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WO2007136100A1 - 暗視野顕微鏡及びその調整方法 - Google Patents

暗視野顕微鏡及びその調整方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2007136100A1
WO2007136100A1 PCT/JP2007/060554 JP2007060554W WO2007136100A1 WO 2007136100 A1 WO2007136100 A1 WO 2007136100A1 JP 2007060554 W JP2007060554 W JP 2007060554W WO 2007136100 A1 WO2007136100 A1 WO 2007136100A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
light
dark field
image
lens
field microscope
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/060554
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takayuki Nishizaka
Ryohei Yasuda
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Japan Science And Technology Agency filed Critical Japan Science And Technology Agency
Priority to CA2653411A priority Critical patent/CA2653411C/en
Priority to EP07743988A priority patent/EP2034347A4/en
Priority to US12/301,858 priority patent/US8379304B2/en
Publication of WO2007136100A1 publication Critical patent/WO2007136100A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G02B21/08—Condensers
    • G02B21/10—Condensers affording dark-field illumination

Definitions

  • the present invention relates to a dark field microscope and a method for adjusting an optical axis thereof.
  • a light source that emits illumination light, a condensing optical system that condenses the illumination light of the light source power to illuminate the observation sample, and a condensing optical system that includes a condenser lens on the condensing side;
  • a dark field microscope including an imaging optical system including an objective lens that forms an enlarged image is known.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing the principle of a conventional general dark field microscope.
  • the thickness of the small tube is about 24, but it can be visualized by a night vision microscope using a mercury lamp as the light source.
  • the device and operation are relatively simple, high contrast images can be obtained, raw samples can be seen without pretreatment, and supramolecular motion and morphological changes can be observed dynamically. There are advantages such as.
  • Patent Document 14 is cited as a conventional technique related to a dark field microscope.
  • Patent Document 1 relates to an illumination system that can easily switch between a bright field and a dark field
  • Patent Document 2 relates to a configuration that enables observation of only a target minute object without reducing resolution
  • Patent Document 3 describes Regarding the configuration that enables observation of extremely minute objects such as flagella of living bacteria
  • Patent Document 4 describes automatic focusing and night vision capable of high-speed processing.
  • the present invention relates to high brightness in a field microscope.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 9297266 “Microscope”
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 9-15507 “Dark Field Microscope”
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 8-122651 “Transmission Dark Field Microscope”
  • Patent Document 4 JP-A-5-346532 “Automatic focusing device and dark field microscope in a microscope”
  • the present invention provides a dark field microscope that can illuminate with a long focal condenser lens that requires a diaphragm in the objective lens and that has a low numerical aperture, and an effective adjustment method for the optical axis.
  • the dark field microscope of the present invention has the following configuration. That is, a light source that emits illumination light, a condensing optical system that condenses the illumination light of the light source power to illuminate the observation sample, and a condensing optical system that condenses the observation sample, and receives scattered light from the observation sample.
  • a dark field microscope equipped with an imaging optical system that includes an objective lens that forms a magnified image of the image the condenser lens on the condenser side is a lens with a long focal length, and the back focal plane (Back Focal Plane) is characterized in that a light shielding member for blocking illumination light is provided at the center of image formation.
  • a conjugate image of the back focal plane may be formed, and a light shielding member may be disposed there. With this configuration, it is shielded from the objective lens.
  • An optical member can be disposed, which contributes to simplification of the configuration.
  • ⁇ is the diameter of the area to be shielded at the back focal plane
  • f 1 is the focal length of the lens that forms a conjugate image of the back focal plane
  • L is the focal length of the second objective lens). You may make it contribute.
  • a mirror may be provided between the primary image and the secondary image to contribute to dual porting.
  • the observation sample is focused by adjusting the focus of the eyepiece, and the position of the condenser lens is adjusted by adjusting the position of the condenser lens.
  • Illuminate focus the observation sample on the imaging surface by adjusting the position of the imaging lens, and align the center of the field of view with the center of the camera by adjusting the aperture of the primary imaging surface and adjusting the position of the mirror.
  • the optical axis may be adjusted by setting the position where the background light becomes the darkest.
  • the direction perpendicular to the optical axis of the light shielding member may be adjusted by a micrometer.
  • the field stop on the condenser lens on the condensing side is minimized, the light is not allowed to enter the camera, and the black level is adjusted so that the value does not become a negative value.
  • adjust the aperture stop to set the position where the image becomes dark, and adjust the light intensity and aperture stop to increase the amount of light and reduce the numerical aperture to obtain the desired contrast. You may make it contribute.
  • the background of the observation sample may be optimized to make the image easier to see.
  • the imaging center of the rear focal plane in the imaging optical system is the imaging center of the rear focal plane in the imaging optical system
  • the objective lens does not require a diaphragm and can be illuminated with a long-focus condenser lens having a low numerical aperture. As a result, space is secured in the observation sample area, and the application range of experimental observation is expanded.
  • FIG. 1 An explanatory diagram showing the principle of a conventional general dark field microscope
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing the principle of a dark field microscope according to the present invention.
  • the inventor reviewed the essence of the dark field microscope and obtained the principle of the present invention as follows.
  • Dark The essence of the field microscope can be regarded as a means for blocking the illumination light (11) with some optical member and imaging only the scattered light (12).
  • the illumination light (11) has an annular shape because it can be effectively blocked by the stop. In other words, the form of illumination was determined by the means of shielding.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram showing the principle of the dark field microscope according to the present invention.
  • the light from the light source passes through the aperture stop (24) and then passes through the condenser lens (25) with a long focal length, and the illumination light (10) is sampled in the flow cell (20) only in a small numerical aperture area. Irradiate (21).
  • the illumination light is scattered by the sample (21)
  • the illumination light (11) itself is reflected by the light shielding member (23) disposed in the back focal plane of the objective lens (22). Is cut off. Therefore, a dark field image of the sample (21) can be obtained by focusing only the scattered light (12) emitted from the objective lens (12) force on the imaging surface of the camera.
  • a transparent optical component selectively deposited in the center with a light reflecting material such as aluminum that reflects light, or a light absorbing material such as suede that absorbs light is attached in the center.
  • a light reflecting material such as aluminum that reflects light, or a light absorbing material such as suede that absorbs light is attached in the center.
  • a glass plate or the like can be used.
  • the luminous flux of the optical system is defined by a field stop and an aperture stop.
  • the field stop defines the size of the image
  • the aperture stop defines the thickness of the light beam, that is, the numerical aperture.
  • the numerical aperture is defined for each objective lens.
  • the image of the aperture stop by the lens in front of the aperture stop is the entrance pupil
  • the image of the aperture stop by the lens behind the aperture stop is the exit pupil.
  • the diaphragm, entrance pupil, and exit pupil are in a conjugate relationship!
  • NA numerical aperture
  • NA n sin ⁇
  • the numerical aperture is an index for knowing at what angle the illumination light (10) is irradiated on the sample (21).
  • the steeper the irradiation angle the higher the image resolution.
  • the smaller the particle the larger the light scattering angle. Therefore, the light captured in the high numerical aperture region contains the high-frequency component of the image, and the fine structure can be observed.
  • the numerical aperture is an important quantity that determines the resolution of the image.
  • the diameter ⁇ of the pupil that satisfies a certain numerical aperture can be approximated by the following equation.
  • the pupil can be regarded as the size of the back focal plane.
  • the place where the light is collected is the back focal plane.
  • the diameter of the light that spreads with a certain numerical aperture can be regarded as the pupil diameter here.
  • the numerical aperture means not the angle but the radius.
  • the angle is imaged on the sample (21) plane, but on the back focal plane, it corresponds to the ring of the region calculated by equation (2).
  • the numerical aperture is the same for the objective lens (22).
  • a force is provided in which the light shielding member (23) is arranged at the back focal plane of the objective lens (22).
  • a lens is arranged behind the camera port, so that the secondary image is converted from the primary image. If made, a conjugate image of the back focal plane can be formed in the meantime. Even if a light-shielding member is placed on this conjugate image.
  • the diameter ⁇ e of the light shielding plate at this time is expressed by the following equation.
  • L is the focal length of the second objective lens
  • Equation (4) L disappears, so we can see that this equation is valid regardless of the type of microscope.
  • a pupil plane called an exit pupil force eye point of the eyepiece lens is used. Similar to the image plane, the pupil plane is also related to each other, and the exit pupil is relayed as the entrance pupil of the rear lens. For this reason, the lens position beyond the objective lens (22) cannot uniquely define the pupil position. Since the distance between the objective lens (22) and the lens barrel also changes, pupil matching is required when connecting multiple optical systems.
  • the present invention can also be applied to dark field illumination using a laser as a light source when particularly intense light illumination is required due to high-speed photography or the like.
  • a laser as a light source
  • Non-patent literature 1 includes laser light is incident perpendicularly to the sample surface as in the arc type light source.
  • the illumination light becomes a point image at the back focal plane, and dark field illumination is obtained by blocking it with a light shielding member (23) in the center. Since it is isotropic illumination than oblique illumination, there is an advantage that a more uniform image can be obtained.
  • Non-patent literature l Yasuda, R "Noji, H.'Yoshida, M., Kinosita, K., Jr. & Itoh, H. Resoluti on of distinct rotational substeps by submillisecondkinetic analysis of F 1 ⁇ — ATPase. , 898-904 (2001)
  • the light shielding plate to be installed may be configured to be replaceable with various sizes.
  • the imaging lens is replaced with a primary image, and its focal length f
  • the numerical aperture of the light shielding plate for the entire optical system can be increased.
  • a mirror is arranged between the primary image and the secondary image, and the conjugate image of the back focal plane is also set in front of the mirror. Is preferred.
  • f 40 mm, and the numerical aperture that was shielded from light, that is, the numerical aperture used for illumination, was 0.375.
  • the force that increases the light by (60Z40) 2 2.25 times.
  • FIG. 3 is a profile obtained by observing beads having a diameter of 0.2 ⁇ m.
  • the sample beads are made of polystyrene and bonded to the glass surface.
  • FIG. 4 is a photograph of the actual gliding movement of bacteria.
  • the aperture stop is gradually changed. Squeeze it down and set it to a position where the entire screen suddenly becomes dark. In this state, the numerical aperture shielded by the central light shielding plate matches the numerical aperture of the condenser lens.
  • This illumination method must be adopted, and is particularly effective under conditions where magnetic tweezers or a solution exchange system are used.

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Abstract

　照明光を発する光源と、その光源からの照明光を集束させて観察試料を照明する集光側コンデンサレンズを含む集光光学系と、観察試料からの散乱光を受光してその拡大像を結像する対物レンズを含む結像光学系とを備えた暗視野顕微鏡において、集光側コンデンサレンズを長焦点距離のレンズとし、結像光学系における後ろ焦点面(Back Focal Plane)もしくはその共役像の結像中心部に、照明光を遮断する遮光部材を設ける。これによって、対物レンズの絞りが必要なく、また開口数の低い長焦点のコンデンサレンズでも照明できる暗視野顕微鏡と、その光軸の有効な調整方法を提供する。  

Description

明 細 書
暗視野顕微鏡及びその調整方法
技術分野
[0001] 本発明は、暗視野顕微鏡とその光軸の調整方法に関する。
背景技術
[0002] 照明光を発する光源と、その光源力 の照明光を集束させて観察試料を照明する 集光側コンデンサレンズを含む集光光学系と、観察試料からの散乱光を受光してそ の拡大像を結像する対物レンズを含む結像光学系とを備えた暗視野顕微鏡は公知 である。
[0003] 図 1は、従来の一般的な暗視野顕微鏡の原理を示す説明図である。
光源力もの光は、高い開口数の集光側コンデンサレンズを介し、円環状の照明光（ 10)として、フローセル（20)内の観察試料（21)に照射される。試料（21)により照明 光は散乱される力 照明光（11)そのものは対物レンズ (22)内にある開口絞り（23) により遮断される。そのため、散乱光（12)のみが対物レンズ（12)力 射出される。そ れをカメラの撮像面に集光させれば、試料（21)の暗視野像が得られる。
[0004] 光は、その波長より小さな粒子や構造によっても散乱されるので、暗視野顕微鏡を 用いれば、可視光の波長以下の大きさのものでも観察することができる。
例えば、徴小管の太さはわず力 24 程度であるが、水銀ランプを光源とした暗視 野顕微鏡によって可視化可能となる。
暗視野顕微鏡には、他に、装置や操作が比較的簡易である、高いコントラスト像が 得られる、前処理無しで生の試料が見える、超分子の運動や形態変化を動的に観察 できる、などの利点がある。
[0005] 暗視野顕微鏡に関する従来技術としては、特許文献 1 4が挙げられる。
特許文献 1は、明視野と暗視野とを容易に切り換え可能にする照明系に関し、特許 文献 2は、分解能を低下させることなく対象の微小物体だけを観察可能にする構成 に関し、特許文献 3は、生きているバクテリアの鞭毛のような極めて微細な物体の観 察を可能にする構成に関し、特許文献 4は、高速処理可能な自動焦点合わせと暗視 野顕微鏡における高輝度化に関する。
[0006] 特許文献 1：特開平 9 297266「顕微鏡」
特許文献 2：特開平 9 - 15507「暗視野顕微鏡」
特許文献 3：特開平 8 - 122651「透過暗視野顕微鏡」
特許文献 4 :特開平 5— 346532「顕微鏡における自動焦点合わせ装置及び暗視野 顕微鏡」
[0007] このような従来技術による暗視野顕微鏡では、対物レンズ (22)内に絞り（23)が必 要であり、また開口数の高い集光側コンデンサレンズを用いる必要があるという制約 かあつた。
もし、開口数の低い長焦点のコンデンサレンズで照明できれば、フローセル（20)の 上側に空間が確保されるので、実験観察の応用範囲が広がるなどの利点がある。 しかし、これを実現する暗視野顕微鏡は従来にはな力つた。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] そこで、本発明は、対物レンズ内の絞りが必要なぐまた開口数の低い長焦点のコ ンデンサレンズでも照明できる暗視野顕微鏡と、その光軸の有効な調整方法を提供 することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0009]
上記課題を解決するために、本発明の暗視野顕微鏡は次の構成を備える。すなわち 、照明光を発する光源と、その光源力ゝらの照明光を集束させて観察試料を照明する 集光側コンデンサレンズを含む集光光学系と、観察試料からの散乱光を受光してそ の拡大像を結像する対物レンズを含む結像光学系とを備えた暗視野顕微鏡におい て、集光側コンデンサレンズが長焦点距離のレンズであり、結像光学系における後ろ 焦点面 (Back Focal Plane)の結像中心部に、照明光を遮断する遮光部材が備わるこ とを特徴とする。
[0010] ここで、結像光学系に、 1次像から 2次像を形成することにより、後ろ焦点面の共役 像を形成し、そこに遮光部材を配置してもよい。この構成により、対物レンズの外に遮 光部材を配置することが可能になり、構成の簡素化に寄与する。
[0011] 後ろ焦点面の共役像の結像中心部に配設される遮光部材に、径 φ e = φ 'f 1 ZU
Φは後ろ焦点面において遮光する領域の径、 f 1は後ろ焦点面の共役像を結像する レンズの焦点距離、 Lは第 2対物レンズの焦点距離)の遮光板を用いて、有効な遮光 に寄与させてもよい。
[0012] 1次像から 2次像を形成する結像側光学系を複数のレンズで構成し、そのレンズの 中で後ろ焦点面の共役像を結像するレンズの合計の焦点距離を、 f =^ φ β φ (L は第 2対物レンズの焦点距離、 φ Θは遮光部材の径、 φは後ろ焦点面において遮光 する領域の径）として、遮光部材の大きさは一定のまま、開口数を調整できるようにし てもよい。
[0013] また、 1次像と 2次像の間にミラーを設けて、デュアルポート化に寄与させてもよい。
[0014] このような暗視野顕微鏡と、それによる像を受像するカメラを備えた構成において、 接眼レンズの焦点調整により、観察試料にフォーカスを行ない、集光側コンデンサレ ンズの位置調整により、ケーラー照明を行ない、結像側レンズの位置調整により、観 察試料を撮像面にフォーカスし、 1次結像面の絞り調整とミラーの位置調整により、視 野中央をカメラ中央に一致させ、遮光部材の光軸方向位置調整により、背景光が最 も暗くなる位置に設定することで、光軸の調整を司ってもよい。
[0015] ここで、マイクロメーターにより、遮光部材の光軸に垂直な方向を調整してもよい。
[0016] 更に、集光側コンデンサレンズ上の視野絞りを最小にし、光をカメラに入れない状 態で、ブラックレベルの調整により、その値がマイナス値にならないように設定し、光 をカメラ側に切り替え、観察試料にフォーカスしたまま、開口絞りの調整により、像が 暗くなる位置に設定し、光強度及び開口絞りの調整により、光量を増大させると共に 開口数を絞って、所望のコントラストを得ることに寄与させてもよい。
[0017] ブラックレベルの調整により、観察試料の背景を最適化して、像を見やすくしてもよ い。
[0018] 光強度の調整により、観察試料の散乱光の光量を増大させて、好適な輝度を得て ちょい。
発明の効果 [0019]
本発明の暗視野顕微鏡によると、結像光学系における後ろ焦点面の結像中心部に
〇
遮光部材が備わるので、対物レンズに絞りが必要なくなり、また開口数の低い長焦点 のコンデンサレンズで照明可能である。そのため、観察試料部位に空間が確保され、 実験観察の応用範囲が広がる。
また、本発明の暗視野顕微鏡の調整方法によると、通常の安価な光学系や顕微鏡 やカメラ等のシステムを生力したまま、精確な光軸調整が可能となる。 図面の簡単な説明
[0020] [図 1]従来の一般的な暗視野顕微鏡の原理を示す説明図
[図 2]本発明による暗視野顕微鏡の原理を示す説明図
[図 3]ビーズを観察したプロファイル
[図 4]細菌の滑走運動の撮影図
符号の説明
観察試料への照明光
11 照明光
12 散乱光
20 フローセノレ
21 観察試料
22 対物レンズ
23 結像側開口絞り、遮光部材
24 集光側開口絞り
25 集光側コンデンサレンズ
30, 30' 細菌
31, 31 ' 細菌の運動軌跡
発明を実施するための最良の形態
以下に、図面を基に本発明の実施形態を説明する。なお、本発明の趣旨から逸脱 しな ヽ範囲で、実施例におけるスペックは適宜設計変更可能である。
本発明者は、暗視野顕微鏡の本質を見直し、次のように本発明の原理を得た。暗 視野顕微鏡の本質は、照明光（11)を何らかの光学部材で遮断し、散乱光（12)のみ を画像化する手段とみなせる。図 1に示したように従来技術では、この照明光（11)が 円環状になっているのは、絞りによって効率的に遮断できるからである。すなわち、遮 光の手段から照明の形態が決まっていたのである。
それに対し、逆に、照明の形態が限定されているとする。例えば、長焦点距離のコ ンデンサレンズし力使えない場合もある。そのような場合には、遮光の形態を変えるこ とによって、暗視野顕微鏡として機能させることが可能になる。
[0023] 図 2は、本発明による暗視野顕微鏡の原理を示す説明図である。
光源力もの光は、開口絞り（24)を経た後に長焦点距離の集光側コンデンサレンズ (25)を介し、開口数の小さい領域でのみ、照明光（10)はフローセル（20)内の試料 (21)に照射される。
例えば、磁気ピンセットや溶液交換システムを用いるような条件下では、このような 照明方法を選ばざるを得な ヽ。
[0024] 試料 (21)により照明光は散乱されるが、照明光（11)そのものは、対物レンズ (22) の後ろ焦点面に配設された遮光部材 (23)によって、その結像中心部が遮断される。 そのため、対物レンズ（12)力も射出された散乱光（12)のみをカメラの撮像面に集光 させれば、試料 (21)の暗視野像が得られる。
遮光部材 (23)としては、光を反射するアルミ等の光反射材を中央に選択的に蒸着 した透明な光学部品や、逆に光を吸収するスウェード等の光吸収材を中央に貼り付 けたガラス板などが利用可能である。
[0025] 光学系の光束は、視野絞りと開口絞りによって規定される。視野絞りが像の大きさを 規定するのに対し、開口絞りは光束の太さ、すなわち開口数を規定する。
開口数の大きさは対物レンズ毎に規定される。なお、接眼レンズを用いた目による 観察では、開口絞りの前方にあるレンズによる開口絞りの像が入射瞳であり、開口絞 りの後方にあるレンズによる開口絞りの像が射出瞳であり、開口絞り、入射瞳、射出 瞳はそれぞれ共役の関係になって!/、る。
また、試料面からの光束は、試料面の各点と入射瞳径を結んだもの、像面への光 束は、射出瞳径と像面の各点を結んだものとなる。 [0026] 一般に、開口数 (NA)は次式で与えられる。
(式 1)
NA=n sin θ
(ηは屈折率、 Θは光の照射角）
[0027] 開口数は、試料（21)に対して照明光（10)がどのくらいの角度で照射されているか を知るための指標になる。その照射角度が急であればあるほど、像の分解能が高くな る。小さな粒子であるほど光の散乱角が大きいので、開口数の高い領域でとらえた光 ほど、像の高周波成分が含まれ、微細な構造が観察可能になる。このように、開口数 は像の分解能を決める重要な量である。
また実際の照射角 Θの代わりに、対物レンズ (22)の特性を開口数で表現する理由 についても、スネルの法則を考えれば明らかである。光が異なる媒質の境界で屈折し ても、 n sin Θという値は保存されるので、実際の照射角 Θそのものを記述するより有 効である。
[0028] 対物レンズ（22) (無限遠系）において、ある開口数の満たす瞳の直径 φは、次式 で近似できる。
(式 2)
φ = 2-NA-L/M
(Lは第 2対物レンズの焦点距離、 Mは対物レンズの倍率）
[0029] 瞳は、後ろ焦点面の大きさとみなせる。像面を平行な光が通過した時、その光が集 光する場所が後ろ焦点面である。また、像面に理想的な点光源があった時、そこから ある開口数で広がる光の直径を、ここでは瞳の直径とみなせる。
ここで、対物レンズ (22)の後ろ焦点面においては、開口数は角度ではなく半径を 意味する。試料（21)面では角度をイメージするが、後ろ焦点面においては、式（2) で計算される領域の円環に相当する。また、コンデンサレンズで試料を照明する場合
、その開口数は対物レンズ（22)でも同じである。
[0030] 図 2では、対物レンズ (22)の後ろ焦点面に遮光部材（23)を配設している力 カメラ ポートの後方にレンズを配設し、それにより 1次像から 2次像を作れば、その間に後ろ 焦点面の共役像を形成することができる。この共役像に遮光部材を配設してもょ 、。 [0031] この時の遮光板の径 φ eは、次式で表される。
(式 3)
β= -f L
1
( Φは後ろ焦点面において遮光する領域の径、 f
1は後ろ焦点面の共役像を結像する レンズの焦点距離、 Lは第 2対物レンズの焦点距離）
[0032] この式（3)を式（2)に代入すると、下式 (4)が得られる。
式 (4)では、 Lが消えているので、顕微鏡の種類によらずこの式が有効であることが 分かる。
(式 4)
ΝΑ= β· Μ/2ί
1
[0033] なお、接眼レンズを用いた目による観察では、接眼レンズの射出瞳力 アイポイント と呼ばれる瞳面である。像面の関係と同様に、瞳面も互いに関係しながら射出瞳が 後段レンズの入射瞳となってリレーされていく。そのため、対物レンズ (22)より先のレ ンズ系では独自に瞳の位置を定義できない。対物レンズ (22)と鏡筒の距離も変化し うるので、複数の光学系をつなげる場合には、瞳のマッチングが必要となる。
[0034] また、本発明は、高速撮影などにより特に強い光の照明を必要とする場合に、レー ザ一を光源とした暗視野照明にも応用できる。従来のシステムでは、レーザー光を喑 視野コンデンサーに入射する際、光強度を損なわないために光を試料面に対して斜 めに入れる必要があった (例えば、
非特許文献 1 :)。 それに対し、本発明では、アーク型光源と同様に、レーザー光を 試料面に対して垂直に入射する。その照明光は後ろ焦点面で点像となり、それを中 央部の遮光部材 (23)で遮断することにより暗視野照明となる。斜光照明よりも、等方 的な照明となるので、より均一な画像が得られる利点がある。
非特許文献 l :Yasuda, R" Noji, H.'Yoshida, M., Kinosita, K., Jr. & Itoh, H. Resoluti on of distinct rotational substeps by submillisecondkinetic analysis of F1丄— ATPase. N ature 410, 898-904 (2001)
実施例 1
[0035] 複数の光学機器メーカーによる市販品の光学部品を組み合わせて、本発明の原 理に基づく暗視野顕微鏡を製作した。
1次像から 2次像を形成するレンズとして f =60mm、 f = 150mmの組み合わせを用
1 2
い、ガラス面上のゴミを観察したところ、通常の暗視野顕微鏡と変わらない良好な結 果が得られた。ただし、フィルターでハロゲンの波長帯域を絞った場合、十分な光量 が得られな 、と 、う問題が残った。
コンデンサレンズの開口数が高くなれば、照明光の光量が増えるので、遮光しなく てはならない開口数も増加するが、試料 (21)を照明する光の量も増加する。開口数 1.45の対物レンズ（22)を用いるなら、その中央を更に開口数 0.25塞いでも試料（21) 力 の散乱光（12)は十分に得られると考えられる。
[0036] 遮光部材（23)として遮光板を使用する場合は、設置する遮光板を、様々な大きさ のものに取り替え自在に構成してもよ 、。
遮光部材（23)の径を可変に構成する代わりに、 1次像に近 ヽ結像レンズを取り替 えるようにし、その焦点距離 f
1が可変になるように構成してもよい。式 (4)から明らかな ように、 f
1を短くすれば、光学系全体にとつての遮光板の開口数を大きくすることがで きる。
また 1次像から 2次像を形成する結像側光学系を複数のレンズで構成し、そのレンズ の中で後ろ焦点面の共役像を結像するレンズの合計の焦点距離力 ¾ =L- φ eZ Φと なるようにし、遮光部材（23)の大きさは一定のまま、開口数を調整できるようにしても よい。
[0037] ここで、デュアルポートテレビアダプタなどを付設する場合は、 1次像と 2次像の間に ミラーを配置し、後ろ焦点面の共役像もミラーの前に位置するように設定することが好 ましい。
[0038] f を 40mmとし、遮光している開口数、すなわち照明に使っている開口数を 0.375とし た。 f が 60mmの場合に比べて、（60Z40)2=2.25倍だけ光が強くなる力 遮光すること によってロスしている対物レンズの領域は (1.45— 0.375Z1.45 - 0.25)2 =0.80となる 。従って、光は約 1.8倍増加させられる。
[0039] 図 3は、直径 0.2 μ mのビーズを観察したプロファイルである。
試料のビーズは、ポリスチレン製であり、ガラス表面に結合している。 1次像から 2次像を形成するレンズを f =40mm、 f = 150mm,遮光板の径 φ =500
1 2
mの条件で観察したところ、ビーズが十分な明るさで観察された。 CCDカメラのゲイ ンを最大にし、蛍光観察のためのダイクロイツクミラーとェミッションフィルターを取り付 けた状態にもかかわらず、図示の通り十分な強度でビーズ 1個が観察できることが分 かった。
[0040] 図 4は、細菌の滑走運動を実際に撮影した図である。
運動性の細菌である Mycoplasma Mobileの 1個体を観察したところ、その滑走運動 が問題なく観察できることが分力つた。
細菌（30) (30' )は、図 4 (A)に示す始点位置から、矢印で示す線（31) (31 ' )に沿 つて移動し、図 4 (B)に示す終点位置に達した。
[0041] 光軸の調整は、下記の手順が好適である。
(1)試料に焦点を合わせる。
(2)ケーラー照明になるように、コンデンサレンズの xyzを調整する。なお、ケーラー 照明には、光源像をコンデンサレンズの焦点面に投影し、視野絞りが試料面上に正 しく結像し、かつ、必要な部分にまで絞り込め、観察に見合うだけの開口数を持つコ ンデンサレンズおよび照明系であることが必要である。
(3)光をカメラ側に切り替え、コンデンサレンズ f の位置を動力して、試料が撮像面 にフォーカスするようにする。これによつて、接目艮レンズのピントとカメラのピントが一致 する。
(4) 1次結像面の絞りを絞って、視野の中央がカメラの中央に一致するようにミラー を調整する。
(5)遮光板を光軸方向に移動させ、カメラに当たる光が最も暗くなる位置に設定す る。マイクロメーターで、遮光板の xy方向も動力しながら行なうことが好ましい。
[0042] 次に微調整として、開口絞り '光量'カメラのブラックレベルを変えながら、最適な像 が得られる条件を探す。
(6)コンデンサレンズの上の視野絞りを最小にし、光をカメラに入れない状態で、マ ィナスの値が出な 、ように、カメラのブラックレベルを調整する。
(7)光をカメラ側に切り替え、試料に焦点が合っている状態で、開口絞りを少しずつ 絞っていき、急に画面全体が暗くなる位置に設定する。この状態で、中央遮光板によ つて遮光されている開口数と、コンデンサレンズの開口数が一致する。
(8)光の強度を上げ、画面全体が飽和しそうになつたら、開口数を更に絞る。この 2 つの作業を交互に繰り返すことで、最適なコントラストが得られる。
(9)背景が 8bitの〜 10程度になるように、ブラックレベルを調整すると、像が一層見 やすくなる。必要であれば、輝度をモニターしながら、光量を更に上げる。
産業上の利用可能性 本発明の新しい原理の暗視野顕微鏡によると、従来の光学系や顕微鏡やカメラ等の システムを生かしたまま、対物レンズの絞りが必要なくなり、また開口数の低い長焦点 コンデンサレンズでも照明が実現できるようになった。
それに伴い、観察試料面の上側に空間が確保できるので、実験の応用範囲も広が つた。このような照明方法を採らざるを得な 、磁気ピンセットや溶液交換システムを用 いるような条件下には特に有効である。
暗視野顕微鏡は、 ICパターンの検査など工業分野にも用途が広ぐ産業上非常に 有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 照明光を発する光源と、その光源力 の照明光を集束させて観察試料を照明する 集光側コンデンサレンズを含む集光光学系と、観察試料からの散乱光を受光してそ の拡大像を結像する対物レンズを含む結像光学系とを備えた暗視野顕微鏡におい て、
集光側コンデンサレンズが長焦点距離のレンズであり、
結像光学系における後ろ焦点面の結像中心部に、照明光を遮断する遮光部材が 備わる
ことを特徴とする暗視野顕微鏡。
[2] 照明光を発する光源と、その光源力 の照明光を集束させて観察試料を照明する 集光側コンデンサレンズを含む集光光学系と、観察試料からの散乱光を受光してそ の拡大像を結像する対物レンズを含む結像光学系とを備えた暗視野顕微鏡におい て、
集光側コンデンサレンズが長焦点距離のレンズであり、
結像光学系における後ろ焦点面の共役像の結像中心部に、照明光を遮断する遮 光部材が備わる
ことを特徴とする暗視野顕微鏡。
[3] 結像光学系に、 1次像から 2次像を形成すると共に、その間に後ろ焦点面の共役像 を形成するレンズを配置した
請求項 2に記載の暗視野顕微鏡。
[4] 後ろ焦点面の共役像の結像中心部に配設される遮光部材が、
径 β= -f /L
1
( Φは後ろ焦点面において遮光する領域の径、 f
1は後ろ焦点面の共役像を結像する レンズの焦点距離、 Lは第 2対物レンズの焦点距離）
の遮光板である
請求項 3に記載の暗視野顕微鏡。
[5] 1次像から 2次像を形成する結像側光学系を複数のレンズで構成し、そのレンズの 中で後ろ焦点面の共役像を結像するレンズの合計の焦点距離が、
Figure imgf000014_0001
(Lは第 2対物レンズの焦点距離、 φ Θは遮光部材の径、 φは後ろ焦点面において遮 光する領域の径）
である
請求項 3に記載の暗視野顕微鏡。
[6] 1次像と 2次像の間にミラーを備える
請求項 1な!ヽし 5に記載の暗視野顕微鏡。
[7] 請求項 1ないし 6に記載の暗視野顕微鏡と、それによる像を受像するカメラを備えた 構成において、
接眼レンズの焦点調整により、観察試料にフォーカスを行ない、
集光側コンデンサレンズの位置調整により、ケーラー照明を行ない、
結像側レンズの位置調整により、観察試料を撮像面にフォーカスし、
1次結像面の絞り調整とミラーの位置調整により、視野中央をカメラ中央に一致させ 遮光部材の光軸方向位置調整により、背景光が最も暗くなる位置に設定することで 、光軸の調整を司る
ことを特徴とする暗視野顕微鏡の調整方法。
[8] マイクロメーターにより、遮光部材の光軸に垂直な方向を調整する
請求項 7に記載の暗視野顕微鏡の調整方法。
[9] 集光側コンデンサレンズ上の視野絞りを最小にし、
光をカメラに入れない状態で、ブラックレベルの調整により、その値がマイナス値に ならないように設定し、
光をカメラ側に切り替え、観察試料にフォーカスしたまま、開口絞りの調整により、像 が暗くなる位置に設定し、
光強度及び開口絞りの調整により、光量を増大させると共に開口数を絞る 請求項 7または 8に記載の暗視野顕微鏡の調整方法。
[10] ブラックレベルの調整により、観察試料の背景を最適化する
請求項 7な ヽし 9に記載の暗視野顕微鏡の調整方法。 光強度の調整により、観察試料の散乱光を増大させる 請求項 7ないし 10に記載の暗視野顕微鏡の調整方法。
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