WO2006095897A1

WO2006095897A1 - スクリーニング方法

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Publication number: WO2006095897A1
Application number: PCT/JP2006/304839
Authority: WO
Inventors: Masaaki Mori; Kimiko Kanehashi
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date: 2005-03-08
Filing date: 2006-03-07
Publication date: 2006-09-14
Also published as: US8057990B2; JPWO2006095897A1; US20080280938A1; EP1857817A4; EP1857817A1

Abstract

本発明は、タクリン化合物、または配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質とタクリン化合物との結合を促進する化合物などを含有する癌の予防・治療剤などを提供する。

Description

明細書スクリ一二ング方法技術分野

本発明は、 GPR30受容体とタクリン化合物とを用いる医薬のスクリー二ング方法およびスクリ一二ング用キット、該スクリ一二ング方法またはキットによって得られうる化合物などに関する。詳細には、癌、心疾患などの予防 · 治療剤などのスクリ一二ング方法およびスクリ一二ング用キットなどに関する。背景技術

G protein-coupled receptor (GPCR) ίま、 7回 Β莫貫通型受容体で、ホノレモン、神経伝達物質、サイト力インや他の分子のシグナルを細胞膜内へ伝える働きを行っている。 GPCRの一つとして知られているヒト GPR30 ( hGPR30) (Owman, C. ら、 Biochem. Biophys. Res. Commun.、 228卷、 285-292 頁、 1996年）については、以下のような報告がある。

ヒト臍帯静脈内皮細胞を Shear Stressにさらすと hGPR30の発現量が増カロする (Takada, Yら、 Biochem. Biophys. Res. Commun.、 240卷、 734-741 頁、 1997年）。心筋由来細胞におけるラット GPR30 (rGPR30、 GPR41とも呼 'ばれる）の発現量は低酸素刺激後に通常の培養に戻すことにより誘導される (Kimura, Mら、 J. Biol. Chem.、 276卷、 26453-26460頁、 2001年） hGPR30は、ェストロジェン ' レセプター（ER) が発現している乳癌組織、乳癌由来細胞株および胎盤に発現している（Carmeci, ら、 Genomics 、 45卷、 607-617頁、 1997年）。乳癌由来細胞 MCF7に対して、エストロゲン存在下でプロゲスチン刺激を行うと、GPR30の発現量は増加する（Ahola T. M. ら、 Eur. J. Biochem.、 269卷、 2485— 2490頁、 2002年）。 †生ホノレモンは多くの生殖機能の調節を行うことが知られ、例えば、子宫ではプロゲステロンはエスト口ゲンが誘導する子宮内膜上皮細胞の増殖を阻害する。一方、乳腺でのプロゲステロンの働きはまだ解明されていないことが多い。プロゲスチンは、乳癌細胞、正常な乳腺上皮細胞の増殖を阻害する。プロゲスチンによる MCF7細胞の増殖阻害は GPR30の発現量が増加することにより引き起こされることを antisense RNAを用いた実験により示し、 GPR30が乳癌由来細胞の増殖の抑制に関わっている可能性が示された (Ahola, T. M. ら、 Endocrinology, 143卷、 3376 - 3384頁、 2002年）。さらに、プロゲスチンと GPR30による乳癌由来細胞の増殖阻害は MAPK ( mitogen— activated protein kinase) の活十生ィ匕の阻害によることち示されてレヽる（Ahola, T. M. ら、 Endocrinology, 143巻、 4620- 4626頁、 2002 年）。一方、 MCF7などの乳癌由来細胞において GPR30を介したエストロゲンによる MAPKの活性化が報告されている（Filard, E. J. ら、 Mol.

Endocrinol.、 14卷、 1469— 1660頁、 2000年）。これは、 MCF7などの？し癌由来細胞の細胞表面に存在する膜結合型 EGF (epidermal growth factor ) 力 PR30活性化によって可溶化し、 EGF受容体が活性化されるためであることが示唆された（Filard, E. J. ら、 Mol. Endocrinol. _N 14巻、 1469- 1660頁、 2000年）。しカゝし、同時にエスト口ゲン刺激によつて GPR.30 を介した細胞内 cAMP濃度が上昇し、 PKA (protein kinase A) 活性化によつて Rafが抑制されて MAPKの活性化が減弱されることも示された（Filard E. J. ら、 Mol. Endocrinol.、 16巻、 70 - 84頁、 2002年）。これらの事実は、 GPR30がエスト口ゲンの細胞膜型受容体であることを示しており、最近、薬理学的な解析が報告された（Thomas, T. ら、 Endocrinology, 146 卷、 624 - 632頁 _ς 2005年；）。

タクリン (1, 2, 3, 4-tetrahydro-9-acridinamine) はァセチノレコリンェステラーゼ阻害物質であり、アルツハイマー病治療薬として使用されているものの、エストロゲンの核内受容体に作用することは報告されていない。発明の開示安全で優れた癌や心疾患の予防 · 治療剤が求められている。

本発明者たちは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、タクリンによる刺激で、 GPR30発現 CH0細胞の細胞内カルシウムを特異的に上昇させること、さらにはタクリンが GPR30のリガンドであることを見出した。 GPR30はエスト口ゲンの膜結合型受容体であることが示唆されており、乳癌由来細胞において MAPKの活性化を抑制することが知られている。エストロゲンは、核内受容体を介して多様な生理作用を示すことが知られており、GPR30の作用を明らかにするためには核内受容体に作用しなレ、 GPR30特異的なリガンドが必要とされていたため、 GPR30とタクリンまたはその関連化合物を用いて、癌などに有効な医薬の探索が可能となる。これらの知見に基づき、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、

〔 1〕 ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩および（b) タクリン化合物を用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法、

〔 2〕タクリン化合物が、下式

〔式中、環 Aは、置換基を有していてもよいベンゼン環、

R ¹は、置換基を有していてもよいァミノ、

R ²および R ³は、それぞれ置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基またはァシルを示し、あるいは

R ²および R ³は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、置換基を有していてもよい 3ないし 1 0員同素または複素環を形成していてもよい〕で表される化合物またはその塩〔以下、化合物（I ) と略記することもある〕である上記〔 1〕記載のスクリーニング方法、

〔 3〕 ( a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩および（b) タクリンを用いる上記〔 1〕記載のスクリーニング方法、

〔4〕配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるァミノ酸配列である上記〔 1〕記載のスクリーニング方法、

〔 5〕（a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に接触させた場合における、タクリン化合物の該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較する、上記〔 1 〕記載のスクリー-ング方法、

〔 6〕（a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、タクリン化合物の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、上記〔 1〕記載のスクリーニング方法、

〔 7〕配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔6〕記載のスクリ一二ング方法、

〔 8〕タクリン化合物が、標識したタクリン化合物である上記〔 5〕〜〔 7〕記載のスクリーニング方法、

〔 9〕（a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記〔 1〕記載のスクリ一ユング方法、

〔 1 0〕（a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはそめ部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分べプチ.ドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記〔 1〕記載のスクリ一二ング方法、

〔 1 1〕配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記〔 1 0〕記載のスクリーニング方法、

〔 1 2〕 ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（b) タクリン化合物を含有することを特徴とする、該蛋白質またはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ニング用キット、

〔 1 2 a〕上記〔 1〕記載のスクリ一二ング方法または上記〔 1 2〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、

[ 1 2 b ] 化合物が、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしく.はその部分べプチドまたはその塩とタクリン化合物との結合を阻害する化合物またはその塩である上記〔 1 2 a〕記載の化合物またはその塩、

〔 1 2 c〕了ゴニストである上記〔 1 2 b〕記載の化合物またはその塩 [ 1 2 d ) アンタゴニストである上記〔 1 2 b〕記載の化合物またはその塩、

〔 1 2 e〕配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩とタクリン化合物との結合を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬、

〔 1 2 f 〕上記〔 1 2 c〕記載の化合物またはその塩を含有してなる癌の予防，治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または（および）癌細胞の増殖抑制剤、

〔 1 2 g〕上記〔 1 2 d〕記載の化合物またはその塩を含有してなる心疾患の予防 · 治療剤または（および）心筋細胞のアポトーシスの予肪 · 治療剤、

〔 1 3〕タクリン化合物を含有してなる癌の予防 · 治療剤、癌細胞のァポトーシス促進剤または（および）癌細胞の増殖抑制剤、

〔 1 4〕タクリン化合物の活性を促進することを特徴とする癌の予防 · 治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法、

〔 1 5〕タクリン化合物の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする癌の予防 · 治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法、〔 1 6〕癌の予防 · 治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤の製造のための、タクリン化合物の使用、

〔 1 7〕タクリン化合物の活性を阻害することを特徴とする心疾患の予防 · 治療法または（および）心筋細胞のアポトーシスの予防 ' 治療法などを提供する。

以下、「配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしぐは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分べプチドもしくはその塩」を「本発明の受容体」または「本発明の蛋白質」と略記する場合がある。

さらに、本発明は、

( i ) 標識した GTP _y Sの存在下、タクリン化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分への GTP y S結合促進活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ニング方法、

( i i ) 細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を本.発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内 cAMPの産生抑制活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリー二ング方法、

( i i i )細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を、 CRE- レポーター遺伝子べクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、 CRE-レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポ一ター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ニング方法、 ( i v) タクリン化合物を、 SRE-レポーター遺伝子べクタ一を導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、 SRE -レポーター遺伝子べクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、

( V) タクリン化合物を、標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、

( v i )タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することを特徴とする、タク J、ン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、

( vi i ) 標識したィノシトールの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、

( v i i i ) タクリン化合物を、 TRE-レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、 TRE-レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、

( i x)タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の.受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、

( X ) 標識したルビジウムの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、標識したルビジウムの流出活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、 ( x i )タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外の P H変化を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ユング方法、

( x i i ) ヒスチジン合成遺伝子を導入した本発明の受容体発現酵母を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一二ング方法、

( x i i i )タクリン化合物を、本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリカッメガエル卵母細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリカッメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法なども提供する。 '

タクリン化合物（例、化合物（I) ) 、タクリン化合物の活性を促進する化合物またはその塩、本発明の受容体（例、 GPR30など）とタクリン化合物との結合を促進する化合物またはその塩などは、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膝癌、膝内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膝内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防 · 治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。

タクリン化合物の活性を阻害する化合物またはその塩などは、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）の予防 ·治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防 · 治療剤などとして有用である。

また、本発明の受容体（例、 GPR30など）およびタクリン化合物は、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、腌癌、鸱内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、.精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、腌内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防 · 治療作用、癌細胞のアポトーシス促進作用、癌細胞の増殖抑制作用、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など ) の予防 · 治療作用、心筋細胞のアポトーシスの予防 · 治療作用を有する化合物またはその塩のスクリ一二ングに有用である。図面の簡単な説明

図 1は、タクリンに対するヒト GPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、口はタクリン 67〃Μ、 Δはタクリン 20 Μ、〇はタクリン 6. 7 /z M、画はタクリン 2 Μ、·はタクリン 0. 67 Μの場合をそれぞれ表す。図 2は、タクリンに対するラット GPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、口はタクリン 67 Μ、Δはタクリン 20 μ Μ、〇はタクリン 6. 7 Μ、園はタクリン 2 /ζ Μ、·はタクリン 0. 67 // Μの場合をそれぞれ表す。図 3は、タク J、ンに対する GPR30を発現させなレ、 CH0細胞株の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、口はタクリン 67 / M、△はタクリン 20 M、〇はタクリン 6. 7 /z M、國はタクリン 2 z M、會はタクリン 0. 67 μ Μの場合をそれぞれ表す。

図 4は、種々の濃度のタクリンに対するヒト GPR30細胞、ラッド GPR30 細胞、 GPR30を発現させない CH0細胞株の FLIPRにおける蛍光強度の最高値を表す。図中、〇はヒト GPR30細胞、口はラット GPR30細胞、 △は GPR30 を発現させない CH0細胞株をそれぞれ表す。

図 5は、種々の濃度のタクリンに対するヒト GPR30を発現する HeLa細胞および GPR30を発現させない HeLa細胞のルシフェラーゼ活性を表す。図中、國はヒト GPR30を発現する HeLa細胞、口は GPR30を発現させない HeLa細胞のルシフェラーゼ活性の相対値をそれぞれ表す。発明を実施するための最良の形態

配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒトゃ温血動物（例えば、モルモット、. ラット、マウス、 -ヮトリ、ゥサギ、ブタ、ヒッジ、ゥシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膝臓 i3細胞、骨髄細胞、メサンギゥム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、 T細胞、 B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位 (例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、脖臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養糸田月包（ί列、 MEL, Ml , CTLL-2, HT— 2， WEHI— 3, HL-60, J0SK—1 , K562, ML- 1 , MOLT - 3， MOLT - 4， MOLT - 10, CCRF-CEM, TALL - 1 , Jurkat , CCRT-HSB-2 , KE-37, SKW-3, HUT - 78， HUT - 102, H9, U937, THP - 1， HEL, JK- 1 , CMK, KO-812 , MEG-01など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよレヽ。

配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するァミノ酸配列などがあげられる。

アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST ( Nat i onal し enter for B iotechnology Informat ion Bas i c Local Al i gnment Search Too l) を用い、以下の条件（期待値二 10；ギャップを許す；マトリクス = BL0SUM62 ；フィルタリング = 0FF) にて計算することができる。配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。配列番号： 1で表わされるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列としては、例えば、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列、配列番号： 3 で表わされるァミノ酸配列、配列番号： 4で表されるァミノ酸配列などが挙げられる。

実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約 0. 0 1〜 1 0 0倍、好ましくは約 0. 5〜 2 0倍、より好ましくは約 0. 5〜 2倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよレ、。

リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法ゃスクリ一二ング方法に従って測定することができる。

また、本発明の受容体としては、（i) 配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（例えば 1〜 1 0 0個程度、好ましくは 1〜 5 0個程度、好ましくは 1〜 3 0個程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数個（ 1〜 5個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii) 配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表ざれるアミノ酸配列に 1または 2個以上（例えば 1〜 1 0 0個程度、好ましくは 1〜 5 0個程度、好ましくは 1〜 3 0個程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数個（ 1〜 5個））のァミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii) 配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（例えば 1〜 1 0 0個程度、好ましくは 1〜 5 0個程度、好ましくは 1〜 3 0 個程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数個（ 1〜 5個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（iv) 配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上（例えば 1〜 1 0 0個程度、好ましくは 1〜 5 0個程度、好ましくは 1〜 3 0個程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数個（ 1〜 5個））のアミノ酸が挿入されたァミノ酸配列、または（V ) それらを組み合わせたァミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。

本発明の受容体の具体例としては、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ヒト GPR30) 、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ラット GPR30) 、配列番号： 3で表されるァミノ酸配列を含有する蛋白質（マウス GPR30) 、配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ヒト GPR30) などが挙げられる。

本発明の受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであってもよく、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であつて、実質的に同質のリガンド結合活性などを有するものなどが用いられる。

配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydroph i l i c) 部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophob i c ) 部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメィンを個別に含むぺプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に-含む部分のペプチドでもよレ、。

本発明の部分べプチドのアミノ酸の数は、本発明の蛋白質の構成ァミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、好ましくは 5 0個以上、より好ましくは 1 0 0個以上のァミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましレ、。ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。

また、本発明の部分べプチドは、（i ) 上記ァミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは、 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数個（ 1〜 5個））のアミノ酸が欠失し、（i i ) 上記アミノ酸配列に 1または 2個以上（好ましくは、 1〜 2 0個程度、より好ましくは 1〜 1 0個程度、さらに好ましくは数個（ 1〜 5個））のアミノ酸が付加し、または（iii ) 上記ァミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは、 1〜 1 0個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは 1〜 5個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよレ、。

具体例としては、配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列の第 5 9〜 1 0 2番目、第 1 6 7 〜 1 9 8番目、第 2 0 3〜 2 2 4番目または第 3 1 5〜 3 3 8番目のァミノ酸配列を含む部分ぺプチドなどが用いられる。

本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端（ァミノ末端）、右端が C末端（カルボキシル末端）である。 C末端はカルボキシ（- C00H) 、カルボキシレート（-C00— ) 、アミド（- C0NH₂) またはエステル（-C00R) であってもよレヽ。

ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n _ プロピル、イソプロピルもしくは n —ブチルなどの C Hアルキル、例えば、シクロペンチノレ、シクロへキシノレなどの C₃_₈シクロアルキノレ、例えば、フエニル、 α—ナフチルなどの C₆_₁₂ァリール、例えば、ベンジル、フエネチノレなどのフエニル一 C アルキルもしくは α—ナブチノレメチ.ルなどの ά—ナフチル一 C t_₂アルキルなどの C₇„₁₄ァラルキルのほ力経口用エステルとして汎用されるビバロイルォキシメチルなどが用いられる。本発明の受容体および本発明の部分べプチドが C末端以外にカルボキシ（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシがアミド化またはエステル化されているものも本発明の受容体および本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。

さらに、本発明の受容体および本発明の部分ペプチドには、 N末端のアミノ酸残基（例、メチォニン残基）のァミノ基が保護基（例えば、ホノレミノレ、ァセチルなどの C ,_₆アルカノィルなどの C _1-6ァシルなど）で保護されているもの、生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のァミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、 - 0H、 - SH、アミノ基、イミダゾール基、インド一ル基、グァニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル、ァセチルなどの C ^アルカノィルなどの Cい ₆ァシルなど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。本発明の受容体または本発明の部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。

タクリン化合物としては、本発明の受容体と特異的に結合するタクリンまたはその関連化合物であればよく、例えば、本発明の受容体との結合の解離定数が 1 0 M以下、好ましくは 2 μ M以下、さらに好ましく η ΐ μ Μ以下、特に好ましくは 2 0 ◦ η Μ以下、最も好ましくは 1 0 0 η Μ以下である化合物などが挙げられる。

タクリン化合物としては、例えば化合物（I ) などが挙げられる。式（I ) 中、環 Αで示される「置換基を有していてもよいベンゼン環」の「置換基」としては、例えば、ハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、 C ,-₃アルキレンジォキシ（例、メチレンジォキシ、エチレンジォキシなど）、ニトロ、シァノ、ハロゲン化されていてもよレヽ C卜 ₆ァノレキノレ、ノヽロゲン化されてレ、てもよレ、 C ₂-₆アルケニル、カルボキシ C ₂_₆アルケニル（例、 2—カルボキシエテュノレ、 2—力ノレボキシ一 2 —メチルェテニルなど）、ハロゲン化されていてもよい C ₂_₆アルキニノレ、ハロゲン化されていてもよく、縮合していてもよい C ₃_₈シクロアルキル、 C ₆-₁₄7リール（例、フエニル、 1 一ナフチル、 2 _ナフチル、 2 —ビフエ二リル、 3 —ビフエニリノレ、 4 —ビフエ二リル、 2 —アンスリノレなど）、ハロゲン化されていてもよい Cい ₈アルコキシ、 C ,-₆アルコキシ一カルボニル一 C ,— ₆ァノレコキシ（例、エトキシカルボ-ルメチルォキシなど）、 C ₃- ₈シクロアルキル一ォキシ（例、シクロプロピルォキシ、シクロペンチノレオキシ、シクロへキシノレォキシなど）、ヒドロキシ、 C ₆-₁₄ァリールォキシ（例、フエニルォキシ、 1 —ナフチルォキシ、 2—ナフチルォキシなど）、 C ₇-₁₆7ラルキルォキシ（例、ベンジルォキシ、フエネチルォキシなど）、メルカプト、ハロゲン化されていてもよい Cい ₆ アルキルチオ、 C _{6- 14}ァリ一ルチオ（例、フエ二ルチオ、 1 一ナフチルチォ、 2 —ナフチルチオなど）、 C ₇— ₁₆ァラルキルチオ（例、ベンジルチオ、フエネチルチオなど）、ァミノ、ヒドロキシァミノ、モノ一 C Hアルキルアミノ（例、メチルァミノ、ェチルァミノなど）、モノ _ c ₆— ₁₄ァリールァミノ（例、フエニルァミノ、 1 —ナフチルァミノ、 2 _ナフチルァミノなど）、ジ一 Cい ₆アルキルアミノ（例、ジメチルァミノ、ジェチノレアミノ、ェチルメチルァミノなど）、ジ一〇₆—₁₄ァリールァミノ（例、ジフエニノレアミノなど）、ニトロ、二トリノレ、ホノレミノレ、カルボキシ、 C wアルキル一カルボ-ノレ（例、ァセチノレ、プロピオニルなど）、 C _3-

₈シクロアノレキノレ一カノレボニノレ（例、シクロプロピル力ノレ'ボニル、シク口ペンチルカルボニル、シクロへキシルカノレボニルなど）、 C i-₆アル.コキシ一カノレボニノレ（例、メトキシカノレポ二ノレ、エトキシカルボ二ノレ、プ口ポキシカノレポ-ノレ、 t ert-ブトキシカルボニルなど）、 C ₆_₁₄7 リーノレ —カルボニル（例、ベンゾィル、 1 _ナフトイル、 2—ナフトイノレなど ) 、 C ₇_₁₆ァラノレキノレーカノレボニノレ（例、フエニノレアセチノレ、 3 —フエ二ルプロピオニルなど）、 C _{6- 14}ァリールォキシ一カルボニル（例、フエノキシカルボニルなど）、〇 ₇-₁₆ァラルキルォキシ一カルボニル（例、ベンジルォキシカルボニル、フエネチルォキシカルボニルなど）、 5または 6員複素環カルボニル（例、ニコチノィル、イソニコチノィル、テノィノレ、フロイノレ、モルホリノカルボニル、チォモノレホリノカノレボニノレ、ピペラジン一 1 ーィルカルボ-ル、ピロリジン一 1 —ィルカルボニルなど ) 、力ルバモイノレ、モノ一 C _{1 -6}ァノレキノレ一カノレバモイノレ（例、メチノレ力ノレバモイル、ェチノレカノレバモイノレなど）、ジ一 C _{1 -6}アルキル一力ルバモィル（例、ジメチノレ力ルバモイノレ、ジェチルカルバモイル、ェチルメチノレ力ルバモイルなど）、〇_{6- 14}ァリール一力ルバモイル（例、フエ二ノレ力ノレバモイノレ、 1 _ナフチノレカルバモイノレ、 2 —ナフチルカルバモイノレなど）、 C Hアルコキシ一力ルバモイル（例、メトキシカルバモイル、ェトキシカルバモイルなど）、 5または 6員複素環力ルバモイル（例、 2 一ピリジルカルバモイル、 3—ピリジルカルバモイル、 4 —ピリジルカノレバモイル、 2 —チェ二ルカルバモイノレ、 3 —チェ二ルカルバモイルなど）、スルホ、 C アルキルスルホ二ノレ（例、メチノレスノレホニノレ、ェチノレスルホニルなど）、〇₆_₁₄ァリールスルホニノレ（例、フエニノレスルホニ

8 ■

ノレ、 1 —ナフチノレスノレホニノレ、 2 _ナフチノレスノレホニノレなど）、ホ /レミノレアミノ、 C wアルキル一カルボニルァミノ（例、ァセチルァミノなど

) 、。_{6- 14}ァリール一カルボニルァミノ（例、ベンゾィルァミノ、ナフトィルァミノなど）、 C Hアルコキシ一カルボニルァミノ（例、メトキシカノレボニノレアミノ、エトキシカノレボニノレアミノ、プロポキシカノレボニノレァミノ、ブトキシカルボ-ルァミノなど）、 C !— ₆アルキルスルホニルァミノ（例、メチルスルホニルァミノ、ェチルスルホ -ルァミノなど）、〇₆_₁₄ァリールスルホニルァミノ .（例、フエニルスノレホニノレアミノ、 2.— ナフチルスルホニノレアミノ、 1 一ナフチノレスルホニルァミノなど）、 C ,_₆アルキノレ一カルボニルォキシ（例、ァセトキシ、プロピオニノレオキシなど）、. C ₆_₁₄7 リール一カルボニルォキシ（例、ベンゾィルォキシ、ナフチルカノレボニルォキシなど）、 C Hアルコキシ一カルボニルォキシ（例、メトキシカノレポニノレオキシ、エトキシカノレボニノレオキシ、プロポキシカノレポニルォキシ、ブトキシカルボニルォキシなど）、モノー C ^ァノレキノレー力ルバモイルォキシ（例、メチルカルバモイノレォキシ、ェチル力ルバモイルォキシなど）ジー C ,-₆アルキル—力ルバモイルォキシ（例、ジメチノレカルバモイノレォキシ、ジェチルカルバモイルォキシなど）、 C ₆— ₁₄ァリーノレ一カノレバモイノレォキシ（例、フエ二ノレカ^^バモイノレォキシ、ナフチルカルバモイルォキシなど）、 5または 6員複素環カルボ-ルォキシ（例、ニコチノィルォキシ、イソニコチノィルォキシなど）、 5 ないし 7員飽和環状アミノ（例、ピロリジン一 1 一ィル、ピペリジノ、ピぺラジン一 1 一ィル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロアゼピン一 1 一ィル、ホモピぺラジン一 1 —ィルなど）、 5ないし 1 0員芳香族複素環基（例、 2 —チェニル、 3 —チェニル、 2 —フリル、 3 — フリノレ、 2 —ピリジル、 3 —ピリジル、 4 一ピリジル、 2 —キノリノレ、 3—キノリル、 4 —キノリル、 5 —キノリル、 8—キノリノレ、 1 —イソキノリル、 3—イソキノリノレ、 4 _イソキノリノレ、 5 _イソキノリル、 1 —インドリノレ、 2 —インドリノレ、 3 —インドリル、 2 —ベンゾチアゾリノレ、 2 —べンゾ〔b〕チェ二ノレ、 3 —ベンゾ〔 b〕チェ二ノレ、 2 —ベンゾ〔b〕フラニル、 3 —べンゾ〔b〕フラニルなど）、 3なレ、し 1 0 員非芳香族複素環基（例、 1 —ァゼチジニル、 2—ァゼチジニル、 3— ァゼチジニル、 1 —ピロリジニル、 2 —ピロリジニル、 3 —ピロリジニノレ、 2 —イミダゾリニル、 4 _イミダゾリニル、 2—ビラゾリジニル、 3—ビラゾリジニル、 4 一ビラゾリジニル、 2 —ピペリジル、 3 —ピぺリジノレ、 4 —ピペリジノレ、 1 —ピペラジニノレ、 2 —ピペラジニノレ、モノレホリノ、チオモルホリノ、 2 —ォキシラニル、 2 —ォキセタニル、 3 — ォキセタニル、 2 —テトラヒドロフラニル、 4 —テトラヒドロビラニルなど）、ォキソなどが挙げられる。

環 Aは、例えば上記置換基を、置換可能な位置に 1ないし 4個、好ましくは 1.ないし 2個有していてもよく、置換基数が 2個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。

前記「ハロゲン化されていてもよい C ,— ₆アルキル」としては、例えば

1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいアルキル（例、メチル、ェチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチノレ、 sec-ブチノレ、 tert-ブチノレ、ペンチノレ、へキシルなどの C _{1 -6}ァノレキルなど）などが挙げられる。具体例としては、メチル、クロロメチル、ジフルォロメチル、トリクロロメチノレ、トリフノレオロメチノレ、ェチノレ、 2—ブロモェチノレ、 2 , 2 , 2— トリフノレオロェチノレ、ペンタフノレォロェチノレ、プロピノレ、 3 , 3 ， 3 — トリフルォロプロピノレ、イソプロピノレ、ブチル、 4 , 4 , 4— トリフノレオロブチノレ、イソブチノレ、 sec—ブチノレ、 tert-ブチノレ、ペンチル、イソペンチノレ、ネオペンチノレ、 5 ， 5 , 5— トリフルォロペンチノレ、へキシノレ、 6 , 6 , 6— トリフ /レオ口へキシノレなどが挙げられる。前記「ハロゲン化されていてもよい C _2-6アルケニル」としては、例えば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハ口ゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよい C ₂_₆アルケニル（例、ビ二ノレ、プロぺニノレ、イソプロぺニノレ、 2—ブテン一 1ーィノレ、 4 —ペンテン一 1 _ィル、 5 —へキセン一 1 —ィルなど）などが挙げられる。前記「ハロゲン化されていてもよい C ₂-₆アルキニル」としては、例えば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハ口ゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよい C ₂_₆アルキニル（例、プロノヽ⁰ノレギル、 2—ブチン一 1 —ィノレ、 4 —ペンチン一 1 —ィノレ、 5—へキシン一 1 —ィルなど）などが挙げられる。

前記「ハロゲン化されていてもよく、縮合していてもよい C ₃_₈シクロアルキル」の「ノヽロゲン化されていてもよい C ₃_₈シクロア'ルキノレ」としては、例えば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子■ ( 例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいじ₃_₆シクロァノレキノレ（例、シクロプロピノレ、シクロプチノレ、シクロペンチノレ、シク口へキシルなど）などが挙げられる。具体例としては、シクロプロピル、シクロブチノレ、シクロペンチノレ、シクロへキシノレ、 4， 4—ジクロロシクロへキシル、 2 , 2 , 3 , 3—テトラフノレォロシクロペンチノレ、 4— クロロシクロへキシルなどが挙げられる。

前記「ハロゲン化されていてもよく、縮合していてもよい C ₃-₈シクロアルキル」の「縮合した〇_3-8シクロアルキル」としては、例えば、 8ないし 1 4員の二環または三環性 C ₃-₈シクロアルキル（例、 1ーァダマンチノレ、 2 —ァダマンチノレ、デカリン一 1 —ィル、テトラリン一 1 —ィノレ、 9 — フノレオレニノレ、 1 —インダニノレ、 1， 2 , 3， 4 —テトラヒドロ一 1 —ナフチルなど）などが挙げられる。また、該「縮合した C ₃__sシクロアルキル」は、ハロゲン化されていてもよレ、。

前記「ハロゲン化されていてもよいアルコキシ」としては、例えば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハ口ゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよい C _{1 -8}アルコキシ（例、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、 s ec-ブトキシ、ペンチノレオキシ、へキシノレォキシなど）などが挙げられる。具体例としては、例えばメトキシ、ジフルォロメトキシ、トリフルォロメトキシ、エトキシ、 2 , 2， 2— トリフルォロェトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、 4， 4， 4— トリフルォロブトキシ、イソブトキシ、 s ec-ブトキシ、ペンチルォキシ、へキシノレォキシなどが挙げられる。

前記「ハロゲン化されていてもよい C卜₆アルキルチオ」としては、例えば 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個のハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）を有していてもよいアルキルチオ（例、メチノレチォ、ェチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、 s ec-ブチルチオ、 t ert-ブチルチオなど）などが挙げられる。具体例としては、メチルチオ、ジフルォロメチルチオ、トリフルォロメチノレチォ、ェチノレチォ、プロピゾレチォ、イソプロピノレチォ、ブチノレチォ、 4 , 4 , 4— トリフノレオロブチノレチォ、ペンチノレチォ、へキシノレチォなどが挙げられる。

R ¹で示される「置換基を有していてもよいァミノ」の「置換基」としては、例えば、置換基を有していてもよい炭化水素基、置換基を有していてもよい複素環基、ァシルなどが挙げられる。上記「ァミノ」は「置換基」を 1または 2個有していてもよレ、。

上記「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「炭化水素基」としては、例えば、鎖状または環状炭化水素基（例、アルキル、ァルケ-ル、ァノレキニノレ、シクロアルキル、シクロアノレケニノレ、ァリーノレ、ァラノレキル、多環式炭化水素基など）などが挙げられる。このうち、炭素数 1ないし 1 9個の鎖状または環状炭化水素基などが好ましい。上記「アルキル」としては、例えば C i-₆アルキル（例、メチル、ェチノレ、プロピノレ、イソプロピノレ、ブチノレ、イソブチノレ、 s ec—ブチノレ、 tert— ブチル、ペンチル、ネオペンチル、へキシルなど）などが挙げられる。上記「ァルケニル」としては、例えば C ₂_₆アルケニル（例、ビニル、ァリノレ、イソプロぺニル、 1 —ブテニノレ、 2—ブテニル、 3 —ブテニノレ、 2—メチノレ一 2—プロぺニノレ、 1 —メチノレ一 2—プロぺニノレ、 2—メチル一 1 一プロぺニルなど）などが挙げられる。

上記「アルキ -ル」としては、例えば C _2-6アルキニル（例、ェチニノレ、プロパノレギノレ、 1 —ブチニノレ、 2 _ブチニノレ、 3 _ブチニノレ、 1 一へキシニルなど）などが挙げられる。

上記「シクロアルキル」としては、例えば C ₃_₆シクロアルキル（例、シクロプロピノレ、シクロプチノレ、シクロペンチノレ、シクロへキシノレなど

) などが挙げられる。

上記「シクロアルケニル」としては、例えば C ₅— ₆シクロアルケニル（例、 1 —シクロペンテ二ノレ、 3 —シクロペンテ二ノレ、 4—シクロペンテ二ノレ、 1 —シクロへキセニノレ、 3 —シクロへキセ-ノレ、 4 —シクロへキセニルなど）などが挙げられる。

上記「ァリール」としては、例えば C ₆_₁₄7リール（例、フエニル、 1 —ナフチル、 2 _ナフチル、 2—ビフエニリノレ、 3 —ビフエニリノレ、 4 —ビフエ二リル、 2 —アンスリル、 3 —インデニルなど）などが挙げられる。

上記「ァラルキル」としては、例えば C ₇__{1 9}ァラルキル（例、ベンジノレ、フエネチノレ、ジフエニノレメチノレ、トリチノレ、 1 一ナフチノレメチノレ、 2 —ナフチノレメチル、 2， 2 —ジフエニノレエチノレ、 3 —フエニルプロピノレ、 4 —フエニノレブチノレ、 5 —フエ二ノレペンチノレ、 9 —フノレオレニノレなど）などが挙げられる。

上記「多環式炭化水素基」としては、例えば 2ないし 4環性非芳香族炭化水素基（例、 1 —ァダマンチル、 2—ァダマンチル、デカリン一 1 —ィノレ、テトラリン一 1 _ィル、インダン一 1 —ィノレ、アンドロスタン一 3—ィル、 5 —アンドロステン一 3—ィルなど）などが挙げられる。上記「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、例えば、前記環 Aで示される「置換基を有していてもよいベンゼン環」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。「炭化水素基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に 1 ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、置換基数が 2個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよレ、。

上記「置換基を有していてもよい複素環基」の「複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、 1ないし 4個のへテロ原子を含む 5ないし 1 4員（単環、 2環または 3環式）複素環、好ましくは（i ) 5ないし 1 4員（好ましくは 5ないし 1 0員）芳香族複素環、（i i ) 3ないし 1 4員非芳香族 +複素環または（i i i ) 7ないし 1 0員複素架橋環から任意の 1個の水素原子を除いてできる 1価基などが挙げられる。

上記「 5ないし 1 4員（好ましくは 5ないし 1 0員）の芳香族複素環」としては、例えば、チォフェン、ベンゾ〔 b〕チォフェン、ベンゾ〔 b ] フラン、ベンズイミダゾーノレ、ベンズォキサゾーノレ、ベンゾチア.ゾール、ベンズイソチアゾール、 1 H—べンゾトリアゾール、ナフト〔 2 ， 3— b〕チォフェン、フラン、ピロ一ノレ、イミダゾーノレ、ピラゾーノレ、ォキサゾール、 1 , 2 ， 3— トリァゾール、 1 , 2 , 4— トリァゾーノレ、テトラゾール、 1 , 3 , 4—チアジアゾール、 1 , 3 , 4—ォキサジァゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドーノレ、 1 H—インダゾール、プリン、 4 H—キノリジン、ィソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、力バゾ一ノレ、 β —力ルポリン、フエナントリジン、ァクリジン、フエナジン、チアゾール、イソチアゾール、フエノチアジン、イソォキサゾール、フラザン、フエノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が 1ないし複数個（好ましくは 1または 2個）の芳香環（例、ベンゼン環、ピリジン環、イミダゾール環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。

上記「3ないし 1 4員非芳香族複素環」としては、例えば、ォキシラン、ォキセタン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、ピラン、ジォキソラン、ジォキサン、ァゼチジン、ピロリジン、イミダゾリン、ビラゾリジン、ピラゾリン、ピぺリジン、ピぺラジン、モルホリン、チォモルホリン、チアゾリジン、ォキサゾリジン、ォキサジァゾリン、チアジァゾリン、トリァゾリン、 1 , 4—ジァゼパン、 1 , 4—ォキサゼパン、 1 , 4 一チアゼパン、および上記芳香族複素環の還元体または部分還元体（例、 1 , 2 , 3 , 4—テトラヒドロキノリン、 1 , 2 , 3 , 4—テトラヒドロイソキノリン、インドリンなど）などが挙げられる。

上記「 7ないし 1 0員複素架橋環」としては、例えば、キヌクリジン、 7 —ァザビシクロ〔 2 . 2 . 1〕ヘプタンなどが挙げられる。

該「複素環基」として好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、好ましくは、 1ないし 4 個のへテロ原子を含む 5ないし 1 4員（好ましくは 5ないし 1 0員）の (単環または 2環式）複素環基である。具体的には、例えば 2—チェ二ノレ、 3 —チェニル、 2 —フリノレ、 3 —フリノレ、 2 —ピリジル、 3 —ピリジル、 4 一ピリジル、 2 —キノリノレ、 3—キノリノレ、 4—キノリノレ、 5 —キノリル、 8 —キノリル、 1 一イソキノリル、 3 _イソキノリル、 4 一イソキノリル、 5—イソキノリル、ピラジニル、 2 —ピリミジニル、 4 —ピリミジ -ル、 1 一ピロリノレ、 3—ピロリル、 1 一イミダゾリノレ、 2 _イミダゾリル、 3 —ピリダジニル、 2 _チアゾリル、 2—ォキサゾリル、 3 —イソチアゾリル、 3 —イソォキサゾリル、 1 —インドリル、 2 —インドリノレ、 3 —インドリノレ、 2 —ベンゾチアゾリル、 2 —ベンゾ〔 b〕チェニル、 3—ベンゾ〔 b〕チェニル、 2 _ベンゾ〔b〕フラニル、 3—ベンゾ〔b〕フラニルなどの芳香族複素環基、例えば 1 一ピロリジニル、 2 —ピロリジニル、 3 —ピロリジニル、 2 _イミダゾリニル、 4 —イミダゾリニル、 2—ビラゾリジニル、 3—ビラゾリジニル、 4 _ ビラゾリジニル、ピペリジノ、 2 —ピペリジル、 3 —ピペリジル、 4 _ ピペリジル、 1 —ピぺラジュル、 2—ピペラジニル、モルホリノ、チォモルホリノなどの非芳香族複素環基などである。

上記'「置換基を有していてもよい複素環基」の「置換基」としては、例えば、前記環 Aで示される「置換基を有していてもよいベンゼン環」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。「複素環基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3 個有していてもよく、置換基数が 2個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよレ、。

上記「ァシル」としては、例えば、式一（C =〇）一〇R⁴、 - (C = O)— R ⁵、 _ (C = 0)_ NR ⁵R⁶、一（C = S)— NR ⁵R⁶、 _ S O_ R⁴、 - S 0₂- R ⁴ または一 S 0₂— NR⁵ R⁶ 〔式中、 R⁴は置換基を有していてもよい炭化水素基、または置換基を有していてもよい複素環基； R ⁵は水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基、または置換基を有していてもよい複素環基； R ⁶は水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基または置換基を有していてもよい複素環基を示し、 NR ⁵R⁶は環状アミノであってもよレ、〕で表される基などが挙げられる

R⁴、 R ⁵または R⁶で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」としては、上記 R ¹で示される「置換基を有していてもよいアミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい炭化水素基」などが挙げられる。

R⁴、 R ⁵または R⁶で示される「置換基を有していてもよい複素環基」としては、上記 R ¹で示される「置換基を有していてもよいァミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい複素環基」などが挙げられる。

NR ⁵R ⁶で示される「環状ァミノ」としては、例えば、 1個の窒素原子と炭素原子以外に、窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、 1ないし 4個のへテロ原子を含んでいてもよい 5ないし 7員飽和環状ァミノが挙げられ、具体例としては、ピロリジン一 1 ーィノレ、ピペリジノ、ピぺラジン一 1 ーィノレ、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロアゼピン一 1一ィル、ホモピぺラジン一 1 ーィルなどが挙げられる。

R ²または R³で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」としては、上記 R ¹で示される「置換基を有していてもよいァミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい炭化水素基」などが挙げられる。

R ²または R ³で示される「置換基を有していてもよい複素環基」としては、上記 R ¹で示される「置換基を有していてもよいァミノ」の「置換基」として例示された「置換基を有していてもよい複素環基」などが挙げられる。

R ²または R³で示される「ァシル」として'は、例えば、上記式一（C =0)— OR⁴、一（C = 0)— R ⁵、一（C = O)— N R ⁵ R ⁶、一（C= S) _NR ⁵R⁶、一 S O— R⁴、 - S 0₂- R ⁴ または _ S 0₂— NR⁵ R⁶ 〔式中の各記号は上記と同意義を示す〕で表される基などが挙げられる。 R ²および R³が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に形成する「瘇換基を有していてもよい 3ないし 1 0員同素または複素環」の「 3.ないし 1 0員同素環」としては、例えば、 3ないし 1 0員不飽和炭化水素、 3ないし 1 0員飽和炭化水素などが挙げられる。

「 3ないし 1 0員不飽和炭化水素」としては、例えば C^。シクロアルカン（例、シクロプロ/くン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロへキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、シクロノナン、シクロデカンなど）、 C ₅_₇シクロアルケン（例、シクロペンテン、シクロペンタジェン、シクロへキセン、 1 , 3—シクロへキサジェン、 1， 4ーシクロへキサジェン、シクロヘプテン、 1 , 3—シクロへブタジエンなど）などが挙げられる。

「 3ないし 1 0員飽和炭化水素」としては、例えばベンゼン、ナフタレンなどが挙げられる。

R²および R ³が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に形成する「置換基を有していてもよい 3ないし 1 0員同素または複素環」の「 3ないし 1 0員複素環」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、 1ないし 4個のへテ口原子を含む 5ないし 1 0員（単環または 2環式）複素環、好ましくは（i ) 5ないし 1 0員芳香族複素環、（i i ) 3ないし 1 0員非芳香族複素環または（i i i ) 7ないし 1 0員複素架橋環などが挙げられる。

上記「 5ないし 1 0員芳香族複素環」としては、例えば、チォフェン、ベンゾ〔b〕チォフェン、ベンゾ〔 b〕フラン、ベンズイミダゾーノレ、ベンズォキサゾーノレ、ベンゾチアゾーノレ、ベンズイソチアゾーノレ、ナフト〔 2， 3 - b ] チォフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ビラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、 1 H—ィンダゾール、プリン、 4 H—キノリジン、ィソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カノレバゾーノレ、 ]3—カノレボリン、フエナントリジン、ァクリジン、フエナジン、チアゾール、イソチアゾール、ォキサゾール、 1， 2， 3— トリァゾール、 1 , 2 , 4 — トリ Tゾール、テトラゾール、 1， 3， 4—チアジアゾール、 1 , 3 , 4—ォキサジァゾ一ノレ、 1' H—ベンゾトリァゾール、フエノチアジン、イソォキサゾール、フラザン、フヱノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が 1ないし複数個（好ましくは 1または 2個）の芳香環 (例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。

上記「 3ないし 1 0員非芳香族複素環」としては、例えば、ォキシラン、ォキセタン、テトラヒドロフラン、ジヒドロフラン、ピラン、ジォキソラン、ジォキサン、ァゼチジン、ピロリジン、イミダゾリン、ビラゾリジン、ピラゾリン、ピぺリジン、ピぺラジン、モルホリン、チォモルホリン、チアゾリジン、ォキサゾリジン、ォキサジァゾリン、チアジァゾリン、トリァゾリン、 1 , 4 一ジァゼパン、 1 , 4—ォキサゼパン、 1 , 4 一チアゼパン、および上記芳香族複素環の還元体または部分還元体（例、 1 , 2 , 3 , 4 —テトラヒドロキノリン、 1， 2， 3， 4ーテトラヒドロイソキノリン、インドリンなど）などが挙げられる。

上記「 7ないし 1 0員複素架橋環」としては、例えば、キヌタリジン、 7—ァザビシクロ〔 2 . 2 . 1〕ヘプタンなどが挙げられる。

上記「複素環」として好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1または 2種、好ましくは、 1ないし 4 個のへテロ原子を含む 5ないし 1 0員（単環または 2環式）複素環などである。さらに好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる 1 ないし 3個のへテロ原子を含む 5または 6員複素環（例、チォフエン、フラン、ピロール、ィミダゾール、ビラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジンなど）などが挙げられる。

R ²および R ³が、互いに結合して隣接する炭素原子と共に形成する「置換基を有していてもよい 3ないし 1 0員同素または複素環」の「置換基」としては、前記環 Aで示される「置換基を有していてもよいべンゼン環」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。「 3ないし 1 0員同素または複素環」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に 1ないし 5個、好ましくは 1ないし 3個有していてもよく、置換'基数が 2個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。

環 Aは、無置換ベンゼン環が好ましい。

R ¹は、ァミノが好ましい。

R ²および R ³は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、 C ₅_₇シクロアルケン（好ましくは、シクロへキセンなど）を形成するのが好ましレ、。

化合物（I) の好ましい具体例としては、タクリンなどが挙げられる。式（I ) で表される化合物の塩としては、例えば金属塩、アンモニゥム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシゥム塩、バリゥム塩などのアル力リ土類金属塩；アルミニゥム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチノレアミン、トリェチルァミン、ピリジン、ピコリン、 2 , 6 —ルチジン、エタノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン、シク口へキシノレアミン、ジシクロへキシノレアミン、 N , Ν '—ジペンジノレエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コノヽク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスノレホン酸、 ρ— トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オル二チンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばァスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。

このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，力リウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモユウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、 ρ — トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。

標識された化合物（I) も、タクリン化合物として、本発明のスクリ一ニングに用いることができる。

標識物質としては、放射性同位元素（例、〔¹²⁵Ι〕、〔¹³¹ Ι〕、〔³Η〕、〔"C〕、〔³²P〕、〔³³P〕、〔³⁵S〕など）、蛍光物質〔例、シァニン蛍光色素（例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルォレス力ミン、フルォレツセンィソチオシァネート、 NBD (7-n i trobenz-2-oxa- l， 3 - d iazol)など〕、酵素（例、 /3—ガラクトシダーゼ、；3—グ/レコシダーゼ、ァノレカリフォスファターゼ、パーォキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなど）、ピオチン、ランタニド元素などがあげられる。中でも、放射性同位元素〔³H〕、〔¹⁴C〕、〔¹²⁵1〕が好ましい。

本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、前述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のポリぺプチドの精製方法によって製造することもできるし、ポリペプチドをコードする D N Aで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、ぺプチド合成法に準じて製造することもできる。例えば、 Genomi c s 56巻、 12 - 21頁、 1999年、 B i och im. B i ophys . Acta , 1446巻、 57- 70頁、 1999年などに記載の方法またはこれに準じた方法により、製造することもできる。

ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、ィオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することができる。 "

本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩の合成には.、通常、市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルァミン樹脂、アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシべンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルアミン榭脂、 P A M 樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、ポリアタリルァミド榭脂、 4一 ( 2 ' , 4 ' —ジメトキシフヱ二ルーヒドロキシメチル）フエノキシ樹脂、 4 — ( 2 ，， 4 ' —ジメトキシフエニル一 F m o cアミノエチル）フエノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、ひ一アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリぺプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリぺプチド、受容体、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。

上記した保護ァミノ酸の縮合に関しては、ポリぺプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルポジイミド類がよレ、。カルボジイミド類としては、 D C C、 N , N ' —ジイソプロピルカルボジイミド、 N _ェチル一N ' - ( 3—ジメチルァミノプロリル ) カルポジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、 H O B t , H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護ァミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。

保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリぺプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N , N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリドンなどの酸ァミド類、塩化メチレン，クロ口ホルムなどのハ口ゲン化炭化水素類、トリフルォロェタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスノレホキシド類、ピリジン，ジォキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、ァセトニトリル，プロピオ二トリルなどの二トリル類、酢酸メチル，酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリぺプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約一 2 0 °C〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。活性化されたァミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。 · 原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 B o c 、 t —ペンチノレォキシカルボニル、イソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシべンジノレォキシカノレボニル、 C 1 - Z , B r _ Z、ァダマンチルォキシカ ,レボニノレ、トリフノレオロアセチノレ、フタロイノレ、ホノレミノレ、 2 —二トロフエニノレスノレフエニル、ジフエニルホスフイノチオイノレ、 F m o cなどが用いられる。

カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、ェチノレ、プロピノレ、ブチノレ、 tーブチノレ、シクロペンチノレ、シクロへキシル、シクロへプチル、シクロォクチノレ、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、ァラルキルエステル化 (例えば、ベンジノレエステノレ、 4—ニトロべンジノレエステノレ、 4 —メトキシベンジノレエステル、 4 _クロ口べンジルエステノレ、ベンズヒドリルエステル化）、フエナシルエステルイ匕、ペンジノレオキシカルボニノレヒドラジド化、 t _ブトキシカルボ-ルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。

セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、 .ァセチル基などの低級（C ^) アルカノィル基、ベンゾィル基などのァロィル基、ベンジノレォキシカルボニル基、エトキシカノレボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロビラニル基、 t _ブチル基などである。

チロシンのフ： ϋノール性水酸基の保護基としては、例えば、 Β ζ 1 、 C l ₂— Β ζ 1 、 2—ニト口ベンジル、 B r — Ζ、 t—ブチルなどが用いられる。

ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 T o s 、 4 — メトキシ一 2 , 3 , 6 — トリメチノレベンゼンスノレホニノレ、 D N P、ベンジルォキシメチル、 B u m、 B o c 、 T r t 、 F m o cなどが用いられる。原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタク口ロフエノ—ノレ、 2 , 4， 5 — トリクロ口フエノーノレ、 2 , 4 —ジニトロフエノーノレ、シァノメチルァノレコール、ノラニトロフエノ一ノレ、 H O N B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N—ヒドロキシフタルイミド、 H O B t ) とのエステル〕などが用いられる。原料のァミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。

保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、 P d—黒あるいは P d 一炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルォロメタンスルホン酸、トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジィソプロピルェチルァミン、トリェチルァミン、ピぺリジン、ピぺラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリゥムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約 _ 2 0 °C〜 4 0 °Cの温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、ァニソール、フエノーノレ、チオアニソーノレ、メタクレゾ一ノレ、ノラクレゾ一ル、' ジメチルスルフイド、 1， 4—ブタンジチオール、 1， 2 _エタンジチォーノレなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1 , 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリゥム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。

原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。

本発明の受容体または部分べプチドを得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のひ一カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ぺプチド鎖の N末端のひ _ァミノ基の保護基のみを除いたポリぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリぺプチドとを製造し、この両ポリぺプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすベての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリぺプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の受容体またはその部分べプチドのァミド体を得ることができる。

本発明の受容体または部分べプチドもしくはそれらの塩のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸の —カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しァミノ酸エステルとした後、受容体またはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望の受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。

本発明の受容体または部分べプチドは、自体公知のぺプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なぺプチダーゼで切断することによつて製造することができる。ぺプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。. すなわち、本発明受容体または部分ペプチドを構成し得る部分ぺプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の (i) 〜（V) に記載された方法があげられる。

( i) M. Bodanszky および M. A. 0ndetti、 Peptide Synthesis,

Interscience Publishers, New York (1966年)

( i i) Schroederおよび Luebke、 The Peptide, Academic Press, New York (1965年）

(iii) 泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（1975年） (iv) 矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座 1、タンパク質の化学 IV、 205、（1977年）

(v) 矢島治明監修、続医薬品の開発、第 14巻、ペプチド合成、広川書店また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の受容体または部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる受容体または部分ぺプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、 3公知の方法あるいはそれに準じる方

5

法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

本発明の受容体または部分べプチドをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明の受容体または部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよレ、。このうち D NAが好ましく、該 DNAは、ゲノム DNA、ゲノム DNAライブラリ一、前記した細胞 ·組織由来の c D N A、前記した細胞 · 組織由来の c DNAライブラリー、合成 D N Aのいずれでもよレヽ。

ライブラリーに使用するべクタ一は、バクテリオファージ、プラス.ミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞 ·組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymeraseし hain Reaction (以卜、 RT- PCRfeと略称する）によって増幅することもできる。

本発明の受容体をコードする DNAとしては、例えば配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列を含有する DNA、または配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7 または配列番号： 8で表わされる塩基配列とハイストリンジヱン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードする DN Aなどであれば何れのものでもよレ、。配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列とハイストリンジ工ントな条件下でハイブリダイズできるひ N Aとしては、例えば、配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列と約 7 0 %以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。

ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方、法、 ί列 _ ίま'、 Mol ecular し loni ng 2nd ( j . Sambrook et al . , し o l d Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。

ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリゥム濃度が約 1 9 〜 4 0 m M、好ましくは約 1 9〜 2 0 m Mで、温度が約 5 0〜 7 0 °C、好ましくは約 6 0〜 6 5 °Cの条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約 1 9 m Mで温度が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。

より具体的には、配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする D N Aとしては、配列番号： 5で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが、配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする D N Aとしては、配列番号： 6で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが、配列番号： 3で表わされるァミノ酸配列を含有する受容体をコードする D N Aとしては、配列番号： 7で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが、配列番号： 4で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードする D N Aとしては、配列番号： 8で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。

本発明の部分べプチドをコードする D N Aとしては、本発明の受容体の部分べプチドをコ一ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよレ、。また、ゲノム D N A、ゲノム D N Aライブラリー、前記した細胞 ·組織由来の c D N A、前記した細胞 · 組織由来の c D N Aライブラリー、合成 D N Aのいずれでもよい。具体的には、配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列を有する D N Aの部分塩基配列を有する D N A、または配列番号 : 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードする D N Aの部分塩基配列を有する D N Aなどが用レ、られる。

配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列とハイプリダイズできる D N Aは、前記と同意義を示す。

ハイブリダイゼ一ションの方法およびハイストリンジヱントな条件は前記と同様のものが用いられる。

本発明の受容体または部分べプチドをコードするポリヌクレオチド（例、 D N A ) は、自体公知の方法で標識化されていてもよい。標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質（例、フルォレセインなど）、発光物質、酵素、ピオチン、ランタニド元素などがあげられる。

本発明の受容体または部分べプチドを完全にコードする D N Aのクロ一二ングの手段としては、本発明の受容体または部分べプチドの部分塩基配列を有する合成 D N Aプライマーを用いて自体公知の P C R法によつて増幅する力、または適当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明の受容体または部分べプチドの一部あるいは全領域をコードする D N A断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例ば、 Mo l ecular Clon ing 2nd ( J. Sambrook et al . , Co l d spring Harbor Lab. Pres s, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリ一を使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。

D N Aの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、 Mutan^TM-super Express Km (宝酒造（株） ) 、 Mutan^T -K (宝酒造（株））等を用いて、 0DA - LAPCR法、 Gapped duplex法、 Kunke 1法等の自体公知の方法あるレヽはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。

クローン化された受容体をコードする DNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該 DN Aはその 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、また 3 '末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 T G Aまたは TAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成 DN Aアダプターを用いて付加することもできる。

本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、例えば、（a ) 本発明の受容体または部分べプチドをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、（b) 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。

ベクタ一としては、大腸菌由来のプラスミド（例、 p B R 3 2 2 , .p B R 3 2 5 , p U C 1 2 , p UC 1 3 ) 、枯草菌由来のプラスミド（例、 p UB l l O , p T P 5 , p C l 9 4 ) 、酵母由来プラスミド（例、 p S H I 9 , p S H 1 5 ) 、えファージなどのバクテリオファージ、レトロウイノレス，ワクシニアゥイノレス，バキュロウイノレスなどの動物ウイノレスなどの他、 p A l— 1 1、 p XT l、 p R c /CMV, p R c /R S V、 p c D N A I ZN e oなどが用レヽられる。

本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、 S R aプロモーター、 S V 4 0プロモーター、 H I V ' L TRプロモーター、 CMVプロモーター、 H S V— T Kプロモーターなどがあげられる。

これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス）プロモーター、 S R ひプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a 。プロモーター、 r e c Aプロモーター、 L P Lプロモーター、 l p pプロモーター、 T 7プロモータ一などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 S P O lプロモーター、 S P 02プロモータ一、 p e n Pプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、 P H05プロモーター、 P GKプロモーター、 GAPプロモータ一、 ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモーターなどが好ましレ、。発現ベクターには、以上の他に、所望によりェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカー、 S V 4 0複製ォリジン（以下、 S V 4 0 o r i と略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 d h f r と略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（MTX) 耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、 A m p ^rど略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 N e o ^rと略称する場合がある、 G 4 1 8耐性）等があげられる。 '特に、 d h f r遺伝子欠損チヤィニーズハムスター細胞を用いて d h f r遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。

また、 .必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の受容体の N端末側に付加する。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 P h o A · シグナル配列、 Om p A · シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラーゼ ' シグナル配列、サブチリシン ' シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、 MF a · シグナル配列、 S U C 2 · シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン . シグナル配列、 α—インターフェロン . シグナル配列、抗体分子 • シグナル配列などがそれぞれ利用できる。

このようにして構築された本発明の受容体または部分べプチドをコ一ドする DN Αを含有するべクターを用いて、形質転換体を製造することができる。

宿主としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。

ェシエリヒァ属菌の具体例としては、例えば、ェシエリヒア . コリ（ Escherichia coli) K 1 2 · D H 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 卷， 160(1968)〕， J M 1 0 3 [Nucleic Acids Research, 9卷， 309 (1981) 〕， J A 2 2 1 [Journal of Molecular Biology, 120卷， 517 (1978)〕， H B 1 0 1 [Journal of Molecular Biology, 41 , 459(1969)] ， C 6 0 0 [Genetics, 39卷， 440(1954)〕などが用いられる。

バチルス属菌としては、例えば、バチルス . サブチルス（Bacillus subtilis) M I 1 1 4 〔Gene, 24卷， 255 (1983)〕， 2 0 7 — 2 1 [Journal of Biochemistry, 95卷， 87 (1984)〕などが用いられる。

酵母としては、例えば、サッカロマイセスセレピシェ（Saccharomyces cerevisiae) AH 2 2 , AH 2 2 R", NA 8 7— 1 1 A， D KD— 5 D , 2 0 B— 1 2、シゾサッカロマイセスボンべ. (Schizosaccharomyces pombe) N C Y C 1 9 1 3 , N C Y C 2 0 3 6、ピキアパストリス（ Pichia pastoris) K M 7 1などが用いられる。

昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが A c N P Vの場合は、ョトウガの幼虫由来株ィ匕細月包 (Spodoptera frugiperda cell ； S f 糸田月包）、 Trichoplusia niの中腸由来の M G 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five^TM糸田月包、 Mamestra brass icae由来の細胞または Est igmena acrea 由来の細胞などが用いられる。ウィルスが B mN P Vの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞； B mN細胞）などが用いられる。該 S f 細胞としては、例えば、 S f 9細胞（ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 (以上、 Vaughn, J. L. ら、 In Vivo, 13, 213-217, (1977) ) などが用いられる。

昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、 Nature, 315卷， 592(1985)〕。

動物細胞としては、例えば、サル細胞 C O S— 7 (C O S 7 ) , V e r o，チャイニーズハムスター細胞 C HO (以下、 C HO細胞と略記）， d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 C HO (以下、 C HO ( d h f r -) 細胞と略記），マウス L細胞，マウス A t T— 2 0，マウスミエローマ細胞，ラット GH 3 , ヒト F L細胞などが用いられる。ェシェリヒァ属菌を形質転換するには、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69卷， 2110(1972)や Gene, 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。

バチノレス属菌を形質転換するには、例えば、 Molecular & General Genetics, 168卷， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。

酵母を形質転換するには、例えば、 Methods in Enzymology, 194卷 , 182-187 (1991)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 75卷， 1929 (1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。

昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、 Bio/Technology， 6, 47-55 (1988) などに記載の方法に従って行なうことができる。

動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール 263-267(1995) (秀潤社発行）、 Virology, 52卷

, 456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。

このようにして、受容体または部分べプチドをコ一ドする D N Aを含有する発現べクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。宿主がェシ-リヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ ' リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよレ、。培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。

ェシエリヒァ属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含む M 9培地 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、 3 ]3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。

宿主がェシェリヒァ属菌の場合、培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜

2 4時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 3 0〜 4 0 °Cで約 6〜 2 4 時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、ノークホーノレダー（Burkholder)最 /J、培地 [Bostian, K. L. ら、 Pro Natl.

Acad. Sci. USA, 77卷， 4505 (1980)〕や 0. 5 %カザミノ酸を含有する S D 培地 [Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81卷， 5330 (1984)

〕があげられる。培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。培養は通常約 2 0 °C〜 3 5 °Cで約 2 4〜 7 2時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195, 788(1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地の p Hは約 6. 2〜 6. 4に調整するのが好ましい。培養は通常約 2 7 °Cで約 3〜 5 日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約 5〜 2 0 %の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122卷

， 501 (1952)〕， DMEM培地 [Virology, 8卷， 396 (1959)〕， R P M I 1 6 4 0培地 [The Journal of the American Meaical Association 199 巻， 519(1967)〕， 1 9 9培地 [Proceeding of the Society for the Bio logi ca l Medi c ine, 73卷， 1 ( 1950)〕などが用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。培養は通常約 3 0 °C〜 4 0 °Cで約 1 5〜 6 0時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。

以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明の受容体または部分べプチドを生成せしめることができる。

上記培養物から本発明の受容体または部分べプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。

本発明の受容体または部分べプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームお'よびまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリぺプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトン X— 1 0 0 ^TM などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリぺプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。

. このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる受容体または部分べプチドの精製は、自体公知の分離 · 精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および S D S —ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換ク口マトグラフィ一などの荷電の差を利用する方法、ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。

かくして得られる受容体または部分べプチドが遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。

なお、組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、アルギニルエンドぺプチダーゼ、プロティンキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。

タクリン化合物（例、化合物（I) ) は、市販されている場合には市販品をそのまま用いることもでき、自体公知の方法またはこれらに準じた方法に従って製造または抽出することもできる。

配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩に対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明の受容体に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の受容体に対する抗体としては、受容体のシグナル伝達を不活性化する抗体、受容体のシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。

本発明の受容体に対する抗体は、本発明の受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。

配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド（例、 D N A ) に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（例、 D N A ) としては、該ポリヌクレオチドに相補的な、または実質的に相捕的な塩基配列またはその一部を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）であってもよレ、。

具体的には、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（例、 D N A ) (以下、これらの D N Aを本発明の D N Aと略記する場合がある ) に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンス D N A (以下、これらの D N Aをアンチセンス D N Aと略記する場合がある）が挙げられ、本発明の D N Aに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該 D N Aの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンス D N Aであつてもよレヽ。

本発明の. D N Aに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明の D N Aに相補的な塩基配列（すなわち、本発明の D N Aの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約 7 0 %以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、本発明の受容体の N末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約 7 0 % 以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンス D N Aが好適である。これらのアンチセンス D N Aは、公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。

具体的には、配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7 または配列番号： 8で表わされる塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。好ましくは例えば、配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号： 5、配列番号： 6、配列番号： 7または配列番号： 8で表わされる塩基配列を有する D N Aの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜 4 0個程度、好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。

ヌグレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフエ一ト）は、例えば、ホスホロチォエート、メチノレホスホネート、ホスホロジチォネ一'トなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。

以下に、本発明の受容体、タクリン化合物などの用途を説明する。〔 1〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング

本発明の受容体は、 Shear Stressにさらすことによってヒト臍帯静脈内皮細胞において発現量が増加し（Biochem. Biophys. Res. Commun.、 240巻、 734- 741頁、 1997年）、また、ラット心筋由来細胞において低酸素刺激後に通常の培養に戻すことにより発現が誘導される（J. Biol. Chem. 、 276卷、 26453-26460頁、 2001年）。さらに、本発明の受容体は、乳癌由来細胞株に発現しているが、受容体の発現亢進またはリガンドによる活性化により、これらの細胞内の MAPキナーゼの活性化が抑制され、アポトーシスが誘導される（Endocrinology、 143巻、 3376-3384頁、 2002年、 Mol. Endocrinol.、 16卷、 70-84頁、 2002年）。

本発明の受容体を用い、または組換え型本発明の受容体の発現系を用いたリガンドレセプターアツセィ系を用いることにより、本発明の受容体とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物（例、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。

該化合物またはその塩には、（i) 本発明の受容体を介して細胞刺激活性（例、ァラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内 C a ²⁺遊離、細胞内 c AMP生成、細胞内 c AM P産生抑制、細胞内 c GMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o s の活性化、 p Hの低下、 G T P γ S結合活性、 c A M P依存性プロティンキナ一ゼの活性化、 c G M P依存性プロティンキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、マイトジヱン活性化蛋白質リン酸化酵素（M A Pキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を有する化合物（ァゴ二スト）、（i i ) 上記細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（i i i ) 本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を促進する化合物、（i v) 本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を阻害する化合物などが含まれる。

具体的には、（i ) 本発明の受容体に、タクリン化合物を接触させた場合と（i i ) 本発明の受容体に、タクリン化合物および試験化合物を接触させた場合との比較を行なう。比較は、例えば、本発明の受容体に対するタクリン化合物の結合量、細胞刺激活性などを測定して行う。

本発明のスクリーユング方法としての具体例としては、例えば、

( a) タクリン化合物を本発明の受容体に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、タクリン化合物の本発明の受容体に対する結合量を測定し、'比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化さ.せる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、

( b) タクリン化合物を、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、タクリン化合物の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および

( c) 本発明の受容体が、本発明の受容体をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（b) 記載のスクリーニング方法、

( d) タクリン化合物が、標識したタクリン化合物である上記（a) 〜（c ) のスクリ一.ニング方法などのレセプター結合ァッセィ系、 ( e) タクリン化合物を本発明の受容体に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、

( f)タクリン化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および

( g) 本発明の受容体が、本発明の受容体をコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（f) のスクリ一ニング方法などの細胞刺激ァッセィ系などが挙げられる。

本発明のスクリ一二ング方法の具体的な説明を以下にする。

本発明の受容体としては、ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いられる。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。

本発明の受容体を製造するには、前述の本発明の受容体の製造方法などが用いられる。

本発明のスクリ—ユング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をダルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ自体公知の方法に従って行うことができる。

本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。製造方法は前述と同様である。膜画分としては、細胞を破砕した後、それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter— E l vehj em型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ヮーリングブレンダーゃポリトロン（K i nemat i ca社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpn！〜 3000rpm) で短時間（通常、約 1分〜 1 0分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpn！〜 30000rpm) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。

該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、 1細胞当たり 1 0 ³〜 1 0 ⁸分子であるのが好ましく、 1 0 ⁵〜 1 0 ⁷分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が.可能になるばかりでなく、同一口ッ卜で大量の試料を測定できるようになる。

前記のレセプター結合ァッセィ系や細胞刺激ァッセィ系などのスクリ一ユング方法を実施するためには、例えば、本発明の受容体画分と、タクリン化合物（例、標識したタクリン化合物など）などが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましレ、。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したタクリン化合物としては、例えば、放射性同位元素（例、〔¹²⁵1〕、〔 '³¹1〕、〔³H〕、〔¹⁴C〕、〔³²P〕、〔³³P〕、〔³⁵S〕など）、蛍光物質〔例、シァニン蛍光色素（例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバィォサイエンス社製）など）、フルォレスカミン、フルォレツセンイソチオシァネー卜、腦（7 - nitrobenz- 2-oxa - 1, 3- diazol)など〕、酵素 ( 例、 /3—ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、バーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、ノレミノーノレ、ノレミノール誘導体、ノレシフェリン、ノレシゲニンなど）、ビォチン、ランタニド元素などで標識されたタクリン化合物などを用いることができる。

具体的には、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリ一ニングを行うには、本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリ一ユングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。ノくッファーとしては、 p H 4〜 1 0 (望ましくは p H 6〜8 ) のリン酸バッファー、トリス一塩酸バッファーなどのタクリン化合物と受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、 C HA P S , Tw e e n— 8 0^TM (花王一アトラス社）、ジギトニン、デォキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的で PM S F、ロイぺプチン、 E— 6 4 (ペプチド研究 ^製）、ぺプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 0 1〜1 0 m l の該レセプター溶液に、一定量（ 5 0 0 0〜5 0 0 0 0 0 c p m) の標識したタクリン化合物を添加し、同時に 1 0— ^1Q〜 1 0— ⁷Mの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（N S B) を知るために大過剰の未標識のタクリン化合物を加えた反応チューブも用意する。反応は 0 °C〜 5 0 °C、望ましくは 4 °C〜 3 7 °Cで 2 0分〜 2 4時間、望ましくは 3 0分〜 3時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたは γ—力ゥンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（B_Q)から非特異的結合量（N S B) を引いたカウント（B。 -N S B) を 1 0 0 %とした時、特異的結合量（B— N S B) が例えば 5 0 %以下になる試験化合物を、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を低下させる化合物として選択することができる。

さらに、表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、本発明の受容体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。

具体的には、ビアコア 3 0 0 0 (ビアコア社）のセンサーチップ表面に、本発明の受容体を固定化後、チップ表面にリン酸緩衝液（P B S) などに溶解した試験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、本発明の受容体に結合する試験化合物を選択する。例えば、表面プラズモンの変化の測定値が 5 レゾナンスュニット以上与える試験化合物を本発明の受容体に結合性を有する物質として選択する。前記の細胞刺激ァッセィ系のスクリ一二ング方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例、ァラキドン酸遊離、ァセチノレコリン遊離、細胞内 C a ²⁺遊離、細胞内 c AMP生成、細胞内 c AM P産生抑制、細胞内 c GMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c — f o sの活性化、 p Hの低,下、 GT P y S結合活性、 c AMP依存性プロテインキナーゼの活性化、 c GMP依存性プロティンキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロティンキナーゼの活性化、マイトジェン活性化蛋白質リン酸化酵素（MA Pキナーゼ）の活性化などを促進する活性または抑制する活性、受容体細胞内移行活性など）を、自体公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間ィンキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例、ァラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよレ、。また、 c AMP産生抑制などの活性については、フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。

細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。

試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非べプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。

上記細胞刺激ァッセィ系のスクリ一二ング方法について、さらに具体的に以下（ 1 ) 〜（ 1 3 ) に記載する。

( 1 ) 受容体発現細胞が受容体ァゴニストによって刺激されると細胞内の G蛋白質が活性化されて GTPが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、 GTPは加水分解されて GDPへと変化するが、このとき反応液中に GTP v Sを添加しておくと、 6丁？₇ 5は6丁？と同様に G蛋白質に結合するが、加水分解されずに G蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識した GTP y Sを用いると細胞膜に残存した標識された GTP y Sを測定することにより、受容体ァゴニズ卜の受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。

この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができる。この方法は、本発明の受容体を含む膜画分を用いて行う。本測定法において本発明の受容体膜画分への GTP _y S結合促進活性を示す物質はァゴニストである。

具体的には、標識した GTP y Sの存在下、タクリン化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合とタクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分への GTP y S結合促進活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。本方法において、タクリン化合物による本発明の受容体細胞膜画分への GTP y S結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、本発明の受容体細胞膜画分への GTP y S結合促進活性を測定することにより、ァゴニストのスクリ一ユングを行なうこともできる。

スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。

公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50mM Tri s、 5mM MgCl₂、 150mM NaCl、 1 μ M GDP, 0. 1 % BSA ； pH7. 4) で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これを Fa l con2053に 0. 2mlずつ分注し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を加え、さらに終濃度 200pMとなるように [³⁵S] GTP _y Sを加える。 25°Cで 1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50mM Tr i s , 5mM MgCl₂, 150mM NaCl , 0. 1 % BSA, 0. 05 % CHAPS； pH7. 4) 1. 5mlを加えて、ガラス繊維ろ紙 GF/Fでろ過する。' 65°C、 30分保温して乾燥後、液体シンチレーションカゥンターでろ紙上に残った膜画分に結合した

[³⁵S] GTP _y Sの放射活性を測定する。タクリン化合物のみを加えた実験.区の放射活性を 100%、タクリン化合物を加えなかった実験区の放射活性を 0%とし、タクリン化合物による GTP y S結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。 GTP y S結合促進活性が例えば 50%以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

( 2 ) 本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、細胞内 cAMPの産生が抑制される。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリー二ングすることができる。

具体的には、細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内 cAMPの産生抑制活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。

細胞内 cAMP量を増加させる物質としては、例えば、フオルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。

本発明の受容体発現細胞内の cAMP産生量は、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥシなどを免疫して得られた抗 cAMP抗体と〔¹²⁵1〕標識 cAMP (ともに市販品）を使用することによる RIA系、または抗 cAMP抗体と標識 cAMP とを組み合わせた EIA系で測定することができる。また、抗 cAMP抗体を、 prote in Aまたは抗 cAMP抗体産生に用いた動物の IgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと〔¹²⁵1〕標識 cAMPとを使用する SPA ( Sc i nt i l l at ion Prox imi ty As say) 法による定量、ィ匕学增幅型ルミネッセンスプロキシミティーホモジニアスアッセィ系である AlphaScreen ( Perk inElmer社）を応用した競合法 cAMP検出キット（ Perki nElmer社）による定量も可能である。

本方法において、タクリン化合物による本発明の受容体発現細胞の cAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、アンタゴニス.ト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、 cAMP 産生抑制活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ —ニングを行なうことができる。

スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。

本発明の受容体発現細胞（例、 CH0細胞などの動物細胞）を 24穴プレートに 5x l 0⁴ce l l/we l lで播種し、 48時間培養する。細胞を 0. 2mM 3-イソブチル-メチルキサンチン、 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むノヽンクスノくッファー（ρΗ7· 4) で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後、 0. 5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに 0. 25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 20 μ Mのタクリン化合物または 20 Μのタクリン化合物および試験化合物を添加した 2 μ Μ フォルスコリンを含む 0 · 25mlの反応用バッファ —を、細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。 100 μ 1の 20 %過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後氷上で 1時間置くことにより細胞内 cAMP を抽出する。抽出液中の cAMP量を、 cAMP EIAキット（アマシャムフアルマシアバイオテク）を用いて測定する。フオルスコリンの刺激によって産生された cAMP量を 100 %とし、 20 Mのタクリン化合物の添加によって抑制された cAMP量を 0 %として、タクリン化合物による cAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。タクリン化合物の活性を阻害して、 cAMP産生活性が例えば 50%以上になる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

また、タクリン化合物の刺激により、細胞内 cAMP量が増加する性質を示す本発明の受容体発現細胞を使用する場合、タクリン化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内 cAMPの産生促進活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。 . 本方法において、タクリン化合物による本発明の受容体発現細胞の cAMP産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて cAMP産生促進活性を調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ一ニングを行なうことができる。

cAMP産生促進活性は、上記のスクリ一二ング法においてフォルスコリンを添加せずに本発明の受容体発現細胞（例、 CH0細胞などの動物細胞）にタクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加して産生された cAMPを上記の方法で定量して測定する。

( 3 ) CRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。

CRE ( cAMP response e l ement ) を含む DNAを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、 CRE-レポーター遺伝子ベクターを得る。 CRE-レポ一ター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、 cAMP の上昇を伴う刺激は、 CREを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 CRE-レポーター遺伝子べクター導入細胞内の cAMP量の変動を検出することができる。

具体的には、細胞内 cAMP量を増加させる物質の存在下、タクリン化合物を、 CRE-レポーター遺伝子べクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、 CRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。

ベクターとしては、例えば、ピツカジーンべィシックベクター、ピッカジーンェンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。 CREを含む DNAを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクロ一ニングサイトに揷入し、 CRE - レポ一ター遺伝子べクターとする。

本方法において、タクリン化合物によるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

—方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量のタクリン化合物と同様な抑制を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリ一二ング方法の具体例を以下に述べる。

CRE -レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、 24穴プレートに 5xl0³cell/wellで播種し、 48時間培養する。細胞を 0.2mM 3-イソブチル -メチノレキサンチン、 0.05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー（ρΗ7· 4) で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後 0.5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに 0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 100 μ Mのタクリン化合物または 100 / Μのタクリン化合物および試験化合物を添加した 2μ Μ フオルスコリンを含む 0.25mlの反応用バッファーを、細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。細胞をピツカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ノレミノメータ一、液体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンタ一により測定する。タクリン化合物単独を添加した場合と、 100 のタクリン化合物および試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。

タクリン化合物は、フオルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光量の増加を抑制する。該抑制を回復させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフエニコーノレ ' ァセチノレトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyltransf erase) 、 /3—ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよレ、。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530を用いて、クロラムフエニコール . ァセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製 FAST CAT chrol ampheni col Acety l transf erase Assay KiTを用レヽて、 ]3—ガラク卜シダーゼ活性は、例えば和光純薬製 Aurora Ga l-XEを用いて測定する。

( 4 ) SRE -レポーター遺伝子ベクターを用いて、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。

SRE serum response e l ement; を含む DNAを、ベクターのレホーター遺伝子上流に挿入し、 SRE-レポーター遺伝子べクターを得る。 SRE-レポ一ター遺伝子べクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、血清刺激による MAPキナーゼ活性化などの增殖シグナルの活性化は、 SREを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 SRE-レポーター遺伝子べクター導入細胞内の増殖シグナルの活性化を検出することができる。

具体的には、タクリン化合物を、 SRE-レポーター遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、 SRE-レポーター遺伝子べクタ一導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。

ベクターとしては、例えば、ピツカジーンべィシックベクター、ピッ力ジーンェンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。 SREを含む DNAを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローユングサイトに挿入し、 SRE-レポ一ター遺伝子ベクターとする。

本方法において、タクリン化合物によるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性化を抑制させる試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、タクリン化合物と同様な発光量の上昇を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

レポ一ター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリ一二ング方法の具体例を以下に述べる。

SRE -レポーター遺伝子（ルシフェラ一ゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、 24穴プレー卜に 5xl0³cell/wellで播種し、 48時間培養する。細胞を 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスノくッファー（pH7. 4 ) で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後 0. 5mlの反応用バッファーを加えて 30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに 0. 25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、 100 μ Mのタクリン化合物または 100 μ Μのタク ]) ン化合物および試験化合物を添加した 0. 25mlの反応用バッファーを、細胞に加え、 37°Cで 24分間反応させる。細胞をピツカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフラーゼによる発光は、ノレミノメーター、液体シンチレーシヨンカウンタ一またはトップカウンタ一により測定する。タクリン化合物単独を添加した場合と、 100 μ Mのタクリン化合物および試験化合物を添加した場合のルシフヱラーゼによる発光量を測定して、比較する。

タクリン化合物は、ルシフェラーゼによる発光量を増加させる。該増加を抑制させる化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

レポ一タ一遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフエニコーノレ · ァセチノレトランスフェラ t (chloramphenicol acetyltransferase)、 /3—ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530を用いて、クロラムフエニコール . ァセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Κι ίを用レヽて、 β —力フク卜シダーゼ活性は、例えば和光純薬製 Aurora Gal- XEを用いて測定する。

( 5 ) 本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、ァラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーユングすることができる。

あらかじめ、標識したァラキドン酸を、本発明の受容体発現細胞に取り込ませておくことによって、ァラキドン酸代謝物放出活性を、細胞外に放出された標識されたァラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。

具体的には、タクリン化合物を、標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、標識したァラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、ァラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。

本方法において、タクリン化合物によるァラキドン酸代謝物放出活性を阻害する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

また、.試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明の受容体発現細胞のァラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりァゴニスト活性を示す化合物のスクリ一二ングを行なうこともできる。

スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。

本発明の受容体発現細胞を 24穴プレー卜に 5x l 0⁴ce l l/we l lで播種し、 24時間培養後、 [³H]ァラキドン酸を 0. 25 μ Ci/we l lとなるよう添加し、 16 時間後、細胞を 0. 05% BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスバッファー ( pH7. 4) (以下、反応用バッファーと略記する）で洗浄する。終濃度 20 _W Mのタクリン化合物または終濃度 20 ； u Mのタクリン化合物および試験化合物を含む反応用バッファー 500 μ 1を、各 we l lに添加する。 37°Cで 60 分間インキュベートした後、反応液 400 1をシンチレ一ターに加え、反応液中に遊離した [³H]ァラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカゥンターにより測定する。

反応用バッファ一 500 μ 1のみを添加した場合（タクリン化合物非添加 •試験化合物非添加）の遊離 [³Η]ァラキドン酸代謝物の量を 0%、 20 Μ のタクリン化合物を含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の遊離 [³Η]ァラキドン酸代謝物の量を 100%として、試験化合物を添加した場合の遊離 [³Η]ァラキドン酸代謝物の量を算出する。

ァラキドン酸代謝物放出活性が、例えば 50 %以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

( 6 ) 本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、細胞内の Ca濃度が上昇する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ングすることができる。

具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。測定は公知の方法に従って行う。本方法において、タクリン化合物による細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。

スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。

本発明の受容体発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、 2日後、培養液を、 4mM Fura-2 AM (同仁化学研究所）を縣濁した HBSSに置換し、室温で 2時間 30分おく。 HBSSで洗浄した後、キュべットにカバーグラスをセットし、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加し、励起波長 340nmおよび 380nmでの、 505nmの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。

また、 FLIPR (モレキュラーデバイス社製）を使って行ってもよレ、。本発明の受容体発現細胞縣濁液に Fluo-3 AM (同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、 96穴プレートに細胞を播く。 FLIPR装置にセットし、 Fura-2の場合と同様に、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。

さらに、本発明の受容体発現細胞に、細胞内 Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子（例、 aequorinなど）を共発現させておき、細胞内 Caイオン濃度の上昇によって、該遺伝子蛋白質（例、 aequorin など）が Ca結合型となり発光することを利用して、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーユングすることもできる。 '

細胞内 Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた本発明の受容体発現細胞を、 96穴プレートに播き、上記と同様に、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。

タクリン化合物による蛍光強度の上昇を、抑制する試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

( 7 ) 受容体を発現する細胞に、受容体ァゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。タクリン化合物の、本発明の受容体発現細胞における細胞内ィノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。

具体的には、標識したイノシトールの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。測定は公知の方法に従って行う。

本方法において、イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、イノシトール三リン酸産生上昇を測定することによってァゴニス卜のスクリーニングを行なうこともできる。

スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。

本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 1日間培養する。その後、 myo- [2- ³H] i nos i tol ( 2. 5 ^ C i/we l l ) を添加した培地で 1 日間培養し、細胞を放射活性を有するィノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加後、 10%過塩素酸を加え、反応を止める。 1. 5M 水酸化カリウムおよび 60mM HEPES溶液で中和し、 0. 5mlの AGl x8樹脂（B io-Rad) を詰めたカラムに通し、 5mM 四ホゥ酸ナトリウム（Na₂B₄0₇) および 60mM ギ酸ァンモニゥムで洗浄した後、 1M ギ酸アンモニゥムおよび 0. 1M ギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーシヨンカウンターで測定する。タクリン化合物を添加しない場合の放射活性を 0 %、タクリン化合物を添加した場合の放射活性を 100%とし、試験化合物の、タクリン化合物と本発明の受容体の結合に対する影響を算出する。

イノシトール三リン酸産生活性が、例えば 50%以下になる試験化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

( 8 ) TRE-レポ一ター遺伝子ベクターを用いて、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ニングすることができる。

TRE ( TPA response e lement) を含む DNAを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、 TRE-レポーター遺伝子べクタ一を得る。 TRE-レポ一ター遺伝子べクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、 TREを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、 TRE -レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。

具体的には、タクリン化合物を、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、 TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーユングする。

ベクターとしては、例えば、ピツカジーンべィシックベクター、ピッカジーンェンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。 TREを含む DNAを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに揷入し、 TRE- レポーター遺伝子べクターとする。

本方法において、タクリン化合物によるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを TRE-レポーター遺伝子べクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な発光量の増加を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

TRE-レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、 24穴プレートに 5x l 0³ce l l/wel lで播種し、 48時間培養する。糸田胞を 0. 05 % BSAおよび 20mM HEPESを含むハンクスノくッファー（pH7. 4 ) で洗浄した後、 100 Mのタクリン化合物または 100 のタクリン化合物および試験化合物を添加し、 37°Cで 60分間反応させる。細胞をピッ力ジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフラーゼによる発光は、ノレミノメータ一、液体シンチレーシヨンカウンターまたはトップカウンタ一により測定する。タクリン化合物を添加した場合と、 100 μ Μ のタクリン化合物および試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。

タクリン化合物による細胞内カルシウムの上昇によって、ノレシフェラーゼによる発光量が増加する。この増加を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフエニコーノレ ' ァセチノレトランスフェラーゼ (chloramphenicol acetyltransferase)、 β —ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよレ、。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アル力リフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製 Lumi- Phos 530を用いて、クロラムフエニコ.一ノレ ' ァセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製 FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiT¾r用レヽて、 β —力フク卜シダーゼ活性は、例えば和光純薬製 Aurora Gal-XEを用いて測定する。 ( 9 ) 本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、 MAP キナーゼが活性化され、増殖する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーユングすることができる。

具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。

本発明の受容体発現細胞の増殖は、例えば、 MAPキナーゼ活性、チミジン取り込み活性、 ATP量、細胞数などを測定すればよい。

具体例としては、 MAPキナーゼ活性については、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に添加した後、細胞溶解液から抗 M A Pキナーゼ抗体を用いた免疫沈降により M A Pキナーゼ分画を得た後、公知の方法、例えば和光純薬製 MAP Kinase Assay Ki tおよび γ _ [³²P] -ATPを使用して MAPキナーゼ活性を測定し、比較する。

チミジン取り込み活性については、本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播種し、培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加した後、放射活性により標識したチミジン（例、

[methy l- ³H] -チミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーシヨンカウンターで計数することにより、チミジン取り込み活性を測定し、比較する。

ATP量の測定については、本発明の受容体発現細胞を 96大プレートに播種し、培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加した後、例えば Cel lT i ter- Glo (Promega) を用いて細胞内の ATP 量を測定し、比較する。

細胞数の測定については、本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播種し、培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を添加した後、 MTT (

3—（4， 5一 dimethy 1— 2— thiazol y丄ノー 2, 5— diphenyl一 2H— tetrazo l ium bromide ) を添加する。細胞内に取り込まれて MTTが変化した MTTホルマザンを、塩酸にて酸性としたィソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、 570nm の吸収によって測定し、比較する。

本方法において、本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な細胞増殖活性を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

チミジン取り込み活性を利用するスクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。

本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに 5000個/ゥエル播き、 1日間培養する。次に血清を含まない培地で 2日間培養し、細胞を飢餓状態にする。タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を、細胞に添加して 24時間培養した後、 [methyl- ³H] _チミジンをゥエル当たり 0. 015MBq添加し、 6時間培養する。細胞を PBSで洗った後、メタノールを添加して 10分間放置する。次に 5% トリクロ口酢酸を添加して 15分間放置後、固定された細胞を蒸留水で 4回洗う。 0. 3N水酸化ナトリゥム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレ一ションカゥンターで測定する。

タクリン化合物を添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

( 1 0 ) 本発明の受容体発現細胞は、タクリン化合物の刺激により、力リゥムチャネルが活性化し、細胞内にある Kイオンが、細胞外に流出す.る

。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。

Kイオンと同族元素である Rbイオン（ルビジウムイオン）は、 Kイオンと区別無く、カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。よって、本発明の受容体発現細胞に、放射活性同位体である Rb ( [⁸⁶Rb] ) を取り込ませておいた後、タクリン化合物の刺激によって流出する⁸⁶ Rbの流れ（流出活性）を測定することにより、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定する。

具体的には、 ⁸⁶Rbの存在下、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、 ⁸⁶Rbの流出活性を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一エングする。

本方法において、タクリン化合物刺激による⁸⁶ Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な⁸⁶ R bの流出活性の上昇を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。

本発明の受容体発現細胞を 24穴プレートに播き、 2日間培養する。その後、 lmC i/mlの⁸⁶ RbClを含む培地中で 2時間保温する。細胞を培地でよく洗浄し、外液中の⁸⁶ RbClを完全に除く。タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を細胞に添加し、 30分後外液を回収し、 _Ύ カウンターで放射活性を測定し、比較する。

タクリン化合物刺激による⁸⁶ Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

( 1 1 ) 本発明の受容体発現細胞がタクリン化合物に反応し、細胞外の pHが変化する。この反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができる。

具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外の p H変化を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ユングする。

細胞外 pH変化は、例えば、 Cytosensor装置（モレキュラーデバイス社 ) を使用して測定する。

本方法において、タクリン化合物による細胞外 pH変化を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な細胞外 pH変化を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。

本発明の受容体発現細胞を Cytosensor装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチヤンバーにセットして細胞外 pHが安定するまで約 2時間、 0.1 % BSAを含む RPMI1640培地（モレキユラ一デバイス社製）を灌流させる。 pHが安定した後、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じた培地の pH変化を測定し、比較する。

タクリン化合物による細胞外 pH変化を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

、 1 2 ( Saccharomyces cerevisiae の haploid a -mating type (MAT a ) の性フェロモン受容体 Ste2は、 G蛋白質 Gpalと共役しており、性フェロモン α-mating factorに応答して MAPキナーゼを活个生ィ匕し、これに引き続き、 Farl (cell-cycle arrest) および転写活性化因子 Stel2が活性化される。 Stel2は、種々の蛋白質（例えば、接合に関与する FUS1) の発現を誘導する。一方、制御因子 Sst2は上記の過程に抑制的に機能する。この系に.おいて、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体ァゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などを指標として用いる、受容体ァゴニストと受容体との反応の SiJ定系の試みカ f亍なわれてレヽる (Trends in Biotechnology, 15巻， 487-494頁， 1997年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができる。

具体例を以下に示す。

ΜΑΤα酵母の Ste2および Gpalをコ一ドする遺伝子を除去し、代わりに、本発明の受容体遺伝子および Gpal_Gai2融合蛋白質をコ一ドする遺伝子を導入する。 Farlをコードする遺伝子を除去して cell- cycle arrestが生じないようにし、また、 Sst2をコードする遺伝子を除去してタクリン化合物に対する応答の感度を向上させておく。さらに、 FUS1にヒスチジン生令成遺伝子 HIS3を結合した FUS1- HIS3遺伝子を導入する。この遺伝子組換え操作は、例えば、 Molecular and Cellular Biology, 15巻， 6188-6195 頁， 1995年に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ 2 (SSTR2 ) 遺伝子を、本発明の受容体に置き換えて実施することができる。

このように構築された形質変換酵母は、タクリン化合物に高感度で反応し、その結果、 MAPキナーゼの活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が合成されるようになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。

従って、上記の本発明の受容体発現酵母（Ste2遺伝子および Gpal遺伝子が除去され、本発明の受容体遺伝子および Gpal-Gai2融合蛋白質コード遺伝子が導入され、 Far遺伝子および Sst2遺伝子が除去され、 FUS1-HIS3 遺伝子が導入された MAT c 酵母）を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一ユングすることができる。本方法において、該酵母の生育を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、タクリン化合物と同様な酵母の生育を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。

スクリ一ユング法の一具体例を以下に述べる。

上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、 2xl0⁴cell/mlの濃度になるように加える。ついで、 9x9cmの角形シヤーレに播く。寒天が固化した後、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、 30°Cで 3日間培養する。試験化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、タクリン化合物のみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培地にタクリン化合物を添加しておき、滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。

酵母の生育を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

( 1 3 )本発明の受容体遺伝子 RNAをアフリカッメガエル卵母細胞に注入し、タクリン化合物によって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、 cal c i um-act i vated chlor i de current力 S生じる。これは、月莫電位の変ィ匕としてとらえることができる（Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様

) 。タクリン化合物によって生じる本発明の受容体導入アフリカッメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、タクリン化合物の本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングすることができる。

具体的には、タクリン化合物を、本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を、本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリ力ッメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することにより、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリ一二ングする。

本方法において、細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、アンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

一方、試験化合物のみを本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリカツメガエル卵母細胞に接触させ、タクリン化合物と同様な細胞膜電位変化を測定することによりァゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。スクリ一二ング法の一具体例を以下に述べる。

氷冷して動けなくなった雌のァフリカツメガエルから取り出した卵母細胞塊を、 MBS液 ( 88raM NaCl, ImM KC1 , 0. 41raM CaCl , 0. 33mM Ca (N0₃) ₂, 0. 82mM MgS0_{4 )} 2. 4mM NaHC0₃, l OmM HEPES ； pH7. 4) に溶かしたコラーゲナ一ゼ（0. 5mg/ml ) で卵塊がほぐれるまで 19°C、 1〜6時間、 150rpmで処理する。外液を MBS液に置換することで 3度洗浄し、マイクロマニピュレーターで本発明の受容体遺伝子 poly A付加 cRNA ( 50ng/50nl) を卵母細胞にマイクロインジェクションする。

本発明の受容体遺伝子 mRNAは、組織や細胞から調製してもよく、プラスミドから in v i troで転写してもよい。本発明の受容体遺伝子 mRNAを MBS 液中で 20°Cで 3日培養し、これを Ri nger液を流している vol tage c lamp装置のくぼみ.に置き、電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、（一）極は細胞外に置く。電位が安定したら、タクリン化合物またはタクリン化合物および試験化合物を含む Ringer液を流して電位変化を記録する。試験化合物の影響は、本発明の受容体遺伝子 RNA導入ァフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、タクリン化合物のみ含む Ringer液を流した場合と比較することによって測定することができる。

細胞膜電位変化を抑制する化合物をアンタゴニスト候補化合物として選択することができる。

上記の系において、電位の変化量を増大させると、測定しやすくなるため、各種の G蛋白質遺伝子の po ly A付加 RNAを導入してもよレ、。また、カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質（例、 aequor inなど）の遺伝子の po ly A付加 RNAを共ィンジヱクションすることにより、膜電位変化ではなく発光量を測定することもできる。

タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング用キットは、本発明の受容体または本発明の受容体を含有する細胞もしくは細胞の膜画分、およびタクリン化合物を含有する。

本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。

1 . スクリ一二ング用試薬 (i) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液

Hanks' Balanced Salt Solution (インビ卜ロジェン社製）に、 0.05 %のゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。

孔径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存する力または用時調製しても良い。

(ii) 本発明の受容体標品

本発明の受容体を発現させた CH0細胞を、 12穴プレー卜に 5X10⁵個 Z穴で継代し、 37°C、 5%C0₂、 95%airで 2日間培養したもの。

(iii) 標識リガンド

〔³H〕、〔¹²⁵I〕、〔¹⁴C〕、〔³²P〕、〔³³P〕、〔³⁵S〕などの放射性同位元素で標識したタクリン化合物を適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、 4°Cまたは- 20°Cにて保存し、用時に測定用緩衝液にて 1 Μに希釈する。

(iv) リガンド標準液

タクリン化合物を 0.1%ゥシ血清アルブミン（シグマ社製）を含む PBS で ImMとなるように溶解し、 -20°Cで保存する。

2. 測定法

(i) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。

(ii) 10一³〜 10_^1GMの試験化合物溶液を 5 1加えた後、標識したタクリン化合物を 5 μ 1加え、室温にて 1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに 10— ³Μのタクリン化合物を 5μ 1加えておく。

(iii) 反応液を除去し、 lmlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。細胞に結合した標識されたタクリン化合物を 0.2N NaOH- 1%SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレーター A (和光純薬製）と混合する。

(iv) 液体シンチレーシヨンカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。

PMB = [ (B— N S B) / (B。一 N S B) .] X 1 0 0 PMB ： Percent Maximum Binding

B ：検体を加えた時の値

N S B ： Non-specific Binding (非特異的結合量）

B₀ ：最大結合量

本発明のスクリ一ニング方法またはスクリ一ユング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、タクリン化合物と本発明の受容体との結合を変化させる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物であり、具体的には、（i) 本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明の受容体ァゴニスト）、 (ii)該刺激活性を有しない化合物（本発明の受容体アンタゴニスト）、

(iii) 本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を促進する化合物、

(iv) 本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を阻害する化合物などである。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非べプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。 '

該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。

上記本発明の受容体ァゴニストである力またはアンタゴニストであるかの評価方法は、例えば、以下の（i) または（ii) に従えばよい。

(i) 前記（a) 〜（c) のスクリーニング方法で示されるバインディング • アツセィを行い、タクリン化合物と本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体ァゴニスト (ァゴ二スト）であり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニスト（アンタゴニスト）である。

(ii) (a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体ァゴニストである。

(b)タクリン化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、タクリン化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。

前述したように、本発明の受容体は、乳癌由来細胞株に発現している力受容体の発現亢進またはリガンドによる活性化により、これらの細胞内の MA キナーゼの活性化を抑制され、アポトーシスが誘導される（ Endocr i no l ogy , 143巻、 3376-3384頁、 2002年、 Mo l . Endocr ino l . , 16 卷、 70- 84頁、 2002年）。

従って、本発明の受容体ァゴニストおよびタクリン化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直鳩癌、肝臓癌、肝細胞癌、膝癌、膝内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 Τ細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、腌内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防 · 治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。

本発明の受容体アンタゴニストは、本発明の受容体が有する生理作用 (例、虚血再かん流後の心筋細胞のアポトーシスなど）を抑制することができるので、安全で低毒性な医薬、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防 · 治療剤、心筋細胞のアポト一シスの予防 ' 治療剤などとして有用である。

本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を促進する化合物は、安全で低毒性な医薬、' 例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、腌癌、腌内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、'尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宫体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、鸱内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防 · 治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の增殖抑制剤などとして有用である。

本発明の受容体とタクリン化合物との結合力を阻害する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防 · 治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防 · 治療剤などとして有用である。

本発明のスクリーニング方法またはスクリ一ニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、蛋白、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明の受容体とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物、本発明の受容体の活性または機能を促進または阻害する化合物、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害（発現量を増加または減少）する化合物などである。該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。

上記化合物またはその塩を上記の医薬（予防 · 治療剤など）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。該化合物またはその塩は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D —ソルビトール、 D —マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、. ァノレコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレンダリコール、ポリエチレングリコ一ルなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルべ一ト 8 0 ^TM、 H C O— 5 0など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤.（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザノレコニゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ゥマ、トリ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。

該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、症状、投与ルートなどにより差異はある。

例えば、乳癌患者（体重 60kg当たり）に、一日につき該化合物を約 0. 1 〜100mg、好ましくは約 1. 0〜50mg、より好ましくは約 1. 0〜20mg経口投与する。非経口的に投与する場合、例えば、該化合物を注射剤の形で乳癌患者（体重 60kg当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約 0. 01 〜30mg、好ましくは約 0. l〜20mg、より好ましくは約 0. 1〜 10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。

上記医薬は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、シクロフォスファミド、ブスルファン、メルファランなど）、代謝拮抗剤（例、シタラビン、 6 —メルカプトプリン、メソトレキサート、 5 _フルォロウラシルなど）、抗癌性抗生物質（例、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビラノレビシン、ミドキサントロン、イダルビシン、マイトマイシン、ァドリアマイシンなど）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール、エトポシドなど）、酵素製剤（例、 L-ァスパラギナーゼなど）、副腎皮質ホルモン薬（例、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、酢酸コルチゾンなど）、エストロゲン薬（例、エストラジォーノレ、ェチニノレエストラジオ一ノレ、ホスフェストローノレ、クロ口トリァニセンなど）、抗エストロゲン薬（例、ェピチォスタノール、メピチォスタン、タモキシフェン、クロミフェンなど）、黄体ホルモン薬（例、力プロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ジドロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、ノルェチステロン、ノルェチンドロンなど）、 LHRH誘導体.（例、酢酸リュープロレリンなど）、シスプラチン、カルボプラチン、トランスレチノイン酸、インターフェロン α、ィマチ-ブなどと併用してもよい。併用により、予防および（または）治療に必要な抗癌作用を低下させることなく上記医薬、および（または）上記薬物の投与量を減らすことができるため、予防および（または）治療効果を減少させることなく副作用（例、正常細胞に対する障害作用など）を軽減することができる。この際、投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、上記化合物とこれら薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。

〔 2〕タクリン化合物を含有する癌の予防 · 治療剤

タクリン化合物は、乳癌由来細胞株に発現し、受容体の発現亢進またはリガンドによる活性化により、これら細胞内の MAPキナーゼの活性化が抑制され、アポ卜一シスが誘導される本発明の受容体のリガンドである。従って、タクリン化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、癌（例、脳腫瘍、.下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、鸱癌、滕内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宫肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、鸱内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防 • 治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。

タクリン化合物を上記の医薬（予防 · 治療剤など）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。

該化合物は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるレ、は水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチヱリ一のような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D —ソルビトール、 D —マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、ァノレコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート 8 0 ^TM、 H C O— 5 0など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。

このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ヒッジ、 .ブタ、ゥシ、ゥマ、トリ、ネコ、ィヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。

上記医薬は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、シクロフォスファミド、ブスルファン、メルファランなど）、代謝拮抗剤（例、シタラビン、 ' 6 —メノレカプトプリン、メソトレキサート、 5 —フノレオロウラシルなど）、抗癌性抗生物質（例、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビラノレビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、マイトマイシン、ァドリアマイシンなど）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソ一ル、エトポシドなど）、酵素製剤（例、 L-ァスパラギナーゼなど）、副腎皮質ホルモン薬（例、プレドニゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾン、酢酸コルチゾンなど）、エストロゲン薬（例、エストラジォーノレ、ェチニノレエストラジオ一ノレ、ホスフェストローノレ、クロ口トリァニセンなど）、抗エストロゲン薬（例、ェピチォスタノ一ル、メピチォスタン、タモキシフェン、クロミフェンなど）、黄体ホルモン薬（例、力プロン酸ヒドロキシプロゲステロン、ジドロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、ノルェチステロン、ノルェチンドロンなど）、 LHRH誘導体（例、酢酸リュープロレリンなど）、シスブラチン、カルボプラチン、トランスレチノイン酸、インターフェロンお、イマチニブなどと併用してもよい。併用により、予防および（または）治療に必要な抗癌作用を低下させることなく上記医薬、および（または）上記薬物の投与量を減らすことができるため、予防および（または）治療効果を減少させることなく副作用（例、正常細胞に対する障害作用など）を軽減することができる。この際、投与時期は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、上記化合物とこれら薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせ等に応じて適宜選択することができる。本明細書および配列表において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commi ss ion on Bi ochemi cal Nomenc l ature による略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る'場合は、特に明示しなければ L体を示すものとする。

D N A ：デォキシリボ核酸

c D N A ：相補的デォキシリボ核酸

A ：アデニン

T ：チミン

G ：グァニン C ：シトシン

R N A ：リボ核酸

m R N A ：メッセンジャーリボ核酸 d A T P ：デォキシアデノシン三リン酸 d T T P ：デォキシチミジン三リン酸 d G T P ：デォキシグアノシン三リン酸 d C T P ：デォキシシチジン三リン酸

A T P ：アデノシン三リン酸

E D T A ：エチレンジアミン四酢酸

S D S ：ドデシル硫酸ナトリウム

G 1 y ：グリシン

A 1 a ：ァラニン

V a 1 ：ノくリン

し e u ：ロイシン

I 1 e ：イソロイシン

s e r ：セリン

T h r ：スレ才ニン

C y s ：システィン

M e t ：メチォニン

G 1 u ：グルタミン酸

A s P ：ァスパラギン酸

L y s ：リジン

A r g ：アルギニン

H i s ：ヒスチジン

P h e ：フエニノレアラニン

T y r ：チロシン

T r P ：トリブトファン

P r o ：プロリン

A s n ：ァスパラギン G i n ：グルタミン

p G 1 u ：ピログルタミン酸

S e c ：セレノシスティン ( selenocysteine)

また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。

M e ：メチノレ基

E t ：ェチル基

B u ：ブチル基

P h ：フェニル基

T C ：チアゾリジン一 4 (R) —カルボキサミド基

T o s ： P _ トノレエンスノレフォニノレ

C H O ：ホルミノレ

B z 1 ：ベンジノレ

Cl₂-Bzl ： 2 , 6—ジクロロべンジル

B o m ：ベンジルォキシメチノレ

Z ：ベンジルォキシカルボ二ノレ

C 1 - Z ： 2—クロ口べンジノレオキシカノレボニル

B r — Z ： 2—ブロモベンジノレオキシカノレボニノレ

B o c ： t _ブトキシカノレボニノレ

DN P ：ジニトロフエニル

T r t ：トリチル

B u m ： t—ブトキシメチノレ

Fm o c ： N— 9— フノレオレニノレメトキシカノレボニノレ

H O B t ： 1 — ヒドロキシベンズトリァゾーノレ

HOO B t : 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一

1 , 2， 3—べンゾトリアジン

H O N B ： 1-ヒドロキシ -5-ノノレボルネン- 2, 3-ジカルボキシィミド

D C C ： N， N'—ジシクロへキシルカルボジイミド本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。

〔配列番号： 1〕

ヒト GPR30のアミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 2〕

ラット GPR30のアミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 3〕

マウス GPR30のァミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 4〕

ヒト GPR30のアミノ酸配列を示す。

〔配列番号： 5〕

配列番号： 1で表されるァミノ酸配列を有するヒト GPR30をコードする cDNAの塩基配列を示す。

〔配列番号： 6〕

ラット GPR30をコードする cDNAの塩基配列を示す。

〔配列番号： 7〕

マウス GPR30をコ一ドする cDNAの塩基配列を示す。

〔配列番号： 8〕

配列番号： 4で表されるァミノ酸配列を有するヒト GPR30をコードする cDNAの塩基配列を示す。実施例

以下に、参考例および実施例により本発明をより具体的にするが、本発明はこれらに限定されるものではない。参考例 1

ヒ卜 GPR30発現 CH0細胞の作製

ヒト GPR30の cDNA (配列番号： 5 ) を公知の PCR法によりクローニングし、 pAKKOl . 11H発現ベクター (Bi ocherai ca et Bi ophys i cs Acta 1219 ( 1994) 251-259) に組み込んだ。プラスミドの構造を、制限酵素処理および配列解析で確認し、正しい構築のものを CH0細胞発現用プラスミド pAK— hGPR30として使用した。

このプラスミ卜- pAK— hGPR30を CHO/dhfr—糸田胞 (American Type Culture Collection) にエレクト口ポレーシヨン法で形質導入した。まず、プラスミド pAK_hGPR30を制限酵素 Ahd Iで処理した。エレクトロポレーション用のキュべッ卜に、 PBS 500 μ 1 に懸濁した 5 X 10⁶個の CHO/ dhfr" 細胞と、 TE buffer 10 ； u lに溶解したプラスミド DNA 5 gを添加し、 5分間氷上で静置後、 0.25V、 960 μ Fの条件でェレクト口ポレーションを行った。 5分間氷上で静置後、全量の CHO/ dhfr—細胞を T75フラスコに播き、 10 %のゥシ胎児血清（BIO WHITTAKER 社）を含む、核酸含有 MEMalpha培地 (Invitrogen社）中で 37°C、 5%炭酸ガス中で 1 日間培養した。該細胞をトリプシン処理により分散させてフラスコから回収し、 200個または 500 個ずつ 96 well plateに植え込み、透析済み 10%ゥシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、 50 // g/ml gentamic inを含む核酸不含隱 alpha培地 ( Invitrogen社）中にて 37°C、 5%炭酸ガス中にて培養を開始した。プラスミドの導入された形質転換 CH0細胞は該培地中で生育するが、非導入細胞は次第に死滅していく。培養開始 8〜10日後に、 96 well plate の一個の wellの中に一個のコ口 -一が生育してきた wellを選択し、形質転換 CH0 細胞のコロニーを約 48個選んだ。それぞれ選択された細胞から RNAを市販の RNA単離用キットを用いて回収し、以降、公知の TaqMan RT-PCR法によりヒト GPR30を高発現する形質転換 CH0細胞（以後、ヒト GPR30細胞と略称する）を選別した。

参考例 2

ラット GPR30発現 CH0細胞の作製

ラッ卜 GPR30は、 GPR41として Biochemical Biophysical Research

Communications 234卷、 190-193頁、 1997年に報告されている。

ラット GPR30レセプター cDNA (配列番号： 6 ) を公知の PCR法によりクローニングし、 pAKKOl.11H発現べクタ一 (Biochemica et Biophysics Acta 1219巻、 251-259頁、 1994年）に組み込んだ。プラスミドの構造を、制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、正しい構築のものを CHO細胞発現用プラスミド pAK- rGPR30として使用した。

このプラスミド pAK— rGPR30を参考例 1に記載した方法に従い、 CHO/dhfr—糸田胞 (American Type Culture Collection) にエレク卜ロボレーシヨン法で形質導入し、ラット GPR30を高発現する形質転換 CH0細胞（以後、ラット GPR30細胞と略称する）を選別した。実施例 1

( 1 ) FLIPRによるヒト GPR30およびラット GPR30ァゴニスト活性の測定上記参考例で得られたヒト GPR30細胞およびラット GPR30細胞を、それぞれ 15X10⁴cells/mlとなるように培地（10% d FBS-DMEM) に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom, Coster社）に 8連ピぺットを用いて各ゥエルに 200 /X 1ずつ植え込み（3. OX 10⁴cells/200 1/ゥヱル）、 5% C0₂インキュベータ一中にて 37°Cでー晚培養した後用いた（以後、糸田月包プレートとする）。 H/HBSS 20 ml, 250 mM Probenecid 200 I U ゥシ胎児血清（FBS) 200w lを混合した。また、 Fluo'3-ΑΜ (同仁化学研究所） 2バイアル（50;u g) をジメチルスルフォキサイド 40 z l、 20 % Pluronic acid (Molecular Probes社） 40 1に溶角？し、これを上記 H/HBSS-Probenecid-FBS に加え、混和後、 8連ピぺットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ゥヱル ΙΟΟμ Ιずつ分注し、 5% C0₂インキュベータ一中にて 37°Cで 1時間インキュベートした（色素ローデイング）。種々の濃度のタクリン (Aldrich Chemical Company) 溶液8 1を2.5 mM Probenecid, 0.1% CHAPS, 0.1% BSAを含 H/HBSS 259 1にカロえて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート（V-Bottomプレート、 Coster社）へ移した（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローデイング終了後、 H/HBSSに 2.5 mM Probenecidをカ卩えた洗浄バッファーでプレートウォッシヤー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを 5回洗浄し、洗浄後 100 1の洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレ一トを FLIPRにセットし（FLIPRにより、サンプルプレートカら 50 1のサンプルが細胞プレートへと移される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定した。

結果を図 1〜図 4に示す。

これより、タクリンによる刺激によって、ヒト GPR30細胞およびラット GPR30細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇が濃度依存的に惹起されることが明らかとなった。

( 2 ) FLIPRを用いた試験化合物の活性の検討法

上記参考例で得られたヒト GPR30細胞を、 15X10⁴cells/mlとなるように培地（10% d FBS-DMEM) に懸濁し、 FLIPR用 96穴プレート（Black plate clear bottom, Coster社） tこ 8連ピぺットを用レヽて各ウエノレ（こ 200 μ 1ずつ植え込み（3. OX 10⁴cells/200;u 1/ゥエル）、 5% C0₂インキュベーター中にて 37°Cで一晩培養した後にアツセィに用いる（以後、細胞プレートとする）。 H/HBSS 20 ml 250 mM Probenecid 200 μ 1, ゥシ月台 J¾血'?青（FBS) 200μ 1を混合する。また、 Fluo 3- AM (同仁化学研究所） 2バイアル（50 μ g) をジメチノレスノレフォキサイド 40 1、 20% Pluronic acid (

Molecular Probes.社）に溶角军し、これを上記 H/HBSS— Probeneci d — FBSに加え、混和後、 8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレー卜に各ゥエル 100 1ずつ分注し、 5% C0₂インキュベータ一中にて 37°C で 1時間インキュベートする（色素ローデイング）。

試験化合物を含有する溶液を 2.5 mM Probenecid, 0.1% CHAPSを含む H/HBSSに加えて希釈し、 FLIPR用 96穴プレート（V-Bottomプレート、Coster 社）へ移す（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素口一ディング終了後、 H/HBSSに 2.5 mM Probenecidを力!]えた洗浄ノッファーでプレートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを 5回洗浄し、洗浄後 100μ 1の洗浄バッファーを残す。この細胞プレ一トとサンプルプレートを FLIPRにセットし（FLIPRにより、サンプルプレー卜から 50 1のサンプルが細胞プレートへと移される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定する。 GPR30を発現させない CH0細胞株を用いて上記と同様の試験を実施し、 GPR30発現 CHO細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を特異的に上昇させる化合物を探索する。

実施例 2

( 1 ) Gタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミドおよびレポータープラスミドの宿主細胞（HeLa) での一過性発現

参考例 1記載のプラスミド pAK- hGPR30を用いて大腸菌 JM109を形質転換し、得られたコロニーを単離 ·培養後、 QIAGEN Plasmid Maxi Kit (キァゲン）を用いてプラスミドの大量調製を行なった。また、血清応答配列（SRE) の下流にレポーターとしてルシフェラーゼ遺伝子が連結された pSRE-Luc (Invitrogen) のレポータープラスミドおよび Gタンパク質の一種であるヒト GaoA、ヒト Gj31、ヒト G γ 2の発現べクタ一プラスミドを同様にして調製した。

Gタンパク質共役型レセプタータンパク質発現プラスミド pAK-hGPR30 およびレポータープラスミドを導入する宿主細胞としては、 HeLa細胞を用レ、、 384穴アツセィプレート（C0STAR 3704) 4こ 4, 000 cells/well、培養液量 25 1で播種し、ー晚培養した。培地は DMEM (Invitrogen) に 10 %のゥシ胎児血清と 1% MEM non-essential amino acids solutionを添加したもの（DMEM/NEAA) を用いた。

各プラスミドを 240ng/ 1の濃度に希釈し、 pAK- hGPR30または対照実験としてレセプターの発現プラスミドの代りにレセプタ一タンパク質をコ一ドする DNAを含まない発現べクタ一 pAKKO-1.11Hのプラスミドを 1 1とレポータープラスミド 9μ 1および GaoA、 Gj31、 G_y 2の Gタンパク質発現プラスミド各 1 μ 1の害 U合で 250 1の 0pti_MEM_I (Invitrogen) に添力 Pした。これを、同じく 250/z 1の Opti— ΜΕΜ_Ιίこ 10μ 1の Lipofectamine^TM2000 Reagent (Invitrogen) を添加したものと等量混合して、添付のマ二ユアル記載の方法に従ってリポソームとプラスミドの複合体を形成させた。これらを 5μ 1/wellずつ HeLa細胞の培養液に添加し、プラスミドの導入を行った後、 37°C、 5% C0₂下で一晩培養した。

( 2) レポーターアツセィによるリガンド活性の検出上記（ 1 ) で準備した HeLa細胞を、ゥシ胎児血清を含まない DMEM/NEAA (アツセィ用培地）で 2回洗浄後、 37°C、 5 % C0₂下で 2時間培養した。さらにァッセィ用培地で 1回洗浄後、 0. 05% CHAPSを含むァッセィ用培地に溶解したタクリン（Aldr i ch Chemi cal Company) を各穴の細胞に添加した。サンプル添加後に 37°C、 5% C0₂下で 4時間のインキュベーションを行ない、レセプターを介したリガンドのァゴニスト活性によって惹起される細胞内シグナル伝達に由来するレポーター遺伝子の転写 · 翻訳の促進を誘導した。インキュベーション終了後に各穴の培地を除去し、ルシフェラーゼ活性測定用の基質であるピツカジーン LT2. 0 (東洋ィンキ社）を 8 x lずつ加えた。細胞が溶解し、基質と充分に混合した後、各穴のレポーター遺伝子の発現誘導量に由来する化学発光量をプレートリーダー ( EnV i s ion™, パーキンエルマ一）にて測定した。

その結果、図 5に示すように GPR30発現細胞で、タクリン（100 M) 添加によって顕著なルシフェラーゼ活性亢進が認められた。一方、対照の pAKKO- 1. 1 1H導入細胞では、タクリン（100 /z M) を添加しても有意な活性の亢進は検出されなかった。

以上よりタクリンによる刺激によってヒト GPR30を発現する細胞に特異的に血清応答因子によって制御される遺伝子の転写が促進されることが明らかとなった。

タクリンの代わりに試験化合物を添加して同様の測定を実施することにより、GPR30を活性化して血清応答因子によって制御されるルシフェラ —ゼ遺伝子転写活性の促進を示す化合物を探索することができる。産業上の利用可能性

タクリン化合物（例、化合物（I) ) 、タクリン化合物の活性を促進する化合物またはその塩、本発明の受容体（例、 GPR30など）とタクリン化合物との結合を促進する化合物またはその塩などは、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、滕癌、腌内分泌腫瘍、 ' 胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、膝内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防 • 治療剤、癌の転移抑制剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして有用である。

また、本発明の受容体（例、 GPR30など）およびタクリン化合物は、例えば、癌（例、脳腫瘍、下垂体腺腫、神経膠腫、聴神経鞘腫、咽頭癌、喉頭癌、舌癌、胸腺腫、中皮腫、乳癌、肺癌、非小細胞 ^癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、肝細胞癌、膝癌-、眸内分泌腫瘍、胆管癌、胆嚢癌、陰茎癌、腎臓癌、腎盂癌、尿管癌、腎細胞癌、精巣腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、外陰癌、子宮癌、子宮頸部癌、子宮体部癌、子宮肉腫、絨毛性疾患、膣癌、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、皮膚癌、悪性黒色腫、菌状息肉症、基底細胞腫、軟部肉腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、骨髄異形成症候群、多発性骨髄腫、白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、成人 T細胞白血病、慢性骨髄増殖性疾患、腌内分泌腫瘍、原発不明癌など）などの予防 · 治療作用、癌細胞のアポトーシス促進作用、癌細胞の増殖抑制作用、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など ) の予防 · 治療作用、心筋細胞のアポトーシスの予防 · 治療作用を有する化合物またはその塩のスクリ一ニングに有用である。

Claims

請求の範囲

1 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩および（b) タクリン化合物を用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一二ング方法。

2 . タクリン化合物が、下式

〔式中、環 Aは、置換基を有していてもよいベンゼン環、

R ¹は、置換基を有していてもよいァミノ、

R ²および R ³は、互いに結合して隣接する炭素原子と共に、置換基を有していてもよい 3ないし 1 0員同素または複素環を形成していてもよレ、〕で表される化合物またはその塩である請求項 1記載のスクリーニング方法。

3 . ( a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩および（b)タクリンを用いる請求項 1記載のスクリ一二ング方法。

4 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号： 2、配列番号： 3または配列番号： 4で表されるアミノ酸配列である請求項 1記載のスクリ一二ング方法。

5 . ( a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩に接触させた場合における、タクリン化合物の該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し、比較する、請求項 1記載のスクリ一二ング方法。

6 . ( a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、タクリン化合物の該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、請求項 1記載のスクリーニング方

' 法。

7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩をコードする D

N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 6記載のスクリ一二ング方法。

8 . タクリン化合物が、標識したタクリン化合物である請求項 5〜請求項 7記載のスクリ一ユング方法。

9 . (a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ぺプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項 1記載のスクリ一二ング方法。

1 0 . ( a) タクリン化合物を、配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b) タクリン化合物および試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項 1記載のスクリ一二ング方法。

1 1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードする

D N Aを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩である請求項 1 0記載のスクリ一ユング方法。

1 2 . ( a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（b) タクリン化合物を含有することを特徴とする、該蛋白質ま'たはその塩とタクリン化合物との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリ一ユング用キット。

1 3 . タクリン化合物を含有してなる癌の予防 ·治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または（および）癌細胞の増殖抑制剤。

1 4 . タクリン化合物の活性を促進することを特徴とする癌の予防 · 治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法。

1 5 . タクリン化合物の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする癌の予防 · 治療法、癌細胞のアポトーシス促進法または（および）癌細胞の増殖抑制法。

1 6 . 癌の予防 · 治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤の製造のための、タクリン化合物の使用。

1 7 . タクリン化合物の活性を阻害することを特徴とする心疾患の予防 · 治療法または（および）心筋細胞のアポトーシスの予防 · 治療法。