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WO2007145232A1 - 二次イオン質量分析方法及びイメージング方法 - Google Patents

二次イオン質量分析方法及びイメージング方法 Download PDF

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Publication number
WO2007145232A1
WO2007145232A1 PCT/JP2007/061864 JP2007061864W WO2007145232A1 WO 2007145232 A1 WO2007145232 A1 WO 2007145232A1 JP 2007061864 W JP2007061864 W JP 2007061864W WO 2007145232 A1 WO2007145232 A1 WO 2007145232A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
analyzed
sample
ion beam
ion
mass spectrometry
Prior art date
Application number
PCT/JP2007/061864
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jiro Matsuo
Original Assignee
Kyoto University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University filed Critical Kyoto University
Priority to EP07767098A priority Critical patent/EP2037260A4/en
Priority to US12/308,326 priority patent/US7960691B2/en
Priority to JP2008521224A priority patent/JP5120955B2/ja
Publication of WO2007145232A1 publication Critical patent/WO2007145232A1/ja

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Classifications

    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/02—Details
    • H01J49/10—Ion sources; Ion guns
    • H01J49/14—Ion sources; Ion guns using particle bombardment, e.g. ionisation chambers
    • H01J49/142—Ion sources; Ion guns using particle bombardment, e.g. ionisation chambers using a solid target which is not previously vapourised
    • H—ELECTRICITY
    • H01—ELECTRIC ELEMENTS
    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
    • H01J49/0004—Imaging particle spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a secondary ion mass spectrometry method and an imaging method.
  • IMS imaging mass spectrometry
  • LDM laser desorption ionization
  • Non-patent document 1 Matrix—assisted laser desorption / ionization; hereinafter, “MALDI” is used to ionize any part of the sample and perform mass analysis by time-of-flight mass spectrometry (TOFMS).
  • TOFMS time-of-flight mass spectrometry
  • the primary ion source is a liquid metal ion source (hereinafter referred to as “: LM I”) that generates an ion beam of Ga + or In +, and the focused diameter of the ion beam is usually: L m And maximum lOOnm can be realized.
  • the Cs + ion gun which is an inexpensive primary ion source, has a spot diameter of 2 to 3 / ⁇ ⁇ .
  • LDI is a method that uses a laser beam that is not a primary beam, such as SIMS.
  • a laser For light irradiation, a laser with a wavelength that is absorbed by the sample or medium, It is required that the laser has an irradiation power density sufficient for vaporization of the polymer molecules and an appropriate pulse width (10 6 to 10 1Q WZc m 2 ).
  • a typical light source is a quadruple wave Nd ZYAG laser (wavelength 266 nm, pulse width 10 ns ⁇ pulse energy 10 m), and its spot diameter is usually about 1 to 5 / ⁇ ⁇ .
  • MALDI is a method in which a matrix that assists ionic ions of organic molecules is added to the surface of the sample and irradiated with a laser beam.
  • the matrix suppresses decomposition of organic molecules and desorbs them. And there is a merit that ionic candy is promoted.
  • a light source usually a laser
  • YAG laser wavelength 355nm, pulse width 10ns
  • the irradiation power is about 10 5 to 10 8 WZcm 2 which is considerably smaller than LDI is there.
  • SIMS surface resolution
  • lateral resolution lateral resolution
  • problems For example, organic molecules such as proteins are destroyed by elastic collisions between atoms and ions in a biological sample, so that only one measurement can be performed per minimum unit dividing the sample surface.
  • the amount of secondary ions generated from organic molecules gradually decreases and disappears when the cumulative dose of primary ions exceeds a certain value (static SIMS limit), but the SIMS static SIMS limit is approximately 10 12 X 10 13 ZCM 2 der is, when the primary ion current density InAZ m 2, the irradiation time is from about. 15 to 0.99 s, and becomes a serious problem in imaging.
  • SIMS has the problem of charging the sample due to the charge of the primary ions.
  • SIMS is not suitable for measurements targeting proteins and the like because the practical mass range is up to about 500. Therefore, secondary ion mass spectrometry (liquid-SIMS, hereinafter referred to as “LSIMS”) in which a non-volatile liquid compound such as glycerol is added as a liquid matrix has been proposed, and the practical mass range can be expanded to about 3000. is there.
  • LSIMS secondary ion mass spectrometry
  • the practical mass range of SIMS and LDI is up to about 500, while it is possible to measure targets with mass ranges exceeding this, such as proteins. Excellent sensitivity can be realized.
  • targets with mass ranges exceeding this, such as proteins. Excellent sensitivity can be realized.
  • the composition of the matrix and the method of addition there is a problem of fluctuation of the material distribution.
  • the ion generation site is larger than the irradiation spot diameter, so high surface resolution is difficult even if one laser beam is focused to the limit.
  • Non-Patent Document 1 Yasuhide Naito, “Mass Microscope for Biological Samples” J. Mass Spectrom. Soc. Jpn. Vol. 53, No. 3 pl25—132, 2005
  • Non-Patent Literature 2 Shuichi Shinma, Mitsutoshi Seta, “Trends in Imaging Mass Spectrometry” J. Mass. Soc. Jpn Vol. 53, No. 4, p230—238, 2005 Disclosure of Invention
  • an object of the present invention is to provide a new method capable of analyzing organic molecules such as proteins and environmental hormones with excellent sensitivity.
  • the present invention relates to a secondary ion mass spectrometry method with improved sensitivity, in which an analyte molecule is present at an atmol (amol) or sub-attomole level in a region irradiated with a primary ion beam.
  • the present invention is also an imaging method using secondary ion mass spectrometry, the step of irradiating a sample to be analyzed with a primary ion beam, and the sample sample to be analyzed by irradiation with the primary ion beam.
  • Process for mass analysis of generated secondary ions and quality of the obtained secondary ions And an image processing step based on a result of quantitative analysis, wherein the primary ion beam is a heavy ion beam of 1.25 keV Zamu or more.
  • the present invention further includes secondary ion mass spectrometry means for secondary ion mass spectrometry of the sample to be analyzed, and image processing means for image processing based on the mass analysis result of the obtained secondary ions.
  • An imaging apparatus wherein the secondary ion mass analyzing means includes an ion source, an irradiating means for irradiating a surface of the sample to be analyzed with a primary ion beam, and a sample ion force generated by the irradiation of the primary ion beam.
  • Mass analysis means for mass analysis of secondary ions wherein the ion source is an ion source that generates a heavy ion beam of 1.25 keV Zamu or more, and the irradiation means is a primary ion beam that generates the ion source force. 1. It relates to an imaging apparatus having a control means for controlling 25 keV Zamu or more. The invention's effect
  • the present invention uses a heavy ion beam of 1.25 keV Zamu or higher (hereinafter also referred to as "fast heavy ion beam”) as a primary ion beam in secondary ion mass spectrometry (hereinafter also referred to as SIMS).
  • a heavy ion beam of 1.25 keV Zamu or higher hereinafter also referred to as "fast heavy ion beam”
  • SIMS secondary ion mass spectrometry
  • the present invention is a new analysis method for biologically relevant substances, for example, in the medical field such as clinical and drug discovery and biological It is extremely useful in various fields such as academia.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a SIMS device of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic view showing an example of the imaging apparatus of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of SIMS of the present invention.
  • FIG. 4 shows mass spectra for a trehalose thin film in one example of the present invention. Is the result of
  • FIG. 5 is a result of mass spectrum for a trehalose thin film in another example of the present invention, (A) is a result of positive ions, and (B) is a result of negative ions.
  • FIG. 6 (A) is a graph showing the relationship between the stopping power (electronic stopping power. Nuclear stopping power) of trehalose for the Au ion beam and the energy of the ion beam.
  • FIG. 6 (B) is a graph showing the relationship between the stopping power of trehalose (electronic stopping power-nuclear stopping power) for the copper ion beam and the energy of the ion beam.
  • FIG. 6 (C) is a graph showing the relationship between the stopping power (electronic stopping power-nuclear stopping power) of trehalose with respect to the carbon ion beam and the energy of the ion beam.
  • FIG. 7 shows the result of mass spectrum of an arginine thin film in still another example of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between secondary ion yield and electronic blocking ability in still another example of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the ratio of parent ions to decomposed ions in still another example of the present invention.
  • FIG. 10 is an image of a triglycine thin film in still another example of the present invention.
  • A shows the result of 15 ⁇ 15 pixels
  • B shows 30 ⁇ 30 pixels.
  • C is a reference CCD image.
  • FIG. 11 (A) is a photograph of an image of a triglycine thin film in still another example of the present invention
  • FIG. 11 (B) shows the relationship between the ionic strength of the triglycine thin film and scan coordinates. It is a graph which shows.
  • FIG. 12 shows the result of mass spectrum for a trehalose thin film in still another example of the present invention.
  • FIG. 13 shows the result of mass spectrum for a triglycine thin film in still another example of the present invention.
  • FIG. 14 is an example of mass spectrum results for peptides.
  • FIG. 15 is an example of imaging results for peptides.
  • FIG. 16 is an example of a mass spectrum result for a mixed lipid sample.
  • the present invention provides a secondary ion mass spectrometry method (SIM S) with improved sensitivity, in which a molecule to be analyzed is at an atomic or subatomic level in a region irradiated with a primary ion beam.
  • SIM S secondary ion mass spectrometry method
  • the primary ion beam is a heavy ion beam of 1.25 keV / amu or more.
  • “heavy ions” refers to ions heavier than He ions
  • keVZamu is a general unit indicating the velocity of an ion beam
  • “amu” is an abbreviation for Atomic Mass Unit.
  • the speed of the primary ion beam is not particularly limited as long as it is 1.25 keVZamu or more as described above, but is preferably 2 keVZamu or more, more preferably 4 keVZamu or more.
  • the upper limit of the speed is not particularly limited, and is, for example, 83, OOOkeVZamu or less, preferably 8,300 keVZamu or less, more preferably 1,250 keVZamu or less.
  • the ion source of the primary ion beam is not particularly limited !, but, for example, Au, Ar, Ga, In, Bi, O, Cs, Xe, SF, C, Ag, Si, C, Cu Etc. Among these,
  • Ga, In, Au, Bi, and the like are preferable because an ion source with high brightness can be easily formed.
  • the ion source is Au
  • the primary ion species are, for example, Au, Au 2+ , Au 3+ , Au 4+ , Au 5+ , and the higher the ion valence, the higher the energy. I prefer a charged ion.
  • the electronic stopping power of the molecule to be analyzed with respect to the primary ion beam is equal to or more dominant than the nuclear stopping power.
  • a heavy ion beam with ion energy is preferred.
  • the ion energy at the boundary point where the electronic stopping power and the nuclear stopping power for the primary ion beam of the molecule to be analyzed are equivalent is preferably 0.5 MeV or more, for example, in the case of Au ions. Is greater than or equal to IMeV, particularly preferably greater than or equal to 5 MeV, and the upper limit is not particularly limited, but is, for example, lOOOMeV or less.
  • the stopping power is the degree to which a charged particle loses energy due to interaction with a substance while traveling a unit length in the substance.
  • the electronic stopping power is the stopping power (contribution of inelastic scattering) due to the interaction between the charged particle and the substance's electron system
  • the nuclear stopping power is the elasticity between the charged particle and the nucleus. This is the stopping power (contribution of elastic scattering) caused by collision.
  • the relationship between the electronic stopping ability and the nuclear stopping ability of the molecule to be analyzed for various ion species can be known based on common technical knowledge by those skilled in the art.
  • the energy of the primary ion beam is not particularly limited.
  • It is preferably 5 MeV or more, more preferably lMeV or more, particularly preferably 5 MeV or more, and the upper limit is not particularly limited, but is, for example, lOOOMeV or less
  • the primary ion beam is usually a focused ion beam, and its beam diameter is, for example, 5 to: LO, OOOnm, preferably 5 to: LOOOnm, and more preferably. 5 ⁇ : LOOnm.
  • the dose amount of the primary ion beam is not particularly limited. 1S For example, 10 12 to 10 15 ionsZcm 2 , preferably 10 12 to 10 14 ionsZcm 2 , more preferably 10 12 to 10 13 ions / cm 2 .
  • the primary ion beam may be irradiation with a continuous pattern (non-pulse irradiation) or irradiation with a non-continuous pattern (pulse irradiation).
  • the frequency is, for example, 100 Hz to: LOOkHz, preferably 1 kHz to 100 kHz, more preferably 1 kHz to 50 kHz
  • the pulse width is, for example, 5 to: LOOns, preferably 5 to 20 ns, more preferably 5 ns or less.
  • the pulsing can be performed by, for example, an electrostatic field or a static magnetic field.
  • Time-of-flight ion mass spectrometry can be performed by pulse irradiation of a primary ion beam, as in the conventional method.
  • non-pulse irradiation may be used according to the method of the present invention.
  • the reason why TOFMS is possible by this non-pulse irradiation is based on the following mechanism.
  • the primary ion beam is irradiated, secondary electrons and secondary ions are generated, but the pulse of secondary electrons is higher than the pulse of secondary ions. Therefore, the difference between the pulse heights of secondary electrons and secondary ions is used to determine the start and end of the analysis. Specifically, as shown in the schematic diagram of FIG.
  • the amount of beam may be smaller than that of norse irradiation (about lkcps to 100 kcps).
  • the secondary ion detected in the present invention may be either a positive secondary ion or a negative secondary ion.
  • the negative secondary ion is detected. It is preferable.
  • the sample to be analyzed is usually irradiated with the primary ion beam in a vacuum.
  • the vacuum conditions are not particularly limited, the same conditions as conventional SIMS can be employed, for example, in the range of 10- 3 ⁇ 10- 8 Pa.
  • irradiation in the atmosphere is possible by a method in which the primary ions are incident on the sample through a thin film that separates from the atmosphere, or by maintaining the differential pressure by differential exhaust.
  • the sample to be analyzed is an analyte in which the molecule to be analyzed is present at the atomic level (amol) or subatomic level in the region irradiated with the primary ion beam. It is a sample.
  • the sample to be analyzed is not particularly limited as long as it contains the molecule to be analyzed, and examples thereof include biological samples.
  • the molecule to be analyzed refers to a molecule to be detected in secondary ion mass spectrometry. Examples of the molecules to be analyzed include biological substances and biopolymers.
  • the biological substance is not limited to a biologically isolated substance, for example, and may be an artificially prepared substance such as an enzymatic reaction or chemical synthesis.
  • the molecular weight of the molecule to be analyzed is not particularly limited, but is, for example, 50 or more, preferably 100 or more, and the upper limit thereof is not particularly limited, for example, 10,000 or less, 5, 000 or less, 2,000 or less
  • the yield of secondary ions increases as the energy of the heavy ion beam, which is the primary ion beam, is, for example, 0.5 MeV or higher.
  • the higher the energy of the primary ion beam the easier it is for the analyte molecules to be decomposed when irradiated with the primary ion beam, and even if the yield is improved, the improvement in sensitivity can be expected. I thought it was not.
  • the secondary ion mass spectrometry method of the present invention since the decomposition of the analyte molecule is suppressed as the secondary ion yield is improved, the analyte molecule at the atomic or sub-attomole level can be detected, and the highly sensitive secondary ion mass spectrometry method can be used. Secondary ion mass spectrometry is possible. According to the secondary ion mass spectrometry method of the present invention, for example, a trace amount of an analysis sample can be analyzed. In the present invention, the amol or Sabuatomoru, for example, 0. 01: A L, 000 X 10- 18 mol, preferably 0. 1: a L00 X 10- 18 mol.
  • the molecule to be analyzed may be present at attomole or sub-attomole level in at least one region irradiated with the primary ion beam.
  • the sample to be analyzed can further improve the secondary ion yield, for example, a matrix agent used in MALDI is further added, or a metal thin film is formed on the surface of the sample to be analyzed. You may form by vapor deposition.
  • the sample to be analyzed is usually placed on a substrate (stage) for the sample to be analyzed.
  • the composition of the substrate is not particularly limited.
  • a Si substrate a substrate with a transparent conductive film such as ITO, a metal substrate such as stainless steel, and an insulating substrate such as glass because the incident amount of primary ions is small. Etc.
  • substrates such as Au and Ag are also preferred.
  • the present invention provides an imaging method using secondary ion mass spectrometry, which includes a step of irradiating a sample to be analyzed with a primary ion beam, and generation from the sample to be analyzed by irradiation with the primary ion beam.
  • the primary ion beam, its irradiation conditions, and the secondary ion mass analysis method are as described above.
  • the sample to be analyzed includes a sample containing a molecule to be analyzed, such as a biological sample, and the content of the molecule to be analyzed is not particularly limited.
  • the molecules to be analyzed include biological substances and biopolymers as described above.
  • the image processing includes, for example, converting the obtained analysis result of the secondary ions into an image signal and displaying the converted image signal, which are performed by using a conventionally known method. Yes.
  • the imaging method of the present invention scanning and irradiating a primary ion beam on the XY plane of the sample to be analyzed, and secondary ions generated from each irradiation region of the sample to be analyzed are performed. Based on the result of mass analysis of the secondary ions, an image signal is obtained in each irradiation region of the sample to be analyzed, and each irradiation is performed on the XY coordinates corresponding to the XY plane of the sample to be analyzed. And an imaging method including displaying the image signal corresponding to the region.
  • the scanning method of the primary ion beam is not particularly limited.
  • scanning may be performed by moving the sample to be analyzed, or the irradiation site may be moved by deflecting the primary ion beam.
  • a method of moving the sample to be analyzed using an XY axis stage or the like is preferable.
  • the size of the pixel is not particularly limited, but, for example, 0.01 X 0. 01! 1 to 10 10 111, preferably 0.01 X 0. 01 ⁇ to 5 ⁇ 5 ⁇ m, more preferably 0.01 X 0.01 ⁇ m to l ⁇ ⁇ ⁇ m.
  • the Pixenole is generally a minimum unit obtained by dividing an image processing area, and the length of one side corresponds to the amount of movement of the primary ion beam to be scanned. That is, in the present invention, the pixel is synonymous with each irradiation region.
  • the time required for analyzing one pixel is not particularly limited, but is, for example, 0.0 1 to: LOsec, preferably 0.01 to: more preferably 0.01 to 0.1 sec. It is.
  • a secondary ion beam is generated by irradiating the sample to be analyzed with a primary ion beam, and a secondary ion relative to the surface of the sample to be analyzed is generated.
  • Mass spectrometry in a state in which a general positional relationship is maintained, and an image signal is obtained based on the analysis result of the secondary ions, and this is displayed as an ion image so as to correspond to the positional relationship.
  • an imaging method including projecting onto the screen. As will be described later, this uses an enlarged ion optical system instead of scanning with a primary ion beam, so that, for example, secondary ions generated with a plurality of positional forces can be detected at the same time. Thus, the time can be further shortened.
  • an apparatus for performing secondary ion mass spectrometry includes an ion source, irradiation means for irradiating the surface of the sample to be analyzed with a primary ion beam, and the sample to be analyzed by irradiation with the primary ion beam.
  • the ion source is a ion source that generates a heavy ion beam of 1.25 keV Zamu or more, and the irradiation means generates the ion source force.
  • An example is a SIMS device with a control means for controlling the primary ion beam to 1.25 k eVZamu or higher. According to this apparatus, the above-described SIMS of the present invention can be executed.
  • the control means is not particularly limited, and a normal ion accelerator can be used.
  • FIG. 1 is an example of the SIMS device of the present invention, and is not limited to this.
  • the SIMS apparatus shown in the figure includes an ion source 11, a primary ion beam irradiation means including an accelerator 12, a sorting electromagnet 13 and a focusing and deflection system 14, and a secondary ion analyzer 16 as a mass analyzing means.
  • the irradiating means usually further includes an electrode pair (a force sword electrode and an anode electrode) for generating plasma and an extraction electrode for primary ions.
  • the mass spectrometric means includes a microchannel plate (amplifying the secondary ions extracted from the arch I, the extraction electrode of the secondary ions between the sample 15 to be analyzed and the analyzer 16). Equipped with an electron multiplier such as MCP).
  • MCP electron multiplier
  • SIMS of an analysis sample can be performed as follows. First, by generating a plasma by applying a voltage between the anode electrode and the force sword electrode, primary ions (heavy ions) are generated, and an electrode is applied between the anode electrode and the extraction electrode. To extract the primary ions. Then, the extracted primary ion beam (A in the figure) is accelerated by the calorimeter 12 so that it becomes 1.25 keV Zamu or more, and the accelerated primary ion beam is distributed by passing the distribution electromagnet 13. It is deflected in the direction of the sample to be analyzed by a converging 'deflection system 14 (for example, a deflection plate).
  • a converging 'deflection system 14 for example, a deflection plate.
  • the primary ion beam is irradiated onto the sample 15 to be analyzed (for example, a biological sample) to generate secondary ions (B in the figure). And it applies to a secondary ion extraction electrode, a secondary ion is introduce
  • the extracted secondary ions may be amplified through an electron multiplier such as a multi-ion plate (MCP) and then analyzed by the analyzer 16.
  • MCP multi-ion plate
  • secondary ions generated by the irradiation of the primary ion beam obtain kinetic energy by the acceleration voltage and fly in the flight tube toward the analyzer. The resolution can be further improved by increasing the length of the flight tube or by using a reflection analyzer.
  • the apparatus is irradiated with a primary ion beam
  • the analysis result of the sample to be analyzed on the XY plane can be obtained.
  • the scanning may be performed, for example, by moving the stage on which the sample to be analyzed is placed on the X axis and the Y axis, or by moving the irradiation site by deflecting the primary ion beam by an electrostatic field or a static magnetic field. Also good.
  • a device for slicing cells such as a microtome or a two-dimensional electrophoresis device may be used in conjunction.
  • the slicer for example, cell slicing and praying can be performed continuously, so that, for example, a three-dimensional distribution can be analyzed.
  • a sample is prepared by adding a matrix to the sample to be analyzed. Therefore, when the sample is subjected to electrophoresis, the force required to cut out the gel force is essential. The sample subjected to electrophoresis can be analyzed as it is. For this reason, high-sensitivity and rapid analysis is possible in conjunction with the electrophoresis apparatus.
  • the present invention provides secondary ion mass spectrometry means for performing secondary ion mass spectrometry on a sample to be analyzed, and image processing means for performing image processing based on the obtained mass analysis result of secondary ions.
  • An imaging device including: an ion source; an irradiation means for irradiating a surface of the sample to be analyzed with a primary ion beam; and an irradiation from the sample to be analyzed by irradiation with the primary ion beam.
  • the ion source is an ion source that generates a heavy ion beam of 1.25 keV Zamu or more
  • the irradiation means is a primary ion beam generated from the ion source.
  • the present invention relates to an imaging device equipped with a control means for controlling 1.25 keV Zamu or more.
  • Examples of the secondary ion mass spectrometry means include the SIMS device described above.
  • the secondary ion mass spectrometry means includes scanning means that scans and irradiates a primary ion beam onto the XY plane of the analysis sample, and the image processing means includes the second ion processing apparatus.
  • image signal generating means for obtaining an image signal in each irradiation region of the sample to be analyzed, and each irradiation region at the XY coordinates corresponding to the XY plane of the sample to be analyzed
  • an imaging device including display means for displaying the image signal corresponding to.
  • the scanning unit include a deflection unit and a moving unit for the sample to be analyzed.
  • FIG. 2 is an example of the image display device of the present invention, and is not limited to this, and the same parts as those in FIG.
  • the image display device shown in the figure further includes a calculation unit 17 and a display unit 18 which are image signal creation means in addition to the SIMS device shown in FIG.
  • a calculation unit 17 and a display unit 18 which are image signal creation means in addition to the SIMS device shown in FIG.
  • an analyte sample can be imaged as follows.
  • a primary ion beam (A in the figure) is scanned and irradiated on the XY plane of the sample 15 to be analyzed, and the generated secondary ions (! And B in the figure) are analyzed.
  • the analysis result of the mass spectrometry is input to the calculation unit 17 and converted into an image signal.
  • the converted image signal force display unit 18 is input to display a two-dimensional image of the sample 15 to be analyzed. Specifically, the analysis result of each pixel is obtained by scanning irradiation, and each of these analysis results is converted into an image signal.
  • the image signal corresponding to each pixel The symbol may be displayed in the XY coordinates corresponding to the XY plane of the sample to be analyzed. Thereby, a two-dimensional image of the sample to be analyzed can be displayed.
  • Conversion of the analysis result power in the calculation unit 17 into an image signal is not particularly limited, and a conventionally known method can be adopted. Specifically, for example, for each mZz that is a target, the intensity of the ion signal of each pixel (for example, the ion count number, ion current value, etc.) may be replaced with a signal indicating color shading. For example, the higher the ion signal intensity, the higher the color density, and the lower the ion signal intensity, the lower the color density. In this way, the analysis result (ion signal intensity) is replaced with a signal indicating the color density, and this signal is input to the display unit.
  • the intensity of the ion signal of each pixel for example, the ion count number, ion current value, etc.
  • the analysis result ion signal intensity
  • this signal is input to the display unit.
  • the sample to be analyzed is displayed as a two-dimensional image depending on the color density.
  • the color shading can be represented by, for example, a gray scale in which white to black are divided stepwise by the color density.
  • the distribution of a plurality of substances can be displayed in one image.
  • an enlarged ion optical system may be used instead of the method of scanning the primary ion beam (so-called "scanning modej").
  • This is a two-dimensional analysis of the target substance on the surface of the sample to be analyzed.
  • secondary ions are generated in a planar shape, and the analysis is performed with the relative positional relationship of the secondary ion ions maintained! (Stigmatic mode: projection type)
  • an enlarged ion optical system for example, an electrostatic lens, an electrostatic field, or the like
  • an objective lens in a magnetic field, etc. can be used to project an enlarged ion image on the display unit, so that secondary ions with multiple potential forces can be detected simultaneously, making image processing even more time-consuming.
  • Trehalose was analyzed by irradiating a MeV high-speed heavy ion beam and detecting the generated secondary ions.
  • a trehalose thin film having a thickness of lOOnm was formed on a single crystal Si substrate by spin-coating a trehalose aqueous solution. The trehalose thin film was irradiated with a high-speed heavy ion beam under the following conditions, and the generated secondary ions (negative ions) were detected.
  • Fig. 4 shows the results of the mass spectrum when irradiated with a 9 MeV (A u 5+ ) ion beam.
  • Beam volume ⁇ 10pA (measured by F. C. with suppressor)
  • FIG. 4A is a mass spectrum showing positive ions
  • FIG. 4B is a mass spectrum showing negative ions.
  • trehalose peaks T—OH +, T—H—
  • trehalose peak is larger than darcos peak, it can be said that detection of negative ions is more preferable in the case of trehalose.
  • FIG. 6 (A) shows the relationship between the stopping power of trehalose (electronic stopping power and nuclear stopping power) for the Au ion beam and the energy of the ion beam.
  • the vertical axis is the stopping power (eVZA)
  • the horizontal axis is the energy (MeV)
  • the solid line is the electronic stopping power
  • the dotted line is the result of the nuclear stopping power.
  • the energy of the ion beam to irradiate is about 3 MeV or higher, and the electronic stopping power is dominant. It can be said.
  • Figure 6 (B) shows the relationship between the stopping power of trehalose (electronic stopping power 'nuclear stopping power) for the Cu ion beam and the energy of the ion beam.
  • the vertical axis is stopping power (e VZ A)
  • the horizontal axis is energy (MeV)
  • the left chevron line shows electronic stopping power
  • the right chevron line shows nuclear stopping power.
  • the energy at which the electron stopping power and the nuclear stopping power are the same is 700keV and llkeVZamu
  • the energy at which the electron stopping power is twice the nuclear stopping power is 1200keV and 19keVZamu.
  • Figure 6 (C) shows the relationship between the stopping power of trehalose (electronic stopping power. Nuclear stopping power) for the C ion beam and the energy of the ion beam.
  • the vertical axis is the stopping power (eVZA)
  • the horizontal axis is the energy (MeV)
  • the left chevron line shows the electronic stopping power
  • the right chevron line shows the nuclear stopping power. Show.
  • the energy at which the electron stopping power and the nuclear stopping power are the same is 15 keV and 1.25 keV Zamu
  • the energy at which the electron stopping power is twice the nuclear stopping power is 30 keV and 25 keV Zamu.
  • Arginine was analyzed by irradiating a 9 MeV high-speed heavy ion beam (Au 5+ ) and detecting the generated secondary ions.
  • a trehalose thin film and an arginine thin film were formed on the Si substrate surface in the same manner as in Example 1 and Example 2, respectively, and the relationship between the yield of secondary ions generated and the electronic stopping power was examined. confirmed.
  • the secondary ion yield was determined as the ratio of secondary ion to primary ion (secondary ion Z primary ion).
  • the ion species, energy, and standardization energy (square of velocity) of the ion beam to be irradiated are as follows.
  • Each symbol indicates the result of arginine positive ion r (country), arginine negative ion (mouth), trehalose positive ion ( ⁇ ), and trehalose negative ion ( ⁇ ).
  • Yield Secondary ion / primary ion
  • the yield of secondary ions is improved by irradiating an ion beam with high electron stopping power.
  • the ion efficiency is improved by irradiating a high-energy ion beam.
  • the yield of trehalose molecular ions is about 0.1 molecule ions / primary ions. Therefore, (i) the beam diameter is 0.3 / ⁇ ⁇ , (ii) the limit dose is 10 12 primary ionsZcm 2 or less, and (i ii) one molecule layer of trehalose on the substrate surface (2 X 10 14 molecules / cm 2 ) Assuming that it is adsorbed! /, 100 trehalose molecular ions can be detected. At this time, since the number of trehalose molecules on the surface is 2 ⁇ 10 5 molecules, it can be estimated that 0.3 attomole molecules can be detected.
  • Mass spectrometry was performed by irradiating a triglycine (Gly-Gly-Gly) thin film whose surface was covered with a mesh with a 6 MeV copper ion beam (95 keV Zamu). Imaging processing was performed. Unless otherwise indicated, the conditions were the same as in Example 1.
  • a triglycine thin film (lcm X lcm) having a thickness of lOOnm was formed on a Si substrate by spin coating an aqueous triglycine solution, and the triglycine thin film was covered with a mesh.
  • the mesh passed 70 wires per inch (wire spacing 360 ⁇ m), and the wire thickness was about 30 ⁇ m.
  • FIG. 10 shows this image. Note that (A) in the figure shows the results for the number of pixels of 15 ⁇ 15 pixels, and (B) shows the results for the number of pixels of 30 ⁇ 30 pixels. The figure also shows an optical microscope image (Fig. (C)).
  • the triglycine thin film is generated by scanning a copper ion beam along the Y-axis direction (arrow in the figure) as shown in the image photograph of FIG. 11A.
  • the intensity of the secondary ions was measured.
  • the pinhole diameter was 10 ⁇ m
  • the scan width was 150 ⁇ m
  • the step width was 1 ⁇ m. The result is shown in the graph of FIG. From the figure, it was found that the full width at half maximum of the beam was about 5 m.
  • a trehalose thin film was formed on a Si substrate in the same manner as in Example 1, and the same mesh as in Example 4 was placed on the surface. Then, continuous irradiation (lOOcps) of 9MeV Au 5+ beam as primary ions was performed, and TOFMS was performed with detection of secondary electrons as analysis start signal and detection of negative secondary ions as analysis end signal. On the other hand, the same trehalose thin film was subjected to TOFMS by irradiating a 9MeV Au 5+ beam discontinuously (pulse irradiation) under the following conditions. These results are also shown in Fig. 12.
  • Beam diameter 2mm in diameter
  • Beam amount 5000cps (continuous irradiation)
  • Pulse 50 nanoseconds, 10kHz repetition (pulse irradiation)
  • Measurement time 500 seconds (pulse irradiation) 200 seconds (continuous irradiation)
  • a 6MeV copper ion beam (95keVZa mu) was applied to a triglycine (Gly-Gly-Gly) thin film in the same manner as in Example 4 except that the length of the flight tube on which the secondary ions flew was changed. Irradiated to perform mass spectrometry. The results of these mass spectra are shown in FIG.
  • a square bismuth flat plate was placed on the Si substrate to form a lattice-shaped groove (width 30 m) as shown in Fig. 15A.
  • a solution of the following peptide (1154u) was dropped into this groove to form a thin film, and a 6 MeV copper ion beam (95 keV Zamu) was irradiated for mass spectrometry, and imaging was performed based on the results.
  • Other conditions of mass spectrometry were the same as in Example 1.
  • the peptide used was a quenching fluorescent substrate for caspase 3 having the following structure (manufactured by Peptide Laboratories).
  • MOCAc represents (7-Methoxycounarin-4-yl) acetyl, and represents Dnpi or Dinitrophenyl.
  • FIG. 14 An example of the result of the mass spectrum is shown in Fig. 14, and the result of imaging is shown in Fig. 15 (2). As shown in these figures, even molecules having a molecular weight exceeding 1000 could be detected well. The spatial resolution of imaging was 5 ⁇ m.
  • the present invention for example, even when the sample to be analyzed is a biological substance such as a protein or a polysaccharide, the destruction of the biological substance such as conventional SIMS is suppressed. And ionization efficiency is excellent. For this reason, according to the present invention, it is possible to analyze biologically related substances such as proteins with high sensitivity. Also, since a matrix like conventional LSIMS and MALDI is not essential, high surface resolution can be realized. In addition, according to the present invention, mass analysis with high sensitivity can be performed on biologically related substances, and therefore image display can be performed according to the obtained analysis. If image display becomes possible, the presence or distribution of biologically relevant substances and their distribution can be easily confirmed. Therefore, the present invention is a new analytical method for biologically relevant substances, for example, clinical fields such as clinical and drug discovery and biological It is extremely useful in various fields.

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Abstract

　優れた感度でタンパク質や環境ホルモン等の有機分子を分析する新たな方法の提供。 　重イオンビームを一次イオンビームに使用した二次イオン質量分析方法は、高感度であって、例えば、サブアトモルレベルの生体関連物質を検出できる。これにより、良好な生体関連試料のイメージングが可能となる。

Description

明 細 書
二次イオン質量分析方法及びイメージング方法
技術分野
[0001] 本発明は、二次イオン質量分析方法及びイメージング方法に関する。
背景技術
[0002] 近年、生化学や医学の分野にお!ヽて、新たに、生体を分子レベルで解析し、画像 として表示するイメージングマススぺタトロメトリー（以下、「IMS」 t\、う） t\、う手法が 着目されている。この IMSは、例えば、二次イオン質量分析法（secondary ion m ass spectrometry;以下、「SIMS」という）、レーザー脱離イオン化（laser desorp tion/ionization；以下「LDI」という）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化方法（ matrix— assisted laser desorption/ionization;以 、「MALDI」と 、っリによ り、試料の任意の部位をイオン化し、飛行時間型質量分析法 (TOFMS)により質量 分析を行い、前記試料における物質の分布や局在状態を可視化する方法である (非 特許文献 1、非特許文献 2)。この手法によって、タンパク質、ペプチド、環境ホルモン 等の各種有機化合物を測定すれば、例えば、細胞レベルの機能変化を検出すること による超早期診断、テーラーメイド医療、創薬候補の選別、創薬のデリバリーのサー チ、生命現象や疾患の解明等が可能になるため、極めて有用な手法として期待され ている。
[0003] 具体的には、 SIMSを用いた IMSは、 3〜25keVに加速し収束させた一次イオンビ 一ムを高真空中で試料に照射し、前記試料の表面力も物質力 Sスパッタされる際に発 生する二次イオンを利用する方法である。通常、一次イオン源としては、 Ga+や In+の イオンビームを発生する液体金属イオン源（liquid metal ion source ;以下「： LM I」という）が使用され、イオンビームの収束径は、通常: L mであり、最大 lOOnmが実 現できる。また、安価な一次イオン源である Cs+イオン銃は、 2〜3 /ζ πιのスポット径で ある。
[0004] また、 LDIは、 SIMSのように一次ビームではなぐレーザービームを使用する方法 である。光照射については、試料または媒質によって吸収される波長のレーザー、試 料分子の気化に十分な照射パワー密度、および、適切なパルス幅（106〜101QWZc m2)のレーザーであることが必要とされている。代表的な光源としては、 4倍波の Nd ZYAGレーザー（波長 266nm、パルス幅 10nsゝパルスエネルギー 10m)があげら れ、そのスポット径は、通常 1〜5 /ζ πι程度で使用されている。
[0005] MALDIは、有機分子のイオンィ匕を補助するマトリックスを試料表面に添カ卩してレー ザ一ビームを照射する方法であり、前記マトリックスにより、有機分子の分解が抑制さ れ、脱離やイオンィ匕が促進されるというメリットがある。光源としては、通常、 Νレーザ
2 一（波長 337nm、パルス幅 4ns)や 3倍波 Nd:YAGレーザー（波長 355nm、パルス 幅 10ns)等が使用され、照射パワーは、 LDIよりもかなり小さい 105〜108WZcm2程 度である。
[0006] しかしながら、 SIMSを用いた場合、面分解能（lateral resolution)には優れるも のの、以下のような問題がある。例えば、生体試料中の原子とイオンとの弾性衝突に より、タンパク質等の有機分子が破壊されてしまうため、試料表面を分割した極小単 位あたり 1回の測定しか行うことができない。また、有機分子由来の二次イオン生成量 は、一次イオンの積算照射量が一定の値 (static SIMS limit)を超えると次第に 減少して消滅するが、 SIMSの static SIMS limitは、約 1012 X 1013個 Zcm2であ り、一次イオン電流密度を InAZ m2とすると、照射時間は約 15〜 150 sとなり、 イメージングにおいては大きな問題点となる。以上のように、 1回しか測定を行うことが できず、且つ、イオンィ匕効率が悪く有機分子由来の二次イオン生成量が低い場合、 十分な測定が行えず、 SIMSを用いた方法では感度が問題となる。さらに、 SIMSに は、一次イオンの電荷による試料の帯電 (チャージアップ)の問題もある。
[0007] また、 SIMSは、実用的な質量範囲が 500程度までであることから、タンパク質等を 標的とする測定には適していない。そこで、グリセロール等の不揮発性液状ィ匕合物を 液体マトリックスとして添加する二次イオン質量分析 (liquid— SIMS、以下「LSIMS 」という）が提案され、実用的な質量範囲を 3000程度まで拡大可能である。しかし、 質量範囲の拡大や、 static SIMS limitを回避して感度を向上させることが可能で あるものの、物質分布が乱れてしまうという問題がある。
[0008] 一方、 LDIを用いた場合、 SIMSのように試料表面のチャージアップの問題がなぐ SIMSの static SIMS limitに相当するイオン生成量の減少も SIMSよりは少ない 。し力しながら、 1パルスごとのイオン生成量が極めて微量であるため、複数回のパル ス照射で測定と信号積算とを繰り返す必要があり、この方法によっても感度の問題が ある。
[0009] そして、 MALDIの場合は、 SIMSや LDIの実用的な質量範囲が 500程度までで あるのに対して、タンパク質のようなこれを超える質量範囲の標的についても測定が 可能であり、非常に優れた感度を実現できる。し力しながら、マトリックスの組成や添 加方法によっては、物質分布の変動という問題がある。また、マトリックス内部でのェ ネルギー伝播により、イオン生成部位が、照射スポット径よりも拡大するため、レーザ 一ビームを極限に収束しても、高い面分解能が困難である。
非特許文献 1 :内藤康秀、「生体試料を対象にした質量顕微鏡」 J. Mass Spectrom . Soc. Jpn. Vol. 53, No. 3 pl25— 132, 2005
非特許文献 2 :新間秀一、瀬籐光利、「イメージングマススぺクトメトリーの動向」 J. M ass. Spectrom. Soc. Jpn Vol. 53, No. 4, p230— 238, 2005 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] したがって、本発明は、優れた感度でタンパク質や環境ホルモン等の有機分子の 分析が可能となる新たな方法の提供を目的とする。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明は、感度が向上した二次イオン質量分析方法であって、一次イオンビーム が照射される領域に分析対象分子がアトモル (amol)又はサブアトモルレベルで存 在する被分析試料を準備する工程と、被分析試料に一次イオンビームを照射するェ 程と、前記一次イオンビームの照射により前記被分析試料力 発生する二次イオンを 質量分析する工程とを含み、前記一次イオンビームは、 1. 25keVZamu以上の重 イオンビームである二次イオン質量分析方法に関する。
[0012] 本発明はまた、二次イオン質量分析を用いたイメージング方法であって、被分析試 料に一次イオンビームを照射する工程と、前記一次イオンビームの照射により前記被 分析試料カゝら発生する二次イオンを質量分析する工程と、得られた二次イオンの質 量分析結果に基づいて画像処理する工程とを含み、前記一次イオンビームは、 1. 2 5keVZamu以上の重イオンビームであるイメージング方法に関する。
[0013] 本発明はさらにまた、被分析試料を二次イオン質量分析する二次イオン質量分析 手段、及び、得られた二次イオンの質量分析結果に基づいて画像処理する画像処 理手段を含むイメージング装置であって、前記二次イオン質量分析手段が、イオン 源、被分析試料の表面に一次イオンビームを照射する照射手段、及び、前記一次ィ オンビームの照射により前記被分析試料力 発生する二次イオンを質量分析する質 量分析手段を備え、前記イオン源は、 1. 25keVZamu以上の重イオンビームを発 生するイオン源であり、前記照射手段は、前記イオン源力 発生する一次イオンビー ムを 1. 25keVZamu以上に制御する制御手段を備えるイメージング装置に関する。 発明の効果
[0014] 本発明は、二次イオン質量分析法 (以下、 SIMSともいう。 )において一次イオンビ ームとして 1. 25keVZamu以上の重イオンビーム（以下、「高速重イオンビーム」とも いう）を使用することにより、被分析試料がタンパク質や多糖類等の生体関連物質で あっても、従来の SIMSのような前記生体関連物質の破壊を抑制でき、イオン化効率 にも優れる。このため、本発明によれば、タンパク質等の生体関連物質を高感度で分 析することが可能である。また、従来の LSIMSや MALDIのようなマトリックスが必須 ではないため、高い面分解能も実現できる。また、このように本発明によれば、生体 関連物質について高感度での質量分析が可能となるため、得られた分析に従って画 像表示 (イメージング）を行うことができる。画像表示が可能となれば、生物関連物質 の有無やその分布を容易に確認できるため、本発明は、生体関連物質の新たな分 析方法として、例えば、臨床、創薬等の医学分野や生物学等の様々な分野において 極めて有用である。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は、本発明の SIMS装置の一例を示す概略図である。
[図 2]図 2は、本発明のイメージング装置の一例を示す概略図である。
[図 3]図 3は、本発明の SIMSの一例を示す概略図である。
[図 4]図 4は、本発明の一実施例における、トレハロース薄膜についての質量スぺタト ルの結果である。
[図 5]図 5は、本発明のその他の実施例における、トレハロース薄膜についての質量 スペクトルの結果であり、（A)は正イオンの結果、（B)が負イオンの結果である。
[図 6A]図 6 (A)は、 Auイオンビームに対するトレハロースの阻止能（電子的阻止能. 核的阻止能）とイオンビームのエネルギーとの関係を示すグラフである。
[図 6B]図 6 (B)は、銅イオンビームに対するトレハロースの阻止能 (電子的阻止能-核 的阻止能）とイオンビームのエネルギーとの関係を示すグラフである。
[図 6C]図 6 (C)は、炭素イオンビームに対するトレハロースの阻止能 (電子的阻止能- 核的阻止能）とイオンビームのエネルギーとの関係を示すグラフである。
[図 7]図 7は、本発明のさらにその他の実施例における、アルギニン薄膜についての 質量スペクトルの結果である。
[図 8]図 8は、本発明のさらにその他の実施例における、二次イオン収率と電子的阻 止能との関係を示すグラフである。
[図 9]図 9は、本発明のさらにその他の実施例における、親イオンと分解イオンとの比 を示すグラフである。
[図 10]図 10は、本発明のさらにその他の実施例における、トリグリシン薄膜の画像で あり、（A)は画素数 15 X 15ピクセルの結果、（B)は、画素数 30 X 30ピクセルの結果 であり、（C)は参考の CCD画像である。
[図 11]図 11 (A)は、本発明のさらにその他の実施例における、トリグリシン薄膜の画 像写真であり、同図（B)は、前記トリグリシン薄膜のイオン強度とスキャン座標の関係 を示すグラフである。
[図 12]図 12は、本発明のさらにその他の実施例における、トレハロース薄膜について の質量スペクトルの結果である。
[図 13]図 13は、本発明のさらにその他の実施例における、トリグリシン薄膜について の質量スペクトルの結果である。
[図 14]図 14は、ペプチドについての質量スペクトルの結果の一例である。
[図 15]図 15は、ペプチドについてのイメージングの結果の一例である。
[図 16]図 16は、混合脂質試料についての質量スペクトルの結果の一例である。 発明を実施するための最良の形態
[0016] < SIMS >
本発明は、一つの態様において、感度が向上した二次イオン質量分析方法 (SIM S)であって、一次イオンビームが照射される領域に分析対象分子がアトモル (amol) 又はサブアトモルレベルで存在する被分析試料を準備する工程と、被分析試料に一 次イオンビームを照射する工程と、前記一次イオンビームの照射により前記被分析試 料力も発生する二次イオンを質量分析する工程とを含み、前記一次イオンビームは、 1. 25keV/amu以上の重イオンビームである。本発明において「重イオン」とは、 H eイオンよりも重いイオンをいい、 keVZamuは、イオンビームの速度を示す一般的な 単位であり、「amu」は、 Atomic Mass Unitの略である。
[0017] 前記一次イオンビームの速度は、前述のように 1. 25keVZamu以上であれば特 に制限されないが、好ましくは 2keVZamu以上であり、より好ましくは 4keVZamu 以上である。また、速度の上限も特に制限されず、例えば、 83, OOOkeVZamu以下 であり、 8, 300keVZamu以下が好ましぐより好ましくは 1, 250keVZamu以下で ある。
[0018] 前記一次イオンビームのイオン源としては、特に制限されな!、が、例えば、 Au、 Ar 、 Ga、 In、 Bi、 O、 Cs、 Xe、 SF、 C 、 Ag、 Si、 C、 Cu等があげられる。この中でも、
2 5 60
輝度の高いイオン源をつくりやすいことから、 Ga、 In、 Au、 Bi等が好ましい。イオン源 が Auの場合、一次イオン種は、例えば、 Au、 Au2+、 Au3+、 Au4+、 Au5+があげられ、 イオン原子価が大き 、程エネルギーが高 、ことから、多価イオンが好ま 、。
[0019] 前記一次イオンビームは、前記速度を満たして 、ればよ 、が、前記分析対象分子 の一次イオンビームに対する電子的阻止能が核阻止能と同等または核阻止能より支 配的になるイオンエネルギーの重イオンビームであることが好ましい。また、前記分析 対象分子の一次イオンビームに対する電子的阻止能と核阻止能とが同等となる境界 点のイオンエネルギーは、例えば Auイオンの場合、 0. 5MeV以上であることが好ま しぐより好ましくは IMeV以上であり、特に好ましくは 5MeV以上であり、その上限は 特に制限されないが、例えば、 lOOOMeV以下である。前記阻止能とは、荷電粒子 が物質中の単位長さを進む間に、物質との相互作用によってエネルギーを失う度合 いを言い、中でも、電子的阻止能とは、荷電粒子と物質の電子系との相互作用による 阻止能 (非弾性散乱の寄与)であり、核阻止能とは、荷電粒子と原子核との弾性衝突 によって生じる阻止能（弾性散乱の寄与)である。なお、各種イオン種に対する分析 対象分子の電子的阻止能と核阻止能との関係は、当該技術分野における当業者で あれば、技術常識に基づいて知ることができる。
[0020] さらに、前記一次イオンビームのエネルギーは、特に制限されないが、例えば、 0.
5MeV以上であることが好ましぐより好ましくは lMeV以上であり、特に好ましくは 5 MeV以上であり、その上限は特に制限されないが、例えば、 lOOOMeV以下である
[0021] 本発明において、前記一次イオンビームは、通常、収束イオンビームであり、そのビ ーム径は、例えば、 5〜： LO, OOOnmであり、好ましくは 5〜： LOOOnmであり、より好ま しくは 5〜： LOOnmである。また、一次イオンビームのドーズ量は、特に制限されない 1S 例えば、 1012〜1015ionsZcm2であり、好ましくは、 1012〜1014ionsZcm2であり、 より好ましくは、 1012〜1013ions/cm2である。
[0022] 本発明にお 、て、前記一次イオンビームは、連続パターンでの照射 (非パルス照射 )でもよいし、非連続的パターンでの照射 (パルス照射)であってもよい。パルス照射 において、周波数は、例えば、 100Hz〜： LOOkHzであり、好ましくは、 lkHz〜100k Hz、より好ましくは、 lkHz〜50kHzであり、パルス幅は、例えば、 5〜： LOOnsであり、 好ましくは、 5〜20ns、より好ましくは、 5ns以下である。パルス化は、例えば、静電場 '静磁場により行うことができる。
[0023] 本発明の方法による飛行時間型イオン質量分析 (TOFMS)は、従来法と同様に、 一次イオンビームのパルス照射によって行うことができる。し力しながら、本発明の方 法によれば、非パルス照射であってもよい。この非パルス照射により TOFMSが可能 である理由は、以下のようなメカニズムに基づく。一次イオンビームを照射すると、二 次電子と二次イオンが発生するが、二次電子のパルスは二次イオンのパルスよりも高 いという性質を示す。したがって、二次電子と二次イオンのパルスの高さの相違を利 用して、分析の開始時と終了時を決定するのである。具体的には、図 3の模式図に 示すように、連続パターンのイオンを被分析試料に照射してから、まず、二次イオン のパルスよりも高 ヽ二次電子のパルス信号を取り出し、これを分析開始信号とする。 そして、その後に発生する二次イオンのパルス（二次電子よりも低!、パルス)信号を取 り出し、これを分析終了信号とする。この分析開始信号から分析終了信号が検出され るまでの時間が飛行時間 (TOF)となる。このように非パルス照射によれば、イオンの 利用効率が低い（例えば、 0. 1%以下)パルスビームを使用しないため、イオンの利 用効率が向上し、分解能の向上も可能である。また、非パルス照射の場合、ノ ルス照 射と比較して、ビーム量も少なくてよい（約 lkcps〜100kcps)。本発明において検出 する二次イオンは、正の二次イオンと負の二次イオンのいずれでもよいが、このような 非パルス照射による TOFMS分析を行う際には、負の二次イオンを検出することが好 ましい。さらに、非パルス照射の場合に、二次電子等でパルス間隔をモニターするこ とによって、パルスのオーバラップによるノイズを低減することも可能である。
[0024] 本発明において、前記一次イオンビームは、通常、真空中で被分析試料に照射す ればよい。真空条件としては、特に制限されず、従来の SIMSと同様の条件が採用 でき、例えば、 10— 3〜10— 8Paの範囲である。また、例えば、一次イオンを大気と隔てる 薄膜を通して試料に入射する方法や、差動排気により差圧を維持することによって、 大気中での照射も可能である。
[0025] 本発明の二次イオン質量分析方法にお!ヽて、被分析試料は、一次イオンビームが 照射される領域に分析対象分子がアトモル (amol)又はサブアトモルレベルで存在 する被分析試料である。被分析試料としては、分析対象分子を含むものであれば、 特に制限されず、例えば、生物関連試料などがあげられる。本発明において、分析 対象分子とは、二次イオン質量分析において検出対象とする分子をいう。前記分析 対象分子としては、生物関連物質、生体高分子などがあげられ、具体的には、例え ば、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、単糖や多糖等の糖類、 DNAや RNA等の核 酸、脂質、環境ホルモン等があげられる。なお、本発明において生物関連物質とは、 例えば、生物力 単離した物質には限られず、例えば、酵素反応や化学合成等によ つて人工的に調製したものであってもよい。本発明において、分析対象分子の分子 量は、特に制限されないが、例えば、 50以上であり、好ましくは 100以上であって、そ の上限も特に制限されず、例えば、 10, 000以下、 5, 000以下、 2, 000以下であつ て、例えば、 50〜： LO, 0000であり、好まし <は、 100〜5, 000であり、より好まし <は 、 100〜2, 000であり、さらにより好ましくは 100〜500である。
[0026] 本発明の二次イオン質量分析方法は、一次イオンビームである重イオンビームのェ ネルギ一が、例えば、 0. 5MeV又はそれ以上になるほど、二次イオンの収率があが るとともに、分析対象分子の分解が起こらなくなるという知見に基づく。すなわち、一 般的には、一次イオンビームのエネルギーが高くなるほど一次イオンビームが照射さ れたときに分析対象分子が分解されやすくなり、たとえ収率が向上しても、感度の向 上は望めないと考えられた。しかしながら、本発明の二次イオン質量分析方法では、 二次イオン収率の向上とともに分析対象分子の分解が抑制されるため、アトモル又は サブアトモルレベルの分析対象分子を検出でき、高感度な二次イオン質量分析方法 が可能となる。本発明の二次イオン質量分析方法によれば、例えば、微量な被分析 試料の分析も可能となる。本発明において、アトモル又はサブアトモルとは、例えば、 0. 01〜： L, 000 X 10— 18モルであって、好ましくは、 0. 1〜： L00 X 10— 18モルである。本 発明の二次イオン質量分析方法における被分析試料は、一次イオンビームを照射 する少なくとも 1つの領域に、分析対象分子がアトモル又はサブアトモルレベルで存 在すればよい。
[0027] また、前記被分析試料は、二次イオン収率をより一層向上できることから、例えば、 MALDIで使用されて ヽるマトリックス剤をさらに添加したり、前記被分析試料の表面 に金属薄膜を蒸着等により形成してもよい。
[0028] 前記被分析試料は、通常、被分析試料用の基板 (ステージ）に配置される。前記基 板の組成は、特に制限されないが、例えば、 Si基板、 ITO等の透明導電膜付き基板 、ステンレス等の金属基板、さらには、一次イオンの入射量が少ないことから、ガラス 等の絶縁基板等があげられる。また、二次イオン収率をより一層向上できることから、 Auや Ag等の基板も好まし 、。
[0029] <イメージング方法 >
本発明は、その他の態様として、二次イオン質量分析を用いたイメージング方法で あって、被分析試料に一次イオンビームを照射する工程と、前記一次イオンビームの 照射により前記被分析試料から発生する二次イオンを質量分析する工程と、得られ た二次イオンの質量分析結果に基づ 、て画像処理する工程とを含み、前記一次ィ オンビームは、 1. 25keVZamu以上の重イオンビームであるイメージング方法に関 する。一次イオンビーム及びその照射条件、並びに、二次イオンの質量分析方法に ついては、上述のとおりである。本発明のイメージング方法において、被分析試料は 、分析対象分子を含むもの、例えば、生物関連試料などがあげられ、前記分析対象 分子の含有量は特に制限されない。前記分析対象分子としては、上述のとおり、生 物関連物質、生体高分子などがあげられる。前記画像処理は、例えば、得られた二 次イオンの分析結果を画像信号に変換すること、及び、変換した画像信号を表示す ることを含み、それらは、従来公知の方法を利用することにより行える。
[0030] 本発明のイメージング方法の一態様として、被分析試料の XY平面に一次イオンビ ームを走査して照射すること、前記被分析試料の各照射領域から発生する二次ィォ ンをそれぞれ質量分析すること、及び、前記二次イオンの質量分析結果に基づいて 前記被分析試料の各照射領域における画像信号を得て、前記被分析試料の XY平 面に相当する XY座標に前記各照射領域に対応する前記画像信号を表示することを 含むイメージング方法があげられる。
[0031] 一次イオンビームの走査方法は、特に制限されず、例えば、被分析試料を移動さ せることによって走査してもよいし、一次イオンビームを偏向させて照射部位を移動さ せてもよいが、操作が容易であることから、例えば、 XY軸ステージ等を用いて、被分 析試料を移動させる方法が好まし ヽ。
[0032] 本発明のイメージング方法にぉ 、て、ピクセルのサイズは特に制限されな 、が、例 えば、 0. 01 X 0. 01 ！!1〜10 10 111でぁり、好ましくは0. 01 X 0. 01 πι〜5 Χ 5 μ mであり、より好ましくは 0. 01 X 0. 01 μ m〜l Χ ΐ μ mである。前記ピクセノレは、 一般に、画像処理を行う領域を分割した最小の単位であり、一辺の長さは、走査する 一次イオンビームの移動量に相当する。すなわち、本発明において、前記ピクセル は、各照射領域と同義である。したがって、例えば、各ピクセルのマススペクトル (分 析結果)を画像信号に置き換え、他方、 XY座標をピクセルに分割し、各ピクセルに 対応する画像信号を表示することによって、後述するように被分析試料を視覚化でき る。 [0033] また、一個のピクセルの分析に要する時間は、特に制限されないが、例えば、 0. 0 1〜： LOsecあり、好ましくは 0. 01〜： Lsecゝより好ましくは 0. 01〜0. lsecである。
[0034] 本発明のイメージング方法のその他の態様として、前記被分析試料に一次イオンビ ームを照射して二次イオンを面状に発生させること、前記被分析試料の面における 二次イオンの相対的な位置関係を維持した状態で質量分析を行うこと、及び、前記 二次イオンの分析結果に基づ ヽて画像信号を得て、これを前記位置関係と対応する ようにイオン像として表示部に投影することを含むイメージング方法があげられる。こ れは、後述するとおり、一次イオンビームの走査に換えて、拡大イオン光学系を使用 しものであり、これにより、例えば、複数の位置力 発生した二次イオンを同時に検出 できるため、画像処理において、より一層時間の短縮を図ることができる。
[0035] < SIMS装置 >
つぎに、本発明において、二次イオン質量分析を行う装置としては、イオン源、被分 析試料の表面に一次イオンビームを照射する照射手段、及び、前記一次イオンビー ムの照射により前記被分析試料力 発生する二次イオンを質量分析する質量分析手 段を備え、前記イオン源力 1. 25keVZamu以上の重イオンビームを発生するィォ ン源であり、前記照射手段が、前記イオン源力 発生する一次イオンビームを 1. 25k eVZamu以上に制御する制御手段を備えるこる SIMS装置があげられる。この装置 によれば、前述の本発明の SIMSを実行することができる。前記制御手段としては、 特に制限されず、通常のイオン加速器が使用できる。
[0036] 本発明における SIMS装置の一例を図 1に示す。なお、図 1は、本発明の SIMS装 置の一例であって、これには制限されない。同図に示す SIMS装置は、イオン源 11と 、加速器 12、振分電磁石 13および収束'偏向系 14を含む一次イオンビーム照射手 段と、質量分析手段として二次イオン分析器 16とを備える。図示していないが、前記 照射手段は、通常、さらに、プラズマを発生するための電極対 (力ソード電極およびァ ノード電極）、および、一次イオンの引出し電極を備える。前記質量分析手段は、通 常、被分析試料 15と分析器 16との間に、さら〖こ、発生した二次イオンの引出し電極、 弓 Iき出した二次イオンを増幅させるマイクロチャンネルプレート（MCP)等の電子増 倍素子を備える。また、被分析試料 15は、通常、ステージに配置されるが、前記ステ ージは、走査分析を行うため、 XY平面上で移動する XY軸ステージが好ましい。
[0037] この装置を用いて、例えば、以下のようにして被分析試料の SIMSを行うことができ る。まず、アノード電極と力ソード電極間に電圧を印加してプラズマを発生させること により、一次イオン (重イオン）を生成し、さら〖こ、アノード電極と引出し電極との間に 電極を印加することによって、前記一次イオンを取り出す。そして、取り出した一次ィ オンビーム（同図において A)を、カロ速器 12で 1. 25keVZamu以上となるように加 速し、加速した一次イオンビームを、振分電磁石 13の通過によって振分けた後、収 束'偏向系 14 (例えば、偏向板）により被分析試料の方向に偏向する。この一次ィォ ンビームを被分析試料 15 (例えば、生体関連試料）に照射して、二次イオン（同図に おいて B)を発生させる。そして、二次イオン引出し電極に印加して、二次イオンを分 析器 16に導入し、質量分析を行う (質量 Z電荷比)。引き出した二次イオンは、マル チイオンプレート (MCP)等の電子増倍素子を通して増幅させた後、分析器 16で質 量分析してもよい。図示していないが、一次イオンビームの照射によって発生した二 次イオンは、加速電圧によって運動エネルギーを得、フライトチューブ中を分析器に 向かって飛行する。このフライトチューブの長さを長くする、あるいは、反射型分析計 を用いることによって、さらに分解能を向上させることも可能である。
[0038] 前記装置にお!、て、一次イオンビームを走査して照射すれば、被分析試料の XY 平面上の分析結果を得ることができる。走査は、例えば、被分析試料を配置している ステージを X軸および Y軸に移動させることによって行ってもよいし、一次イオンビー ムを静電場または静磁場により偏向させて照射部位を移動させてもよい。
[0039] さらに、ミクロトーム等の細胞をスライスする装置 (スライサー）や、二次元電気泳動 装置と連動させてもよい。前記スライサーを備える場合、例えば、細胞のスライスと分 祈とを連続的に行うことができるため、例えば、 3次元的な分布を解析することが可能 となる。また、従来の MALDIでは、被分析試料にマトリックスを添加して試料を調製 するため、試料を電気泳動に供した場合、ゲル力ゝらの切り出しが必須であった力 本 発明の方法によれば、電気泳動に供した試料をそのまま分析することが可能である。 このため、電気泳動装置と連動させて、高感度で迅速な分析も可能である。
[0040] <イメージング装置 > 本発明は、さらにその他の態様において、被分析試料を二次イオン質量分析する 二次イオン質量分析手段、及び、得られた二次イオンの質量分析結果に基づいて画 像処理する画像処理手段を含むイメージング装置であって、前記二次イオン質量分 析手段が、イオン源、被分析試料の表面に一次イオンビームを照射する照射手段、 及び、前記一次イオンビームの照射により前記被分析試料から発生する二次イオン を質量分析する質量分析手段を備え、前記イオン源は、 1. 25keVZamu以上の重 イオンビームを発生するイオン源であり、前記照射手段は、前記イオン源から発生す る一次イオンビームを 1. 25keVZamu以上に制御する制御手段を備えるイメージン グ装置に関する。前記二次イオン質量分析手段としては、例えば、上述の SIMS装 置があげられる。
[0041] 本発明のイメージング装置の一態様として、前記二次イオン質量分析手段が、分析 試料の XY平面に一次イオンビームを走査して照射する走査手段を含み、前記画像 処理手段が、前記二次イオンの質量分析結果に基づ!、て前記被分析試料の各照射 領域における画像信号を得る画像信号作成手段、及び、前記被分析試料の XY平 面に相当する XY座標に前記各照射領域に対応する前記画像信号を表示する表示 手段を含むイメージング装置があげられる。前記走査手段としては、例えば、偏向手 段や、前記被分析試料の移動手段があげられる。
[0042] 本発明の画像表示装置の一例を図 2に示す。なお、図 2は、本発明の画像表示装 置の一例であって、これには制限されず、また、図 1と同一箇所には同一符号を付し ている。同図に示す画像表示装置は、前記図 1に示す SIMS装置に加えて、さらに、 画像信号作成手段である演算部 17、及び、表示部 18を備える。この装置を用いて、 例えば、以下のようにして被分析試料のイメージングを行うことができる。
[0043] まず、前述と同様にして、一次イオンビーム（図において A)を被分析試料 15の XY 平面に走査して照射し、発生した二次イオン（図にお!、て B)を分析器 16にお 、て質 量分析する。この質量分析の分析結果が演算部 17に入力されて画像信号に変換さ れ、この変換された画像信号力 表示部 18に入力されて被分析試料 15の二次元画 像が表示される。具体的には、走査照射により各ピクセルの分析結果が得られ、これ らの分析結果はそれぞれ画像信号に変換される。この各ピクセルに対応する画像信 号を、被分析試料の XY平面に相当する XY座標に表示すればよい。これによつて、 被分析試料の二次元画像が表示できる。
[0044] 演算部 17における分析結果力も画像信号への変換は、特に制限されず、従来公 知の方法が採用できる。具体的には、例えば、標的となる mZzごとに、各ピクセルの イオン信号の強度 (例えば、イオンカウント数やイオン電流値等）を、色の濃淡を示す 信号に置換すればよい。例えば、イオン信号の強度が相対的に高い程、色の濃度は 相対的に濃くなり、イオン信号の強度が相対的に弱い程、色の濃度は相対的に薄く 設定できる。このように分析結果 (イオン信号の強度)を色の濃度を示す信号に置換 し、この信号を表示部に入力する。また、表示の際には、被分析試料の XY平面にお ける X軸 Y軸を基準として、被分析試料の各ピクセル (各照射領域)の座標 (x、 y)に、 各ピクセルの画像信号が示す色が表示されるため、色の濃淡によって被分析試料が 二次元画像として表示されることとなる。色の濃淡は、例えば、白から黒までを色の濃 度で段階的に分割したグレイスケールで表すことができる。また、この他にも、例えば 、 Z軸 (垂直軸)をイオン信号強度とする三次元図形や、カラー画像での表示も可能 である。特にカラー画像として表示する場合、例えば、標的とする mZzごとに色相を 変化させれば、 1つの画像において、複数の物質の分布を表示することもできる。
[0045] また、一次イオンビームの走査を行う方法（ 、わゆる「scanning modej )に代えて 、拡大イオン光学系を使用してもよい。これは、被分析試料の表面における目的物質 の二次元分布を反映するように、二次イオンを面状に発生させ、二次イオンイオンの 相対的な位置関係を維持した状態で分析を行!ヽ、この分析結果を位置関係と合わ せてイオン像として表示部に投影する方法である（stigmatic mode：投影型)。具 体例としては、例えば、分析器 (検出器)の前段または後段に、拡大イオン光学系（例 えば、静電レンズ、静電場や磁場における対物レンズ等）を配置すれば、拡大したィ オン像を表示部に投影できる。これにより、複数の位置力 発生した二次イオンを同 時に検出できるため、画像処理において、より一層時間の短縮を図ることができる。 実施例 1
[0046] MeVの高速重イオンビームを照射して、発生した二次イオンを検出することにより、 トレハロースの分析を行った。 [0047] トレハロース水溶液をスピンコーティングすることによって、単結晶 Si基板上に厚み lOOnmのトレハロース薄膜を形成した。そして、このトレハロース薄膜に下記条件で 高速重イオンビームを照射し、発生した二次イオン (負イオン）を検出した。 9MeV(A u5+)のイオンビームを照射した際の質量スペクトルの結果を図 4に示す。
[0048] (条件）
入射イオン： 3MeV ( 15keV/amu)
6MeV (30keV/amu)
9MeV (45keV/amu)
試料 ：トレハロース薄膜 (分子量 342. 30)
ビーム量：〜 10pA(F. C.による計測、サプレッサ有）
ビーム径：直径 2mm
パルス ：50ナノ秒、繰り返し 10kHz
測定時間： 500秒
1回の測定における照射量：〜 106ions
(〜10 ions/ cm )
入射角： 30°
[0049] 図 4に示すように、 9MeVのイオンビームを照射することにより、スペクトルにおいて 2分子のグルコースが結合したトレハロース (T—OH)のピークが検出できた。通常の SIMSの場合、 2分子のグルコース間の 1, 1結合が切断されるため、二糖のトレハロ ースを検出できないが、 MeVのイオンビームを照射することにより、結合を切断する ことなくトレハロースの検出が可能となることがわ力つた。
[0050] また、同様にしてトレハロース薄膜にイオンビーム（6MeV Au4+)を照射し、発生す る正イオンと負イオンとをそれぞれ検出した。この結果を図 5に示す。同図 (A)が正ィ オンを示す質量スペクトルであり、同図（B)が負イオンを示す質量スペクトルである。 同図に示すように、正イオンおよび負イオンのいずれによっても、トレハロースのピー ク (T— OH+、 T—H—)がそれぞれ検出できた。特にトレハロースのピークがダルコ一 スのピークよりも大きいことから、トレハロースの場合、負イオンの検出がより好ましいと いえる。 [0051] なお、図 6 (A)に、 Auイオンビームに対するトレハロースの阻止能（電子的阻止能' 核的阻止能）とイオンビームのエネルギーとの関係を示す。同図において、縦軸が阻 止能 (eVZA)、横軸がエネルギー（MeV)であり、実線が電子的阻止能、点線が核 的阻止能の結果である。同図に示すように、照射するイオンビームのエネルギーが約 3MeV以上で電子的阻止能が支配的となっていることから、少なくとも IMeV以上で イオン照射を行えば、前述と同様の結果が得られるといえる。
[0052] 図 6 (B)に Cuイオンビームに対するトレハロースの阻止能（電子的阻止能'核的阻 止能）とイオンビームのエネルギーとの関係を示す。同図において、縦軸が阻止能（e VZ A)、横軸がエネルギー（MeV)であり、左の山型の線が電子的阻止能を示し、 右の山型の線が核的阻止能を示す。同図に示すように、電子阻止能と核阻止能が 同じになるエネルギーが 700keV、 llkeVZamuであり、電子阻止能が核阻止能の 2倍になるエネルギーが 1200keV, 19keVZamuである。
[0053] 図 6 (C)に Cイオンビームに対するトレハロースの阻止能 (電子的阻止能.核的阻止 能）とイオンビームのエネルギーとの関係を図 6に示す。同図において、縦軸が阻止 能（eVZA)、横軸がエネルギー（MeV)であり、左の山型の線が電子的阻止能を示 し、右の山型の線が核的阻止能を示す。同図に示すように、電子阻止能と核阻止能 が同じになるエネルギーが 15keV、 1. 25keVZamuであり、電子阻止能が核阻止 能の 2倍になるエネルギーが 30keV、 25keVZamuである。
実施例 2
[0054] 9MeVの高速重イオンビーム (Au5+)を照射して、発生した二次イオンを検出するこ とにより、アルギニンの分析を行った。
[0055] アルギニン水溶液をスピンコーティングすることによって、単結晶 Si基板上に厚み 1
OOnmのアルギニン薄膜 (分子量 174. 2)を形成した。そして、このアルギニン薄膜 に前記実施例 1と同じ条件で MeVのイオンビームを照射し、二次イオン (正イオン)を 検出した。この質量スペクトルの結果を図 7に示す。
[0056] 図 7に示すように、アルギニンのピークが検出できた。特に親イオン (Arg+H)+の 大きなピークが観察できたことから、アミノ酸は MeVイオンビームの照射によっても分 解され難いことがわ力つた。 実施例 3
[0057] (1)実施例 1および実施例 2と同様にして Si基板表面にトレハロース薄膜およびァ ルギニン薄膜をそれぞれ形成し、発生する二次イオンの収率と電子的阻止能との関 係を確認した。二次イオン収率は、二次イオンと一次イオンの比（二次イオン Z一次 イオン）として求めた。照射するイオンビームのイオン種、エネルギーおよび規格化工 ネルギー（速度の 2乗）は、以下の通りである。
[0058] [表 1] エネルギー 規格化エネルギー イオン種
Figure imgf000018_0001
[0059] これらの結果を、図 8に示す。同図において、数字はイオンビームのエネルギー（単
A
位 MeV)を示し、それぞれのシンボルは、アルギニンの正イオン r（國）、アルギニンの 負イオン（口）、トレハロースの正イオン（▲)、トレハロースの負イオン（△)の結果を示 す。同図に示すように、電子阻止能が高いイオンビームを照射することによって、二 次イオン収率（Yield = Secondary ion/primary ion)が向上している。つまり、 エネルギーの高いイオンビームを照射することによって、イオンィ匕効率が向上してい る。
[0060] (2)アルギニン薄膜に異なるエネルギーのイオンビームを照射し、親イオンと分解ィ オンの収率比と電子的阻止能との関係を確認した。
[0061] 実施例 2と同様にして、 Si基板上にアルギニン薄膜を形成した。そして、イオンビー ム（Auイオン）のエネルギーを、 0. 5MeV、 lMeV、 3MeV、 6MeV、 9MeVに変化 させた以外は、前記実施例と同様にして分析を行った。そして、発生した親イオン (A rg + H) +と分解イオン ( Arg - COOH + H) +のとの比を収率比（ Arg— COOH + H) + Z(Arg+H)+として求めた。この結果を図 9に示す。
[0062] 同図に示すように、電子阻止能が高いイオンビームを照射することによって、分解ィ オンが減少した。つまり、エネルギーの高いイオンビームを照射することによって、分 解イオンの発生を抑制して、効率良く親イオンを生成させることが可能であることがわ かる。
[0063] (3)検出レベル
前述のように 9MeV Au5+の一次イオンビームをトレハロースに照射した際、トレハ ロース分子イオンの収量は、約 0. 1 molecule ions/primary ionsである。したが つて、（i)ビーム径 0. 3 /ζ πι、 （ii)限界ドーズ量 1012primary ionsZcm2以下とし、 (i ii)基板表面にトレハロースが 1分子層（2 X 1014分子 /cm2)吸着して!/、ると仮定する と、 100個のトレハロース分子イオンを検出できる。この際、表面のトレハロースの分 子数は、 2 X 105分子であることから、 0. 3アトモルの分子検出が可能になると推測で きる。
[0064] また、イメージングを行った場合に、 1ピクセル当たりどの程度のトレハロース分子ィ オンが検出できるかという点を検討する。 9MeV Au5+の一次イオンビームをトレハロ ースに照射した際、トレハロース分子イオンの収量は、 MCP等の電子倍増素子の検 出効率を考慮して、約 0. 1 molecule ions/primary ionsと考えられる。したがつ 飞、 u) 1ピグ ノレを 1 μ Ώΐ Χ ΐ μ ΐη (10—。cm2)、 （ii)限界ドーズ量 1012 pnmarv ions /cm2以下と仮定すると、 1ピクセル当たり 1000個のトレハロース分子イオンを検出 できる。この結果から、イメージングにおいて十分な分子の検出が可能であることがわ かる。
実施例 4
[0065] (1)表面をメッシュで覆ったトリグリシン（Gly- Gly-Gly)薄膜に 6MeVの銅イオンビ ーム（95keVZamu)を照射して質量分析を行!ヽ、その結果に基づ 、てイメージング 処理を行った。なお、特に示さない限りは、実施例 1と同様の条件とした。
[0066] トリグリシン水溶液をスピンコーティングすることによって、 Si基板上に、厚み lOOnm のトリグリシン薄膜（lcm X lcm)を形成し、さらに、前記トリグリシン薄膜をメッシュで 覆った。前記メッシュは、 1インチ当たり 70本のワイヤーが通っており（ワイヤーの間隔 360 μ m)、ワイヤーの太さは約 30 μ mであった。
[0067] そして、このトリグリシン薄膜表面に、走査しながら 6MeVの高速重イオンビーム (銅 イオンビーム)を照射し、二次イオン (負イオン)を検出した。そして、検出結果を用い て画像処理を行った。この画像を図 10に示す。なお、同図 (A)は、画素数 15 X 15ピ クセルの結果であり、同図（B)は、画素数 30 X 30ピクセルの結果である。同図に光 学顕微鏡像をあわせて示す（同図 (C) )。
[0068] (2)また、前記トリグリシン薄膜に対して、図 11 (A)の画像写真に示すように銅ィォ ンビームを Y軸方向に沿って（図における矢印）走査し、発生する二次イオンの強度 を測定した。なお、ピンホール径 10 μ m、スキャン幅 150 μ m、ステップ幅 1 μ mとし た。この結果を図 11 (B)のグラフに示す。同図から、ビームの半値幅は約 5 mであ ることがわかった。
実施例 5
[0069] 実施例 1と同様にして、 Si基板上にトレハロース薄膜を形成し、その表面に、実施 例 4と同様のメッシュを配置した。そして、一次イオンとして 9MeVの Au5+ビームを連 続照射（lOOcps)し、二次電子の検出を分析開始信号、負の二次イオンの検出を分 析終了信号として TOFMSを行った。他方、同様のトレハロース薄膜に、以下の条件 で非連続的に 9MeVの Au5+ビームを照射（パルス照射）して、 TOFMSを行った。こ れらの結果を図 12に合わせて示す。
[0070] ビーム径：直径 2mm
ビーム量： 5000cps (連続照射）
〜10pA (パルス照射）
パルス ：50ナノ秒、繰り返し 10kHz (パルス照射）
測定時間： 500秒 (パルス照射) 200秒 (連続照射）
1回の測定における照射量：〜 106ions
(〜10 ions/ cm )
入射角： 30°
[0071] 同図に示すように、連続照射によっても、ノ ルス照射に類似したスペクトルが得られ 、且つ、分解能も若干優れていた。この結果から、本発明の方法によれば、パルス照 射を行うことなく TOFMSが可能であることがわかる。また、ビーム量も低減できること から、例えば、装置のコンパクト化も可能である。 実施例 6
[0072] 二次イオンが飛行するフライトチューブの長さを変化させた以外は、前記実施例 4と 同様にしてトリグリシン（Gly- Gly-Gly)薄膜に 6MeVの銅イオンビーム（95keVZa mu)を照射して質量分析を行った。これらの質量スペクトルの結果を図 13に示す。
[0073] 同図に示すスペクトルから、長!、フライトチューブの分析能が MZ Δ M = 120、短 V、フライトチューブの分解能が M/ Δ M = 40となり、長さによって分解能が約 3倍増 加するという結果が得られた。この結果から、フライトチューブの長さを長くすることに より、すなわち、飛行距離を長くすることにより、さらに分解能を向上させることができ るといえる。
実施例 7
[0074] Si基板上に正方形のビスマス平板を配置して、図 15 (A)のような格子状の溝 (幅 3 0 m)を作製した。この溝に下記ペプチド（1154u)の溶液を滴下して薄膜を形成さ せ、 6MeVの銅イオンビーム（95keVZamu)を照射して質量分析を行い、その結果 に基づきイメージングを行った。その他の質量分析の条件は、実施例 1と同様であり、 使用したぺプヂドは、下記構造のカスパーゼー 3に対する消光性蛍光基質である（ ペプチド研究所社製)。
MOCAc - Asp - Glu - Val - Asp - Ala - Pro - Lvs (Dnp) - NH
2
上記ペプチドにおいて、 MOCAcは（7— Methoxycounarin—4—yl) Acetylを表 し、 Dnpiま Dinitrophenylを表す。
[0075] 質量スペクトルの結果の一例を図 14に示し、イメージングの結果を図 15 (2)に示す 。これらの図に示すとおり、分子量が 1000を超える分子についても良好に検出でき た。なお、イメージングの空間分解能は 5 μ mであった。
実施例 8
[0076] 所定の割合で混合したホスファチジルコリン（PC)とホスファチジルイノシトール（PI) との脂質混合物 (それぞれ、 Avanti Polar—Lipids社製)を用いて Si基板上に膜を 形成し、 6MeVの銅イオンビーム（95keVZamu)を照射して質量分析を行った。そ の他の質量分析の条件は、実施例 1と同様とした。その結果を図 16及び下記表に示 す。従来の SIMSにおいては、被分析試料が脂質の混合物であると、それらを区別 して検出できな力つたが、本発明の二次イオン質量分析方法であれば、同図及び下 記表に示すとおり、混合された複数の脂質分子について定量分析が可能であること が示された。
[0077] [表 2]
Figure imgf000022_0001
産業上の利用可能性
[0078] 以上のように、本発明の SIMSによれば、例えば、被分析試料がタンパク質や多糖 類等の生体関連物質であっても、従来の SIMSのような前記生体関連物質の破壊を 抑制でき、イオン化効率にも優れる。このため、本発明によれば、タンパク質等の生 体関連物質を高感度で分析することが可能である。また、従来の LSIMSや MALDI のようなマトリックスが必須ではないため、高い面分解能も実現できる。また、このよう に本発明によれば、生体関連物質について高感度での質量分析が可能となるため、 得られた分析に従って画像表示を行うことができる。画像表示が可能となれば、生物 関連物質の有無やその分布を容易に確認できるため、本発明は、生体関連物質の 新たな分析方法として、例えば、臨床、創薬等の医学分野や生物学等の様々な分野 において極めて有用である。

Claims

請求の範囲
[1] 感度が向上した二次イオン質量分析方法であって、
一次イオンビームが照射される領域に分析対象分子がアトモル (amol)又はサブアト モルレベルで存在する被分析試料を準備する工程と、
被分析試料に一次イオンビームを照射する工程と、
前記一次イオンビームの照射により前記被分析試料から発生する二次イオンを質量 分析する工程とを含み、
前記一次イオンビームは、 1. 25keVZamu以上の重イオンビームである、二次ィォ ン質量分析方法。
[2] 前記二次イオンを質量分析する工程が飛行時間型イオン質量分析計を用いて行わ れ、前記被分析試料から発生する二次電子の検出を分析開始信号とし、続いて発生 する二次イオンビームの検出を分析終了信号とする、請求項 1記載の二次イオン質 量分析方法。
[3] 前記分析対象分子が、生体高分子である、請求項 1又は 2に記載の二次イオン質量 分析方法。
[4] 二次イオン質量分析を用いたイメージング方法であって、
被分析試料に一次イオンビームを照射する工程と、
前記一次イオンビームの照射により前記被分析試料から発生する二次イオンを質量 分析する工程と、
得られた二次イオンの質量分析結果に基づいて画像処理する工程とを含み、 前記一次イオンビームは、 1. 25keVZamu以上の重イオンビームである、イメージ ング方法。
[5] 前記被分析試料の XY平面に一次イオンビームを走査して照射すること、
前記被分析試料の各照射領域力 発生する二次イオンをそれぞれ質量分析するこ と、及び、
前記二次イオンの質量分析結果に基づいて前記被分析試料の各照射領域における 画像信号を得て、前記被分析試料の XY平面に相当する XY座標に前記各照射領 域に対応する前記画像信号を表示することを含む、請求項 4記載のイメージング方 法。
[6] 前記一次イオンビームを走査する方法が、前記一次イオンビームを偏向走査する方 法、又は、被分析試料を移動させる方法である、請求項 5記載のイメージング方法。
[7] ピクセルのサイズ力 5nm X 5nm〜20 Χ 20 μ mである、請求項 4から 6の!、ずれか 一項に記載のイメージング方法。
[8] 前記被分析試料に一次イオンビームを照射して二次イオンを面状に発生させること、 前記被分析試料の面における二次イオンの相対的な位置関係を維持した状態で質 量分析を行うこと、及び、
前記二次イオンの分析結果に基づ ヽて画像信号を得て、これを前記位置関係と対 応するようにイオン像として表示部に投影することを含む、請求項 4記載のイメージン グ方法。
[9] 前記一次イオンビームのイオン種力 Au、 Ar、 Ga、 In、 Bi、 O、 Cs、 Xe、 SF、 C 、
2 5 60
Ag、 Si、 C、及び、 Cuからなる群力も選択された少なくとも一つである、請求項 4から
8の 、ずれか一項に記載のイメージング方法。
[10] 前記二次イオン質量分析における分析対象分子が、生体高分子である、請求項 4か ら 9の 、ずれか一項に記載のイメージング方法。
[11] 被分析試料を二次イオン質量分析する二次イオン質量分析手段、及び、得られた二 次イオンの質量分析結果に基づいて画像処理する画像処理手段を含むイメージン グ装置であって、
前記二次イオン質量分析手段が、イオン源、被分析試料の表面に一次イオンビーム を照射する照射手段、及び、前記一次イオンビームの照射により前記被分析試料か ら発生する二次イオンを質量分析する質量分析手段を備え、
前記イオン源は、 1. 25keVZamu以上の重イオンビームを発生するイオン源であり 前記照射手段は、前記イオン源力も発生する一次イオンビームを 1. 25keV/amu 以上に制御する制御手段を備える、イメージング装置。
[12] 前記二次イオン質量分析手段は、分析試料の XY平面に一次イオンビームを走査し て照射する走査手段を含み、 前記画像処理手段は、前記二次イオンの質量分析結果に基づ！ヽて前記被分析試 料の各照射領域における画像信号を得る画像信号作成手段、及び、前記被分析試 料の XY平面に相当する XY座標に前記各照射領域に対応する前記画像信号を表 示する表示手段を含む、請求項 11記載のイメージング装置。
[13] 前記被分析試料と前記二次イオン質量分析手段との間、又は、前記二次イオン質量 分析手段と前記画像処理手段との間に、さらに、拡大イオン光学系を備える、請求項 12記載のイメージング装置。
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