WO2007145227A1

WO2007145227A1 - 造血幹細胞増加促進剤

Info

Publication number: WO2007145227A1
Application number: PCT/JP2007/061850
Authority: WO
Inventors: Takashi Yoshikubo; Masashi Shiina; Yukiko Inagaki
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2006-06-14
Filing date: 2007-06-13
Publication date: 2007-12-21
Also published as: KR20090021217A; JPWO2007145227A1; MX2008015975A; EP2044956A1; RU2009100930A; BRPI0713589A2; US20100040600A1; AU2007259739A1; EP2044956A4; AU2007259739B2; CA2657951A1

Abstract

　本発明者らは、TPO受容体に対する低分子化アゴニスト抗体（VB22B sc(Fv)2）の投与により、ヒト巨核球特異的分化誘導（血小板前駆細胞の増加）に加え、ヒト臍帯血由来の血液幹細胞(CD34陽性細胞）の生着、およびmulti-lineageな血液前駆細胞の有意な増加を見出した。TPO又はTPO受容体アゴニストは、造血幹細胞移植（特に臍帯血移植）後に単独投与（G-CSFやerythropoietinの併用なく）するだけで効果を期待し得る、造血系CD34陽性細胞の増殖促進剤又は骨髄での生着促進剤として使用し得る。また、multi-lineageな造血前駆細胞の増殖及び/又は分化促進剤、並びにmulti-lineageな造血能回復促進剤として使用し得る。

Description

明細書

造血幹細胞増加促進剤

技術分野

[0001] 本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する造血幹細胞増殖促進剤に関する。また本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着促進剤、並びに造血幹細胞移植における造血能回復促進剤に関する。

背景技術

[0002] トロンボポェチン（Thrombopoietin : TPO)は、巨核球系の造血細胞の増殖と分化を促進するサイト力インであり、巨核球コロニー刺激因子（Megakaryocyte colony-stimul ating factor)あるいは c-mplのリガンドとして知られている。サイト力イン受容体の多くは、リガンドの結合により受容体同士力量体化し、シグナルが細胞内に伝達される。

TPOにおいても、その特異的レセプターである c-mplと結合し、受容体を 2量体化することにより、細胞内に情報を伝え、生理作用を示すことが報告されている（非特許文献 1参照）。

[0003] このような性質をもつ受容体に結合する抗体の中で、ァゴニスト活性を示す抗体が存在することが報告されている。例えば、エリスロポエチン (EPO)受容体に対する抗体がエリスロポエチン機能を代替することが報告されており、この抗体を一価（Fab)にすると EPO受容体への結合能を維持したまま、シグナル伝達能を失うことから、二価の結合によるエリスロポエチン受容体の二量体形成が必要と考えられている（非特許文献 2参照）。

[0004] 同様に、 c-mplに結合する TPO受容体ァゴニスト活性を有する抗体も報告されており（非特許文献 3〜4、特許文献 1〜3参照）、このような抗体を利用した造血幹細胞の増殖を促進させる試みも行われてレ、る。

[0005] 例えば、ヒト臍帯血細胞（CD34陽性細胞）を移植された NOD/SCIDマウスに TPOを

1回投与し、臍帯血細胞の増殖を検討した実験例の報告がある（非特許文献 5参照）。し力しながらこの報告によると、 CD34陽性細胞の生着増強は認められていない。

[0006] また、臍帯血移植モデルマウスに TPO以外の TPO受容体ァゴニスト（PEG-rHuMG DF)を投与した報告もある（非特許文献 6参照）。しかしながら、該文献には血小板回復促進作用についての報告があるのみで、 CD34陽性細胞の骨髄への生着に対する作用に関しては一切報告されてレ、なレ、。

[0007] さらに、 N〇Gマウス（NOD/SCIDマウスより、更に免疫不全度が高いマウスである）にヒト臍帯血細胞を移植し、移植後 2-6か月後から c-mplァゴニストを投与した実験が報告されている（非特許文献 7参照）。しかし該文献によると、骨髄での CD34陽性細胞の増加は認められなかつた。

[0008] また、実際に患者 1名に対して、ヒト臍帯血移植後に TP〇、 G-CSF及び ΕΡΟの 3薬剤を同時に投与することにより、血球の回復を早めることが出来たという報告がある。し力、しながら、これら 3薬剤は tri_lineageな造血を助ける目的で投与されたことが記載されているため（p.198右欄中段）、 TPO単独での CD34陽性細胞の増殖や分化効果につレ、て示唆するものではなレ、（非特許文献 8参照）。

[0009] 一方、 TPOノックアウトマウスに TPOを投与することで移植の効率が上がることが報告されている（非特許文献 9参照）。該文献では、 TPOが血小板以外の細胞系譜にも作用することが示唆されている。し力しながら、 CD34陽性細胞の生着の有無についての報告はなぐまた、ヒト臍帯血についての言及もない。

このように、これまでのところ、 TPO受容体ァゴニスト活性を有する抗体を投与することによって実際に造血幹細胞の増殖を活性化させることに成功したという報告はない

[0010] なお、本発明の先行技術文献を以下に示す。

特許文献 1： WO2002/33072

特許文献 2： WO2005/056604

特許文献 3： WO2005/107784

非特許文献 1 : Stem Cells.1996年、 Voll4 suppl 1,ρ124-132

非特許文献 2 : Elliott Sら著、 J.Biol.Chem., 1996年、 Vol.271(40)、 p.24691- 24697 非特許文献 3 : Abeら著、 Immunol. Lett. 1998年、 Vol.61, p.73-78 非特許文献 4 : Bijia Dengら著、 Blood, 1998年、 Vol.92, p.1981-1988 非特許文献 5 : British Journal of Haematology 122, 837-846， 2003

非特許文献 6 Japanese Journal of Transfusion Medicine 46(3)， 311-316， 2000 非特許文献 7 : Blood 2006年、 Vol.107, p4300-4307

非特許文献 8 : Bone Marrow Transplantation 29, 197—204 (2002)

非特許文献 9 : The Journal of Clinical Investigation 110(3), 389-394 (2002)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0011] 本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、本発明は、 TPO受容体のァゴニストを有効成分として含有する造血幹細胞増殖促進剤を提供することを課題とする。また本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着促進剤、並びに造血幹細胞移植における造血能回復促進剤を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

[0012] 本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行なった。本発明者らは、 TP 0受容体に対する低分子化ァゴニスト抗体 (VB22B sc(Fv)2)の投与により、ヒト巨核球特異的分化誘導（巨核球系細胞の増加）に加え、ヒト臍帯血由来の造血幹細胞（造血系 CD34陽性細胞）の骨髄での生着促進、および multi-lineageな血液前駆細胞の有意な増殖が起こることを見出した。このことから本発明者らは、 TPO又は TPO受容体ァゴニストが、造血幹細胞移植（特に臍帯血移植)後に単独投与（G-CSFや eryt hropoietinの併用なく）するだけで効果を期待し得る、造血系 CD34陽性細胞の増殖促進剤又は骨髄での生着促進剤として使用し得ることを想到した。また本発明者らは、 TPO又は TPO受容体ァゴニストが、 multi-lineageな造血前駆細胞の増殖及び/又は分化促進剤、並びに multi-lineageな造血能回復促進剤として使用し得ることを想到した。

[0013] より具体的には、本発明は以下の〔1〕〜〔42〕を提供するものである。

〔1〕ΤΡΟ受容体 (c_mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血幹細胞増殖促進剤、

〔2〕TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血系 CD34 陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、

〔3〕TPO受容体 (c_mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血系 CD34 陽性細胞の骨髄への生着増加剤、

〔4〕TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血能回復促進剤、

〔5〕造血幹細胞移植において用いられる、〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載の薬剤、

〔6〕造血幹細胞移植後に投与される、〔1〕〜〔5〕のいずれか一項に記載の薬剤、

〔7〕造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植からなる群より選択される、〔5〕又は〔6〕に記載の薬剤、

〔8〕臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、 [7]に記載の薬剤、

〔9〕複数回投与されることを特徴とする、〔8〕に記載の薬剤、

〔10〕TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤、

〔11〕ΤΡΟ受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤、

〔12〕造血幹細胞移植が、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われることを特徴とする、〔5〕に記載の薬剤、

〔13〕患者が、放射線治療または化学療法による治療を受けた後の患者である、〔12 〕に記載の薬剤、

〔14〕放射線治療または化学療法を、 AML (急性骨髄性白血病）、 ALL (急性リンパ性白血病）、 CML (慢性骨髄性白血病）、悪性リンパ腫、成人 T細胞白血病、 MDS ( 骨髄異形成症候群）、 AA (再生不良性貧血)その他造血幹細胞移植が適応となる疾患の治療のために行うことを特徴とする、〔13〕に記載の薬剤、

〔15〕TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血幹細胞の増殖を促進する方法、

〔16〕TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する方法、

〔17〕TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる方法、

〔18〕TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血能の回復を促進する方法、

〔19〕造血幹細胞移植において行われる、〔15〕〜〔： 18〕のいずれかに記載の方法、〔20〕造血幹細胞移植後において行われる〔15〕〜〔19〕のいずれかに記載の方法、〔21〕造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植から選択される、〔19〕又は〔20〕に記載の方法、

〔22〕臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、 [21]に記載の方法、

[23]複数回投与されることを特徴とする、 [22]に記載の方法、

〔24〕 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞を増殖させる方法、

〔25〕 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化を促進する方法、

〔26〕造血幹細胞移植が、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われることを特徴とする、〔19〕に記載の方法、

〔27〕患者が、放射線治療または化学療法による治療を受けた後の患者である、〔26 〕に記載の方法、

〔28〕放射線治療または化学療法を、 AML (急性骨髄性白血病）、 ALL (急性リンパ性白血病）、 CML (慢性骨髄性白血病）、悪性リンパ腫、成人 T細胞白血病、 MDS ( 骨髄異形成症候群）、 AA (再生不良性貧血)その他造血幹細胞移植が適応となる疾患の治療のために行うことを特徴とする、 [27]に記載の方法、

〔29〕造血幹細胞増殖促進剤の製造における、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用、

〔30〕造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤の製造における、 TP〇受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用、

〔31〕造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤の製造における、 TPO受容体 (c -mpl)に対するァゴニストの使用、

〔32〕造血能回復促進剤の製造における TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用、

〔33〕造血幹細胞移植において用いられる造血幹細胞増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血能回復促進剤の製造における TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用、

〔34〕造血幹細胞移植後に投与される造血幹細胞増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血能回復促進剤の製造における TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用、

〔35〕造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植から選択される、〔33〕又は〔34〕に記載の使用、

〔36〕臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、〔35〕に記載の使用、

〔37〕複数回投与されることを特徴とする、〔36〕に記載の使用、

〔38〕リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤の製造における、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用、

〔39〕リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤の製造における、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用、

〔40〕造血幹細胞移植が、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われることを特徴とする、〔33〕に記載の使用、

〔41〕患者が、放射線治療または化学療法による治療を受けた後の患者である、 [40 〕に記載の使用、

〔42〕放射線治療または化学療法を、 AML (急性骨髄性白血病）、 ALL (急性リンパ性白血病）、 CML (慢性骨髄性白血病）、悪性リンパ腫、成人 T細胞白血病、 MDS ( 骨髄異形成症候群）、 AA (再生不良性貧血)その他造血幹細胞移植が適応となる疾患の治療のために行うことを特徴とする、〔41〕に記載の使用。

図面の簡単な説明 [0014] [図 1]各血球系細胞数に対する sc(Fv)2 (hVB22 u2_wz4)の影響を示す図である（mea nは一、 ^AS ver.5.0 wiicoxon test

[図 2]CFU-Megコロニー数に対する sc(Fv)2 (hVB22 u2-wz4)の影響を示す図および写真である (meanは一、 SA ver.5.0 wiicoxon test) ₀

[図 3]各血球系細胞数に対する sc(Fv)2 (hVB22 u2-wz4)の用量依存的な影響を示す図である（平均値バ¹ ~ " h SD, Jonckheere-Terpstra検定）。図中 MAB(H)、 MAB(M)、 MAB(L)は、それぞれ WB22sc(Fv)2の高投与群、中投与群、低投与群を表す。

[0015] 〔発明の実施の形態〕

本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する造血幹細胞の増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、並びに造血能回復促進剤（以下本明細書において、これらの薬剤を総称し、「本発明の薬剤」と称する場合あり）を提供する

[0016] 本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血幹細胞増殖促進剤を提供する。本発明においてァゴニストとは、受容体に働いて神経伝達物質やホルモンなどと同様の機能を示す物質を指す。本発明のァゴニストとしては、これに限定されるものではないが、低分子化合物や抗体が挙げられる。本発明の抗体には、低分子化された抗体、ヒト化抗体やキメラ化抗体などのアミノ酸配列が改変された抗体、他の分子 (例えば、ポリエチレングリコールなどの高分子等）が結合した修飾抗体、糖鎖が改変された抗体、など如何なる抗体も含まれる。

[0017] 本発明において造血幹細胞とは、あらゆるリンパ系細胞又は骨髄系細胞への分化が可能な細胞を指す。本発明における造血幹細胞は、このような性質を有するものであれば特に限定されるものではなレ、が、造血系 CD34陽性細胞として特徴づけることが可能である。造血系 CD34陽性細胞は、 CD34陽性造血幹細胞及び CD34陽性造血前駆細胞を含むヘテロな細胞集団であり、例えば、多能性幹細胞、リンパ系幹細胞、 CFU- GEMM、 CFU- GM、 BFU- E、 CFU-MEGなどが含まれる。ここで、 CD34陽性造血前駆細胞とは、 CD34を発現している細胞であって、リンパ系細胞（B細胞、 T 細胞等）または骨髄系細胞（好中球、単球、赤血球、巨核球等）への分化の過程にあるものの、各系統への分化が方向づけられておらず、また形態学的にも分化先の細胞を同定することが不可能な段階にある細胞を意味する。細胞が CD34を発現しているか否かは、当業者に周知の方法、例えば文献 Journal of Hematotherapy 5， 213-22 6， 1996 (Robert Sutherland et al. The ISHAGE guidelines for CD34 cell determinati on by Flow Cytometry.)に記載の方法によって判定することが可能である。

[0018] 本発明において「増殖の促進」とは、本発明の薬剤を投与する前と比較して、造血幹細胞、造血系 CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の増殖が活性化することを意味する。造血幹細胞、造血系 CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の増殖が活性化したか否かの判定は、当業者が通常行う方法によって行うことが可能であり、例えば造血幹細胞、造血系 CD3 4陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の増殖速度の変化、造血幹細胞、造血系 CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の数 (コロニー数）の変化、又は造血幹細胞、造血系 CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の増殖に関与する細胞内シグナルの変化等を検出することによって行うことが出来る。

[0019] また本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤を提供する。本発明において「造血系 CD34陽性細胞の分化」とは、あらゆるリンパ系細胞又は骨髄系細胞へと変化することが可能であった造血系 CD34陽性細胞力そのような状態を脱し、ある特定の細胞へと変化することが決定づけられる過程、及び、該決定づけられた細胞へと至る過程を意味する。ここで、造血系 CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の分化先の細胞としては、特これらに限定されるものではなレ、が、 T 細胞、 B細胞、 NK細胞等のリンパ系細胞及び、赤血球、白血球、血小板、好中球、単球、好酸球等の骨髄系細胞が挙げられる。

[0020] また本発明において「分化の促進」とは、本発明の薬剤を投与する前と比較して、分化が活性化することを意味する。造血系 CD34陽性造血幹細胞の分化が活性化したか否かの判定もまた当業者に公知の方法によって行うことが可能であり、例えば細胞の増殖速度の変化、細胞数の変化、分化に関与する細胞内シグナル強度の変化、分化マーカー、細胞形態の変化等を検出することによって行うことができる。

また造血幹細胞移植においては、移植された造血幹細胞が骨髄に生着することが求められる。本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤を提供する。本発明の薬剤を投与することによって、造血系 CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の骨髄への生着を促進することが可能となる。造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着の有無又は程度の測定 (造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着率の測定）は、例えば、ヒト造血細胞を移植した NOD/SCIDマウス骨髄におけるヒト造血系 CD34陽性細胞の絶対数を測定することによって行うことができる。マウス骨髄細胞中でのヒト細胞は、ヒト CD34特異的蛍光標識抗体を用いて検出することによって測定される。具体的には、以下の手順によって、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着率の測定を行うことが出来る。まず、ヒト臍帯血由来 CD34陽性細胞移植 3週後に、 NOD. CB17-Prkdcく scid〉/Jマウスを安楽死させ、大腿骨 2本を採取する。次に、大腿骨の骨端をハサミで切除し、 26G針シリンジでフラッシュアウトし、骨髄細胞の採取を行う。 2% FBS含 IMDMで洗浄後、 5mLの赤血球溶解液を添加し 5分静置する。遠心し上清を除去後、 2mLの 2%FBS含 IMDMに懸濁し、 70 μ mのメンブレンに通し、骨髄細胞懸濁液（ 2mL/大腿骨 2本/ mouse)を調製する。これを 100 /i L/サンプルに分注し、蛍光標識ヒト CD34特異的抗体と PI (終濃度 2 i g/mL)で 15分間染色する。洗浄後、 FLOW-COU NT蛍光粒子を 50 /i L添加し、細胞解析装置 EPICS XLを用いて、ヒト CD34陽性細胞生着数を測定する。測定は、例えばベックマン'コールター社製アプリケーションノート 5 : Flow-Countを用いた細胞絶対数の測定に準じて実施すればよい。同様に、検出する抗体を変えることで、各種の血球系細胞の骨髄での絶対数を計測することが可能である。大腿骨 2本に含まれる各ヒト細胞絶対数は、下記式によって表される。

ヒト細胞絶対数 =測定値 (個/ x L) X l/2(FLOW_COUNT添加量 (50)/サンプル添加量 (100)) X 2000(2mL/大腿骨 2本/ mouse)

(Barnett D, Granger V, Whitby L, Stone I, Reiliy JT. Absolute CD4+ T-lymphocyte and CD34+ stem cell counts by single-platform flow cytometry: the way forward. Br J Haematol. 1999 S印; 106(4):1059- 62.) また、上記以外の方法にも、例えば造血幹細胞移植を受けたヒトにおける造血系 C D34陽性細胞の骨髄への生着率を測定する場合には、間接的に、末梢血での血球の回復状態をモニターすることによって行うことが可能である。

[0022] また本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する造血能回復促進剤を提供する。一般に、移植後造血幹細胞が生着し白血球が回復するまで、 1—3週間の時間を要するとされている。この間、血液中の白血球数は極めて少ないため、肺炎などの細菌やかびによる感染症を起こしやすいという問題がある。また、一般に、移植後造血幹細胞が生着し血小板が回復するまで、 2— 10週間の時間を要するとされている。この間、血液中の血小板数は極めて少ないため、出血を起こしやすいという問題がある。本発明の造血能回復促進剤を用いることによって、このような移植後の幹細胞の造血能の活性に関する課題を解決することが可能である。本発明において「造血能回復促進」とは、本発明の薬剤を投与する前と比較して、骨髄における造血能が活性化することを意味する。骨髄における造血能が活性化したか否かは、末梢血での血球の回復状態をモニターすることによって判定することが可能である。

[0023] また本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤を提供する。本発明者らは、 TPO 受容体（c-mpl)に対するァゴニストによって造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着が増加した結果、リンパ系、及び骨髄系のいずれの細胞系譜の細胞も増加することを見出した (実施例参照）。本発明のリンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤は、このような知見に基づくものである。本発明におけるリンパ系細胞としては、これらに限定されるものではなレ、が、 T細胞、 B細胞、 NK細胞が挙げられる。また骨髄系細胞としては、これらに限定されるものではなレ、が、赤血球、白血球、血小板、好中球、単球、好酸球などが挙げられる。

[0024] 本発明者らは、 TPO受容体 (c_mpl)に対するァゴニストが、造血系 CD34陽性細胞（ CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の分化を活性化させることを見出した。よって本発明は、 TPO受容体 (c- mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤を提供する。本発明において、造血系 CD34陽性細胞（CD34陽性造血幹細胞、 CD34陽性造血前駆細胞）の分化先の細胞としては、 T細胞、 B細胞、 NK細胞等のリンパ系細胞、赤血球、白血球、血小板、好中球、単球、好酸球等の骨髄系細胞が挙げられる。

[0025] 本発明の薬剤は、急性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異変形症候群、急性リンパ球性白血病、成人 T細胞白血病、再生不良性貧血、悪性リンパ腫その他造血幹細胞が適応となる疾患を治療するために行う造血幹細胞移植において、造血幹細胞の増殖を促進させるため、造血系 CD34陽性造血幹細胞の増殖及び/又は分化を促進させるため、造血系 CD34陽性造血幹細胞の骨髄への生着を増加させるため、若しくは造血能の回復を促進させるために有用である。

[0026] 本発明の造血幹細胞移植には、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、及び臍帯血移植が含まれる。一般に、白血病等の治療目的で骨髄移植を行う際、骨髄移植に加えて末梢血幹細胞移植、臍帯血移植が広く行われてレ、る。

[0027] c-mplは TPOの受容体であり、ヒト c_mplの遺伝子配列は既に解析されている（Palaci os et al、 Cell, 1985年、 Vol.41, p.727-734又は、 Genebank:NM— 005373)。又、カニクィザル c-mpl (塩基/配列番号： 52、アミノ酸/配列番号： 53)、マウス c-mpl(GenBan k#NM_010823)の配歹 IJも既に公知である。ヒト c-mplのアミノ酸配列を配列番号： 51に示す。

[0028] 又、本発明における C- mplには、上述の c-mplにおいてアミノ酸が置換、欠失、付カロ等された変異 c-mpl受容体も含まれる。変異 c-mplの具体例としては、例えば、 Matthi as Ballmaier et al" BLOOD, (2001)、 Vol.97, No. l、 P139等に記載された変異 c_mpl を挙げることができる。

[0029] 本発明においては c-mplに対するァゴニストは、造血幹細胞の増殖を促進する作用、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する作用、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる作用、もしくは造血能の回復を促進する作用を有する限り限定されない。候補化合物がこれらの作用を有するか否かは当業者に公知の方法により確認することが可能である。

[0030] c_mplに対するァゴニスト活性とは、造血幹細胞の増殖を促進する活性、造血系 CD 34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する活性、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる活性、若しくは造血能の回復を促進する活性である。ァゴニスト活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能である。又、ァゴニスト活性の測定は、本来の活性を指標に測定するだけでなぐ他の活性を指標に測定することも可能である。

[0031] 例えば、細胞増殖を指標にァゴニスト活性を測定することが可能である。より具体的には、ァゴニスト依存性増殖を示す細胞にァゴニスト活性を測定したレ、抗体を添加し、培養する。その後、へモサイトメーターを用いて細胞を測定すること、フローサイトメ一ターにより細胞数を測定すること、若しくはテトラゾリゥム塩 WST-8 (同仁化学研究所）のような生細胞数に応じて特定の波長において発色反応を呈する試薬を添加して吸光度を測定し、得られた吸光度を指標とすること等によって、ァゴニスト活性を測定することが可能である。

[0032] ァゴニスト依存性増殖を示す細胞も当業者に公知の方法により作製することが可能であり、例えば、受容体が細胞増殖シグナルを発する受容体である場合には、該受容体を発現している細胞を用いればよい。又、受容体が細胞増殖シグナルを出さない受容体である場合には、細胞増殖シグナルを発する受容体の細胞内領域と、細胞増殖シグナルを出さない受容体の細胞外領域力なるキメラ受容体を作製し、該キメラ受容体を細胞で発現させればょレ、。細胞増殖シグナルを発する受容体の例としては、例えば、 G-CSF受容体、 mpl、 neu、 GM-CSF受容体、 EPO受容体、 c_kit、 FLT-3 等を挙げることができる。受容体を発現させる細胞としては、例えば、 BaF3、 NFS60、 FDCP- 1、 FDCP_2、 CTLL- 2、 DA- 1、 KT-3等を挙げることができる。

[0033] その他、ァゴニスト活性を測定する為に用いる検出指標としては、量的及び/又は質的な変化が測定可能である限り、どのようなものでも使用することができる。例えば、無細胞系 (cell free assay)の指標、細胞系 (eel卜 based assay)の指標、組織系の指標、生体系の指標を用いることができる。無細胞系の指標としては、酵素反応やタンパク質、 DNA、 RNAの量的及び Z又は質的な変化を用いることができる。酵素反応としては、例えば、アミノ酸転移反応、糖転移反応、脱水反応、脱水素反応、基質切断反応等を用いることができる。また、タンパク質のリン酸化、脱リン酸化、二量化、多量化、分解、乖離等や、 DNA、 RNAの増幅、切断、伸長を用いることができる。例えばシグナル伝達経路の下流に存在するタンパク質のリン酸化を検出指標とすることができる。細胞系の指標としては、細胞の表現型の変化、例えば、産生物質の量的及び/又は質的変化、増殖活性の変化、細胞数の変化、形態の変化、特性の変化等を用いること力 Sできる。産生物質としては、分泌タンパク質、表面抗原、細胞内タンパク質、 m RNA等を用いることができる。形態の変化としては、突起形成及び/又は突起の数の変化、偏平度の変化、伸長度 Z縦横比の変化、細胞の大きさの変化、内部構造の変ィ匕、細胞集団としての異形性 Z均一性、細胞密度の変化等を用いることができる。これらの形態の変化は検鏡下での観察で確認することができる。特性の変化としては、足場依存性、サイト力イン依存応答性、ホルモン依存性、薬剤耐性、細胞運動性、細胞遊走活性、拍動性、細胞内物質の変化等を用いることができる。細胞運動性としては、細胞浸潤活性、細胞遊走活性がある。また、細胞内物質の変化としては例えば、酵素活性、 mRNA量、 Ca²⁺や cAMP等の細胞内情報伝達物質量、細胞内タンパク質量等を用いることができる。また、細胞膜受容体の場合には、受容体の刺激によって誘導される細胞の増殖活性の変化を指標とすることができる。組織系の指標としては、使用する組織に応じた機能変化を検出指標とすることができる。生体系の指標としては組織重量変化、血液系の変化、例えば血球細胞数の変化、タンパク質量や、酵素活性、電解質量の変化、また、循環器系の変化、例えば、血圧、心拍数の変化等を用いることができる。

これらの検出指標を測定する方法としては、特に制限はなぐ吸光、発光、発色、蛍光、放射活性、蛍光偏光度、表面プラズモン共鳴シグナル、時間分解蛍光度、質量、吸収スペクトル、光散乱、蛍光共鳴エネルギー移動等を用いることができる。これらの測定方法は当業者にとっては周知であり、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、吸収スペクトルは一般的に用いられるフォトメータやプレートリーダ等、発光はルミノメータ等、蛍光はフルォロメータ等で測定することができる。質量は質量分析計を用いて測定することができる。放射活性は、放射線の種類に応じてガンマカウンターなどの測定機器を用いて、蛍光偏光度は BEACON (宝酒造）、表面プラズモン共鳴シグナルは BIACORE、時間分解蛍光、蛍光共鳴エネルギー移動などは ARVO などにより測定できる。さらに、フローサイトメータなども測定に用いることができる。これらの測定方法は、一つの測定方法で 2種以上の検出指標を測定しても良ぐ簡便であれば、 2種以上の測定を同時及び/又は連続して測定することによりさらに多数の検出指標を測定することも可能である。例えば、蛍光と蛍光共鳴エネルギー移動を同時にフノレオ口メータで測定することができる。

[0035] 本発明におけるァゴニストは、天然の化合物であっても人工の化合物であってもよレ、。本発明におけるァゴニストとしては公知のものを用いることができる。また、上記方法によってァゴニスト活性を有すると判定された新規化合物を用レ、ることもできる。

[0036] 本発明のァゴニストの好ましい態様の一つとして、低分子化抗体が挙げられる。低分子化抗体は、全長抗体 (whole antibody,例えば whole IgG等)の一部分が欠損している抗体断片を含み、抗原への結合能を有していれば特に限定されなレ、。本発明における低分子化抗体は、 whole抗体と比較して、顕著に高い活性を有する。本発明の抗体断片は、全長抗体の一部分であれば特に限定されないが、重鎖可変領域 (VH) 又は/及び軽鎖可変領域 (VL)を含んでレ、ることが好ましレ、。 VHまたは VLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び/又は挿入がされていてもよい。さらに抗原への結合能を有する限り、 VH又は/及び VLの一部を欠損させてもよい。又、可変領域はキメラ化ゃヒトイ匕されていてもよレ、。抗体断片の具体例としては、例えば、 Fab, Fab'、 F(ab') 2、 Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、 Fab 、 Fab、 F(ab')2、 Fv、 scFv single chain Fv)、 Diabody、 sc(Fv 2 ^single chain (Fv)2)などを挙げること力 Sできる。

[0037] ここで、「Fv」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。「Fv」断片は 1つの VHおよび VLが非共有結合により強く連結されたダイマー (VH -VLダイマー）である。各可変領域の 3つの相補鎖決定領域（complementarity deter mining region ; CDR)が相互作用し、 VH-VLダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。 6つの CDRが抗体に抗原結合部位を付与している。し力ながら、 1つの可変領域（または、抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。

[0038] scFvには、抗体の VHおよび VLが含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、 Fvポリペプチドはさらに VHおよび VLの間にポリペプチドリンカ一を含んでおり、これにより scFvは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（scFvの総説については、 Pluckthun『The Pharmacology of Monoclonal Antibo dies』Vol. l l3 (Rosenburg and Moore ed (Springer Verlag, New York) pp.269-315, 19 94)を参照）。本発明におけるリンカ一は、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。

[0039] Diabodyは、遺伝子融合により構築された二価 (bivalent)の抗体断片を指す (Holliger

P et al" Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448 (1993)、 EP404,097号、 W093/111 61号等)。 Diabodyは、 2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、通常、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中で VL及び VH力互いに結合できない位に短レ、、例えば、 5残基程度のリンカ一により結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされる VLと VHとは、その間のリンカ一が短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、 Diabodyは 2つの抗原結合部位を有することとなる。

[0040] 本発明の薬剤に含まれる c-mplを認識する抗体の特に好ましい態様としては、 sc(Fv )2を挙げることができる。 sc(Fv)2は、 2つの VH及び 2つの VLをリンカ一等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson et al、 J Immunol. Methods 1999 ; 231 : 17 7-189)。 sc(Fv)2は、全長抗体や他の低分子化抗体と比較して、特に高いァゴニスト活性を示すことが本願出願人により見出されている。 sc(Fv)2は、例えば、 scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。

[0041] また 2つの VH及び 2つの VL力一本鎖ポリペプチドの N末端側を基点として VH、 V L、 VH、 VL ( [VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [VL] )の順に並んでレ、ることを特徴とする抗体が好ましい。

[0042] 2つの VHと 2つの VLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば、以下のような配置も挙げることができる。

[VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [ VH]リンカ一 [ VL]

[VH]リンカ一 [VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]

[VH]リンカ一 [VH]リンカ一 [ VL]リンカ一 [ VL]

[VL]リンカ一 [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [ VH] [VL]リンカ一 [VH]リンカ一 [ VL]リンカ一 [ VH]

[0043] 抗体の可変領域を結合するリンカ一としては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカ一、又は合成化合物リンカ一（例えば、 Protein Engineering, 9(3)， 299 -305, 1996参照）に開示されるリンカ一等を用いることができる力本発明においてはペプチドリンカ一が好ましい。ペプチドリンカ一の長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することが可能であるが、通常、 1〜100アミノ酸、好ましくは 3〜 50アミノ酸、更に好ましくは 5〜30アミノ酸、特に好ましくは 12〜18アミノ酸 (例えば、 15 アミノ酸)である。

[0044] 例えば、ペプチドリンカ一の場合：

ber

Gly Ser

Gly Gly Ser

Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：77)

Ser · Gly · Gly · Gly (配列番号：78)

Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：79)

Ser · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号：80)

Gly · Gly · Gly · Gly · Gly · Ser (配列番号：81)

Ser · Gly · Gly · Gly · Gly · Gly (配列番号：82)

Gly . Gly · Gly . Gly . Gly · Gly . Ser (配列番号：83)

Ser · Gly . Gly · Gly . Gly · Gly · Gly (配列番号： 84)

(Gly . Gly . Gly . Gly . Ser (配列番号： 79) )n

(Ser . Gly . Gly . Gly . Gly (配列番号： 80) )n

[nは 1以上の整数である]等を挙げることができる。但し、ペプチドリンカ一の長さや配列は目的に応じて当業者が適宜選択することができる。

[0045] よって本発明において特に好ましい sc(Fv)2の態様としては、例えば、以下の sc(Fv) 2を挙げることができる。

[VH]ペプチドリンカ一 (15アミノ酸) [VL]ペプチドリンカ一 (15アミノ酸) [VH]ペプチドリンカ一 (15アミノ酸) [VL]

[0046] 合成化学物リンカ一（ィヒ学架橋剤）は、ペプチドの架橋に通常用いられている架橋剤、例えば N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS)、ジスクシンイミジルスべレート（DSS)、ビス（スルホスクシンィミジル）スべレート（BS³)、ジチォビス（スクシンィミジルプロビオネート）（DSP)、ジチオピス（スルホスクシンィミジルプロピオネート）（DTSSP)、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS)、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ一EGS)、ジスクシンィミジル酒石酸塩（DST)、ジスルホスクシンィミジル酒石酸塩（スルホ一DST)、ビス [2- (スクシンイミドォキシカルボニルォキシ）ェチル]スルホン（BSOCOES)、ビス [2- (スルホスクシンイミドォキシカルボニルォキシ）ェチル]スルホン（スルホ -BSOCOES)などであり、これらの架橋剤は市販されている。

[0047] 4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、 3つのリンカ一が必要となるが、全て同じリンカ一を用いてもよいし、異なるリンカ一を用いてもよい。本発明において好ましい低分子化抗体は Diabody又は sc(Fv)2であり、特に好ましくは sc(Fv)2である。このような低分子化抗体を得るには、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンなどで処理し、抗体断片を生成させるか、又はこれら抗体断片をコードする DNAを構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、 C o， M. S. et al" J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976； Better, M. and Horwitz, A. Η·， Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496； Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods E nzymol. (1989) 178, 497-515； Lamoyi, Ε·， Methods Enzymol. (1986) 121， 652-663 ； Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669； Bird, R. E. and Wal ker, B. W.， Trends Biotechnol. (1991) 9， 132- 137参照）。

[0048] sc(Fv)2化された抗 c- mpl抗体は、 c- mplに対して特に高レ、ァゴ二スト活性を有するので、造血幹細胞の増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血幹細胞移植における造血能回復促進剤として特に有用である。

[0049] 本発明の薬剤に含まれる c-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、キメラ抗体又はヒト化抗体等の改変抗体を挙げることができ、特にヒト化抗体を挙げることができる。

[0050] キメラ抗体は、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体であり、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体などである。キメラ抗体の作製は公知の方法を用いて行うことができ、例えば、抗体 V領域をコードする DNAとヒト抗体 C領域をコードする DNAとを連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。

[0051] ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相ネ甫 '性決定領域 (CDR; complementarity determining region)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号 EP 125023号公報、 WO 96/02576号公報参照）。

[0052] 具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region ;

FR)とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端領域にオーバ一ラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR法により合成する (W098/13388号公報に記載の方法を参照)。

[0053] CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K.etal., CancerRes. (1993) 53, 851 -856)。

[0054] キメラ抗体及びヒト型化抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えば H 鎖では、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3、 C γ 4を、 L鎖では C /c、 C λを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域を修飾してもよい。

[0055] 一般的に、キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒトイ匕抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域および定常領域とからなる。

[0056] なお、キメラ抗体やヒト化抗体を作製した後に、可変領域 (例えば、 FR)や定常領域中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換等してもよい。

キメラ抗体における可変領域、又はヒト化抗体における CDRの由来は特に限定されず、どのような動物由来でもよい。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ゥサギ抗体、ラタダ抗体などの配列を用いることが可能である。

[0057] c-mplを認識するヒト化抗体の例としては、後述の（9) _ (19)に記載のヒト化抗体を挙げ'ること力 Sできる。

キメラ抗体やヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、ヒトに投与する場合に特に有用であり、造血幹細胞の増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血幹細胞移植における造血能回復促進剤として特に有用である。

[0058] 本発明の薬剤に含まれる c-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、可溶型 c_ mplに結合する抗体を挙げることができる。ここでレ、う可溶型 c-mplとは、細胞膜上に発現している c-mpl以外の c-mplのことをいう。可溶型 c_mplの具体的な例としては、膜貫通領域の一部又は全部が欠損している c-mplを挙げることができる。ヒト C- mplの場合、膜貫通領域は配列番号： 51において 492番目のアミノ酸〜 513番目のアミノ酸の部分が相当する。

[0059] 可溶型組換え c-mplに結合する抗体は、ェピトープの詳細な解析や結合における反応速度論的解析に利用できるだけでなぐ in vivo試験における血中濃度や体内動態を評価することにも有用である。

[0060] 本発明の薬剤に含まれる c-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、ヒト c-mpl とサル c-mplの両方に対して結合活性又はァゴニスト活性を有する抗体を挙げることができる。ヒト c-mplとサル c- mplの両方に対してァゴニスト活性を有する抗体は、通常、ヒトにおいて測定することが困難な体内動態や in vivoでの効果を、サルを用いて検証できることから、非常に有用であると考えられる。これらの抗体は、さらに、ヒト及びサル以外の動物（例えば、マウスなど）の c- mplに対して、結合活性やァゴニスト活性を有していてもよい。

[0061] さらに本発明の薬剤に含まれる c_mplを認識する抗体の好ましい態様としては、 TP 〇ァゴニスト活性（_c-_mplに対するァゴニスト活性）力 ¾C50=100nM以下、好ましくは EC 50=30nM以下、さらに好ましくは EC50=10nM以下である抗体を挙げることができる。

[0062] さらに本発明の薬剤に含まれる c-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、可溶型 c-mplへの結合活性が KD=10— ⁶M以下、好ましくは KD=10— ⁷M以下、さらに好ましくは KD=10— 以下の抗体を挙げることができる。

[0063] 本発明において、可溶型組換え c_mplへの結合活性が KD=10— ⁶M以下の抗体であるか否かは、当業者に公知の手段を使用して測定することができる。例えば、 BIAcor eを用いた表面プラズモン共鳴を利用して測定することが可能である。すなわち Senso r Chip上に可溶型 c-mp卜 Fc蛋白質を固定させ、抗体と可溶型 c- mp卜 Fcの相互作用を測定値から反応速度定数として算出することができる。また、結合活性の評価には、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法）、 EIA (酵素免疫測定法)、 RIA (放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用レ、ることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、被験抗体が結合する抗原をコーティングしたプレートに、被験抗体を含む試料、例えば、被験抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファタ一ゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、

P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質をカ卩えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。

[0064] 結合活性の上限は特に限定されないが、例えば、当業者が技術的に作製可能な範囲の上限を設定することができる。しかしながら、技術的に作製可能な範囲は、技術の進歩により拡大される。

[0065] 本発明の薬剤に含まれる c-mplを認識する抗体の好ましい態様としては、以下の（1

)〜（19)のレ、ずれかに記載の抗体を挙げることができる。（1)〜（： 19)のいずれかに記載の抗体は好ましくは低分子化抗体である。

[0066] (1)配列番号 1、 2、 3 (VB22B : VH CDR1、 2、 3)に記載のアミノ酸配列からなる CDR1

、 2、 3を有する VHを含む抗体。

[0067] (2)配列番号 4、 5、 6 (VB22B : VL CDR1、 2、 3)に記載のアミノ酸配列からなる CDR1

、 2、 3を有する VLを含む抗体。

[0068] (3)配列番号： 1、 2、 3 (VB22B : VH CDR1、 2、 3)に記載のアミノ酸配列力、らなる CDR

1、 2、 3を有する VH、および配列番号： 4、 5、 6 (VB22B : VL CDR1、 2、 3)に記載のァミノ酸配歹 IJ力らなる CDR1、 2、 3を有する VLを含む抗体。

[0069] (4)配列番号： 8 (VB22B： VH)に記載のアミノ酸配列からなる VHを含む抗体。

[0070] (5)配列番号： 10(VB22B:VL)に記載のアミノ酸配列からなる VLを含む抗体。

[0071] (6)配列番号： 8(VB22B:VH)に記載のアミノ酸配列からなる VH、および配列番号：

10 (VB22B： VL)に記載のアミノ酸配列からなる VLを含む抗体。

[0072] (7)配列番号： 12 (VB22B： scFv)に記載のアミノ酸配列を有する抗体。

[0073] (8)配列番号： 14(VB22B:sc(Fv)2)に記載のアミノ酸配列を有する抗体。

[0074] (9)以下の（a)から（c)のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VHを含むヒト化抗体。

(a)配歹幡号： 15、 16、 17、 18(hVB22B p-z:VH FR1、 2、 3、 4)

(b)配歹' J番号： 19、 20、 21、 22(hVB22B g- e:VH FR1、 2、 3、 4)

(c)配歹幡号： 23、 24、 25、 26 (hVB22B e:VH FR1、 2、 3、 4)

(d)配歹幡号： 54、 55、 56、 57(hVB22B u2_wz4:VH FR1、 2、 3、 4)

(e)酉己歹 IJ番号： 54、 55、 58、 57(hVB22B q— wz5:VH FR1、 2、 3、 4)

[0075] (10)以下の（a)から（d)に記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VLを含むヒト化抗体。

(a)配歹幡号： 27、 28、 29、 30(hVB22B p-z:VL FR1、 2、 3、 4)

(b)配歹幡号： 31、 32、 33、 34(hVB22B g- eまたは hVB22B e:VL FR1、 2、 3、 4)

(c)配歹幡号： 59、 60、 61、 62(hVB22B u2- wz4:VL FR1、 2、 3、 4)

(d)配歹幡号： 59、 63、 64、 62(hVB22B q-wz5:VL FR1、 2、 3、 4)

[0076] (11)以下の（a)力 (e)のいずれかに記載の VHおよび VLを含むヒト化抗体。

(a)配列番号： 15、 16、 17、 18に記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VH、および酉己歹 IJ番号： 27， 28, 29, 30に記載のアミノ酸酉己歹 IJ力、らなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VL

(b)配列番号： 19、 20、 21、 22に記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VH、および配列番号： 31、 32、 33、 34に記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VL

(c)配列番号： 23、 24、 25、 26に記載のアミノ酸配列力もなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VH、および配列番号： 31、 32、 33、 34に記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VL

(d)配列番号： 54、 55、 56、 57に記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VH、および酉己歹 IJ番号： 59、 60、 61、 62に記載のアミノ酸酉己歹 IJ力、らなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VL

(e)配列番号： 54、 55、 58、 57に記載のアミノ酸配列からなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VH、および酉己歹 IJ番号： 59、 63、 64、 62に記載のアミノ酸酉己歹 IJ力、らなる、 FR1、 2、 3、 4を有する VL

[0077] (12)配列番号： 1、 2、 3に記載のアミノ酸配列からなる CDR1、 2、 3を有する VHを含むヒト化抗体。

[0078] (13)配列番号： 4、 5、 6に記載のアミノ酸配列からなる CDR1、 2、 3を有する VLを含むヒト化抗体。

[0079] (14)配列番号： 1、 2、 3に記載のアミノ酸配列からなる CDR1、 2、 3を有する VH、および配列番号： 4、 5、 6に記載のアミノ酸配列からなる CDR1、 2、 3を有する VLを含むヒト化抗体。

[0080] (15)配列番号： 36(hVB22B p_z:VH)、配列番号： 38 (hVB22B g_e:VH)、配列番号： 40(hVB22B e:VH)、配列番号： 65(hVB22B u2_wz4:VH)、あるいは配列番号: 66(hVB22B q-wz5:VH)に記載のアミノ酸配列力なる VHを含むヒト化抗体。

[0081] (16)配列番号： 42(hVB22B p_z:VL)、配列番号： 44(hVB22B g_e:VLあるいは hV B22B e:VL)、配列番号： 67(hVB22B u2_wz4: VL)、あるいは配列番号： 68 (hVB22 B q-wz5:VH)に記載のアミノ酸配列からなる VLを含むヒトイ匕抗体。

[0082] (17)以下の（a)から（e)のレ、ずれかに記載の VHおよび VLを含むヒト化抗体。

(a)配列番号： 36(hVB22B p-z:VH)に記載のアミノ酸配列からなる VH、及び配列番号： 42(hVB22B p_z:VL)に記載のアミノ酸配列からなる VL

(b)配列番号： 38(hVB22B g_e:VH)に記載のアミノ酸配列からなる VH、及び配列番号： 44(hVB22B g_e: VLあるいは hVB22B e:VL)に記載のアミノ酸配列力、らなる VL

(c)配列番号: 40(hVB22B e:VH)に記載のアミノ酸配列からなる VH、及び配列番号 :44(hVB22B g_e: VLあるいは hVB22B e:VL)に記載のアミノ酸配列力、らなる VL (d)配列番号： 65(hVB22B u2_wz4:VH)に記載のアミノ酸配列力なる VH、及び配列番号： 67(hVB22B u2-wz4:VL)に記載のアミノ酸配列からなる VL

(e)配列番号： 66(hVB22B q_wz5:VH)に記載のアミノ酸配列からなる VH、及び配列番号： 68(hVB22B q_wz5:VL)に記載のアミノ酸配列からなる VL

[0083] 配列番号： 36 (hVB22B p-z： VH)、配列番号： 38 (hVB22B g-e： VH)、配列番号： 4

0 (hVB22B e:VH)、配列番号： 65(hVB22B u2_wz4:VH)、または配列番号： 66 (hV

B22B q-wz5:VH)に記載のアミノ酸配列において、

アミノ酸部位： 31〜35が CDR1、

アミノ酸き M立： 50〜66力 CDR2、

アミノ酸き M立： 99〜： 107力 CDR3、

アミノ酸部位：:!〜 30が FR1、

アミノ酸部位： 36〜49力 FR2、

アミノ酸部位： 67〜98が FR3、

アミノ酸部位： 108〜 118が FR4に相当する。

[0084] 又、配列番号： 42(hVB22B p_z:VL)または配列番号： 44(hVB22B g_e:VLまたは hVB22B e:VL)、配列番号： 67(hVB22B u2_wz4:VL)、あるいは配列番号： 68(hVB

22B q-wz5:VH)に記載のアミノ酸配列において、

アミノ酸部位： 24〜39が CDR1、

アミノ酸部位： 55〜61が CDR2、

アミノ酸部位： 94〜： 102が CDR3、

アミノ酸部位：:!〜 23が FR1、

アミノ酸部位： 40〜54カ 1¾、

アミノ酸部位： 62〜93が FR3、

アミノ酸部位： 103〜112が FR4に相当する。

[0085] 本発明において、 hVB22B p-z VH配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B p-z VH:FRlZ配列番号： 15

hVB22B p-z VH： CDRl/配列番号： 1 hVB22B p-z VH:FR2/配列番号： 16

hVB22B p-z VH： CDR2/配列番号： 2

hVB22B p-z VH:FR3/配列番号： 17

hVB22B p-z VH： CDR3/配列番号： 3

hVB22B p-z VH:FR4Z配列番号： 18

[0086] 本発明において、 hVB22B p-z VL配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B p-z VL:FRlZ配列番号： 27

hVB22B p-z VL:CDR1/配列番号： 4

hVB22B p-z VL:FR2Z配列番号： 28

hVB22B p-z VL:CDR2/配列番号： 5

hVB22B p-z VL:FR3Z配列番号： 29

hVB22B p-z VL:CDR3/配列番号： 6

hVB22B p-z VL:FR4/配列番号： 30

[0087] 本発明において、 hVB22B g-e VH配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B g-e VH： FR1/配列番号： 19

hVB22B g-e VH： CDR1/配列番号： 1

hVB22B g-e VH： FR2/配列番号： 20

hVB22B g-e VH： CDR2/配列番号： 2

hVB22B g-e VH： FR3/配列番号： 21

hVB22B g-e VH： CDR3Z配列番号： 3

hVB22B g-e VH:FR4/配列番号： 22

[0088] 本発明において、 hVB22B g-e VL配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B g-e VL: FR1/配列番号： 31

hVB22B g-e VL:CDRl/配列番号： 4

hVB22B g-e VL: FR2/配列番号： 32 hVB22B g-e VL： CDR2/配列番号： 5

hVB22B g-e VL : FR3/配列番号： 33

hVB22B g-e VL： CDR3/配列番号： 6

hVB22B g-e VL： FR4/配列番号： 34

[0089] 本発明において、 hVB22B e VH配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B e VH : FRlZ配列番号： 23

hVB22B e VH： CDRl/配列番号： 1

hVB22B e VH： FR2Z配列番号： 24

hVB22B e VH： CDR2/配列番号： 2

hVB22B e VH： FR3Z配列番号： 25

hVB22B e VH： CDR3/配列番号： 3

hVB22B e VH： FR4/配列番号： 26

[0090] 本発明において、 hVB22B e VL配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B e VL: FR1/配列番号： 31

hVB22B e VL: CDR1/配列番号： 4

hVB22B e VL: FR2/配列番号： 32

hVB22B e VL： CDR2/配列番号： 5

hVB22B e VL: FR3/配列番号： 33

hVB22B e VL: CDR3/配列番号： 6

hVB22B e VL: FR4Z配列番号： 34

[0091] 本発明において、 hVB22B u2-wz4 VH配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B u2-wz4 VH： FRlZ配列番号： 54

hVB22B u2-wz4 VH : CDRl/配列番号： 1

hVB22B u2-wz4 VH : FR2Z配列番号： 55

hVB22B u2-wz4 VH： CDR2/配列番号： 2 hVB22B u2-wz4 VH:FR3/配列番号： 56

hVB22B u2-wz4 VH： CDR3/配列番号： 3

hVB22B u2-wz4 VH:FR4/配列番号： 57

[0092] 本発明において、 hVB22B u2-wz4 VL配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B u2-wz4 VL:FRl/配列番号： 59

hVB22B u2-wz4 VL:CDRl/配列番号： 4

hVB22B u2-wz4 VL: FR2Z配列番号： 60

hVB22B u2-wz4 VL: CDR2Z配列番号： 5

hVB22B u2-wz4 VL:FR3Z配列番号： 61

hVB22B u2-wz4 VL: CDR3/配列番号： 6

hVB22B u2-wz4 VL:FR4/配列番号： 62

[0093] 本発明において、 hVB22B q-wz5 VH配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B q-wz5 VH： FR1/配列番号： 54

hVB22B q-wz5 VH:CDRlZ配列番号： 1

hVB22B q-wz5 VH : FR2Z配列番号： 55

hVB22B q-wz5 VH : CDR2/配列番号： 2

hVB22B q-wz5 VH : FR3/配列番号： 56

hVB22B q-wz5 VH:CDR3/配列番号： 3

hVB22B q-wz5 VH : FR4/配列番号： 57

[0094] 本発明において、 hVB22B q-wz5 VL配列における CDRおよび FRと配列番号との対応は以下の通りである。

hVB22B q-wz5 VL:FRl/配列番号： 59

hVB22B q-wz5 VL: CDRlZ配列番号： 4

hVB22B q-wz5 VL: FR2Z配列番号： 63

hVB22B q-wz5 VL: CDR2Z配列番号： 5

hVB22B q-wz5 VL:FR3/配列番号： 64 hVB22B q-wz5 VL : CDR3/配列番号： 6

hVB22B q-wz5 VL : FR4/配列番号： 62

[0095] なお、 VB22B VHの塩基配列を配列番号： 7、 VB22B VLの塩基配列を配列番号： 9 、 VB22B scFvの塩基配列を配列番号： 11、 VB22B sc(Fv)2の塩基配列を配列番号： 13、 hVB22B p_z VHの塩基配列を配列番号： 35、 hVB22B g_e VHの塩基配列を配列番号： 37、 hVB22B e VHの塩基配列を配列番号： 39、 hVB22B u2_wz4 VHの塩基配列を配列番号： 69および hVB22B q-wz5 VHの塩基配列を配列番号： 71、 hVB22B p-z VLの塩基配列を配列番号： 41、 hVB22B g-e VL、 hVB22B e VLの塩基配列を配列番号： 43、 hVB22B u2_wz4 VLの塩基配列を配列番号： 70および hVB22B q-wz 5 VLの塩基配列を配列番号： 72、 hVB22B p-z sc(Fv)2の塩基配列を配列番号： 45 、 hVB22B g-e sc(Fv)2の塩基配列を配列番号： 47、 hVB22B e sc(Fv)2の塩基配列を配列番号： 49、 hVB22B u2_wz4 sc(Fv)2の塩基配列を配列番号： 75および hVB22B q-wz5 sc(Fv)2の塩基配列を配列番号： 76に記載する。

[0096] (18)配列番号： 46 (hVB22B p-z： sc(Fv)2)、配列番号： 48 (hVB22B g-e： sc(Fv)2)、配列番号： 50 (hVB22B e： sc(Fv)2)、配列番号： 73 (hVB22B u2_wz4： sc(Fv)2)または配列番号： 74 (hVB22B q-wz5： sc(Fv)2)のレ、ずれかに記載のアミノ酸配列を有するヒト化抗体。

[0097] (19)上記（1)〜（18)のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1又は複数のァミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入され、かつ上記抗体と同等の活性を有する抗体。ここで、上記抗体と同等の活性を有するとは、造血幹細胞の増殖促進作用、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進作用、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加作用、並びに造血幹細胞移植における造血能回復促進作用において、同等の活性を有することを意味する。

[0098] 上記（1)〜（： 19)のいずれかに記載の抗体は c-mplに対するァゴニスト活性が非常に高い為、造血幹細胞の増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、若しくは造血幹細胞移植における造血能回復促進剤として特に有用である。

[0099] あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法としては、ポリペプチドに変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene

152， 271-275、 Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100， 468-500、 K ramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441—9456、 Kramer W， and Fritz HJ( 1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367、 Kunkel,TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA.

82, 488-492、 Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85， 2763-2766)などを用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製すること力 Sできる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において 1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30ァミノ酸以内であり、さらに好ましくは 10アミノ酸以内（例えば、 5アミノ酸以内）であると考えられる。

[0100] 変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（ A、 I、し、 M、 F、 P、 W、 Y、 V)、親水十生アミノ酸（R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T)、月旨肪族側鎖を有するアミノ酸 (G、 A、 V、 L、 I、 P)、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸 (S、 T、 Υ)、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸 (C、 M)、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸 (D、 N、 E、 Q)、塩基含有側鎖を有するアミノ酸 (R、 K、 Η)、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸 (H、 F、 Y、 W)を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す)。

[0101] あるアミノ酸配列に対する 1又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び/又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al , Proc. Natl. Acad • Sci. USA (1984) 81， 5662-5666、 Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500、 Wang, A. et al" Science 224, 1431-1433、 Dalbadie- McFar land, G. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 )。

[0102] 本発明の抗体のアミノ酸配列に複数個のアミノ酸残基が付加された抗体には、これら抗体を含む融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質は、これら抗体と他のぺプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと他のペプチド又はポリべプチドをコードするポリヌクレオチドをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよぐ当業者に公知の手法を用いることができる。本発明の抗体との融合に付される他のペプチド又はポリペプチドとしては、例えば、 FLAG (Hopp, T. P. et al.， BioTechnology (1988) 6, 1204-1210 )、 6個の His (ヒスチジン）残基からなる 6 X His、 10 X His,インフルエンザ凝集素（HA)、ヒト c-mycの断片、 VSV-GPの断片、 pl8HIVの断片、 T7_tag、 HSV_tag、 E_tag、 SV40T抗原の断片、 lck tag, ひ- tubulinの断片、 B_tag、 Protein Cの断片等の公知のペプチドを使用すること力 Sできる。また、本発明の抗体との融合に付される他のポリペプチドとしては、例えば、 GST (グノレタチオン -S-トランスフェラーゼ）、 HA (インフルエンザ凝集素）、ィムノグロブリン定常領域、 -ガラクトシダーゼ、 MBP (マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。市販されているこれらペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレォチドを、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと融合させ、これにより調製された融合ポリヌクレオチドを発現させることにより、融合ポリペプチドを調製することができる。

[0103] 本発明の抗体は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配歹 U、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られた抗体が本発明の抗体と同等の機能を有している限り、本発明の抗体に含まれる。例えば、本発明の抗体を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来の抗体のアミノ酸配列の N末端にメチォニン残基が付加される。本発明の抗体はこのような抗体も包含する。

[0104] さらに、本発明の薬剤に含まれる c_mplを認識する抗体の好ましい態様としては、上記（1)〜（： 19)の抗体が認識するェピトープを認識する抗体を挙げることができる。

[0105] 抗体が認識するェピトープを認識する抗体は当業者に公知の方法により得ることが可能である。例えば、上述の抗体が認識するェピトープを通常の方法により決定し、該ェピトープに含まれるアミノ酸配列を有するポリペプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製された抗体のェピトープを決定し、上述の抗体とェピトープが同じ抗体を選択する方法などにより得ることができる。

[0106] 本発明においては、配列番号： 73に記載のアミノ酸配列を有する抗体が認識するェピトープを認識する抗体が特に好ましい。配列番号： 73に記載のアミノ酸配列を有する抗体は、ヒト c_mplの 26番目の Gluから 274番目の Leuまでの領域、好ましくは 189 番目の Alaから 245番目の Glyの領域、さらに好ましくは 213番目の Ginから 231番目の A laまでの領域を認識していると予想される。従って、ヒト c_mplの 26番目〜274番目、あるいは 189番目〜245番目、あるいは 213番目〜231番目の領域を認識する抗体も本発明に含まれる。

[0107] ヒト c_mplのアミノ酸配歹 IJ (配列番号： 51)の 26番目〜 274番目、あるいは 189番目〜 2 45番目、あるいは 213番目〜231番目の領域を認識する抗体は、当業者に公知の方法により得ることが可能であり、例えば、ヒト c_mplのアミノ酸配列（配列番号： 51)の 26 番目〜274番目、あるいは 189番目〜245番目、あるいは 213番目〜231番目のぺプチドを免疫原として抗体を作製する方法や、通常の方法で作製した抗体が認識するェピトープを決定し、本発明の抗体と同じェピトープを認識する抗体を選択する方法などにより得ることが可能である。

[0108] c-mplに結合する抗体は当業者に公知の方法により作成することができる。例えば

、モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、 c-mplタンパク質又は c-mpl発現細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。

[0109] 具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよレ、。まず、抗体取得の感作抗原として使用される c-mplタンパク質を、 Genebank:NM_005373に開示された c-mpl遺伝子 Zアミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、 c-mpl をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒト c-mplタンパク質を公知の方法で精製する。 [0110] 次に、この精製 c-mplタンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、 c-mplの部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒト c-mplのアミノ酸配列より化学合成により得ることも可能である。

[0111] 本発明の抗 c-mpl抗体の認識する c-mpl分子上のェピトープは特定のものに限定されず、 c_mpl分子上に存在するェピトープならばどのェピトープを認識してもよレ、。従つて、本発明の抗 c_mpl抗体を作製するための抗原は、 c_mpl分子上に存在するェピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。

[0112] 感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではなレ、が、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはゥサギ、サル等が使用される。

[0113] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。

[0114] このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

[0115] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、 P3 (P3x63Ag8.653) (J. Im mnol. (1979) 123, 1548—1550)、 P3x63Ag8U. l (Current Topics in Microbiology and I mmunology (1978) 81, 1 - 7)、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (19 76) 6， 511—519)、 MPC—l l (Margulies. D.H. et al" Cell (1976) 8, 405-415)、 SP2/0 ( Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269—270)、 F〇（deSt. Groth, S. F. et al., J. I mmunol. Methods (1980) 35, ト 21)、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323)、 R210 (Galfre， G. et al., Nature (1979) 277, 131-133)等が好適に使用される。

[0116] 前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミノレスティンらの方法（Kohler. G. and Milstein, C, Methods Enzymol. (19 81) 73， 3-46)等に準じて行うことができる。

より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール (PEG )、センダイウィルス (HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

[0117] 免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1-10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。

[0118] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め 37°C程度に加温した PEG溶液 (例えば平均分子量 1000-6000程度）を通常 30-60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

[0119] このようにして得られたハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記 HAT培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。

[0120] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球を in vitroで c-mplに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、 c_mplへの結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 1-59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジエニック動物に抗原となる c-mplを投与して抗 MPL抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞から c-mplに対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号 WO 94/25585号公報、 WO 93/12227号公報、 WO92/03918号公報、 W 0 94/02602号公報参照）。

[0121] このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

[0122] 当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

[0123] 抗体遺伝子をハイプリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型の抗体を作製することも可能である（例えば、 Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192， 767-775， 1990参照）。

[0124] 具体的には、抗 c-mpl抗体を産生するハイブリドーマから、抗 c-mpl抗体の可変（V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299)、 AGPC法 (Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem. (1987) 162， 156-159)等により行って全 RNA を調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用して目的の mRNAを調製する。また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直接調製することもできる。

[0125] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生ィ匕'子ェ桌社製）等を用いて行う。また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'_Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）および PCRを用いた 5し RACE法（Frohman, M. A. et al. , Pro c. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002、 Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids R es. (1989) 17, 2919-2932)等を使用することができる。

[0126] 得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とする DNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデォキシヌクレオチドチェインターミネーシヨン法等により確認する。

目的とする抗 c-mpl抗体の V領域をコードする DNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域 (C領域）をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み込む。

[0127] 本発明で使用される抗 c-mp航体を製造するには、通常、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現べクタ一に組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。

[0128] 抗体遺伝子の発現は、 H鎖または L鎖をコードするポリヌクレオチドを別々に発現べクタ一に組み込んで宿主細胞を同時に形質転換させてもよいし、あるいは H鎖および L鎖をコードするポリヌクレオチドを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（WO 94/11523号公報参照）。

[0129] ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、 JM109、 DH5 a、 HB101、 XLlBlue)などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ori」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子 (例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフエ二コール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベタターの例としては、 M13系ベクター、 pUC系ベクター、 pBR322、 pBluescript、 pCR-Scri ptなどが挙げられる。また、 cDNAのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、 pGEM-T、 pDIRECT、 pT7などが挙げられる。

[0130] 発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほ力に、宿主を JM109、 DH5ひ、 HB101、 XLl-Blueなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプ口モーター、例えば、 _lacZプロモーター（_Wardら， ature (1989) 341, 544-546； FASE B J. (1992) 6, 2422-2427)、 araBプロモーター（Betterら, Science (1988) 240, 1041-1 043 )、または T7プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクタ一としては、上記ベクターの他に pGEX-5X_l (フアルマシア社製）、「QIAexpress syst emj (キアゲン社製）、 pEGFP、または pET (この場合、宿主は T7 RNAポリメラーゼを発現している BL21が好ましい）などが挙げられる。

[0131] また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。蛋白質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)を使用すればよレ、。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法を用いて行うことができる。

[0132] 大腸菌以外にも、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製）や、 pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17)，p5322)、 pEF、 pCD M8)、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to_BAC baculovairus expression systemj (ギブコ BRL社製）、 pBacPAK8)、植物由来の発現ベクター（例えば ρΜΗ1、 MH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVl l、 SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 _PPL608、 pKTH50)が挙げられる。

[0133] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（Mulliga nら， Nature (1979) 277, 108)、 MMTV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモーター（Mizu shimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、薬剤（ネオマイシン、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましレ、。このような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK_RSV、 p BK- CMV、 pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。

[0134] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート（MTX)により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、 S V40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起点を持つベクター（pcDなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由来のものを用レ、ることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現べクタ一は選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。

[0135] ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。宿主細胞は、例えば、本発明の抗体の製造や発現のための産生系として使用することができる。ポリペプチド製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

[0136] 真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いること力 Sできる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108， 945)、 COSヽ 3T3、ミエローマ、 BHK (baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、両生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature (1981) 291， 358-3 40)、あるいは昆虫細胞、例えば、 Sf9、 Sf21、 Tn5が知られている。本発明においては、 CHO_DG44、 CH0_DXB11、 COS7細胞、 BHK細胞が好適に用いられる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特に CHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクト口ボーレーション法、リポフヱクションなどの方法で行うことが可能である。

[0137] 植物細胞としては、例えば、ニコチアナ.タパカム（Nicotiana tabacum)由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces)属、例えば、サッカロミセス'セレビンェ (Saccharomyces cerevisiae)、サッ刀口;セス-ホンへ (Saccharomvces pombe)、糸状菌、例えば、ァスペルギルス（Aspergillus)属、例えば、ァスペルギルス'二ガー（ Aspergillus niger) ¾失ロられてレヽる。

[0138] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌 (E. coli)、例えば、 JM109、 DH5ひ、 HB 101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。

[0139] 本方法においては次いで上記宿主細胞を培養する。目的とするポリヌクレオチドにより形質転換された細胞を in vitroで培養することにより、抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、 DME M、 MEM, RPMI1640, IMDMを使用することができる。その際、 FBS、牛胎児血清（FC S)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時の pHは、約 6〜8であるのが好ましレ、。培養は、通常、約 30〜40°Cで約 15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。

[0140] 一方、 in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリヌクレオチドを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。

[0141] 動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。

[0142] 例えば、目的とするポリヌクレオチドを、ャギカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容したャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁力、目的の抗体を得ることができる。トランスジヱニックャギから産生される抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよレヽ（Ebert, K.M. et al.， Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。

[0143] また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用レ、る場合、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的の抗体を得ることができる（Susumu, M. et al.， N ature (1985) 315， 592-594)。

[0144] さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とする抗体をコードするポリヌクレオチドを植物発現用ベクター、例えば pMO N 530に揷入し、このベクターをァグロバタテリゥム'ッメファシエンス（Agrobacterium t umefaciens)のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ.タバカム（Nicotiana tabacum)に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得ることができる（Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 13ト 138)。

[0145] これにより得られた抗体は、宿主細胞内または細胞外 (培地など）から単離し、実質的に純粋で均一な抗体として精製することができる。抗体の分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリペプチドを分離、精製すること力 Sできる。

[0146] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィ二ティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグフクイ¹ ~~等力、挙（フられる (Strategies for Protein Purification andし naractenzat ion: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。例えば、プロテイン Aを用いたカラムとして、 Hyper D， POROS, Sepharos e F. F. (Pharmacia)等が挙げられる。

[0147] なお、抗体の精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えること、部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ、プロティンキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。

また、本発明の TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストは、低分子化合物であってもよい。本発明の低分子化合物は、造血幹細胞の増殖を促進する作用、造血系 CD3 4陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する作用、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる作用、若しくは造血能の回復を促進する作用を有する限りどのようなものであっても構わないが、好ましい態様として、以下の化学式で示される化合物、 { 5-[(2-{1-[5_(3，4-ジクロロフヱニル)-4-ヒドロキシ_3_チェニル]ェチレデン}ヒドラジノ)カルボニル -2-チォフェンカルボン酸が挙げられる（Blood First Edition Paper, p republished online February 16, 2006; DOI10.1182/blood- 2005- 11- 4433)。

[0149] また本発明の TPO受容体（c-mpl)に対するァゴニストとして、 Amgen AMG-531 (rec ombmant megakaryopoiesis stimulating proteinノ、 SB297115/Eltrombopag ( sk s ora 1 TPO- R agonistic compound)、 peg-TPOmp, YM477、 NIP004を挙げることも出来る。 Amgen AMG—531は、 Fc domainと Peptide receptor binding domainを有す分ナ量 60 ，000Dのタンパク質であり、下記表 1に記載の性質を有する（Clinical Pharmacology & Therapeutics. 76(6), 628, 2004, Blood .volume 104,abstract #511, 2004)。

(表 1)

•MW=60,000D

•4 Mpl binding sites

•No sequence homology with ΡΟ

•Expressed in E.coli.

[0150] また、 SB297115/Eltrombopagは、以下の化学式で示される化合物であり、下記表 2 に記載の性質を有する（Blood. Volume 104,abstract#2909. 2004)。

(表 2)

• Binding site： a hu c-mpl transmembrane domain (His499， Thr496)

• Highly species specincity

•No cross reactive： cynomolgus macaques, cat, mouse' "

•Cross reactive： chimpanzee

• In vitro activity

•Hu BM CD34 differentiation assay; EC50〜100nM

•T half=12hr peg— TPOmpは、 Phage display combinatorial peptide library ら発見された PEGィ匕ペプチドであり、以下の化学式で特徴づけることが出来る。また、下記表 4に記載の性質を有する（Blood volume 106,numberl l abstract#1249, 2005 )。

(表 3) •14merのペプチドを Lysで繋いで 29merの両端を PEG化

•hTPOとの相同性なし

•Mouse, Rat, Dogに交差する

[0152] また本発明の TPO受容体（c-mpl)に対するァゴニストとして、 YM477を挙げることもできる。 YM477に関しては、 Blood volume 106,numberl l abstract#2298, 2005に、その詳細が開示されている。

[0153] c_mplを認識する抗体は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。

[0154] 注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなべヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば D-ソルビトール、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート 80 (TM)、 HCO-50と併用してもよい。

[0155] 油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジノレアルコールと併用してもよレ、。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロ力イン、安定剤、例えばべンジノレアルコール、フヱノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプノレに充填させる。 [0156] 投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与すること力 Sできる。

[0157] また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重 lkgあたり O.OOOlmgから lOOOmgの範囲で選ぶことが可能である。あるレ、は、例えば、患者あたり 0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

[0158] また本発明の薬剤の投与時期は限定されず、例えば造血幹細胞の増殖を促進させたいとき、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進させたいとき、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着を増加させたいとき、若しくは造血能を回復させたレ、ときに投与することができる。例えば、本発明の薬剤は、骨髄造血機能が低下した患者に対して行われる造血幹細胞移植の際に投与することができる。本発明の薬剤は、単剤投与によって、造血幹細胞のみならず、骨髄系細胞及び/又はリンパ球系細胞の骨髄における生着増強を、用量依存的傾向をもって示す。

本発明の薬剤は、移植直後からの一定期間の間にある程度の高濃度の量を投与することによって、造血幹細胞の骨髄定着促進効果を得ることが出来る（実施例 3を参照)。本発明の薬剤が投与される移植直後からの一定期間および投与量は、当業者であれば、本発明の薬剤の投与を必要とする患者の症状、年齢等を考慮し、適宜設計することが出来る。例えば、本発明の薬剤が投与される一定期間（投与時期）としては、これに限定されるものではなレ、が、移植日もしくはその翌日より 3日間以上、好ましくは 7日間〜 28日間又はそれ以上を挙げることが出来る。また投与量は、骨髄移植患者の内在血中の TPO濃度の 10倍以上、好ましくは 5倍以上、より好ましくは 2 倍以上の量を投与することが可能であるが、これらに限定されず、移植後一定期間以上、血中の薬剤濃度を維持するために必要な量を投与することが可能である。また本発明の薬剤力 SI回の造血幹細胞移植において投与される回数は制限されず

、造血幹細胞移植の際、及び造血幹細胞移植の後のそれぞれにおいて、任意の回数投与することが可能である。本発明の薬剤の投与時期、投与量、及び投与回数は、造血幹細胞移植を受けた患者の症状に応じて適宜判断することが可能であるが、例えば上述の投与時期、投与量を挙げることが可能である。

[0159] 本発明の薬剤は、造血幹細胞移植において用いられる。また本発明の薬剤は、造血幹細胞移植後において用いられる。本発明における造血幹細胞移植には、これに限定されるものではないが、骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植が含まれる。本発明の薬剤が用いられる造血幹細胞移植の特に好ましい態様としては、ヒト臍帯血移植が挙げられる。

[0160] 本発明の薬剤の投与部位は、特に限定されるものではないが、皮下注射、静脈注射、経口投与などが挙げられる。本発明においては、点滴による静脈投与が特に好ましレ、。また本発明の薬剤は、造血幹細胞とともに投与することも可能である。造血幹細胞とともに投与する場合、本発明の薬剤と造血幹細胞を同時に同じ部位に投与してもよいし、異なる時期に別々の部位に投与してもよい。同じ部位に投与する場合、例えば静脈より投与することが可能である。また投与時期は、本発明の薬剤を単独で投与する場合と同様の時期を選択することが可能である。

一方、本発明の薬剤と造血幹細胞を異なる時期に投与する場合、これらのうちのどちらを先に投与しても構わない。また、これら 2つの投与間隔も制限されない。

本発明の薬剤を造血幹細胞とともに投与する場合、造血幹細胞は、自己に由来するもの（自家移植）であっても、他人から提供されたもの（他家移植）であっても良レ、。造血幹細胞の取得は、当業者に周知の方法によって行うことが可能であり、例えば以下の文献に記載の方法によって取得することが出来る。

Heike'T et.al. Biochimica et Biophysica Acta 2002年 vol.1592, p313-321. Ex vivo ex pansion of hematopoietic stem ells by cytokines. , Yvette van Hensbergen et.al. Exp erimental Hematology 2006 vol34,p943-950. Ex vivo culture of human CD34+ cord り lood cells with thrombopoietin(TPO) accelerates platelet engraftmnet in a NOD/SC ID mouse model. [0161] また本発明においては、造血幹細胞移植を行う疾患はなんら限定されるものではないが、好ましくは AML (急性骨髄性白血病）、 ALL (急性リンパ性白血病）、 CML ( 慢性骨髄性白血病）、 MDS (骨髄異形成症候群)または AA (再生不良性貧血)悪性リンパ腫、成人 T細胞白血病が挙げられる。

[0162] 本発明は、本発明者らが、造血幹細胞と TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストとの接触によって、分化先の細胞であるリンパ系細胞の数及び/又は骨髄系細胞の数が増加することを見出したことに基づく。よって本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する薬剤であって、該ァゴ二ストと造血幹細胞との接触により、造血幹細胞の分化先の細胞であるリンパ系細胞の数及び/又は骨髄系細胞の数を増加させるための薬剤に関する。また本発明は、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する薬剤であって、点滴により静脈から造血幹細胞とともに投与することで、造血幹細胞の分化先の細胞であるリンパ系細胞の数及び/又は骨髄系細胞の数を増加させるための薬剤に関する。ァゴニスト、造血幹細胞、リンパ系細胞、骨髄系細胞、投与時期、投与量などに関する説明は、上述の通りである。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

実施例

[0163] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

「窗列 1〕ヒ H告冓 ^マウスヒ^. 細包ケにする TPO 本ァゴニストの影響

ヒト臍帯血由来造血幹細胞の移植後の初期段階において、ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒト血球細胞生着数に対する配列番号： 73に記載のアミノ酸配列からなる sc (Fv)2抗体 (hVB22 u2-wz4: sc(Fv)2)の影響を検討することを目的に、以下の方法に従って実験を実施した。なお、配列番号： 73に記載のアミノ酸配列からなる sc(Fv)2抗体は、 WO2005/056604に記載の方法によって調整することが可能である。

逾マウスは馴化した NOD.CB17-Prkdcく scid>/J、 6w、を用いた。マウスに、 3.0Gyの X線を全身照射した後、抗ァシァロ GM1抗体を、照射当日から 10日に 1回 i.p.投与した。照射の翌日に、ヒト臍帯血由来 CD34陽性細胞を 1マウスあたり 5xl0⁴個尾静脈より移植した。配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体の投与は、移植の翌日力連続して 1 0日間行い、その後は 5投 2休で投与を行った。投与量は、朝 0.25mg/5mL/kg、夕 2mg /5mL/kgとし、インターバル 8時間、 s.c.、 1日 2回通期 3週間投与した (n=10)。 vehicleとして、 0.02%Tween80を含む 20mmoL/Lクェン酸緩衝液を、配列番号： 73に記載の sc( Fv)2抗体と同様に投与した。移植後 3週目で骨髄を採取し、 EPIX XLによる FACS解析を実施した。ヒト細胞の絶対数は flow count (Beckman)を用いて測定した。

、

マウス左右大腿骨に存在するヒト細胞数を解析した。配列番号： 73に記載の sc(Fv) 2抗体投与群において、当初目的としたヒト CD34陽性細胞数ば力でなぐ CD45陽性細胞数、 CD41陽性細胞数、 CD19陽性細胞数、 CD33陽性細胞数が vehicle群と比較し統計有意に増加した (図 1)。これらの結果は、 c-mplァゴニストである配列番号： 7 3に記載の sc(Fv)2抗体の投与力ヒト巨核球特異的分化誘導に加えて、造血系 CD3 4陽性細胞の生着数の増加とそれに伴う各血球系細胞数の増加に寄与したと考えられる。

「実施例 2〕ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒト CFU-Megコロニー数に対する TPO受容体ァゴニストの影響

ヒト臍帯血由来造血幹細胞移植後、ヒト CFU-Megコロニー数に対する配列番号： 7 3に記載の sc(Fv)2抗体の影響を検討することを目的に、以下の実験を実施した。雄

マウスは馴化した NOD.CB17- Prkdcく scid>/J、 6w、（^を用いた。 3.0Gyの X線を全身照射後、抗ァシァロ GM1抗体を照射当日から 10日に 1回、 i.p.投与した。照射翌日にヒト臍帯血由来 CD34陽性細胞を 5xl0⁴/mouse、尾静脈より移植した。移植翌日から連投で 10日間、その後は 5投 2休で配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体を、朝 0.25mg /5mL/kg、インターバル 8時間、夕 2mg/5mL/kg 、 s. 、 1日 2回通期 3週間投与した (n = 10)。 vehicleとして 0.02%Tween80を含む 20mmoL/Lクェン酸緩衝液を配列番号： 73 に記載の sc(Fv)2抗体と同様に投与した。移植後 3週目で骨髄細胞を採取し、 MegaC ult-C(StemCell Technologies)を用いて、各マウス大腿骨 1本に含まれる骨髄細胞を配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体と共に 13日間培養した。ヒト CFU_Megコロニー数は光学顕微鏡下で CD41陽性の 50 cellsん olony以上のものをカウントした。

、

配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体投与群の骨髄には、 vehicle投与群と比較し、統計有意により多くの CFU_Megコロニーが存在することが明らかとなった（図 2)。

「寞窗列 3〕ヒ H告冓 ^マウスヒト . 細包ケにする TPO 体ァゴニストの fe な

ヒト臍帯血由来造血幹細胞移植後、ヒト造血系再構築マウス骨髄中ヒト血球細胞生着数に対する配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体の用量依存的な効果を検討することを目的に、以下の実験を実施した。

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マウスは馴化した NOD.CB17-Prkdcく scid>/J、 6w、を用いた。 3.0Gyの X線を全身照射後、抗ァシァロ GM1抗体を照射当日および 8日後に、 i.p.投与した。照射翌日にヒト臍帯血由来 CD34陽性細胞を 5xl0⁴/m_OUSe、尾静脈より移植した。移植翌日から連投で 10日間、配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体を、以下の 3通りの用量にて投与した（s.c.、各群 n=9)。

'高用量投与群 (朝 0.25mg/kg、インターバル 8時間、夕 2mg/kg/day)

'中用量投与群 (朝 0.05mg/kg、インターバル 8時間、夕 0.2mg/kg/day)

'低用量投与群 (朝 0.01mg/kg、インターバル 8時間、夕 0.02mg/kg/day)

高用量、中用量、低用量投与各群において、投与期間中の末梢血中での薬剤最小濃度が、それぞれ、 50ng/ml、 lOng/ml, 2ng/mlになるように設定した。

vehicleとして 0.02%Tween80を含む 20mmoL/L sodium citrate/ 150mM NaCl緩衝液（ pH 6.5)を、配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体と同様に投与した。移植後 2週目で骨髄細胞を採取し、 FACS解析を実施した。ヒト細胞の絶対数は flow count (Beckman )を用いて測定した。

、マウス左右大腿骨に存在するヒト細胞数を解析した。 CD34陽性細胞数ば力りでなく、 CD45陽性細胞数、 CD41陽性細胞数、 CD19陽性細胞数、 CD33陽性細胞数、 CD3 8陽性細胞数の増加が、用量依存的傾向をもって認められた（図 3)。このことは、配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体の投与が、より直接的に薬効に関与している可能性を示唆する。また、投与用量により薬効をコントロールできる可能性を示唆する。マウスの内在 TPO濃度は約 lng/ml程度（文献値、および、 in house実測値)であり、 X線照射により 5— 10倍程度上昇する（マウス in house data₀ヒト臨床は同様に正常値 80pg/ml程度から l _ 3ng/ml程度まで上がることが知られている）。本実施例において、内在 TP〇以上の濃度の配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体を投与することによって、用量依存的に薬効が上乗せされることが確認された。

なお本実施例においては、方法のセクションに示されているように、血中の配列番号： 73に記載の sc(Fv)2抗体の濃度の底値が維持されるように、投与プランが設計されている。

産業上の利用可能性

[0166] 本発明によって、新たな造血幹細胞の増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、並びに造血能回復促進剤が提供された。本発明の薬剤は、その活性成分として TPO受容体（ c-mpl)に対するァゴニストを含有する。

[0167] 本発明の新たな造血幹細胞の増殖促進剤、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤、並びに造血能回復促進剤は、造血幹細胞移植（特に臍帯血移植）後に単独投与（G-CSFや erythropoie tinの併用なく）するだけで効果を期待し得ることを、その特徴とする。

[0168] 本発明において提供される上記薬剤は、例えば急性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異変形症候群、急性リンパ球性白血病、成人 T細胞白血病、再生不良性貧血、悪性リンパ腫等、造血幹細胞移植が適応となる疾患を治療するために造血幹細胞移植 (骨髄移植、末梢血幹細胞移植、臍帯血移植）を行う際に、造血幹細胞の増殖を促進させるため、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進させるため、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着を促進させるため、若しくは造血能の回復を促進するために有用である。

特に臍帯血移植においては、移植後の血小板の回復遅延が問題となっている。移植時の骨髄における造血幹細胞の生着促進は、 _c-mplァゴニストの本来の作用である巨核球分化増殖作用と協調して血小板の回復促進をもたらすため、本発明の薬剤は有用である。

また、従来の造血幹細胞移植においては G-CSFが用いられている力 G— CSFは作用が好中球系に特化しているという問題がある。これに対して TPOは、巨核球のみならず幹細胞に作用することによって、より多様な細胞系列を回復させることが可能と考えられる。また TP〇は、現在認可されている G-CSFや ΕΡΟとのシナジー効果も十分期待される。本発明の薬剤は、このような観点からも有用である。

Claims

請求の範囲

[I] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血幹細胞増殖促進剤。

[2] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤。

[3] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤。

[4] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、造血能回復促進剤。

[5] 造血幹細胞移植において用いられる、請求項 1〜4のいずれか一項に記載の薬剤。

[6] 造血幹細胞移植後に投与される、請求項:!〜 5のいずれか一項に記載の薬剤。

[7] 造血幹細胞移植が、骨髄移植、末梢血幹細胞移植又は臍帯血移植からなる群より選択される、請求項 5又は 6に記載の薬剤。

[8] 臍帯血移植がヒト臍帯血移植である、請求項 7に記載の薬剤。

[9] 複数回投与されることを特徴とする、請求項 8に記載の薬剤。

[10] TPO受容体 (c_mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤。

[II] TPO受容体 (c_mpl)に対するァゴニストを有効成分として含有する、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤。

[12] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血幹細胞の増殖を促進する方法。

[13] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系 CD

34陽性細胞の増殖及び/又は分化を促進する方法。

[14] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血系 CD

34陽性細胞の骨髄への生着を増加させる方法。

[15] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、造血能の回復を促進する方法。

[16] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞を増殖させる方法。

[17] TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストを被検体に投与する工程を含む、リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化を促進する方法。

[18] 造血幹細胞増殖促進剤の製造における、 TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用。

[19] 造血系 CD34陽性細胞の増殖及び/又は分化促進剤の製造における、 TPO受容体（ c-mpl)に対するァゴニストの使用。

[20] 造血系 CD34陽性細胞の骨髄への生着増加剤の製造における、 TPO受容体 (c_mpl) に対するァゴニストの使用。

[21] 造血能回復促進剤の製造における TPO受容体 (c-mpl)に対するァゴニストの使用。

[22] リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞の増殖促進剤の製造における、 TPO受容体 (c- mpl)に対するァゴニストの使用。

[23] リンパ系細胞及び/又は骨髄系細胞への分化促進剤の製造における、 TPO受容体（ c-mpl)に対するァゴニストの使用。