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WO2008145830A2 - Nouveaux composes pro-fluorescents - Google Patents

Nouveaux composes pro-fluorescents Download PDF

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Publication number
WO2008145830A2
WO2008145830A2 PCT/FR2007/052631 FR2007052631W WO2008145830A2 WO 2008145830 A2 WO2008145830 A2 WO 2008145830A2 FR 2007052631 W FR2007052631 W FR 2007052631W WO 2008145830 A2 WO2008145830 A2 WO 2008145830A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
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seq
compound
radical
derivatives
compound according
Prior art date
Application number
PCT/FR2007/052631
Other languages
English (en)
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WO2008145830A3 (fr
Inventor
Pierre-Yves Renard
Anthony Romieu
Jean-Alexandre Richard
Marc Massonneau
Original Assignee
Quidd
Universite De Rouen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quidd, Universite De Rouen filed Critical Quidd
Publication of WO2008145830A2 publication Critical patent/WO2008145830A2/fr
Publication of WO2008145830A3 publication Critical patent/WO2008145830A3/fr

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Definitions

  • the subject of the present invention is novel pro-fluorescent compounds that can be activated by a physical, chemical or biological phenomenon, in particular by enzymatic hydrolysis, and the use of these compounds in processes for qualifying and / or quantifying these phenomena, by example an enzymatic activity.
  • Obtaining a sensitive detection system in a fluorescence-based assay protocol requires the smallest possible background signal, so that the fluorescence signal generated as a result of the reaction to be followed is easily detectable. In many situations, background noise reduces the detection threshold and the sensitivity of the tests.
  • the pro-fluorescent compounds that can be activated by a physical, chemical or biological phenomenon can be composed of a labile structure activatable by the phenomenon in question, for example an enzyme-hydrolysable substrate unit, directly linked to the fluorescent molecule. or fluorophore.
  • Activation of the labile structure such as the hydrolysis of the bond between a substrate pattern and a fluorescent compound, releases the latter leading to the generation of a light signal.
  • Activation of the labile structure such as the hydrolysis of the bond between a substrate pattern and a fluorescent compound, releases the latter leading to the generation of a light signal.
  • such compounds have the disadvantage of being able to implement only fluorophores naturally having a reactive function capable of being coupled to the activatable labile structure.
  • WO 2005/047245 proposes the use of pro-fluorescent compounds for monitoring enzymatic reactions activated by esterases, glycosidases or leucineaminopeptidase.
  • GB 2 324 529 discloses 7-aminomethylcoumarin-substituted tetrapeptide derivatives useful for identifying specific substrates of different enzymes such as serine or cysteine protease.
  • the object of the present invention is precisely to propose new pro-fluorescent compounds offering a wide range of excitation and emission wavelengths, thus making it possible to diversify the fields of use of such compounds.
  • Another object of the present invention is to propose novel pro-fluorescent compounds suitable for detecting, quantifying and monitoring an enzymatic reaction releasing a free amine function, for example using an amidase hydrolase, for example a cysteine protease or penicillin amidase.
  • an amidase hydrolase for example a cysteine protease or penicillin amidase. This process can be extended to other enzymes or chemical reactions and also to changes in the medium (pH change or decomplexation of metal ions for example) releasing an amine.
  • an activatable labile structure by a physical, chemical or biological phenomenon, such as a substrate that is hydrolyzable for example by a cysteine protease, to a wide variety of fluorophores. comprising at least one reactive function -OH or -SH by means of a reactive arm as detailed below.
  • the subject of the present invention is a pro-fluorescent compound of general formula (I):
  • B is a reactive arm, activatable by release of A and capable of generating a radical bearing a nucleophilic substituent, optionally anionic, said radical being capable of undergoing an intramolecular rearrangement leading to the release of F, - X is a sulfur atom, oxygen, an OC (O), OC (O) O, OS (O) or OP (O) moiety,
  • F is a fluorophore radical compatible with the establishment of an ether, thioether, ester, carbonate, sulphate, sulphonate, sulfinate, phosphate, phosphonate, phosphinate or aminophosphonate bond with B via the X unit and being such that the emission spectrum and / or excitation of F linked to B is shifted relative to the spectrum of emission and / or excitation of free F, B being selected from radicals of general formulas (IIa), (IIb), (IIc), (IId), (IIc), (IIf), and (IIg), as follows:
  • Y represents O, NH or S
  • R 1 and R 2 independently of one another may represent H, an alkyl radical -C 3 -alkoxy or Ci-C 3 carboxyl or carboxylate group,
  • R 3 and R 4 independently of one another may represent H, an alkyl radical -C 5 alkoxy Ci -C 5 or an electron-withdrawing radical or electron donor such as a ester, nitrile, nitro, ether, amine, or amide group, n is 1 or 2, - P is 0 or 1,
  • the reactive arm of formula (JIf) as defined above may in particular represent a radical chosen from radicals of formulas (Hi), (Hf), (Hj) and (Hk) which follow:
  • pro-fluorescent compounds of general formula (I) which are subjects of the invention, there may be mentioned a group of compounds of formula (I) as defined above, comprising in particular a reactive arm chosen from the arms of formulas (IIa), (Ile) and (Hf), including (IFf).
  • the term "pro-fluorescent compound” means a molecular architecture consisting of: (A) an entity having one or more units capable of interacting with the entity to be detected (for example an enzyme) and of undergoing one or more chemical transformations under the effect of said chemical entity; (B) a fluorescent molecule (fluorophore) which, when it is covalently associated with the entity (A), has its optical properties significantly modified, in particular such that an offset of its emission spectrum and / or excitation.
  • the offset can be performed in terms of intensity variation of the spectra maxima.
  • the fluorescence level of the pro-fluorophore can be almost zero or very much lower than that of the free fluorophore.
  • the offset can be performed on the position of the wavelengths of the maxima of the emission and / or excitation spectra.
  • a shift of excitation wavelengths and / or fluorescence emission to shorter wavelengths is observed.
  • the displacement can be carried out to longer excitation and / or emission lengths (batrochromic effect).
  • the interaction between the pro fi uorescent probe and the entity to be detected results in the release of the fluorophore and the appearance of a signal (after excitation at the appropriate wavelength) easily detectable.
  • the subject of the present invention is the use of a pro-fluorescent compound according to the invention for the preparation of a pharmaceutical and / or diagnostic composition.
  • the subject of the present invention is a pharmaceutical and / or diagnostic composition comprising at least an effective amount of at least one pro-fluorescent compound according to the invention.
  • the term "effective amount" the amount of a given compound required to obtain a desired effect, for example biological, pharmaceutical or diagnostic, desired.
  • the subject of the present invention is a method for detecting and / or quantifying a physical, chemical or biological phenomenon comprising at least the steps of: a) bringing into contact with a medium capable of manifestation of said phenomenon, a pro-fluorescent compound according to the invention under conditions appropriate to the release of the activatable labile structure A, and b) detecting the presence or absence of a fluorescence signal of F.
  • a process according to the invention can be carried out in vitro, ex vivo or in vivo.
  • a biological phenomenon may be an enzymatic activity.
  • the enzymatic activity may be that of an enzyme releasing a free amine function, such as a cysteine protease or a penicillin amidase.
  • the subject of the present invention is a diagnostic kit comprising at least one pro-fluorescent compound according to the invention.
  • derivative is intended to denote tautomeric forms, stereoisomeric forms, polymorphic forms, acceptable salts and pharmaceutically acceptable or diagnostic solvates.
  • the term “tautomeric form” is intended to mean one of the isomers whose structures differ by the position of an atom, generally hydrogen, and one or more multiple bonds and which are able to transform themselves easily and reversibly into one another.
  • the term “stereoisomeric form” is intended to denote isomers of molecules of identical constitution, which differ only in one or more arrangements (s) different from their atoms in space.
  • salts means compounds obtained by reaction of a compound of general formula (I) with a base or an acid.
  • a base suitable for the invention mention may be made of sodium hydroxide, sodium methoxide, sodium hydride, potassium tert-butoxide, calcium hydroxide and magnesium hydroxide. and the like, and mixtures thereof, in solvents such as THF (tetrahydrofuran), methanol, tert-butanol, dioxane, isopropanol, ethanol, their analogs, and mixtures thereof.
  • Organic bases such as lysine, arginine, diethanolamine, choline, tromethamine, guanidine and their derivatives may also be used.
  • acid addition salts which are suitable for the invention, mention may be made of those which may be prepared by reaction of a pro-fluorescent compound according to the invention with an acid such as the acid hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, para-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid (TFA), acid citric acid, maleic acid, salicylic acid, hydroxynaphthoic acid, ascorbic acid, palmitic acid, succinic acid, benzoic acid, benzenesulphonic acid, tartaric acid, and the like, and mixtures thereof, in solvents such as ethyl acetate, ether, solvents, alcoholics, acetone, THF, dioxane, their analogues and mixtures thereof.
  • an acid such as the acid hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric
  • polymorphic form is intended to mean compounds obtained by crystallization of a compound according to the invention under different conditions, such as, for example, the use of various solvents, generally used for crystallization. Crystallization at different temperatures involves, for example, different cooling modes, for example very fast to very slow cooling involving heating or compound melting steps followed by gradual or rapid cooling.
  • the presence of polymorphic forms can be determined by means of NMR spectroscopy, IR (infrared) spectroscopy, DSC (Différenciai Scaning Calorimetry) analysis, X-ray diffraction or other similar techniques.
  • alkyl radical is intended to mean a linear, branched or cyclic, condensed or non-condensed, saturated or unsaturated hydrocarbon radical containing from 1 to 5 carbon atoms, preferably from 1 to 4 carbon atoms, and more preferably 2 to 3 carbon atoms may be substituted by radicals as defined below.
  • radicals such as methyl, ethyl, isopropyl, n-butyl, tert-butyl, tert-butylmethyl, n-propyl, pentyl.
  • cyclic alkyl radical means an alkylene ring of 3 to 5 carbon atoms, such as cyclopropyl or cyclopentyl.
  • alkoxy radical means an -OR radical in which the alkyl radical R is a linear, branched or cyclic hydrocarbon radical, condensed or not, saturated or unsaturated, as defined above.
  • alkyl radical R is a linear, branched or cyclic hydrocarbon radical, condensed or not, saturated or unsaturated, as defined above.
  • the hydrocarbon chain of the aforementioned radicals can be interrupted by one or more heteroatoms chosen from O, N and S, to form, for example, a heteroalkyl radical such as an alkyl ether radical, an alkyl ester radical or a heterocycle.
  • substituents which may be used for substituting the abovementioned radicals, mention may be made of a hydroxyl radical, an oxo unit, a thio group, an amino group, a halogen atom, a alkyl radical, a carboxy radical, an acyl radical, an amido radical, an alkoxy radical, an alkyl- or dialkylamino radical, an alkylthio radical, a haloalkyl radical such as, for example, perfluoroalkyl, an alkyl-, dialkyl- or trialkyl-silyl, an alkyl-, dialkyl- or trialkyl-siloxy radical, an aryl radical, as defined above.
  • halogen atom is understood to mean an F, Cl, Br or I atom.
  • the halogen atoms advantageously used in the present invention are fluorine and chlorine.
  • haloalkyl radical an alkyl radical as defined above substituted with one or more halogen atoms as defined above, and in particular, by way of non-limiting example, perfluoromethyl.
  • a pro-fluorescent compound according to the invention may comprise a reactive arm represented by B of general formulas as defined above.
  • the B-X unit may be chosen from the following radicals of formulas (HIa), (HIb), (IIIc), (HId), (HIe), (HIf), (HIg) and (HIh):
  • - * has the same meaning as before and - @ symbolizes the link to F and n is 1 or 2.
  • unit B-X represents a radical of formula (HIa), (HIb) or (IIIc) as defined above.
  • A represents a labile structure activatable by a chemical, physical, or biological phenomenon.
  • physical phenomenon is meant for the purposes of the present invention, for example, a temperature variation, a pressure variation.
  • chemical phenomenon is meant for the purposes of the present invention a phenomenon involving, for example, a pH variation, a variation in salinity, a variation of the redox potential, an appearance or disappearance of species for example ions such as F “ , RS “ , HS “ or S 2 " , and alkaline earth metal ions such as Ca 2+ .
  • A may advantageously be, for example an ammonium, an amide, an amine, an ester, an organosilane, a thiol, a carbamate, or a carbonate.
  • biological phenomenon is intended to denote a phenomenon involving the activity of a biological entity, for example an enzymatic activity, such as, for example, a hydrolysis, a transfer of an amino group, an isomerization.
  • an enzymatic activity such as, for example, a hydrolysis, a transfer of an amino group, an isomerization.
  • a biological entity capable of activating the compounds according to the invention mention may be made, in a nonlimiting manner, of enzymes, ribozymes and abzymes.
  • enzymes capable of activating the compounds in accordance with the invention mention may be made of transferases, such as aminotransferases, hydrolases such as esterases or phosphatases (alkaline phosphatase, for example), glycosidases, proteases (trypsin, metalloproteinases or caspases for example), isomerases.
  • A may include a labile structure by the action of an enzyme, and especially by the action of a hydrolase, for example of the amidase type.
  • A may be a substrate unit by a protease or penicillin amidase hydrolase.
  • A may represent a peptide or pseudopeptide substrate of sufficient length to allow its recognition and its hydrolysis by an enzyme, and in particular a protease.
  • proteases that may be suitable for the implementation of the present invention, mention may be made, without limitation, of caspases such as caspase-3, acylaminoacyl peptidase, aminopeptidase M, penicillin amidase or penicillinase G acylase, thermolysin, cathepsins B, G, L, metalloproteinases, elastase, subtilisin, plasminogen activator, urokinase.
  • A when A is a peptide substrate, it may comprise at least two amino acid residues, in particular at least four, in particular at month six and more particularly at least eight amino acid residues.
  • A may comprise from 2 to 10 amino acids, in particular from 3 to 8 amino acids and more particularly A may comprise 4 amino acids.
  • the amino acids entering the peptide sequence of the substrate unit A may be amino acids of configuration L or D.
  • a peptide substrate unit A suitable for the invention may optionally comprise one or more natural amino acids, modified or otherwise, or synthetic.
  • the amino acids can be modified natural amino acids.
  • modifications that are suitable for the invention mention may be made of the addition of one or more substituents on the side chain or on an amine or carboxylic function not engaged in a peptide bond.
  • the modification (s) made to a natural amino acid present in the substrate unit A or the introduction of a synthetic amino acid are operated in such a way as not to substantially affect the hydrolysis of the substrate unit A by the enzyme to detect.
  • a substituent may be a phenyl or a hydroxyl function.
  • a substituent that is suitable for the invention may be an acetyl radical.
  • the protease may be a specific aspartyl cysteine protease (caspase). More particularly, the cysteine protease may be caspase-3.
  • A may represent a tetrapeptide chosen from WEHD (SEQ ID NO: 1), YVAD (SEQ ID NO: 2), LEHD (SEQ ID NO: 3), DETD (SEQ ID NO: 4), DEVD (SEQ ID NO: 5), DEHD (SEQ ID NO: 6), VEHD (SEQ ID NO: 7), LETD (SEQ ID NO: 8), LEHD (SEQ ID NO: 9), SHVD (SEQ ID NO: 10), DELD (SEQ ID NO: 11), DGPD (SEQ ID NO: 12), DEPD (SEQ ID NO: 13), DGTD (SEQ ID NO: 14), DLND (SEQ ID NO: 15), DEED ( SEQ ID NO: 16), DSLD (SEQ ID NO: 17), DVPD (SEQ ID NO: 18), DEAD (SEQ ID NO: 19), DSYD (SEQ ID NO: 20), ELPD (SEQ ID NO: 21), VEID (SEQ ID NO: 26) or
  • A may be a tetrapeptide, in particular DEVD (SEQ ID No. 5), modified by the addition of an acetyl radical (Ac) at the N-terminus.
  • A may include a pattern recognized by a penicillin amidase hydrolase.
  • A may comprise a structure that is labile by the action of an esterase hydrolase, such as a carboxyesterase, a phosphatase or a lipase.
  • A may represent a unit comprising a radical derived from a carboxylic acid, in particular a fatty acid recognized by an esterase enzyme or a radical derived from a sugar recognized by a glycosidase or radical enzyme.
  • phosphate recognized by a phosphatase enzyme may be any suitable for phosphate.
  • a phosphate radical that is suitable for the invention may be of the following formula:
  • M + represents a cation such as an alkali metal, such as Na + or K +, ammonium, or a quaternary ammonium cation N (R) 4 + wherein each R may be alkyl, -C C 2 , an ayl such as benzyl, or form a part of a heterocycle, such as a pyridinium.
  • R represents a cation such as an alkali metal, such as Na + or K +, ammonium, or a quaternary ammonium cation N (R) 4 + wherein each R may be alkyl, -C C 2 , an ayl such as benzyl, or form a part of a heterocycle, such as a pyridinium.
  • R may be alkyl, -C C 2 , an ayl such as benzyl, or form a part of a heterocycle, such as a pyridinium.
  • A may be a labile structure by action of a glycosidase type enzyme.
  • A may comprise a radical derived from a sugar.
  • a sugar which may be suitable for the implementation of the invention, mention may be made of ⁇ -D- or ⁇ -D-galactoside, ⁇ -D- or ⁇ -D-glucoside , ⁇ -D- or ⁇ -D-mannoside and ⁇ -D or ⁇ -D-fructofuranoside.
  • A may comprise a structure which is labile by the action of an aminotransferase, such as, for example, and without limitation, an alanine aminotransferase or an aspartate aminotransferase.
  • an aminotransferase such as, for example, and without limitation, an alanine aminotransferase or an aspartate aminotransferase.
  • a fluorophore that is suitable for the invention is such that the emission and / or excitation spectrum of the fluorophore bonded to B is shifted with respect to the emission and / or excitation spectrum of the free fluorophore.
  • the offset can occur in terms of intensity variation of the spectra maxima, or by a shift of the wavelengths of the maxima to shorter or longer wavelengths.
  • a fluorophore that is suitable for the invention is such that the fluorescence signal of this fluorophore bonded to B is substantially decreased, or even zero or close to zero, relative to the fluorescence signal of free F.
  • a fluorophore F suitable for the invention comprises in its structure at least one reactive function capable of being engaged in a thioether, ether, ester, carbonate, sulphate, sulphonate, sulfinate, phosphate, phosphonate, phosphinate or aminophosphonate bond with B and for which S, O, OC (O), OC (O) O, OS (O) or OP (O) is represented by X in general formula (I).
  • fluorophores chosen from hydroxynaphthalenes, hydroxypyrenes, acridine and its derivatives such as hydroxyacridines, 9-methylacridine and 7-hydroxy-9H ( 1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin-2-one) (DDAO), and 7-hydroxy-9H- (9,9-dimethylacridin-2-one) (DAO), coumarin and its derivatives such as 7-hydroxycoumarin, hydroxystilbenes, furan, oxazole, oxadiazole, nitrobenzoxadiazole and its derivatives such as hydroxynitrobenzoxadiazoles, indole and its derivatives, benzoindoles, benzopyran and its derivatives (chromene and derivatives), benzothiazole and its derivatives, phenoxazine and its derivatives, benzophenoxazines (cresy
  • a pro-fluorescent compound of the invention capable of being activated by a cysteine protease, and in particular a caspase may in particular be such that:
  • A can represent Ac-DEVD, in which Ac is an acetyl radical, B-X can represent a unit of formula (HIa) or (HIb):
  • F may be chosen from a radical derived from 7-hydroxycoumarine, a radical derived from DAO and a radical derived from DDAO.
  • a pro-fluorescent compound that is suitable for the invention may be chosen from the following formulas (IVa) and (IVb):
  • a pro-fluorescent compound of the invention capable of being activated by a penicillin amidase may be such that: A may represent:
  • B-X may represent a radical of formula (HIa) or (HId)
  • F may be chosen from a radical derived from 7-hydroxycoumarine, a radical derived from DAO and a radical derived from DDAO.
  • a pro-fluorescent compound that is suitable for the invention may have the following formula (V):
  • a compound according to the invention may further comprise, at the level of the activatable labile structure, a targeting structure D.
  • a compound may have the following general formula (VI):
  • D is a targeting structure
  • A, B and F are as previously defined.
  • the targeting structure D is an element capable of recognizing or binding preferentially cells expressing a particular cellular element, such as, for example, and in a nonlimiting manner, a receptor, an enzyme, a structural protein, a glycoprotein, a sugar, a lipid or a phospholipid.
  • a particular cellular element such as, for example, and in a nonlimiting manner, a receptor, an enzyme, a structural protein, a glycoprotein, a sugar, a lipid or a phospholipid.
  • the cellular element is a membrane element, preferably having a part of its structure disposed in the extracellular medium.
  • this cellular element may be specific for a physiological or pathological state of the cell or tissue surrounding the cell or organ comprising the cell.
  • the cellular element may be specific for the cell's growth state, its position in the cell cycle, an inflammatory response of the cell or tissue, an apoptosis,
  • the expression "preferentially recognize or bind" is intended to indicate that the targeting structure D has a particular affinity for the cells or tissues under consideration, even if a nonspecific or less important binding with other cells or tissues can not be totally excluded in vivo or ex vivo. The preferential binding, however, allows targeting of the compounds according to the invention to the sites of interest, reducing the dissemination of the compound according to the invention to tissues and / or cells of lesser interest.
  • the targeting structure D can be chosen, for example and without limitation, from a lectin, an antibody or a fragment thereof specifically recognizing an element present on the surface of cells such as for example a protein, a sugar, a lipid; a ligand of a cellular receptor such as, for example, a peptide such as neuropeptide Y, a catecholamine such as adrenaline, an antagonist such as, for example, a ⁇ -adrenergic receptor antagonist, such as propranolol, a growth factor, a amino acid or a derivative thereof such as for example glutamate, a cytokine such as for example interleukin, interferon or TNF or the HIF (hypoxyinducing factor), a hormone, a vitamin, an apolipoprotein, the cholesterol; a ligand capable of interacting with a membrane lipid or phospholipid such as, for example, annexin; a ligand capable of interacting with a sugar present on the surface of the cells.
  • cellular receptor is intended to denote any cellular element capable of transducing information from the outside to the inside of the cell. It is within the skill of those skilled in the art to determine the nature of the structure D appropriate to the desired targeting, where appropriate by using test methods customarily practiced in the field.
  • the targeting structure D may be a ligand, for example a polypeptide, capable of binding to the surface of cells typically or specifically present in a particular tissue or pathology.
  • the targeting structure D can also bind to the surface of tumor cells or present in tumor tissue, or on the surface of cells present in inflammatory tissue.
  • the targeting structure D may, for example, bind to the surface of cells involved in an apoptosis process, which expose negatively charged lipids, such as phosphatidylserine, on their surface.
  • the targeting structure D can be a protein or a fragment of a protein such as a peptide or a polypeptide or a pseudopeptide.
  • proteins capable of binding to the membranes which expose negatively charged lipids mention may be made, in a non-limiting manner, of the annexin family, the families of proteins comprising a Cl or C2 domain, such as the coagulation factors V and VIII. blood, the families of proteins having a PH domain or a FYVE domain, or proteins having a domain identical to or homologous to the domain of ⁇ 2-glycoprotein-I ( ⁇ GP-I). These proteins or domains derived from their sequences can be used as a targeting structure in compounds according to the invention.
  • a targeting structure D may be fixed one or more compounds of general formula (I), in order to increase, in particular, the intensity of the emitted signal.
  • at least one, especially at least two, in particular at least 3, in particular at least 4, and more particularly at least 5 compounds of formula ABF can be fixed per targeting element D.
  • the subject of the present invention is also a use, for purposes of detecting and / or quantifying a physical, chemical or biological phenomenon, of at least one pro-fluorescent compound according to the invention, in which A is an activatable labile structure.
  • a process according to the invention comprises at least the steps of contacting at least one effective amount of at least one pro-fluorescent compound according to the invention, and in particular of general formula (I), with a medium suitable for the manifestation of a physical, chemical or biological phenomenon under conditions appropriate to the release of the activatable labile structure A, and the detection of the presence or absence of a fluorescence signal of F.
  • a method according to the invention can be carried out in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the present invention aims to also provide a method for detecting and / or quantifying a biological phenomenon represented by a biological entity.
  • a biological entity can be an enzyme.
  • A may be an enzyme hydrolysable unit, for example a hydrolase such as a cysteine protease or a penicillin amidase.
  • cysteine protease may be a caspase.
  • a medium suitable for the manifestation of a biological phenomenon may be a presumed medium comprising an enzyme.
  • a pro-fluorescent compound according to the invention implemented in this use may comprise a BX unit chosen from the formulas (HIa), (HIb) or (IIIc).
  • the labile structure A is a substrate recognized by said enzyme. The action of the enzyme on the substrate A, under conditions conducive to the manifestation of the reactivity of the enzyme, leads to the emission of a fluorescent signal.
  • a medium that is suitable for the process of the invention may be a biological, synthetic or natural medium, like a sample of biological fluid.
  • a method according to the invention may be, in particular, implemented in a biological sample comprising cells.
  • Such a sample can be obtained by culturing primary cells or lineage cells.
  • Primary cells can be obtained by biopsy.
  • the detection of a fluorescence signal of F may be indicative of a biological response, in particular of a cellular response, for example an apoptosis.
  • a medium suitable for the implementation of the invention may be represented by neuronal cells.
  • fluorescein fluorescein, bovine albumin, human albumin, and quaternary onium polymer salts such as polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride (TMQ), polyvinylbenzyltributylammonium (TBQ) chloride (Sapphire-II TM), polyvinylbenzyldimethylammonium chloride (BDMQ) (Sapphire-I TM), polyvinylbenzyltributylphosphonium chloride, polyvinylbenzyltributylsulfonium chloride, poly (benzyldimethylvinylbenzyl) ammonium chloride, sodium salt fluorescein (Emerald TM), poly (benzyltributyl) ammonium, and fluorescein sodium salt (Emerald II TM).
  • TMQ polyvinylbenzyltrimethylammonium chloride
  • TBQ polyvinylbenzyltributylammonium chloride
  • a sample placed in contact with a compound according to the invention may, optionally after an incubation period, be subjected to an analytical method comprising or not a step of separating the elements making up the sample, for example by chromatography (For example a high performance liquid chromatography, HPLC), and a spectral analysis step (for example by UV spectroscopy) of the different fractions from the separation step.
  • chromatography For example a high performance liquid chromatography, HPLC
  • a spectral analysis step for example by UV spectroscopy
  • the detection and measurement of the specific spectroscopic signal of a compound according to the invention may be correlated with the presence, and / or the intensity / quantity of the phenomenon. to detect, such as for example the presence, quantity, and / or kinetic activity of an enzyme.
  • a method or a use in accordance with the invention can be implemented in vivo with a pro-fluorescent compound according to the invention comprising, as fluorophore F, a fluorophore whose spectrum of emission is in the near infra-red, for example between 650 nm and 900 nm.
  • a method and a use according to the invention can be implemented in vivo.
  • a pro-fluorescent compound according to the invention may be previously administered to a living being, such as for example an animal or a human, and then the detection of the fluorescence signal can be carried out in vivo according to the means usually implemented in the domain.
  • the implementation in vivo of a use according to the invention makes it possible to establish images of tissues or organs in which the activity of an enzyme to be detected / quantified is likely to occur.
  • a method according to the invention can be implemented in medical imaging methods.
  • a method according to the invention is an in vivo in vitro diagnostic method comprising the detection and / or quantification of an enzyme using a compound of general formula (I).
  • the method according to the invention can be applied, for example and without limitation, to medical, experimental, clinical or pre-clinical diagnostic targets in humans or in animals such as laboratory animals or animals used. in agriculture, such as rat, mouse, guinea pig, non-human primate, guinea pig, or pig.
  • the enzyme capable of being detected and / or quantified by a process according to the invention may be a hydrolase such as a protease, in particular a cysteine protease, more particularly a caspase and in particular caspase. 3.
  • a hydrolase such as a protease, in particular a cysteine protease, more particularly a caspase and in particular caspase. 3.
  • the enzyme to be detected and / or quantified may be a penicillin amidase.
  • the compounds in accordance with the invention may be formulated in order to be suitable for oral, or parenteral, in particular intravenous, intraarterial, intracardiac, intracerebroventricular, intraperitoneal or intratumoral administration. , or for pulmonary, nasal, ophthalmic and possibly rectal, vaginal or topical administration.
  • the compounds in accordance with the invention can thus be used in a formulation adapted to the detection method to be carried out and to the chosen administration voice.
  • the compounds according to the invention may be prepared in the form of a tablet, a capsule or an aqueous solution, concentrated or otherwise.
  • This aqueous solution can be advantageously sterile.
  • the compounds in accordance with the invention may be in solid form, for example in powder form, and be prepared in aqueous solution, advantageously sterile, just before their administration.
  • the present invention also relates to the use of a compound according to the invention, in particular of general formula (I) for the manufacture of a pharmaceutical composition and / or diagnostic.
  • a composition of the invention may be intended for the implementation of an in vivo diagnostic method, in particular a medical imaging method.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least an effective amount of at least one compound according to the present invention, in particular of general formula (I).
  • the implementation of a compound according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition may be in the form of a derivative, such as a pharmaceutically acceptable salt or ester.
  • the present invention also relates to the salts and esters of the compounds according to the invention.
  • an ester of a compound according to the invention mention may be made of a succinate, a hemisuccinate, a malate, a tartrate or a glycolate of a compound according to the invention.
  • a salt of a compound according to the invention there may be mentioned a sulfate, a phosphate, a sodium salt, a calcium salt of a compound according to the invention.
  • the adjustment of the appropriate effective amounts of the compound (s) according to the invention, to be used in a process or a use according to the invention, depends on the cysteine protease, to detect / quantify and the environment in which the process according to the invention is carried out (in vitro, ex vivo or in vivo).
  • the effective amounts can also be adjusted according to the size, the weight of the individual to whom the process according to the invention is applied, or in which the use according to the invention is implemented, as well as depending on the organ or tissue targeted.
  • the present invention relates to a kit for the detection and / or quantification of a cysteine protease, said kit comprising at least one pro-fluorescent compound according to the present invention.
  • the present invention relates to a kit for the detection and / or quantification of a cysteine protease, comprising a compound according to the present invention, and in particular of general formula (I).
  • the kit according to the present invention may also comprise at least one light amplifier as defined above.
  • FIGURE LEGENDS Figure 1 illustrates the emission spectrum of the coumarin model 29
  • Figure 2 illustrates the kinetics of cleavage of the coumarin model 29
  • Figure 3 illustrates the emission spectrum of the DAO model 31
  • Figure 4 illustrates the kinetics of cleavage of the DAO model 31
  • Figure 5 illustrates the emission spectrum of the Ac probe -DEVD-PABA- Coumarin 23
  • Figure 6 illustrates the kinetics of cleavage of the probe Ac-DEVD-PABA-Coumarin 23
  • Figure 7 temporal evolution of the fluorescence emission of the Ac-DEVD (OH) -PABA-Coumarin probe 23
  • Figure 8 illustrates the emission spectrum of the Ac-DEVD-P probe AB A-D AO 25
  • Figure 9 illustrates the cleavage of the Ac-DEVD -PABA-DAO probe
  • Figure 10 illustrates the cleavage of the PhAc-ThAEC-Coumarin probe (k).
  • Scheme 1 synthesis of model compounds 29, 30 and 31
  • Diagram 6 introduction of the PABA 4 linker on the tetrapeptide Ac-DEVD-OH 3 SScchheema 77 :: synthesis of the Ac-DEVD-P ABA-Coumarin probe 23
  • HPLC High performance liquid Chromato graphy separations
  • Double UV-Visible detection was carried out at 210 and 254 nm
  • the amino acid is dissolved in a mixture of anhydrous DMF and CH 3 CN (1.4 M). Freshly distilled pyridine (2 eq.) And 2-trimethylsilyl (ethanol) (1.2 eq.) Were added, then the mixture was cooled to 0 ° C. and N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC 1 , 1 eq.) Has been added. After stirring for 1 hour at room temperature, the solution was filtered through Celite and washed with AcOEt.
  • the benzyl esters were dissolved in ethyl acetate (0.06 M). The medium was cooled to 0 ° C., then palladium on charcoal (10%, Pd / C) was added and the mixture was stirred at room temperature and under hydrogen atmosphere overnight. The solution was filtered through celite and the filtrates were concentrated in vacuo, yielding the corresponding free acids.
  • N- (4-hydroxymethyl) phenyl) -2-phenylacetamide (443 mg, 1.84 mmol) was dissolved in anhydrous acetone (23 ml) and cooled to 0 ° C.
  • Triethylamine (770 ⁇ l, 5.5 mmol, 3 eq.)
  • methanesulfonyl chloride (425 ⁇ l, 5.5 mmol, 3 eq.)
  • CH 2 Cl 2 (20 ml) was added and the solution was poured onto a cooled (0 0 C) aqueous solution of HCl (2N).
  • AC-DEVD (TMSE) -OH 3 (598 mg, 0.73 mmol) was dissolved in anhydrous DMF (7 ml) and cooled to -4 ° C. Then, the alcohol / ⁇ - ⁇ -aminobenzyl alcohol (PABA) (90 mg, 0.73 mmol, 1 eq.) And N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDCI) (154 mg, 0.80 mmol, 1.1 eq.) Were were added and the mixture was stirred for 1 hour at room temperature.
  • PABA ⁇ - ⁇ -aminobenzyl alcohol
  • EDCI N-ethyl-N '- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • Phenylacetyl chloride 26 was reacted with ⁇ - ⁇ -aminobenzyl alcohol 4 in the presence of pyridine. After purification on silica gel, the compound 27 is thus obtained with a yield of 78%. The alcohol function of compound 27 is then activated with mesyl chloride and triethylamine. Fluorophores 18, 20 and 21 were then introduced, leading to probes 29-31 with respective yields in 2 steps (activation and grafting) of 28, 7 and 14% (Scheme 1).
  • the model compound 32 has a fluorescent 7-hydroxycoumarin motif at physiological pH but loses its fluorescent character when the phenol function is esterified.
  • This probe was prepared in two steps from the derivative of homovanillic acid 33 and benzyl ester of (7-hydroxycoumarin-4-yl) acetic acid 34 (Scheme 2).
  • Compound 5 is synthesized in 7 steps from protected derivatives of glutamic and aspartic acids 7 and 8.
  • the carboxylic acid function of the side chains is protected by a TMSE group in the presence of 2 - ((trimethyl) sylil) ethyl alcohol, DCC and pyridine.
  • the compounds thus obtained are deprotected respectively by treatment with trifluoroacetic acid (TFA) and catalytic hydrogenation to give amine 10 and acid 11 with yields in two steps of 83 and 99%.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the compound H-VD-Bn 6 is obtained in a 4-step yield of 77% from the protected derivative of aspartic acid 8.
  • the protection of the side chain with 2 - ((trimethyl) sylil) ethyl alcohol performs the same way as before.
  • Deprotection of the Boc group by TFA treatment leads to amine 15 with a 2-step yield of 85%.
  • Compound 15 is then coupled to commercial valine 9 in the presence of BOP and DIEA, allowing the dipeptide 16 to be obtained in quantitative yield.
  • the dipeptide H-VD-Bn 6 is obtained by deprotection of 16 by treatment with TFA with a yield of 92% (Scheme 4).
  • the tetrapeptide 17 is obtained by coupling reaction of the dipeptides Ac-DE-OH 5 and H-VD-Bn 6 in the presence of BOP and DIEA. Catalytic hydrogenation on Pd / C makes it possible to obtain Ac-DEVD-OH 3 with a two-stage yield of 95% (Scheme 5).
  • Example VI Spectral Properties and Enzymatic Cleavage of Ac-DE VD-PABA-Coumarin 23 by Caspase-3
  • the preparation of the probe (k) is carried out in 7 steps (diagram 9).
  • the protection of 4-carboxybenzaldehyde acid (a) was achieved in the presence of an excess of allyl alcohol by an esterification reaction with moderate heating to avoid polymerization of the ethylenic unit of the alcohol.
  • the compound (c) obtained is then condensed on benzamide in the presence of benzotriazole (by analogy with the method described in Katritzky AR, Drewniak M., Lue P., J.
  • the benzotriazole, leaving group, is easily substituted by the thioalkylethersilyl (f) in basic medium to give the racemic compound (g) (by analogy with the method described in Böhm G., Dowden J., Rice D. C, Burgess L, Pilard JF, Guilbert B., Haxton A., RC Hunter, Turner NJ, Flitsch SL, Tetrahedron Lett 1998, 39, 3819-3822.)
  • the deprotection of the alcohol in the presence of TBAF tetrabutylammonium fluoride makes it possible to obtain the alcohol (h).
  • This is treated with disuccinimidyl carbonate (DSC) to obtain the relatively stable intermediate compound (i).
  • DSC disuccinimidyl carbonate
  • the introduction of the 7-hydroxycoumarin is carried out under more basic conditions and according to a preferred embodiment, its corresponding sodium salt (7-hydroxycoumarin treated with an aqueous solution of sodium hydroxide and lyophilization) is prepared beforehand in order to render the reaction instantaneous substitution before degradation of the activated carbonate.
  • the compound (j) is obtained in a yield of 83%.
  • the last step is the deprotection of the acid function.
  • the allylic ester is deprotected under standard conditions via an ⁇ -allyl palladium complex, further requiring the presence of a nucleophile to trap the released allyl portion.
  • the dimedone / benzylamine mixture 3/2 mol / mol, as described in Zhang HX, Guibé F., Balavoine G., Tetrahedron Lett. 1988, 29, 623-626, and is preferably used to limit nucleophilic attack on the carbonate.
  • the final compound (k) is obtained with a yield of 33%.
  • Compound (g) A solution of sodium ethanolate is prepared by dissolving the sodium metal (24 mg, 1.03 mmol) in 2 mL of absolute ethanol under an argon atmosphere. Compound (f) (326 mg, 1.03 mmol) is then added to this solution and the resulting mixture is stirred for 10 minutes. The whole is then added to compound (d) (400 mg, 0.94 mmol) dissolved in 2 mL of absolute ethanol. The reaction is stirred again for 2 hours at room temperature under an argon atmosphere. An AcOEt / water mixture (1/1 v / v) is then added to the reaction mixture in order to carry out the extraction with ethyl acetate.
  • a solution of the compound (k) (1.0 mg / ml) in a mixture of acetone (10% vol.) And PBS buffer (100 mM phosphate and 150 mM NaCl, pH 7.50) was prepared and then diluted 500 times to using the PBS buffer. 3 ml of this solution (3.7 ⁇ M) are transferred into a fluorescence vat (Varian Fluorescence CeIl 10 mm Open Top) and then 14 mg of penicillin G amidase (0.63 unit / mg) are added to the measuring vessel and the mixture incubated at 37 ° C.
  • a EX 360 nm
  • the same procedure is used for the measurement of non-specific hydrolysis, but without the addition of amidase.
  • a rapid increase in fluorescence at 460 nm is observed (FIG. 10).
  • a similar measurement carried out under the same buffer conditions but in the absence of an enzyme also shows a slight increase in the emission of fluorescence at 460 nm. It is due to the non-specific hydrolysis of the probe (k) which amounts to about 20% after 1 hour, while the enzymatic cleavage is complete after 15 minutes. (Fig.10).
  • the curves in FIG. 10 show a good functioning of the reactive arm releasing 7-hydroxycoumarin very rapidly (maximum fluorescence reached after 15 minutes).
  • the non-specific hydrolysis observed reflects a moderate stability of the probe (k) in an aqueous medium.
  • SEQ ID NO: 1 WEHD
  • SEQ ID NO: 2 YVAD
  • SEQ ID NO: 3 LEHD
  • SEQ ID NO: 11 SHVD SEQ ID NO: 11: DELD SEQ ID NO: 12: DGPD SEQ ID NO: 13: DEPD SEQ ID NO: 14: DGTD SEQ ID NO: 15: DLND SEQ ID NO: 16: DEED SEQ ID NO: 17: DSLD SEQ ID NO: 18: DVPD SEQ ID NO: 19: DEAD SEQ ID NO: 20: DSYD SEQ ID NO: 21: ELPD SEQ ID NO: 26: VEID SEQ ID NO: 24: IETD

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Abstract

La présente invention concerne un composé pro-fluorescent de formule générale (I): A-B-X-F(I) dans laquelle A figure une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique,B figure un bras réactif, activable par libération de A et apte à générer un radical portant un substituant nucléophile, éventuellement anionique, ledit radical étant apte à subir un réarrangement intramoléculaire conduisant à la libération de F,X figure un atome de soufre, d' oxygène, un motif OC(O), OC(O)O, OS(O) ou OP(O), F figure un radical fluorophore compatible avec l'établissement d'une liaison éther, thioéther, ester, carbonate, sulfate, sulfinate, sulfonate, phosphate, phosphonate, phosphinate ou aminophosphonate avec B via le motif X et étant tel que le spectre d'émission et/ou d'excitation de F lié à B est décalé relativement au spectre d'émission et/ou d'excitation de F libre.

Description

Nouveaux composés pro-fluorescents
La présente invention a pour objet de nouveaux composés pro-fluorescents activables par un phénomène physique, chimique ou biologique, notamment par hydrolyse enzymatique, et la mise en œuvre de ces composés dans des procédés de qualification et/ou de quantification de ces phénomènes, par exemple une activité enzymatique.
De nombreux composés ayant la propriété de générer un signal lumineux, par exemple de fluorescence sont utilisés en biologie cellulaire, que ce soit dans l'étude de réactions biochimiques, ou de phénomènes plus complexes tels que la mitose, la migration cellulaire ou l'apoptose. Des fluorophores sont ainsi utilisés pour marquer des molécules destinées à être utilisées comme agents réactifs dans de nombreux protocoles expérimentaux fondés sur la génération ou la destruction d'un composé fluorescent. Ces composés pro-fluorescents constituent un moyen efficace pour suivre une réaction impliquant un changement d'environnement tel qu'une variation de pH, de concentrations de certains ions, ou une activité enzymatique. Ainsi de tels composés sont utilisés dans des tests chromogéniques, fluorescents ou luminescents, afin, par exemple, de détecter l'activité de diverses enzymes.
L'obtention d'un système sensible de détection dans un protocole d'essai fondé sur la fluorescence nécessite un signal de bruit de fond le plus petit possible, de telle sorte que le signal de fluorescence généré à la suite de la réaction à suivre soit aisément détectable. Dans de nombreuses situations, le bruit de fond réduit le seuil de détection et la sensibilité des essais.
Il existe donc un besoin de disposer dans ces essais de composés générant peu ou pas de bruit de fond.
Les composés pro-fluorescents activables par un phénomène physique, chimique ou biologique, notamment par voie enzymatique, peuvent être composés d'une structure labile activable par le phénomène considéré, par exemple un motif substrat hydrolysable par une enzyme, directement relié à la molécule fluorescente ou fluorophore.
L'activation de la structure labile, telle que l'hydrolyse de la liaison entre un motif substrat et un composé fluorescent, libère ce dernier conduisant à la génération d'un signal lumineux. Malheureusement, de tels composés présentent l'inconvénient de ne pouvoir mettre en œuvre que des fluorophores présentant naturellement une fonction réactive apte à être couplée à la structure labile activable.
Or il existe peu de fluorophores dont la structure contient une ou plusieurs fonctions dont la modification chimique réversible permet de masquer/révéler des propriétés spectrales, en particulier dans le proche infra-rouge.
Ainsi, suivant les phénomènes à détecter, il existe peu de possibilité de mise en œuvre de fluorophores possédant une fonction -OH ou une fonction -SH réactive.
Par conséquent, seul un faible choix de fluorophores est disponible, conduisant à une gamme limitée de longueurs d'ondes d'excitation et d'émission susceptibles d'être utilisées.
Pour surmonter en partie cette difficulté, il est possible de mettre en œuvre dans ces composés pro-fluorescents un bras réactif entre le composé fluorescent et le motif substrat. WO 2005/047245 propose l'utilisation de composés pro-fluorescents pour suivre des réactions enzymatiques activées par des estérases, des glycosidases ou une leucineaminopeptidase.
GB 2 324 529 décrit des dérivés tétrapeptides substitués par une 7- aminométhylcoumarine, utiles pour l'identification de substrats spécifiques de différentes enzymes telles qu'une protéase à serine ou à cystéine.
Quant à JONES et al. (Bioorganic Médicinal Chemistry, 2006, 14: 418), il décrit un pro-fluorophore comprenant un fluorophore relié à un bras réactif par une fonction -NH2 réactive, le bras étant relié à un substrat reconnu par l'enzyme PSA (Prostate Spécifie Antigen). Pour sa part, le document WO 2006/129036 divulgue des dérivés de 3,4- dioxane, biomarqueurs à émission luminescente.
Toutefois, ces systèmes ne permettent pas d'élargir sensiblement la gamme des structures de fluorophores utilisables.
Ainsi, ces systèmes offrent peu de souplesse et de latitude en terme de longueurs d'onde d'excitation et d'émission exploitables, notamment en proche infra-rouge. La présente invention a précisément pour objet de proposer de nouveaux composés pro-fluorescents offrant une large gamme de longueurs d'onde d'excitation et d'émission, permettant ainsi de diversifier les domaines d'utilisation de tels composés.
La présente invention a également pour objet de proposer de nouveaux composés pro-fluorescents convenant à la détection, à la quantification et au suivi de réaction enzymatique libérant une fonction aminé libre, par exemple mettant en œuvre une hydrolase de type amidase, comme par exemple une protéase à cystéine ou une pénicilline amidase. Ce procédé peut être élargi à d'autres enzymes ou réactions chimiques et également à des modifications de milieu (changement de pH ou décomplexation d'ions métalliques par exemple) libérant une aminé.
Les inventeurs ont ainsi observé, de manière inattendue, qu'il est possible de coupler une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique, tel qu'un substrat hydrolysable par exemple par une protéase à cystéine, à une grande variété de fiuorophores comprenant au moins une fonction réactive -OH ou -SH au moyen d'un bras réactif tel que détaillé par la suite.
Ainsi, selon un premier objet, la présente invention a pour objet un composé pro-fluorescent de formule générale (I) :
A-B-X-F (I) dans laquelle : - A figure une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique,
B figure un bras réactif, activable par libération de A et apte à générer un radical portant un substituant nucléophile, éventuellement anionique, ledit radical étant apte à subir un réarrangement intramoléculaire conduisant à la libération de F, - X figure un atome de soufre, d'oxygène, un motif OC(O), OC(O)O, OS(O) ou OP(O),
F figure un radical fluorophore compatible avec l'établissement d'une liaison éther, thioéther, ester, carbonate, sulfate, sulfonate, sulfinate, phosphate, phosphonate, phosphinate ou aminophosphonate avec B via le motif X et étant tel que le spectre d'émission et/ou d'excitation de F lié à B est décalé relativement au spectre d'émission et/ou d'excitation de F libre, B étant choisi parmi les radicaux de formules générales (lia), (Hb), (Ile), (Hd), (Ile), (Ilf), et (Hg), suivantes :
Figure imgf000005_0001
(Ma)
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
(Md)
(Ile)
Figure imgf000005_0004
(Ng) dans lesquelles :
Y représente O, NH ou S,
R1 et R2, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical alkyle en Ci -C3, un radical alcoxy en Ci-C3 ou un groupe carboxyle ou carboxylate,
R3 et R4, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical alkyle en Ci -C5, un radical alcoxy en Ci -C5 ou un radical électro-attracteur ou électro-donneur tel qu'un groupe ester, nitrile, nitro, éther, aminé, ou amide, n est égal à 1 ou 2, - P représente 0 ou 1,
-* symbolise une liaison vers A, et -a symbolise une liaison vers X, L représente
— S-(CHJ-
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
- avec m représentant 1, 2, 3 ou 4, ou un de ses dérivés.
Selon la présente invention, le bras réactif de formule (JIf) tel que défini précédemment peut notamment représenter un radical choisi parmi les radicaux de formules (Hi), (Hf), (Hj) et (Hk) qui suivent :
Figure imgf000007_0001
(Mf)
Figure imgf000007_0002
Parmi les composés pro-fluorescents de formule générale (I) objets de l'invention, on peut citer un groupe de composés de formule (I) telle que définie précédemment, comportant notamment un bras réactif choisi parmi les bras de formules (lia), (Ile) et (Hf), dont (IFf).
Au sens de l'invention, on entend par « composé pro-fluorescent », une architecture moléculaire constituée : (A) d'une entité possédant un ou plusieurs motifs susceptibles d'interagir avec l'entité à détecter (par exemple une enzyme) et de subir une ou plusieurs transformations chimiques sous l'effet de ladite entité chimique ; (B) d'une molécule fluorescente (fluorophore) qui, lorsqu'elle est associée de façon covalente à l'entité (A) voit ses propriétés optiques significativement modifiées, notamment tel qu'un décalage de son spectre d'émission et/ou d'excitation.
Le décalage peut s'effectuer en terme de variation d'intensité des maxima des spectres. Ainsi, le niveau de fluorescence du pro -fluorophore peut être quasiment nul ou très largement inférieur à celui du fluorophore libre. Le décalage peut s'effectuer sur la position des longueurs d'onde des maxima des spectres d'émission et/ou d'excitation. Ainsi, dans certains cas, un déplacement des longueurs d'ondes d'excitation et/ou d'émission de fluorescence vers les plus courtes longueurs d'ondes (effet ipsochrome) est observé. Dans d'autres cas, le déplacement peut s'effectuer vers des longueurs d'excitation et/ou d'émission plus grandes (effet bathochrome). Ainsi, l'interaction entre la sonde pro- fiuorescente et l'entité à détecter se traduit par la libération du fluorophore et l'apparition d'un signal (après excitation à la longueur d'onde appropriée) facilement détectable.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un composé pro-fluorescent conforme à l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou de diagnostic.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique et/ou de diagnostic comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé pro-fluorescent conforme à l'invention.
Au sens de l'invention, on entend par « quantité efficace », la quantité d'un composé donné nécessaire à l'obtention d'un effet, par exemple biologique, pharmaceutique ou diagnostique, désiré. Selon encore un autre objet, la présente invention a pour objet un procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique comprenant au moins les étapes de : a) mettre en contact, avec un milieu apte à la manifestation dudit phénomène, un composé pro-fluorescent conforme à l'invention dans des conditions appropriées à la libération de la structure labile activable A, et b) détecter la présence ou l'absence d'un signal de fluorescence de F.
Un procédé conforme à l'invention peut être effectué in vitro, ex vivo ou in vivo. Un phénomène biologique peut être une activité enzymatique. Notamment l'activité enzymatique peut être celle d'une enzyme libérant une fonction aminé libre, telle qu'une protéase à cystéine ou une pénicilline amidase.
Selon encore un autre aspect, la présente invention a pour objet un kit de diagnostic comprenant au moins un composé pro-fiuorescent conforme à l'invention.
DÉFINITIONS
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « dérivé », des formes tautomères, des formes stéréoisomères, des formes polymorphes, des sels acceptables et des solvates acceptables pharmaceutiquement ou en diagnostic.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « forme tautomère », l'un des isomères dont les structures diffèrent par la position d'un atome, en général d'hydrogène, et d'une ou de plusieurs liaisons multiples et qui sont capables de se transformer facilement et réversiblement l'un dans l'autre. Au sens de la présente invention, on entend désigner par « forme stéréoisomère » des isomères de molécules de constitution identique, et qui ne diffèrent que par un ou des arrangement(s) différents de leurs atomes dans l'espace.
Au sens de la présente invention, on entend désigner par « sels » des composés obtenus par réaction d'un composé de formule générale (I) avec une base ou un acide. A titre d'exemple de base convenant à l'invention on peut mentionner l'hydroxyde de sodium, le méthoxyde de sodium, l'hydrure de sodium, le tert-butoxyde de potassium, l'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde de magnésium, et analogues, et leurs mélanges, dans des solvants tels que le THF (tétrahydrofuranne), le méthanol, le tert- butanol, le dioxanne, Pisopropanol, l'éthanol, leurs analogues, et leurs mélanges. Les bases organiques comme la lysine, l'arginine, la diéthano lamine, la choline, la trométhamine, la guanidine et leurs dérivés peuvent également être utilisées.
A titre d'exemple de sels d'addition d'acide convenant à l'invention, on peut citer ceux susceptibles d'être préparés par réaction d'un composé pro-fluorescent conforme à l'invention avec un acide tel que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide nitrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide para-toluènesulfonique, l'acide méthanesulfonique, l'acide acétique, l'acide trifluoroacétique (TFA), l'acide citrique, l'acide maléique, l'acide salycilique, l'acide hydroxynapthoïque, l'acide ascorbique, l'acide palmitique, l'acide succinique, l'acide benzoïque, l'acide benzènesulfonique, l'acide tartrique, et analogues, et leurs mélanges, dans les solvants tels que l'acétate d'éthyle, l'éther, des solvants alcooliques, l'acétone, le THF, le dioxanne, leurs analogues et leurs mélanges. On entend désigner par « forme polymorphe », des composés obtenus par cristallisation d'un composé conforme à l'invention dans différentes conditions, telles que par exemple l'utilisation de différents solvants, généralement utilisés pour la cristallisation. La cristallisation à différentes températures implique, par exemple, différents modes de refroidissement, par exemple des refroidissements très rapides à très lents impliquant des étapes de chauffage ou fusion de composés suivie par un refroidissement graduel ou rapide. La présence de formes polymorphes peut être déterminée au moyen d'analyses par spectroscopie RMN, par spectroscopie IR (infrarouge), par DSC (Différenciai Scaning Calorimetry), par diffraction de rayons X ou d'autres techniques analogues.
Au sens de la présente invention, on entend par « radical alkyle », un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, de 1 à 5 atomes de carbone, de préférence de 1 à 4 atomes de carbone et mieux encore de 2 à 3 atomes de carbone susceptible d'être substitué par des radicaux tels que définis ci-après.
A titre d'exemple, sont inclus dans cette définition des radicaux tels que méthyle, éthyle, isopropyle, n-butyle, tert-butyle, tert-butylméthyle, n-propyle, pentyle. Au sens de la présente invention, on entend par « radical alkyle cyclique », un cycle alkylène de 3 à 5 atomes de carbone, tel que le cyclopropyle ou le cyclopentyle.
Au sens de la présente invention, on entend par "radical alcoxy", un radical -OR dans lequel le reste alkyle R est un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, tel que défini ci-dessus. On peut citer, à titre d'exemple, les groupes méthoxy, éthoxy, propoxy, butoxy, n-butoxy, isobutoxy, sec-butoxy, n-pentoxy, isopentoxy, sec-pentoxy, tert-pentoxy.
Au sens de la présente invention, on entend par « radical acyle », un radical hydrocarboné linéaire, ramifié ou cyclique, condensé ou non, saturé ou insaturé, comprenant une fonction terminale C=O et ayant de 1 à 5 atomes de carbone, en particulier de 1 à 4 atomes de carbone et de préférence de 2 à 3 atomes de carbone par exemple, un radical formyle, un radical acétyle, un radical succinyle. La chaîne hydrocarbonée des radicaux précités peut être interrompue par un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, pour former par exemple un radical hétéroalkyle comme un radical alkyléther, un radical alkylester ou un hétérocycle.
A titre d'exemples de substituants susceptibles d'être utilisés pour substituer les radicaux précités, il peut être fait mention d'un radical hydroxyle, un motif oxo, un radical thio, un radical amino, un atome d'halogène, d'un radical alkyle, un radical carboxy, un radical acyle, un radical amido, un radical alcoxy, un radical alkyl- ou dialkyl- amino, un radical alkylthio, un radical halogénoalkyle tel que par exemple le perfiuoroalkyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-silyle, un radical alkyl-, dialkyl- ou trialkyl-siloxy, un radical aryle, tel que défini précédemment.
Au sens de la présente invention, on entend par « atome d'halogène », un atome de F, Cl, Br ou I. Les atomes d'halogène avantageusement mis en œuvre dans la présente invention sont le fluor et le chlore.
Au sens de la présente invention, on entend par « radical halogénoalkyle », un radical alkyle tel que défini précédemment substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène tel que défini précédemment, et notamment, à titre d'exemple non limitatif, le perfiuorométhyle.
BRAS REACTIF Un composé pro-fluorescent conforme à l'invention peut comprendre un bras réactif figuré par B de formules générales telles que définies précédemment.
En particulier, le motif B-X peut être choisi parmi les radicaux de formules (HIa), (HIb), (IIIc), (HId), (HIe), (HIf), (HIg) et (HIh) suivantes :
Figure imgf000011_0001
(MIa) (MIb)
Figure imgf000012_0001
(MIc) (MId)
Figure imgf000012_0002
CIIlQ) et (MIh)
dans lesquelles, -* a la même signification que précédemment et -@ symbolise la liaison vers F et n est égal à 1 ou 2.
En particulier, le motif B-X représente un radical de formule (HIa), (HIb) ou (III c) telle que définie ci-dessus.
STRUCTURE LABILE A
Dans la formule générale (I) des composés conformes à l'invention, A représente une structure labile activable par un phénomène chimique, physique, ou biologique.
Par « phénomène physique », on entend désigner au sens de la présente invention, par exemple, une variation de température, une variation de pression.
Par « phénomène chimique », on entend désigner au sens de la présente invention un phénomène faisant intervenir, par exemple, une variation de pH, une variation de la salinité, une variation du potentiel rédox, une apparition ou une disparition d'espèces chimiques, par exemple des ions tels que F", RS", HS" ou S2 ", et des ions métaux alcalino- terreux tels que Ca2+.
Lorsque A représente une structure labile activable par un phénomène chimique, A peut avantageusement être, par exemple un ammonium, un amide, une aminé, un ester, un organosilane, un thiol, un carbamate, ou un carbonate.
Par « phénomène biologique », on entend désigner au sens de la présente invention un phénomène faisant intervenir l'activité d'une entité biologique, par exemple une activité enzymatique, à l'image par exemple d'une hydrolyse, d'un transfert d'un groupement aminé, d'une isomérisation. Ainsi, lors de l'activation des composés selon l'invention par un phénomène biologique, les composés sont soumis à l'action d'une entité biologique.
A titre d'illustration d'une entité biologique susceptible d'activer les composés selon l'invention, on peut mentionner, de manière non limitative, les enzymes, les ribozymes, les abzymes. A titre d'exemple d'enzymes susceptibles d'activer les composés conformes à l'invention, il peut être fait mention des transférases, telles que les aminotransférases, les hydrolases telles que les estérases ou les phosphatases (phosphatase alcaline par exemple), les glycosidases, les protéases (trypsine, métalloprotéinases ou caspases par exemple), les isomérases. Selon un mode de réalisation, A peut figurer une structure labile par action d'une enzyme, et notamment par action d'une hydrolase, par exemple de type amidase.
Selon un mode de réalisation, A peut figurer un motif substrat par une hydrolase de type protéase ou pénicilline amidase.
Avantageusement, A peut représenter un substrat peptidique ou pseudopeptidique de longueur suffisante pour permettre sa reconnaissance et son hydrolyse par une enzyme, et notamment une protéase.
A titre d'exemple de protéases susceptibles de convenir à la mise en œuvre de la présente invention, il peut être fait mention, non limitativement, des caspases telles que la caspase-3, de l'acylaminoacyl peptidase, de l'aminopeptidase M, de la pénicilline amidase ou pénicillinase G acylase, de la thermolysine, des cathepsines B, G, L, des métalloprotéinases, de l'élastase, de la subtilisine, de l'activateur du plasminogène, de l'urokinase. Selon un mode de réalisation, lorsque A est un substrat peptidique, il peut comprendre au moins deux résidus acides aminés, en particulier au moins quatre, en particulier au mois six et plus particulièrement au moins huit résidus acides aminés.
A peut comprendre de 2 à 10 acides aminés, en particulier de 3 à 8 acides aminés et plus particulièrement A peut comprendre 4 acides aminés.
Les acides aminés entrant dans la séquence peptidique du motif substrat A peuvent être des acides aminés de configuration L ou D.
Un motif substrat peptidique A convenant à l'invention peut comprendre optionnellement un ou plusieurs acides aminés naturels, modifiés ou non, ou synthétiques. En particulier, les acides aminés peuvent être des acides aminés naturels modifiés. A titre d'exemple de modifications convenant à l'invention, on peut mentionner l'addition d'un ou plusieurs substituants sur la chaîne latérale ou sur une fonction aminé ou carboxylique non engagée dans une liaison peptidique.
La ou les modification(s) apportées à un acide aminé naturel présent dans le motif substrat A ou l'introduction d'un acide aminé synthétique sont opérées de manière à ne pas affecter substantiellement l'hydrolyse du motif substrat A par l'enzyme à détecter.
Les substituants convenant à la mise en œuvre de l'invention peuvent être notamment un radical de type R-C(O)- ou R-W-C(O)-, avec W=O ou NH, et R pouvant être un radical alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou insaturé en Ci à C5, un radical acyle, un radical cyclique en C3 à C10, saturé ou insaturé, en particulier un radical aryle. Un substituant peut être un phényle ou une fonction hydroxyle. En particulier, un substituant convenant à l'invention peut être un radical acétyle.
Selon un mode de réalisation, la protéase peut être une protéase à cystéine aspartyle spécifique (caspase). Plus particulièrement, la protéase à cystéine peut être la caspase-3.
Selon un mode de réalisation, A peut représenter un tétrapeptide choisi parmi WEHD (SEQ ID NO: 1), YVAD (SEQ ID N0:2), LEHD (SEQ ID N0:3), DETD (SEQ ID NO: 4), DEVD (SEQ ID NO: 5), DEHD (SEQ ID NO: 6), VEHD (SEQ ID NO: 7), LETD (SEQ ID NO: 8), LEHD (SEQ ID NO: 9), SHVD (SEQ ID NO: 10), DELD (SEQ ID NO: 11), DGPD (SEQ ID NO: 12), DEPD (SEQ ID NO: 13), DGTD (SEQ ID NO: 14), DLND (SEQ ID NO: 15), DEED (SEQ ID NO: 16), DSLD (SEQ ID NO: 17), DVPD (SEQ ID NO: 18), DEAD (SEQ ID NO: 19), DSYD (SEQ ID NO: 20), ELPD (SEQ ID NO: 21), VEID (SEQ ID NO: 26) ou IETD (SEQ ID NO: 24).
En particulier, A peut être un tétrapeptide, notamment DEVD (SEQ ID NO 5), modifié par addition d'un radical acétyle (Ac) à l'extrémité N-terminale. Selon un mode de réalisation, A peut figurer un motif reconnu par une hydrolase de type pénicilline amidase.
Selon une autre variante de réalisation, A peut figurer une structure labile par action d'une hydrolase de type estérase, telle qu'une carboxyestérase, une phosphatase ou une lipase. Dans ce cas, A peut représenter un motif comprenant un radical issu d'un acide carboxylique, notamment d'un acide gras reconnu par une enzyme de type estérase ou un radical issu d'un sucre reconnu par une enzyme de type glycosidase ou un radical phosphate reconnu par une enzyme de type phosphatase.
Un radical phosphate convenant à l'invention peut être de formule suivante :
O — P O M+ ° M+ dans laquelle M+ représente un cation tel un métal alcalin, comme Na+ ou K+, un ammonium, ou un cation ammonium quaternaire N(R)4 + dans lequel chaque R peut être un alkyle en Ci-C2, un ayle comme un benzyle, ou former une partie d'un hétérocycle, comme un pyridinium. De telles structures sont avantageusement hydrolysées par une phosphatase alcaline.
Selon une variante de réalisation, A peut figurer une structure labile par action d'une enzyme de type glycosidase.
Dans ce cas, A peut comprendre un radical issu d'un sucre. A titre d'exemple de sucre susceptible de convenir à la mise en œuvre de l'invention, on peut mentionner l'α-D- ou le β-D-galactoside, l'α-D- ou le β-D-glucoside, l'α-D- ou le β-D-mannoside et l'α-D ou le β-D-fructofuranoside.
Selon un autre mode de réalisation A peut figurer une structure labile par action d'une aminotransférase, telle que par exemple, et de manière non limitatif, une alanine aminotransférase ou une aspartate aminotransférase. FLUOROPHORE
Un fluorophore convenant à l'invention est tel que le spectre d'émission et/ou d'excitation du fluorophore lié à B est décalé par rapport au spectre d'émission et/ou d'excitation du fluorophore libre.
Le décalage peut s'opérer en terme de variation d'intensité des maxima des spectres, ou par un déplacement des longueurs d'onde des maxima vers des longueurs d'onde plus courtes ou plus grandes.
En particulier, un fluorophore convenant à l'invention est tel que le signal de fluorescence de ce fluorophore lié à B est sensiblement diminué, voire nulle ou proche de zéro, par rapport au signal de fluorescence de F libre.
Un fluorophore F convenant à l'invention comprend dans sa structure au moins une fonction réactive apte à être engagée dans une liaison de type thioéther, éther, ester, carbonate, sulfate, sulfonate, sulfinate, phosphate, phosphonate, phosphinate, aminophosphonate, avec B, et pour laquelle S, O, OC(O), OC(O)O, OS(O) ou OP(O) est figuré par X en formule générale (I).
A titre d'exemple de fluorophore convenant à l'invention, on peut mentionner les fluorophores choisis parmi , les hydroxynaphtalènes, les hydroxypyrènes, l'acridine et ses dérivés tels que les hydroxyacridines, la 9-méthylacridine, la 7-hydroxy-9H(l,3- dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one) (DDAO), et la 7-hydroxy-9H-(9,9-diméthylacridin-2- one) (DAO), la coumarine et ses dérivés tel que la 7-hydroxycoumarine, les hydroxystilbènes, le furane, l'oxazole, l'oxadiazole, le nitrobenzoxadiazole et ses dérivés tels que les hydroxynitrobenzoxadiazoles, l'indole et ses dérivés, les benzoindoles, le benzopyrane et ses dérivés (chromène et dérivés), le benzothiazole et ses dérivés, la phénoxazine et ses dérivés, les benzophénoxazines (crésyl violet, NiIe red, NiIe blue, ...), la fluorescéine et ses dérivés, les rhodols et leurs dérivés, l'éosine et ses dérivés, l'érythrosine et ses dérivés tels que les hydroxyérythrosines, la résorufine et ses dérivés tels que les hydroxyrésorufines, la quinoléine et ses dérivés tels que la 6-hydroxyquinoléine,, les hydroxyaryl 4-(3H)-quinazolinones, les cyanines fluorescentes et dérivés telles que les hydroxycyanines, et plus généralement tous les fluorophores à chaîne polyméthine (Le., chaîne polyènique). Selon un mode de réalisation, F peut représenter, en particulier, un radical issu d'un fluorophore choisi parmi la DDAO, la DAO, la 7-hydroxycoumarine et la résorufine.
Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent de l'invention apte à être activé par une protéase à cystéine, et notamment une caspase peut en particulier être tel que :
A peut représenter Ac-DEVD, dans lequel Ac est un radical acétyle, B-X peut représenter un motif de formule (HIa) ou (HIb) :
Figure imgf000017_0001
(MIa) (MIb)
F peut être choisi parmi un radical issu de la 7-hydroxycoumarine, un radical issu de la DAO et un radical issu de la DDAO.
Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent convenant à l'invention peut être choisi parmi les formules (IVa) et (IVb) suivantes :
Figure imgf000017_0002
(IVb)
Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent de l'invention apte à être activé par une pénicilline amidase peut être telle que : A peut représenter :
Figure imgf000018_0001
B-X peut représenter un radical de formule (HIa) ou (HId)
Figure imgf000018_0002
la) (MId)
F peut être choisi parmi un radical issu de la 7-hydroxycoumarine, un radical issu de la DAO et un radical issu de la DDAO.
Selon un mode de réalisation, un composé pro-fluorescent convenant à l'invention peut être de formule (V) suivante :
Figure imgf000018_0003
(V)
CIBLAGE
Selon un mode de réalisation, un composé conforme à l'invention peut comprendre, en outre au niveau de la structure labile activable, une structure de ciblage D. Ainsi, un composé peut être de formule générale (VI) suivante :
D-A-B-F dans laquelle : D figure une structure de ciblage, et A, B et F sont tels que définis précédemment.
La structure de ciblage D, ou ligand, est un élément susceptible de reconnaître ou de lier préférentiellement des cellules exprimant un élément cellulaire particulier, tel que par exemple, et de manière non limitative, un récepteur, une enzyme, une protéine de structure, une glycoprotéine, un sucre, un lipide ou un phospholipide. Avantageusement l'élément cellulaire est un élément membranaire, de préférence possédant une partie de sa structure disposée dans le milieu extracellulaire.
Selon un mode de réalisation, cet élément cellulaire peut être spécifique d'un état physiologique ou pathologique de la cellule ou du tissu environnant la cellule ou de l'organe comprenant la cellule. Ainsi, et de manière non limitative, l'élément cellulaire peut être spécifique de l'état de croissance de la cellule, de sa position dans le cycle cellulaire, d'une réponse inflammatoire de la cellule ou du tissu, d'une apoptose, d'une dégénérescence tissulaire, .... L'expression « reconnaître ou se lier préférentiellement » vise à indiquer que la structure de ciblage D possède une affinité particulière pour les cellules ou tissus considérés, même si une liaison non spécifique ou moins importante avec d'autres cellules ou d'autres tissus ne peut être totalement exclue in vivo ou ex vivo. La liaison préférentielle permet toutefois un ciblage des composés conformes à l'invention vers les sites d'intérêt, réduisant la dissémination du composé selon l'invention vers les tissus et/ou les cellules de moindres intérêts.
Ainsi, la structure de ciblage D peut être choisie, par exemple et de manière non limitative, parmi une lectine, un anticorps ou un fragment de celui-ci reconnaissant spécifiquement un élément présent à la surface des cellules tel que par exemple une protéine, un sucre, un lipide ; un ligand d'un récepteur cellulaire telle que par exemple un peptide comme le neuropeptide Y, une catécholamine telle que l'adrénaline, un antagoniste comme par exemple un antagoniste de récepteurs β-adrénergiques, tel que le propranolol, un facteur de croissance, un acide aminé ou un dérivé de celui-ci tel que par exemple le glutamate, une cytokine tel que par exemple une interleukine, un interféron ou un TNF ou le HIF (hypoxy-inducing factor), une hormone, une vitamine, une apolipoprotéine, le cholestérol ; un ligand susceptible d'interagir avec un lipide ou phospholipide membranaire tel que par exemple une annexine ; un ligand susceptible d'interagir avec un sucre présent à la surface des cellules.
On entend désigner par « récepteur cellulaire » tout élément cellulaire capable de transduction d'une information de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule. II relève des connaissances de l'homme de l'art de déterminer la nature de la structure D appropriée au ciblage désiré, le cas échéant en faisant appel à des méthodes d'essais habituellement pratiquées dans le domaine.
Selon un mode de réalisation, la structure de ciblage D peut être un ligand, par exemple un polypeptide, capable de se lier à la surface de cellules présentes de façon caractéristique ou spécifique dans un tissu particulier ou présentant une pathologie.
La structure de ciblage D peut également se lier à la surface de cellules tumorales ou présentes dans un tissu tumoral, ou à la surface de cellules présentes dans un tissu inflammatoire.
La structure de ciblage D peut, par exemple, se lier à la surface des cellules engagées dans un processus d'apoptose, qui exposent à leur surface des lipides chargés négativement, comme par exemple la phosphatidylsérine.
Selon une variante de réalisation la structure de ciblage D peut être une protéine ou un fragment de protéine tel qu'un peptide ou un polypeptide ou un pseudopeptide. Parmi les protéines susceptibles de se lier aux membranes exposant des lipides chargés négativement, on peut mentionner, de manière non limitative, la famille des annexines, les familles des protéines comportant un domaine Cl ou C2, telles que les facteurs V et VIII de la coagulation sanguine, les familles des protéines comportant un domaine PH ou un domaine FYVE, ou encore des protéines comportant un domaine identique ou homologue du domaine 5 des β2-glycoprotéines-I (βGP-I). Ces protéines ou des domaines issus de leurs séquences peuvent être utilisés comme structure de ciblage dans des composés conformes à l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, à une structure de ciblage D peuvent être fixés un ou plusieurs composés de formule générale (I), afin d'augmenter, notamment, l'intensité du signal émis. Ainsi, il peut être fixé par élément de ciblage D, au moins une, notamment au moins deux, en particulier au moins 3, en particulier au moins 4, et plus particulièrement au moins 5 composés de formule A-B-F.
PROCÉDÉ DE DÉTECTION
Comme précisé précédemment, la présente invention a également pour objet une utilisation, à des fins de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique, d'au moins un composé pro-fluorescent conforme à l'invention, dans lequel A figure une structure labile activable. Un procédé conforme à l'invention comprend au moins les étapes de mise en contact d'au moins une quantité efficace d'au moins un composé pro-fluorescent conforme à l'invention, et notamment de formule générale (I), avec un milieu apte à la manifestation d'un phénomène physique, chimique ou biologique dans des conditions appropriées à la libération de la structure labile activable A, et la détection de la présence ou de l'absence d'un signal de fluorescence de F.
En détectant la présence ou l'absence du signal fluorescent, il est possible de mettre en évidence la présence ou l'absence de la manifestation du phénomène physique, chimique ou biologique. En mesurant l'intensité d'un tel signal, il est également possible de déterminer l'ampleur du phénomène. Un procédé selon l'invention peut être effectué in vitro, ex vivo ou in vivo.
En particulier, la présente invention vise à proposer également un procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène biologique figuré par une entité biologique.
Une entité biologique peut être une enzyme. Ainsi A peut figurer un motif hydrolysable par une enzyme, par exemple une hydrolase telle qu'une protéase à cystéine ou une pénicilline amidase.
Notamment une protéase à cystéine peut être une caspase.
Ainsi un milieu apte à la manifestation d'un phénomène biologique peut être un milieu présumé comprendre une enzyme. Un composé pro-fluorescent selon l'invention mis en œuvre dans cette utilisation peut comprendre un motif B-X choisi parmi les formules (HIa), (HIb) ou (III c). Dans cette mise en œuvre, la structure A labile figure un substrat reconnu par ladite enzyme. L'action de l'enzyme sur le substrat A, dans des conditions propices à la manifestation de la réactivité de l'enzyme, conduit à l'émission d'un signal fluorescent.
En détectant la présence ou l'absence d'un signal fluorescent, il est possible de mettre en évidence la présence ou l'absence de l'enzyme.
En mesurant l'intensité du signal de fluorescence, il est également possible de mettre en évidence la concentration et/ou les caractéristiques cinétiques de l'enzyme ainsi détectée.
Un milieu convenant au procédé de l'invention peut être un milieu biologique, synthétique ou naturel, à l'image d'un échantillon de fluide biologique.
Un procédé conforme à l'invention peut être, en particulier, mis en œuvre dans un échantillon biologique comprenant des cellules.
Un tel échantillon peut être obtenu par culture de cellules primaires ou de cellules en lignée. Les cellules primaires peuvent être obtenues par biopsie. La détection d'un signal de fluorescence de F peut être indicative d'une réponse biologique, notamment d'une réponse cellulaire, par exemple une apoptose.
Selon un mode de réalisation, un milieu approprié à la mise en œuvre de l'invention peut être représenté par des cellules neuronales.
Il peut être avantageux d'utiliser, in vitro, ou le cas échéant ex vivo, conjointement à un composé conforme à l'invention, au moins un amplificateur de lumière susceptible d'augmenter le signal fluorescent résultant de la dégradation dudit composé conforme à l'invention.
De tels composés sont déjà connus.
A titre d'exemple de ces amplificateurs, il peut être fait mention de la fluorescéine, de l'albumine bovine, de l'albumine humaine, et des sels de polymère d'onium quaternaires tels que le chlorure de polyvinylbenzyltriméthylammonium (TMQ), le chlorure de polyvinylbenzyltributylammonium (TBQ) (Sapphire-II™), le chlorure de polyvinylbenzyldiméthylammonium (BDMQ) (Sapphire-I™), le chlorure de polyvinylbenzyltributylphosphonium, le chlorure de polyvinylbenzyltributylsulfonium, le chlorure de poly(benzyldiméthylvinylbenzyl)ammonium, un sel de sodium de la fluorescéine (Emerald ™), le poly(benzyltributyl)ammonium et le sel de sodium de fluorescéine (Emerald II™). Lorsque le procédé conforme à l'invention est mis en œuvre in vitro, la détection du signal de fluorescence peut se faire par tout appareil habituellement mis en œuvre par l'homme de l'art dans ce domaine.
Par exemple un échantillon mis en contact avec un composé selon l'invention peut, éventuellement après une période d'incubation, être soumis à une méthode analytique comprenant, ou non, une étape de séparation des éléments composant l'échantillon, par exemple par chromatographie (par exemple une chromatographie liquide haute performance, HPLC), et une étape d'analyse spectrale (par exemple par spectroscopie UV) des différentes fractions issues de l'étape de séparation. La détection et la mesure du signal spectroscopique spécifique d'un composé selon l'invention (par exemple la hauteur et la surface d'un pic de chromatographie) peuvent être corrélées à la présence, et/ou à l'intensité/quantité du phénomène à détecter, tel que par exemple la présence, la quantité, et/ou l'activité cinétique d'une enzyme.
Selon un mode de réalisation de l'invention, un procédé ou une utilisation conforme à l'invention peuvent être mis en œuvre in vivo avec un composé pro-fiuorescent selon l'invention comprenant à titre de fiuorophore F, un fiuorophore dont le spectre d'émission se situe dans le proche infra-rouge, par exemple entre 650 nm et 900 nm.
Un procédé et une utilisation conformes à l'invention peuvent être mis en œuvre in vivo. Un composé pro-fiuorescent conforme à l'invention peut être préalablement administré à un être vivant, tel que par exemple un animal ou un être humain, puis la détection du signal de fluorescence peut être réalisée in vivo selon les moyens usuellement mis en œuvre dans le domaine.
Avantageusement, la mise en œuvre in vivo d'une utilisation conforme à l'invention permet d'établir des images des tissus ou organes dans lesquels l'activité d'une enzyme à détecter/quantifier est susceptible de se manifester.
Selon un mode particulier de réalisation il est possible de construire une ou des images des tissus ou organes susceptibles d'exprimer une enzyme à détecter et/ou à quantifier. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation, un procédé selon l'invention peut être mis en œuvre dans des méthodes d'imagerie médicale. Selon un autre mode de réalisation, un procédé selon l'invention est un procédé de diagnostic in vitro in vivo comprenant la détection et/ou la quantification d'une enzyme au moyen d'un composé de formule générale (I).
Le procédé conforme à l'invention peut être appliqué, par exemple et de manière non exhaustive, à des visées diagnostiques médicales, expérimentales, cliniques ou pré-cliniques chez des êtres humains ou chez des animaux tels que des animaux de laboratoires ou des animaux utilisés dans l'agriculture, tels que le rat, la souris, le cobaye, le primate non humain, le cochon d'inde, ou le cochon.
Selon un mode de réalisation, l'enzyme susceptible d'être détectée et/ou quantifiée par un procédé selon l'invention peut être une hydrolase telle qu'une protéase, en particulier une protéase à cystéine, plus particulièrement une caspase et notamment la caspase 3.
Selon un autre mode de réalisation, l'enzyme à détecter et/ou quantifier peut être une pénicilline amidase. Dans le cadre de la mise en œuvre in vivo, les composés conformes à l'invention peuvent être formulées afin d'être adaptés à une administration par voie orale, ou parentérale, notamment intraveineuse, intraartérielle, intracardiaque, intracérébro- ventriculaire, intrapéritonéale, intratumorale, ou pour une administration par voie pulmonaire, nasale, ophtalmique et éventuellement rectale, vaginale ou topique. Les composés conformes à l'invention peuvent être ainsi mis en œuvre dans une formulation adaptée au procédé de détection à réaliser et à la voix d'administration choisie.
Par exemple, les composés conformes à l'invention peuvent être préparés sous la forme d'un comprimé, d'une gélule ou d'une solution aqueuse concentrée ou non. Cette solution aqueuse peut être avantageusement stérile.
Selon un autre mode de réalisation, les composés conformes à l'invention peuvent être sous forme solide, par exemple en poudre, et être préparés en solution aqueuse, avantageusement stérile, juste avant leur administration.
Ainsi, selon un de ses aspects la présente invention se rapporte également à l'utilisation d'un composé conforme à l'invention, notamment de formule générale (I) pour la fabrication d'une composition pharmaceutique et/ou de diagnostic. Une composition de l'invention peut être destinée à la mise en œuvre d'une méthode de diagnostic in vivo, notamment une méthode d'imagerie médicale.
Ainsi selon un autre de ses aspects, la présente invention se rapporte également à une composition pharmaceutique comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé conforme à la présente invention, notamment de formule générale (I).
Avantageusement, la mise en œuvre d'un composé selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique peut se faire sous la forme d'un dérivé, tel qu'un sel ou un ester pharmaceutiquement acceptable. Ainsi, la présente invention se rapporte également aux sels et esters des composés conformes à l'invention. A titre d'exemple d'ester d'un composé selon l'invention, on peut mentionner un succinate, un hémisuccinate, un malate, un tartrate, un glycolate d'un composé selon l'invention. A titre d'exemple de sel d'un composé selon l'invention, on peut mentionner un sulfate, un phosphate, un sel de sodium, un sel de calcium d'un composé selon l'invention.
L'ajustement des quantités efficaces adéquates du ou des composés conformes à l'invention, à mettre en œuvre dans un procédé ou une utilisation selon l'invention, dépend de la protéase à cystéine, à détecter/quantifier et de l'environnement dans lequel le procédé selon l'invention est effectué (in vitro, ex vivo ou in vivo).
In vivo, les quantités efficaces peuvent, également, être ajustées selon la taille, le poids de l'individu à qui le procédé selon l'invention est appliqué, ou chez qui l'utilisation selon l'invention est mise en œuvre, ainsi que selon l'organe ou le tissu ciblé.
Les ajustements peuvent être réalisés par toutes méthodes usuellement pratiquées par l'homme de l'art.
Selon un autre mode particulier de réalisation, la présente invention se rapporte à un kit pour la détection et/ou la quantification d'une protéase à cystéine, ledit kit comprenant au moins un composé pro-fluorescent conforme à la présente invention.
Selon un mode de réalisation particulier, la présente invention se rapporte à un kit pour la détection et/ou la quantification d'une protéase à cystéine, comprenant un composé conforme à la présente invention, et notamment de formule générale (I).
Selon une mise en œuvre particulière, le kit conforme à la présente invention peut également comprendre au moins un amplificateur de lumière tel que défini précédemment.
La présente invention sera mieux comprise d'après les exemples suivants. Ces exemples sont présentés à titre d'illustrations de l'invention et ne doivent pas être interprétés comme pouvant limiter la portée de la présente invention.
LEGENDES DES FIGURES Figure 1 : illustre le spectre d'émission du modèle coumarine 29
Figure 2 : illustre la cinétique de clivage du modèle coumarine 29 Figure 3 : illustre le spectre d'émission du modèle DAO 31 Figure 4 : illustre la cinétique de clivage du modèle DAO 31 Figure 5 : illustre le spectre d'émission de la sonde Ac-DEVD-PABA- Coumarine 23
Figure 6 : illustre la cinétique de clivage de la sonde Ac-DEVD-PABA- Coumarine 23
Figure 7 : évolution temporelle de l'émission de fluorescence de la sonde Ac- DEVD(OH)-PABA-Coumarine 23 Figure 8 : illustre le spectre d'émission de la sonde Ac-DEVD-P AB A-D AO 25
Figure 9 : illustre le clivage de la sonde Ac-DEVD -PABA-DAO 25 Figure 10 : illustre le clivage de la sonde PhAc-ThAEC-Coumarine (k). Schéma 1 : synthèse des composés modèles 29, 30 et 31
Schéma 2 : synthèse du composé modèle 32, et hydrolyse par une pénicilline amidase
Schéma 3 : synthèse du dipeptide Ac-DE-OH 5
Schéma 4 : synthèse du dipeptide H-VD-Bn 6
Schéma 5 : synthèse du tétrapeptide Ac-DEVD-OH 3
Schéma 6 : introduction du linker PABA 4 sur le tétrapeptide Ac-DEVD-OH 3 SScchhéémmaa 77 :: synthèse de la sonde Ac-DEVD-P ABA-Coumarine 23
Schéma 8 : synthèse de la sonde Ac-DEVD-P ABA-D AO 25
Schéma 9 - synthèse de la sonde PhAc-ThAEC-Coumarine (k).
EXEMPLES SECTION EXPERIMENTALE
I Séparations par Chromato graphie Liquide Haute Performance (CLHP) Différents systèmes de chromatographie ont été utilisés pour les expériences analytiques et les étapes de purification : système A : une CLHP en phase inverse (C18, Hypersil GOLD, 5 μm, 4,6 x
150) avec CH3CN et de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % dans l'eau (TFA 0,1 % pH 2,0) en tant qu'éluants (100 % TFA (5 min), puis un gradient linéaire de 0 à 100 % (50 min) de CH3CN] selon un débit de 1,0 ml/min.
Une double détection UV-Visible a été effectuée à 210 et 254 nm,
- système B : une CLHP en phase inverse (C18, Hypersil GOLD, 5 μm, 4,6 x
150) avec CH3CN et de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % dans l'eau (TFA 0,1 % pH 2,0) en tant qu'éluants (80 % TFA (5 min), puis un gradient linéaire de 20 à 100 % (40 min) de CH3CN) à un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV-Visible a été effectuée à 210 et 254 nm, et système C : une CLHP en phase inverse (C18, Hypersil GOLD, 5 μm, 4,6 x
150) avec CH3CN et un tampon acétate de triéthylammonium (TEAA 100 mM, pH 7,0) en tant qu'éluants (90 % TEAA (2 min), puis un gradient linéaire de 10 à 90 % (40 min) de CH3CN) à un débit de 1,0 ml/min. Une double détection UV-Visible a été effectuée à 254 et 285 nm.
II Procédures générales ILl. Procédure générale pour l'introduction des groupes TMSE
L'acide aminé est dissous dans un mélange de DMF anhydre et de CH3CN (1,4 M). De la pyridine fraîchement distillée (2 eq.) et du 2-triméthylsilyl(éthanol) (1,2 eq.) ont été ajoutés, puis le mélange a été refroidi à 0 0C et du N,N'-dicyclohéxylcarbodiimide (DCC 1,1 eq.) a été ajouté. Après agitation pendant 1 heure à température ambiante, la solution a été filtrée sur de la Celite, puis lavée avec du AcOEt. Les filtrats ont été concentrés sous pression réduite, l'huile obtenue a été dissoute dans du AcOEt, puis lavée avec de l'acide citrique en solution aqueuse (10 %), de l'eau déminéralisée, une solution aqueuse saturée de NaHCO3, puis une nouvelle fois avec de l'eau déminéralisée. La phase organique a été séchée sur du Na2SO4, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie sur un gel de silice (CH2Cl2ZAcOEt), conduisant à l'obtention de l'acide aminé protégé sous forme d'une huile incolore. II.2. Procédure générale pour l'élimination du groupement Boc La déprotection du groupement Boc a été effectuée avec du TFA (20 eq.) dans du CH2Cl2 (0,8 M) ; la réaction a été suivie par chromatographie sur couche mince (CH2Cl2ZAcOEt). A la fin de la réaction, le mélange a été refroidi à 0 0C et neutralisé avec une solution saturée de NaHCO3. La phase aqueuse a été extraite avec du CH2Cl2 puis les phases organiques combinées ont été lavées avec de l'eau déminéralisée, et séchées sur du Na2SO4, filtrées et concentrées sous pression réduite. 1,1 eq. de TFA a été ajouté aux composés 6 et 13 afin d'éviter leur dégradation.
11.3. Procédure générale pour l'élimination des esters benzyliques
Les esters benzyliques ont été dissous dans de l'acétate d'éthyle (0,06 M). Le milieu a été refroidi à 0 0C, puis du palladium sur charbon (10 %, Pd/C) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation à température ambiante et sous atmosphère d'hydrogène pendant une nuit. La solution a été filtrée sur de la Celite et les filtrats ont été concentrés sous vide, conduisant à l'obtention des acides libres correspondants.
//.4. Procédure générale pour le couplage des acides aminés Les acides et les aminés ont été dissous dans de l'acétonitrile anhydre (0,1 M). Le réactif de couplage hexafluorophosphate de O-benzotriazol-1-yloxytris (diméthylamino)phosphonium (BOP, 1 eq.) et de la N,N-diisopropyléthylamine (DIEA, 3 eq.) ont été ajoutés et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Ensuite, le mélange a été concentré sous pression réduite, le résidu huileux obtenu a été dissous dans du CH2Cl2, puis lavé avec de l'acide citrique en solution aqueuse (10 %), de l'eau déminéralisée, une phase aqueuse saturée de NaHCO3, puis d'eau déminéralisée. La phase organique a été séchée sur du Na2SO4, puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie sur gel de silice (CH2Cl2/ AcOEt).
II.5. Procédure générale pour l'élimination des groupes TMSE Les composés 23 et 25 ont été obtenus à partir de 22 et 24 après traitement avec un excès de fluorure de tétraméthylammonium (TMAF) dans du DMF anhydre. La réaction a été suivie par CLHP analytique en phase inverse. Une fois l'élimination complète des groupes TMSE, les composés ont été purifiées par CLHP semi-préparative en phase inverse en utilisant une solution aqueuse de TFA (0.1 %) et de l'acétonitrile comme éluants.
11.6. Synthèse des composés 29, 30 et 31
Le N-(4-hydroxyméthyl)phényl)-2-phénylacétamide 27 (443 mg, 1,84 mmol) a été dissous dans de l'acétone anhydre (23 ml) et refroidi à 00C. La triéthylamine (770 μl, 5,5 mmol, 3 eq.) et le chlorure de méthane sulfonyle (425 μl, 5,5 mmol, 3 eq.) ont été ajoutés et le milieu réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant la nuit. Ensuite, du CH2Cl2 (20 ml) a été ajouté et la solution a été versée sur une solution aqueuse refroidie (0 0C) d'HCl (2N). La phase aqueuse a été extraite avec du CH2Cl2 (30 ml), et les phases organiques réunies ont été lavées avec de l'eau déminéralisée (30 ml), séchées sur Na2SO4, filtrées puis concentrées sous pression réduite, conduisant à l'obtention du méthane sulfonate 4-(2-phénylacétamido)benzyle 28 sous la forme d'un solide blanc. Le résidu obtenu, relativement instable, a été utilisé directement dans l'étape suivante sans purification supplémentaire.
1U RMN (300 MHz, CDCI3): δ 3.62 (s, 3H, CH3), 3.69 (s, 2H, ArCH2), 4.49 (s, 2Η, CH2OH), 7.22-7.40 (m, 9H, ArH); 13C RMN (75.4 MHz, CDCI3): δ 44.7, 46.2, 52.8, 120.5, 127.8, 129.4, 129.6, 129.7, 133.8, 134.6, 138.0.
Les différents fiuorophores ont été dissous dans du CH2Cl2 anhydre (pour la 7-hydroxycoumarine 18) ou du DMF anhydre (pour la DDAO 20 et la DAO 21, 1,2 eq., [c] = 0,1 M). K2CO3 (2 eq.) a été ajouté et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation pendant 15 minutes. Ensuite, le composé 28 (1 eq.) a été ajouté et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant la nuit. La formation du produit a été suivie par CLHP en phase inverse. En fin de réaction, la solution a été concentrée sous pression réduite, et du CH2Cl2 (10 ml) a été ajouté et la solution a été lavée avec de l'eau déminéralisée. La phase organique a été séchée sur du Na2SO4, puis filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par CLHP semi- préparative en phase inverse (TFA (0,1 % dans l'eau ) et CH3CN comme éluants), conduisant à l'obtention des composés 29, 30 et 31. //.7. Synthèse du Ac-DEVD (TMSE)-PABA-OH 2
AC-DEVD(TMSE)-OH 3 (598 mg, 0,73 mmol) a été dissous dans du DMF anhydre (7 ml) et refroidi à -4 0C. Ensuite, l'alcool /?αrα-aminobenzylique (PABA) (90 mg, 0,73 mmol, 1 eq.) et l'hydrochlorure de N-éthyl-N'-(3- diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDCI) (154 mg, 0,80 mmol, 1, 1 eq.) ont été ajoutés et le mélange a été maintenu sous agitation pendant 1 heure à température ambiante. Le solvant a été éliminé sous vide, et le solide obtenu a été dissous dans du CH2Cl2 (40 ml) puis lavé avec de l'acide citrique en solution aqueuse (10 %) (15 ml) et de l'eau déminéralisée (20 ml). La phase organique a été séchée sur du Na2SO4 puis filtrée et concentrée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par chromatographie sur un gel de silice (CH2Cl2/ AcOEt 3/7), conduisant à l'obtention de Ac-DEVD(TMSE)-PABA- OH 2 sous forme d'un mélange (85/15) de deux diastéréoisomères qui ont été ensuite séparés par CLHP semi-préparative en phase inverse (solides jaune, 580 mg, 86 %).
//.8. Synthèse du Ac-DEVD(TMSE)-P AB A-coumarine 22
Ac-DEVD-PABA(TMSE)-OH 2 (152 mg, 0,16 mmol) a été dissous dans de l'acétone anhydre (2 ml) et refroidi à 00C. Ensuite, le triéthylamine (67 μL, 0,48 mmol, 3 eq.) et le chlorure de méthane sulfonyle (37 μL, 0,48 mmol, 3 eq.) ont été ajoutés et le mélange a été maintenu sous agitation pendant la nuit. Le milieu réactionnel a été dilué avec du CH2Cl2 (5 ml) et versé sur une solution aqueuse refroidie de HCl (2 N). La phase aqueuse a été extraite avec du CH2Cl2 (10 ml). Les phases organiques combinées ont été lavées avec de l'eau déminéralisée (8 ml), puis séchées sur du Na2SO4 puis filtrées et évaporées sous pression réduite, conduisant à l'obtention de Ac-DE VD(TMSE)-PAB A- OMs sous forme d'un solide jaune. Le résidu obtenu a été utilisé sans purification supplémentaire dans l'étape suivante. La 7-hydroxycoumarine 18 (29 mg, 0,18 mmol, 1,1 eq.) a été mise en suspension dans du CH2Cl2 anhydre (2 ml). Du K2CO3 (44 mg, 0,32 mmol,
2 eq.) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation pendant 20 minutes, la solution devient alors jaune. Puis le Ac-DEVD(TMSE)-PABA-OMs, en solution dans du CH2Cl2 anhydre (2 ml) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation sur la nuit à température ambiante. La formation du produit a été suivie par CLHP en phase inverse. A la fin de la réaction, la solution a été diluée dans du CH2Cl2 (10 ml) et lavée avec de l'eau déminéralisée (10 ml). La phase organique a été séchée sur du Na2SO4 filtrée puis évaporée sous pression réduite. Le résidu a été purifié par CLHP semi-préparative en phase inverse (TFA (0,1 % dans l'eau) et CH3CN comme éluants), permettant la séparation des deux diastéréoisomères et conduisant à l'obtention de Ac-DEVD(TMSE)-PABA- coumarine 22 sous la forme d'un solide blanc (32 mg, 25 %).
II.9. Synthèse du Ac-DEVD (TMSE)-P AB A-D AO 24
De la 7-hydroxy-9-H-(9,9-diméthylacridin-2-one) (DAO) 21 (10 mg, 0,042 mmol, 1,2 eq.) a été dissoute dans du DMF anhydre (800 μl). Du K2CO3 (12 mg, 0,084 mmol, 2,4 eq.) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation pendant 20 minutes, la solution devient alors bleue. Ensuite, le Ac-DEVD(TMSE)-P ABA-OMs (35 mg, 0,035 mmol, 1 eq.) a été ajouté et le mélange a été maintenu sous agitation sur la nuit à température ambiante. La formation du produit a été suivie par CLHP en phase inverse. A la fin de la réaction, la solution a été concentrée, du CH2Cl2 (15 ml) a été ajouté et la phase organique a été lavée avec de l'eau déminéralisée (7 ml), puis séchée sur du Na2SO4 puis filtrée et évaporée sous pression réduite. Le résidu obtenu a été purifié par CLHP semi- préparative en phase inverse permettant la séparation des deux diastéréoisomères et conduisant à l'obtention de Ac-DEVD(TMSE)-PABA-DAO 24 sous la forme d'un solide orange (4 mg, 13 %).
Exemple I : Synthèse de composés modèles 29, 30, 31
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000031_0002
Le chlorure de phénylacétyle 26 a été mis en réaction avec l'alcool /?αrα-aminobenzylique 4 en présence de pyridine. Après purification sur gel de silice, le composé 27 est ainsi obtenu avec un rendement de 78 %. La fonction alcool du composé 27 est ensuite activée à l'aide de chlorure de mésyle et de triéthy lamine. Les fluorophores 18, 20 et 21 ont ensuite été introduits, conduisant aux sondes 29-31 avec des rendements respectifs sur 2 étapes (activation et greffage) de 28, 7 et 14 % (Schéma 1).
Composé 29 1U RMN (300 MHz, CDCl3): δ 3.66 (s, 2H, ArCH2), 4.96 (s, 2H, CH2OH),
6.15 (d, J = 9 Hz, IH, ArHCoum), 6.74-6.81 (m, 2Η, ArHCoum), 7.15-7.31 (m, 8H, ArH + MHPABA + ArHcoum), 7.39 (d, J= 8 Hz, 2H, AvHPABA), 7.54 (d, J= 9 Hz, IH, ArHCoum); 13C RMN (75.4 MHz, CDCl3): δ 45.1, 70.4, 102.2, 113.5, 113.6, 120.3, 128.0, 128.7, 129.1, 129.6, 129.8, 1320, 134.7, 138.1, 143.8, 156.0, 161.6, 162.1, 169.6; Rf 0..05 (CH2Cl2/Ac0Et 5/5); MS (ESI, mode positif): cale pour [C24H2oN04]+ 386.14, déterminée 386.33; CLHP (système B) : Rt = 29.4 min (pureté = 95 %); UV (CH3CN) : K^ 275, 8(27S) = OSOOO M-1 Cm"1.
Composé 30 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 1.78 (s, 3H, CH3), 1.85 (s, 3Η, CH3), 3.77 (s,
2Η, ArCH2), 5.04 (s, 2Η, CH2OH), 6.66-6.69 (m, IH, ArHDDΛO), 7.13 (s, IH, ArHDDΛO), 7.30-7.51 (m, 10H, 5ArH + 4ArHPABA + ArHDDAO), 7.63 (s, 1Η, ArHDDAO), 7.75 (s, 1Η, NH); 13C RMN (75.4 MHz, CDCl3): δ 29.1, 38.4, 45.2, 75.0, 114.1, 114.3, 120.0, 120.3, 128.1, 128.8, 128.9, 129.1, 129.6(6), 129.7, 129.9, 130.6, 132.5, 132.9, 133.7, 134.6, 138.3, 139.8, 140.4, 141.0, 141.3, 148.7, 153.0, 153.5, 169.5, 187.7; Rf 0.5 (CH2CL2/Ac0Et 6/4); MS (ESI mode positif): cale pour [C30H24Cl2NaN2O3]+ 553.11, déterminée 553.33; CLHP (système B) : Rt 36.8 min (pureté = 94 %); UV (PB/acétone, 8/2, v/v) : Vax 424, ε (424) = 15000 M"1 cm"1.
Composé 31
1U RMN (300 MHz, (CD3)2CO): δ 1.57 (s, 6H, 2CH3), 3.70 (s, 2Η, ArCH2), 5.20 (s, 2Η, CH2OH), 6.55 (dd, J = 2 et 10 Hz, IH, ArHDΛO), 6.68 (d, J = 2 Hz, IH, ArHDAO), 7.07 (dd, J = 3 et 9 Hz, IH, AvHDAO), 7.22-7.48 (m, 9H, 5ArH + 2ArHPABA + IAIHDAO), 7.60 (d, J = 9 Hz, IH, ArHDΛO), 7.71 (d, J = 8 Hz, 2H, 2ArHPΛBΛ); 13C RMN (75.4 MHz, CDCl3): δ 32.2, 37.7, 44.3, 70.3, 113.4, 114.4, 119.6, 127.1, 127.6, 128.8, 129.1, 129.7, 131.3, 132.1, 134.0, 136.4, 137.2, 139.9, 140.2, 142.0, 148.1, 150.8, 161.7, 169.4, 186.8; MS (ESI, mode positif): cale pour [C3oH27N2θ3]+ 463.20, déterminé 463.13; CLHP (système B) : R4 = 31.6 min (pureté = 95%); UV(PB/acétone, 8/2, v/v) : K∞ 458, ε(458) = 17000 M"1 cm"1.
Exemple II : Synthèse du composé 32
Figure imgf000033_0001
32
Le composé modèle 32 possède un motif 7-hydroxycoumarine fluorescent à pH physiologique mais qui perd son caractère fluorescent lorsque la fonction phénol est estérifiée. Cette sonde a été préparée en deux étapes à partir du dérivé de l'acide homovanillique 33 et de l'ester benzylique de l'acide (7-hydroxycoumarin-4-yl)acétique 34 (Schéma 2).
L'acide 4,5-diméthoxy-2-[(phénylacétamino)méthyl]phénylacétique (33, 50 mg, 0,14 mmol) et le (7-hydroxycoumarine-4-yl)acétate de benzyle (34, 54 mg, 0,17 mmol) ont été dissous dans du DMF anhydre (1 ml). De la triéthylamine (70, 6 μl, 0,51 mmol) et le réactif de couplage BOP (72, 3 mg, 0,16 mmol) ont été ajoutés et le mélange réactionnel a été maintenu sous agitation sous atmosphère d'argon pendant deux heures. La réaction de couplage a été suivie jusqu'à son terme par CCM et CLHP, puis le mélange réactionnel a été évaporé à sec. Le résidu huileux a été purifié par chromatographie sur un gel de silice (10 g, gradient d'AcOEt dans du CH2Cl2, 0-20 %) pour obtenir le composé 35 sous forme d'un solide blanc (45 mg, 45 %).
Composé 35
R/ (CH2Cl2/ACOEt 7/3, v/v) : 0.43. HPLC (system C) Rt 27.8 min. UV (enregistré lors de l'analyse CLHP) λmax 236, 280 and 310 nm, λmm 252 and 300 nm. IR (KBr) 3411, 3274, 3070, 2935, 1756 (intense), 1724, 1644, 1616, 1522, 1431, 1393, 1334, 1325, 1261, 1118, 1001, 838, 697, 559. MS (MALDI-TOF, mode positif, matrice CHCA) m/z 696.34 (M+K)+, 658.27 (M+Na)+ (masse calculée pour C37H33NO9635.68). 1R NMR ((CD3)2SO, 300 MHz): δ 8.53 (t, J= 5.3 Hz, IH), 7.78 (d, J= 8.6 Hz, IH, H5-coumarine), 7.39-7.18 (m, 12H, H-phényle and H6- et H8-coumarine), 6.98 (s, IH, H- acide phénylacétique), 6.84 (s, IH, H- acide phénylacétique), 6.57 (s, IH, H3-coumarine), 5.19 (s, IH, CH2-Bn), 4.31 (d, J 6.0 Hz, 2H, Ph-CH2-C(O)-N(H)-CH2-), 4.16 (s, 2H, CH2- CO2Bn), 4.03 (s, 2H, Ph-CH2-C(O)-N(H)-), 3.78 (s, 3H, CH3-O), 3.67 (s, 3H, CH3-O), 3.49 (s, 2H, CH2-CO2-coumarine).
Le composé 35 (40 mg, 0,06 mmol) a été mis en suspension dans un mélange de CH2Cl2 (1 ml) et d'acétate d'éthyle (1 ml). 6.5 mg de palladium sur charbon (10 %, Pd/C) ont été ajoutés et une atmosphère d'hydrogène a été établie. Le mélange réactionnel (légèrement chauffé pour augmenter la solubilité du matériel de départ) a été maintenu sous agitation à température ambiante pendant 19 heures. La déprotection a été suivie jusqu'au terme de la réaction par CLHP. Ensuite, le mélange réactionnel a été filtré sur Celite et les filtrats concentrés sous vide. Le résidu huileux a été dissous dans de l'eau diminéralisée et lyophilisé pour conduire au composé 32 sous forme d'un solide blanc (30 mg, 88 %).
Composé 32
CLHP (system C) Rt 16.8 min. UV (enregistré lors de l'analyse CLHP) λmax 235, 281 and 308 nm, λmm 253 and 300 nm. IR (KBr) 3552, 3484, 3416, 2963, 1734 (faible), 1717, 1636, 1617, 1522, 1384, 1261, 1100, 1021, 828, 621, 559. MS (MALDI- TOF, mode positif, matrice CHCA) m/z 584.09 (M+K)+, 568.13 (M+Na)+ (masse calculée pour C30H27NO9 545.45). 1U RMN ((CD3)2SO, 300 MHz): δ 8.55 (t, J= 5.3 Hz, IH), 7.82 (d, J = 8.7 Hz, IH, H5-coumarine), 7.38-7.23 (m, 12H, H-phényle and H6- and H8- coumarine), 7.00 (s, IH, H- acide phénylacétique), 6.87 (s, IH, H- acide phénylacétique), 6.57 (s, IH, H3-coumarine), 4.33 (d, J = 6.0 Hz, 2H, Ph-CH2-C(O)-N(H)-CH2-), 4.06 (s, 2H, CH2-CO2Bn), 4.00 (s, 2H, Ph-CH2-C(O)-N(H)-), 3.80 (s, 3H, CH3-O), 3.70 (s, 3H, CH3-O), 3.51 (s, 2H, CH2-CO2-coumarine).
Exemple III : Synthèse de Ac-DEVD-P ABA-Coumarine 23
Figure imgf000035_0001
Ll Synthèse du tétrapeptide Ac-DEVD-OH 3 Ll. a. Synthèse du dipeptide Ac-DE-OH 5
Figure imgf000035_0002
La synthèse du composé 5 s'effectue en 7 étapes à partir des dérivés protégés d'acides glutamique et aspartique 7 et 8.
Figure imgf000035_0003
La fonction acide carboxylique des chaînes latérales est protégée par un groupement TMSE en présence d'alcool 2-((triméthyle)sylil)éthylique, de DCC et de pyridine. Les composés ainsi obtenus sont déprotégés respectivement par traitement à l'acide trifluoroacétique (TFA) et par hydrogénation catalytique pour conduire à l'aminé 10 et à l'acide 11 avec des rendements sur deux étapes de 83 et 99 %.
Les composés 10 et 11 sont ensuite couplés en présence de BOP (Castro et al. ; Tetrahedron Letters, 1975 : 1219) et de DIEA pour conduire au dipeptide 12 avec un rendement de 98 %. La déprotection du groupement Boc s'effectue par traitement au TFA et permet d'obtenir le sel 13 avec un rendement de 82 %. Le composé 13 réagit ensuite avec l'anhydride acétique en présence de pyridine, puis l'ester benzylique est sélectivement déprotégé par hydrogénation catalytique sur Pd/C. Le composé Ac-DE-OH 5 est ainsi obtenu avec un rendement sur deux étapes de 77 % (Schéma 3).
Ac-Asp(TMSE)-Glu(TMSE)-OH 5 (huile incolore, 100 %)
1U RMN (300 MHz, CDCl3): δ 0.03 (s, 9H, 3CH3), 0.06 (s, 9H, 3CH3), 0.96-1.02 (m, 4Η, 2CH2Si), 1.96-2.10 (m, 4Η, CH3 + CH2Gi«), 2.15-2.30 (m, 1Η, CH2Gi«), 2.32-2.51 (m, 2Η, CH2COGIU), 2.63 (dd, J = 6 et 17 Hz, IH, CH2ASp), 2.98 (dd, J = 4 et 17 Hz, IH, CH2^), 4.09-4.22 (m, 4Η, OCH2), 4.46-4.53 (m, 1Η, C*HG/u), 4.83-4.89 (m, 1Η, C*H^), 7.03 (d, J = 8 Hz, NH4^), 7.56 (d, J = 8 Hz, NHG&); 13C RMN (75.4 MHz, CDCl3): δ -1.17 (6C), 17.5, 17.6, 23.5, 26.8, 30.9, 36.1, 49.6, 52.6, 63.5, 64.0, 171.3, 171.4, 172.7, 173.9, 174.0; IR (net): 3308, 2954, 1733, 1656, 1536 cm"1; [α]21 365 +32.1° (c 0.39, CHCl3); R/ 0.2 (100 % AcOEt); MS (MALDI-TOF, mode positif, matrice CHCA): cale, pour [C2IH40N2O8Si2Na]+ 527.22, déterminée 527.58; Anal cale, pour C2IH40N2O8Si2, 0.14 CH2Cl2: C, 49.13; H, 7.86; N, 5.42. Déterminée: C, 48.87; H, 7.84; N, 5.50.
LLb. Synthèse du dipeptide H-VD-Bn 6
Figure imgf000036_0001
Le composé H-VD-Bn 6 est obtenu avec un rendement sur 4 étapes de 77 % à partir du dérivé protégé d'acide aspartique 8. La protection de la chaîne latérale par l'alcool 2-((triméthyl)sylil)éthylique s'effectue de la même manière que précédemment. La déprotection du groupement Boc par traitement au TFA conduit à l'aminé 15 avec un rendement sur 2 étapes de 85 %. Le composé 15 est ensuite couplé à la valine commerciale 9 en présence de BOP et de DIEA, permettant l'obtention du dipeptide 16 avec un rendement quantitatif. Enfin, le dipeptide H-VD-Bn 6 est obtenu par déprotection de 16 par traitement au TFA avec un rendement de 92 % (Schéma 4).
H-Val-Asp(TMSE)-Bn/TFA 6 (solide blanc, 92 %)
1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 0.01 (s, 9H, 3CH3), 0.88-0.99 (m, 8H, CH2Si + 2CHWal), 2.13-2.19 (m, 1Η, CHCH3), 2.76 (dd, J = 5 et 17 Hz, IH, CH2), 2.98 (dd, J = 5 et 17 Hz, IH, CH2), 3.85 (d, J = 5 Hz, IH, C*HVaι), 4.05-4.13 (m, 2H, OCH2), 4.91-4.94 (m, 1Η, C*HΛsp), 5.13 (dd, J = 11 et 12 Hz, OCH2Ar), 7.27-7.31 (m, 5Η, ArH); 7.55 (d, J = 8 Hz, IH, NH4^), 8.0-8.3 (mtroad, 3Η, NH3 +); 13C RMN (75.4 MHz, CDCl3): δ -1.3 (3C), 17.4, 17.8, 18.0, 30.6, 35.9, 49.1, 59.0, 64.0, 68.1, 128.8-128.9 (2 pics, 5C), 135.3, 168.3, 170.3, 171.7; IR (KBr): 3366, 2947, 1671, 1542 cm"1 ; [α]21 3es +38.7° (c 0.97, CHCl3) ; MS (ESI, mode positif): cale, pour [C2IH35N2O5Si]+ 423.23, déterminée 423.13; Anal Cale, pour C23H35F3N2O7Si: C, 51.48; H, 6.57; N, 5.22. Déterminée: C, 51.51; H, 6.43; N, 5.17.
I.l.c. Synthèse du tétrapeptide AC-DEVD(TMSE)-OH 3
Figure imgf000037_0001
Le tétrapeptide 17 est obtenu par réaction de couplage des dipeptides Ac-DE- OH 5 et H-VD-Bn 6 en présence de BOP et de DIEA. L'hydrogénation catalytique sur Pd/C permet d'obtenir Ac-DEVD-OH 3 avec un rendement sur deux étapes de 95 % (Schéma 5). Ac-Asp(TMSE)-Glu(TMSE)- Val- Asp(TMSE)-OH 3 (solide gris, 99 %) 1H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 0.08 (s, 27H, 9CH3), 0.96-1.08 (m, 12H, 3CH2Si + 2CH3Fα/), 1.91-2.05 (m, 4Η, CiZ2(H. + CH3), 2.12-2.24 (m, 2Η, CHCH3 + CH2Gh), 2.38- 2.50 (m, 2Η, CH2COG/u), 2.65-2.93 (m, 4Η, 2CH2^), 4.16-4.28 (m, 7Η, C*HVaι + OCH2), 4.40-4.45 (m, 1Η, C*HGιu), 4.70-4.80 (m, 2Η, C*H^), 7.97 (d, J = 8 Hz, IH, Ni/™), 8.22 (d, J= 8 Hz, IH, NH4^), 8.32 (d, J= 8 Hz, IH, NH4^), 8.41 (d, J= 8 Hz, IH NHG&); 13C RMN (75.4 MHz, CD3OD): δ - 0.6 (9C), 19.0 (3C), 19.6, 20.6, 23.4, 28.8, 32.3, 32.6, 37.8, 38.1, 51.2, 52.2, 55.0, 61.0, 64.7, 65.0, 65.2, 173.1, 173.3, 173.8, 173.9, 174.0, 174.2(0), 174.2(4), 175.7; IR (KBr): 3926, 2958, 1732, 1694, 1668, 1645, 1564, 1538 cm"1; [α]21 365 +17.5° (c 0.94, CHCl3). R/ 0.5 (CH2Cl2/Me0H 95/5); MS (MALDI-TOF, mode positif, matrice CHCA): cale, pour [C35H66N4Oi2Si3Na]+ 841.39, déterminée 841.57; Anal cale, pour C35H66N4Oi2Si3, 1.2 CH2Cl2: C, 47.20; H, 7.48; N, 6.08. Déterminée: C, 47.14; H, 7.22; N, 6.21.
ILl. Introduction du bras réactif : Ac-DEVD(TMSE)-PABA OH 2
L'introduction du bras réactif (PABA) a été effectuée par couplage peptidique du composé 3 avec l'alcool /?αrα-aminobenzylique 4 (Schéma 6). Un carbodiimide hydrosoluble l'EDCI (l-Ethyl-3-(3-Diméthylamino-propyl) Carbodiimide) est utilisé comme agent de couplage.
III.l. Introduction du fluorophore 7-hydroxvcoumarine 18
Figure imgf000038_0001
La fonction alcool de 2 a été activée par l'intermédiaire d'un groupement mésyle. Puis, l'introduction de la 7-hydroxycoumarine 18 sur l'extrémité C-terminale de ce tétrapeptide-PABA a été effectuée en présence d'une base minérale (K2CO3). La sonde
Ac-DEVD(TMSE)-PABA-Coumarine 22 a été obtenue avec un rendement sur 2 étapes de
25 % après séparation des deux diastéréoisomères par CLHP semi-préparative sur phase inverse. La déprotection des groupements TMSE a été effectuée avec du fluorure de tetramethyl ammonium (TMAF) et a permis l'obtention quantitative du composé 23 (Schéma 7). Ac-DEVD(TMSE)-PABA-OH 2
1H RMN (300 MHz, CD3OD): δ 0.07 (s, 27H, 3Si(Me3)3), 0.99-1.04 (m, 12H, 3CH2Si + 2CH3Fα/), 1.95-2.10 (m, 4Η, CiZ2(H. + CH3), 2.10-2.18 (m, 2Η, CHCH3 + CH2Gh), 2.41- 2.48 (m, 2Η, CH2COG&), 2.7-3.1 (m, 4Η, 2CH2^), 4.05-4.25 (m, 7Η, C*Hvd + 3OCH2), 4.36-4.42 (m, 1Η, C*HG/u), 4.58 (s, 2Η, ArCH2O), 4.70-4.76 (m, 1Η, C*H^), 4.80-4.95 (m, 1Η, C*HΛsp), 7.33 (d, J = 8 Hz, 2H, ArH), 7.63 (d, J = 8 Hz, 2H, ArH), 7.94 (d, J = 1 Hz, IH, NHvai), 8.31 (d, J= 8 Hz, IH, NH4^), 8.42-8.47 (m, 2Η, NHG& + NH4^), 9.48 (s, 1Η, OH); 13C RMN (75.4 MHz, CD3OD): δ -0.6, 19.1, 20.0, 20.5, 23.4, 28.4, 32.1, 32.3, 37.7, 52.3, 53.1, 55.7, 62.2, 64.8, 65.1, 65.3, 65.7, 122.2, 129.4, 139.3, 139.7, 171.4, 173.0, 173.4, 174.2(6), 174.3(4), 174.4, 175.2, 175.7; [α]21 365 -125.5° (c 1.1, CHCl3); R/ 0.5 (CH2Cl2/Ac0Et 3/7); MS (ESI, mode positif): cale, pour [C42H73N5Oi3Si3Na]+ 946.40, déterminée 946.45; CLHP (système B) : Rt = 30.5 min (pureté > 95 %).
Ac-DEVD-P ABA-Coumarine 23
1U RMN (300 MHz, CDCl3): δ 0.84-0.89 (m, 6H, 2CHWa), 1.70-2.10 (m, 6H, CHCH3 + CH2GIu + CH3), 2.25-2.31 (m, 2Η, CH2COG&), 2.52-2.80 (m, 4Η, 2CH1Asp\ 4.15-4.21 (m, IH, C*HVai), 4.35-4.41 (m, IH, C*HGi«), 4.50-4.54 (m, IH, C*H^), 4.67-4.73 (m, 1Η, C'HASP), 5.18 (s, 2Η, ArOCH2), 6.33 (d, J = 9 Hz, IH, ArHCoum), 7.04 (d, J = 9 Hz, IH, ArHcoum), 7.11 (s, IH, ArHCoum), 7.44 (d, J= 9 Hz, 2H, 2ArHPΛBΛ), 7.66 (m, 3H, ArHCoum + IAIHPABA) 7.85 (d, J = 8 Hz, IH, NHvai), 8.01-8.15 (m, 3H, ArHCoum + NHG/u + NH4^), 8.42 (d, J = 7 Hz, IH, NH4^), 10.00 (s, 1Η, COOH), 12.2-12.5 (mLarge, 2Η, 2COOH); IR (KBr): 3278, 2971, 2883, 1742, 1686, 1664, 1618, 1542, 1490, 1384, 1197, 1140 cm"1; MS (ESI, mode positif): cale, pour [C36H42N5OH]+ 768.27, déterminée 768.20; CLHP (système A) : Rt = 23.6 min (95%); UV : λmax 250, 320 nm, ε (320) = 17000 M"1 cm"1.
Exemple IV : Synthèse de Ac-DEVD-PABA PAO 25
Figure imgf000039_0001
Ll. Synthèse de Ac-DEVD-P ABA-OH 2
Le composé 2 a été obtenu comme indiqué à l'Exemple 1. 1.2. Introduction du fluorophore PAO 21
Figure imgf000040_0001
Le composé 2 a été activé par un groupement mésyle, puis la réaction avec DAO en présence de K2CO3 a permis d'obtenir la sonde Ac-DEVD(TMSE)-PABA-DAO 24 avec un rendement sur 2 étapes de 10 %. La déprotection par traitement au TMAF a permis l'obtention de la sonde Ac-DE VD(OH)-P AB A-D AO 25 (Schéma 8).
Ac-DEVD(TMSE)-PABA-DAO 24
1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ 0.02 (s, 9H, Si(Me3)3), 0.03 (s, 9H, Si(Me3)3), 0.05 (s, 9H, Si(Me3)3), 0.78-1.02 (m, 12H, 3CH2Si + 2CH3 Vai), 1.19 (s, 3H, CHm40), 1.25 (s, 3Η, CH3DΛo), 1.95-2.20 (m, 5H, CiZ2(H. + CH3), 2.25-2.39 (m, 1Η, CHCH3), 2.45-2.62 (m, 2H, CH2COGIU), 2.80-3.12 (m, 4H, 2CH2Asp), 3.95-4.22 (m, 8H, C*Hvd + C*HG/u + 3OCH2), 4.65-4.72 (m, 1Η, C*H^), 4.95-5.09 (m, 3Η, ArCH2O + C*H^), 6.58-6.66 (m, 3Η, 3ArHDAO), 6.93-6.97 (m, IH, ArHDAO), 7.08-7.12 (m, 2H, NHFa, + NH4^), 7.35-7.41 (m, 3Η, AxHDAo + 2ArHPABA), 7.58-7.63 (m, 2H, NH4^ + AxHDAO), 7.77-7.80 (d, 2Η, J= 9 Hz, 2AxHPABA), 8.47 (d, J = 4 Hz, IH, NHG&), 8.67 (s, 1Η, NHPABA); MS (ESI): cale, pour [C57Η85N6Oi3Si3]+ 1145.55, déterminée 1145.33; CLHP (système A) : Rt = 39.5 min (pureté = 90 %); UV : λmax 247, 457 nm, ε(457 nm) = 6500 M"1 cm"1.
MS (ESI, mode positif): cale, pour [C42H47N6On]+ 843.32, déterminée 843.40; HPLC (système A) : Rt = 25.8 min (pureté = 91 %); UV-Visible : λmax 247, 457 nm, ε(457) = 6500 M-1 Cm"1.
Exemple V : Clivage des composés 29, 31 et 32 par une pénicilline amidase
Pour les expériences de clivage, une pénicilline amidase immobilisée sur un support solide inerte de type Eupergit C a été utilisée, ce qui permet d'accroître sa tolérance vis à vis de certains solvants organiques (acétone et méthanol). Ainsi, les différents essais ont été réalisés dans un mélange tampon phosphate (PB, 0.1 M, pH 7.4) et acétone dans les proportions 8/2 (v/v).
Le spectre UV-Visble du modèle 29 (2.6 mM) a été enregistré dans un mélange PB/acétone (8/2, v/v ; pH 7.5 ; 37 0C) ; il présente un maximum d'absorption à λ = 275 nm (ε = 63000 M"1 cm"1). Le spectre d'émission de fluorescence a également enregistré été (AEX = 275 nm) ; une très faible fluorescence de la sonde (λEm = 395 nm) dans l'acétonitrile et une fluorescence quasi-nulle dans le mélange PB/acétone (8/2, v/v) est observée (Figure 1). La pénicilline amidase (6,4 unités) est ensuite ajoutée dans le milieu et la cinétique de clivage est suivie par mesure de fluorescence (XEX = 360 nm, λEm = 460 nm). On observe une augmentation progressive de la fluorescence à λ = 460 nm caractéristique de la 7-hydroxycoumarine 18 ; il y a donc bien libération progressive dans le milieu du fluorophore (Figure 2, courbe c). Une expérience de contrôle a été réalisée en absence d'enzyme et montre qu'il n'y a pas de libération de la 7-hydroxycoumarine 18 par hydrolyse non spécifique de la sonde pro-fluorescente (Figure 2, courbe d).
Les caractéristiques UV- Visible du modèle DAO 31 (2,2 mM), déterminées dans un mélange PB/acétone (8/2, v/v, 37°C°) sont les suivantes : λmax = 458 nm et ε = 17000 M"1 cm"1. Le spectre d'émission de fluorescence a également été enregistré et une faible fluorescence a été observée à λ = 599 (XEX = 458 nm) (Figure 3). Des expériences similaires ont été réalisés avec le composé modèle 32. La libération de la coumarine fluorescente est également observée.
Un test de clivage par la pénicilline amidase (6,2 unités) a été effectué et montre clairement une augmentation significative de l'émission du DAO (2,2 mM ; pH 7.5 ; 37 0C) (XEX = 638 nm, λEm = 652 nm) au cours du temps (Figure 4). Il y a donc bien libération du fluorophore, libération qui est seulement imputable à l'action attendue de l'enzyme.
Exemple VI : Propriétés spectrales et clivage enzymatique de Ac-DE VD- PABA-Coumarine 23 par la caspase-3 Les spectres UV-Visible (λmaχ = 250 et 320 nm, ε(320) = 17000 M"1 cm"1) et de fluorescence de la sonde Ac-DEVD(OH)-P ABA-Coumarine 23 (3 μM) ont été enregistrés dans un tampon (sucrose 10 % (m/v) 40 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.1 % (m/v) CHAPS), pH 7,4) à 37 0C, avec des spectrophotomètres UV/visible Varian Cary 50 scan et de fluorescence Varian Eclipse. Une microcellule de mesure de fluorescence (Hellma®, 105.51 -QS, 3 x 3 mm, 45 μl) a été utilisée pour ces mesures. Une émission résiduelle de la sonde pro-fluorescente 23 est observée à λ = 393 nm (XEX = 320 nm) (Figure 5).
1 μl de caspase-3 recombinante humaine (1,6 10"3 unité) a été ajouté et la fluorescence a été suivie à λEm = 460 (XEX = 360 nm) en fonction du temps (par incrément de 5 secondes) (Figure 2). La courbe (Figure 6) montre une libération progressive de la 7-hydroxycoumarine 18 fluorescente dans le milieu. Dans les mêmes conditions que précédemment (3 μM, pH = 7,4, 37 0C), une mesure en absence d'enzyme a été effectuée. La courbe de la Figure 7 montre clairement qu'il n'y a pas de libération de 7-hydroxycoumarine 18. La libération du fluorophore observée lors de l'expérience de clivage enzymatique (Figure 6) est donc bien due à la caspase-3.
Exemple VII : Propriétés spectrales et clivage enzymatique de Ac-
DEVD(OH)-PABA-DAO 25 par la caspase-3
50 μl de la sonde Ac-DE VD(OH)-P AB A-D AO 25 (solution du sel d'ammonium dans l'eau déminéralisée (pH 6.0), [c] = 23.0 μM) ont été transférés dans une microcellule de mesure de fluorescence (Hellma®, 105.51 QS, 3 x 3 mn, 45 μl). Le spectre UV-Visible enregistré à 37 0C indique un maximum d'absorption à λmax = 457 nm (ε = 6500 M"1 cm"1) alors que le spectre d'émission de fluorescence montre deux bandes assez larges à 606 et 641 nm (Figure 8).
2 μl de caspase-3 recombinante humaine ont été introduits (3.2 10"3 unités) et la cinétique de clivage a été suivie par mesure de fluorescence (XEX = 638 nm, λEm = 652 nm, incrément de 5 secondes). Les résultats montrent une forte d'augmentation de fluorescence à 652 nm, indiquant que le DAO 21 est bien libéré dans le milieu (Figure 9). La libération de ce fluorophore n'est due qu'à l'action de l'enzyme car en absence de celle- ci, on n'observe pas d'augmentation du signal à λ = 652 nm.
Exemple VIII : Synthèse de la sonde PhAc-ThAEC-Coumarine (k)
La préparation de la sonde (k) s'effectue en 7 étapes (schéma 9). Comme indiqué dans le schéma 9, la protection de l'acide 4-carboxybenzaldéhyde (a) a été réalisée en présence d'un excès d'alcool allylique par une réaction d'estérifïcation avec chauffage modéré pour éviter une polymérisation du motif éthylènique de l'alcool. Le composé (c) obtenu est ensuite condensé sur le benzamide en présence du benzotriazole (par analogie avec la méthode décrite dans Katritzky A.R., Drewniak M., Lue P., J. Org. Chem. 1988, 53, 5854-5856; Katritzky A.R., Takahashi L, Fan W-Q., Pernak J., Synthesis 1991, 1147- 1150) à reflux dans le toluène pendant 48 heures pour donner le composé (d) avec un rendement de 60 % ainsi que le sous-produit (e) (à hauteur de 10-20 %). Ce dernier est issu d'une attaque nucléophile compétitive entre le benzotriazole et l'eau générée au cours de la réaction. Le composé (f) est obtenu après protection de la fonction alcool du β- mercaptoéthanol par le chlorure de te/t-butyldiphénylsilyle (plus stable que le groupe protecteur te/t-butyldiméthylsilyle) en présence d'imidazole. Le benzotriazole, groupement partant, est facilement substitué par le thioalkyléthersilylé (f) en milieu basique pour donner le composé (g) racémique (par analogie avec la méthode décrite dans Bôhm G., Dowden J., Rice D. C, Burgess L, Pilard J-F., Guilbert B., Haxton A., Hunter R.C., Turner N.J., Flitsch S.L., Tetrahedron Lett. 1998, 39, 3819-3822.)
La déprotection de l'alcool en présence de TBAF (fluorure de tétrabutylammonium), permet d'obtenir l'alcool (h). Celui-ci est traité avec le carbonate de disuccinimidyle (DSC) afin d'obtenir le composé activé intermédiaire (i) relativement stable. L'introduction de la 7-hydroxycoumarine est effectué dans des conditions plus basiques et selon un mode préféré de réalisation, on prépare au préalable son sel de sodium correspondant (7-hydroxycoumarine traitée par une solution aqueuse de soude puis lyophilisation) pour rendre la réaction de substitution instantanée avant la dégradation du carbonate activé. Le composé (j) est obtenu avec un rendement de 83 %. La dernière étape consiste en la déprotection de la fonction acide. L'ester allylique se déprotège dans les conditions classiques par l'intermédiaire d'un complexe π- allyl palladium, nécessitant en outre la présenced'un nucléophile pour piéger la partie allyl libérée. Le mélange dimédone/benzylamine : 3/2 mol/mol, comme décrit dans Zhang H.X., Guibé F., Balavoine G., Tetrahedron Lett. 1988, 29, 623-626, et est utilisé de préférence afin de limiter l'attaque nucléophile sur le carbonate. On obtient le composé final (k) avec un rendement de 33 %. Mode de préparation des intermédiaires
Composé (c) : Le 4-carboxybenzaldéhyde (4,5 g, 30 mmol) est placé dans l'alcool allylique (40 mL) sous atmosphère d'argon. Il est traité avec du BF3-Et2O (7,4 mL, 60 mmol) et chauffé à 60 0C pendant 24 heures. 90 mL d'eau sont ensuite ajoutés au mélange qui est extrait deux fois à l'acétate d'éthyle. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre, filtrée puis évaporée sous vide. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (cyclohexane/ AcOEt : 9/1 v/v) donnant le composé (c) sous forme d'une huile incolore (4,13 g, 72 %).
R/= 0.60 (cyclohexane/AcOEt : 2/1 v/v); 1R RMN (CDCl3): δ = 10.10 (IH, s,
CHO), 8.21 (2H, d, J = 8.3 Hz, HA1), 7.95 (2H, d, J = 8.3 Hz, HA1), 6.09-5.98 (IH, m, CH=CH2), 5.46 (IH, d, J = 17.3 Hz, CH=CH2frΩm), 5.33 (1Η, d, J = 11.6 Hz, CH=CH2cκ), 4.85 (2Η, d, J= 8.3 Hz, OCH2); 13C RMN (CDCl3): δ = 191.8, 165.4, 139.3, 135.3, 131.9, 130.4 (2C), 129.7 (2C), 118.9, 66.3 ppm.
Composé (d) : Un mélange de phénylacétamide (1,08 g, 7,94 mmol), benzotriazole (0.95 g, 7,94 mmol) et de composé (c) (1,51 g, 7.94 mmol) est chauffé à reflux dans le toluène anhydre (25 mL) sous atmosphère d'argon, à l'aide d'un appareil de type Dean-Stark pendant 3 jours. 0,1 équivalent de chlorure de mésyle (60 μL, 0.79 mmol.) est ajouté au milieu et remis à chauffer pendant 2 heures. Le solvant est ensuite évaporé et le résidu obtenu purifié par chromatographie sur gel de silice (cyclohexane/ AcOEt : 8/2 puis 3/1 v/v) donnant le composé (d) sous forme d'un solide blanc (2,1 g, 63 %).
R/= 0.32 (cyclohexane/AcOEt : 2/1 v/v) ; 1R RMN (CDCl3): δ = 8.25 (1Η, d, J = 8.2 Hz, NH), 8.05-8.00 (2Η, t, J= 8.7 Hz, HA1), 7.95 (2H, d, J= 8.5 Hz, HA1), 7.86 (2H, s brd, HAT), 7.63 (IH, d, J = 8.2 Hz, CH), 7.47-7.39 (4Η, m, HAT), 7.28-7.23 (3H, m, H^ + chloroform), 6.05-5.96 (IH, m, CH=CH2), 5.39 (IH, d, J = 15.5 Hz, CH=CH2frΩM), 5.28
(1Η, d, J = 9.2 Hz, CH=CH2cκ), 4.80 (2Η, d, J = 5.7 Hz, OCH2); 3.77 ppm (2Η, s, CH2 ) ;
13C RMN (CDCl3): δ = 145.5, 140.7, 133.8, 132.7, 131.9, 130.9, 129.3, 129.0, 128.4, 127.6, 126.6, 124.8, 119.9, 118.6, 109.9, 65.9, 64.2, 43.1 ppm. Composé (f) : Un mélange de chlorure de tert-butyldiphénylsilyle (10,3 mL, 40 mmol), 2-mercaptoéthanol (2,8 mL, 40 mmol) et d'imidazole (2,72 g, 40 mmol) est agité sous atmosphère d'argon à température ambiante pendant 15 heures dans du DMF fraîchement distillé. La réaction est ensuite diluée dans l'eau et la phase organique extraite au dichlorométhane. La phase organique est lavée deux fois à l'eau osmosée, séchée sur sulfate de sodium anhydre, filtrée et évaporée. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur gel de silice (cyclohexane 100 %) donnant le composé (f) sous forme d'une huile incolore (11,87 g, 93 %).
R/ = 0.50 (cyclohexane/CH2Cl2 : 4/1 v/v) ; 1R RMN (CDCl3): δ = 7.70-7.67
(4H, m, HA,), 7.44-7.36 (6H, m, HA,), 3.78 (2H, t, J= 6.4 Hz, OCH2), 2.66 (2H, td, J= 8.3, 6.4 Hz, SCH2), 1.60 (1Η, t, J = 8.3 Hz, SH), 1.07 ppm (9Η, s, CH(CHj)3 ) ; 13C RMN (CDCl3) δ = 135.6 (4C), 133.5, 129.8 (2C), 127.8 (6C), 65.7, 27.3, 26.9 (2C), 19.3 ppm.
Composé (g) : Une solution d'éthanolate de sodium est préparée en dissolvant le sodium métallique (24 mg, 1,03 mmol) dans 2 mL d'éthanol absolu sous atmosphère d'argon. Le composé (f) (326 mg, 1,03 mmol) est ensuite ajouté à cette solution et le mélange obtenu est agité pendant 10 minutes. Le tout est ensuite ajouté au composé (d) (400 mg, 0,94 mmol) en solution dans 2 mL d'éthanol absolu. La réaction est à nouveau agitée pendant 2 heures à température ambiante sous atmosphère argon. Un mélange AcOEt/eau (1/1 v/v) est ensuite ajouté au mélange réactionnel afin de réaliser l'extraction à l'acétate d'éthyle. La phase organique résultante est lavée avec une solution saturée de chlorure de sodium, séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (cyclohexane/ AcOEt : 9/1 v/v) donnant le composé (g) sous forme d'une résine blanche (545 mg, 93 %).
R/= 0.46 (cyclohexane/AcOEt : 4/1 v/v) ; 1U RMN (CDCl3): δ = 7.92 (2Η, d, J = 8.2 Hz, HAΓ), 7.65 (4H, d, J= 7.5 Hz, HA1), 7.38-7.12 (13H, m, HA1), 6.19 (IH, d, J= 9.1 Hz, CH), 6.03-5.92 (2Η, m, NH + CH=CH2 anyi), 5.39 (IH, d, J = 15.5 Hz, CH=CiT2***.), 5.25 (1Η, d, J = 9.2 Hz, CH=CH2cκ), 4.78 (2Η, d, J = 5.7 Hz, OCH2 aUyl); 3.85-3.65 ppm (2Η, m, OCH2 ), 3.48 (2Η, s, CH2 ), 2.58-2.77 (2Η, m, SCH2), 1.02 ppm (9Η, s, CH(CHj)3 ); 13C RMN (CDCl3): δ = 170.5, 166.1, 144.4, 135.9 (6C), 134.7, 133.8, 133.7, 132.5, 130.4, 130.2, 129.6 (2C), 129.5 (2C), 128.1, 128.0 (6C), 126.8, 118.7, 66.0, 63.6, 56.9, 44.0, 34.4, 27.2, 19.6 ppm.
Composé (h) : Le composé (g) (491 mg, 0.79 mmol) est dissous dans 1,5 mL de THF et refroidi à 0 0C sous atmosphère d'argon. Une solution 1.0 M de TBAF dans le THF est ensuite introduite à 0 0C (1,5 mL, 1,57 mmol) et le mélange est agité à température ambiante pendant 1 heure. Après évaporation du solvant, le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (CH2Cl2ZAcOEt : 1/1 v/v) donnant le composé (h) sous la forme d'un solide blanc (274 mg, 90 %).
R/ = 0.33 (CH2Cl2/Ac0Et : 1/1 v/v) ; 1R RMN (CDCl3): δ = 8.00 (2H, d, J = 8.0 Hz, HAT), 7.45-7.25 (7H, m, HA1), 6.33 (IH, d, J= 8.7 Hz, CH), 6.35 (IH, d, J= 8.7 Hz, NH), 6.06-5.96 (IH, m, CH=CH2), 5.39 (IH, d, J= 15.5 Hz, CH=CH2frΩm), 5.28 (1Η, d, J = 9.2 Hz, CH=CH2cκ), 4.80 (2Η, d, J = 5.4 Hz, OCH2auyi), 3.76-3.55 (4H, m + d, OCH2 + CH2 ), 2.54 (2Η, t, J= 5.8 Hz, SCH2 ), 1.97 ppm (1Η, s brd, OH); 13C RMN (CDCl3): δ = 170.6, 165.8, 143.9, 134.6, 132.2, 130.0 (2C), 129.8, 129.7 (2C), 129.2 (2C), 127.7, 126.8 (2C), 118.5, 65.8, 62.2, 55.6, 43.9, 32.9 ppm.
Composé (i) : Le composé (i) (200 mg, 0,52 mmol.) est dissous dans 5 mL d'acétonitrile anhydre. A cette solution est ajouté la triéthylamine (145 μL, 1,04 mmol) et le carbonate de disuccinimidyle (160 mg, 0,62 mmol) sous atmosphère d'argon et à température ambiante. Après 2 heures d'agitation, la réaction ne montre plus d'évolution.
Le solvant est évaporé et le brut directement purifié par chromatographie sur gel de silice
(CH2Cl2/ AcOEt : 95/5 v/v) donnant le composé (i) sous la forme d'un solide blanc (153 mg, 56 %).
R/ = 0.65 (CH2Cl2/Ac0Et : 8/2 v/v) ; 1U RMN (CDCl3): δ = 8.01 (2H, d, J = 8.5 Hz HAT), 7.40-7.26 (7H, m, H^ + chloroform), 6.37 (2H, d, J = 8.2 Hz, CH + NH), 6.08-5.95 (1Η, m, CH=CH2), 5.40 (IH, d, J = 15.5 Hz, CH=CH2frΩM), 5.28 (1Η, d, J = 9.2 Hz, CH=CH2cκ), 4.82 (2Η, d, J= 5.6 Hz, OCH2aU≠), 4.51-4.36 (2H, m, OCH2 ), 3.65 (2Η, s, CH2 ), 3.00-2.86 (6Η, m + s, SCH2 + CH2-CH2 NHS); 13C RMN (CDCl3): δ = 170.8, 168.8, 165.8, 151.6, 143.2, 134.4, 132.2, 130.3 (2C), 130.0 (2C), 129.7, 129.4 (2C), 127.7, 126.7, 126.6 (2C), 118.5, 69.2, 65.8, 56.4, 43.7, 30.1, 25.6 (2C) ppm; MS (ESI, mode positif): m/z 526.93 [M + H]+, 1052.67 [2M + H]+, 1074.80 [2M + Na]+, 1069.73 [2M + H2O]+, masse calculée pour C2OH2ON2OsS 526.57.
Composé (j) : Le sel de sodium de la 7-hydroxycoumarine (40 mg, 0,21 mmol) est mis en suspension dans l'acétonitrile anhydre (3 mL) à température ambiante sous atmosphère d'argon. Le composé (i) (114 mg, 0,21 mmol) dilué dans l'acétonitrile anhydre (2 mL) est directement ajouté à la suspension précédente. Après 1 heure 30 minutes, le solvant est évaporé puis le résidu extrait à l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée à l'eau osmosée, filtrée, séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée sous vide. Le solide obtenu est trituré dans l'éther diéthylique puis filtré pour donner un solide blanc (100 mg, 83 %).
R/ = 0.77 (CH2Cl2/Ac0Et : 8/2 v/v) ; 1H RMN (CDCl3): δ = 8.00 (2H, d, J = 8.6 Hz, HAΓ), 7.70 (IH, d, J= 9.3 Hz, HA1), 7.50 (IH, d, J= 8.6 Hz, HA1), 7.41-7.23 (8H, m,
HA, + chloroform), 7.14 (IH, d, J= 8.4 Hz, HA,), 6.41 (2H, d + d, CH + Hcoum), 6.11-6.39
(2Η, m + d, CH=CH2 + NH), 5.42 (1Η, d, J = 17 Hz, CH=CiT2***.), 5.28 (1Η, d, J = 10.4
Hz,
Figure imgf000047_0001
4.81 (2H, d, J= 4.4 Hz, OCH2aU≠), 4.55-4.32 (2H, m, OCH2 ), 3.66 (2Η, s, CH2 ), 3.00-2.75 (2Η, m, SCH2); 13C RMN (CDCl3): δ = 170.6, 165.7, 160.3, 154.7, 153.3, 152.7, 143.3, 142.9, 134.3, 132.1, 130.2 (2C), 129.4 (2C), 129.3 (2C), 128.8, 127.8,
126.6 (2C), 118.5, 117.8, 116.9, 116.4, 110.0, 67.5, 65.8, 56.3, 43.8, 30.1 ppm; MS (ESI, mode positif): m/z 590.80 [M + H2O]+, 1163.93 [2M + H2O]+, masse calculée pour
Figure imgf000047_0002
Obtention de la sonde (k)
Sonde (k): PhAc-ThAEC-Coumarine (ThAEC pour thioaminalethoxycarbonyl)
Le compose (j) (50 mg, 87 μmol) et le palladium tétrakis(triphénylphosphine)
(5 mg, 8.7 μmol) sont dissous dans le dichlorométhane anhydre sous atmosphère d'argon. Après 10 minutes d'agitation, la benzylamine (20 μL, 174 μmol) et la 5,5- diméthylcyclohexa-l,3-dione (dimédone, 37 mg, 261 μmol) sont simultanément ajoutés en solution dans le dichlorométhane anhydre (1 mL) à température ambiante. Un suivi de la réaction est effectué par CLHP en phase inverse (système A). Après 7 heures, le mélange réactionnel est évaporé à sec, repris dans 400 μL de DMF et dilué avec un mélange CH3CN/TFA0,l % dans l'eau : 1/1 v/v.. La solution obtenue est ensuite purifiée par CLHP semi-préparative en phase inverse (système B). Les fractions collectées sont lyophilisées pour donner 21 mg de produit attendu avec une pureté de 80 %. Une seconde purification CLHP dans les mêmes conditions donne la sonde (k) avec une pureté de 92 % (15 mg, rendement global : 33 %).
1U RMN (acétone-de): δ = 8.32 (IH, d, J = 9.5 Hz, NH), 8.05 (2H, d, J = 8.3 Hz, HA,), 7.70 (IH, d, J = 9.3 Hz, HA,), 7.62 (IH, d, J = 8.6 Hz, HA1), 7.38-7.20 (10H, m,
HAΓ), 6.53 (IH, d, J = 9.5 Hz, CH), 6.42 (1Η, d, J = 9.7 Hz, Hcoum), 4.58-4.35 (2Η, m,
OCH2), 3.67 (2Η, dd, J = 16.0 Hz, CH2 ), 3.06-2.85 ppm (2Η, m, SCH2); 13C RMN
(acétone-de): δ = 171.0, 160.3, 155.6, 154.4, 153.6, 145.3, 144.0, 136.9, 131.0, 130.7 (2C),
130.1 (2C), 129.2 (2C), 128.1, 127.8 (2C), 127.5, 118.6, 117.9, 116.8, 110.5, 68.4, 56.2, 43.5 (2C) ppm; ΗPLC (system Al) : tR = 31.0 min (pureté: 92.6%); UV : Vax 237, 268,
307 nm; MS (ESI, mode négatif): m/z 532.07 [M - H]", 1064.93 [2M - H]", MS (ESI, mode positif): m/z 550.93 [M + H2O]+, 1083.80 [2M + H2O]+, masse calculée pour C28H23NO8S
533.56.
Exemple IX : Test de clivage de la sonde (k) par l'amidase de pénicilline
Une solution du composé (k) (1.0 mg/mL) dans un mélange d'acétone (10 % vol.) et de tampon PBS (100 mM phosphate et 150 mM NaCl, pH = 7.50) a été préparée puis diluée 500 fois à l'aide du tampon PBS. 3 mL de cette solution (3.7 μM) sont transférés dans une cuve de fluorescence (Varian Fluorescence CeIl 10 mm Open Top) puis 14 mg d'amidase de pénicilline G (0,63 unité/mg) sont ajoutés dans la cuve de mesure et le mélange incubé à 37 0C. La fluorescence de la 7-hydroxycoumarine libérée par la réaction d'hydrolyse enzymatique est mesurée à 460 nm (AEX = 360 nm) en fonction du temps. La même procédure est utilisée pour la mesure de l'hydrolyse non-spécifique, mais sans l'ajout d'amidase Comme attendu, une augmentation rapide de la fluorescence à 460 nm est observée (Fig.10). Une mesure similaire réalisée dans les mêmes conditions de tampon mais en absence d'enzyme montre également une faible augmentation de l'émission de fluorescence à 460 nm. Elle est due à l'hydrolyse non-spécifique de la sonde (k) qui s'élève à environ 20 % au bout de 1 heure, alors que la coupure enzymatique est totale au bout de 15 minutes. (Fig.10).
Les courbes de la figure 10 montrent un bon fonctionnement du bras réactif libérant la 7-hydroxycoumarine très rapidement (maximum de fluorescence atteint au bout de 15 minutes). L'hydrolyse non spécifique observée traduit une stabilité modérée de la sonde (k) en milieu aqueux.
En outre, des expériences complémentaires ont montré que dans le tampon PBS, le temps de demi- vie d'une sonde comportant un bras réactif de formule (Hi) dans laquelle m représente 3, augmentait.
LISTE DE SEQUENCES
SEQ ID NO: 1 : WEHD SEQ ID NO:2 : YVAD SEQ ID NO:3 : LEHD
SEQ ID NO: 4 DETD SEQ ID NO: 5 DEVD SEQ ID NO: 6 DEHD SEQ ID NO: 7 VEHD SEQ ID NO: 8 LETD SEQ ID NO: 9 LEHD
SEQIDNO: 10 : SHVD SEQ ID NO: 11 : DELD SEQ ID NO: 12 : DGPD SEQIDNO: 13 : DEPD SEQ ID NO: 14 : DGTD SEQIDNO: 15 : DLND SEQIDNO: 16 : DEED SEQIDNO: 17 : DSLD SEQIDNO: 18 : DVPD SEQIDNO: 19 : DEAD SEQ ID NO: 20 : DSYD SEQ ID NO: 21 : ELPD SEQ ID NO: 26 : VEID SEQ ID NO: 24 : IETD

Claims

REVENDICATIONS
1. Composé pro-fluorescent de formule générale (I) :
A-B-X-F (I) dans laquelle : - A figure une structure labile activable par un phénomène physique, chimique ou biologique,
B figure un bras réactif, activable par libération de A et apte à générer un radical portant un substituant nucléophile, éventuellement anionique, ledit radical étant apte à subir un réarrangement intramoléculaire conduisant à la libération de F, - X figure un atome de soufre, d'oxygène, un motif OC(O), OC(O)O, OS(O) ou OP(O),
F figure un radical fluorophore compatible avec l'établissement d'une liaison éther, thioéther, ester, carbonate, sulfate, sulfinate, sulfonate, phosphate, phosphonate, phosphinate ou aminophosphonate avec B via le motif X et étant tel que le spectre d'émission et/ou d'excitation de F lié à B est décalé relativement au spectre d'émission et/ou d'excitation de F libre,
B étant choisi parmi les radicaux de formules générales (lia), (Hb), (Ile), (Hd), (Ile), (Hf) et (Hg) suivantes :
Figure imgf000051_0001
(lia)
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000052_0002
(Md)
(Ile)
Figure imgf000052_0003
(iig) dans lesquelles :
Y représente O, NH ou S,
R1 et R2, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical alkyle en Ci -C3, un radical alcoxy en Ci-C3 ou un groupe carboxyle ou carboxylate,
R3 et R4, indépendamment l'un de l'autre, peuvent représenter H, un radical alkyle en Ci -C5, un radical alcoxy en Ci -C5 ou un radical électro-attracteur ou électro-donneur tel qu'un groupe ester, nitrile, nitro, éther, aminé, ou amide, n est égal à 1 ou 2, p représente 0 ou 1 , -* symbolise une liaison vers A, et -a symbolise une liaison vers X, L représente
-S-(CH2)
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000053_0002
avec m représentant 1, 2, 3 ou 4, ou un de ses dérivés.
2. Composé selon la revendication 1, dans lequel le phénomène biologique fait intervenir l'action d'une entité biologique.
3. Composé selon la revendication 2, dans lequel l'entité biologique est une enzyme, notamment une hydrolase.
4. Composé selon la revendication 3, dans lequel l'enzyme est une protéase à cystéine aspartyle spécifique (caspase).
5. Composé selon la revendication 4, dans lequel la protéase est une caspase- 3.
6. Composé selon l'une quelconque des revendications 3 à 5, dans lequel A représente un substrat peptidique, ledit substrat peptidique comprenant optionnellement un ou plusieurs acides aminés naturels, modifiés ou non, ou synthétiques.
7. Composé selon l'une quelconque des revendications 3 à 6, dans lequel A représente un tétrapeptide choisi parmi WEHD (SEQ ID NO: 1), YVAD (SEQ ID NO:2), LEHD (SEQ ID NO:3), DETD (SEQ ID NO: 4), DEVD (SEQ ID NO: 5), DEHD (SEQ ID NO: 6), VEHD (SEQ ID NO: 7), LETD (SEQ ID NO: 8), LEHD (SEQ ID NO: 9), SHVD (SEQ ID NO: 10), DELD (SEQ ID NO: 11), DGPD (SEQ ID NO: 12), DEPD (SEQ ID NO: 13), DGTD (SEQ ID NO: 14), DLND (SEQ ID NO: 15), DEED (SEQ ID NO: 16), DSLD (SEQ ID NO: 17), DVPD (SEQ ID NO: 18), DEAD (SEQ ID NO: 19), DSYD (SEQ ID NO: 20), ELPD (SEQ ID NO: 21), VEID (SEQ ID NO: 26) ou IETD (SEQ ID NO: 24).
8. Composé selon la revendication précédente, dans lequel le tétrapeptide est modifié par addition d'un radical acétyle à l'extrémité N-terminale.
9. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel B-X est choisi parmi les radicaux de formules (HIa), (HIb), (HIc), (HId), (HIe), CIIIf), (HIg) et (UIh) suivantes :
Figure imgf000054_0001
(MIa) (MIb)
Figure imgf000054_0002
(MIc) (MId)
Figure imgf000054_0003
ClIlQ) et (MIh)
dans lesquelles :
-* a la même signification qu'en revendication 1,
- @ symbolise la liaison vers F, et
- n égal 1 ou 2.
10. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel B-X représente un radical de formule (HIa), (HIb) et (HIc).
11. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel F représente un radical issu d'un fluorophore choisi parmi les hydroxynaphtalènes, les hydroxypyrènes, l'acridine et ses dérivés tels que les hydroxyacridines, la 9-méthylacridine, la 7-hydroxy-9H(l,3-dichloro-9,9-diméthylacridin-2-one) (DDAO), et la 7-hydroxy-9H-(9,9-diméthylacridin-2-one) (DAO), la coumarine et ses dérivés tel que la 7-hydroxycoumarine, les hydroxystilbènes, le furane, l'oxazole, l'oxadiazole, le nitrobenzoxadiazole et ses dérivés tels que les hydroxynitrobenzoxadiazoles, l'indole et ses dérivés, les benzoindoles, le benzopyrane et ses dérivés (chromène et dérivés), le benzothiazole et ses dérivés, la phénoxazine et ses dérivés, les benzophénoxazines (crésyl violet, NiIe red, NiIe blue, ...), la fluorescéine et ses dérivés , les rhodols et leurs dérivés, l'éosine et ses dérivés, l'érythrosine et ses dérivés tels que les hydroxyérythrosines, la résorufïne et ses dérivés tels que les hydroxyrésorufïnes, la quinoléine et ses dérivés tels que la 6-hydroxy quinoléine, les hydroxyaryl 4-(3H)-quinazolinones, les cyanines fluorescentes et dérivés telles que les hydroxycyanines, et des fluorophores à chaîne polyméthine (Le., chaîne polyènique).
12. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel F représente un radical issu d'un fluorophore choisi parmi la DDAO, la DAO, la 7-hydroxycoumarine et la résorufine.
13. Composé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel :
A représente Ac-DEVD, dans lequel Ac est un radical acétyle,
B-X représente un motif de formule (HIa) ou (HIb),
F est choisi parmi un radical issu de la 7-hydroxycoumarine et un radical issu de la DAO.
14. Utilisation d'un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications précédentes pour la préparation d'une composition pharmaceutique et/ou de diagnostic.
15. Utilisation d'un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour la détection et/ou la quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique.
16. Utilisation selon la revendication précédente dans laquelle le phénomène biologique fait intervenir l'action d'une entité biologique.
17. Utilisation selon la revendication précédente, dans laquelle l'entité biologique est une enzyme.
18. Composition pharmaceutique et/ou de diagnostic comprenant au moins une quantité efficace d'au moins un composé tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
19. Procédé de détection et/ou de quantification d'un phénomène physique, chimique ou biologique, in vitro ou ex vivo, comprenant au moins les étapes de : a) mettre en contact, avec un milieu apte à la manifestation dudit phénomène, un composé pro-fluorescent tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 dans des conditions appropriées à la libération de la structure labile activable A, et b) détecter la présence ou l'absence d'un signal de fluorescence de F.
20. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel le phénomène biologique est une activité enzymatique.
21. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel l'activité enzymatique est celle d'une protéase à cystéine.
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, dans lequel la détection d'un signal de fluorescence de F est indicatif d'une réponse cellulaire, notamment une apoptose.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 19 à 22, dans lequel le milieu est représenté par des cellules neuronales.
24. Kit de diagnostic comprenant au moins un composé pro-fluorescent tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
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