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WO2008081111A1 - OLIGO- β(1→3)-GLUCANES A EFFET INHIBITEUR DES REACTIONS ALLERGIQUES, ET APPLICATIONS - Google Patents

OLIGO- β(1→3)-GLUCANES A EFFET INHIBITEUR DES REACTIONS ALLERGIQUES, ET APPLICATIONS Download PDF

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Publication number
WO2008081111A1
WO2008081111A1 PCT/FR2007/001996 FR2007001996W WO2008081111A1 WO 2008081111 A1 WO2008081111 A1 WO 2008081111A1 FR 2007001996 W FR2007001996 W FR 2007001996W WO 2008081111 A1 WO2008081111 A1 WO 2008081111A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
oligo
glucan
use according
allergies
glucans
Prior art date
Application number
PCT/FR2007/001996
Other languages
English (en)
Other versions
WO2008081111A8 (fr
Inventor
Michel François DEGRE
Vincent Bulone
Linda Dombrowsky
Original Assignee
Bio Serae Laboratoires Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Serae Laboratoires Sa filed Critical Bio Serae Laboratoires Sa
Publication of WO2008081111A1 publication Critical patent/WO2008081111A1/fr
Publication of WO2008081111A8 publication Critical patent/WO2008081111A8/fr

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K31/716—Glucans
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents

Definitions

  • the invention relates to the field of curative preventive and / or palliative treatments for allergies. It relates more particularly to compositions, such as a medicament, a food supplement and / or a medicament, for preventing and / or blocking allergic reactions.
  • allergens a hypersensitivity reaction of the body to different substances, called allergens, which are present either naturally in the surrounding environment (pollen, venom, insect droppings, animal dander .. .) artificially as a result of human activities (industrial pollutants, chemical products, processed foods, medicines, etc.).
  • allergens include allergens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, antigens, which are present either naturally in the surrounding environment (pollen, venom, insect droppings, animal dander .. .) artificially as a result of human activities (industrial pollutants, chemical products, processed foods, medicines, etc.).
  • allergens class E immunoglobulins
  • An abnormally high total serum IgE titre in an individual constitutes an allergic state index which, on the occasion of a second revealing contact with the initial allergen concerned, will be confirmed by more or less violent clinical manifestations (asthma , conjunctivitis, rhinitis, sinusitis, alveolitis, urticaria, eczema, edema, anaphylactic shock ...), the nature and severity of which depend essentially on the type of allergy and the allergen involved.
  • allergies all reflect a pathological condition that, at the cellular and molecular level, is closely related to the presence and activity of IgE.
  • the already formed IgE bind to the allergen according to an antigen-antibody reaction.
  • This allergen-antibody complex binds to the membrane receptors of basophils and mast cells and causes their degranulation with massive release of allergenic mediators responsible for clinical manifestations of allergy.
  • Desensitization, or specific immunotherapy (also known as allergenic vaccine therapy), consists in regularly administering to the patient, subcutaneously or sublingually, extracts of the allergenic substance at regularly increasing doses. It takes place in two phases:
  • the doctor may prescribe a specific treatment protocol.
  • a wide range of drugs sodium cromoglycate, glucocorticoids methyl xanthines, ⁇ -adrenergic agonists, antihistamines .
  • the efficacy of these medications is well established, but their repeated administration may be accompanied by adverse effects (sodium cromoglycate: irritation of the throat, unpleasant taste, nausea, coughing or wheezing). ..
  • glucocorticoids cutaneous atrophy, inhibition of cell multiplication, delayed healing, depigmentation, risk of systemic passage through topical application ...
  • methyl-xanthines anorexia, nausea, epigastric pain (teratogenicity observed in mice).
  • ⁇ -adrenergic agonists tachycardia, palpitations, tremor, sweating, and exceptionally pulmonary edema, myocardial ischemia, cardiac arrhythmias .
  • the aim of the invention is to propose a new approach for the treatment of allergy which can be applied in general to all types of allergies.
  • the invention aims to propose new active agents that can intervene on the cellular and / or molecular mechanisms involved in the establishment of the allergic reaction, in general.
  • the invention is aimed primarily at preventing, attenuating or even blocking allergic reactions, in particular by at least partially inhibiting the release and / or the effects of the reactive mediators.
  • the invention aims to provide active agents capable of attenuating or even blocking the synthesis of IgE reaginic agents and / or the effects of these IgE reagins, especially with respect to degranulation of mast cells.
  • the invention also aims to propose a particular use of these active agents for the preparation of a drug, a food supplement and / or a foodstuff, whose point or regular administration has no toxic effect.
  • the invention relates to the use of at least one ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharide comprising a main chain of degree of polymerization of 3 to 6, called oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan, for the preparation of a composition for treating allergy.
  • a composition prepared according to the invention may consist of a food supplement and / or a food.
  • the invention may then be defined as a process for preparing a medicament for treating allergy, wherein at least one ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharide comprising a main chain of degree of polymerization of 3 to 6, called oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan.
  • the total amount of ⁇ (1- ⁇ ) -glucan (s) oligo (s) used to prepare said composition is chosen to allow at least a significant inhibition of the synthesis of IgE reaginic, in the subject, after administration.
  • said composition is intended for the treatment of allergies of the type chosen from: respiratory allergies, contact allergies, food allergies, drug allergies, venom allergies.
  • said composition is intended to prevent allergic reactions.
  • said composition is adapted to be able to attenuate the synthesis and / or the reaginic effects of IgE.
  • the inventors have demonstrated that linear or branched ⁇ (1- ⁇ ) -glucan oligosaccharides, whose main chain has a degree of polymerization equal to 3, 4, 5 or 6, have a significant efficiency to moderate or to inhibit, the immune mechanisms involved in triggering allergic reactions, including anaphylactic shocks.
  • IgA immunoglobulins
  • IFN ⁇ interferon ⁇
  • CD4-Th1 and CD8 which antagonizes interleukin-4 (IL-4) by inhibiting IgE production and related allergic reactions.
  • interleukin-10 interleukin-10
  • IL-10 interleukin-10
  • Th1 and Th2 B lymphocytes and monocytes
  • B lymphocytes and monocytes which induces the terminal differentiation of plasma cells and stimulates the synthesis of class G (IgG) and A (IgA) immunoglobulins.
  • IgG interleukin-10
  • IgA immunoglobulins
  • linear oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans are advantageously used.
  • Branched oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans can also be used; in particular oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans with a molecular weight of less than 2,000 Da, comprising at least one ⁇ (1 ⁇ 6) branching.
  • the linear (s) and / or branched (s) oligo- ⁇ (1- ⁇ ) -glucan (s) used in the context of the invention are soluble in an aqueous medium. especially a physiological liquid.
  • the low degree of polymerization and possible branching of the oligo- ⁇ (1- ⁇ ) glucans contemplated by the invention advantageously condition their solubility in water and in physiological fluids, as well as their biological activities on the various components of the immune system.
  • the oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans targeted by the invention can be prepared from ⁇ -glucans of high molecular weight ⁇ chain (1 ⁇ 3), optionally branched ⁇ (1 ⁇ 6 ⁇ ).
  • these high molecular weight ⁇ -glucans can be digested with enzymes with ⁇ (1 ⁇ 3) -glucanase and ⁇ (1-6) -glucanase activity, and / or acid hydrolysis. (for example, hot hydrolysis with formic acid).
  • oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans previously prepared from ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan polymers originating from a source chosen from: the yeast, oat bran, curdlan.
  • the anti-allergy composition prepared according to the invention is intended to be administered orally, in the form of an oral medication, a food supplement, or a medicament.
  • an orally administered composition (especially when it is an oral drug or a food supplement) can be carried out in galenic forms and in very diverse formulations: form of a mixture of solid and divided particles, for example an effervescent or non-effervescent powder, the setting of which requires it to be mixed with water, in the form of an effervescent tablet or not, to be swallowed with a little water, to suck or chew,
  • form of a mixture of solid and divided particles for example an effervescent or non-effervescent powder, the setting of which requires it to be mixed with water, in the form of an effervescent tablet or not, to be swallowed with a little water, to suck or chew
  • an orally administered composition prepared according to the invention advantageously consists of a food, that is to say a food composition, solid and / or liquid, which incorporates at least one oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan targeted by the invention, in an effective amount.
  • the anti-allergy composition prepared according to the invention is advantageously adapted to be administered topically (for example, in the form of a cream, a gel. ..).
  • a composition prepared according to the invention may require the addition of additives and / or excipients of a pharmaceutical or food order, traditional.
  • additives and / or excipients are, for example, binders, lubricants, sweeteners, diluents, excipients, effervescent agents, coating agents. ...
  • the invention also relates to the use of oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans targeted by the invention for the preparation of compositions for oral administration, intended to prevent and / or to attenuate allergic reactions, as well as a method of preventive and / or palliative treatment of allergic reactions, in which the subject, punctually or repeatedly, is administered an effective amount of oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan (s), characterized in combination by all or some of the features mentioned above or below.
  • ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharides may be prepared from ⁇ -glucans of high molecular weight.
  • JP 2005/110675, WO 99/52920 we can mention JP 2005/110675, WO 99/52920.
  • ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharides studied by the inventors were obtained by extractions and fractionations made from various commercial products available in agro-food industries such as bacterial curdlan, yeasts and oat bran.
  • curdlan of bacterial origin consisting of homopolymers of glucose, of chain, is used.
  • main ⁇ (1 ⁇ 3) linear and high degree of polymerization.
  • Curdlan is available in commercially purified form.
  • Purification steps, prior to the hydrolysis step of these homopolymers, may be necessary to remove salts and other small molecules that may be present in the commercial product.
  • dialysis against water of the product in solution in dimethylsulfoxide (DMSO) can be carried out.
  • the first process is based on enzymatic hydrolysis.
  • the enzymatic system chosen is a mixture of ⁇ (1 ⁇ 3) -glucanase and ⁇ (1-6) -glucanase, marketed under the name
  • GLUCANEX NOVO-Nordisk
  • This enzymatic system has been selected for its ⁇ (1-3) -glucanase activity.
  • Curdlan is subjected to enzymatic hydrolysis in the presence of GLUCANEX, in an aqueous medium at a pH of about 4 and at a temperature of about 40 ° C.
  • the enzyme concentration is 2 units per 50 mg of curdlan .
  • the hydrolysis reaction is carried out in a concentration cell allowing the continuous extraction of the oligosaccharides formed by ultrafiltration on a membrane of 10,000 Da at a pressure of 1.5 bars.
  • the liberated oligosaccharides are then separated by steric exclusion chromatography making it possible to obtain five fractions of oligo- ⁇ (1- ⁇ ) -glucans, denoted I-A to I-F and listed in Table 1 below.
  • the operating conditions of this steric exclusion chromatography are as follows: the steric exclusion column used is a Bio-Gel P2 column (210 ⁇ 1.5 cm, 100-180 Da cutoff), the eluent is distilled water, the flow is 40 ml. min '1 , the monitoring of the elution is carried out by a RID refractometer
  • the amount of sample injected is 0.5 ml, the collected fractions are concentrated and lyophilized.
  • the second method of hydrolysis of curdlan is based on chemical hydrolysis.
  • Curdlan is subjected to hot acid hydrolysis in the presence of 50% formic acid at 100 ° C. for 2 hours.
  • the residual pellet resulting from the hydrolysis is subjected to a new treatment in the presence of formic acid (for 2 hours at 100 ° C.).
  • the supernatants obtained at the end of the two successive hydrolyses are combined and dried under vacuum using a rotary evaporator.
  • hydrolysates are solubilized in distilled water. The whole is boiled for 3 hours to remove the formyl substituents. The deformylated oligosaccharides are then washed and dried by evaporation under vacuum.
  • the extract obtained is then fractionated by chromatography on a steric exclusion column of Bio-Gel type P2 making it possible to obtain nine fractions of ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharides. These different fractions are denoted I-A to I-I and are listed in Table 2 below. The corresponding elution profile is shown in Figure 2.
  • curdlan ⁇ -glucans provides linear ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharides with a wider range of degree of polymerization.
  • a total yeast extract is solubilized in an alkaline medium in urea (5%) in the presence of sodium hydroxide at 4 ° C. for 12 hours.
  • This step aims to extract branched ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans in ⁇ (1-6).
  • the urea / NaOH insoluble fraction is removed.
  • This fraction is composed mainly of non-polysaccharide solutes, such as salts and proteins.
  • the solution is then treated with acetic acid to remove the remaining soluble non-parietal compounds.
  • acetic acid causes the precipitation of ⁇ (l-> 3) -glucans branched in ⁇ (1-6), in the form of a gel.
  • the last soluble compounds are removed by dialysis. Fine ultrafiltration or nanofiltration can also be used for this purpose.
  • the ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans branched to ⁇ (1 ⁇ 6) thus purified are subsequently freeze-dried and then subjected to hot acid hydrolysis in the presence of 50% formic acid at 100 ° C. for 2 hours. .
  • the supernatant recovered by centrifugation is evaporated under vacuum and boiled for 3 hours to remove the formic acid.
  • hydrolysates are solubilized in distilled water and boiled for 3 hours to remove the formyl substituents.
  • the deformylated oligosaccharides are then washed and dried by evaporation under vacuum.
  • the extract obtained is then fractionated by chromatography on a steric exclusion column of Bio-Gel type P2 making it possible to obtain eight fractions of ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharides, optionally branched to ⁇ (1 -6). , denoted HA to HH and listed in Table 3 below.
  • the corresponding elution profile is shown in Figure 3.
  • the ⁇ -glucan polymers of oat bran are linear polymers with ⁇ (1 ⁇ 3) and ⁇ (1 ⁇ 4) bonds.
  • the extraction process of these polymers is based on the protocol developed by Aspinall and Carpenter (Aspinall G.O. and Carpenter R.C .: Carbohydrate Polymers (1984) 4: 271-282). It made it possible to isolate two fractions of polymers ⁇ (1 ⁇ 3), (1 ⁇ 4) -glucans; one comprises polymers soluble in DMSO, and the other, polymers soluble in water after an action of an ⁇ -amylase for the hydrolysis of starch.
  • the polymers of this latter fraction are degraded by an enzymatic process to facilitate the purification of ⁇ (1 ⁇ 3), (1 ⁇ 4) -glucans.
  • the different solubility properties of the polymers of these fractions are related to their ⁇ (1 ⁇ 3) -glucose / ⁇ (1-4) -glucose ratio.
  • This purification process made it possible to obtain a production yield of 7% for soluble ⁇ (I-> 3), (1 ⁇ 4) -glucans in DMSO and a production yield of 2.5% for ⁇ (1-3), (1-4) -glucans soluble in water.
  • the oat bran Prior to the treatment of the starch, the oat bran is extracted with water / ethanol (1: 9) at 100 ° C. for 14 hours.
  • the hydroalcoholic extract is lyophilized and then subjected to enzymatic hydrolysis in the presence of ⁇ -amylase in order to degrade the starch.
  • the mixture is subjected to centrifugation giving rise to an insoluble fraction (pellet) and a soluble fraction (supernatant).
  • the insoluble fraction is washed in the presence of water and dissolved in DMSO.
  • the supernatant obtained after centrifugation is dialyzed and lyophilized.
  • the treatment of this insoluble fraction gives rise to the fraction of ⁇ (1 ⁇ 3), (1 ⁇ 4) -glucans soluble in DMSO with a yield of 7% oat bran.
  • the fraction of soluble ⁇ (1-> 3), (1-4) -glucans obtained after degradation of the starch undergoes heat treatment at 100 ° C. for 1 hour.
  • the supernatant obtained after centrifugation is subsequently dialyzed and freeze-dried.
  • the dried extract is treated in the presence of 20% of ammonium sulfate (NHi) 2 SO 4 in order to precipitate the ⁇ -glucans and the pellet obtained after centrifugation is dialyzed in the presence of water and then freeze-dried.
  • NHi ammonium sulfate
  • the extract obtained from the fraction of ⁇ (1 ⁇ 3), (1 ⁇ 4) -glucans soluble in water is then fractionated by steric exclusion HPLC making it possible to obtain four fractions of ⁇ -oligosaccharides. glucan.
  • the combination of enzymatic hydrolysis and chemical hydrolysis is carried out on purified curdlan.
  • the acid hydrolysis is carried out using a 50% formic acid solution at 100 ° C. (30 ml for 50 mg of curdlan) for 1 hour. A single treatment cycle under reflux and stirring is applied.
  • the supernatant is then recovered by centrifugation, evaporated in vacuo and boiled for 3 hours to remove formic acid.
  • the extract obtained is then subjected to enzymatic hydrolysis with GLUCANEX (2 units per 50 mg of curdlan) at pH 4 and 40 ° C. for 30 minutes.
  • the enzymatic reaction is carried out in a concentration cell on a 10,000 Da membrane at a pressure of 1.5 bar.
  • the extract obtained is concentrated and fractionated by steric exclusion HPLC making it possible to obtain nine fractions of oligo- ⁇ -glucans.
  • the oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans according to the invention have the property of modulating the synthesis of the different classes of immunoglobulins.
  • the leucocytes suspended in complete RPMI medium, are divided into several series of tubes of 1 ml volume, at a rate of 150,000 cells per tube.
  • Leukocytes are cultured in the presence of interleukin-4 (11-4), at 20 ng / ml.
  • IL-4 produced by T lymphocytes, is a growth factor of lymphocytes, basophils and mast cells.
  • IL-4 plays a major role in inducing IgE production by plasma cells.
  • Each culture tube also receives 10 ⁇ g of one of the ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharide fractions previously prepared.
  • the leucocytes are thus cultured for 13 days at 37 ° C.
  • the total leucocyte secreted IgE assay in the culture supernatant medium of each series is performed by a sandwich immunoenzymatic technique employing labeled anti-human IgE antibodies.
  • ⁇ -glucan fractions IB, IC, ID, HE, HF, HG, IV -E; IV-F, IV-G and VE are characterized by a reducing activity of IgE synthesis in human leukocytes cultured in the presence of IL-4.
  • the series of culture tubes for IgA titration receive 10 ⁇ g of one of the ⁇ (1- ⁇ ) -glucan preparations, and are cultured for 13 days at 37 ° C.
  • the total IgA assay in culture supernatants is performed by a sandwich immunoenzymatic technique employing labeled anti-human IgA antibodies.
  • the other fractions according to the invention do not modify the natural rate of synthesis of IgA by leukocyte cells.
  • fractions of ⁇ (1 ⁇ 3) -glucan oligosaccharides previously prepared, and referenced IB, IC, HF, II-G and VE, are therefore characterized by the fact that they possess on the human leucocyte cells a double selective activity which depresses neo-synthesis of IgE-class immunoglobulins and stimulates neosynthesis of IgA-class immunoglobulins.
  • IL-10 mammalian immune system
  • IL-10 is an anti-inflammatory cytokine produced in humans by Th-I and Th-2 lymphocytes, by B-lymphocytes and monocytes; it induces the terminal differentiation of plasma cells and stimulates the synthesis of immunoglobulins G,
  • IFN ⁇ gamma interferon
  • oligo- ⁇ -glucans The action of oligo- ⁇ -glucans on the respective productions of IL-10 and IFN ⁇ is evaluated according to the methodology described above on human leukocyte cultures in RPMI medium supplemented with 10 ⁇ g of phyto-hemagglutinin (PHA).
  • PHA phyto-hemagglutinin
  • the quantities of cytokines produced in the culture media are evaluated by sandwich enzyme immunoassays using labeled anti-IL-10 and anti-IFN ⁇ antibodies.
  • I-B 10 52 ⁇ 1 425 ⁇ 12 ND 723 ⁇ 12
  • I-B 1 70 + 9 320 ⁇ 52 ND 690 ⁇ 15
  • I-B 0.1 42 ⁇ 1 360 ⁇ 51 ND 673 ⁇ 51
  • I-C 0.1 40 ⁇ 2 370 ⁇ 32 ND 681 ⁇ 38
  • H-F 1 37 ⁇ 2 360 ⁇ 8 ND 652 ⁇ 20
  • H-G 1 40 ⁇ 1 612 ⁇ 75 ⁇ ND 853 ⁇ 52 ⁇ II-G: 0.1 38 ⁇ 3 401 ⁇ 25 ND 685 ⁇ 12
  • V-E 10 31 ⁇ 10 378 ⁇ 35 ND 661 ⁇ 12
  • V-E 1 32 ⁇ 7,360 ⁇ 17 ND 670 ⁇ 20
  • V-E 0.1 32 ⁇ 4,339 ⁇ 21 ND 673 ⁇ 17
  • oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans The activity of oligo- ⁇ (1 ⁇ 3) -glucans in the prevention of allergic conditions is evaluated in guinea pigs.
  • the animals of batch 1 receive, by oesophageal probe, a daily dose of 0.5 ml of oligo- ⁇ -glucans (I-C, H-G,) in solution at 20 mg / ml.
  • the animals in batch 2 receive 0.5 ml of isotonic water.
  • the skin prick test used to reveal a possible IgE dependent sensitization, includes a negative control and a codeine positive control.

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Abstract

L'invention relève du domaine des traitements curatifs préventifs et/ou palliatifs des allergies. Elle concerne plus particulièrement des compositions, telles qu'un médicament, un complément alimentaire et/ou un alicament, comprenant au moins un oligosaccharide β(1→3)-glucane à chaîne principale de degré de polymérisation de 3 à 6, dit oligo-β(1→3)-glucane, susceptible de prévenir et/ou de bloquer les réactions allergiques. Outre la capacité d'inhiber la synthèse des IgE réaginiques, les oligo-β( (1→3)-glucanes visés par l'invention stimulent avantageusement la libération des IgA, la sécrétion et l'activité physiologique de l'INFγ et de l'IL-10.

Description

OLIGO-β(l ->3)-GLUCANES À EFFET INHIBITEUR DES RÉACTIONS ALLERGIQUES, ET APPLICATIONS
L'invention relève du domaine des traitements curatifs préventifs et/ou palliatifs des allergies. Elle concerne plus particulièrement des compositions, telles qu'un médicament, un complément alimentaire et/ou un alicament, destinées à prévenir et/ou à bloquer les réactions allergiques.
Les changements de mode de vie intervenus au cours des trente dernières années sont responsables d'un accroissement explosif des phénomènes allergiques dans les pays industrialisés. En effet, les allergies, qui atteignaient un européen sur dix il y a vingt ans, sont en constante progression. Et, selon l'Organisation Mondiale de la Santé, elles pourraient affecter, à titres divers, près d'un européen sur deux en 2020.
L'allergie est l'expression pathologique d'une réaction d'hypersensibilité de l'organisme à différentes substances, dites allergènes, qui sont présentes soit naturellement dans le milieu environnant (pollens, venins, les déjections d'insectes, phanères animaux...) soit artificiellement à la suite des activités humaines (polluants industriels, produits chimiques, aliments transformés, médicaments...). Dans la plupart des cas, l'allergie survient lors d'un premier contact sensibilisant avec un allergène qui induit une réponse d'hypersensibilité supportées par des immunoglobulines de classe E (IgE). Un titre anormalement élevé d'IgE totale sérique chez un individu constitue un indice d'état allergique qui, à l'occasion d'un deuxième contact révélateur avec l'allergène initial concerné, sera confirmé par des manifestations cliniques plus ou moins violentes (asthme, conjonctivite, rhinites, sinusites, alvéolites, urticaire, eczéma, œdèmes, choc anaphylactique...), et dont la nature et la gravité dépendent essentiellement du type d'allergie et de l'allergène en cause.
Malgré leur grande diversité étiologique, les allergies traduisent toutes un état pathologique qui, au niveau cellulaire et moléculaire, est étroitement lié à la présence et à l'activité des IgE. Lors d'un second contact avec l'allergène, les IgE déjà formées se lient à l'allergène selon une réaction antigène- anticorps. Ce complexe al lergène- anticorps se fixe sur les récepteurs membranaires des basophiles et mastocytes et provoque leur dégranulation avec libération massive de médiateurs allergéniques responsables des manifestations cliniques de l'allergie.
Parmi les approches thérapeutiques actuellement proposées pour traiter l'allergie, la désensibilisation est considérée pour l'heure comme l'unique traitement véritablement curatif.
La désensibilisation, ou immunothérapie spécifique (on parle aussi de vaccinothérapie allergénique), consiste à administrer régulièrement au patient, par voie sous-cutanée ou sublinguale, des extraits de la substance allergisante à des doses régulièrement croissantes. Elle se déroule en deux phases :
. une phase d'accoutumance (ou d'induction), d'une durée généralement de 3 à 4 mois, lors de laquelle la dose d'allergène administrée augmente progressivement, passant d'une dose initialement très minime (généralement 1 000 fois inférieure à la charge d'allergène à laquelle le patient est susceptible d'être confronté) jusqu'à la dose d'entretien (évaluée par le praticien, au cas par cas), la fréquence des administrations passant de 1-3 fois par semaine, à 1 fois par mois, une phase d'entretien (ou de maintenance), d'une durée moyenne de 3 à 5 ans, au cours de laquelle, tout les mois, une dose d'entretien est administrée au patient.
Particulièrement efficace à l'égard des acariens, de la poussière, du venin d'hyménoptères et des pollens, la désensibilisation s'est révélée néanmoins inopérante pour traiter nombre d'allergies aux animaux, aux moisissures... Une connaissance insuffisante de l'allergène ou des allergènes en cause ainsi que le nombre relativement limité d'extraits d'allergène appropriés disponibles, sont les premières causes des médiocres résultats obtenus jusqu'à présent. En alternative et/ou en complément à la désensibilisation, des traitements palliatifs sont prévus pour traiter les manifestations cliniques relatives à l'allergie.
En fonction du type de manifestations cliniques (asthme, conjonctivite, rhinites, sinusites, alvéolites, urticaire, eczéma, œdèmes, choc anaphylactique...), le médecin pourra prescrire un protocole de traitement spécifique. Une large gamme de médicaments (cromoglycate de sodium, glucocorticoïdes méthyl-xanthines, agonistes β-adrénergiques, anti- histaminiques...) est disponible. L'efficacité de ces médicaments n'est plus à démontrer, mais leur administration répétitive peut s'accompagner, selon les patients, d'effets indésirables (cromoglycate de sodium : irritation de la gorge, goût désagréable, nausées, toux ou respiration sifflante... ; glucocorticoïdes : atrophie cutanée, inhibition de la multiplication cellulaire, retard de la cicatrisation, dépigmentation, risque de passage systémique en application topique... ; méthyl-xanthines : anorexie, nausées, douleurs épigastriques (tératogénie constatée chez la souris)... ; agonistes β-adrénergiques : tachycardie, palpitations, tremblements, sudation, et exceptionnellement œdème pulmonaire, ischémie myocardique, arythmies cardiaques...).
Pour les allergies alimentaires, les allergies médicamenteuses et les allergies aux venins qui donnent souvent lieu à des chocs anaphylactiques violents susceptibles de conduire à la mort du sujet, un traitement doit être dispensé en urgence au sujet (injections d'adrénaline, d' antivenimeux...) pour éviter toute séquelle irréversible ; une hospitalisation s'avère souvent indispensable. L'éviction des allergènes est une troisième méthode de lutte contre les allergies. Elle est considérée comme un traitement préventif à part entière.
A l'égard des allergies alimentaires, médicamenteuses et aux venins, cette approche préventive est privilégiée par rapport aux tentatives de désensibilisation et aux approches palliatives, précédemment évoquées. Sa mise en œuvre est relativement aisée et conduit à des résultats généralement très satisfaisants. Tel n'est pas le cas pour les allergies respiratoires et, éventuellement pour les allergies de contact, du fait de l'ubiquité et de la nature de certains allergènes en cause (acariens, pollens, poussière, pollution...). Mais, quel que soit le type d'allergie concerné, l'éviction des allergènes n'est réellement envisageable que dans la mesure où le sujet est parfaitement conscient de son état à risque et de la nature de l'allergie. Ce qui, en pratique, est rarement le cas.
L'invention a pour objectif de proposer une nouvelle approche de traitement de l'allergie qui puisse être appliquée de manière générale à tous types d'allergies. A cet effet, l'invention vise à proposer de nouveaux agents actifs susceptibles d'intervenir sur les mécanismes cellulaires et/ou moléculaires impliqués dans l'établissement de la réaction allergique, en général.
L'invention vise principalement à prévenir, à atténuer, voire à bloquer les réactions allergiques, notamment en inhibant au moins partiellement la libération et/ou les effets des médiateurs réaginiques. En particulier, l'invention vise à proposer des agents actifs capables d'atténuer, voire de bloquer, la synthèse des IgE réaginiques et/ou les effets de ces IgE réaginiques, notamment à l'égard de la dégranulation des mastocytes.
L'invention a également pour objectif de proposer une utilisation particulière de ces agents actifs pour la préparation d'un médicament, d'un complément alimentaire et/ou d'un alicament, dont l'administration ponctuelle ou régulière ne présente aucun effet toxique.
A cet effet, l'invention concerne l'utilisation d'au moins un oligosaccharide β(l→3)-glucane comprenant une chaîne principale de degré de polymérisation de 3 à 6, dit oligo-β(l→3)-glucane, pour la préparation d'une composition pour traiter l'allergie.
Une composition préparée selon l'invention, peut consister en un complément alimentaire et/ou un alicament.
Elle peut consister également en un médicament ; l'invention peut alors -être définie comme un procédé de préparation d'un médicament pour traiter l'allergie, dans lequel on utilise au moins un oligosaccharide β(l->3)-glucane comprenant une chaîne principale de degré de polymérisation de 3 à 6, dit oligo-β(l→3)-glucane.
La quantité totale d'oligo-β(l-»3)-glucane(s) utilisée pour préparer ladite composition est choisie po ur permettre au moins une inhibition significative de la synthèse des IgE réaginiques, chez le sujet, après administration.
Avantageusement et selon l'invention, ladite composition est destinée au traitement des allergies de type choisi parmi : les allergies respiratoires, les allergies de contact, les allergies alimentaires, les allergies médicamenteuses, les allergies aux venins.
Avantageusement et selon l'invention, ladite composition est destinée à prévenir les réactions allergiques.
Avantageusement et selon l'invention, ladite composition est adaptée pour pouvoir atténuer la synthèse et/ou les effets réaginiques des IgE. Les inventeurs ont démontré que les oligosaccharides β(l-»3)-glucane, linéaires ou ramifiés, dont la chaîne principale est de degré de polymérisation égale à 3, 4, 5 ou 6, présentent une efficacité significative pour modérer ou pour inhiber, les mécanismes immunitaires impliqués dans le déclenchement des réactions allergiques, y compris les chocs anaphylactiques. Outre une inhibition de la synthèse des IgE réaginiques, responsables de la dégranulation des mastocytes et de la synthèse et/ou la libération massive des médiateurs allergéniques, des tests in vitro entrepris par les inventeurs sur des leucocytes humains ont permis de mettre en évidence que l'effet biologique des oligo-β(l→3)-glucanes visés par l'invention se traduit également par :
• une stimulation de. la libération des immunoglobulines de classe A (IgA), connues pour leur action antagoniste vis-à-vis des IgE réaginiques,
. une stimulation de la sécrétion et de l'activité physiologique de l'interféron γ (INFγ), une cytokine produite par les lymphocytes T, CD4-Thl et CD8, qui antagonise l'interleukine de type 4 (IL-4) en inhibant la production d'IgE et les réactions allergiques qui leur sont liées.
. une stimulation de la sécrétion et de l'activité physiologique de l'interleukine de type 10 (IL-IO), une cytokine anti- inflammatoire produite par les lymphocytes T, ThI et Th2, par les lymphocytes B et les monocytes, qui induit la différenciation terminale de plasmocytes et stimule la synthèse des immunoglobulines de classes G (IgG) et A (IgA).
Enfin, des tests in vivo réalisés par les inventeurs sur des cobayes ont permis, d'une part, de confirmer les propriétés anti-allergie des oligo- β(l→3)-glucanes visés par l'invention et, d'autre part, de constater, notamment :
. une protection efficace des cobayes à l'égard des chocs anaphylactiques, une absence de toxicité, aigϋe et chronique, aussi bien chez les cobayes traités quotidiennement par voie orale avec des oligo-β(l→3)- glucanes, que chez les cobayes traités par des injections intra-péritonéale de ces mêmes d'oligo-β(1^3)-glucanes.
En outre, pour préparer une composition pour traiter l'allergie conformément à l'invention, on utilise avantageusement des oligo- β(l→3)-glucanes linéaires. On peut aussi utiliser des oligo-β(l→3)-glucanes ramifiés ; en particulier des oligo-β(l-»3)-glucanes de poids moléculaire inférieur à 2 000 Da, comprenant au moins une ramification en β(l->6). Egalement, on peut aussi utiliser un mélange d'oligo-β(l→3)-glucanes linéaires et d'oligo- β(l→3)-glucanes ramifiés en β(l→6).
Avantageusement, le(s) oligo-β(l-»3)-glucane(s), linéaire(s) et/ou ramifié(s), utilisé(s) dans le cadre de l'invention sont solubles dans un milieu aqueux -notamment un liquide physiologique-. Le faible degré de polymérisation et une éventuelle ramification des oligo-β(l-»3)-glucanes visés par l'invention conditionnent avantageusement leur solubilité dans l'eau et dans les liquides physiologiques, ainsi que leurs activités biologiques sur les différentes composantes du système immunitaire. De manière connue, les oligo-β(l→3)-glucanes visés par l'invention peuvent être préparés à partir de β-glucanes de haut poids moléculaire de chaîne principale β(l→3), éventuellement ramifiée β(l→6). Pour ce faire, ces β-glucanes de haut poids moléculaires peuvent être soumis à une digestion par des enzymes à activité β(l->3)-glucanase et β(l-»6)-glucanase, et/ou à une hydrolyse acide (par exemple, une hydrolyse à chaud par l'acide formique).
Avantageusement, pour la mise en œuvre de l'invention, on utilise des oligo-β(l→3)-glucanes préalablement préparés à partir de polymères β(l→3)-glucane provenant d'une source choisie parmi : la paroi de levure, le son d'avoine, le curdlan.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la composition anti-allergie préparée conformément à l'invention est destinée à être administrée par voie orale, sous la forme d'un médicament per os, un complément alimentaire, ou un alicament. Selon ce mode de réalisation particulier, on utilise une quantité efficace d'oligo-β(l→3)-glucane(s) correspondant à une prise journalière d'oligo-β(l→3)-glucane(s) de l'ordre de 100-1 000 mg, de préférence de l'ordre de 400 mg, pour un adulte de 65 kg.
Selon ce premier mode de réalisation, une composition à administration par voie orale (notamment lorsqu'il s'agit d'un médicament per os ou d'un complément alimentaire) peut être réalisée sous des formes galéniques et des formulations très diverses : sous la forme d'un mélange de particules solides et divisées, par exemple une poudre effervescente ou non effervescente, et dont la prise nécessite qu'elle soit mélangée à de l'eau, sous la forme d'un comprimé effervescent ou non, à avaler avec un peu d'eau, à sucer ou à croquer,
• sous forme d'une solution, par exemple, une suspension, un sirop, une composition liquide enrobée dans une capsule dure ou molle. Selon une variante de mise en œuvre d'une composition à administration par voie orale préparée conformément à l'invention, celle-ci consiste avantageusement en un alicament, c'est-à-dire une composition alimentaire, solide et/ou liquide, qui incorpore au moins un oligo-β(l->3)-glucane visé par l'invention, en quantité efficace.
Selon un second mode de réalisation de l'invention, la composition anti-allergie préparée conformément à l'invention, est avantageusement adaptée pour pouvoir être administrée par voie topique (par exemple, sous la forme d'une crème, d'un gel...). Quelle que soit la forme dans laquelle se concrétise la présente invention (médicament per os, complément alimentaire, alicament), outre ladite quantité d'oligo-β(l→3)-glucane(s), une composition préparée selon l'invention, de manière classique, peut nécessiter l'adjonction d'additifs et/ou d'excipients d'ordre pharmaceutique ou d'ordre alimentaire, traditionnels. Ces additifs et/ou excipients, rentrant éventuellement „ dans la formulation d'une composition conforme à l'invention, sont par exemple des liants, des lubrifiants, des édulcorants, des diluants, des excipients, des agents effervescents, des agents d'enrobage...
L'invention concerne également l'utilisation d'oligo-β(l→3)- glucanes visés par l'invention pour la préparation de compositions à administration par voie orale, destinées à prévenir et/ou à atténuer les réactions allergiques, ainsi qu'un procédé de traitement préventif et/ou palliatif des réactions allergiques, dans lequel on administre au sujet, ponctuellement ou de façon répétée, une quantité efficace d'oligo-β(l→3)-glucane(s), caractérisés en combinaison par tout ou partie des caractéristiques mentionnées ci-dessus ou ci- après.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit et qui concerne la préparation d'oligosaccharides β(l->3)-glucane et la caractérisation des propriétés anti-allergie des oligo-β(l-»3)-glucanes. La description relative aux méthodes de préparation et d'analyse des oligosaccharides β(1^3)-glucane fait notamment référence aux figures 1 à 6, annexées, qui en présentent les profils d'élution.
1/ - PRÉPARATION D'OLIGOSACCHARIDES ET DOLIGO- βπ->3>GLUCANES ANTI-ALLERGIE De manière connue, les oligosaccharides β(l→3)-glucane peuvent être préparés à partir de β-glucanes de haut poids moléculaire. A titre d'exemple de méthodes pouvant être utilisées pour ce faire, on peut citer JP 2005/110675, WO 99/52920.
Les oligosaccharides β(l→3)-glucane étudiés par les inventeurs ont été obtenus par extractions et fractionnements réalisés à partir de différents produits commerciaux disponibles en industries agro-alimentaires tels que le curdlan bactérien, les levures et le son d'avoine. a) Suivant un premier exemple de produit de départ utilisé pour la préparation d'oligo-β(l→3)-glucanes visés par l'invention, on utilise le curdlan d'origine bactérienne, constitué d'homopolymères de glucose, de chaîne principale β(1^3), linéaire et de degré de polymérisation élevé.
Le curdlan est disponible sous forme purifiée dans le commerce.
Des étapes de purification, préalables à l'étape d'hydrolyse de ces homopolymères, peuvent s'avérer nécessaires en vue d'éliminer les sels et autres petites molécules éventuellement présents dans le produit commercial. A cet effet, on peut réaliser une dialyse contre de l'eau du produit en solution dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
Deux procédés d'hydrolyse et de purification ont été mis en œuvre sur le curdlan, pour obtenir les oligo-β-glucanes visés par l'invention.
• Le premier procédé est basé sur une hydrolyse enzymatique. Le système enzymatique choisi est un mélange de β(l→3)- glucanase et de β(l-»6)-glucanase, commercialisé sous la dénomination
GLUCANEX (NOVO-Nordisk). Ce système enzymatique a été sélectionné pour son activité β(l-»3)-glucanase. Le curdlan est soumis à une hydrolyse enzymatique en présence de GLUCANEX, dans un milieu aqueux à un pH de l'ordre de 4 et à une température de l'ordre 400C. La concentration enzymatique est de 2 unités pour 50 mg de curdlan.
La réaction d'hydrolyse est réalisée dans une cellule de concentration permettant l'extraction en continu des oligosaccharides formés par ultrafiltration sur une membrane de 10 000 Da à une pression de 1,5 Bars.
Les oligosaccharides libérés sont ensuite séparés par chromatographie d'exclusion stérique permettant d'obtenir cinq fractions d'oligo-β(l-»3)-glucanes, notées I-A à I-F et reprises dans le tableau 1 ci-après.
Les conditions opératoires de cette chromatographie d'exclusion stériques sont les suivantes : la colonne d'exclusion stérique utilisée est une colonne Bio-Gel P2 (210 x 1,5 cm ; seuil de coupure 100-1 80 Da), l'éluant est de l'eau distillée, le débit est de 40 ml. min'1, le suivi de l'élution est réalisé par un réfractomètre RID
Iota, la quantité d'échantillon injectée est de 0,5 ml, les fractions recueillies sont concentrées et lyophilisées.
Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 1.
Figure imgf000011_0001
Tableau 1 . Le deuxième procédé d'hydrolyse du curdlan est basé sur une hydrolyse chimique.
Le curdlan est soumis à une hydrolyse acide à chaud en présence d'acide formique 50 % à 1000C pendant 2 heures. Le culot résiduel issu de l'hydrolyse est soumis à un nouveau traitement en présence d'acide formique (pendant 2 heures à 1000C).
Les surnageants obtenus à l'issue des deux hydrolyses successives sont réunis et séchés sous vide à l'aide d'un évaporateur rotatif.
Les hydrolysats sont solubilisés dans l'eau distillée. L'ensemble est porté à ébullition pendant 3 heures afin d'éliminer les substituants formyle. Les oligosaccharides déformylés sont alors lavés et séchés par évaporation sous vide.
L'extrait obtenu est ensuite fractionné par chromatographie sur une colonne d'exclusion stérique de type Bio-Gel P2 permettant d'obtenir neuf fractions d'oligosacchrides β(l→3)-glucane. Ces différentes fractions sont notées I-A à I-I et sont reprises dans le tableau 2 ci-après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 2.
L'hydrolyse chimique non spécifique des β-glucanes du curdlan permet d'obtenir des oligosaccharides β(l→3)-glucane linéaires avec une plus large gamme de degré de polymérisation.
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000013_0001
Tableau 2 b) Suivant un deuxième exemple de méthode permettant d'obtenir des oligo-β(l-»3)-glucanes visés par l'invention, on utilise la paroi de levures constituée d'homopolymères de glucose hautement polymérisés, à chaîne principale β(l-»3), éventuellement parfois ramifiée en β(l→6).
A cet effet, un extrait total de levure est solubilisé en milieu alcalin dans de l'urée (5%) en présence de soude à 4°C, pendant 12 heures. Cette étape a pour objectif d'extraire les β(l→3)-glucanes ramifiés en β(l-*6).
Par centrifugation, on élimine la fraction insoluble dans l'urée/NaOH. Cette fraction est composée principalement de solutés de nature non polysaccharidique, tels que les sels et les protéines. La solution est ensuite traitée avec de l'acide acétique afin d'éliminer le reste des composés non pariétaux solubles. L'ajout d'acide acétique provoque la précipitation des β(l->3)-glucanes ramifiés en β(l->6), sous la forme d'un gel.
Les derniers composés solubles sont éliminés par dialyse. Une ultrafiltration fine ou une nanofiltration peuvent également être mises en oeuvre à cet effet. Les β(l→3)-glucanes ramifiés en β(l->6) ainsi purifiés sont par la suite lyophilisés, puis soumis à une hydrolyse acide à chaud en présence d'acide formique 50 % à 1000C, pendant 2 heures.
Deux cycles de ce traitement acide, sous reflux et agitation, sont nécessaires pour obtenir une majorité d'oligosaccharides β(l->3)-glucane, éventuellement ramifiés en β(l→6).
Le surnageant récupéré par centrifugation est évaporé sous vide et soumis à ébullition pendant 3 heures en vue d'éliminer l'acide formique.
Les hydrolysats sont solubilisés dans l'eau distillée et portés à ébullition pendant 3 heures afin d'éliminer les substituants formyle. Les oligosaccharides déformylés sont alors lavés et séchés par évaporation sous vide.
L'extrait obtenu est ensuite fractionné par chromatographie sur une colonne d'exclusion stérique de type Bio-Gel P2 permettant d'obtenir huit fractions d'oligosaccharides β(l→3)-glucane, éventuellement ramifiés en β(l-»6), notées H-A à H-H et reprises dans le tableau 3 ci -après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 3.
Figure imgf000014_0001
Tableau 3
De façon comparable aux résultats obtenus avec le curdlan, l'hydrolyse chimique permet d'obtenir une gamme plus large d'oligosaccharides de différents DP. Les ramifications des β-glucanes de levures rendent la détermination du degré de polymérisation difficile. En revanche, il est confirmé que les oligosaccharides β(l→3)-glucane issus de cette hydrolyse chimique sont caractérisés par une chaîne principale β(l→3) de degré de polymérisation majoritairement inférieur à 10. c) Suivant un troisième exemple, la préparation d'oligo- β(1^3)-glucanes visés par l'invention est mise en œuvre à partir du son d'avoine.
Les polymères β-glucanes de son d'avoine sont des polymères linéaires à liaisons β(l→3) et β(l-»4). Le procédé d'extraction de ces polymères est inspiré du protocole mis au point par Aspinall et Carpenter (Aspinall G. O. and Carpenter R.C. : Carbohydrate Polymers (1984) 4:271-282). Il a permis d'isoler deux fractions de polymères β(l-»3),(l→4)-glucanes ; l'une comprend des polymères solubles dans le DMSO, et l'autre, des polymères solubles dans l'eau après une action d'une α-amylase permettant l'hydrolyse de l'amidon.
Les polymères de cette dernière fraction sont dégradés par un procédé enzymatique pour faciliter la purification des β(l→3),(l->4)-glucanes.
Les propriétés de solubilité différentes des polymères de ces fractions sont liées à leur rapport β(l→3)-glucose/β(l-»4)-glucose. Ce procédé de purification a permis d'obtenir un rendement de production de 7 % pour les β(l->3),(l→4)-glucanes solubles dans le DMSO et un rendement de production de 2,5% pour les β(l-»3),(l-»4)-glucanes solubles dans l'eau.
Préalablement au traitement de l'amidon, le son d'avoine est soumis à une extraction Eau/Ethanol (1 :9) à 1000C pendant 14 heures. L'extrait hydroalcoolique est lyophilisé puis soumis à une hydrolyse enzymatique en présence d'α-amylase afin de dégrader l'amidon. Le mélange est soumis à une centrifugation donnant lieu à une fraction insoluble (culot) et une fraction soluble (surnageant). La fraction insoluble est lavée en présence d'eau et mise en solution dans le DMSO. Le surnageant obtenu après centrifugation est dialyse et lyophilisé. Le traitement de cette fraction insoluble donne lieu à la fraction de β(l-»3),(l-»4)-glucanes solubles dans le DMSO avec un rendement de 7 % du son d'avoine.
La fraction de β(l->3),(l-»4)-glucanes solubles obtenue après dégradation de l'amidon subit un traitement thermique à 1000C pendant 1 heure. Le surnageant obtenu après centrifugation est par la suite dialyse et lyophilisé. L'extrait séché est traité en présence de 20 % de sulfate d'ammonium (NHi)2SO4 afin de précipiter les β-glucanes et le culot obtenu après centrifugation est dialyse en présence d'eau puis lyophilisé. Le traitement de cette fraction de β(l→3),(l->4)-glucanes solubles donne lieu à la fraction de β-(l→3),(l→4)-glucanes solubles dans l'eau avec un rendement de 2,5 % du son d'avoine. Les deux fractions de polymères solubles dans le DMSO et solubles dans l'eau obtenues à partir du son d'avoine sont par la suite soumises à une hydrolyse chimique en vue d'extraire et de purifier les oligo-β-glucanes liés en β-(l-»3) et/ou en β-(l-»4).
Ces fractions sont soumises à une hydrolyse acide à chaud en présence d'acide formique 50 % à 1000C pendant 2 heures. Deux cycles de traitement sous reflux et agitation sont nécessaires pour obtenir la majorité des oligo-β-glucanes. Le surnageant est par la suite récupéré par centrifugation, évaporé sous vide et soumis à ébullition pendant 3 heures en vue d'éliminer l'acide formique. L'extrait obtenu à partir de la fraction de β(l→3),(l->4)- glucanes solubles dans le DMSO est ensuite fractionné par HPLC d'exclusion stérique permettant d'obtenir sept fractions d'oligosaccharides β-glucane.
Les différentes fractions d'oligosaccharides β-glucane obtenues, notées IV-A à IV-G, sont reprises dans le tableau 4 ci-après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 4.
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Tableau 4
L'extrait obtenu à partir de la fraction de β(l→3),(l-*4)- glucanes solubles dans l'eau est ensuite fractionné par HPLC d'exclusion stérique permettant d'obtenir quatre fractions d'oligosaccharides β-glucane.
Les fractions d'oligosaccharides β-glucanes ainsi obtenues sont rapportées dans le tableau 5 ci-après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 5.
Figure imgf000017_0002
Tableau 5 d) Suivant un exemple particulier, la préparation d'oligo- β(l→3)-glucanes visés par l'invention est mise en œuvre par hydrolyse chimique et enzymatique.
A titre d'exemple, la combinaison de l'hydrolyse enzymatique et de l'hydrolyse chimique est réalisée sur le curdlan purifié.
En premier lieu, l'hydrolyse acide est réalisée à l'aide d'une solution d'acide formique à 50 % à 1000C (30 ml pour 50 mg de curdlan) pendant 1 heure. Un seul cycle de traitement sous reflux et agitation est appliqué.
Le surnageant est par la suite récupéré par centrifugation, évaporé sous vide et porté à ébullition pendant 3 heures en vue d'éliminer l'acide formique.
L'extrait obtenu est ensuite soumis à une hydrolyse enzymatique avec la GLUCANEX (2 unités pour 50 mg de curdlan) à pH 4 et à 400C pendant 30 minutes. La réaction enzymatique est réalisée dans une cellule de concentration sur une membrane de 10 000 Da à une pression de 1,5 Bars. L'extrait obtenu est concentré et fractionné par HPLC d'exclusion stérique permettant d'obtenir neuf fractions d'oligo-β-glucanes.
Les différentes fractions obtenues sont reprises dans le tableau 6 ci-après. Le profil d'élution correspondant est présenté à la figure 6.
La combinaison des hydrolyses chimique et enzymatique permet de générer les oligosaccharides définis par des degrés de polymérisation équivalents à ceux obtenus par les traitements individuels mais améliore le rendement de 2 à 3 fois par rapport à une simple hydrolyse chimique.
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Tableau 6
2/ - CARACTÉRISATION BIOLOGIQUE DES OLIGO- SACCHARIDES βq->3)-GLUCANES PRÉPARÉS a) Effet des oligosaccharides β(l→3)-glucane préparés sur la synthèse d'immunoglobulines par les leucocytes.
Les oligo-β(l→3)-glucanes selon l'invention présentent la propriété de moduler la synthèse des différentes classes d'immunoglobulines.
Cette activité modulatrice a été mise en évidence sur une culture in vitro de leucocytes humains, isolés sur gradient de Ficoll à partir de prélèvements sanguins effectués sur des donneurs sains.
Les leucocytes, mis en suspension en milieu RPMI complet, sont répartis en plusieurs séries de tubes de 1 ml de volume, à raison de 150 000 cellules par tube.
. Effet des oligosaccharides β(l→3)-glucane sur la synthèse des IgE.
Les leucocytes sont cultivés en présence d'interleukine 4 (11-4), à raison de 20 ng/ml. L'IL-4, produites par les lymphocytes T, est un facteur de croissance des lymphocytes, des basophiles et des mastocytes. L'Il-4 joue un rôle prépondérant dans l'induction de la production d'IgE par les plasmocytes.
Chaque tube de culture reçoit aussi 10 μg de l'une des fractions d'oligosaccharides β(l→3)-glucane précédemment préparées. Les leucocytes sont ainsi cultivés pendant 13 jours à 37°C.
Le dosage des IgE totales sécrétées par les leucocytes dans le milieu surnageant de culture de chaque série est effectué par une technique immunoenzymatique de type sandwich faisant appel à des anticorps marqués anti-IgE humaine.
Les résultats obtenus sont recueillis dans le tableau 7 ci- après.
Ces résultats démontrent, après analyse statistique
(Statistique Wilcoxon test, * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** : p < 0,001) que les fractions de β-glucanes I-B, I-C, I-D, H-E, H-F, H-G, IV-E; IV-F, IV-G et V-E se caractérisent par une activité réductrice de la synthèse d'IgE dans les leucocytes humains cultivés en présence d'IL-4.
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Tableau 7
. Effet des oligosaccharides β(l→3)-glucane sur la synthèse des IgA.
Les fractions d'oligosaccharides β-glucane aptes à diminuer la synthèse d'IgE, précédemment décelées, ont été testées pour leur effet potentiel sur la synthèse d'IgA.
Les séries de tubes de culture destinées au titrage des IgA reçoivent 10 μg de l'une des préparations de β(l-»3)-glucanes, et sont cultivés pendant 13 jours à 37°C. Le dosage des IgA totales dans les surnageants de culture est effectué par une technique immunoenzymatique de type sandwich faisant appel à des anticorps marqués anti-Ig A humaine.
Les résultats obtenus sont recueillis dans le tableau 8 ci- après.
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Tableau 8
Les séries de résultats obtenus ci-dessus permettent, après analyses statistiques (Statistique Wilcoxon test, * : p < 0,05 ; ** : p < 0,01 ; *** ; p < 0,001), de conclure que les préparations d'oligo-β-glucanes selon l'invention, dénommées respectivement I-B, I-C, H-F, II-G et V-E, se caractérisent in vitro par une activité significative de stimulation de la néosynthèse d'IgA par les leucocytes humains.
Les autres fractions selon l'invention ne modifient pas le taux naturel de synthèse des IgA par les cellules leucocytaires.
Les fractions d'oligosaccharides β(l→3)-glucane précédemment préparées, et référencées I-B, I-C, H-F, II-G et V-E, sont donc caractérisées par le fait qu'elles possèdent sur les cellules leucocytaires humaines une double activité sélective qui déprime la néo-synthèse des immunoglobulines de classe IgE et qui stimule la néosynthèse des immunoglobulines de classe IgA. b) Effet des oligosaccharides β(1^3)-glucane préparés sur la synthèse des cytokines par les leucocytes.
. Effet des oligosaccharides β(1^3)-glucane sur la synthèse d'interleukine 10 (IL-IO) et d'interféron γ (IFN-γ). Les oligosaccharides β(l→3)-glucane des fractions I-B,
I-C, H-F, H-G et V-E, précédemment préparées, ont également été testées pour leur effet potentiel sur la sécrétion et l'activité physiologique de l'IL-10 et de l'INF-γ, deux interleukines impliquées dans la régulation de la réaction immunitaire des mammifères : - l'interleukine 10 (IL-10), est une cytokine anti-inflammatoire produite chez l'homme par les lymphocytes Th-I et Th-2, par les lymphocytes B et les monocytes ; elle induit la différentiation terminale des plasmocytes et stimule la synthèse des immunoglobulines G,
- l'interféron gamma (IFNγ) est une cytokine produite par les lymphocytes T CD4-Thl et CD8 et qui antagonise l'IL-4 en inhibant la production d'IgE et les réactions allergiques supportées par les basophiles.
L'action des oligo-β-glucanes sur les productions respectives d'IL-10 et d'IFNγ est évaluée selon la méthodologie décrite précédemment sur cultures de leucocytes humains en milieu RPMI additionné de 10 μg de phyto-hémagglutinine (PHA). Les quantités de cytokines produites dans les milieux de culture sont évaluées par dosages immuno-enzymatiques de type sandwich faisant appel à des anticorps marqués anti-IL-10 et anti-IFNγ.
Les résultats obtenus sont rapportés dans le tableau 9 ci- après. Les résultats obtenus permettent de conclure que les oligo- β-glucanes I-C et H-G selon l'invention sont caractérisés par le fait qu'ils stimulent, suivant une loi dose-effet, la production de l'interleukine- 10 et de l'interféron-γ par les cellules leucocytaires humaines en culture in vitro. Les deux cytokines induites par ces oligo-β-glucanes participent, de façon non spécifique, à la régulation et à l'inhibition de la réaction allergique. IL-10 (pg/ml) IFNγ (pg/ml)
Glucanes (μg/ml)
C + PHA C + PHA
Témoin 35+5 375 ± 52 Φ ND 698 ± 27 Φ
I-B : 10 52 ±1 425 ±12 ND 723 ±12
I-B: 1 70 + 9 320 ± 52 ND 690 ±15
I-B : 0,1 42 ±1 360 ± 51 ND 673 ± 51
I-C: 10 73 ±10 725 ± 23 Φ 73 ±21 1025 ±53
I-C: 1 92 ±6 695 ± 73 Φ ND 760 ± 32 Φ
I-C: 0,1 40 ±2 370 ± 32 ND 681 ± 38
H-F: 10 41 ±1 612 ±73 Φ ND 801 ± 35
H-F : 1 37 ±2 360 ±8 ND 652 ± 20
H-F: 0,1 38 ±3 401 ±25 ND 685 ±12
II-G: 10 51 ±12 995 ± 27 Φ 83 ±12 1375 ±36 Φ
H-G : 1 40 ±1 612 ±75 Φ ND 853 ± 52 Φ II-G : 0,1 38 ±3 401 ±25 ND 685 ±12
V-E : 10 31 ±10 378 ± 35 ND 661 ± 12
V-E: 1 32 ±7 360 ±17 ND 670 ± 20
V-E : 0,1 32 ±4 339 ±21 ND 673 ±17
Tableau 9
3/ - TEST DE PRÉVENTION SUR COBAYE
La plupart des animaux de laboratoire (rat, cobaye, lapin,...) peuvent manifester, dans des conditions expérimentales déterminées, des phénomènes d'hypersensibilité par anticorps allergisants. Ils constituent donc des modèles biologiques utiles pour l'étude et la mise au point de nouvelles stratégies de lutte contre les allergies.
L'activité des oligo-β(l-»3)-glucanes dans la prévention des états allergiques est évaluée sur des cobayes.
Pour ce faire, de jeunes cobayes albinos en bonne santé, de 300 g environ, sont répartis en deux lots séparés (Lot 1 - Expérimental, et Lot 2 - Témoin), de cinq animaux chacun.
Au jour zéro du test, tous les animaux reçoivent par injections sous-cutanées en 2 points distincts, un volume de 0,20 ml d'une solution commerciale isotonique d'allergènes extraits de pollens de graminées, un volume de 0,20 ml d'oligosaccharides β(l→3)-glucane, la solution étant à une concentration de 20 mg/ml.
Les trois semaines suivantes, les animaux du lot 1 reçoivent, par sonde œsophagienne, une dose quotidienne de 0,5 ml d'oligo-β- glucanes (I-C, H-G,) en solution à 20 mg/ml. Les animaux du lot 2 reçoivent quant à eux 0,5 ml d'eau isotonique.
Au 21eme jour du test, tous les animaux sont soumis à un prick-test par inoculation épidermique de 100 μl de la solution d'allergènes de pollens. Le prick-test cutané, utilisé pour révéler une éventuelle sensibilisation IgE dépendante comporte un témoin négatif et un témoin positif à la codéine.
L'apparition rapide, en 30 minutes, au point d'inoculation d'un œdème entouré d'un érythème d'une taille équivalente à celle du test témoin positif signe la positivité d'un état allergique aux pollens chez les cobayes. Les résultats obtenus sur cobayes permettent d'observer des prick-tests positifs aux allergènes de pollens sur les animaux témoins du lot 2 et des prick-tests négatifs sur les animaux du lot 1.
Les résultats de tests, répétés sur plusieurs lots successifs de cobayes, selon des posologies déterminées des différentes fractions I-B, I-C, I-D, H-E, H-F, H-G, IV-E, IV-F, IV-G et V-E, permettent de conclure que les oligo-β(l→3)-glucane visés par l'invention se caractérisent par le fait que :
- leurs ingestions quotidiennes et répétées pendant trois semaines ne révèlent pas de toxicité aigϋe ou chronique, pour le cobaye,
- leurs administrations orales quotidiennes et répétées selon des posologies déterminées protègent le cobaye sensibilisé du choc anaphylactique.

Claims

REVENDICATIONS
1/ - Utilisation d'au moins un oligosaccharide β(l→3)- glucane comprenant une chaîne principale de degré de polymérisation de 3 à 6, dit oligo-β(l→3)-glucane, pour la préparation d'une composition pour traiter l'allergie.
2/ - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un oligo-β(l->3)-glucane est linéaire.
3/ - Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'au moins un oligo-β(l->3)-glucane est de poids moléculaire inférieur à 2 000 Da et comprend au moins une ramification en β(l→6).
Al - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'au moins un oligo-β(l→3)-glucane est soluble dans un milieu aqueux.
5/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'au moins un oligo-β(l→3)-glucane a été préalablement préparé à partir de polymères β(l-*3)-glucane provenant d'une source choisie parmi : la paroi de levure, le son d'avoine, le curdlan.
61 - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à être administrée par voie orale, sous une forme choisie parmi : un médicament per os, un complément alimentaire, un alicament.
Il - Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on utilise une quantité d'oligo-β(l→3)-glucane(s) totale correspondant à une prise journalière déterminée pour une prise journalière d'oligo-β(l→3)-glucane(s) de l'ordre de 100-1 000 mg, pour un adulte de 65 kg.
8/ - Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'on utilise une quantité d'oligo-β(l→3)-glucane(s) totale correspondant à une prise journalière d'oligo-β(l →3)-glucane(s) de l'ordre de 400°mg, pour un adulte de 65 kg. 9/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite composition est adaptée pour pouvoir être administrée par voie topique.
10/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que ladite composition est destinée au traitement des allergies de type choisi parmi : les allergies respiratoires, les allergies de contact, les allergies alimentaires, les allergies médicamenteuses, les allergies aux venins.
11/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir les réactions allergiques.
12/ - Utilisation selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ladite composition est adaptée pour pouvoir atténuer la néosynthèse et/ou les effets réaginiques des IgE.
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