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WO2006118327A1 - カチオン性アミノ酸型脂質 - Google Patents

カチオン性アミノ酸型脂質 Download PDF

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Publication number
WO2006118327A1
WO2006118327A1 PCT/JP2006/309211 JP2006309211W WO2006118327A1 WO 2006118327 A1 WO2006118327 A1 WO 2006118327A1 JP 2006309211 W JP2006309211 W JP 2006309211W WO 2006118327 A1 WO2006118327 A1 WO 2006118327A1
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WO
WIPO (PCT)
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group
amino acid
acid type
cationic
cationic amino
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/309211
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shinji Takeoka
Yosuke Obata
Original Assignee
Oxygenix Co Ltd
Univ Waseda
Shinji Takeoka
Yosuke Obata
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oxygenix Co Ltd, Univ Waseda, Shinji Takeoka, Yosuke Obata filed Critical Oxygenix Co Ltd
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Priority to US11/919,286 priority patent/US7838685B2/en
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    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06147—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and His-amino acid; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a complex lipid having a cationic functional group derived from an amino acid.
  • ribosome membrane-constituting lipids for example, mixed lipids of membrane-constituting lipids such as diacyl phosphatidylcholine and cholestadiol, diacyl phosphatidyl glycerol, and charged phospholipids are widely used.
  • ribosome preparations that can be administered to a living body can be achieved relatively easily in vivo, while inhibiting the degradation of drugs and controlling pharmacokinetics. .
  • the purpose of this is to increase the drug concentration near the target tissue or cell by controlling the pharmacokinetics of the drug contained in the ribosome preparation. This is because it depends on the permeability of the bilayer membrane and the cell membrane.
  • phagocytic cells such as macrophages and monocyte cells are targeted, there are cases in which these cells have the property of being easy to take up microparticles such as ribosomes, and thus cell migration is enhanced.
  • the present invention provides a cationic amino acid type lipid as shown below.
  • R 1 is a hydrocarbon group having a cationic functional group derived from an amino acid
  • 1 2 ⁇ Pi 1 3 are each independently a chain hydrocarbon group
  • a 1 and A 2 is each independently a linking group selected from the group consisting of 1 COO—, 1 OCO—, 1 CONH—, and NHCO—
  • n is an integer of 2 to 4
  • a force thionic amino acid type lipid represented by
  • (5) 1 2 and 1 3 are each independently a substituent selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an isoprenoid group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, and a mercapto group.
  • the cationic amino acid type lipid according to any one of (1) to (4) above, which is a chain hydrocarbon group having 12 to 30 carbon atoms in the main chain.
  • a cationic amino acid type lipid represented by any one of formulas (1) -1, (1) -2, and (1) -3.
  • the cationic amino acid type lipid of the present invention is easy to procure and synthesize raw materials, it can be synthesized at low cost and in large quantities.
  • the force thionic lipid of the present invention is used as a component of a preparation such as micelles, lipid microspheres, ribosomes, etc., thereby increasing the affinity of the preparation for cells and extremely intracellular transfer. A highly addictive formulation can be formed.
  • the cationic amino acid type lipid of the present invention has a high endoplasmic reticulum formation ability, it can stably encapsulate useful substances.
  • the cationic amino acid type lipid of the present invention is highly biodegradable and has low toxicity since the ⁇ -decomposed product is amino acid or a derivative thereof, such as V, or a long chain alcohol. Therefore, the cationic amino acid type lipid of the present invention is used in pharmaceuticals, reagents, cosmetics and the like. It is useful as a component of a stable, safe and functional carrier for medicinal substances.
  • Figure 1 is a transmission electron micrograph of the molecular assembly after the extrusion treatment of the cationic amino acid type lipid (2) hydrate.
  • Figure 2 is a transmission electron micrograph of the molecular assembly after cationic amino acid lipid ( ⁇ hydrate extrusion).
  • Fig. 3 is a transmission electron micrograph of the molecular assembly after the extrusion treatment of the cationic amino acid type lipid (4) hydrate.
  • Figure 4 shows cationic amino acid type lipids after hydrate treatment of hydrates
  • FIG. 3 is a diagram comparing a transmission electron micrograph of a molecular assembly composed of (2) and a transmission electron micrograph of a molecular assembly composed of Lys-Asp2C 16 (5).
  • FIG. 5 is a diagram comparing a polarization micrograph (a) of a molecular assembly composed of Lys-Asp2Ci 6 ( ⁇ ) at 37 ° C with a polarization micrograph (b) at room temperature.
  • Figure 6 is a graph comparing the cytotoxicity of cationic amino acid type lipids (2) and ribophetamine using COS-7 cell viability (a) and CCD-32SK cell viability (b).
  • the cationic amino acid type lipid of the present invention has the general formula (I)
  • R 1 is a hydrocarbon group having a cationic functional group derived from an amino acid
  • 1 2 ⁇ Pi 1 3 are each independently a chain hydrocarbon group
  • a 1 and A 2 So
  • n is an integer of 2-4.
  • R 1 is a hydrocarbon group having a cationic functional group derived from an amino acid.
  • the “cationic functional group” means a group that exhibits a cationic property in an aqueous solution, and is not particularly limited as long as it has such properties.
  • examples of the cationic functional group include an amino group, a guanidino group, an imidazole group, and derivatives thereof.
  • “Derivatives” include hydrogen atoms contained in amino groups, guanidino groups, and imidazole groups, lower alkyl groups (such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, etc.), aminoalkyl groups (ami / methyl).
  • oligoaminoalkyl groups hydroxyl groups, hydroxyalkyl groups (hydroxymethyl, hydroxyxetyl, hydroxypropyl, etc.), oligooxyalkyl groups (oligooxymethyl group) , Oligooxetyl group, oligooxypropinole, etc. and the like.
  • R 1 may have at least one cationic functional group, but preferably has two or more cationic functional groups.
  • compounds with two or more cationic functional groups can form stable complexes with polyanions such as nucleic acids such as DNA and RNA, or a portion where the negative charge on the cell surface is dense. It is preferable in that it can be stably bound to and can be transferred into fine JI packages.
  • the combination of the cationic substituents is not particularly limited.
  • R 1 is preferably a group represented by any of the following formulas (a), (b), or (c).
  • R 2 and R 3 are each independently a chain hydrocarbon group.
  • the “chain hydrocarbon group” is not particularly limited as long as it is a hydrophobic group that can be covalently introduced into the linking group A 1 or A 2 .
  • the chain hydrocarbon group may be either a straight chain or a branched chain, but is preferably a straight chain.
  • the number of carbon atoms in the main chain of the chain hydrocarbon group is preferably 12 to 30 and more preferably 12 to 22. When such a chain hydrocarbon group has an unsaturated bond such as a double bond or a triple bond, the number is preferably 1 to 4.
  • the main chain of the chain hydrocarbon group is preferably an alkyl chain, an alkenyl chain or an alkynyl chain, and more preferably an alkyl chain.
  • the chain hydrocarbon group may have a substituent selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an isoprenoid group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, and a mercapto group.
  • a substituent selected from the group consisting of an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an isoprenoid group, a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group, and a mercapto group.
  • alkyl group a nalalkyl group having 1 to 6 carbon atoms is preferable.
  • a til group, a hexyl group, etc. are mentioned.
  • the alkenyl group is preferably an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and examples thereof include a vinyl group, an aryl group, a propenyl group, an isopropenyl group, and 2-pteny
  • R 2 and R 3 are preferably alkyl chains having 12 to 22 carbon atoms, which may have a substituent.
  • a 1 and A 2 are each independently a linking group selected from the group consisting of 1 COO—, 1 OCO—, 1 CONH—, and NHCO—.
  • a 1 combination of ⁇ beauty A 2 is not particularly limited, A 1 and A 2 are both. It is preferably an COO-.
  • n is an integer of 2-4. It is preferable that n is 2 to 4 in that the chain hydrocarbon group of the compound of the formula (I) can be oriented substantially perpendicular to the plane of the film in the bimolecular film.
  • n is 2 to 4
  • the parent-hydrophobic interface of the bilayer membrane formed by the aggregation of cationic amino acid type lipids in aqueous solution is stable and forms an endoplasmic reticulum structure. By using it as a constituent lipid component, the effect of stabilizing the endoplasmic reticulum structure and the dispersed state can be expected.
  • glutamic acid and its derivatives can be used as raw materials, which is more preferable in terms of low cost and low toxicity.
  • the cationic amino acid type lipid of the present invention is preferably a compound represented by the following formula (1) -1, (1) -2, or (1) -3.
  • Such a cationic amino acid type lipid of the present invention can be produced very simply by combining known reactions.
  • the cationic amino acid type lipid of the present invention has the following formula:
  • a 1 1 and A 12 are each independently a carboxyl group, a hydroxyl group, or an amino group, and n is an integer of 2 to 4.
  • the trifunctional core compound having can be produced by sequentially reacting a chain hydrocarbon group supply source and a hydrocarbon group supply source having a cationic functional group.
  • a typical synthesis route for producing the cationic amino acid type lipid of the present invention is as follows.
  • the chain hydrocarbon group source is reacted with A 1 1 and A 1 2 parts of the trifunctional core compound.
  • a hydrocarbon group-containing source having a cationic functional group is reacted with the amino group of the obtained compound.
  • the source of the hydrocarbon group having a cationic functional group is preferably protected in advance by a tert-butoxy group or the like and activated by succinimide or the like.
  • the reaction is preferably carried out in the presence of a catalyst such as tertiary amine.
  • Any of the above reactions can be performed at room temperature.
  • the reaction can be carried out under pressure, reduced pressure, or atmospheric pressure. However, it is desirable to carry out the reaction under atmospheric pressure because the operation is simple.
  • reaction After completion of the reaction, it can be deprotected by treatment with an acid such as trifluoroacetic acid and purified by a conventional method to obtain a cationic amino acid type lipid.
  • an acid such as trifluoroacetic acid
  • purified by a conventional method to obtain a cationic amino acid type lipid.
  • the end point of the reaction can be confirmed by gas chromatography, high performance liquid chromatography, thin layer chromatography, nuclear magnetic resonance spectrum, infrared absorption spectrum and the like.
  • the method for producing the cationic amino lipid of the present invention is not limited to the above method.
  • the amino group of the trifunctional core compound is reacted first with a hydrocarbon group source having a force thione functional group, and then a chain hydrocarbon group at A 1 1 or A 1 2 parts. It can also be reacted with a source of ⁇
  • the supply source of the chain hydrocarbon group is not particularly limited as long as it has a reactive functional group such as an amino group, a hydroxyl group, and a strong loxyl group that can be covalently bonded to the trifunctional core compound.
  • a fatty acid is mentioned as a supply source of the chain hydrocarbon group having a strong loxyl group.
  • Phosphoric acid nonadecanoic acid, araquinic acid, behenic acid, palmitoleic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, etc., each including a branched chain.
  • acid anhydrides or acid chlorides are also included.
  • the source of chain hydrocarbon group having amino group is, as linear primary amine, dodecylamine, tridecylamine, tetradecylamine, pentadecylamine, hexadecylamine, heptadecylamine, octadecylamine , Docosylamine, oleylamine, etc., and their branched chains are also included. Further, amines such as branched isoprenoids can also be used.
  • the aliphatic hydrocarbon groups having amino groups include N-methyldodecylamine, N-methyltetradecylamine, N-methylhexadecylamine, N-ethyldodecylamine, N-ester.
  • Secondary amines such as tirutetradecylamine, N-ethyl-hexadecylamine, N-propyl dodecylamine, N-propyl-tetradecylamine, N-propi-hexadecylamine, dioleylamine, etc. are also included, and their branched chains Is also used.
  • Examples of the supply source of the chain hydrocarbon group having a hydroxyl group include laurinoreal cornole, cetinoleanoloseles, stearino real concore, behenol alcohol and the like as linear primary saturated alcohols.
  • Other straight chain primary saturated alcohols such as 1,1 1-dodecenol, 1-oleic alcohol, linolenyl alcohol, branched first saturated alcohol, branched primary unsaturated alcohol, secondary saturated alcohol or secondary unsaturated Al Call.
  • dialkyl glycerol mouths composed of dialkyl glycerols, primary saturated alcohols and primary unsaturated alcohols in which these alcohols are bonded to the 1,3- or 1,2-positions of glycerin.
  • sterols can be cited as a source of chain hydrocarbon groups.
  • Cholesterol, Cholestanol, Sitostero, and Enoregostero can be cited as a source of chain hydrocarbon groups.
  • Cholesterol, Cholestanol, Sitostero, and Enoregostero can be cited as a source of chain hydrocarbon groups.
  • Cholesterol, Cholestanol, Sitostero, and Enoregostero can be cited as a source of chain hydrocarbon groups.
  • amino acid or a derivative thereof can be used as a source of the hydrocarbon group having a cationic functional group.
  • lysine, arginine, histidine or derivatives thereof are preferable, and lysine, arginine and histidine are more preferable.
  • the hydrogen atom contained in the amino acid contains a low alkyl group (methyl, ethyl, propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, etc.), an aminoalkyl group (aminomethyl, aminoethyl).
  • oligoaminoalkyl groups hydroxyl groups, hydroxyalkyl groups (such as hydroxymethyl, hydroxyxetyl, hydroxypropyl), and oligoalkyl groups (oligooxymethyl groups) , Oligooxetyl group, oligooxypropyl, etc.) and the like.
  • the molecular assembly of the present invention is not particularly limited as long as it contains the above-described cationic amino acid type lipid of the present invention as a constituent fat.
  • examples of such molecular assemblies include polymer assemblies, polymer micelles, emulsions, lipid microspheres, bilayer vesicles (ribosomes), assemblies having hexagonal structures, and other tubular assemblies.
  • the content of the cationic amino acid type lipid of the present invention the total number of moles of constituent lipids of the molecular assembly,. 20 to: L00 preferably mole 0/0, 50 to 100 mol 0 More preferably / 0 .
  • constituent lipids contained in the molecular assembly of the present invention can form a molecular assembly with the cationic amino acid type lipid of the present invention, and are one of the constituent lipids of the molecular assembly. If it is generally used, it will not be specifically limited. Examples include phospholipids, fatty acids, sterols, and various glycolipids.
  • phospholipids examples include egg yolk lecithin, soybean lecithin, hydrogenated egg yolk lecithin, hydrogenated soybean lecithin, diacinorephosphatidinorecholine, diacinorephosphatidinorethanolamine, and sphingomyelin. These phospholipids may contain unsaturated parts such as ene (double bond), in (triple bond), gen, diyne, and triene, or polymerizable groups such as vinyl groups, such as styryl groups. May be contained.
  • phospholipid there is no particular limitation on the content of phospholipid, relative to the total number of moles of constituent lipids of the molecular assembly, and more is possible preferably from 0 to 70 mole 0/0, 0 to 50 mole 0/0 preferable.
  • fatty acid constituting the acyl chain of the phospholipid a saturated or unsaturated fatty acid having 1.2 to 22 carbon atoms is used.
  • trifunctional amino acids for example, amino acid lipids such as amphoteric having glutamic acid or lysine skeleton can be used.
  • the content of fatty acids the total number of moles of constituent lipids of the molecular assembly, rather L preferred that a 1 to 70 mole 0/0, is 5 to 30 mole 0/0 It is more preferable.
  • sterols may be added to the molecular assembly as stabilizers as membrane components of the lipid vesicles.
  • examples of such sterols include all steroids having a perhydrocyclopentanophenanthrene skeleton such as ergosterol and cholesterol, with cholesterol being preferred.
  • the content of the sterols in consideration of the stability of the endoplasmic reticulum membrane, it is preferably 5 to 50 mol% with respect to the total number of moles of the constituent lipids of the molecular assembly. Preferably, it is 15 to 40 mol%.
  • ribosome production methods include single or mixed lipid powder or thin film after hydration and dispersion, high pressure extrusion method, ultrasonic irradiation method, stirring (portex mixing, homogenizer) method, A method of manufacturing by freeze-thaw method, microfluidizer method, etc., after injecting a solution of single or mixed fat dissolved in organic solvent into the aqueous phase, ethanol, ether, etc.
  • a nonionic surfactant such as sodium cholate, sodium dodecyl sulfate, TritonX or lauryl ether.
  • a method of forming an emulsion and removing it by dialysis, a reverse phase evaporation method, an incubation method, or the like can be employed.
  • a method for encapsulating a useful substance in such a molecular assembly may be appropriately selected according to the kind of the useful substance.
  • the useful substance is a water-soluble drug
  • it can be prepared, for example, by dissolving the drug in an aqueous phase at the time of liposome production.
  • a water-soluble drug can be added to the outer aqueous phase, and the drug can be introduced into the inner aqueous phase using the permeability of the liposome membrane.
  • Water-soluble drugs not encapsulated can be separated from the endoplasmic reticulum by gel filtration, ultracentrifugation, or ultrafiltration membrane treatment.
  • the drug is mixed in a state where a single or mixed lipid is dissolved in an organic solvent, and a liposome is formed by the method described above, whereby the drug is added to the hydrophobic part of the bilayer membrane.
  • a liposome can be produced in advance, and then the drug can be dissolved in an organic solvent mixed with water and added to the outer aqueous phase to introduce the drug into the hydrophobic part of the bilayer membrane.
  • step (B) The dialkyl glutamic acid derivative 1 (1.0 g, 1.67 mmol) obtained in step (A) and triethylamine (202 mg, 2.0 mmol) were dissolved in 30 mL of dichloromethane and stirred at room temperature for 1 hour. Then, protect the amino group with t-butoxy group and add succinimide activated lysine (617 mg, 1.4 mmol), histidine (633 mg, 1.4 mmol), or arginine (593 mg, 1.4 mmol) The mixture was further stirred at room temperature for 6 hours.
  • Each cationic amino acid type lipid obtained was simply dispersed in pure water at 60 ° C as the measurement sample, and 60 L of the sample solution (lipid concentration 1 wt%) was sealed in a silver pan (sealed type).
  • the phase transition temperature Tc was measured with a scanning calorimeter at a heating rate of 2 ° C / min and a measurement temperature of 20-80 ° C. Table 1 shows the measurement results.
  • Table ⁇ The temDerature of the gel
  • the zeta potential of a single molecular assembly (1 mg / mL) of each cationic amino acid type lipid (2), (3), (4) prepared by the extrusion method was measured using a zeta potential measurement device (Nano-ZS, Malvern ) Was used to measure the zeta potential under the conditions of phosphate buffer 30 mM pH 7.4. Table 2 shows the measurement results.
  • the cationic amino acid type lipid (2) was +37 mV
  • the cationic amino acid type lipid ⁇ was +45 mV
  • the cationic amino acid type lipid (4) was +18 mV lower than the others. From the above, under physiological conditions, the surface of the aggregate is positively charged from the zeta potential value of the molecular aggregate composed of cationic amino acid type lipids. It became clear.
  • Table 2 Characteristics ⁇ cation ic vesicles
  • Each cationic amino acid type lipid (2), (3), (4) 10 mg was hydrated in 2 mL of pure water, stirred at room temperature for 6 hours, and then hydrated with a membrane filter (final pore size 0.22 im ) Was allowed to pass through under pressure (etatrusion method).
  • the permeability of the 0.22 u rn membrane filter was poor, so the lipid dispersion was heated to about 60 ° C and allowed to pass through the filter.
  • ultracentrifugation (33,000 rpm, 30 min) and redispersion with pure water gave a cationic amino acid type lipid aggregate.
  • the molecular assemblies of each prepared cationic amino acid type lipid were observed with a transmission electron microscope (TEM, acceleration voltage 100 kV).
  • the particle size measured by the dynamic light scattering method was 241 + 96 nm.
  • Tubular molecular aggregates with a diameter of about 20 nm were observed.
  • the branches of the tube-like molecular assembly were connected in a hollow shape.
  • the tip of the tube was open.
  • the wall thickness of the tube was about 5 nm, corresponding to the bilayer thickness of the cationic amino acid type lipid 3.
  • HS Kim et al. Long Sung Kim et al., Gene-Tranferring Efficiencies of Novel Diamino Cationic Lipids with Varied Hydrocarbon Chans. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1095. Therefore, the difference between the cationic amino acid type fat (2) and Lys-Asp2Ci 6 was clarified.
  • Lys-Glu2Ci6 (2) Lys-Asp2Ci6 (5) Hydrate Lys-Asp2Ci 6 (S) at a lipid concentration of 10 mg / mL and pass through a membrane filter with a final pore size of 0.22 jum by the extrusion method, and then determine the phase transition temperature and particle size of the aggregate. It was measured. As a result, the particle size of the molecular assembly of Lys-Asp2Ci 6 measured by the dynamic light scattering method was 374 soils and 178 nm, and the phase transition temperature was 30 ° C. It was found that Lys-Asp2C 16 was poorer in molecular packing and more likely to aggregate than the cationic amino acid type lipid (2).
  • Lys-Asp2Ci 6 has an unstable morphology, and after passing through a 0.22 ⁇ membrane filter, the morphology changed to a lip-on shape, with a length of about 1 ⁇ .
  • mixing with other phospholipids may cause destabilization of the dispersed state as well as the structure of the resulting endoplasmic reticulum.
  • the cationic amino acid type lipid of the present invention is used as a surface modifier for ribosomes and microspheres having a specific recognition ability for cells and proteins, a filler for separation, various sensors, a cell culture substrate and the like. Furthermore, it can be applied to emulsifiers, stabilizers, dispersants, solubilizers, admixtures, penetrants, viscosity modifiers, etc. for pharmaceuticals, foods, cosmetics, and dyes.

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Abstract

　本発明は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する新規な複合脂質を提供する。すなわち、本発明は、次式（式中、Ｒ１は、アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、鎖状炭化水素基であり、Ａ１及びＡ２は、それぞれ独立して、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、―ＣＯＮＨ−、及びＮＨＣＯ−からなる群から選択される結合基であり、ｎは、２～４の整数である。）で表されるカチオン性アミノ酸型脂質を提供する。

Description

^チオン性アミノ酸型脂質 技術分野
本発明は、 アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する複合脂質に関する。 背景技術
明
人工の二分子膜からなる小胞体、 リポソームに有用物質を内包させる技術は、 医薬品、 香粧品、 食品、 染料などの分野で盛んに研究されている。
田
リボソームの膜構成脂質としては、 例えば、 ジァシルホスファチジルコリン及 ぴコレステ口ールなどの膜構成脂質と、 ジァシルホスファチジルグリセ口ール、 電荷リン脂質の混合脂質が広く用いられている。
しかし、 生体に投与できるリボソーム製剤において、 in vivo における薬物分 解抑制及び体内動態制御は比較的容易に達成可能であるが、 細胞內移行性の向上 に対する工夫をも達成できる製剤の構築は極めて難しい。 これは、 リボソーム製 剤が内包する薬物の体内動態を制御することによって、 標的とする組織または細 胞近傍での薬物濃度を上昇させることを目的としており、 細胞への移入は薬物自 身のリボソーム二分子膜と細胞膜の透過性に依存しているからである。 ただし、 マクロファージ及び単球細胞などの貪食細胞を標的とした場合には、' これらの細 胞がリボソーム等の微粒子を取り込み易レ、性質を有するため、 細胞內移行性が高 まる例がある。
近年では、 カチオン性脂質単独またはそれを含むリボソームを用いて、 遺伝子 と複合体を形成することにより、 細胞内に遺伝子を導入する研究が行われている。 しかしながら、 この細胞内移行性を有する担体の使用には、 1)カチオン脂質の合 成が困難である、 2)製剤が高価である、 3)細胞毒性が強い、 という問題があった。
ところで、 カチオン性脂質.としては、 ジアルキルァスパラギン酸にリシンを結 合させたアミノ酸型 ϋ旨質が報告されている（Hong Sung Kim et al.， Gene- Tranferring Efficiencies of Novel Diamino Cationic Lipids with Varied Hydrocarbon Chans. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1095)。 し力 しな力 Sら、 こ の脂質は小胞体構造をとり難く、 分散状態が不安定であるという問題があった。 上記実情に鑑み、 1)容易に合成可能であり、 2)安価に提供可能であり、 3)生体 適合性が高い、 すなわち低毒性のカチオン性脂質の開発が望まれている。 発明の開示
本発明者らは、 上記実情に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、 アミノ酸由来のカチ オン性官能基を有する複合脂質の合成に成功した。
すなわち、 本発明は、 以下に示したとおりのカチオン性アミノ酸型脂質を提供 するものである。
(1) 一般式 (I)
Figure imgf000003_0001
(Ι) (式中、 R 1は、 アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、 1 2及ぴ1 3は、 それぞれ独立して、 鎖状炭化水素基であり、 A 1及び A 2は、 そ れぞれ独立して、 一 C O O—、 一O C O—、 一 C O N H—、 及ぴ N H C O—から なる群から選択される結合基であり、 nは、 2〜4の整数である。 ）
で表される力チオン性ァミノ酸型脂質。
(2) カチオン性官能基が、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾール基、 及ぴこれ らの誘導体からなる群から選択されるものである、 上記 (1)に記載のカチオン性 アミノ酸型脂質。
(3) R 1が、 式 (a)、 （b)、 または (c)のいずれかで表されるものである、 上記 (1)ま たは (2)のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
Figure imgf000004_0001
(4) A 1及ぴ A 2が、 いずれも、 一 C O O—である、 上 |Β(1)〜（3)のいずれかに記 載のカチオン性アミノ酸型脂質。
(5) 1 2及ぴ1 3が、 それぞれ独立して、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル 基、 イソプレノイ ド基、 カルボキシル基、 水酸基、 アミノ基、 及びメルカプト基 からなる群から選択される置換基を有していてもよい、 主鎖の炭素数が 1 2〜3 0の鎖状炭化水素基である、 上記 (1)〜(4)のいずれかに記載のカチオン性ァミノ 酸型脂質。
(6) R 2及ぴ R 3が、 それぞれ独立して、 炭素数 1 2〜2 2のアルキル鎖である、 上記 (1)〜(5)のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
(7) nが 2である、 上記 (1)〜(6)のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
(8) 式 (1)-1、 （1)-2、 または (1)-3のいずれかで表されるカチオン性アミノ酸型脂質。
Figure imgf000005_0001
(9) 上記 (1)〜(8)のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質を含む分子集合 体。
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、 原料の調達及ぴ合成が容易であるため、 安価かつ大量に合成が可能である。 本発明の好ましい態様によれば、 本発明の力 チオン性脂質は、 ミセル、 リピッドマイクロスフェア、 リボソーム等の製剤の構 成成分に用いることにより、 製剤の細胞に対する親和性を高め、 極めて細胞内移 行性の高い製剤を形成することができる。 また、 本発明のカチオン性アミノ酸型 脂質は、 小胞体形成能が高いため、 有用物質を安定に内包させることができる。 さらに、 本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、 生分解性が高く γ分解物もアミ ノ酸またはその誘導体、 ある V、は長鎖アルコールなどであるので低毒性である。 従って、 本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、 医薬品、 試薬、 化粧品等におい て、 薬効を有する物質の安定、 安全かつ機能的な担体の成分として有用である 図面の簡単な説明
図 1は、 カチオン性アミノ酸型脂質 (2)水和物をェクストルージョン処理した 後の分子集合体の透過型電子顕微鏡写真である。
図 2は、 カチオン性アミノ酸型脂質 (^水和物をェクストルージョン処理した 後の分子集合体の透過型電子顕微鏡写真である。
図 3は、 カチオン性アミノ酸型脂質 (4)水和物をェクストルージョン処理した 後の分子集合体の透過型電子顕微鏡写真である。
図 4は、 水和物をエタストルージョン処理した後のカチオン性アミノ酸型脂質
(2)からなる分子集合体の透過型電子顕微鏡写真と、 Lys-Asp2C16(5)からなる分 子集合体の透過型電子顕微鏡写真とを比較した図である。 一
図 5は、 Lys-Asp2Ci6(≤)からなる分子集合体の 37°Cにおける偏光顕微鏡写真 (a)と、 室温における偏光顕微鏡写真 (b)とを比較した図である。
図 6は、 カチオン性アミノ酸型脂質 (2)とリボフエトァミンとの細胞毒性を COS-7 の細胞生存率 (a)及ぴ CCD-32SK の細胞生存率 (b)により比較したグラフ である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明のカチオン性アミノ酸型脂質及びそれを含む分子集合体について 詳細に説明する。
A. カチオン性アミノ酸型脂質
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、 一般式 (I)
Figure imgf000006_0001
(1)
(式中、 R 1は、 アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、 1 2及ぴ1 3は、 それぞれ独立して、 鎖状炭化水素基であり、 A 1及び A 2は、 そ れぞれ独立して、 一COO—、 _OCO_、 一 CONH—、 及び NHCO二から なる群から選択される結合基であり、 nは、 2〜4の整数である。 ）
で表されることを特徴としている。
式 (I)中、 R1は、 アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基である。 ここで 「カチオン性官能基」 とは、 水溶液中でカチオン性を示す基をいい、 この ような性質を有するものであれば特に限定されない。 例えば、 カチオン性官能基 としては、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾール基、 及ぴこれらの誘導体が挙 げられる。 「誘導体」 としては、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾール基に含 まれる水素原子が、 低級アルキル基 （メチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 n—ブチル、 s e c—ブチル等） 、 ァミノアルキル基 (アミ /メチル、 アミノエ チル、 ァミノプロピル、 アミノブチルなど） や対応するオリゴァミノアルキル基、 水酸基、 ヒ ドロキシアルキル基 （ヒ ドロキシメチル、 ヒ ドロキシェチル、 ヒ ドロ キシプロピルなど） 、 オリゴォキシアルキル基 (オリゴォキシメチル基、 オリゴ ォキシェチル基、 オリゴォキシプロピノレなど) などの置換基で置換された化合物 が挙げられる。
R1は、 カチオン性官能基を少なく とも一つ有していればよいが、 カチオン性 官能基を二つ以上有していることが好ましい。 特に、 カチオン性官能基を二つ以 上有している化合物は、 ポリア二オンである DNAや RNAなどの核酸と安定な 複合体を形成できる、 あるいは細胞表面の負電荷が密集している部分に安定に結 合し細 JI包内移行性が高まる点で好ましい。 カチオン性置換基を二つ以上有してい る場合は、 カチオン性置換基の組み合わせは特に限定されない。
これらの中でも、 R1としては、 次式 (a)、 （b)、 または (c)のいずれかで表され る基であることが好ましい。
Figure imgf000007_0001
次に、 式 (I)中、 R2及ぴ R3は、 それぞれ独立して、 鎖状炭化水素基である。 「鎖状炭化水素基」 は、 結合基 A 1または A 2に共有結合にて導入できる疎水性 の基であれば特に限定されない。 鎖状炭化水素基は、 直鎖または分岐鎖のいずれ であってもよいが、 直鎖が好ましい。 鎖状炭化水素基の主鎖の炭素数は、 1 2〜 3 0が好ましく、 1 2〜2 2がより好ましい。 このような鎖状炭化水素基に二重 結合または三重結合などの不飽和結合がある場合、 その数は 1〜4であることが 好ましい。 鎖状炭化水素基の主鎖としては、 アルキル鎖、 アルケニル鎖またはァ ルキニル鎖が好ましく、 アルキル鎖がより好ましい。
また、 鎖状炭化水素基は、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキニル基、 イソプ レノイド基、 カルボキシル基、 水酸基、 アミノ基、 及ぴメルカプト基からなる群 から選択される置換基を有していてもよい。 ここで、 アルキル基としては、 炭素 数 1〜 6のナルキル基が好ましく、 例えば、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピノレ基、 n—ブチル基、 s e c—ブチノレ基、 t e r t一プチノレ基、 ペン チル基、 へキシル基等が挙げられる。 アルケニル基としては、 炭素数 1〜 6のァ ルケ-ル基が好ましく、 例えば、 ビニル基、 ァリル基、 プロぺニル基、 イソプロ ぺニル基、 2—プテニル等が挙げられる。 アルキニル基としては、 炭素数 1 ~ 6 のアルキニル基が好ましく、 ェチニル基、 プロピニル基、 ブチニル基等が挙げら れる。
これらの鎖状炭化水素基の中でも、 R 2及び R 3としては、 置換基を有してい てもよい、 炭素数 1 2〜 2 2のアルキレ鎖が好ましい。
また、 式 (I)中、 A 1及ぴ A 2は、 それぞれ独立して、 一 C O O—、 一O C O—、 一 C O N H—、 及び N H C O—からなる群から選択される結合基である。 A 1及 び A 2の組み合わせは特に限定されるものではないが、 A 1及び A 2が、. いずれも、 一 C O O—であることが好ましい。
式 (I)中、 nは、 2〜4の整数である。 nが 2〜4であると、 二分子膜中で式 (I)の化合物の鎖状炭化水素基を膜平面に対して略垂直に配向させることができ る点で好ましい。 また、 nが 2〜4であると、 水溶液中でカチオン性アミノ酸型 脂質が集合して形成する二分子膜の親一疎水界面が安定であり小胞体構造を形成 しゃすいため、 分子集合体の構成脂質成分として用いることにより、 小胞体構造 ならびに分散状態を安定化させる効果が期待できる。 特に、 nが 2であると、 上 述の効果に加えて、 グルタミン酸やその誘導体を原料にできるため、 低価格や低 毒性の点でより好ましい。
. 具体的には、 本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、 下記式 (1)-1、 （1)-2、 また は (1)-3で表される化合物であることが好ましい。
(I)一 2
Figure imgf000009_0001
(製造方法）
このような本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、 公知の反応を組み合わせる ことによって極めて簡便に製造することができる。 例えば、 本発明のカチオン性 アミノ酸型脂質は、 次式
Figure imgf000010_0001
(式中、 A 1 1及び A 1 2は、 それぞれ独立して、 カルボキシル基、 水酸基、 また はァミノ基であり、 nは、 2〜4の整数である。 ）
を有する三官能性コア化合物に、 鎖状炭化水素基の供給源及びカチオン性官能基 を有する炭化水素基の供給源を順次反応させることによって製造することができ る。
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質を製造するための代表的な合成経路を示す と以下のとおりである。
まず、 三官能性コア化合物の A 1 1や A 1 2部に、 鎖状炭化水素基の供給源を反 応させる。 この際、 必要に応じて、 カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給 源と反応させる官能基を、 t e r t —ブトキシ基等の保護基で保護しておくこと が好ましい。
次いで、 得られた化合物のァミノ基にカチオン性官能基を有する炭化水素基の 供給源を反応させる。 カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源は、 予めァ ミノ基を t e r t—ブトキシ基などにより保護し、 スクシンィミ ドなどにより活 性化しておくことが望ましい。 反応は、 第三級ァミンなどの触媒の存在下で行う ことが好ましい。
上記反応はいずれも、 室温で行うことができる。 また、 反応は、 加圧、 減圧ま たは大気圧いずれの圧力下でも行うことができるが、 操作が簡便であることから、 大気圧雰囲気下で行うことが望ましい。
反応終了後は、 トリフルォロ酢酸などの酸で処理して脱保護し、 常法により精 製してカチオン性アミノ酸型脂質を得ることができる。 なお、 反応の終点は、 ガ スクロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィー、 薄層クロマトグラフィー、 核磁気共鳴スぺクトル、 及ぴ赤外吸収スぺクトル等によって確認できる。
本発明のカチオン性アミノ 型脂質の製造方法は、 上記方法に限定されるもの ではない。 例えば、 三官能性コア化合物のァミノ基に力チオン性官能基を有する 炭化水素基の供給源と先に反応させ、 次いで、 A 1 1や A 1 2部に鎖状炭化水素基 の供給源と反応させることもできる。 ·
以下、 本発明のカチオン性アミノ酸型脂質の合成に用いることができる原料化 合物を例示する。
鎖状炭化水素基の供給源としては、 三官能性コア化合物と共有結合しうる、 ァ ミノ基、 水酸基、 力ルポキシル基などの反応性官能基 有するものであれば特に 限定されない。
力ルポキシル基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、 脂肪酸が挙げられ る。 例えば、 酢酸、 プロピオン酸、 酪酸、 吉草酸、 イソ吉草酸、 カブロン酸、 ェ ナント酸、 力プリル酸、 ゥンデカン酸、 ラウリル酸、 トリデカン酸、 ミリスチン 酸、 ペンタデカン酸、 パルミチン酸、 マーガリン酸、 ステア.リン酸、 ノナデカン 酸、 ァラキン酸、 ベヘン酸、 パルミ トレイン酸、 ォレイン酸、 リノール酸、 リノ レン酸、 ァラキドン酸等であり、 それぞれ分岐鎖体も含まれる。 また、 それらの 酸無水物、 または酸クロライドも含まれる。
アミノ基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、 直鎖第一ァミンとして、 ドデシルァミン、 ト リデシルァミン、 テトラデシルァミン、 ペンタデシルァミン、 へキサデシルァミン、 ヘプタデシルァミン、 ォクタデシルァミン、 ドコシルアミ ン、 ォレイルァミン等 挙げられ、 それらの分岐鎖体も含まれる。 さらに分岐状 のイソプレノイド等のアミンも使用できる。 また、 アミノ基を有する脂肪族炭化 水素基の供給源には、 N—メチルードデシルァミン、 N—メチルーテトラデシル ァミン、 N—メチルーへキサデシルァミン、 N—ェチルードデシルァミン、 N— ェチルーテトラデシルァミン、 N—ェチル—へキサデシルァミン、 N—プロピル ードデシルァミン、 N—プロピルーテトラデシルァミン、 N—プロピ —へキサ デシルァミン、 ジォレイルァミン等の第二アミンも含まれ、 それらの分岐鎖体も 用いられる。
水酸基を有する鎖状炭化水素基の供給源としては、 直鎖第一飽和アルコールと してラウリノレアルコーノレ、 セチノレアノレコースレ、 ステアリノレアルコーノレ、 ベへ二ノレ アルコール等が挙げられる。 その他、 1， 1一ドデセノール、 1ーォレイアルコ ール、 リノレニルアルコール等の直鎖第一飽和アルコール、 分岐第一飽和アルコ ール、 分岐第一不飽和アルコール、 第二飽和アルコールあるいは第二不飽和アル コールが挙げられる。 また、 これらアルコール類をグリセリンの 1， 3—位ある いは 1， 2—位に結合したジアルキルグリセロール、 第一飽和アルコール及び第 一不飽和アルコールで構成されたジアルキルグリセ口ールが挙げられる。
その他、 鎖状炭化水素基の供給源としては、 ステロール類が挙げられる。 例え ば、 コレステロ一ノレ、 コレスタノ一ノレ、 シトステロ一ノレ及びエノレゴステロ一ノレ等 である。
カチオン性官能基を有する炭化水素基の供給源としては、 アミノ酸またはその 誘導体を使用できる。 中でも、 リシン、 アルギニン、 ヒスチジンまたはこれらの 誘導体が好ましく、 リ シン、 アルギニン、 ヒスチジンがより好ましい。 ここで、 アミノ酸の誘導体には、 アミノ酸に含まれる水素原子が、 低鋏アルキル基 （メチ ル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 n—ブチル、 s e c—ブチル等） 、 アミ ノアルキル基 （アミノメチル、 アミノエチル、 ァミノプロピル.、 アミノブチルな ど） や対応するオリゴァミノアルキル基、 水酸基、 ヒ ドロキシアルキル基 （ヒ ド 口キシメチル、 ヒ ドロキシェチル、 ヒ ドロキシプロピルなど） 、 オリゴォキシァ ルキル基 （オリゴォキシメチル基、 オリゴォキシェチル基、 オリゴォキシプロピ ルなど） などの置換基で置換された化合物が含まれる。
B . 分子集合体
次に、 本発明の分子集合体について説明する。 本発明の分子集合体は、 構成脂 質として、 上述した本発明のカチオン性アミノ酸型脂質を含むものであれば特に 限定されない。 そのような分子集合体としては、 例えば、 高分子集合体、 高分子 ミセル、 ェマルジヨン、 リピドマイクロスフィァ、 二分子膜小胞体（リボソーム）. へキサゴナル構造を有する集合体およびその他のチューブ状集合体などが挙げら れるが、 本発明においては、 有用物質を内包させるためにリボソームなどの小胞 体構造やチューブ状構造を有するものであることが好ましい。 本発明のカチオン 性アミノ酸型脂質の含有量に特に制限はないが、 分子集合体の構成脂質の全モル 数に対し、 20〜： L00 モル0 /0であることが好ましく、 50〜100 モル0 /0であることが より好ましい。
本発明の分子集合体に含まれるその他の構成脂質は、 本発明のカチオン性アミ ノ酸型脂質と分子集合体を形成することができ、 分子集合体の構成脂質として一 般に使用されるものであれば特に限定されない。 例えば、 リン脂質、 脂肪酸、 ス テロール類、 多種の糖脂質などが挙げられる。
リン脂質としては、 卵黄レシチン、 大豆レシチン、 水添卵黄レシチン、 水添大 豆レシチン、 ジアシノレホスファチジノレコリン、 ジアシノレホスファチジノレエタノ一 ルァミン、 スフインゴミエリ ンなどが挙げられる。 これらのリ ン脂質は、 ェン (二重結合)、 イン (三重結合)、 ジェン、 ジイン、 トリェンなどの不飽和部を含有 しても良いし、 ビニル基などの重合性基、 例えばスチリル基を含有しても良い。 リン脂質の含有量に特に制限はないが、 分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 0〜70モル0 /0であることが好ましく、 0〜50モル0 /0であることがより好ましい。
リン脂質のァシル鎖を構成する脂肪酸としては、 炭素数 1.2〜22 の飽和または 不飽和脂肪酸が用いられる。 例えば、 ミ リスチン酸、 パルミチン酸、 ステアリン 酸、 ォレイン酸、 リノール酸、 リノレン酸、 ォクタデ力- 2,4-ジェン酸などがある。 更には、 グリセロール骨格ではなく、 3 官能性アミノ酸、 例えばグルタミン酸や リジン骨格を持つ両ィオン性などのアミノ酸型脂質も使用することができる。 脂 肪酸の含有量に特に制限はないが、 分子集合体の構成脂質の全モル数に対し、 1 〜70モル0 /0であることが好ま Lく、 5〜30モル0 /0であることがより好ましい。
また、 分子集合体には、 脂質小胞体の膜成分としてステロール類を安定化剤と して添加してもよい。 そのようなステロール類としては、 例えば、 エルゴステロ ール、 コレステロール等、 ペルヒ ドロシクロペンタノフエナントレン骨格を有す る全てのステロイドが挙げられるが、 好ましくはコレステロールである。 ステロ ール類の含有量に特に制限はないが、 小胞体膜の安定性を考慮すれば、 分子集合 体の構成脂質の全モル数に対し、 5〜50 モル％であることが好ましく、 より好ま しくは 15〜40モル％である。
分子集合体の製造方法は特に限定されるものではなく、 一般に公知の方法を用 いることができる。 例えば、 リボソームの製造の手法としては、 単独または混合 脂質の粉末もしくは薄膜を水和させ分散させた後、 高圧押出し (ェタストルージ ヨン)法、 超音波照射法、 撹拌（ポルテックスミキシング、 ホモジナイザー)法、 凍結融解法、 マイクロフルイダィザ一法などで製造する方法、 単独または混合脂 質を有機溶媒に溶解させた溶液を水相に注入した後、 エタノールやエーテルなど の有機溶媒を減圧または透析で除去して形成する方法、 あるいは、 単独または混 合脂質をコール酸ナトリウム、 ドデシル硫酸ナトリウム、 TritonX またはラウリ ルエーテルなどの非ィォン性界面活性剤と共に水相に分散させてェマルジヨンを 形成させ、 透析によって除去して形成する方法、 その他、 逆相蒸発法、 インキュ ベーシヨン法などを採用することができる。
このような分子集合体に有用物質を内包させる方法は、 有用物質の種類等に応 じて適宜選択すればよい。 有用性物質が水溶性薬剤の場合には、 例えば、 リポソ ーム製造時に薬剤を水相に溶解させて調製することができる。 あるいは、 リポソ ームを製造した後に外水相に水溶性薬剤を添加し、 リポソーム膜の透過性を利用 して、 内水相に薬剤を導入させることができる。 内包されなかった水溶性薬剤は ゲルろ過、 超遠心分離または限外ろ過膜処理などにより内包小胞体と分離できる。 脂溶性薬剤の場合には、 例えば、 単独または混合脂質が有機溶媒に溶けている状 態で薬剤を混合して、 上述した方法でリポソームを形成させることにより、 二分 子膜の疎水部に薬物を導入することができる。 あるいは、 あらかじめリボソーム を製造した後、 水と混じり合う有機溶媒に薬剤を溶解させ、 これを外水相に添加 して薬剤を二分子膜の疎水部に導入させることができる。
以下、 実施例により、 本発明を具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら実施 例に限定されるものではない。
〔実施例 1〕
カチオン性アミノ酸型脂質の合成
(A) p-トルエンスルホン酸一水和物 (4.56 g、 24 mmol)のベンゼン溶液（100 mL) を 85°Cにて沸点還流し、 ジンスタークを用いて反応前に水を除去した。 反応液 にグルタ ミ ン酸（2.96 g、 20 mmol)とへキサデシルアルコール （10.7 g、 44 mmol)を添加し、 10 時間生成水を除去しながら沸点還流した。 反応の進行に伴 い、 懸濁液は徐々に溶解し透明に変化した。
反応終了後、 溶媒を減圧除去し、 クロ口ホルムに溶解して、—炭酸ナトリウム飽 和水溶液で 3 回洗浄した。 クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、 ろ過 後、 溶媒を減圧除去した。 残留物はメタノールから 4°Cにて再結晶し、 ジアルキ ルグルタミン酸誘導体 (1) (収率 83%)を白色粉末で得た。
Figure imgf000015_0001
ジアルキルグルタミン酸誘導体 (I)の分析結果は以下のとおりであった。
薄層クロマトグラフィー （シリカゲルプレート、 クロ口ホルム/メタノール /1) (容量 Z容量） ： : 0.83 (モノスポッ ト） ） 。
赤外吸収スぺク トル （cnr1) ： 1737 ( V c=o,ester).
-NMR (CDC13 500 MHzヽ δ ppm) ： 0.89 (t,6H,-CH3) ； 1.25 (s，52H，- CH2- CH2-) ； 1.62 (m,4H,-CO-O-C-CH2) ； 1.84 (m, lH,glu β -C¾) ； 2.08 (m,lH, glu β -CH2) ； 2.45 (t，2H， glu γ -CH2) ； 3.45 (t, lH， glu a -CH) ； 4.06,4.10 (t,4H, - CO-0-CH2)
MS(ESI) Calcd： 595.9 ； Found： 597.3 (MH)+.
(B) 工程 (A)で得られたジアルキルグルタミン酸誘導体 1(1.0 g、 1.67 mmol) と、 トリェチルァミン (202 mg、 2.0 mmol)をジクロロメタン 30 mLに溶解し、 1時 間室温で撹拌した。 その後、 アミノ基を t-ブトキシ基で保護し、 スクシンイミ ド により活性化されたリ シン（617 mg、 1.4 mmol) , ヒスチジン（633 mg、 1.4 mmol)、 又はアルギニン (593 mg、 1.4 mmol)を添加し、 さらに 6 時間室温で撹 拌した。
反応終了後、 溶媒を減圧除去し、 クロ口ホルムに溶解して、 炭酸ナトリウム飽 和水溶液で 3 回洗浄した。 クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、 ろ過 後、 溶媒を減圧除去した。 残留物はメタノールから 4°Cで再結晶し、 グラスフィ ルター (G6)ろ過して、 アミノ基を保護したリジン、 ヒスチジン、 アルギニン誘導 体をそれぞれ得た。
得られた誘導体にフルォロ酢酸 (20 mL)を加え、 4°Cで、 2時間撹拌した。 反応 終了後、 溶媒を減圧除去し、 クロ口ホルムに溶解して、 炭酸ナトリウム飽和水溶 液で 4 回洗浄した。 クロ口ホルム層を硫酸マグネシウムで脱水し、 ろ過後、 溶 媒を減圧除去した。 残留物はメタノールから 4°Cで再結晶し、 ろ過し、 乾燥して、 カチオン性アミノ酸型脂質 (2)(80%)、 (3)(53%), (4)(43%)を白色粉末として得た。
Figure imgf000016_0001
力チオン性ァミノ酸型脂質 (2)及び (3)及び④の分析結果は以下のとおりであつ た。
(2)： 薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量 /容量） ： Rf： 0.63(モノスポット)）
赤外吸収スぺク トル （cm—1)： 1737 ( V c=o,ester)； 1673 ( v c=o, amide)
iH-NMR(CDCl3、 500 MHz、 δ (ppm))： 0.88(t, 6H, -CH3)； 1.25-1.29(br, 44H, - CH2-)； 4.5l(d, 1H， -CO-N-CH-)； 7.8, 8.2(br, 2H， -C-NH2)
(3)： 薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量 /容量） ： ： 0.68(モノスポット)）
赤外吸収スぺク トル (cm"1)： 1737 ( v c=o,ester)； 1673 ( v c=o, amide)
!H-NMRCCDCla 500 MHz、 δ (ppm))： 0.88(t, 6H, -CH3)； 1.25_1.29(br, 44H, CH2-)； 4.5l(d, 1H, -CO-N-CH-)； 7.8, 8.2(br, 2H, -C-NH2) (4)： 薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、 クロ口ホルム/メタノール (4/1) (容量 /容量） ： : 0·62(モノスポッ ト》
赤外吸収スぺク トル (cm"1) ： 3321 ( V N=H, ester)； 1708 ( v c=o, amide)
iH-NMR(CDCl3、 500 MHzゝ δ (ppm))： 0.88(t， 6H, -CH3)； 1.25-1.29(br, 44H, - CH2")； 4.5l(d, 1H, -CO-N-CH-)； 7.8， 8.2(br, 2H, -C-腿 2)
〔実施例 2〕
(A) カチオン性アミノ酸型脂質の相転移温度
得られた各カチオン性アミノ酸型脂質を 60°Cで純水に単純分散させたものを 測定試料とし、 試料溶液 (脂質濃度 1 wt%)60 Lを銀製パン (密閉型)に封入し、 示差走査熱量計にて相転移温度 Tcを昇温速度： 2°C/min、 測定温度： 20 - 80°Cで 測定した。 測定結果を表 1に示す。 表 Ί The temDerature of the gel
to liquid-crystalline phase transition
化^/ Tc fC]
1 49.4
2 41.2
3 43.7
4 44.8
(B) カチオン性アミノ酸型脂質単独分子集合体のゼータ電位
ェクストルージョン法にて調製した各カチオン性アミノ酸型脂質 (2)， (3), (4)の 単独分子集合体（1 mg/mL)のゼータ電位をゼータ電位測定装置（Nano-ZS， Malvern)を用いて、 リン酸緩衝液 30 mM pH 7.4の条件にてゼータ電位測定を 行った。 測定結果を表 2 に示す。 カチオン性アミノ酸型脂質 (2)は +37 mVであ り、 カチオン性アミノ酸型脂質^).は +45 mV、 カチオン性アミノ酸型脂質 (4)で は他より低く +18 mVであった。 以上より、 生理条件では、 カチオン性アミノ酸 型脂質から成る分子集合体のゼータ電位値から、 集合体表面が正電荷を帯びてい ることが明らかとなった。 表 2 Characteristics οτ cation ic vesicles
化合物 rc ζ p°tential
ra _[mV]
41.2 37
11一 234 43.7 45
44.8 A 8 〔実施例 3〕
(A) カチオン性アミノ酸型脂質単独分子集合体の観察
' 各カチオン性アミノ酸型脂質 (2)， (3), (4) 10 mgを純水 2 mLに水和させ、 室 温にて 6 時間撹拌後、 水和物をメンブランフィルター (最終孔径 0.22 i m)に加 圧透過させた（エタストルージョン法)。 室温でのェクストルージョンでは 0.22 u rn のメンブランフィルター透過性が悪かったため、 脂質分散液を約 60°Cに加 温してからフィルターを透過させた。 透過後、 超遠心 (33,000 rpm， 30 min)し、 純水で再分散し、 カチオン性アミノ酸型脂質集合体を得た。 調製したそれぞれの カチオン性アミノ酸型脂質の分子集合体を透過型電子顕微鏡 (TEM、 加速電圧 100 kV)により観察した。
(B) カチオン性アミノ酸型脂質 (2)単独の分子集合体
カチオン性アミノ酸型脂質 (2)の水和分散液をェクス トルージョンして電子顕 微鏡観察したところ、 図 1 のような 1枚膜の/、胞体が多数観察された。 この小 胞体の粒子径は、 動的光散乱法で測定した粒径 (181土 83 nm)とほぼ同じであつ た。 よってェクストルージョン法で調製されたカチオン性アミノ酸型脂質 (2)は 安定な 1枚膜小胞体を形成することが明らかとなった。
(C) カチオン性アミノ酸型脂質 (3)単独の分子集合体
カチオン性ァミノ酸型脂質 (3)の水和分散体をェクストルージヨンしたところ 動的光散乱法で測定した粒子径は 241 + 96 nmであったが、 電子顕微鏡では管 径 20 nm程度のチューブ状の分子集合体が観測された。 チューブ状の分子集合 体の枝分かれ箇所は、 図 2 のように空洞になってつながつていた。 またチュー ブの先端は開いていた。 チューブの壁の厚さは 5 nm程度であり、 カチオン性ァ ミノ酸型脂質③の二分子膜厚に相当していた。
(D)カチオン性ァミノ酸型脂質 (4)単独の分子集合体
カチオン性アミノ酸型脂質 ( の水和分散体をェクストルージョンしたところ、 透過型電子顕微鏡では 600 nmから Ι μ πιの 1枚膜小胞体構造が観察された (図 3)。 動的光散乱法で測定された粒子径も 1 ^u ni を超えていた（1647土 733 nm)。 孔径' 0.22 μ ιηのフィルターを透過させた後にこのような大.きな一枚膜小胞体が 観測されたことから、 小さな一枚膜小胞体が直ちに凝集融合して成長し大きな一 枚膜小胞体となったと思われる。
(Ε) カチオン性アミノ酸型脂質 (2)と Lvs-AsP2C1 fi(5)の検討
本発明では一般式 (1)の nを 2〜4 と定義し、 特に nが 2のグルタミン酸を用 いており、 nが 1のァスパラギン酸を排除している。 他方、 前述のとおり、 H. S. Kim らによってジアルキルァスパラギン酸にリシンを結合させた Lys-
Figure imgf000019_0001
が報告されている （Hong Sung Kim et al.， Gene- Tranferring Efficiencies of Novel Diamino Cationic Lipids with Varied Hydrocarbon Chans. Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1095)。 そこでカチオン性アミノ酸型脂 質 (2)と Lys-Asp2Ci6 の相違を明らかとした。
Figure imgf000019_0002
Lys-Glu2Ci6 (2) Lys-Asp2Ci6 {5) Lys-Asp2Ci6(S)を 10 mg/mL の脂質濃度で水和しェクストルージョン法によ り最終孔径 0.22 ju mのメンブランフィルターを透過させた後、 集合体の相転移 温度や粒径を測定した。 その結果、 動的光散乱法により測定した Lys- Asp2Ci6 の分子集合体の粒子径は 374土 178 nmであり、 相転移温度は 30 °C であった。 カチオン性アミノ酸型脂質 (2)よりも Lys-Asp2C16 の方が分子充填 状態が悪いことと凝集しやすいことが判明した。
表 3 Comparison of cationic vesicles
Figure imgf000020_0001
5 30.0 374 + 178 nm
透過型電子顕微鏡 （TEM) での観察では、 カチオン性アミノ酸型脂質 (2)は二 分子膜小胞体構造であつたのに対し、 Lys-Asp2Ci6⑥ではリボン状の分子集合体 が観察された （図 4) 。 リボンの厚さは二分子膜厚の 5 mn程度であると思われ る。 リポンの幅が約 100 mnで長さが約 1 μ ηι以上もあった。 以上のことから 疎水部骨格がグルタミン酸とァスパラギン酸とでは、 水和時の分子集合体が異な ることが明らかとざれた。
また Lys-Asp2Ci6(5)の相転移温度が 30°C付近であることから、 37°Cにおける Lys-Asp2Ci6 の分子集合形態を偏光顕微鏡にて観察したが、 同様にリボン状の 繊維形態が観測され、 相転移温度上下で大きな形態の変化は観測されなかった (図 5)。 また 37°Cでは偏光が観測されなかったことから、 このリポンは液晶状態 になっており、 室温では偏光が 測されゲル状態になっていると思われた。
結論として、 Lys-Asp2Ci6 は形態が不安定であり、 0.22 μ ηι のメンブラン フィルターを透過後、 形態がリポン状に変化し、 長さは 1 μ πι程度になること が明らかとなった。 また、 他のリン脂質との混合においても、 得られた小胞体の 構造ならぴに分散状態を不安定化することが懸念される。 〔実施例 3〕
カチオン性ァミノ酸型脂質 (2)の細胞毒性試験
カチオン性アミノ酸型脂質②の細胞への添加畺を変化させ細胞毒性評価を行 つた。 具体的には、 サル腎臓由来細胞 COS-7またはヒ ト繊維芽細胞 CCD-32SK をディッシュに 1 X 104個播種し、 インキュベーター内にて 24時間培養した。 培養細胞に、 培地にて希釈したカチオン性リボソームを 0.1、 1、 5、 10 ^ g/dish になる様に添加して、 さらに 24 時間培養した。 その後培地で洗浄し、 WST assay にて細胞生存率を算出し、 この結果を元に毒性評価を行った (n=2)。 比較 として、 現在遺伝子導入試薬として汎用されているリポフエク トァミンについて も同様に試験を行った。 結果を図 6に示す。 図中、 （a)は COS-7を用いた例であ り、 （b)は CCD-32SK を用いた例である。 リボフエタトァミンでは、 COS-7 に 10 μ g添加後 24時間の細胞生存率は 20%であった。
カチオン性アミノ酸型脂質 (2)単独集合体では、 細胞生存率の低下は 10 g の 添加では全く見られなかったことから、 カチオン性ァミノ酸型脂質 (2)はリボフ エタ トァミンと比較して極めて低毒性であることが明らかとなった。 CCD- 32SK においても、 リボフェクトァミンの場合には lO ^u g の添加では生存率は 20 %以下となったのに対して、 カチオン性アミノ酸型脂質②では同条件での生 存率が 80%程度であり、 lOO ju g添加でも生存率の低下は認められなかった。 以 上より、 カチオン性アミノ酸型脂質 (2)はリボフエタトァミンよりも細胞毒性が かなり低いことが示された。 産業上の利用可能性
本発明のカチオン性アミノ酸型脂質は、 例えば、 細胞やタンパク質に対して特 異的な認識能を有するリボソームやマイクロスフェア、 分離用充填剤、 各種セン サー、 細胞培養基板等の表面改質剤として、 更には、 医薬品、 食品、 化粧品、 染 料等の乳化剤、 安定剤、 分散剤、 可溶化剤、 混和剤、 浸透剤、 粘度調整剤などに 応用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
oen 一般式 (I)
Figure imgf000022_0001
(式中、 R1は、 アミノ酸由来のカチオン性官能基を有する炭化水素基であり、 1 2及ぴ1 3は、 それぞれ独立して、 鎖状炭化水素基であり、. A 1及び A 2は、 そ れぞれ独立して、 一 COO—、 一 OCO—、 一 CONH—、 及び NHCO—から なる群から選択される結合基であり、 nは、 2〜4の整数である。 ）
で表される力チオン性ァミノ酸型脂質。
2. カチオン性官能基が、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾール基、 及びこ れらの誘導体からなる群から選択されるものである、 請求の範囲第 1項に記載の カチオン性アミノ酸型脂質。
3. R1が、 式 (a)、 （b)、 または (c)のいずれかで表されるものである、 請求の 範囲第 1項または第 2項に記載のカチオン性ァミノ酸型脂質。
Figure imgf000022_0002
4. A 1及び A 2が、 いずれも、 一 COO—である、 請求の範囲第 1項〜第 3 項のいずれかに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
5. 1 2及ぴ1 3が、 それぞれ独立して、 アルキル基、 アルケニル基、 アルキ ニル基、 イソプレノィド基、 ビュル基、 力ルポキシル基、 水酸基、 アミノ基、 及 びメルカプト基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、 主鎖の炭 素数が 1 2〜 30の鎖状炭化水素基である、 請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれ かに記載のカチオン性アミノ酸型脂質。
6 . R 2及ぴ R 3が、 それぞれ独立して、 炭素数 1 2〜 2 2のアルキル鎖であ る、 請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれかに記載のカチオン性ァミノ酸型脂質。
7 . nが 2である、 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれかに記載のカチオン性 アミノ酸型脂質。
8； 式 (1)-1、 （1)-2、 または (1)-3 のいずれかで表されるカチオン性アミノ酸型 脂質。
Figure imgf000023_0001
9 . 請求の範囲第 1項〜第 8項のいずれかに記載のカチオン性ァミノ酸型脂質 を含む分子集合体。
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