (antigen-binding fragment), F (ab ′) 2 , Fv, diabody (dibodies), dsFv, linear ⁇ body, scFv (single chain Fv; complementarity determining region ( Examples include peptides containing at least part of complementarity determining region (CDR).
  • Fab is an antibody fragment in which about half of the N-terminal side of the H chain and the entire L chain are linked by a disulfide bond among fragments obtained by treating antibody molecules with a protease enzyme papain.
  • the Fab can be produced by introducing DNA encoding the antibody Fab into an expression vector and introducing the vector into a host organism.
  • F (ab ′) 2 is an antibody fragment slightly larger than that obtained by treating an antibody molecule with a proteolytic enzyme pepsin and having Fab bound via a disulfide bond in the hinge region.
  • F (ab ′) 2 can be prepared by linking a Fab with a thioether bond or a disulfide bond.
  • Fab ′ is an antibody fragment obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 described above.
  • Fab ′ can be produced by inserting DNA encoding the Fab ′ fragment of an antibody into an expression vector and introducing the vector into a host organism.
  • scFv is a polypeptide in which one H chain V region (VH) and one L chain V region (VL) are linked using an appropriate peptide linker, and is an antibody fragment having antigen binding activity. is there.
  • scFv is expressed by obtaining cDNA encoding antibody VH and VL, constructing DNA encoding scFv, inserting the DNA into an expression vector, and introducing the expression vector into a host organism. And can be manufactured.
  • a diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs the DNA encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of the peptide linker is 8 residues or less, and expresses the DNA. And can be produced by introducing the expression vector into a host organism and expressing it.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • dsP is expressed by obtaining cDNA encoding the antibody VH and VL, constructing DNA encoding dsP, inserting the DNA into an expression vector, and introducing the expression vector into a host organism. Can be manufactured.
  • the peptide containing CDR is configured to include at least one region of VH or VL CDR (CDR1-3). Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via an appropriate peptide linker.
  • a peptide containing CDR is produced by constructing DNA encoding the CDR of antibody VH and VL, introducing the DNA into an expression vector, and introducing the expression vector into a host organism. Can do.
  • Peptides containing CDR can be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • the antibody fragment according to the above-described well-known method using the hyperpridoma of the present invention for example, a hybridoma having the receipt number FERM ABP-10984 or DNA or RNA extracted from the hyperidoma as a raw material. Can be produced.
  • the antibody of the present invention can be used as a reagent for detecting a TDP-43 proteinosis lesion.
  • TDP-43 proteinosis lesions are found in the brain and spinal cord of patients with TDP-43 proteinosis, and develop abnormal TDP-43 protein aggregates such as ubiquitin-positive inclusion bodies (NCI).
  • NCI ubiquitin-positive inclusion bodies
  • TDP-43 accumulation, insolubilization, leakage, and certain changes may result in morphological or biochemical changes in cells and tissues.
  • the anti-phosphate TDP-43 antibody of the present invention can detect and quantify phosphorylated TDP-43, it can be used as a diagnostic agent for TDP-43 proteinase.
  • Ser409 and Z For detection of TDP-43 proteinase lesions, Ser409 and Z or It is preferable to use an antibody that binds to Ser410-phosphorylated protein or peptide.
  • Methods for detecting TDP-43 proteinosis or diagnosing TDP-43 proteinosis using an anti-phosphorylated TDP-43 antibody include, for example:
  • step (b) Step of reacting the antigen-antibody complex formed in step (a) with a labeled antibody for detection
  • the signal emitted from the labeled antibody is detected.
  • the detection method or diagnostic method using the detection or diagnostic agent of the present invention may be any method as long as it is an assay using an antibody, that is, an immunoassay, such as an enzyme immunoassay (ELISA), a fluorescence immunoassay, Examples include radioimmunoassay (RIA), luminescence immunoassay, enzyme antibody method, fluorescent antibody method, immunoturbidimetric method, latex agglutination, latex turbidimetry, erythrocyte agglutination, particle agglutination or Western blotting It is done.
  • an immunoassay such as an enzyme immunoassay (ELISA), a fluorescence immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • luminescence immunoassay enzyme antibody method
  • enzyme antibody method fluorescent antibody method
  • immunoturbidimetric method latex agglutination
  • latex turbidimetry erythrocyte agglutination
  • particle agglutination or Western blotting
  • Samples to be used in the detection and / or quantification method or diagnostic method of the present invention include neural tissues such as the brain or spinal cord (eg, tissue sections of the brain) and body cells such as nerve cells, cerebrospinal fluid, and blood. It is not particularly limited as long as it is a raw material that may contain phosphate TDP-43, such as a formula fee.
  • the detection and / or quantification method or diagnostic method of the present invention is performed by an immunoassay using a labeled antibody such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay
  • a labeled antibody such as an enzyme immunoassay, a fluorescence immunoassay, a radioimmunoassay, or a luminescence immunoassay
  • the sandwich method or the competitive method can also be used.
  • at least one of the immobilized antibody and the labeled antibody may be the antibody of the present invention.
  • the labeled antibody means an antibody labeled with a labeling substance
  • these labeled antibodies are samples (for example, neural tissues and nerve cells such as brain and spinal cord, body fluid samples such as cerebrospinal fluid and blood, culture supernatant, etc. Alternatively, it can be used for detecting or quantifying an antigen contained in a centrifugal supernatant or the like.
  • the labeling substance that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can detect the presence of the labeling substance by binding it to the antibody by physical binding or chemical binding.
  • Specific examples of labeling substances include enzymes, fluorescent substances, chemiluminescent substances, piotin, Examples include avidin or radioisotope, and more specifically, penoleoxidase, alfa phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, ⁇ / cousoxidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, Enzymes such as malate dehydrogenase, catalase, luciferase or acetylcholinesterase, fluorescent substances such as fluorescein sothiocyanate, dansyl mouth lide or tetramethylrhodamine isothiocyanate, 3 H, “C, 125 Radioactive isotopes such as isi I, biotin, avidin, or chemilumin
  • radioisotopes and fluorescent substances can give a detectable signal alone, but enzymes, chemiluminescent substances, piotin and avidin alone cannot give a detectable signal, so one more kind. Reaction with these other substances produces a detectable signal.
  • an enzyme at least a substrate is required, and various substrates are used depending on the method for measuring enzyme activity (colorimetric method, fluorescence method, bioluminescence method, chemiluminescence method, etc.).
  • biotin at least avidin or enzyme-modified avidin is generally reacted.
  • Various color-developing substances depending on the substrate are used as necessary.
  • the immobilized antibody detects an antigen contained in a sample (eg, nerve tissue and nerve cells such as brain and spinal cord, body fluid sample such as cerebrospinal fluid and blood, culture supernatant, or centrifugal supernatant).
  • a sample eg, nerve tissue and nerve cells such as brain and spinal cord, body fluid sample such as cerebrospinal fluid and blood, culture supernatant, or centrifugal supernatant.
  • a sample eg, nerve tissue and nerve cells such as brain and spinal cord, body fluid sample such as cerebrospinal fluid and blood, culture supernatant, or centrifugal supernatant.
  • insoluble carriers examples include: (i) polystyrene resins, polycarbonate resins, silicone resins, or nylon resins, (ii) glass, (in) cellulose-based carriers, and garose-based carriers.
  • the kit for detecting a TDP-43 proteinopathy or the diagnostic kit for TDP-43 protein of the present invention comprises the antibody of the present invention.
  • the antibody used here may be the above-mentioned immobilized antibody or labeled antibody.
  • the kit of the present invention may include a secondary antibody for detecting a complex formed by an antigen-antibody binding reaction.
  • the kit of the present invention may contain various auxiliary agents in addition to these antibodies so that the kit can be used efficiently and conveniently.
  • auxiliary agent for example, a solubilizer for dissolving a solid secondary antibody, a wash used for washing an insolubilized carrier, and an enzyme activity is measured when an enzyme is used as an antibody labeling substance.
  • kits that are commonly used as immunological measuring reagent kits such as a substrate for the reaction and a reaction terminator thereof.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises the antibody of the present invention as an active ingredient, and is associated with neurodegenerative diseases such as TDP-43 proteinosis, Alzheimer's disease, Lewy body dementia, motor neuron disease, etc. It is effective in the prevention and treatment of diseases.
  • neurodegenerative diseases such as TDP-43 proteinosis, Alzheimer's disease, Lewy body dementia, motor neuron disease, etc. It is effective in the prevention and treatment of diseases.
  • the antibody to be used include a human chimeric antibody or HI antibody.
  • peptide-conjugated antibodies or conjugates of these peptides and BBB-permeable carriers can be mentioned.
  • the antibody of the present invention can be administered alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent, and the administration can be performed once or divided into several times.
  • pharmaceutically acceptable carrier means excipient, diluent, bulking agent, disintegrant, stabilizer, preservative, buffer,? Examples include L-agents, fragrances, colorants, sweeteners, thickeners, corrigents, solubilizers, and other additives.
  • forms such as tablets, pills, powders, granules, injections, solutions, capsenoles, troches, elixirs, suspensions, emulsions or syrups
  • the pharmaceutical composition can be prepared. These pharmaceutical compositions can be administered orally or parenterally.
  • various excipients such as microcrystalline cellulose, sodium citrate, calcium carbonate, diphosphate, and glycine are used together with disintegrants and binders.
  • disintegrating agent include starch, alginic acid, and some types of silicate double salts.
  • binder include polyvinylpyrrolidone, sucrose, gelatin, and arabia gum.
  • lubricants such as magnesium stearate, sodium lauryl sulfate, and talc are very effective for tablet formation.
  • an emulsifier and suspending agent When used as an aqueous suspension or elixir for oral administration, if necessary, an emulsifier and suspending agent may be used in combination with water, ethanol, propylene glycol, glycerin, etc., and diluents that combine them. .
  • parenteral administration include injections that contain one or more active substances and are formulated in a conventional manner.
  • an injection for example, there is a physiological saline or a commercially available carrier such as distilled water for injection so that the concentration is 0.1 ⁇ g antibody / ml carrier to 10 mg antibody / ml carrier. It can be produced by dissolving or suspending.
  • the injection prepared in this manner is a dose of 10 ⁇ g to 50 mg, preferably 100 g to 2 mg per 1 kg body weight in a single administration to a human patient in need of treatment. Can be administered once to several times per day. However, it is not limited to this range and may vary depending on the patient's weight and symptoms and individual administration routes.
  • the dose may vary depending on the sensitivity of the patient to be treated, the difference in sensitivity to the drug, the way the drug is prescribed, the administration period, and the administration interval. In some cases, a dose lower than the lower limit of the above range is appropriate. There is also.
  • injections may be prepared as non-aqueous diluents (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol), suspensions or emulsions. it can.
  • non-aqueous diluents eg, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethanol
  • suspensions or emulsions it can.
  • Such an injection can be sterilized by sterilization through a bacteria-retaining filter, addition of a bactericide, or irradiation.
  • injectables can be manufactured in the form of preparation at the time of use. That is, it can be made into a sterile solid composition by lyophilization or the like and dissolved in sterile water for injection or other solvents before use.
  • the power to explain the present invention in detail by way of examples The present invention is not limited to these examples.
  • cysteine was added to the N-terminal of the amino acid sequence of amino acid sequence number 388-397, 398-408, or 405-414 in human TDP-43 (SEQ ID NO: 1).
  • the following peptides with added sequences (CASNAGSGSGF, CNGGFGSSMDSK, CMDSKSSGWGM) and phosphorylated serine residues were synthesized by the solid phase method (Sigma Dienosis or Thermoquest) [S (P0 3 H 2 ) Represents serine phosphate].
  • non-phosphorylated peptides having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 4 were also synthesized for use in column preparation, control, and the like.
  • CNGGFGS PO 3 H 2
  • SMDSK SEQ ID NO: 6
  • 4CNGGFGS PO3H 2 ) S (PO3H 2 ) MDSK (SEQ ID NO: 8)
  • CMDSKS P0 3 H 2
  • S PO 3 H 2
  • GWGM SEQ ID NO: 1
  • the synthetic peptide was conjugated with Thyroglobuli or KLH according to a conventional method and used as an antigen.
  • 1ml lmg / ml antigen peptide physiological saline solution containing antigen peptide and 1ml Freund's complete adjuvant (Difco) were combined to form an emulsion by sonication, and a rabbit (New Zealand White, weight 2.5kg, female)
  • the immunization was divided into several power points. Two weeks after the first immunization, 0.5 ml of lmg / ml antigen peptide physiological saline solution and 1 ml of Freund's incomplete adjuvant were combined and boosted by sonication.
  • blood was collected, and the collected blood was allowed to stand at room temperature for 1 hour and then allowed to stand at 4 ° C and centrifuged at 5000 x g for 10 minutes to obtain antiserum.
  • Example 1 (2) Immunization the initial immunization and the second immunization were performed.
  • Three days after the final immunization spleens were collected from the immunized mice.
  • the collected spleen cells and the myeloma cell line were mixed at a ratio of 5: 1, and cell fusion was performed by the polyethylene glycol method.
  • HAT insectin, hypoxanthine, thymidine
  • the hybridomas that had been cultured for 7 to 14 days and proliferated were further screened.
  • Screening is an antibody in which a riton-insoluble fraction of FTLD patient brain is applied onto a PLL-coated slide glass, and the culture supernatant of the hybridoma is reacted to react with abnormal structures (dye abnormal structures). This was done by selecting clones that produced. Thereafter, a hybridoma clone producing the monoclonal antibody of the present invention was obtained by limiting dilution.
  • the monoclonal antibody of the present invention was obtained by administering the hybridoma clone prepared by the above method into the peritoneal cavity of BALB / c mice and preparing a high concentration culture supernatant.
  • the hybridoma clone prepared by the above method was injected into the peritoneal cavity of BALB / c mice that had been administered (6 days ago) 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristan). 10 7 were administered, and ascites was collected 2 weeks later.
  • the monoclonal antibody thus obtained was named pSer409 / 410 monoclonal antibody.
  • the hyperprideoma that produces the pSer409 / 410 monoclonal antibody is referred to as “TDP43-pS409 / 410”.
  • Internationally deposited at the Institute for Patent Biological Deposits Tsukuba Sakai Higashi 1-chome, 1-chome, 1-Chuo 6) (Receipt number: FERMABP-10984).
  • Example 3 Examination of antibody specificity by Western blotting method and ELISA method Western Plotting Whether or not each antibody prepared in Example 1 specifically reacts with a phosphorylated antigen peptide. Confirmed by law and ELISA.
  • the antigen peptides were separated by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and the reactivity of the transferred peptide with the antibody was examined. As a result, these antibodies reacted strongly with recombinant human TDP-43 phosphorylated by CK1, but did not react with TDP-43 that was not phosphorylated by CK1 (Fig. 1). .
  • CK1 represents casein kinase 1
  • rCK2j represents casein kinase 2, which were phosphated using CK1 and CK2, respectively.
  • a 96-well plate (Sumitomo Betalite) was adsorbed with 5 g / well of non-phosphate peptide, a certain retinal or antigen peptide on the bottom surface according to a conventional method.
  • the prepared antibody was diluted 500-1000 times, reacted, and developed using a conventional method.
  • the antibody that did not react with non-phosphorylated peptide showed strong reactivity with the antigen peptide (FIGS. 2 to 4). ' 0
  • Cerebral cerebral cortex collected from FTLD patients is formalin-fixed, sliced into 50 micron thickness, and commercially available anti-human TDP43 antibody (ProteinTech) ( Figure 5, “Phosphorylation-independent anti-DP-43 antibody”) ), And the anti-phosphate TDP-43 antibody of the present invention (FIG. 5, “Phosphorylation-dependent anti-TDP-43 antibody (pS409)”), and immunostained by the avidin'-piotin complex method. Color was developed using aminobenzidine.
  • skein-like inclusions appearing in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) patients also showed a strong positive reaction to the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention detected a broader range of TDP-43 abnormalities with higher sensitivity than commercially available anti-TDP-43 antibodies.
  • FTLD, ALS, FTLD with proskyulin mutation mPGRN
  • cerebral cortex 0.5g collected from patients with Alzheimer's disease (AD) and Lewy body dementia (DLB) with TDP-43 accumulation, and these Unaffected patients or normal persons (Control or Con)
  • Power ⁇ Collected cerebral cortex (0.5 g) in 5 mL of buffer A (lOmM Tris-HCl, pH 7,5, ImM EGTA, 0.8 M NaCl, 10 % sucrose) and centrifuged at 35000 rpm for 20 minutes.
  • buffer A lOmM Tris-HCl, pH 7,5, ImM EGTA, 0.8 M NaCl, 10 % sucrose
  • the precipitate is then homogenized with 5 mL of the same buffer A containing 1% Triton, centrifuged at 35000 rpm for 20 minutes, and the resulting precipitate is further homogenized with 5 mL of the same buffer A containing 1% Sarkosyl and 35000 rpm. , Centrifuged for 20 minutes. The resulting precipitate was dissolved in ImL of 8M urea or overnight or 1% SDS solution and subjected to detection of ELISA or Western blot. Dephosphorylation is 8M urine The raw fraction was dialyzed and treated with ⁇ Protein phosphatase ( ⁇ PPase) at 30 ° C for 2 hours.
  • ⁇ Protein phosphatase ⁇ Protein phosphatase
  • TDP-43 Dilute the insoluble fraction of TDP-43 accumulated, normal brain (Control), and FTLD brain (FTLD) accumulated TDP-43 twice from 4 fg with 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.8).
  • the 96-well plate was coated at 4 ° C. Thereafter, the commercially available TDP-43 antibody, the pSer409 / 410 polyclonal antibody of the present invention (Example 1), and the pSer409 / 410 monoclonal antibody (Example 2) were reacted for 2 hours as the primary antibody, and further peroxidase-labeled 2 After reacting the next antibody for 2 hours, the color was detected using orthophenylenediamine as a base material.
  • Insoluble fraction of TDP-43 accumulation normal brain (Control), FTLD brain with TDP-43 accumulation (FTLD), and ALS patient brain were electrophoresed and separated using 10% polyacrylamide gel.
  • the protein was transferred to a PVDF membrane and reacted with a commercially available antibody or the pSer409 / 410 monoclonal antibody of the present invention.
  • Western blotting was performed with diaminobenzidine using the avidin-piotine complex method as described above.
  • the commercially available antibody strongly recognizes the normal TDP-43 peptide migrating to the 43 kDa position, making it difficult to distinguish between normal TDP-43 and abnormal TDP-43 ( Figure 7 Panel A).
  • the pSer409 / 410 monoclonal antibody of the present invention does not react with the normal TDP-43 node, and the 45 kDa band, 18-26 kDa panda, and the entire lane are stained like FTLD or ALS.
  • An abnormal TDP-43 band such as “smear”) was specifically detected (Fig. 7, Panel B). This reaction is also eliminated by dephosphorylation treatment with I Protein phosphatase (r PPaseJ in the figure) (panel “10” in Figure 7).
  • I Protein phosphatase r PPaseJ in the figure
  • Inclusion bodies are the main lesion type 1, type 2 with many round intracellular inclusions, and type 3 mixed with both, sporadic FTLD is type 1, FTLD-MND and ALS is classified as type 2 and families with PGRN mutations' I ⁇ Live FTLD (mPGRN) are classified as type 3 ( Figure 8 panel A).
  • mPGRN cases and AD and DLB (type 3) with TDP-43 accumulation showed intermediate forms between sporadic FTLD and FTLD-MND / ALS cases ( Figure 8 panels B and C).
  • This example shows that the antibody of the present invention can specifically recognize phosphorylated TDP-43. Further, it was shown that by using the antibody of the present invention, a TDP-43 proteinosis lesion can be specifically detected, and further, the type of TDP-43 proteinosis lesion can be discriminated.
  • the antibody of the present invention is useful as a phosphate TDP-43 detection agent, a TDP-43 proteinosis detection agent, and a TDP-43 proteinosis diagnostic agent. 8 062650
  • the present invention it is possible to provide an antibody that specifically binds to an abnormal aggregate of TDP-43 protein such as ubiquitin positive inclusion bodies detected in vivo.
  • the antibody of the present invention can specifically bind to phosphorylated TDP-43 constituting a TDP-43 protein abnormal aggregate found in a TDP-43 protein patient and a peptide having a part thereof. Therefore, the antibody of the present invention is useful for diagnosis and treatment of TDP-43 proteinases such as FTLD and ALS.
  • SEQ ID NO: 2 Synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 3 Synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 6 phosphorylated synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 7 phosphorylated synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 8 phosphorylated synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 9 phosphorylated synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 10 phosphorylated synthetic peptide
  • SEQ ID NO: 1 2 Phosphate consensus sequence
  • SEQ ID NO: 13 Phosphate consensus sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、TDP-43蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体を提供し、また、当該抗体を含有する、TDP-43プロテイノパチー病変の検出薬、及び当該抗体を用いたTDP-43プロテイノパチー病変の検出方法又は診断方法等を提供する。

Description

明 細書
TDP-43凝集物に特異的に結合する抗体 技術分野
本発明は、 TDP-43蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体、該抗体を含有する TDP-43プロティノパチ一病変の検出薬及び検出方法、並びに TDP-43プロティノ パチ一の治療用医薬組成物に関する。 背景技術
TDP-43 (TAE DNA-binding protein of 43 kDa) は、 TAE (trans activation responsive region) DNAに結合し、転写調節や選択的スプライシング（alternative splicing) に関与する核因子であることが知られている。
また、 TDP-43は、 ュビキチン陽性細胞内封入体 （NCI) や変性突起様構造物な どの形態で、 前頭側頭型認知症を含む前頭側頭葉変性症 （frontotemporal lobar degeneration: FTLD) などの変性神経細胞に凝集、 蓄積するタンパク質である (Arai T et al.， Biochem Biophys Res Commun. 2006 Dec 22； 351(3):602-11. Epub 2006 Oct 30、 Neumann M et al., Science. 2006 Oct 6； 314(5796)： 130-3)。 TDP-43は、 FTLD以外にも筋萎縮性側索硬化症 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS)、 グアム島パーキンソン認知症複合、 紀伊半島パーキンソン認知症複合等の 神経細胞ゃグリァ細胞にも蓄積することが知られており、これらの疾患は TDP-43 プロティノパチ一 （TDP-43蛋白蓄積症） と総称される。 TDP-43 の異常蓄積は、 それぞれの疾患の病変部位に見られ、これらの疾患における神経変性の原因と密接 な関係があると考えられる。
現在、 DP-43の研究や TDP-43プロティノパチ一の病理診断には、市販されて いる 2種類の抗体が用いられている力 これらの抗体は患者の脳又は脊髄内に異常 蓄積する TDP-43 と結合するだけでなく、 脳又は脊髄などに正常に存在する TDP-43 とも強く結合し、 脳又は脊髄標本の免疫染色でも核に存在する正常の TDP-43を染め出すことが知られていた。 一方、 TDP-43は、患者の脳又は脊髄において高度にリン酸化されて蓄積してい ることが判明した （Arai T et al., Biochem Biophys Res Commun. 2006 Dec 22; 351(3)：602-11. Epub 2006 Oct 30、 Neumann M et al., Science. 2006 Oct 6； 314(5796):130-3)。 し力 しながら、そのリン酸化部位やリン酸化に関わる酵素につ いては未だ報告はない。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、その角決しようとする 課題は、 TDP-43蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体、および該抗体を含有す る TDP-43プロティノパチ一病変の検出薬及び検出方法、 並びに TDP-43プロテ イノパチ一の治療用医薬組成物を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究した結果、変性神経細胞に異常 蓄積した TDP-43 (ュビキチン陽性封入体を構成する） において、構成アミノ酸の 一部がリン酸ィヒされていることを見出した。さらにこのリン酸化ァミノ酸を含む合 成ぺプチドを抗原として調製した抗体は、 TDP-43蛋白異常凝集物と特異的に結合 することを見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
( 1 ) 以下の （a ) 若しくは （b ) のタンパク質又は （c ) のペプチドと特異的 に結合する抗体。
( a )配列番号 1に示されるァミノ酸配列にぉ 、て少なくとも 1つのァミノ酸残 基がリン酸ィヒされたアミノ酸配列を含むタンパク質
( b )配列番号 1に示されるァミノ酸配列において 1個若しくは数個のアミノ酸 残基が欠失、 置換、 挿入若しくは付加された変異型アミノ酸配列を含み、 つ
TDP-43活性を有するタンパク質であって、当該変異型ァミノ酸配列のうち少なく とも 1つのアミノ酸残基がリン酸ィ匕された前記タンパク質 '
( c ) 上記 ( a ) 又は （b ) のタンパク質のアミノ酸配列において、 リン酸ィ匕さ れたァミノ酸残基を含む一部のァミノ酸配列を含む部分べプチド
( 2 ) 少なくとも 1つのァミノ酸残基が、セリン残基、 トレオニン残基及ぴチロ シン残基からなる群から選ばれる少なくとも 1つである、 （1 ) に記載の抗体。 (3) 少なくとも 1つのアミノ酸残基が、配列番号 1に示されるアミノ酸配列の 第 393番目、第 403番目、第 404番目、第 409番目及ぴ第 410番目のァ ミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも 1つである、 （1) 又は （2) に記 載の抗体。
(4)ペプチドのアミノ酸配列が配列番号 5〜11のいずれかに示されるものであ る （1) 〜 （3) のいずれか 1項に記載の抗体。
(5) リン酸化により （a) 若しくは （b) のタンパク質又は （c) の部分べプチ ドの構造が変化した部位に結合することができる、 （1) 〜 （4) のいずれか 1項 に記載の抗体。
(6) リン酸ィヒがカゼインキナーゼ 1によるものである （1) 〜 （5) のいずれか 1項に記載の抗体。
(7) 抗体がモノクローナル抗体である （1) 〜 （6) のいずれか 1項に記載の抗 体。
(8) 抗体がポリクローナル抗体である （1) 〜 （6) のいずれか 1項に記載の抗 体。
( 9 )受領番号が FEKM ABP- 10984であるハイブリドーマにより産生されるモノ クローナル抗体。上記ハイプリドーマは、 2008年 7月 3日付で、独立行政法人産 業技術総合研究所特許生物寄託センター （茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央 第 6) に寄託されている。
(10) (7) 〜 （9) のいずれか 1項に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合 する抗体。
(11) 抗体が、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、 （7)、 (9) 又は （10) のいずれか 1項に記載の抗体。
(12) (7) 又は （9) 〜 （11) のいずれか 1項に記載の抗体を産生するハイ プリ ドーマ。
(13) 受領番号が: FERMABP-10984であるハイブリドーマ。
( 14 ) ( 1 )〜（ 11 )のレ、ずれか 1項に記載の抗体を含有する、 リン酸化 TDP-43 検出 。
(15) (1) 〜 （11) のいずれか 1項に記載の抗体を含有する、 TDP-43 プロ ティノパチ一病変検出薬。
(16) (1) 〜 （11) のいずれか 1項に記載の抗体を含有する、 TDP-43プロ ティノパチ一の診断薬。
(17) (1) 〜 （11) のいずれか 1項に記載の抗体を有効成分として含有する 医薬組成物。
(18) (1) 〜 （11) のいずれか 1項に記載の抗体と採取された被験試料とを 反応させることを特徴とする、 TDP-43プロティノパチ一病変の検出方法。
(19) (14) 若しくは （15) に記載の検出薬、 (16) に記載の診断薬、 又は (17) に記載の医薬組成物の製造における、 （1) 〜 （11) のいずれか 1項に 記載の抗体の使用。 本発明により、 TDP-43蛋白異常凝集物に特異的に結合する抗体、 およぴ該抗体 を含有する TDP-43プロティノパチ一病変の検出薬及び検出方法、並びに TDP-43 プロティノパチ一の治療用医薬組成物等が提供される。
本発明の抗体は、 FTLDや ALS等の TDP-43プロティノパチーを発症した患者 で認められる TDP-43蛋白異常？皿物に特異的に結合することができるため、これ らの疾患の診断や治療に有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、本発明の抗体の特異性をウェスタンプロッティングにより解析した結 果を示す図である。
図 2は、 ELISA法による抗 pSer409リン酸化ぺプチド抗体の反応性（特異性） の検討結果を示す図である。
図 3は、 ELISA法による抗 pSer410リン酸化べプチド抗体の反応性（特異性） の検討結果を示す図である。
図 4は、 ELISA法による抗 pSer409,410リン酸化ペプチド抗体の反応性 （特 異性） の検討結果を示す図である。
図 5は、市販 TDP-43抗体及ぴ pS409抗体を用いた FTLD脳組織の免疫染色 結果を示す図である。 図 6は、 ELISA法による異常 TDP-43の検出結果を示す図である。
図 7は、ウェスタンブロッティング法による異常 TDP-43の検出結果を示す図 である。
図 8は、ウェスタンプロッティング法による異常 TDP-43の検出結果を示す図 である。 発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための 例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、そ の要旨を逸脱しない限り、 様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、 および公開公報、特許公報その他 の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、 2007 年 7月 6日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願 '(特願 2007-178583号） の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
1 . 概要
本発明は、リン酸化 TDP-43に特異的に結合する抗体、該抗体を含有する TDP-43 プロティノパチ一病変の検出薬及び検出方法、及び TDP-43プロティノパチ一の治 療用医薬組成物等に関する。 '
TDP-43は、 TDP-43プロティノパチー患者の脳又は脊髄の神経細胞などにぉレヽ て異常に蓄積し、ュビキチン陽性細胞内封入体（NCI)や変性突起様構造物などの TDP-43蛋白異常凝集物を形成する。 そして、 TDP-43蛋白異常凝集物は高度にリ ン酸化されている。また、凝集、蓄積している DP-43は線維状構造をとっており、 リン酸化によって TDP-43 は本来の構造が変ィ匕して) 3シート構造に富むコンホメ ーションをとっていると考えられる。
本発明者らは、異常蓄積した TDP-43の構成ァミノ酸の一部がリン酸ィ匕されてい ることに着目し、さらにこのリン酸化ァミノ酸を有する合成ぺプチドを抗原として 調製した抗体が、 TDP-43蛋白異常 物と特異的に結合することを見出し、本発 明を完成するに至ったものである。 また、 本発明においては、 リン酸化により TDP-43の構造が変化した部分にも、 本発明の抗体が結合することを見出した。 さらに、 本発明者は、 TDP-43がカゼインキナーゼ 1 (CK1) の基質になること を見出し、その基質結合部位の多くが患者脳でもリン酸化されていることを見出し た。 したがって、 TDP-43のァミノ酸配列の中で CK1のリン酸化コンセンサス配 列 （pS/ "X-X-S/T， pS/ "X-X-X-S) に合う部位、 すなわち TDP-43のアミノ酸配列 部位のうち CK1が結合しリン酸ィ匕する部位は、 本発明の抗体がよく結合する部位 であると考えられる。
本発明の抗体は、 リン酸化されていない TDP-43には結合しないのに対し、 リン 酸化 TDP-43及びその一部を有するぺプチドと特異的に結合することができる。従 つて、 本発明の抗体は、 FTLDや ALS等の DP-43プロティノパチ一の診断や治 療に有用である。
2 . リン酸ィヒ TDP-43に特異的に結合する抗体
本発明の「抗体」は、上記リン酸化 TDP-43と特異的に結合する抗体又はその断 片を意味し、 ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよレ、。 本明細書にお！/ヽては、 リン酸化 TDP-43又はリン酸化 TDP-43部分べプチドと特 異的に結合する抗体又はその断片を 「抗リン酸化 TDP-43抗体」 と称する。
本発明の抗体には、本発明の抗体が結合する抗原決定基（ェピトープ） と結合す る抗体も含まれる。 抗原決定基はリン酸化 TDP-43の全部又は一部の領域であり、 例えば上記 CK1のリン酸化コンセンサス配列 (pS/T^X-X-S/T, pS/T-X-X-X-S) に 合う部位、 すなわち TDP-43のァミノ酸配列部位のうち CK1が結合しリン酸化す る部位が挙げられる。
本発明において、 「特異的に結合する」 とは、 リン酸化された TDP-43タンパク 質若しくは TDP-43ぺプチド（リン酸化により構造が変化した部位を含む）には結 合する （反応する） 力 リン酸化されていないタンパク質又はペプチドには結合し ない （反応しない） ことを意味する。結合が特異的か否かであることの確認は、免 疫学的手法、 例えば ELISA法、 ウェスタンプロット法、 又は免疫組織学的染色等 によつて確認することができる。
本発明の抗体には、 抗体断片が含まれる。 抗体の断片としては、 例えば、 Fab (antigen - binding fragment) F(ab')2、 Fab\ Fv、 diabody (dibodies) dsFv、 線状抗体、 scFv (single chain Fv)、相補性決定領域 (complementarity determining region： CDR) を少なくとも一部に含むペプチド等などが挙げられる。 抗体のァ ミノ酸配列が改変されたとしても、 上記リン酸化 TDP-43又はリン酸化 TDP-43 部分ぺプチドと特異的に結合することができる限り、そのような抗体は本発明の範 囲内に含まれる。
また、 本発明の抗体には、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体、 ヒト化抗体が含まれる。 3 . 抗体の製造
以下、 抗リン酸化 TDP-43抗体の調製方法について説明する。
( 1 ) 抗原の調製
( 1 - 1 ) 全長 TDP-43
リン酸化 TDP-43は、 本発明の抗体を作製するための免疫源として使用される。 また、抗原には、上記リン酸化 TDP-43の全長配列のうち一部のアミノ酸配列を含 むペプチドを使用することも可能である。
ここで、 リン酸ィ匕 TDP-43としては、 以下の （a ) 又は （b ) のタンパク質が挙 げられる。
( a )配列番号 1に示されるァミノ酸配列にぉレ、て少なくとも 1つのアミノ酸残基 がリン酸化されたァミノ酸配列を含むタンパク質
( b )配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1個若しくは数個のアミノ酸残 基が欠失、置換、挿入若しくは付加された変異型ァミノ酸配列を含み、かつ TDP-43 活性を有するタンパク質であって、当該変異型ァミノ酸配列のうち少なくとも 1つ のァミノ酸残基がリン酸化された前記タンパク質
すなわち、本発明において、抗原として用いるリン酸ィ匕 TDP-43において、アミ ノ酸配列部分は配列番号 1に示されるが、 これ以外に、 以下の 〜 (ίν)の変異型ァ ミノ酸配列を有するリン酸ィヒ TDP-43を使用することも可能である。
0)配列番号 1に示すァミノ酸配列のうち 1個又は数個（例えば 1個〜 10個、 さ らに好ましくは 1個〜 5個） のァミノ酸が欠失したァミノ酸配列
(ii)配列番号 1に示すァミノ酸配列のうち 1個又は数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個）のァミノ酸が他のァミノ酸で置換したァミノ酸配列、 Gii)配列番号 1に示すァミノ酸配列のうち 1個又は数個 （例えば 1個〜 10個、 さらに好ましくは 1個〜 5個）の他のァミノ酸が付加又は挿入されたァミノ酸配列 本発明においては、上記 (i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列からなり、力 上 記 TDP-43活性と同様の作用を有する変異型の TDP-43を使用することもできる。 ここで、 ΓΤΌΡ-43活性」 とは、 TG (チミン-グァニン)あるいは UG (ゥラシル-グ ァニン)の繰り返しを有する核酸との結合活性を意味する。このような結合活性は、
UV cross-linking とその競合阻害試験を行うことにより、 あるレ、は公知の EMSA 法により測定することができる。
また、本発明で用いられる TDP-43は、 TDP-43活性を有する限り、 上記ァミノ 酸配列とホモロジ一を有するタンパク質でもよレ、。そのようなタンパク質としては、 配列番号 1に示すァミノ酸配列と 85%以上、好ましくは 90%以上、 より好ましく は 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
このような配列番号 1で表されるァミノ酸配列にぉレ、て 1若しくは数個のァミ ノ酸が欠失、 置換、 挿入又は付加されたァミノ酸配列をコ一ドする DNAは、 TDP-43 をコードする DNA の塩基配列を用いて、 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.J (Cold Spnnsr Harbor Laboratory Press (1989))、 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、 Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85： 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製する ことができる。
また、 DNAに変異を導入するには、 Kunkel法や Gapped duplex法等の部位特 異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、 例えば QuitChangeTM Site-Dii-ected Mutagenesis Kit (ス トラタジーン社製）、 GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (ィ ンビトロジェン社製）、 TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan_K、 Mutan-Super Express Km ： タカラバイオ ） 等を用いて行うことができる。
その後、 通常の遺伝子工学的手法を用いた宿主-発現系により、 目的とする TDP-43 タンパク質を得ることができる （Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Haroor Laboratory Press U989))。 リン酸化の対象となるアミノ酸残基は、特に限定されるものではないが、セリン
(Ser) 残基、 トレオニン （ hr) 残基及ぴチロシン （IVr) 残基からなる群から選 ばれる少なくとも 1つであることが好ましレ、。
また、 上記リン酸化コンセンサス配列 (pSer/Thr-X-X-Ser/ hr (配列番号 1 2 ) 又は pSer/ThrX-X-X-Ser (配列番号 1 3 ) ) (Xは任意のァミノ酸配列を表し、 pSer/Thrはその配列中でリン酸化されるセリン若しくはトレオニンを表す） を含 む部位としては、 配列番号 1に示すァミノ酸配列のうち以下のものが挙げられる。
Thr25 (第 25番目の Thrを指す。以下同様。 )、 Ser29、 Thrl41, hrl53、 Ser 180、 Ser254、 Ser347、 Ser369、 Ser373、 Ser375、 Ser389、 Ser403、 Ser404、 Ser407o 本発明においては、 配列番号 1に示すァミノ酸配列のうち第 393番目、 第 403 番目、 第 404番目、 第 409番目及ぴ第 410番目のアミノ酸配列 （Ser又は Thr)の 1つ又は複数のァミノ酸残基をリン酸化することが好ましレ、。上記変異型ァミノ酸 配列の場合も、配列番号 1のアミノ酸配列に対応する位置、すなわち、変異前のァ ミノ酸残基が上記第 393番目、 第 403番目、 第 404番目、 第 409番目及び第 410 番目のァミノ酸配列 (Ser又は Thr)の 1つ又は複数のァミノ酸残基をリン酸化し たものを抗原とすることができる。
なお、配列番号 1に示すアミノ酸配列とその位置を表示するために、本明細書に おいてはその位置の次にァミノ酸の 3文字表記又は 1文字表記をすることがある。 例えば、 配列番号 1に示すァミノ酸配列のうち第 393番目のァミノ酸がセリンの ときは、 「Ser393」 又は 「S393」 のように表示する。 これと同様に、 第 403番目 ァミノ酸残基がセリンのときは、 「Ser403」、 「S403」 のように表示する。他のァミ ノ酸残基と位置にっレ、ても、 この表記に準じて表示する。
ァミノ酸残基へのリン酸化の方法は、 TDP-43を含む基質溶液にカゼィンキナー ゼ 1 (CK1)、 カゼインキナーゼ 2 (CK2)、 その他のリン酸化酵素、 あるいはそれ らを含む粗酵素液と ATPを混合し、 数分から数十時間ィンキュベートすることに よって TDP-43をリン酸化することができる。 DP-43を含む基質溶液は大腸菌や 培養細胞内に TDP-43 を揷入したプラスミドを導入した細胞を増殖させる方法が ある。 この他、 試験管内で合成したり、 生 ί材才料から調製することも可能である。 また全長の TDP-43だけでなく、部分分解物や部分べプチドを基質とし、上記のよ うな酵素を用いてリン酸化することも可能である。
( 1 - 2 ) リン酸ィ匕 TDP-43の部分べプチド
本発明においては、 リン酸ィ匕 TDP-43の全長のみならず、 リン酸化部位（リン酸 化されたアミノ酸残基）を含む限り、一部の長さの部分断片を抗原として使用する ことが可能である。本発明においては、 この一部の長さの部分断片を「部分べプチ ド」 と呼ぶ。 ペプチドにはポリペプチドも含まれる力 本発明においては、 ァミノ 酸配列の長さに関係なく、 リン酸ィ匕 TDP-43の一部の配列を有し、かつ、少なくと も 1つのァミノ酸残基がリン酸ィ匕されている限り 「部分べプチド」 と総称する。 本発明において、抗原として使用するのに好ましい部分べプチドのアミノ酸配列 は、 上記 ( 1 - 1 ) の項に記載の （a ) 又は （b ) のタンパク質のアミノ酸配列に おいて、 リン酸化されたァミノ酸残基を含む一部のァミノ酸配列であり、好ましく は連続する 4個以上のァミノ酸配列を含む。 より好ましくは、部分ぺプチドの長さ は配列番号 1に示すァミノ酸配列の 8〜 1 5個の配列であり、 さらに好ましくは、 配列番号 1に示すァミノ酸配列の 1 0〜： 1 1個の配列である。神経病理学、及び生 化学的解析結果によると、 部分べプチドは、 配列番号 1に示すァミノ酸配列の C 末端側の部分配列を有することが好ましい。そのような部分配列としては、以下の 配列番号 2〜 4に示されるものを例示することができる。
ぺプチド 388-397： ASNAGSGSGF (配列番号 2 )
ぺプチド 398-408： NGGFGSSMDSK (配列番号 3 )
ぺプチド 405-414： MDSKSSGWGM (配列番号 4 )
配列番号 2.、 3、 4に示されるァミノ酸配列は、 それぞれ配列番号 1で示される アミノ酸配列における 388〜397番目、 398〜408番目、 405〜414番目のアミノ酸 配列である。伹し、本発明においては、上記部分配列を一部改変して用いることが できる。 例えば、 Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) 又は Thyroglobuliaなど の担体蛋白質を架橋させるために、 上記配列番号 2 ~ 4に示すァミノ酸配列の N 末端側又は C末端側に、 システィン （Cys) 残基を付加することができる。
また、 前記の通り、 TDP-43のアミノ酸配列の中で CK1のリン酸化コンセンサ ス配列 (pS/ -X-X-S/T, pS/T-X-X-X-S) で CK1が結合しリン酸化する部位のアミ ノ酸配列も、 本発明における部分ペプチドとして使用することが可能である。 さらに、上記タンパク質及び部分ペプチドは、マウス、 ヒト等の脳や脊髄などの 組織や細胞から精製された天然型の TDP-43及びその部分べプチドでもよいし、遺 伝子工学的に生産された TDP-43又はその部分ペプチドでもよレ、。また、そのアミ ノ酸配列を指定することにより、固相法などの公知のタンパク質合成法又は市販の タンパク質合成装置を用いて合成することもできる。
ここで、 リン酸化されるァミノ酸残基としては、 Ser、 Thr及び Ttyr残基が挙げ られる力 好ましくは Ser及び Thr残基である。 置換による変異処理が施された 変異型ァミノ酸配列にぉレ、て、置換後のァミノ酸残基が Ser、 Thr又は 1>1のとき は、 これらのアミノ酸残基もリン酸化の対象となる。
より具体的には、リン酸化部分ぺプチドは例えば以下の配列番号 5〜： L 1に示す ものが挙げられる。
CASNAGS(P03H2)GSGF (配列番号 5 )
CNGGFGSCP03H2)SMDSK (配列番号 6 )
CNGGFGSS(P03H2)MDSK (配列番号 7 )
CNGGFGS(P03H2)S(PO3H2)MDSK (配列番号 8 )
CMDSKS(P03H2)SGWGM (配列番号 9 )
CMDSKSS(P03H2)GWGM (配列番号 1 0 )
CMDSKS(P03H2)S(PO3H2)GWGM (配列番号 1 1 )
上記ァミノ酸配列において 「(PO3H2)」 はその前に記載のァミノ酸残基がリン酸 化されたことを意味する。 例えば、 上記アミノ酸配列において、 「S(P03H2)」 は、 Serがリン酸ィ匕されていることを意味する。
配列番号 5に示すァミノ酸配列は、配列番号 2に示すァミノ酸配列の第 6番目の Ser残基をリン酸化し、 力つ、 N末端に Cysを付カ卩したものである。
配列番号 6に示すァミノ酸配列は、配列番号 3に示すァミノ酸配列の第 6番目の Ser残基をリン酸化し、 カ つ、 N末端に Cysを付加したものである。
配列番号 7に示すァミノ酸配列は、配列番号 3に示すァミノ酸配列の第 7番目の Ser残基をリン酸化し、 力 、 N末端に Cysを付加したものである。
配列番号 8に示すァミノ酸配列は、配列番号 3に示すァミノ酸配列の第 6番目及 び第 7番目の Ser残基をリン酸化し、カゝつ、 N末端に Cysを付加したものである。 配列番号 9に示すァミノ酸配列は、配列番号 4に示すァミノ酸配列の第 5番目の Ser残基をリン酸化し、 力つ、 N末端に Cysを付加したものである。
配列番号 1 0に示すァミノ酸配列は、配列番号 4に示すァミノ酸配列の第 6番目 の Ser残基をリン酸化し、 かつ、 N末端に Cysを付カ卩したものである。
配列番号 1 1に示すァミノ酸配列は、配列番号 4に示すァミノ酸配列の第 5番目 及び第 6番目の Ser残基をリン酸化し、 かつ、 N末端に Cysを付加したものであ る。
これらのリン酸化 TDP-43又は部分べプチドは、 TDP-43プロティノパチ一病変 が認められるマウス、ヒト等の脳や脊髄などの組織又は細胞から精製された天然型 のリン酸化 TDP-43でもよいし、 遺伝子工学的に生産されたリン酸化 TDP-43で もよい。例えば、 TDP-43プロティノパチー病変が認められる脳や脊髄などの組織 を各種界面活性剤、 例えば Triton_X、 Sarkosylなどを用い、 可溶性画分と不溶性 画分に分画する。 さらに不溶性画分を尿素やグァ-ジン塩酸などに溶解し、各種力 ラム、 例えばへパリンカラムあるいは結合樹脂に結合させることによりリン酸化 TDP-43を得ることができる。 また、抗原として用いるリン酸化 TDP-43は、 その ァミノ酸配列を指定することにより、固相法などの公知のタンパク質合成法又は市 販のタンパク質合成装置を用いて合成することもできる。 合成したぺプチドは、 Keyhole Iimpet Hemocyanin (KLH) 又は Thyroglobulinなどの担体蛋白質と結 合させ、 免疫原として用いることができる。
( 2 ) ポリクローナル抗体の作製
前記のようにして作製したリン酸ィ匕 TDP-43又は部分ぺプチドをそれ自体で、あ るいは担体、 希釈剤と共に温血動物、 例えばゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、ャギ等に投与することにより免疫する。抗原の動物 1匹当たりの投与量は、 アジュバントを用いないときは 1〜： !Om gであり、アジュバントを用いるときは 5 〜500 gである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュパント （FCA)、 フロイント不完全アジュバント (FIA)ヽ 水酸化アルミニウムアジュバント等が挙 げられる。免疫は、主として静脈内、皮下又は腹腔内等に注入することにより行わ れる。 また、免疫の間隔は特に限定されず、 数日から数週間間隔、 好ましくは 1〜 2週間間隔で、 2〜10回、 好ましくは 3〜5回免疫を行う。 免疫の間隔は、 当業者 であれば得られる抗体価を勘案して設定することができる。 3回〜 4回皮下免疫を 行った時点で言对采血を行い、抗体価を測定することが好ましレヽ。血清中の抗体価の 測定は、 ELISA ( enzvme-linked immunosorbent assay )、 EIA ( enzyme immunoassay) , 放射'性免疫測定法 (RIA; radioimmuno assay) 等によって行う ことができる。 抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる 方法により抗体を分離精製することができる。例えば、 目的の抗体を含有する血清 を、リン酸化されていない TDP-43又はリン酸化されていない合成ぺプチド (以下、 「非リン酸ィ匕 TDP-43J という） を結合したカラムに通し、 素通り画分を採取する ことにより、リン酸ィ匕 TDP-43に対する特異性を向上させたポリク口ーナル抗体を 得ることができる。
( 3 ) モノクローナル抗体の作製
( 抗体産生細胞の採取
前記のようにして作製したリン酸ィ匕 TDP-43又は部分ぺプチドをそれ自体で、 あるいは担体及び希釈剤と共に温血動物に投与することにより免疫する。抗原の動 物 1匹当たりの投与量は、 アジュバントを用いないときは 1〜： LOm gであり、 アジ ュバントを用いるときは 5〜500μ gである。 用いられるアジュバントの種類、 免 疫方法、免疫の間隔はポリクローナル抗体の作製と同様である。最終の免疫日から 1〜30日後、好ましくは 2〜 5日後に、抗体価の認められた個体を選択し抗体産生 細胞を採集する。 抗体産生細胞としては、 脾臓細胞、 リンパ節細胞、 末梢血細胞等 が挙げられるが、 脾臓細胞又はリンパ節細胞が好ましレ、。
ϋ)細胞融合
ハイプリ ドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。 融合操作は既知の方法、 例えば Kohlerらの方法に従い実施できる。 抗体産生細胞 と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な株ィ匕細 胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合 の状態では HAT選択培地 （ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジンを含む） で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが 好ましい。 ミエローマ細胞としては、 例えば PAI、 P3U1、 NSI/l-Ag4-l、 NSO/1 などのマウスミエ口一マ細胞株、 YB2/0などのラットミエロ一マ細胞株などが挙げ られる。
上記ミエ口一マ細胞と抗体産生細胞との細胞融合は、 血清を含まなレ、 DMEM、 RPMI-1640培地などの動物細胞培養用培地中で、 Ixl08〜5xl08個の抗体産生細胞 と 2xl07〜10xl07個のミエローマ細胞とを混合し （抗体産生細胞とミエローマ細 胞との細胞比 1 : 1〜： I： 10)、 細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。 細胞 融合促進剤として、平均分子量 1000〜6000ダノレトンのポリエチレングリコール又 はセンダイウィルス等を使用することができる。 また、電気刺激（例えばエレクト 口ポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用レヽて抗体産生細胞とミエロー マ細胞とを融合させることもできる。
Οϋ)ハイブリドーマの選別及びクローニング
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリ ドーマを選別する。その方法とし て、 細胞懸濁液を、 例えば 10〜20%のゥシ胎児血清含有 EPMI-1640培地などで 適当に希釈後、 マイクロタイタープレート上に 5xl07個/ well程度まき、 各ゥェ ルに HAT培地などの選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。 その結果、 選択培地で培養開始後、 10 日前後から生育してくる細胞をハイプリド 一マとして得ることができる。
次に、生育してきたハイプリドーマをさらにスクリーニングする。ハイプリドー マのスクリーニングは、 通常の方法に従えばよく、 特に限定されるものではない。 例えば、ハイプリ ドーマを培養したゥエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵 素免疫測定法、 放射性免疫測定法等によって、 スクリーニングすることができる。 具体的には、 96 ゥエルプレートに抗原を吸着させた後、 仔牛血清でブロッキング する。 ハイプリドーマ細胞の培養上清を固相化した抗原に 37°Cで 1時間反応させ た後、 ペルォキシダーゼ標識した抗マウス IgGを 37°Cで 1時間反応させ、 オルト フエ-レンジアミンを基質として用いて発色させる。 酸で反応を停止させた後、 490nmの波長における吸光度を測定することにより、 スクリーニングすることが できる。上記測定法により陽性を示したモノク口ーナル抗体を産生するハイブリ ド 一マを、 限界希釈法等によりクローニングする。 そして、 最終的に、 リン酸化 TDP-43 に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する細胞であるハイブリ ドーマを樹立する。 (iv) モノクローナル抗体の採取
樹立したハイプリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の 細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。細胞培養法においては、ハ イブリ ドーマを 10%ゥシ胎児血清含有 RPMI- 1640培地、 MEM培地又は無血清 培地等の動物細胞培養培地中で、 通常の培養条件 (例えば 37°C、 5% C02濃度） で 7〜： 14 日間培養し、 その培養上清から抗体を取得する。 腹水形成法の場合は、 ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物、 例えばマウス （BALB/c) の腹腔内 にハイプリドーマを約 2xl07個投与し、ハイプリ ドーマを大量に増殖させる。そし て、 1〜2週間後に腹水を採取する。 上記抗体の採取方法において抗体の精製が必 要とされる場合は、硫安塩析法、 イオン交換クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 ァフ ィユティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組 み合わせることにより精製することができる。
なお、 ヒト型化抗体は、免疫原 （抗原） をヒト抗体産生トランスジエニック非ヒ ト哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によつて取得することができる。 ヒ ト型化抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト型化抗体産生トランスジエニックマウ スの作製方法は公知である （Nature Genetics 7: 13-21 (1994) ； Nature Genetics 15： 146-156 (1997) 等)。
( 4 ) 微生物の寄託
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマ （識別のための表示： TDP43_pS409/410)は、 2008年 7月 3日付で独立行政法人産業技術総合研究所特 許生物寄託センター （茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に FERM ABP- 1098 としてブダぺスト条約に基づき国際寄託されている。
( 5 ) 遺伝子組換え抗体の作製
本発明の抗リン酸ィ匕 TDP-43抗体の好ましい態様の一つとして、遺伝子組換え抗 体が挙げられる。 遺伝子組換え抗体としては、 限定はされなレ、が、例えば、 キメラ 抗体、 ヒト型化抗体及びヒト化抗体等が挙げられる。
キメラ抗体（すなわちヒト型キメラ抗体） は、マウス由来抗体の可変領域をヒト. 由来の定常領域に連結 （接合） した抗体であり (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ， 6851-6855, (1984)等を参照）、 キメラを作製する場合は、 そのように連結した抗 体が得られるよう、 遺伝子組換え技術によつて容易に構築できる。
ヒト型化抗体を作製する場合は、 いわゆる CDRグラフティング （CDR移植） と呼ばれる手法を採用することができる。 CDRグラフティングとは、 マウス抗体 の可変領域から相補性決定領域 （CDR) をヒ ト可変領域に移植して、 フレームヮ ーク領域 （FR) はヒト由来のもので CDRはマウス由来のものからなる、 再構成 した可変領域を作製する方法である。次に、 これらのヒト型化された再構成ヒト可 変領域をヒト定常領域に連結する。 このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野に おいて周知である （Nature, 321, 522-525 (1986)； J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)； Queen C et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86： 10029-10033 (1989)；特 許第 2828340号公報等を参照)。
ヒト化抗体 （完全ヒト抗体） は、 一般に V領域の抗原結合部位である超過変領 域 （Hyper Variable region)、 V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、 ヒト の抗体と同じ構造を有するものである。但し、超可変部位は他の動物由来であって もよい。 ヒト化抗体を作製する技術も公知であり、 ヒトに共通の遺伝子配列につい ては遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。 ヒト化抗体は、例 えば、 ヒト抗体の H鎖及ぴ L鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体 産生マウスを用いた方法 （Tomizuka, K.et al.， Nature Genetics, (1977)16， 133-143； Kuroi a, Y.et.al., Nuc. Acids Res" (1998)26, 3447-3448； Yoshida, H.et.al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects,(l999)l0, 69-73 (Kitagawa, Y.,Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Klu er Academic Publishers; Ibmizuka, et.al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2000)97, 722-727等を参照） や、 ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得 す ·θ方法 ( Wormstone, I. M. et.al, Investigative Ophthalmology & visual Science., (2002)43 (7), 2301-8； Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)l (2), 189-203； Siriwardena, D. et.al., Opthalmology, (2002)109 (3)， 427-431等を参照） により取得することができる。 また、 本 明においては、 本発明のハイプリ ドーマ （例えば受領番号 FERM ABP-10984のハイブリドーマ） 又は当該ハイブリドーマから抽出した DNA若し くは RNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、 ヒト型ィ匕 抗体、 ヒト化抗体を作製することができる。
( 6 ) 抗体断片の作製
本発明の抗体断片としては、例えば、 Fab (antigen - binding fragment)、 F(ab')2、 Fv、 diabody (dibodies)、 dsFv、 線状 ίτι体、 scFv (single chain Fv; 相補 性決定領域 (complementarity determining region： CDR) を少なくとも一部に 含むぺプチド等などが挙げられる。
Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパィンで処理して得られる断片のうち、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体とがジスルフィド結合で結合した抗体断片であ る。 Fabは、 抗体の Fabをコードする DNAを、 発現ベクターに揷入し、 該べク ターを宿主生物に導入することにより発現させて、 製造することができる。
F(ab')2は、 抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片の うち、 Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大き い抗体断片である。 F(ab')2は、 Fab をチォエーテル結合又はジスルフィド結合さ せて作製することができる。
Fab'は、 上記 F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した抗体断片であ る。 Fab'は、抗体の; Fab'断片をコードする DNAを、発現ベクターに挿入し、該べ クターを宿主生物に導入することにより発現させて、 製造することができる。
scFvは、 1本の H鎖 V領域 (VH) と 1本の L鎖 V領域 （VL) とを適当なぺ プチドリンカーを用いて連結したポリぺプチドであり、抗原結合活性を有する抗体 断片である。 scFvは、 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFv をコードする DNAを構築して、 該 DNAを発現べクターに挿入し、 該発現べクタ 一を宿主生物に導入することにより発現させて、 製造することができる。
diabodyは、 scFvが二量体化した抗体断片であり、 二価の抗原結合活性を有す る抗体断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異 なる抗原結合活性とすることもできる。 diabodyは、抗体の VHおよび VLをコー ドする cDNAを取得し、 ぺプチドリンカ一のアミノ酸配列の長さが 8残基以下と なるように scFvをコードする DNAを構築して、 該 DNAを発現べクターに挿入 し、該発現ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造することが できる。 dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1ァミノ酸残基をシスティン残基に置換 したポリぺプチドを、該システィン残基間のジスルフィド結合を介して結合させた ものをいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測に基 づいて選択することができる（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)。 dsP は、 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 dsP をコードする DNAを 構築して、該 DNAを発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主生物に導入す ることにより発現させて、 製造することができる。
CDRを含むぺプチドは、 VH又は VLの CDR (CDR1〜3) の少なくとも 1領域 以上を含んで構成される。複数の CDRを含むペプチドは、 直接又は適当なぺプチ ドリンカ一を介して結合させることができる。 CDRを含むペプチドは、抗体の VH および VLの CDRをコードする DNAを構築し、 該 DNAを発現ベクターに揷入 して、該発現ベクターを宿主生物に導入することにより発現させて、製造すること ができる。 CDRを含むぺプチドは、 Fmoc法 (フルォレニルメチルォキシカルボ ニル法） 及ぴ tBoc法 （t-ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法によって製 造することができる。
本発明においては、 本発明のハイプリ ドーマ （例えば受領番号 FERM ABP-10984のハイブリ ドーマ） 又は当該ハイプリドーマから抽出した DNA若し くは RNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じて抗体断片を作製するこ とができる。
4 . 検出薬及び検出方法、 並びに診断薬および診断方法
本発明の抗体は、 TDP-43プロティノパチ一病変を検出するための試薬として用 いることができる。 TDP-43プロティノパチ一病変は、 TDP-43プロティノパチ一 の患者の脳、 脊髄などで認められ、 ュビキチン陽性封入体 (NCI) などの TDP-43 蛋白異常凝集物の発生などを呈する。 さらに、 TDP-43の蓄積、 不溶化、 漏出、 あ るレ、はこれに伴う細胞や組織の形態的又は生化学的変化などが生じる。
また、 本発明の抗リン酸ィヒ TDP-43抗体は、 リン酸化 TDP-43の検出及び定量 ができるので、 TDP-43プロティノパチ一の診断薬に用いることができる。
TDP-43プロティノパチ一病変検出には、 検出感度の点から、 Ser409及び Z又 は Ser410がリン酸ィヒされたタンパク質又はべプチドと結合する抗体を用いること が好ましい。
抗リン酸化 TDP-43抗体を用いて TDP-43 プロティノパチ一病変の検出又は TDP-43プロティノパチ一の診断をする方法は、 例えば、
(a) 本発明の抗体またはその断片と試料とを反応させる工程、 及び
(b) 工程 （a) で形成した抗原抗体複合体と、 検出のための標識抗体とを反応さ せる工程
を含む。 反応後、 標識抗体から発するシグナルを検出する。
本発明の検出又は診断薬を用いる検出方法又は診断方法は、抗体を用いるアツセ ィ、即ち免疫ァッセィであれば、 いずれの方法でもよく、例えば、酵素免疫測定法 (ELISA)、 蛍光免疫測定法、 放射免疫測定法 （RIA)、発光免疫測定法、酵素抗体 法、蛍光抗体法、免疫比濁法、 ラテックス凝集反応、 ラテックス比濁法、赤血球凝 集反応、 粒子凝集反応又はウェスタンブロット法等が挙げられる。
本発明の検出及び/又は定量法、あるいは診断法に供される試料としては、脳又 は脊髄などの神経組織（例えば脳の組織切片） 及び神経細胞、脳脊髄液、血液等の 体¾|式料等、リン酸ィ匕 TDP-43が含まれる可能性のある生 ί標料であれば特に限定 されるものではない。
本発明の検出及び/又は定量法、あるいは診断法を酵素免疫測定法、蛍光免疫測 定法、放射免疫測定法又は発光免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫測定法により 実施する場合には、サンドィツチ法又は競合法により行うこともでき、サンドィッ チ法の場合には固相化抗体及び標識抗体のうち少なくとも 1種が本発明の抗体で あればよい。
標識抗体とは、標識物質で標識された抗体を意味し、 これらの標識抗体は、試料 (例えば、 脳、 脊髄などの神経組織及び神経細胞、 脳脊髄液、 血液等の体液試料、 培養上清あるいは遠心上清等）中に含まれる抗原を検出または定量するために用い ることができる。
本発明で用いることができる標識物質は、抗体に物理的結合又は化学的結合等に より結合させることによりそれらの存在を検出可能にするものであれば特に限定 されない。標識物質の具体例としては、酵素、蛍光物質、化学発光物質、ピオチン、 アビジンあるいは放射性同位体等が挙げられ、より具体的には、ぺノレオキシダーゼ、 アル力リフォスファターゼ、 β一 D—ガラクトシダーゼ、グ^/コースォキシダーゼ、 グルコース一 6—ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、 リンゴ 酸脱水素酵素、カタラーゼ、ルシフェラーゼ若しくはァセチルコリンエステラーゼ 等の酵素、 フルォレスセィンィソチオシァネート、ダンシルク口ライド若しくはテ トラメチルローダミンイソチオシァネート等の蛍光物質、 3H、 "C、 125 Ϊ若しく は isi I等の放射性同位体、 ビォチン、 アビジン、 または化学発光物質が挙げられ る。 標識物質と抗体との結合法は、 ダルタルアルデヒド法、 マレイミ ド法、 ピリジ ルジスルフィド法又は過ョゥ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
ここで、放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすこと ができるが、 酵素、化学発光物質、 ピオチン及びアビジンは、 単独では検出可能な シグナルをもたらすことができないため、さらに 1種以上の他の物質と反応するこ とにより検出可能なシグナルを生じる。例えば、酵素の場合には少なくとも基質が 必要であり、 酵素活性を測定する方法 （比色法、 蛍光法、 生物発光法あるいは化学 発光法等） に依存して種々の基質が用いられる。 また、 ビォチンの場合には少なく ともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的である。必要に応 じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
固定化抗体は、試料（例えば、脳、脊髄などの神経組織及び神経細胞、脳脊髄液、 血液等の体液試料、培養上清あるレ、は遠心上清等）中に含まれる抗原を検出、定量、 分離または精製するために用いることができる。
抗体を固定化するために使用できる不溶性担体としては、 例えば、 （i) ポリスチ レン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂又はナイ口ン樹脂等、 (ϋ) ガラス、 (in) セルロース系担体、 ァガロース系担体、 ポリアクリルァミ ド系担体、 デキス トラン系担体、 ポリスチレン系担体、 ポリビニルアルコール系担体、 ポリアミノ酸 系担体あるいは多孔性シリカ系担体等が挙げられる。 これらの担体は、 ビーズ、 フ ィルタ一又はメンブレン等の形態で、あるいはァフィユティークロマトグラフィー 用の担体として使用することができる。
5 . 検出用又は診断用キット 本発明の TDP-43プロティノパチ一病変検出用キット又は TDP-43プロティノ パチー診断用キットは、本発明の抗体を含むものである。 ここで用いる抗体は、上 記した固定化抗体や標識抗体でもよい。例えば、本発明の抗体を一次抗体として使 用する場合、本発明のキットには、抗原抗体結合反応により形成された複合体を検 出するための二次抗体を含めてもよレ、。本発明のキットには、該キットを効率的か つ簡便に利用できるようにするために、これら抗体以外に種々の補助剤を含めても よい。補助剤としては、例えば固体状の二次抗体を溶解させるための溶解剤、不溶 化担体を洗浄するために使用される洗,、抗体の標識物質として酵素を使用した 場合に酵素活性を測定するための基質、その反応停止剤などの免疫学的測定試薬の キットとして通常使用されるものが挙げられる。
6 . 医薬組成物
本発明の医薬組成物は、 本発明の抗体を有効成分として含有するものであり、 TDP-43プロティノパチ一、アルツハイマー病、 レビー小体型認知症、運動ニュー 口ン疾患などの関連の神経変性疾患等の疾患の予防、治療に有効である。用いられ る抗体としては、例えば、ヒトキメラ抗体またはヒ 1、化抗体が挙げられる。さらに、 血液脳関門 （BBB) を通過させるために、 ペプチドィ匕した抗体又はこれらのぺプ チドと BBB透過性運搬体との結合体が挙げられる。
本発明の抗体は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体または希釈剤等と共 に投与することができ、またその投与は 1回または数回に分けて行うことができる。 ここで 「薬学的に許容され得る担体」 とは、 賦形剤、 希釈剤、 増量剤、 崩壊剤、 安定剤、 保存剤、 緩衝剤、 ？ L化剤、 芳香剤、 着色剤、 甘味剤、 粘稠剤、 矯味剤、 溶 解補助剤あるいはその他の添加剤等が挙げられる。そのような担体の一つ以上を用 いることにより、 錠剤、 丸剤、 散剤、顆粒剤、 注射剤、 液剤、 カプセノレ剤、 トロー チ剤、ェリキシル剤、懸濁剤、乳剤あるいはシロップ剤等の形態の医薬組成物を調 製することができる。 これらの医薬組成物は、経口又は非経口的に投与することが できる。
経口投与の場合、微晶質セルロース、 クェン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、 リ ン酸ジ力リゥム、 グリシン等の種々の賦形剤を、崩壊剤、結合剤等とともに使用す ることができる。 崩壊剤としては、澱粉、 アルギン酸、 ある種のケィ酸複塩などが 挙げられ、結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、 蔗糖、 ゼラチン、 ァラ ビアゴムなどが挙げられる。また、ステアリン酸マグネシゥム、 ラウリル硫酸ナト リゥム、タルク等の滑沢剤は錠剤形成に非常に有効である。経口投与用として水性 懸濁液又はエリキシルにする場合は、 必要により乳化剤、 懸濁化剤を併用し、 水、 ェタノール、プロピレングリコール、 グリセリン等、およびそれらを組み合わせた 希釈剤と共に使用することができる。
非経口投与のためのその他の形態としては、一つまたはそれ以上の活性物質を含 み、 常法により処方される注射剤などが含まれる。
注射剤の場合には、例えば生理食塩水ある 、は市販の注射用蒸留水等の薬学的に 許容される担体中に 0.1 μ g抗体/ ml担体〜 10mg抗体/ ml担体の濃度となるように 溶解または懸濁することにより製造することができる。このようにして製造された 注射剤は、 処置を必要とするヒト患者に対し、 1回の投与において 1kg体重あた り、 10μ g〜50mgの割合で、 好ましくは 100 g〜2mgの割合で、 1日あたり 1 回〜数回投与することができる。但し、 この範囲に限定されるものではなく、患者 の体重およぴ症状や個々の投与経路によって変動し得る。治療する患者の薬物に対 する感受性の差異、薬剤の処方の仕方、投与期間および投与間隔によっても投与量 に変動が生じてくるので、場合によっては前記範囲の下限より低い投与量が適当な こともある。
投与の形態としては、静脈内注射、皮下注射、皮内注射などが挙げられるが、好 ましくは静脈内注射である。 また、 注射剤は、場合により、 非水性の希釈剤 （例え ばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、ォリーブ油等の植物油、エタ ノール等のアルコール類など）、 懸濁剤あるいは乳濁剤として調製することもでき る。 そのような注射剤の無菌化は、バクテリア保留フィルターを通す濾過滅菌、殺 菌剤の配合または照射により行うことができる。注射剤は、用時調製の形態として 製造することができる。即ち、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使 用前に無菌の注射用蒸留水または他の溶媒に溶解して使用することができる。 以下、実施例により本発明を詳細に説明する力 本発明はこれらの実施例に限定 されるものではない。 実施例 1 抗体の調製
( 1 ) 抗原の調製
本発明の抗体を得るための抗原ペプチドとして、 ヒト TDP-43 (配列番号 1 ) に おけるァミノ酸配列番号 388-397、 398-408、又は 405-414のァミノ酸配列の N末 端にシスティンを付加した配列 （ CASNAGSGSGF、 CNGGFGSSMDSK、 CMDSKSSGWGM) を有し、 且つリン酸化セリン残基を有する以下のぺプチドを 固相法により合成した （シグマジエノシス、 又はサーモクエスト） [S(P03H2)はリ ン酸化セリンを表す]。 また、 カラム作製、 コントロール等に使用するため、 配列 番号 2〜4に示されるアミノ酸配列を有する非リン酸化べプチドも合成した。
1 . CASNAGS(PO3H2)GSGF (配列番号 5 )
2 . CNGGFGS(PO3H2)SMDSK (配列番号 6 )
3 . CNGGFGSS(P03H2)MDSK (配列番号 7 )
4 · CNGGFGS(PO3H2)S(PO3H2)MDSK (配列番号 8 )
5 . CMDSKSa?03H2)SGWGM (配列番号 9 )
6 . CMDSKSS(P03H2)GWGM (配列番号 1 0 )
7 . CMDSKS(P03H2)S(PO3H2)GWGM (配列番号 1 1 )
( 2 ) 免疫
前記合成ぺプチドを Thyroglobuli 又は KLHと定法に従つてコンジユゲートし、 抗原として用いた。 抗原べプチドを含有する 1mlの lmg/ml抗原べプチド生理食 塩水溶液と 1mlのフロイント完全アジュバント （Difco社） を合わせ、 超音波処理 によってェマルジヨン化し、 ゥサギ （ニュージーランドホワイト、体重 2.5kg、雌） の背中数力所以上に分けて免疫した。 初回免疫から 2週間後に 0.5ml の lmg/ml 抗原ぺプチド生理食塩溶液と 1mlのフロイント不完全ァジュバントを合わせ、 超 音波処理によりェマルジョンィヒしたものを追加免疫した。免疫した 1週間後に採血 を行い、 採取した血液は室温で 1時間静置後、 4°Cでー晚静置し、 5000 x g、 10分 間の遠心分離を行い、 抗血清を得た。
( 3 ) 抗体の精製 抗体を精製するため、 ホルミルセル口ファイン （生化学工業）、 あるいはトヨパ ール A トレシル 650M (柬ソ一）約 2mlに対し、 TDP-43におけるアミノ酸配列 番号 388-397、 398-408又は 405-414のァミノ酸配列を有する非リン酸化合成ぺプ チド約 2mgを反応させたカラムを作製した。 抗血清 2ml をこのカラムにおいて 10-20時間循環させ、カラムに吸着されなかつた抗体を抗リン酸ィヒ TDP-43抗体と した。
抗リン酸化 TDP-43抗体のうち、 Ser409及び Ser410がリン酸化されたぺプチ ドに対するポリクローナル抗体を、 pSer409/410ポリクローナル抗体と名づけた。 実施例 2 モノクローナル抗体の調製
( 1 ) ハイプリ ドーマの作製
上記 「実施例 1 ( 2 ) 免疫」 の方法に準じて初回免疫及び ロ免疫を行なった。 最終免疫の 3日後に、免疫したマウスから脾臓を採取した。採取した脾臓細胞とミ ェ口一マ細胞株とを 5 ： 1の割合で混合し、 ポリエチレングリコール法により細胞 融合を行った。 HAT (アミノプテリン、 ヒポキサンチン、 チミジン） を含む選択 培地を用い、 5% C02インキュベーターで培養した。 7〜 1 4日間培養し、 増殖し てきたハイブリ ドーマに対しさらにスクリーニングを行った。
スクリ一二ングは、 FTLD患者脳の riton不溶性画分を PLLコートしたスライ ドグラス上に塗布し、それにハイプリ ドーマの培養上清を反応させ、異常構造物と 反応する （異常構造物を染める）抗体を産生するクローンを選択することにより行 つた。 その後、 限界希釈法により、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブ リ ド—マのクローンを得た。
( 2 ) モノクローナル抗体の調製
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法で作製したハイブリ ドーマのクローン を BALB/cマウスの腹腔内に投与して腹水を採取する力、、高濃度培養上清を作製す ることにより得た。
具体的には、上記方法で作製したハイプリ ドーマのクローンを、予め（1 0日前） 2，6， 10， 14-テトラメチルペンタデカン （プリスタン） を投与された BALB/cマウス の腹腔内に 1 X 107個投与し、 2週間後の腹水を採取した。 このようにして得られたモノクローナル抗体を pSer409/410モノクローナル抗 体と名づけた。
( 3 ) ハイプリドーマの寄託
上記方法により得られたハイブリドーマのうち、 pSer409/410モノクロ一ナル抗 体を産生するハイプリ ドーマは、 「TDP43-pS409/410」 と称して、 2008年 7月 3 日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば巿 東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に国際寄託した （受領番号： FERMABP- 10984)。 実施例 3 ウェスタンブロッテイング法及び ELISA法による抗体の特異性の検討 実施例 1におレ、て調製した抗体が、それぞれリン酸化した抗原ぺプチドと特異的 に反応するか否かをウェスタンプロッティング法及ぴ ELISA法により確認した。 ウェスタンプロッティング法による検討においては、抗原べプチドとして、 2種 類のリン酸化リコンビナントヒ ト TDP-43及び非リン酸ィヒ TDP-43 (コント口ール） を用い、 抗体としては、 Ser409がリン酸化されたペプチド （pSer409 (pS409) ) に対する抗体、 Ser410 がリン酸ィヒされたペプチド （pSer410) に対する抗体並び に Ser409及ぴ Ser410がリン酸化されたぺプチド （pSer409,410) に対する抗体 を用いた。 また、 アミノ酸配列番号 405-414のアミノ酸配列を有する非リン酸ィ匕 TDP-43ぺプチドに対する抗体をコントローノレとして用いた。
上記抗原ペプチドを、 SDS-PAGEにより分離し、 PVDF膜に転写し、 転写した ペプチドと上記抗体との反応性を調べた。 その結果、 これらの抗体は、 CK1 によ りリン酸化したリコンピナントヒト TDP-43とは強く反応したが、 CK1によりリ ン酸化しない TDP-43とは反応が見られなかった （図 1 )。 図 1において、 「CK1」 はカゼインキナーゼ 1、 rCK2j はカゼィンキナーゼ 2を表し、 それぞれ、 CK1、 CK2を用いてリン酸ィ匕させたものである。
ELISA法による検討では、定法に従って 96ゥエルプレート（住友ベータライト） に 5 g/wellの非リン酸ィヒぺプチド、あるレ、は抗原べプチドを底面に吸着させた後、 実施例 1で調製した抗体を 500-1000倍希釈して反応させ、定法を用いて発色させ た。 その結果、非リン酸化ペプチドとは反応しなかった力 抗原ペプチドとは強い 反応性を示した （図 2〜4 )。 ' 0
実施例 4 抗体の免疫組織染色
FTLD患者から採取された脳大脳皮質をホルマリン固定後、 50ミクロン厚に薄 切し、 市販されている抗ヒト TDP43抗体 （ProteinTech社） （図 5、 「リン酸化非 依存性抗 DP-43抗体」 )、 及び本発明の抗リン酸ィ匕 TDP-43抗体 （図 5、 「リン酸 化依存性抗 TDP-43抗体 （pS409)」） を用い、 アビジン 'ピオチン複合体法により 免疫染色し、 ジァミノベンチジンを用いて発色させた。
その結果、本発明の抗リン酸化 TDP-43抗体を用いた場合は、大脳皮質において 強い陽性反応 （褐色） が認められ、 変性神経突起様、 球状、 あるいはドット状の TDP-43プロティノパチ一病変が認められた。 これに対し、細胞核に局在する正常 の TDP-43とはほとんど反応が見られなかつた （図 5右パネル)。一方、 市販の抗 ヒト TDP43抗体を用いた場合は、細胞核に局在する正常の TDP-43との反応が認 められた（図 5左パネル)。また、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)患者に出現する skein 様封入体も本発明の抗体に対して強い陽性反応を示した。 さらに、本発明の抗体は 市販の抗 TDP-43抗体よりも広汎な TDP-43の異常を高感度に検出した。 実施例 5 ELISA法、 及びウェスタンブロッティング法による異常 TDP-43の検 出
( 1 ) 試料の調製
FTLD、 ALS, プロダラニュリン変異を有する FTLD (mPGRN)、 TDP-43蓄 積が認められたアルツハイマー病 （AD) 及びレビー小体型認知症 （DLB) の患者 から採取した大脳皮質（0.5g)並びにこれらの疾患に罹患していない患者又は正常 人 （Control又は Con) 力 ^採取した大脳皮質 （0.5g) をそれぞれ 5mLの緩衝液 A (lOmM Tris-HCl, pH7,5, ImM EGTA, 0.8M NaCl, 10% sucrose) にてホモジ ナイズし、 35000rpm， 20分遠心した。 その後、 沈殿を 1% Tritonを含む 5mLの 同緩衝液 Aにてホモジナイズし、 35000rpm, 20分遠心し、得られた沈殿をさらに 1% Sarkosylを含む 5mLの同緩衝液 Aにてホモジナイズして 35000rpm， 20分の 遠心を行った。得られた沈殿を ImLの 8M尿素?薪夜、 あるいは 1%SDS溶液に溶 かし、 ELISAあるいはウェスタンブロットの検出に供した。 脱リン酸化は 8M尿 素画分を透析後、 λ Protein phosphatase ( λ PPase)にて 30°Cで 2時間処理した,
( 2 ) ELISA法による検出
TDP-43蓄積のなレ、正常脳 (Control)、及び TDP-43蓄積のある FTLD脳 (FTLD) の不溶性画分を、 50mM Tris-HCl緩衝液 (pH8.8)により 4 f gから倍々希釈して 96 ゥエルプレートに 4 °Cでー晚コーティングした。 その後、 一次抗体として巿販 TDP-43 抗体、 本発明の pSer409/410 ポリクローナル抗体 （実施例 1 )、 及ぴ pSer409/410モノクローナル抗体 （実施例 2 ) を 2時間反応させ、 さらにペルォキ シダーゼ標識した二次抗体を 2時間反応させた後、オルトフェニレンジァミンを基 質として発色させて検出した。
市販抗体では正常 （Control) と FTLDの間に違いは検出されなかった （図6パ ネル A) のに対し、 本発明の抗リン酸化 TDP-43抗体を用いた場合、 PSer409/410 モノクローナル抗体 （図 6パネル B)、 及び pSer409/410ポリクローナル抗体 （図 6パネル C) のレ、ずれにぉレ、ても、 FTLD患者由来の試料に対し強レ、陽性反応が認 められ、 その反応は量依存的であった。
( 3 ) ウェスタンブロッテイングによる検出 （1)
TDP-43蓄積のなレ、正常脳 (Control)、 TDP-43蓄積のある FTLD脳 (FTLD)、 及び ALS患者の脳の不溶性画分を 10%ポリアクリルアミ ドゲルで電気泳動し、分 離したタンパク質を PVDF膜に転写し、市販抗体、あるいは本発明の pSer409/410 モノクローナル抗体と反応させた。 ウェスタンブロッテイングは、上記と同様ァビ ジン · ピオチン複合体法を用い、 ジァミノベンチジンにより発色させた。
その結果、 市販抗体では 43kDaの位置に泳動される正常 TDP-43のパンドが強 く認識され、 正常 TDP-43 と異常 TDP-43の区別が困難であるのに対し （図 7パ ネル A)、本発明の pSer409/410モノクローナル抗体は正常 TDP-43ノ ンドとは反 応せず、 FTLD, あるいは ALS患者にみられる 45kDaバンド， 18~26kDaパンド， レーン全体がスメァ状に染まる反応 （図中 「smear」） など、 異常な TDP-43バン ドを特異的に検出した （図 7パネル B)。 またこの反応は； I Protein phosphatase (図中 r PPaseJ ) による脱リン酸化処理 （図 7の 「十」 のパネル） によって消失 することから、抗体が患者脳に蓄積するリン酸ィ匕 TDP-43を特異的に認識している ことが確認された。
( 4 ) ウェスタンプロッティングによる TDP-43断片の検出 (2)
TDP-43の蓄積病変は疾患によって異なる病変を示すことが知られている。突起 内封入体が主な病変である 1型、円形の細胞内封入体が多い 2型、さらにはその両 者が混在する 3型に分類され、 孤発性 FTLDは 1型、 FTLD-MND及び ALSは 2型、 PGRN変異を有する家族' I·生 FTLD (mPGRN) は 3型に分類される （図 8 パネル A)。
また、 最近 TDP-43蓄積が認められるアルツハイマー病 （AD) 及びレビー小体 病 （DLB) の症例が報告されたが、 これらは 3型の病変を示していた （図 8パネ ル A)。 これらの患者脳から上記のように調製した不溶性画分を 15%ポリアクリノレ アミドゲルで電気泳動し、 分離したタンパク質を PVDF膜に転写し、 本発明の pSer409/410抗体と反応させ、 その違いについて検討した。
その結果、 孤発性 FTLD症例 （1型） は、 23及ぴ 24 kDaの二本の主要バンド (断片 A群） 並びに 18及ぴ 19 kDaの 2本の弱いバンド （断片 B群） が検出され た。 これに対し、 FTLD-MND及び ALS症例 （2型） では、 23、 24及ぴ 26kDa の 3本の主要バンド （断片 A群） 並びに 18及び 19 kDaの二本の弱いバンド （断 片 B群） が検出された。 23 kDaバンドは孤発性 FTLD例で最も強いのに対し、 24 kDaバンドは FTLD-MND あるいは ALSで最も強かった。さらに mPGRN症 例並びに TDP-43 蓄積のある AD 及び DLB ( 3型） は、 孤発性 FTLD と FTLD-MND/ALS症例の中間型を示した （図 8パネル B， C)。 本実施例により、本発明の抗体がリン酸化 TDP-43を特異的に認識できることが 示された。 また、本発明の抗体を用いることにより、 TDP-43プロティノパチ一病 変を特異的に検出することができ、さらに TDP-43プロティノパチ一病変の種類を 判別できることが示された。
以上より、本発明の抗体は、 リン酸ィ匕 TDP-43検出薬、 TDP-43プロティノパチ 一病変の検出薬及び TDP-43プロティノパチ一の診断薬として有用である。 8 062650
産業上の利用可能性
本発明により、生体内で検出されるュビキチン陽性封入体等の TDP-43蛋白異常 凝集物に特異的に結合する抗体の提供が可能となる。 本発明の抗体は、 TDP-43プ ロティノパチ一患者で認められる TDP-43 蛋白異常凝集物を構成するリン酸化 TDP-43及びその一部を有するぺプチドと特異的に結合することができる。従って、 本発明の抗体は、 FTLDや ALS等の TDP-43プロティノパチ一の診断や治療に有 用である。 配列表フリーテキスト
配列番号 2 ： ：合成ぺプチド
配列番号 3 ： ：合成べプチド
配列番号 4 ： ：合成べプチド
配列番号 5 ： ： リン酸化合成べプチド
配列番号 6 ： ： リン酸化合成べプチド
配列番号 7 ： ： リン酸化合成べプチド
配列番号 8 ： ： リン酸化合成べプチド
配列番号 9 ： ： リン酸化合成べプチド
配列番号 1 0 ： リン酸化合成べプチド
配列番号 1 1 ： リン酸化合成ペプチド
配列番号 1 2 ： リン酸ィ匕コンセンサス配列
配列番号 1 3 ： リン酸ィ匕コンセンサス配列

Claims

請求 の 範囲
1. 以下の （a) 若しくは （b) のタンパク質又は （c) のペプチドと特異的 に結合する抗体。
(a) 配列番号 1に示されるアミノ酸配列において少なくとも 1つのアミ ノ酸残基がリン酸化されたァミノ酸配列を含むタンパク質
( b ) 配列番号 1に示されるァミノ酸配列にぉレ、て 1個若しくは数個のァ ミノ酸残基が欠失、 置換、 挿入若しくは付加された変異型アミノ酸配列を 含み、 かつ TDP-43活性を有するタンパク質であって、 当該変異型ァミノ 酸配列のうち少なくとも 1つのアミノ酸残基がリン酸ィ匕された前記タンパ ク質
(c) 上記 (a) 又は （b) のタンパク質のアミノ酸配列において、 リン 酸化されたァミノ酸残基を含む一部のァミノ酸配列を含む部分べプチド
2. 少なくとも 1つのァミノ酸残基が、 セリン残基、 トレオニン残基及ぴチロ シン残基からなる群から選ばれる少なくとも 1つである、 請求項 1に記載 の抗体。
3. 少なくとも 1つのァミノ酸残基が、 配列番号 1に示されるァミノ酸配列の 第 393番目、 第 403番目、 第 404番目、 第 409番目及び第 41 0 番目のアミノ酸残基からなる群から選ばれる少なくとも 1つである、 請求 項 1又は 2に記載の抗体。
4. ペプチドのアミノ酸配列が配列番号 5〜1 1のいずれかに示されるもの である請求項：！〜 3のいずれか 1項に記載の抗体。
5. リン酸化により （a) 若しくは （b) のタンパク質又は （c) の部分ぺプ チドの構造が変化した部位に結合することができる、 請求項 1〜 4のいず れか 1項に記載の抗体。
6. リン酸化がカゼインキナーゼ 1によるものである請求項 1〜5のいずれ か 1項に記載の抗体。
7. 抗体がモノクローナル抗体である請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の 抗体。
8 . 抗体がポリクローナル抗体である請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の f几体。
9 . 受領番号が FERMABP-10984であるハイブリドーマにより産生されるモ ノクローナル抗体。
1 0 . 請求項 7〜 9のいずれか 1項に記載の抗体が結合する抗原決定基に結合 する抗体。
1 1 抗体が、 キメラ抗体、 ヒト型化抗体又はヒト化抗体である、 請求項 7、 9 又は 1 0のいずれか 1項に記載の抗体。
1 2 . 請求項 7又は 9〜 1 1のいずれか 1項に記載の抗体を産生するハイブリ ドーマ。
1 3 . 受領番号が FERMABP- 10984であるハイブリドーマ。
1 4 . 請求項 1〜 1 1のいずれか 1項に記載の抗体を含有する、 リン酸化 TDP-43検出薬。
1 5 . 請求項 1〜 1 1のいずれか 1項に記載の抗体を含有する、 TDP-43プロテ イノパチー病変検出薬。
1 6 . 請求項：！〜 1 1のいずれか 1項に記載の抗体を含有する、 TDP-43プロテ イノパチ一の診断薬。
1 7. 請求項 1〜 1 1のいずれか 1項に記載の抗体を有効成分として含有する 医薬組成物。
1 8 . 請求項 1〜 1 1のレ、ずれか 1項に記載の抗体と採取された被験試料とを 反応させることを特徴とする、 TDP-43プロティノパチ一病変の検出方法。 1 9 . 請求項 1 4若しくは 1 5に記載の検出薬、 請求項 1 6に記載の診断薬、 又 は請求項 1 Ίに記載の医薬組成物の製造における、 請求項 1〜 1 1のいず れか 1項に記載の抗体の使用。
PCT/JP2008/062650 2007-07-06 2008-07-07 Ｔｄｐ－４３凝集物に特異的に結合する抗体 WO2009008529A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/667,624 US8940872B2 (en) 2007-07-06 2008-07-07 Antibody binding specifically to TDP-43 aggregate
EP08778121.7A EP2189526B1 (en) 2007-07-06 2008-07-07 Antibody binding specifically to tdp-43 aggregate
JP2009522694A JP5439176B2 (ja) 2007-07-06 2008-07-07 Ｔｄｐ−４３凝集物に特異的に結合する抗体

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007-178583 2007-07-06
JP2007178583 2007-07-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2009008529A1 true WO2009008529A1 (ja) 2009-01-15

Family

ID=40228697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2008/062650 WO2009008529A1 (ja) 2007-07-06 2008-07-07 Ｔｄｐ－４３凝集物に特異的に結合する抗体

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8940872B2 (ja)
EP (1) EP2189526B1 (ja)
JP (1) JP5439176B2 (ja)
WO (1) WO2009008529A1 (ja)

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013073219A1 (ja) 2011-11-18 2013-05-23 公益財団法人 東京都医学総合研究所 神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法
WO2013180201A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
KR20140018649A (ko) * 2012-08-03 2014-02-13 한양대학교 산학협력단 Ｔｄｐ―４３ 관련 질환 진단 마커
KR20140100480A (ko) * 2011-10-28 2014-08-14 바이오겐 아이덱 인터내셔널 뉴로사이언스 게엠베하 Tdp-43 특이적 결합 분자
US10060933B2 (en) 2011-06-22 2018-08-28 Universite Laval Methods for diagnosis and treatment of amyotrophic lateral sclerosis based on an increased level of interaction between TDP-43 polypeptide and NF-KB P65 polypeptide
US10202443B2 (en) 2014-12-05 2019-02-12 UNIVERSITé LAVAL TDP-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
US10253100B2 (en) 2011-09-30 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic antigen-binding molecule with a FcRn-binding domain that promotes antigen clearance
WO2019177138A1 (ja) 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人滋賀医科大学 異常ｔｄｐ－４３を分解除去する抗体断片
US10618965B2 (en) 2011-02-25 2020-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US10919953B2 (en) 2012-08-24 2021-02-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIB-specific Fc region variant
US10962551B2 (en) 2015-06-17 2021-03-30 The Johns Hopkins University TDP-43 in degenerative disease
US11267868B2 (en) 2013-04-02 2022-03-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
WO2023204313A1 (ja) 2022-04-22 2023-10-26 国立大学法人新潟大学 Ｔｄｐ－４３の凝集抑制剤及び医薬組成物
US11827699B2 (en) 2011-09-30 2023-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing antibodies promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018503596A (ja) * 2014-10-03 2018-02-08 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ Ｔｄｐ−４３の病理学的形態に対する抗体及びその使用
TWI592423B (zh) * 2014-10-03 2017-07-21 中央研究院 可辨識致病性ｔｄｐ－４３之抗體及其用途
US20240050529A1 (en) 2019-10-07 2024-02-15 University Of Virginia Patent Foundation Modulating lymphatic vessels in neurological disease
US20230067811A1 (en) 2020-01-24 2023-03-02 University Of Virginia Patent Foundation Modulating lymphatic vessels in neurological disease
US20230322908A1 (en) * 2020-08-14 2023-10-12 Ac Immune Sa Humanized Anti-TDP-43 Binding Molecules and Uses Thereof
CN118019759A (zh) 2021-03-10 2024-05-10 莫比伦有限公司 抗tdp-43的抗体及其使用方法
WO2025059486A1 (en) * 2023-09-15 2025-03-20 Prothena Biosciences Limited Anti-tdp-43 antibodies and uses thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997034145A1 (fr) * 1996-03-13 1997-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Anticorps a proteine tau antiphosphorylee et procede de detection de la maladie d'alzheimer l'utilisant

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5688511A (en) * 1991-11-05 1997-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cellular protein TDP-43 and regulation of HIV-1 gene expression
US8354236B2 (en) * 2006-09-29 2013-01-15 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Detection of neurodegenerative disease
WO2008151055A1 (en) * 2007-06-01 2008-12-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Diagnosing neurodegenerative diseases
GB0719287D0 (en) * 2007-10-03 2007-11-14 Univ Manchester Prognostic or diagnostic test

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997034145A1 (fr) * 1996-03-13 1997-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Anticorps a proteine tau antiphosphorylee et procede de detection de la maladie d'alzheimer l'utilisant

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAI T. ET AL.: "TDP-43 is a component of ubiquitin-positive tau-negative inclusions in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 351, no. 3, 22 December 2006 (2006-12-22), pages 602 - 611, XP008130902 *
HASEGAWA M. ET AL.: "TDP-43 is deposited in the Guam parkinsonism-dementia complex brains", BRAIN, vol. 130, no. PART 5, May 2007 (2007-05-01), pages 1386 - 1394, XP009137596 *
NEUMANN M. ET AL.: "Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis", SCIENCE, vol. 314, no. 5796, 6 October 2006 (2006-10-06), pages 130 - 133, XP002534603 *
OMI S. ET AL.: "Shinpan Ko Peptide Kotai Jikken Protocol -Idenshi Sanbutsu no Dotai kara Tanpakushitsu Kino Kaiseki Made-", vol. 2ND ED., 6 September 2004, SHUJUNSHA CO., LTD., pages: 106 - 129, XP008141316 *

Cited By (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10618965B2 (en) 2011-02-25 2020-04-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US11718678B2 (en) 2011-02-25 2023-08-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for altering plasma retention and immunogenicity of antigen-binding molecule
US10060933B2 (en) 2011-06-22 2018-08-28 Universite Laval Methods for diagnosis and treatment of amyotrophic lateral sclerosis based on an increased level of interaction between TDP-43 polypeptide and NF-KB P65 polypeptide
US11827699B2 (en) 2011-09-30 2023-11-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing antibodies promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
US10253100B2 (en) 2011-09-30 2019-04-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Therapeutic antigen-binding molecule with a FcRn-binding domain that promotes antigen clearance
KR20140100480A (ko) * 2011-10-28 2014-08-14 바이오겐 아이덱 인터내셔널 뉴로사이언스 게엠베하 Tdp-43 특이적 결합 분자
US11091540B2 (en) 2011-10-28 2021-08-17 Biogen International Neuroscience Gmbh TDP-43 specific binding molecules
KR102032080B1 (ko) * 2011-10-28 2019-10-15 바이오겐 인터내셔널 뉴로사이언스 게엠베하 Tdp-43 특이적 결합 분자
US9587014B2 (en) 2011-10-28 2017-03-07 Biogen International Neuroscience Gmbh TDP-43 specific binding molecules
US10259866B2 (en) 2011-10-28 2019-04-16 Biogen International Neuroscience Gmbh TDP-43 specific binding molecules
JP2017205118A (ja) * 2011-10-28 2017-11-24 バイオジェン インターナショナル ニューロサイエンス ゲーエムベーハー Ｔｄｐ−４３に特異的な結合分子
JP2015505665A (ja) * 2011-10-28 2015-02-26 バイオジェン アイデック インターナショナル ニューロサイエンス ゲーエムベーハー Ｔｄｐ−４３に特異的な結合分子
JP2019022500A (ja) * 2011-10-28 2019-02-14 バイオジェン インターナショナル ニューロサイエンス ゲーエムベーハー Ｔｄｐ−４３に特異的な結合分子
KR20180132977A (ko) * 2011-10-28 2018-12-12 바이오겐 인터내셔널 뉴로사이언스 게엠베하 Tdp-43 특이적 결합 분자
KR101961508B1 (ko) * 2011-10-28 2019-03-25 바이오겐 인터내셔널 뉴로사이언스 게엠베하 Tdp-43 특이적 결합 분자
US9624279B2 (en) 2011-11-18 2017-04-18 Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science Method for producing insoluble aggregate of neurodegenerative-disease-related protein
WO2013073219A1 (ja) 2011-11-18 2013-05-23 公益財団法人 東京都医学総合研究所 神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法
JPWO2013073219A1 (ja) * 2011-11-18 2015-04-02 公益財団法人東京都医学総合研究所 神経変性疾患関連タンパク質の不溶性凝集体の製造方法
JPWO2013180201A1 (ja) * 2012-05-30 2016-01-21 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
EP3892638A1 (en) 2012-05-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule for eliminating aggregated antigens
JP7481236B2 (ja) 2012-05-30 2024-05-10 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
WO2013180201A1 (ja) 2012-05-30 2013-12-05 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
JP2018172384A (ja) * 2012-05-30 2018-11-08 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
JP2021042225A (ja) * 2012-05-30 2021-03-18 中外製薬株式会社 会合化した抗原を消失させる抗原結合分子
KR20140018649A (ko) * 2012-08-03 2014-02-13 한양대학교 산학협력단 Ｔｄｐ―４３ 관련 질환 진단 마커
KR101587923B1 (ko) 2012-08-03 2016-01-25 한양대학교 산학협력단 Ｔｄｐ―４３ 관련 질환 진단 마커
US10919953B2 (en) 2012-08-24 2021-02-16 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha FcgammaRIIB-specific Fc region variant
US11267868B2 (en) 2013-04-02 2022-03-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Fc region variant
US10202443B2 (en) 2014-12-05 2019-02-12 UNIVERSITé LAVAL TDP-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases
US10962551B2 (en) 2015-06-17 2021-03-30 The Johns Hopkins University TDP-43 in degenerative disease
JPWO2019177138A1 (ja) * 2018-03-16 2021-05-13 国立大学法人滋賀医科大学 異常ｔｄｐ−４３を分解除去する抗体断片
WO2019177138A1 (ja) 2018-03-16 2019-09-19 国立大学法人滋賀医科大学 異常ｔｄｐ－４３を分解除去する抗体断片
JP7320282B2 (ja) 2018-03-16 2023-08-03 国立大学法人滋賀医科大学 異常ｔｄｐ－４３を分解除去する抗体断片
US12215142B2 (en) 2018-03-16 2025-02-04 National University Corporation Shiga University Of Medical Science Antibody fragment degrading and removing abnormal TDP-43
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
WO2023204313A1 (ja) 2022-04-22 2023-10-26 国立大学法人新潟大学 Ｔｄｐ－４３の凝集抑制剤及び医薬組成物

Also Published As

Publication number Publication date
US8940872B2 (en) 2015-01-27
EP2189526A1 (en) 2010-05-26
JP5439176B2 (ja) 2014-03-12
EP2189526A4 (en) 2010-09-29
US20110287453A1 (en) 2011-11-24
JPWO2009008529A1 (ja) 2010-09-09
EP2189526B1 (en) 2013-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5439176B2 (ja) Ｔｄｐ−４３凝集物に特異的に結合する抗体
US10208111B2 (en) Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
US7910333B2 (en) Antibodies to alpha-synuclein
EP2363471B1 (en) Immunoassay method for human cxcl1 protein
JP2021517239A (ja) 神経変性を検出するためのアッセイ
CA2595164A1 (en) An antibody which recognizes phosphorylated polypeptides
WO2004081047A1 (ja) モノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ
KR20160039682A (ko) 생물학적 샘플에서 개선된 성능을 가지는 timp2에 대한 검정
EP3533459A1 (en) Anti-pla2-gib antibodies and the uses thereof
US10584163B2 (en) Monoclonal antibody against human tau protein
JP4319700B1 (ja) 酸化修飾タンパク質またはポリペプチドに対する高特異性モノクローナル抗体
Zheng et al. Production and characterization of novel monoclonal antibodies against pathological human TDP-43 proteins
WO2020100779A1 (ja) ｐＳｅｒ４６－ＭＡＲＣＫＳに特異的に結合するモノクローナル抗体
JP7107497B2 (ja) Ｄｎａ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体
US20230125690A1 (en) Antibody for detecting acetylation of cox2 protein, and uses thereof
WO2025037271A1 (en) Plasma assay for detecting cns-derived tau peptides
KR100996486B1 (ko) 인체 무등(ｍｕｄｅｎｇ) 단백질에 대한 단일클론 항체
CN113366021A (zh) 糖基化Apo J特异性抗体及其用途
EA045805B1 (ru) Анализы для выявления нейродегенеративных заболеваний
HK1203206B (en) Antibody and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08778121

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009522694

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12667624

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008778121

Country of ref document: EP