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WO2006059507A1 - 11β-HSD1 ANTISENSE COMPOUND - Google Patents

11β-HSD1 ANTISENSE COMPOUND Download PDF

Info

Publication number
WO2006059507A1
WO2006059507A1 PCT/JP2005/021339 JP2005021339W WO2006059507A1 WO 2006059507 A1 WO2006059507 A1 WO 2006059507A1 JP 2005021339 W JP2005021339 W JP 2005021339W WO 2006059507 A1 WO2006059507 A1 WO 2006059507A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
els
pharmacologically acceptable
acceptable salt
antisense oligonucleotide
compound
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/021339
Other languages
French (fr)
Japanese (ja)
Inventor
Makoto Koizumi
Manabu Abe
Kazushi Araki
Ryo Okuyama
Original Assignee
Sankyo Company, Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Company, Limited filed Critical Sankyo Company, Limited
Publication of WO2006059507A1 publication Critical patent/WO2006059507A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA

Definitions

  • the present invention is known to induce insulin resistance, hypertension and the like due to its excessive expression.
  • 11 18-Treatment of metabolic diseases such as diabetes and hypertension by suppressing the action of HSD1 'Relates to novel 11 ⁇ -HSD1 antisense compounds that are effective in prevention.
  • Darcocorticoids are a type of steroid hormone that is synthesized and released in the adrenal cortex and bind to receptor proteins present in the cell nucleus to transmit signals, thereby allowing a variety of sugars, lipid metabolism, and blood pressure regulation. Demonstrate the function. It is known that excessive production of darcocorticoids such as tumor cells in the adrenal cortex causes symptoms such as excessive accumulation of visceral fat, diabetes, hyperlipidemia, and hypertension (Non-patent Document 1). . On the other hand, darcocorticoids are locally activated not only in the IJ kidney but also in the cells of each tissue.
  • 11 j8 -hydroxysteroid dehydrogenasel (ll j8 -hydroxysteroid dehydrogenase type 1, 11 j8-HSD1) is involved.
  • 11 ⁇ -HSD1 activity in visceral adipose tissue is enhanced, and research results have been reported (Non-patent Document 2).
  • 11 j8-HSD1 activity has also been reported as a result of reports of cases showing no signs of metabolic disease due to decreased 11 ⁇ -HSD1 activity despite high blood darcocorticoid concentrations. It is considered that the active activity of darcocorticoids is closely related to metabolic diseases (Non-patent Document 3).
  • mice overexpressing 11 ⁇ -HSD1 specifically in adipose tissue exhibited visceral fat accumulation type obesity and showed insulin resistance (Non-patent Document 4).
  • mice lacking 11 ⁇ -HSD1 had a slight increase in blood glucose resulting from the induction of insulin resistance when loaded with a high-fat diet (Non-patent Document 5).
  • 11 18-Compound that specifically inhibits HSD1 enzyme activity (hereinafter referred to as “Compound ⁇ ”) was evaluated in ob / ob, db / db, and KK / A y pathological model mice. It showed medicinal effects such as improvement of insulin resistance and correction of hyperglycemia.
  • Compound A is also useful for the treatment or prevention of diabetes, X syndrome, obesity, glaucoma, hyperlipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, osteoporosis, tuberculosis, depression, viral diseases and inflammatory diseases. It is described that it is effective (Patent Document 1 and Non-Patent Document 6). Based on these findings, 11 ⁇ -HSD1 increases the activity in adipose tissue, leading to a metabolic disorder centered on insulin resistance, and the compound that inhibits the enzyme activity has the effect of improving insulin resistance in diabetes. Has been proven.
  • compound B An antisense molecule in which each nucleoside is linked with phosphorothioate and the sugar part of some nucleosides is 2 and is modified with 0- (2-methoxy) ethyl (MOE). ") Is known (Patent Document 2).
  • Patent Document 1 International Patent Publication WO0190092
  • Patent Document 2 US Patent Publication US20030198965A1
  • Non-Patent Document 1 M. Boscaro et al. (2001) Lancet 357: 783-791
  • Non-Patent Document 2 E. Rask et al. (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 3330-3336
  • Non-Patent Document 3 JW Tomlinson et al. (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 57-62
  • Non-Patent Document 4 H. Masuzaki et al. (2001) Science 294: 2166-2170
  • Non-Patent Document 5 Y. Kotelevtsev. Et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 14924—1
  • Non-Patent Document 6 P. Alberts et al. (2003) Endocrinology 144: 4755-4762
  • the gist of the present invention is as follows.
  • At least one of the sugars constituting the compound represented by the general formula (I) is 2, -0,4, -C-alkylenated, 2, -0-alkylated, 2, -0 -Alkyelated or 2, -0-alkylated)
  • each X is independently a group represented by the following formula (XI) or ( ⁇ 2): [0031] O
  • Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an alkoxy, alk-oxy or alkynyloxy group having 1 to 6 carbon atoms
  • Z is each independently a single bond or a carbon number of 1 to 5 alkylene groups.
  • A, AA e A e2s , G, GG e2 , G e2s , G e2t , T, T ⁇ TT 2 C, CC e2 and C e2s are respectively the following formulas (A), (A s ) , (A e2 ), (A e2s ), (G), (G s ), (G e2 ), (G e2s ), (G e2t ), (T), (T s ), (T e2 ), (C), (C s ), () and (C e2s ).
  • AAA e A e2s GGG e2 G e2s G e2t TT ⁇ TT 2 CC 5C e2 and 5C e2s are respectively represented by the following formulas (A), (A s ), (A e2 ), (A e2s ), (G), (G s ), (G e2 ), (G e2s ), (G e2t ), (T), (T s ), (T e2 ), (T e2s ), (C), (C s ), ( 5 ) and ( 5 C e2s ).
  • “11 18 -hydroxysteroid dehydrogenase type 1” means cortisone which is an inactive glucocorticoid, or 11 ⁇ dehydrogenated corticosterone.
  • Nucleic acid molecule encoding 11 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase type 1 means a gene (DNA) of a region encoding 11 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase type 1,
  • the concept includes transcribed RNA (mRNA precursor, including (mature) mRNA), and cDNA reverse transcribed from this RNA.
  • Oligonucleotide refers to not only oligo DNA and oligo RNA, but also those in which at least one D-ribofuranose constituting the oligonucleotide is 2 and 0-alkylated, and at least one constituting the oligonucleotide.
  • One D-ribofuranose, 2, -0-alkenylated, at least one D-ribofuranose force 3 ⁇ 4, -0-alkynylylated, constituting oligonucleotide At least one D-ribofuranose force S2'-0, 4'-C-alkylene-modified, at least one phosphate constituting the oligonucleotide is thioated, at least one constituting the oligonucleotide Also included are those in which individual base groups are modified, or combinations thereof.
  • Antisense oligonucleotide refers to an oligonucleotide that can regulate (eg, suppress or enhance) the expression of a specific target gene, and target nucleic acid molecules (sense strands). Have complementary sequences.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention and pharmacologically acceptable salt thereof can suppress the action of 11 18-HSD1, It is effective in the prevention and treatment of metabolic diseases such as diabetes and hypertension.
  • This specification includes the contents described in the Japanese patent application, Japanese Patent Application No. 2004-345270, which is the basis for priority of the present application, and the Z or drawings. Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows the mechanism of action of antisense oligonucleotides.
  • FIG. 2 Shows the structure of DNA, RNA, and PS ODN and the N and S conformations.
  • FIG. 3 shows the structure of an RNA-type modified nucleotide used in the antisense method.
  • FIG. 4 shows an antisense design using RNA-modified nucleotides.
  • FIG. 5 shows 11 jS -HSDl mRNA suppression by antisense oligonucleotide.
  • FIG. 6 shows 11 iS -HSDl mRNA suppression in mouse subcutaneous adipose tissue by antisense oligonucleotides.
  • the antisense method using a synthetic oligonucleotide is applied not only to the use as a medicine for diseases such as cancer and viruses, but also to the evaluation of target genes in drug development.
  • the mechanism of action of oligonucleotides used in the antisense method is based on the basic concept of binding to and acting on RNA in the living body, as shown in Fig. 1.
  • RNase H is a double strand formed by antisense oligonucleotide and mRNA It is known to recognize and degrade RNase H 3 ⁇ 4 RNA to inhibit mRNA function (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (2003)). Of these three, the most commonly used is the use of the action of RNase H in (3).
  • the antisense oligonucleotide used in this case is a DNA-type oligonucleotide.
  • oligonucleotide having a DNA type and having a phosphate group modified is used.
  • phosphorothioate-type modified oligonucleotides (3: PS 0 DN) are nuclease-resistant and become RNase H substrates when they form a double strand with RNA. It is most commonly used because it has a certain degree of cell permeability (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (2003) .; RS Geary, SP Henry, L.
  • PS ODN is more RNA than natural DNA. It has been reported that there is a decrease in the binding force to the protein, the presence of non-specific protein binding, the inhibition of the blood coagulation system and the activity of the complement system in in vivo adaptation.
  • a number of artificial nucleic acids designed using RNA backbones have been reported as antisense oligonucleotides that overcome the disadvantages of PS ODN (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 ( 2003) .; SM Freier, KH Altmann, Nucleic Acids Res., 25, 4429 (1997).).
  • the furanose ring of a sugar constituting a nucleic acid mainly forms two puckering modes, an N-type conformation and an S-type conformation as shown in FIG. 2 (W. Saenger, Principles of nuclei c acids structure, Springer- Verlag, New York. 1984.) 0 ' having a hydroxyl group in position 2' 2 of the ribose constituting the nucleoside with RNA backbone oxygen atom and the 4 'position of the -OH group
  • the ratio of N-type conformation increases as the conformation of ribose's furanose ring due to the Gauche effect of oxygen atoms.
  • Nucleosides with a DNA skeleton have a hydrogen atom at the 2 ′ position of ribose, so the Gauche effect seen in the RNA skeleton is not seen and the S-type conformation is given priority.
  • nucleosides also exist in the N-type conformation in the A-type helix formed by natural double-stranded RNA.
  • Tm melting temperature
  • the stability of double strands formed by RNA is reported to be much stronger than the stability of double strands formed by DNA and RNA (W. Saenger, Principles of nucleic acids structure, Springer- (Verlag, New York. 1984.) 0
  • Tm melting temperature
  • RNA skeleton resistant to RNase Since the 2, -OH group of RNA is essential for RNase degradation, a number of derivatives have been reported that alkylate this 2, -OH group to form a 2'-0-alkyl nucleoside (4) that does not become an RNase substrate. (Fig. 3). Among them, 2'-0-methyl is a modification found in tRNA and has been used and studied well since the early days of antisense research (H. Inoue, Y.
  • a nucleoside having a 2, -0- (2-methoxyethyl) group (5: 2'-MOE), which has a substituent at the end of the alkyl group, has an affinity for RNA due to the Gauche effect of the methoxyethyl group.
  • a Tm / mod. + 2 ° C) and has nuclease metastases (P. Martin, Helv. Chim. Acta 78, 486 (1995) .; M. Teplova, G. Minasov, V. Tereshko, GB Inamati, P. Dan Cook, M. Manoharan, M. Egli, Nature Struct. Biol. 6, 535 (1999).).
  • Oligonucleotides with nucleosides (7: 2, -F) substituted with -OH groups at 2, -F form in favor of the N-type conformation and also have high affinity for RNA (A Tm / mod. + 2.5 ° C) (AM Ka wasaki, MD Casper, SM Freier, EA Lesnik, MC Zounes, LL Cummins, C.
  • 2,4, -BNA / LNA is an artificial nucleic acid that is completely anchored to the N-type conformation of RNA, with the 2'-oxygen atom and 4'-carbon atom of the sugar moiety bridged by a methylene chain.
  • (8: bridged nucleic acids / locked nucleic acids) has been reported (S. Obika, D. Nanbu, Y. Hari, K. Morio, Y. In, T. Ishi da, T. Imanishi, Tetrahedron Lett. , 38, 8735 (1997) .; S. Obika, D. Nanbu, Y. Hari, J. Andoh, K. Morio, T. Doi, T. Imanishi.
  • oligonucleotides containing 2 ′, 4′-BNA / LNA have improved stability against nucleases compared to DNA.
  • Has C, plus 2,4,-nuclease stability better than BNA / LNA K. Morita, C. Hasegaw a, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. Sone, T. Ishikawa, T. Imanishi, M. Koizumi, Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 73 (2002) .; K. Morita, M.
  • RNA-type modified antisense oligonucleotide forms a stable duplex with the target RNA as described above.
  • Oligonucleotide “lly modified oligonucleotidesj” (hereinafter abbreviated as “FMO”), which also has the ability to modify RNA-type nucleotides, has an extremely strong binding power to mRNA.
  • FMO partially modified oligonucleotidesj
  • Figure 1 (1) From mRNA Inhibition of the translation process of protein synthesis, (2) The ability of the precursor of mRNA is also very useful for the purpose of inhibiting the splicing process of mRNA.
  • the double strand of FMO and target RNA does not become a substrate for RNase H (H. Inoue, Y. Hayase, S.
  • a chimeric oligonucleotide composed of an RNA-type modified nucleoside and DNA is used in the antisense method!
  • the design includes a “gapmer” that has RNA-modified nucleotides called wings on both sides of the oligonucleotide and a continuous DNA called window in the middle.
  • the gapmer has a wing-window-wing structure.
  • 2, -0-methyl nucleoside 2, -OMe RNA
  • a chimeric oligonucleotide such as 2, -OMe RNA-DNA-2'-OMe RNA is obtained. Since gapmer has a continuous DNA region in the central part, the double strand of gapmer and target RNA becomes a substrate of RNase H. The length of DNA in this window varies depending on the RNase H used.
  • human RNase HI has 4 nucleotides or more (H. Wu, WF Lima, ST Crooke, J Biol. Chem.
  • E. coli RNase H requires 5 nucleotides or more (WF Lima, ST Crooke, Biochemistry 36, 390 (1997)). The longer the DNA region of the window part, the easier it becomes a substrate for RNase H Repair of wing part
  • the decorated nucleotide is intended to increase the affinity with the target RNA, and the longer the length, the higher the affinity with the target RNA. In terms of activity as an antisense, it is necessary to balance the length of window and wing, and the good one can be highly active (EA Lesnik, CJ uuinosso, AM Kawasaki, H. Sasmor, M. Zounes, LL Cummins, DL Ecker, P.
  • 2,4,-BNA / LNA is used for wing as well as 2, - ⁇ , and antisense as a gapmer is designed.
  • Antisense containing 2,4, -BNA / LNA targeting rat delta opioid receptor mRNA was designed, and when injected into rat cerebrospinal fluid, suppression of pain response via opioid receptor was observed.
  • the phosphodiester bond is used without modification, and its pharmacokinetics is mainly distributed in the kidney and may be excreted from the urine. It is shown.
  • 2,4, -BNA / LNA which has strong binding power to RNA, has been shown to bind to HIV-1 TAR RNA and inhibit Tat function using a mixmer with 2, -OMe RNA. Yes.
  • the mixmer and TAR RNA form a peudoknot structure and become a stable complex (A. Arzumanov, AP Walsh, VK Rajwanshi, R. Kumar, J. Wengel). , MJ Gait, Biochemistry 40, 14645 (2001).).
  • ENA also showed that gapmers for organic-on transporters involved in drug transport can specifically cleave three subtypes with similar base sequences (M Takagi, K. Morita, D. Nakai, R. Nakagomi, T. Tokui, M. Koizumi, Bi ochemistry, 43, 4501 (2004).) 0 Also, a chimeric oligonucleotide consisting of ENA and 2, -OMe RNA promotes the exon skipping reaction of the dystrophin gene, which is the causative gene of muscular dystrophy, and may be a therapeutic method. (M. Yagi, Y. Takeshima, A. Surono, M. Takagi, M. Koizumi, M.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention is an antisense oligonucleotide having 15 to 19 bases targeting a nucleic acid molecule encoding 11 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase type 1.
  • nucleic acid molecules encoding 11 j8-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 include mature mRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 16, or 18, a precursor of mature mRNA, and type IV DNA. Can do.
  • Examples of the 11 j8-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 include those having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 17 and 19.
  • An example of the base sequence of the antisense oligonucleotide of the present invention is shown in SEQ ID NO: 3. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, all or part of T may be replaced with U.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention has 15 to 19 bases, preferably 16 to 18 bases.
  • At least one of the sugars is 2, -0,4, -C-alkylated, 2, -0-alkylated, 2, -0-alkalylated or Although it is 2, -0-alkylated, other than that, sugar, base, and phosphodiester bonds may be modified.
  • sugar modifications include 2'-0-alkylation, 2, -0-alkylation or 2, -0-alkylation of D-ribofuranose (eg, 2'-0-methyl).
  • D-ribofuranose eg 2'-0,4'-C-e
  • Examples of base modifications include , Cytosine 5-methylation, 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N4-methylation, thymidine 5-demethylation (uracil), 5-fluorination, 5-bromination, 5 -Neomethylation, N6-methylation of adenine, 8-bromination, N2-methylation of guanine, 8-bromination and the like.
  • Examples of phosphoric acid diester bond modifications include phosphorothioate bonds, methyl phosphonate bonds, methylthiophosphonate bonds, phosphorodithioate bonds, phosphoramidate bonds, and the like.
  • Bg is a group represented by the above formula (G1) or (G2)
  • Bt is a group represented by the above formula (T1) or (T2)
  • Be is the above A group represented by the formula (Cl), (C2), (C3) or (C4)
  • Ba is a group represented by the above formula (A1) or (A2)
  • Bgt is the above formula.
  • an alkoxy, alkoxy or alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms examples include methoxy, aminoethoxy, propoxy, allyloxy, methoxyethoxy, butoxy, pentyloxy, propargyloxy, etc., preferably an alcohol having 1 to 3 carbon atoms. It is a xy group.
  • Examples of the alkylene group having 1 to 5 carbon atoms for Z in the formulas (G2), (A2), (C3), (C4), (T2) and (GT2) include a methylene group, ethylene Group, propylene group, tetramethylene group, pentamethylene group and the like.
  • Z is preferably a single bond or a methylene group, more preferably a methylene group.
  • G — GC “AG s — C s — A s — A s — T s — G s — T s — A e2s — G s — T ezs — G ezt — H e2s r e2s ⁇ ⁇ e2s
  • (1)-(6) are those in which 2, -0,4, -C-ethylenated ribofuranose is arranged at 4 or 5 ends.
  • (7)-(12) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (bonded with guanine) in (1)-(6). It is replaced with Su (guanine bond).
  • (13)-(18) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (guanine linked) in (1)-(6) with deoxyribofuranos It is replaced with Su (guanine bond).
  • (19)-(24) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (guanine bond) in (1)-(6) with 4 doxyribofuranos It is replaced with Su (guanine bond).
  • (25)-(30) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (guanine linked) in (1)-(6) with 4 doxyribofuranos Substitute for one of the 2, -0,4, -C-ethyleneiated ribofuranose (adenine bound) instead of deoxyribofuranose (adenine bound) Is.
  • (31)-(60) all phosphoric acids constituting the compounds of (1)-(30) are replaced with phosphorothioates.
  • (61)-(120) the cytosine constituting the compound of (1)-(60) is all replaced with 5-methylcytosine.
  • (121H240) replaced all 2,0,4, -C-ethylenated ribofuranose in (1H120) with 2,0,4, -C-methyleneated ribofuranose, respectively.
  • Is. (241)-(480) is obtained by adding 2, -0,4, -C-ethylene or 2, -0,4, -C-methylene-5-methylcytosine as described in (1)-(240), -0,4, -C-ethylene or 2'-0,4'-C-methylenecytosine.
  • the term “pharmacologically acceptable salt thereof” refers to the antisense oligonucleotide of the present invention (for example, the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 3) or A salt of a compound represented by the general formula (I), such as a sodium salt or a potassium salt.
  • Alkali metal salts such as lithium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, metal salts such as aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts and cobalt salts;
  • Inorganic salts such as salt, toctylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, darcosamine salt, ferroglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methyldarcamamine salt, guanidine salt, jetylamine salt, triethylamine Mine salt, dicyclohexylamine salt, N, N, monodibenzylethylenediamine salt, black mouth pro-in salt, pro-in salt, diethanolamine salt, N-benjirofu enethylamine salt, pipette Amine salts such as organic salts such as radine salts, tetramethylammonium salts, tris (hydroxymethyl) aminomethane salts; hydrogen fluoride
  • the compound represented by the general formula (I) can also exist as a solvate (preferably a hydrate), and such a solvate is also encompassed in the present invention. .
  • the antisense oligonucleotide of the present invention and the compound represented by the general formula (I) (hereinafter referred to as "the compound of the present invention") and pharmacologically acceptable salts thereof are: Use as an experimental reagent to suppress steroid steroid dehydrogenase type 1 expression or as a pharmaceutical.
  • the compound of the present invention is effective as a medicament for use in the treatment and prevention of metabolic diseases such as diabetes and hypertension.
  • the compound of the present invention is described in the literature (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (198 4)) using a commercially available synthesizer (for example, model 392 by the phosphoramidide method of Perkin Elmer Co., Ltd.). It can be synthesized according to the method.
  • Phosphoramida used at that time Iit reagents include natural nucleosides and 2'-0-methyl nucleosides (ie 2'-0-methylguanosine, 2'-0-methyladenosine, 2'-0-methylcytosine, 2'-0-methyluridine). ), Commercially available reagents can be used.
  • 2'-0-alkylguanosine, adenosine, cytosine and uridine having 2 to 6 carbon atoms in the alkyl group are as follows.
  • 2'-0-aminoethylguanosine, adenosine, cytosine, uridine can be synthesized according to the literature (Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.).
  • 2-0-propylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine can be synthesized according to the literature (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.).
  • reagents can be used for 2'-0-arylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine.
  • adenosine, 5-methylcytosine and thymidine 2 'having 2 to 5 carbon atoms of the alkylene group according to the method described in W099 / 14226 -0,4'-C-alkyleneguanosine, adenosine, 5-methylcytosine, cytosine and thymidine can be produced according to the method described in WO00 / 47599.
  • T ETD tetraethylthiuram disulfide
  • Beaucage reagent Glen Research
  • An antisense oligonucleotide having a phosphorothioate bond can be synthesized by reacting a reagent such as tantalum hydride (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253). (1990), PCT / W098 / 54198).
  • CPG controlled pore glass
  • commercially available products having 2 and 0-methyl nucleoside bonded can be used.
  • 2'-0, 4'-C-methylenguanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine 2'-0 having 2 to 5 carbon atoms in the alkylene group according to the method described in W099 / 14226.
  • 3 ' amino—Modifier C3 and PG
  • 3 amino—Modiner C7 CPG, ulyceryl and PG, (ulen Resear ch)
  • 3 and specer C3 SynBase CPG 1000 3 and specer C9 SynBase CPG 1000 (link techn ologies) Can be used to synthesize an oligonucleotide having a hydroxyalkyl phosphate group or an aminoalkyl phosphate group bonded to the 3 ′ end.
  • the compound of the present invention and a pharmacologically acceptable salt thereof can suppress the action of 11 ⁇ -HSD1.
  • the compound represented by the general formula (I) and a pharmacologically acceptable salt thereof are highly resistant to nuclease with high binding ability to RNA, and can also be subjected to mRNA degradation by RNase H. . Therefore, the compounds of the present invention and pharmacologically acceptable salts thereof are effective for the treatment and prevention of metabolic diseases such as diabetes and hypertension.
  • the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is used as a therapeutic / preventive agent for metabolic diseases such as diabetes or hypertension
  • the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is used as a therapeutic / preventive agent for metabolic diseases such as diabetes or hypertension
  • the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is mixed with itself or an appropriate pharmacologically acceptable excipient, diluent, etc., and orally by tablet, capsule, granule, powder or syrup, or injection, It can be administered parenterally with suppositories, patches, or external preparations.
  • excipients for example, sugar derivatives such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, neutral starch, alpha starch, dextrin; crystals Cellulose derivatives such as cellulose; gum arabic; dextrane; organic excipients such as pullulan; silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, magnesium magnesium aluminosilicate; calcium hydrogen phosphate Phosphates; carbonates such as calcium carbonate; inorganic excipients such as sulfates such as calcium sulfate), lubricants (eg stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate) Stearic acid metal salt; talc; colloidal silica; Boric acid; Adipic acid; Sulfate such as sodium sulfate; Daricol; Fumaric acid; Sodium benzoate;
  • excipients for example,
  • the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention is preferably 0.05 to 5 ⁇ mols Zml of the compound of the present invention.
  • a pharmacologically acceptable salt thereof 0.02 to 10% wZv carbohydrate or polyhydric alcohol and 0.01 to 0.4% wZv pharmacologically acceptable surfactant.
  • a more preferable range of the content of the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is 0.1 to 1 oles, ml.
  • the carbohydrate is particularly preferably a monosaccharide and a Z or disaccharide.
  • these carbohydrates and polyhydric alcohols include glucose, galactose, mannose, latatose, maltose, mannitol and sorbitol. These can be used alone or in combination.
  • surfactant examples include polyoxyethylene sorbitan mono-triester, alkylphenol polyoxyethylene, sodium taurocholate, sodium cholate, and polyhydric alcohol ester. Of these, particularly preferred are polyoxyethylene sorbitan mono-triesters, and particularly preferred as esters are oleate, laurate, stearate and palmitate. These may be used alone or in combination.
  • the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention is more preferably 0.03 to 0.09 M of a pharmacologically acceptable neutral salt such as sodium chloride salt, potassium salt and Z salt. Contains calcium.
  • the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention may more preferably contain 0.002 to 0.05 M of a pharmacologically acceptable buffer.
  • buffering agents include sodium citrate, sodium glycinate, sodium phosphate, tris (hydroxymethyl) aminomethane. These buffering agents may be used alone or in combination.
  • the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention may be supplied in a solution state. However, in cases where it is necessary to preserve for a certain period of time, it is usually preferable to freeze-dry in order to stabilize the antisense oligonucleotide and prevent a decrease in the therapeutic effect.
  • the solution may be reconstructed with a solution (eg, distilled water for injection), that is, in a liquid state to be administered. Therefore, the therapeutic / prophylactic agent of the present invention includes those in a lyophilized state for reconstitution with a solution so that each component is in a predetermined concentration range. For the purpose of promoting the solubility of lyophilizate, albumin, glycine, etc. You can add more amino acids.
  • the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is administered to a human, for example, about 0.1 to 100 mg / kg (body weight) per day, preferably 1 to 50 mg / kg It is recommended to administer orally or intravenously in one or several divided doses in kg (body weight), but the dose and number of doses should be changed appropriately depending on the type of disease, symptoms, age, method of administration, etc. sell.
  • Administration of the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof to a diabetic patient can be performed, for example, as follows. That is, the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is produced by a method well known to those skilled in the art, and sterilized by a conventional method, for example, a 1200 gZml solution for injection is prepared. This solution is administered intravenously, for example in the form of an infusion, so that the dosage of antisense oligonucleotide is, for example, 20 mg / kg body weight.
  • Administration is repeated, for example, 4 times at 1-week intervals, and thereafter this treatment is repeated as appropriate while confirming the therapeutic effect using 11 18 -HSD1 expression in the subdermal adipose tissue, blood glucose level, and clinical symptoms as indicators. . Continue treatment unless there are therapeutic effects and no obvious side effects.
  • Administration of the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof to a hypertensive patient can be performed, for example, as follows. That is, the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is produced by a method well known to those skilled in the art, and sterilized by a conventional method, for example, a 1200 gZml solution for injection is prepared. This solution is administered intravenously, for example in the form of an infusion, so that the dosage of antisense oligonucleotide is, for example, 20 mg / kg body weight.
  • Administration is repeated, for example, 4 times at 1-week intervals, and thereafter this treatment is repeated as appropriate while confirming the therapeutic effect using 11 18-HSD1 expression in the subdermal adipose tissue, blood pressure, and clinical symptoms as indicators. . Continue treatment unless there are therapeutic effects and no obvious side effects.
  • nucleic acid automatic synthesizer (ABI model 394 DNA / RNA synthesizer, manufactured by PerkinElmer Co., Ltd.), it was performed according to a 1 / z mol scale program.
  • the solvent and reagent used in each synthesis cycle were those manufactured by ABI or Proligo.
  • the concentration of phosphoramidite was 0.1 M.
  • Non-natural type phosphoramidites are disclosed in Example 14 (5, -O-dimethoxytrityl-2, -0,4, -C-ethylene-6-N-benzoyladenosine-3, -0- (2-Cyanoethyl N, ⁇ -diisopropyl) phosphoramidite),
  • Example 27 (5, -0-dimethoxytrityl-2, -0,4, -C-ethylene-2- ⁇ -isobutyrylguanosine-3, -0- (2-cyanoethyl ⁇ , ⁇ -diisopropyl) phosphoramidite)
  • Example 22 (5, -0-dimethoxytrityl-2, -0,4, -C-ethylene-4- ⁇ -benzoyl-5 -Methylcytidine-3, -0- (2-cyanoethyl ⁇ , ⁇ -diisopropyl) phosphoramidite),
  • Example 9 (5, -0-dimethoxyt
  • the oligomer was also excised as a support, and the protecting group cyanoyl group on the phosphorus atom and the protecting group on the nucleobase were removed.
  • the compounds are negative ions ES
  • the base sequence of this compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
  • Example 2 having the target sequence in the same manner as the compound of Example 1 was synthesized using 1.2 mol of C PG as in Example 1.
  • reverse-phase HPLC Shield-phase HPLC (Shimadzu LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP—18e (4.6 X 100mm)
  • a solution 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0
  • B solution acetonitrile, B%: 10% ⁇ 50% (10 min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm), and the peak of the target compound having a dimethoxytrityl group was collected. .
  • TEAA TEAA was removed by adding water and distilling off under reduced pressure. An 80% aqueous acetic acid solution (200 1) was added and the mixture was allowed to stand for 20 minutes to deprotect the dimethoxytrityl group. After the solvent was distilled off, the residue was dissolved in 1 ml of water, washed with ethyl acetate, and then filtered through a 0.45 ⁇ m filter (MILLIPORE, Ultrafree-MC) to obtain the target oligonucleotide.
  • MILLIPORE Ultrafree-MC
  • This compound consists of reversed-phase HPLC (Shimadzu LC-10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0, B solution: 25% acetonitrile, 0.1 M triethylamine acetate aqueous solution (TEAA), pH 7.0, B%: 30% ⁇ 80% (10 min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm) Then, it was eluted at 6.10 minutes (21.1 A units) ( ⁇ m
  • the base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
  • Example 3 having the target sequence in the same manner as the compound of Example 1 was synthesized using 1.2 mol of C PG as in Example 1.
  • reverse-phase HPLC Shield-phase HPLC (Shimadzu LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP—18e (4.6 X 100mm)
  • a solution 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0
  • B solution acetonitrile, B%: 10% ⁇ 50% (10 min, linear gradient) 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm) to collect the peak of the target compound having dimethoxytrityl group .
  • TEAA TEAA was removed by adding water and distilling off under reduced pressure. Add 80% acetic acid aqueous solution (200 1) and let stand for 20 minutes to deprotect the dimethoxytrityl group. After distilling off the solvent, the residue is dissolved in lml water, washed with ethyl acetate, Filtration through a 0.45 ⁇ m filter (MILLIPORE, Ultrafree-MC) gave the desired oligonucleotide.
  • MILLIPORE Ultrafree-MC
  • this compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 5642.83, measured value: 5642.71).
  • the base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
  • Example 4 having the target sequence in the same manner as the compound of Example 1 was synthesized using 1.2 mol of C PG as in Example 1.
  • reverse-phase HPLC Shield-Coupled Device LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP—18e (4.6 X 100mm)
  • a solution 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0
  • the peaks of the target having a til group were collected.
  • the base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
  • Example 5 Using the nucleic acid automatic synthesizer (ABI model 394 DNA / RNA synthesizer manufactured by Perkin Elma Co., Ltd.), the compound of Example 5 having the target sequence was synthesized using a 10 mol scale program. Solvents and reagents used in each synthesis cycle were those manufactured by ABI or Proligo. The concentration of phosphoramidite was 0.1 M. The non-natural phosphoramidite described in Patent No. 3420984 was used as in Example 1. In the sulfurization reaction, xanthan hydride (Tokyo Kasei) was used as a 0.02 M pyridine / acetonitrile (1/9) solution.
  • xanthan hydride Tokyo Kasei
  • the oligomer is also supported by treating with concentrated aqueous ammonia (60 ° C, about 5 hours).
  • concentrated aqueous ammonia 60 ° C, about 5 hours.
  • the protecting group Cyanethyl group on the phosphorus atom and the protecting group on the nucleobase were removed.
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, and the remaining residue was subjected to reverse-phase HPLC (LC — 10VP column manufactured by Shimadzu Corporation (GL Science Inc., Inertsil PREP— ODS (30 ⁇ 250 mm)), solution A: 5% acetonitrile.
  • TEAA triethylamine acetate
  • solution B 60% acetonitrile
  • TEAA B% 15% ⁇ 60% (20 min, linear gradien t)
  • 40 ° C 20 mL
  • the fraction was eluted at 18.04 minutes, and the solvent was distilled off, then 80% aqueous acetic acid was added and left for 20 minutes to remove the DMTr group.
  • This compound is ion-exchange HPLC (column Tosoh TSK-gel DEAE-5PW (7.5 x 75 mm)); solution A: 20% acetonitrile, solution B: 20% acetonitrile, 67 mM phosphate buffer (pH 6.8), When analyzed at 1.5 MK Br, gradients solution 30% ⁇ 70% (10 min, linear geadient); 60 ° C; 2 mL / min), it was eluted at 5.40 minutes. This compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 595 5.96, measured value: 5955.97).
  • the base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM-005525).
  • CPG was filtered, washed in turn with methanol and dichloromethane, and 2 kinds of CBI reagent (Acetate / Pyridine / Tetrahydrofuran and Acetic Anhydride / Pyridine / Tetrahydrofuran) for the Biosynthesis Systems DNA Synthesizer ABI392 were added to CPG. 20 mL each and left for 5 minutes.
  • the dimethoxytrityl group was deprotected, and the operation was separated.
  • Ion exchange resin dowex (The 'Dow' Chemical 'force, manufactured by Impani, 50W-X8, 100-200 MESH) And converted to sodium salt with Dowex sodium foam, and the target compound was obtained after distilling off the solvent.
  • the antisense oligonucleotide of the example with respect to 11 jS -HSDl was introduced into the obtained cell line, and then the intracellular 11 j8 -HS DlmRNA was quantified to evaluate the mRNA inhibitory effect of the compound of the example.
  • RNA solution Dispense 0.51 of this total RNA solution into a microtube for thermal cycler, and use TaqMan reverse transcription kit (Applied Biosystems) 10x reaction buffer 2.5 ⁇ 10 mM dNTP mixture 5 1, 25 mM magnesium sulfate solution 5.5 ⁇ 1
  • Oligonucleotides (manufactured by Invitrogen) were used.
  • oligonucleotide (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan) in which a reporter dye Fam was bound to the 5 ′ end and a reporter quencher Tamra was bound to the 3 ′ end was used.
  • Oligonucleotides (manufactured by Invitrogen) were used. As a human 36B4 probe, it has the following sequence: 5'-ATGGCAGCATCTACAACCCTGAAGTGCT-3, (SEQ ID NO: 9), the reporter dye Fam at the 5 'end, and the reporter quencher Tam ra at the 3' end. was used (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan).
  • PCR reaction was performed on a MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems Japan).
  • the composition of the reaction solution is 1 ⁇ l of TaqMan PCR vertical stranded cDNA solution 2.5 ⁇ 1, TaqMan PCR primer (50 pmol / ⁇ 1) prepared in both forward and reverse directions.
  • the reaction was incubated at 50 ° C for 2 minutes and at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 reactions of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute, and the amount of reporter dye emitted per cycle.
  • An amplification curve of 36B4, 11 j8-HSD1 was prepared from the amount of luminescence of the reporter dye in each cycle.
  • Each oligonucleotide was prepared immediately before administration with a stock solution dissolved in physiological saline to give a final dose at a dose of lml I 100 g body weight. Injection into the peritoneal cavity for a week. The control group received the same dose of physiological saline. Food ⁇ General behavior was checked at least once daily. On day 21, the mice were sacrificed by decapitation and the subcutaneous adipose tissue was immediately removed, frozen in liquid nitrogen and stored at 80 ° C. Total RNA was extracted from these tissues in order to evaluate the mRNA expression inhibitory effect.
  • TRIzol solution manufactured by Invitrogen
  • a Polytron homogenizer manufactured by Kinematic Power Company
  • RNA was purified using RNeasy mini (manufactured by Kagen) according to the attached protocol.
  • the resulting crude purified total RNA was dissolved in buffer RLT (Qiagen) at a final concentration of 1% and 2-mercaptoethanol (Shida) was added in 350 ⁇ 1, and an equal volume of 70% EtOH (sum) (Made by Kojun Pharmaceutical Co., Ltd.) was added and mixed.
  • Total RNA was purified from this solution according to the attached protocol.
  • the obtained total RNA solution was treated by using a DNAfree kit (Ambion) as usual to digest genomic DNA.
  • TaqMan reverse transcription kit Applied Biosystems 10x reaction buffer 2.5 ⁇ 1, 10 mM dNTP mixture 5 ⁇ 1, 25 mM magnesium sulfate solution 5.5 1, Oligo-
  • Oligonucleotides (manufactured by Invitrogen) were used. In addition, the following sequences are used as probes for TaqMan PCR reaction:
  • oligonucleotide (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan) in which a reporter dye Fam was bound to the 5 ′ end and a reporter quencher Tamra was bound to the 3 ′ end was used.
  • oligonucleotide (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan) in which a reporter dye Fam was bound to the 5 ′ end and a reporter quencher Tamra was bound to the 3 ′ end was used.
  • the PCR reaction was performed on a MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (manufactured by Applied Systems Japan).
  • the composition of the reaction solution was 1 ⁇ l of TaqMan PCR-type single-stranded cDNA solution 2.5 ⁇ 1, TaqMan PCR primer (50 pmol / ⁇ 1) prepared in both forward and reverse directions.
  • the reaction was incubated at 50 ° C for 2 minutes and at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 reactions of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute, and the amount of reporter dye emitted per cycle.
  • An amplification curve of 36B4, 11 j8-HSD1 was prepared from the amount of luminescence of the reporter dye in each cycle.
  • a mixture of the compound of Example 1 in a digestible oil such as soybean oil, cottonseed oil or olive oil is prepared and injected into gelatin with a positive displacement pump to contain 100 mg of active ingredient Soft capsules are obtained, washed and dried.
  • a coating is applied.
  • N- ( ⁇ -trimethylammo-oacetyl) 1-didodecyl 1-D-glutamate chloride (final concentration 30 nmol / mL)
  • dilauroylphosphatidylcholine final concentration 60 nmo / mL
  • dioleoylphosphatidylethanolamine final concentration 60 nmol / mL
  • the compound of Example 2 was stirred in 10% by volume propylene glycol and then sterilized after making the water for injection a constant volume.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention and pharmacologically acceptable salt thereof can suppress the action of 11 18-HSD1, It is effective in the prevention and treatment of metabolic diseases such as diabetes and hypertension. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the mature mRNA of human 11 j8-HSD1 (Accession No. NM_05525 registered in EMBL / GenBank).
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of human 11 j8-HSD1 (encoded by mRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 3 is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of the human 11 jS-HSDl DNA sequence (Accession No. NM — 005525 registered in EMBL / GenBank).
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of a primer used for the reaction of human 11 j8-HSD1 quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of a primer used in the reaction of human 11 j8-HSD1 quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
  • SEQ ID NO: 6 shows the base sequence of the probe used for the reaction of human 11 j8-HSD1 quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in the reaction of human 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
  • SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of a primer used in the reaction of human 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
  • SEQ ID NO: 9 shows the base sequence of the probe used for the reaction of human 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
  • SEQ ID NO: 10 is used for the reaction of mouse 11 jS-HSDl quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
  • V shows the base sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 11 is used for the reaction of mouse 11 jS-HSDl quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
  • V shows the base sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 12 is used for the reaction of mouse 11 jS-HSDl quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
  • V shows the nucleotide sequence of the probe.
  • SEQ ID NO: 13 is used for the mouse 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR reaction used in Test Example 2.
  • V shows the base sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 14 is used for the reaction of mouse 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
  • V shows the base sequence of the primer.
  • SEQ ID NO: 15 is used for the reaction of mouse 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
  • V shows the nucleotide sequence of the probe.
  • SEQ ID NO: 16 is the nucleotide sequence of the mature mRNA of human 11 j8-HSD1 (registered in EMBL / GenBank) Accession No. NM_181755).
  • SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of human 11 jS-HSD1 (encoded by the mRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 16).
  • SEQ ID NO: 22 shows the base sequence of mouse 11 j8-HSD1 mature mRNA (Accession No. NM_008288 registered in EMBL / GenBank).
  • SEQ ID NO: 19 shows the amino acid sequence of mouse 11 jS-HSD1 (encoded by mRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 24).
  • SEQ ID NO: 20 shows the base sequence of the antisense molecule disclosed in US20030198965.

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Abstract

An antisense oligonucleotide of 15 to 19 bases targeting a nucleic acid molecule coding for 11β-hydroxylated steroid dehydrogenase type 1, wherein at least one of the sugars as constituents of the antisense oligonucleotide is 2’-O,4’-C-alkylenated, or 2’-O-alkylated, or 2’-O-alkenylated, or 2’-O-alkynylated; or a pharmacologically acceptable salt of the antisense oligonucleotide. Further, there is provided an inhibitor, or pharmaceutical composition, for expression of 11β-hydroxylated steroid dehydrogenase type 1, comprising the above antisense oligonucleotide.

Description

11 β - HSD1アンチセンス化合物  11 β-HSD1 antisense compound
技術分野  Technical field
[0001] 本発明は、その過剰な発現によりインスリン抵抗性、高血圧等が惹起される事が知 られている 11 18 - HSD1の働きを抑制することにより、糖尿病、高血圧等の代謝性疾患 の治療'予防に有効である新規 11 β -HSD1アンチセンス化合物に関する。  [0001] The present invention is known to induce insulin resistance, hypertension and the like due to its excessive expression. 11 18-Treatment of metabolic diseases such as diabetes and hypertension by suppressing the action of HSD1 'Relates to novel 11β-HSD1 antisense compounds that are effective in prevention.
背景技術  Background art
[0002] ダルココルチコイドは副腎皮質で合成、放出されるステロイドホルモンの一種で、細 胞核内に存在する受容体タンパク質と結合しシグナルを伝達する事により糖'脂質代 謝、血圧調節など多彩な機能を発揮する。副腎皮質に生じた腫瘍カゝらダルココルチ コイドが過剰産生される事により、内臓脂肪の過剰蓄積、糖尿病、高脂血症、高血圧 等の症状を呈する事が知られている（非特許文献 1)。一方、ダルココルチコイドは畐 IJ 腎のみならず各組織の細胞内で局所的に活性ィ匕されており、この活性化に 11 j8 -hy droxysteroid dehydrogenasel(ll j8 -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型、 11 j8 - HSD1) が関与している。肥満に由来する代謝性疾患において、特に内臓脂肪組織中の 11 β - HSD1活性が亢進して 、ると 、う研究結果が報告されて 、る（非特許文献 2)。血 中ダルココルチコイド濃度が高値でありながら 11 β -HSD1活性が低下しているために 代謝性疾患様の徴候を示さない症例が報告されている事からも、 11 j8 - HSD1活性に よる局所的なダルココルチコイドの活性ィ匕が代謝性疾患と密接に関連していると考え られる (非特許文献 3)。脂肪組織特異的に 11 β -HSD1を過剰発現させたマウスは内 臓脂肪蓄積型の肥満を呈し、インスリン抵抗性を示した (非特許文献 4)。また、 11 β - HSD1を欠損したマウスは高脂肪食負荷時のインスリン抵抗性惹起に起因する血糖 上昇が軽微であった (非特許文献 5)。 11 18 - HSD1酵素活性を特異的に阻害するィ匕 合物（以下、「化合物 Α」とする）は、 ob/ob、 db/db、 KK/Ayの各病態モデルマウスを 用いた評価においてインスリン抵抗性の改善、高血糖の是正などの薬効を示した。ま た、化合物 Aが糖尿病、 X症候群、肥満、緑内障、高脂血症、高血糖症、過インシュ リン血症、骨粗鬆症、結核、うつ病、ウィルス病及び炎症性疾患の治療又は予防に 有効であることが記載されている（特許文献 1及び非特許文献 6)。これらの知見より、 11 β -HSD1の脂肪組織における活性亢進によってインスリン抵抗性を中心とした代 謝性疾患が惹起され、その酵素活性を阻害する化合物は糖尿病におけるインスリン 抵抗性の改善作用を有することが証明されている。 [0002] Darcocorticoids are a type of steroid hormone that is synthesized and released in the adrenal cortex and bind to receptor proteins present in the cell nucleus to transmit signals, thereby allowing a variety of sugars, lipid metabolism, and blood pressure regulation. Demonstrate the function. It is known that excessive production of darcocorticoids such as tumor cells in the adrenal cortex causes symptoms such as excessive accumulation of visceral fat, diabetes, hyperlipidemia, and hypertension (Non-patent Document 1). . On the other hand, darcocorticoids are locally activated not only in the IJ kidney but also in the cells of each tissue. 11 j8 -hydroxysteroid dehydrogenasel (ll j8 -hydroxysteroid dehydrogenase type 1, 11 j8-HSD1) is involved. In metabolic diseases derived from obesity, in particular, 11 β -HSD1 activity in visceral adipose tissue is enhanced, and research results have been reported (Non-patent Document 2). 11 j8-HSD1 activity has also been reported as a result of reports of cases showing no signs of metabolic disease due to decreased 11 β -HSD1 activity despite high blood darcocorticoid concentrations. It is considered that the active activity of darcocorticoids is closely related to metabolic diseases (Non-patent Document 3). Mice overexpressing 11β-HSD1 specifically in adipose tissue exhibited visceral fat accumulation type obesity and showed insulin resistance (Non-patent Document 4). In addition, mice lacking 11 β-HSD1 had a slight increase in blood glucose resulting from the induction of insulin resistance when loaded with a high-fat diet (Non-patent Document 5). 11 18-Compound that specifically inhibits HSD1 enzyme activity (hereinafter referred to as “Compound Α”) was evaluated in ob / ob, db / db, and KK / A y pathological model mice. It showed medicinal effects such as improvement of insulin resistance and correction of hyperglycemia. Compound A is also useful for the treatment or prevention of diabetes, X syndrome, obesity, glaucoma, hyperlipidemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, osteoporosis, tuberculosis, depression, viral diseases and inflammatory diseases. It is described that it is effective (Patent Document 1 and Non-Patent Document 6). Based on these findings, 11 β -HSD1 increases the activity in adipose tissue, leading to a metabolic disorder centered on insulin resistance, and the compound that inhibits the enzyme activity has the effect of improving insulin resistance in diabetes. Has been proven.
[0003] そのような化合物として、例えば下記の配列  [0003] Examples of such compounds include the following sequences:
5 '-taccaccttctgtagagttt-3 ' (配列番号 20)  5 '-taccaccttctgtagagttt-3' (SEQ ID NO: 20)
を有し、各ヌクレオシド間がホスホロチォエートで結合し、一部のヌクレオシドの糖部 分が 2し0- (2-メトキシ)ェチル (MOE)修飾されたアンチセンス分子（以下、「化合物 B 」とする。 )が知られて 、る（特許文献 2)。  An antisense molecule (hereinafter referred to as “compound B”) in which each nucleoside is linked with phosphorothioate and the sugar part of some nucleosides is 2 and is modified with 0- (2-methoxy) ethyl (MOE). ") Is known (Patent Document 2).
[0004] 特許文献 1 :国際特許公報 WO0190092  [0004] Patent Document 1: International Patent Publication WO0190092
特許文献 2 :米国特許公報 US20030198965A1  Patent Document 2: US Patent Publication US20030198965A1
非特許文献 1 : M. Boscaro et al. (2001) Lancet 357:783-791  Non-Patent Document 1: M. Boscaro et al. (2001) Lancet 357: 783-791
非特許文献 2 : E. Rask et al. (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 3330-3336 非特許文献 3 : J. W. Tomlinson et al. (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 57-62 非特許文献 4 : H. Masuzaki et al. (2001) Science 294: 2166-2170  Non-Patent Document 2: E. Rask et al. (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 3330-3336 Non-Patent Document 3: JW Tomlinson et al. (2002) J. Clin. Endocrinol. Metab. 87: 57-62 Non-Patent Document 4: H. Masuzaki et al. (2001) Science 294: 2166-2170
非特許文献 5 : Y. Kotelevtsev. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 14924—1 Non-Patent Document 5: Y. Kotelevtsev. Et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 14924—1
4929 4929
非特許文献 6 : P. Alberts et al. (2003) Endocrinology 144: 4755-4762  Non-Patent Document 6: P. Alberts et al. (2003) Endocrinology 144: 4755-4762
発明の開示  Disclosure of the invention
発明が解決しょうとする課題  Problems to be solved by the invention
[0005] 11 β -HSD1阻害剤として開発されたィ匕合物 Αは全身性に作用する事力も副作用を 生じる危険性がある。また、これまでに知られている化合物 Bは安定性が充分でなぐ 少量で長 、作用を発揮しえる安定性の高 、化合物が期待されて 、た。 [0005] 11 Compound developed as an inhibitor of β-HSD1 has a risk of causing side effects even when acting systemically. In addition, the compound B known so far has been expected to be a compound having a high stability that can exert its action for a long time even in a small amount.
課題を解決するための手段  Means for solving the problem
[0006] 本発明者らは、 11 β -HSD1の働きを抑制する物質について検討した結果、糖の少 なくとも 1個が 2，- 0,4，- C-アルキレン化、 2，- 0-アルキル化、 2，- 0-ァルケ-ル化又 は 2， -0-アルキ-ル化（好適には 2， - 0 ,4， -C-アルキレンィ匕）されて!/、る 11 j8 -HSD 1 アンチセンス化合物が 11 β - HSD1の抑制活性を有し、 11 β - HSD1活性亢進が関与 して 、る代謝性疾患の治療に有用であることを見出し、本発明を完成した。 [0006] As a result of examining substances that suppress the action of 11 β -HSD1, the present inventors have found that at least one sugar is 2, -0,4, -C-alkylenated, 2, -0-. Alkylated, 2, -0-alkenylated or 2, -0-alkylated (preferably 2, -0,4, -C-alkylene)! /, 11 j8 -HSD 1 Antisense compound has 11 β-HSD1 inhibitory activity, and 11 β-HSD1 increased activity is involved As a result, the present invention was completed by finding it useful for the treatment of metabolic diseases.
[0007] 本発明の要旨は以下の通りである。  [0007] The gist of the present invention is as follows.
[0008] (1) 11 18 _水酸化ステロイド脱水素酵素 1型をコードする核酸分子を標的とする塩基 数 15〜 19個のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌタレ ォチドを構成する糖の少なくとも 1個が 2， - 0,4， -C-アルキレン化、 2， -0-アルキル化 、 2， -0-ァルケ-ル化又は 2， -0-アルキ-ル化されて!/、る前記アンチセンスオリゴヌ クレオチド又は薬理学上許容されるその塩。  [0008] (1) 11 18 _Antisense oligonucleotide having 15 to 19 bases targeting a nucleic acid molecule encoding hydroxylated steroid dehydrogenase type 1 and constituting the antisense oligonucleotide At least one of the sugars is 2, -0,4, -C-alkylenated, 2, -0-alkylated, 2, -0-alkylated or 2, -0-alkylated! / The antisense oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[0009] (2) 前記 11 18 -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型をコードする核酸分子が配列番号 1の塩基配列を有する（1)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上許容 されるその塩。  (2) The antisense oligonucleotide or pharmacologically acceptable salt thereof according to (1), wherein the nucleic acid molecule encoding the 11 18 -hydroxysteroid dehydrogenase type 1 has the base sequence of SEQ ID NO: 1. .
[0010] (3) 前記 11 j8 -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型が配列番号 2のアミノ酸配列を有 する（1)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上許容されるその塩。  [0010] (3) The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to (1), wherein the 11 j8-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[0011] (4) 配列番号 3の塩基配列を有する（1)〜（3)のいずれかに記載のアンチセンスォ リゴヌクレオチド又は薬理学上許容されるその塩。  [0011] (4) The antisense oligonucleotide according to any one of (1) to (3) having the base sequence of SEQ ID NO: 3, or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[0012] (5) さらに、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する塩基の少なくとも 1個が 修飾されている（1)〜（4)のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は 薬理学上許容されるその塩。  [0012] (5) The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable product according to any one of (1) to (4), wherein at least one of the bases constituting the antisense oligonucleotide is modified. Its salt.
[0013] (6) 前記修飾塩基力 -メチルシトシンである（5)記載のアンチセンスオリゴヌクレオ チド又は薬理学上許容されるその塩。 [0013] (6) The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to (5), which is the modified basic force-methylcytosine.
[0014] (7) さらに、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するリン酸ジエステル結合の 少なくとも 1個が修飾されている（1)〜（6)のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌ クレオチド又は薬理学上許容されるその塩。 (7) The antisense oligonucleotide or pharmacology according to any one of (1) to (6), wherein at least one phosphodiester bond constituting the antisense oligonucleotide is further modified. Its acceptable salt.
[0015] (8) 前記修飾リン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合である（7)記載のァ ンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上許容されるその塩。 (8) The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to (7), wherein the modified phosphodiester bond is a phosphorothioate bond.
[0016] (9) 連続した少なくとも 5個のヌクレオチドを構成する糖がすべてデォキシリボース である（1)〜（8)のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上 許容されるその塩。 [0016] (9) The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of (1) to (8), wherein all the sugars constituting at least 5 consecutive nucleotides are deoxyribose.
[0017] (10) 下記の一般式 (I)で表される化合物又は薬理学上許容されるその塩。 HO- Bg- Bt- Bg- Be- Be- Ba- Bg- Be- Ba- Ba- Bt- Bg- Bt- Ba- Bg- Bt- Bgt- H (I) (式中、 Bgは下記の式 (Gl)又は (G2)で表される基であり、 Btは下記の式 (T1)又は (T2) で表される基であり、 Beは下記の式 (Cl)、（C2)、（C3)又は (C4)で表される基であり、 Ba は下記の式 (Al)又は (A2)で表される基であり、 Bgtは下記の式 (GTl)又は (GT2)で表さ れる基であるが、ただし、一般式 (I)で表される化合物を構成する糖のうち少なくとも 1 個は 2，- 0,4，- C-アルキレン化、 2，- 0-アルキル化、 2，- 0-ァルケ-ル化又は 2，- 0- アルキ-ル化されている。 ) [0017] (10) A compound represented by the following general formula (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof: HO- Bg- Bt- Bg- Be- Be- Ba- Bg- Be- Ba- Ba- Bt- Bg- Bt- Ba- Bg- Bt- Bgt- H (I) (where Bg is the following formula ( Gl) or a group represented by (G2), Bt is a group represented by the following formula (T1) or (T2), Be represents the following formula (Cl), (C2), (C3) Or a group represented by (C4), Ba is a group represented by the following formula (Al) or (A2), and Bgt is a group represented by the following formula (GTl) or (GT2). However, at least one of the sugars constituting the compound represented by the general formula (I) is 2, -0,4, -C-alkylenated, 2, -0-alkylated, 2, -0 -Alkyelated or 2, -0-alkylated)
[0018] [化 1]  [0018] [Chemical 1]
Figure imgf000006_0001
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[0019] [化 2]  [0019] [Chemical 2]
Figure imgf000006_0002
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[0020] [化 3]  [0020] [Chemical 3]
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0]
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0]
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剛 [Ϊ200] CCTZ0/S00Zdf/X3d 9 .0S6S0/900Z OAV 3 Tsuyoshi [Ϊ200] CCTZ0 / S00Zdf / X3d 9.0S6S0 / 900Z OAV Three
() 0寸 () 0 inch
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〔§〔〕9§  [§ [] 9§
〔〕0§0
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[] 0§0
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[0028] [化 11]  [0028] [Chemical 11]
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000009_0002
[0029] [化 12] [0029] [Chemical 12]
Figure imgf000009_0003
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[0030] (式中、 Xは、それぞれ、独立に、下記の式 (XI)又は式 (Χ2)で表される基であり、 [0031] [化 13] O [In the formula, each X is independently a group represented by the following formula (XI) or (Χ2): [0031] O
0=P I—— OH C x l )  0 = P I—— OH C x l)
o I  o I
[0032] [化 14] o [0032] [Chem. 14] o
S=P—— OH ( X 2 )  S = P—— OH (X 2)
o  o
[0033] Yは、それぞれ、独立に、水素原子、水酸基又は炭素数 1〜6のアルコキシ、ァルケ -ルォキシ若しくはアルキニルォキシ基であり、 Zは、それぞれ、独立に、単結合又は 炭素数 1〜5個のアルキレン基である。 ) [0033] Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an alkoxy, alk-oxy or alkynyloxy group having 1 to 6 carbon atoms, and Z is each independently a single bond or a carbon number of 1 to 5 alkylene groups. )
( 11) 下記の式 (I241-a)〜(； I244-a)又は (I274-a)のいずれかで表される（10)記載の 化合物又は薬理学上許容されるその塩。  (11) The compound according to (10) or a pharmacologically acceptable salt thereof represented by any of the following formulas (I241-a) to (; I244-a) or (I274-a):
[0034] HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (1241- a) [0034] HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -CAGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (1241- a)
HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l242-a)HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l242-a)
HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l243-a)HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -CAGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l243-a)
HO-G -T -G -C -C -A-G-C-A-A-T-G-T -A -G -T -G -H (l244-a)HO-G -T -G -C -C -A-G-C-A-A-T-G-T -A -G -T -G -H (l244-a)
HQ—厂 e s—丁 51—厂 八51― s 「 S— s_r s_^~( s_r (I 74 HQ— 厂es —Chi 51 — 厂 八51 — s “ S — s _ rs _ ^ ~ (s _ r (I 74
-a) -a)
(式中、 A、 A Ae Ae2s、 G、 G Ge2、 Ge2s、 Ge2t、 T、 T\ T T2 C、 C Ce2及び Ce2sは 、それぞれ、下記の式 (A)、（As)、（Ae2)、（Ae2s)、（G)、（Gs)、（Ge2)、（Ge2s)、（Ge2t)、（T)、（Ts)、 (Te2)、（Te2s)、（C)、（Cs)、（ )及び (Ce2s)で表される基である。 ) (In the formula, A, AA e A e2s , G, GG e2 , G e2s , G e2t , T, T \ TT 2 C, CC e2 and C e2s are respectively the following formulas (A), (A s ) , (A e2 ), (A e2s ), (G), (G s ), (G e2 ), (G e2s ), (G e2t ), (T), (T s ), (T e2 ), ( T e2s ), (C), (C s ), () and (C e2s ).
[0035] [化 15] [9ΐ^ ] [9S00] [0035] [Chemical 15] [9ΐ ^] [9S00]
Figure imgf000011_0001
CCTZ0/S00Zdf/X3d 6 .0S6S0/900Z OAV
Figure imgf000012_0001
Figure imgf000011_0001
CCTZ0 / S00Zdf / X3d 6.0S6S0 / 900Z OAV
Figure imgf000012_0001
(Ce2) (Ce2s) (C e2 ) (C e2s )
Figure imgf000012_0002
Figure imgf000012_0002
(12) 下記の式 (Il-a)〜(： I4_a)又は (I34-a)のいずれかで表される（10)記載の化合物 又は薬理学上許容されるその塩。 (12) The compound according to (10) or a pharmacologically acceptable salt thereof represented by any of the following formulas (Il-a) to (: I4_a) or (I34-a).
HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (Il-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -CAGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (Il-a)
HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l2-a) HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l3-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -5C e2 -AGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l2-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -CAGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l3-a)
HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l4-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -5C e2 -AGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l4-a)
e2s ^e2s e2s e2s e2s Λ s s s Λ s Λ s ^s s ^e2s Λ e2s e2s ^e2s e2t T T /T n e2s ^ e2s e2s e2s e2s Λ sss Λ s Λ s ^ ss ^ e2s Λ e2s e2s ^ e2s e2t TT / T n
H〇 - G - T - G - 5C - 5C -A - G - C -A -A - T - G - T -A - G - T - G - H (,13 4-a) H〇-G-T-G-5C-5C -A-G-C -A -A-T-G-T -A-G-T-G-H (, 13 4-a)
(式中、 A A Ae Ae2s G G Ge2 Ge2s Ge2t T T\ T T2 C C 5Ce2及び 5Ce2s は、それぞれ、下記の式 (A)、（As)、（Ae2)、（Ae2s)、（G)、（Gs)、（Ge2)、（Ge2s)、（Ge2t)、（T)、 (Ts )、（Te2)、（Te2s)、（C)、（Cs)、（5 )及び (5Ce2s)で表される基である。 ) (In the formula, AAA e A e2s GGG e2 G e2s G e2t TT \ TT 2 CC 5C e2 and 5C e2s are respectively represented by the following formulas (A), (A s ), (A e2 ), (A e2s ), (G), (G s ), (G e2 ), (G e2s ), (G e2t ), (T), (T s ), (T e2 ), (T e2s ), (C), (C s ), ( 5 ) and ( 5 C e2s ).
[化 17] [Chemical 17]
[8ΐ^ ] [6S00] [8ΐ ^] [6S00]
Figure imgf000014_0001
CCTZ0/S00Zdf/X3d ZY .0S6S0/900Z OAV
Figure imgf000014_0001
CCTZ0 / S00Zdf / X3d ZY .0S6S0 / 900Z OAV
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Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000015_0002
Figure imgf000015_0003
Figure imgf000015_0004
Figure imgf000015_0003
Figure imgf000015_0004
(Te2) (T e2 )
[0040] (13) (1)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは薬理学上許容されるその 塩又は（10)記載の化合物若しくは薬理学上許容されるその塩を含有する、 11 水 酸ィ匕ステロイド脱水素酵素 1型発現の抑制剤。 [0040] (13) 11 Hydroxyl steroid containing the antisense oligonucleotide according to (1) or a pharmacologically acceptable salt thereof, or the compound according to (10) or a pharmacologically acceptable salt thereof Dehydrogenase type 1 inhibitor.
[0041] (14) (1)記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは薬理学上許容されるその 塩又は（10)記載の化合物若しくは薬理学上許容されるその塩を含有する、医薬組 成物。 [0041] (14) The antisense oligonucleotide according to (1) or a pharmacologically acceptable one thereof A pharmaceutical composition comprising a salt or the compound described in (10) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[0042] 本明細書において、「11 18 -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型」とは、生体内糖質コ ルチコイドのうち不活性体とされるコルチゾン、あるいは 11 β 脱水素型コルチコステ ロンの 11位に存在するケトン基に水素原子を導入し、生理活性の高い糖質コルチコ イドであるコルチゾールもしくはコルチコステロンを産生する反応、もしくは生理的条 件によってその逆反応を触媒する酵素をいう。  In the present specification, “11 18 -hydroxysteroid dehydrogenase type 1” means cortisone which is an inactive glucocorticoid, or 11 β dehydrogenated corticosterone. An enzyme that introduces a hydrogen atom into a ketone group present at a position to produce cortisol or corticosterone, a highly physiologically active glucocorticoid, or an enzyme that catalyzes the reverse reaction depending on physiological conditions.
[0043] 「11 β -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型をコードする核酸分子」とは、 11 β -水酸化 ステロイド脱水素酵素 1型をコードする領域の遺伝子 (DNA)、この DNAカゝら転写さ れた RNA(mRNA前駆体、（成熟） mRNAを含む）、この RNAから逆転写された cD NAを包含する概念である。  [0043] "Nucleic acid molecule encoding 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1" means a gene (DNA) of a region encoding 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1, The concept includes transcribed RNA (mRNA precursor, including (mature) mRNA), and cDNA reverse transcribed from this RNA.
[0044] 「オリゴヌクレオチド」とは、オリゴ DNA、オリゴ RNAのみならず、オリゴヌクレオチド を構成する少なくとも 1個の D—リボフラノースが 2し0-アルキルイ匕されたもの、オリゴ ヌクレオチドを構成する少なくとも 1個の D リボフラノースが 2， -0-ァルケ-ル化され たもの、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも 1個の D -リボフラノース力 ¾， - 0-アル キニルイ匕されたもの、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも 1個の D—リボフラノース 力 S2'-0, 4'-C-アルキレンィ匕されたもの、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも 1個 のリン酸がチォエートイ匕されたもの、オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも 1個の塩 基が修飾されたもの、それらを組み合わせたものなども包含する。  [0044] "Oligonucleotide" refers to not only oligo DNA and oligo RNA, but also those in which at least one D-ribofuranose constituting the oligonucleotide is 2 and 0-alkylated, and at least one constituting the oligonucleotide. One D-ribofuranose, 2, -0-alkenylated, at least one D-ribofuranose force ¾, -0-alkynylylated, constituting oligonucleotide At least one D-ribofuranose force S2'-0, 4'-C-alkylene-modified, at least one phosphate constituting the oligonucleotide is thioated, at least one constituting the oligonucleotide Also included are those in which individual base groups are modified, or combinations thereof.
[0045] 「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、標的とする特定の遺伝子の発現を調節（例 えば、抑制、増強)することができるオリゴヌクレオチドをいい、標的とする核酸分子（ センス鎖）に対して相補的な配列を有する。  [0045] "Antisense oligonucleotide" refers to an oligonucleotide that can regulate (eg, suppress or enhance) the expression of a specific target gene, and target nucleic acid molecules (sense strands). Have complementary sequences.
発明の効果  The invention's effect
[0046] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬理学上許容されるその塩、並びに 本発明の化合物及び薬理学上許容されるその塩は、 11 18 - HSD1の働きを抑制する ことができるので、糖尿病、高血圧等の代謝性疾患の治療'予防に有効である。 本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2004-345270号の 明細書および Zまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明 [0046] Since the antisense oligonucleotide of the present invention and pharmacologically acceptable salt thereof, and the compound of the present invention and pharmacologically acceptable salt thereof can suppress the action of 11 18-HSD1, It is effective in the prevention and treatment of metabolic diseases such as diabetes and hypertension. This specification includes the contents described in the Japanese patent application, Japanese Patent Application No. 2004-345270, which is the basis for priority of the present application, and the Z or drawings. Brief Description of Drawings
[0047] [図 1]アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用機序を示す。  [0047] FIG. 1 shows the mechanism of action of antisense oligonucleotides.
[図 2]DNA、 RNA、 PS ODNの構造と N、 S型配座を示す。  [Fig. 2] Shows the structure of DNA, RNA, and PS ODN and the N and S conformations.
[図 3]アンチセンス法で用いられて ヽる RNA型修飾ヌクレオチドの構造を示す。  FIG. 3 shows the structure of an RNA-type modified nucleotide used in the antisense method.
[図 4]RNA型修飾ヌクレオチドを用いたアンチセンスのデザインを示す。  FIG. 4 shows an antisense design using RNA-modified nucleotides.
[図 5]アンチセンスオリゴヌクレオチドによる 11 jS -HSDl mRNA抑制を示す。  FIG. 5 shows 11 jS -HSDl mRNA suppression by antisense oligonucleotide.
[図 6]アンチセンスオリゴヌクレオチドによるマウス皮下脂肪組織中 11 iS -HSDl mRNA 抑制を示す。  FIG. 6 shows 11 iS -HSDl mRNA suppression in mouse subcutaneous adipose tissue by antisense oligonucleotides.
発明を実施するための最良の形態  BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0048] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。 [0048] Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail.
[0049] 合成オリゴヌクレオチドを用いるアンチセンス法は、癌、ウィルスなどの疾患を対象と した医薬品としての利用が考えられているだけではなぐ医薬品開発における標的遺 伝子の評価のためにも応用されている（J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (20 03).; R. S. Geary, S. P. Henry, L. R Grillone., Clin. Pharmacokinet., 41, 255 (2002). ； P. Kennewell, Curr. Opin. Mol. Ther., 5, 76 (2003).)。アンチセンス法で用いられ ているオリゴヌクレオチドの作用機構は、図 1に示したように、生体内の RNAに結合し 作用することを基本概念とし、（1) mRNAからたんぱく質が合成される翻訳の過程を 阻害する、 (2) mRNA前駆体 (pre- mRNA)から mRNAが生成するスプライシングの過程 を阻害する、 (3) RNase Hがアンチセンスオリゴヌクレオチドと mRNAとが形成する 2本 鎖を基質として認識し、 RNase H力 ¾RNAを分解し mRNAの機能を阻害する等が知ら れている（J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (2003).)。この 3つの中で一般的 に用いられているのは、（3)の RNase Hの作用を利用したものである。この場合に利 用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA型のオリゴヌクレオチドである。しか しながら、天然のリン酸ジエステル結合を有する DNAを用いた場合、生体内のヌクレ ァーゼの作用により速やかに分解されてしまう。そこで、細胞内でアンチセンス法を 利用する場合、図 2に示したように DNA型であってリン酸基が修飾されたオリゴヌタレ ォチドが用いられている。特にホスホロチォエート型修飾オリゴヌクレオチド（3: PS 0 DN)は、ヌクレアーゼ耐性があり、 RNAと 2本鎖を形成した場合 RNase Hの基質になり 、ある程度の細胞透過性を有することから最も一般的に用いられている (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (2003).; R. S. Geary, S. P. Henry, L. R Grillone., Clin. Pharmacokinet., 41, 255 (2002).; P. Kennewell, Curr. Opin. Mol. Ther., 5, 76 (2003 ).) 0その反面、 PS ODNは天然の DNAと比較して、 RNAへの結合力が低下すること、 非特異的なタンパク質への結合があること、 in vivoでの適応において血液凝固系の 阻害、補体系の活性等の欠点が報告されている。それらの PS ODNの欠点を克服す るアンチセンスオリゴヌクレオチドとして、 RNA骨格を利用してデザインされた人工核 酸が数多く報告されている（J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (2003).; S. M. F reier, K. H. Altmann, Nucleic Acids Res., 25, 4429 (1997).)。 [0049] The antisense method using a synthetic oligonucleotide is applied not only to the use as a medicine for diseases such as cancer and viruses, but also to the evaluation of target genes in drug development. (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (20 03) .; RS Geary, SP Henry, L. R Grillone., Clin. Pharmacokinet., 41, 255 (2002) .; P. Kennewell, Curr. Opin. Mol. Ther., 5, 76 (2003).). The mechanism of action of oligonucleotides used in the antisense method is based on the basic concept of binding to and acting on RNA in the living body, as shown in Fig. 1. (1) Translation of protein that is synthesized from mRNA (2) Inhibits the splicing process that mRNA is generated from mRNA precursor (pre-mRNA), (3) RNase H is a double strand formed by antisense oligonucleotide and mRNA It is known to recognize and degrade RNase H ¾ RNA to inhibit mRNA function (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (2003)). Of these three, the most commonly used is the use of the action of RNase H in (3). The antisense oligonucleotide used in this case is a DNA-type oligonucleotide. However, when DNA having a natural phosphodiester bond is used, it is rapidly degraded by the action of nuclease in vivo. Therefore, when using the antisense method in a cell, as shown in FIG. 2, an oligonucleotide having a DNA type and having a phosphate group modified is used. In particular, phosphorothioate-type modified oligonucleotides (3: PS 0 DN) are nuclease-resistant and become RNase H substrates when they form a double strand with RNA. It is most commonly used because it has a certain degree of cell permeability (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 (2003) .; RS Geary, SP Henry, L. R Grillone., Clin. Pharmacokinet., 41, 255 (2002) .; P. Kennewell, Curr. Opin. Mol. Ther., 5, 76 (2003).) 0 On the other hand, PS ODN is more RNA than natural DNA. It has been reported that there is a decrease in the binding force to the protein, the presence of non-specific protein binding, the inhibition of the blood coagulation system and the activity of the complement system in in vivo adaptation. A number of artificial nucleic acids designed using RNA backbones have been reported as antisense oligonucleotides that overcome the disadvantages of PS ODN (J. Kurreck, Eur. J. Biochem., 270, 1628 ( 2003) .; SM Freier, KH Altmann, Nucleic Acids Res., 25, 4429 (1997).).
[0050] 核酸を構成する糖のフラノース環は、図 2に示すように主に 2つのパッカリング様式 、 N型配座と S型配座を形成することが知られている（W. Saenger, Principles of nuclei c acids structure, Springer— Verlag, New York. 1984.) 0 RNA骨格をもつヌクレオシド を構成するリボースの 2 '位に水酸基を有するものは、 2 ' -OH基の酸素原子と 4'位の 酸素原子のゴーシュ効果によってリボースのフラノース環の立体配座として N型配座 の割合が多くなつていることが知られている。 DNA骨格をもつヌクレオシドは、リボース の 2'位が水素原子になっているため、 RNA骨格でみられたゴーシュ効果がみられず S型配座を優先する。 [0050] It is known that the furanose ring of a sugar constituting a nucleic acid mainly forms two puckering modes, an N-type conformation and an S-type conformation as shown in FIG. 2 (W. Saenger, Principles of nuclei c acids structure, Springer- Verlag, New York. 1984.) 0 ' having a hydroxyl group in position 2' 2 of the ribose constituting the nucleoside with RNA backbone oxygen atom and the 4 'position of the -OH group It is known that the ratio of N-type conformation increases as the conformation of ribose's furanose ring due to the Gauche effect of oxygen atoms. Nucleosides with a DNA skeleton have a hydrogen atom at the 2 ′ position of ribose, so the Gauche effect seen in the RNA skeleton is not seen and the S-type conformation is given priority.
[0051] また、天然の 2本鎖 RNAが形成する A型らせん中においても個々のヌクレオシドが N 型配座として存在しており、実際に安定性を融解温度 (Tm)により測定すると、 RNAと RNAとが形成する 2本鎖の安定性は、 DNAと RNAとが形成する 2本鎖の安定性よりも 尚 ヽこと力報告 れて ヽ (W. Saenger, Principles of nucleic acids structure, Springe r- Verlag, New York. 1984.) 0これらのことより、 RNAを標的とするアンチセンスオリゴ ヌクレオチドの利用を考えた場合、 N型配座を優先する RNA骨格を利用するが有利 であると考えられている。 [0051] In addition, individual nucleosides also exist in the N-type conformation in the A-type helix formed by natural double-stranded RNA. When stability is actually measured by melting temperature (Tm), The stability of double strands formed by RNA is reported to be much stronger than the stability of double strands formed by DNA and RNA (W. Saenger, Principles of nucleic acids structure, Springer- (Verlag, New York. 1984.) 0 Based on these facts, when considering the use of antisense oligonucleotides targeting RNA, it is considered advantageous to use an RNA backbone that favors the N-type conformation. Yes.
[0052] 天然型 RNAをアンチセンスオリゴヌクレチドとしてそのまま細胞実験で使うことは、細 胞培養に用いられる血清中や細胞内に存在するリボヌクレアーゼ (RNase)に感受性 が高 、ために実用的ではな!/、。そこで RNaseに耐性を示す RNA骨格をベースとした 誘導体化がなされている。 RNAの 2，- OH基は RNaseの分解反応に必須であるので、この 2，- OH基をアルキル 化し RNaseの基質にならない 2 ' -0-アルキルヌクレオシド（4)とした数多くの誘導体が 報告されている（図 3)。中でも 2 ' - 0-メチル体は tRNAの中にも見られる修飾体で、ァ ンチセンス研究の初期の頃から利用されよく研究されている（H. Inoue, Y. Hayase, A . Imura, S. Iwai, K. Miura, E. Ohtsuka. Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987).)。さらに 2， -O-メチル体は相補鎖 RNAとの親和性も向上させることができ（ Δ Tm/mod.( DNA の場合と比較し一残基あたりの Tm値の変化を表し、 +の場合 RNAとの親和性が高 いことを意味する） = +1.5°C)、 RNase耐性も示す。アルキル基の炭素数を増加させる とともに RNAとの親和性が減少し、 2，-0-プロピル体では、 DNAと同様の A Tm/mod. 値を示し、それ以上では、 A Tm/mod.値は低下する（E. A. Lesnik, C. J. Guinosso, A. M. Kawasaki, H. Sasmor, M. Zounes, L. L. し ummins, D. L. Ecker, P. Danし ook,[0052] It is not practical to use natural RNA as an antisense oligonucleotide as it is in cell experiments because it is highly sensitive to RNases present in serum and cells used for cell culture. ! / Therefore, derivatization based on RNA skeleton resistant to RNase has been made. Since the 2, -OH group of RNA is essential for RNase degradation, a number of derivatives have been reported that alkylate this 2, -OH group to form a 2'-0-alkyl nucleoside (4) that does not become an RNase substrate. (Fig. 3). Among them, 2'-0-methyl is a modification found in tRNA and has been used and studied well since the early days of antisense research (H. Inoue, Y. Hayase, A. Imura, S. Iwai, K. Miura, E. Ohtsuka. Nucleic Acids Res. 15, 6131 (1987).). Furthermore, 2, -O-methyl can also improve the affinity with complementary RNA (Δ Tm / mod. (Represents the change in Tm value per residue compared to DNA, and + (Meaning high affinity with RNA) = + 1.5 ° C), also shows resistance to RNase. As the number of carbon atoms in the alkyl group increases, the affinity with RNA decreases, and the 2, -0-propyl compound shows the same A Tm / mod. Value as DNA, and beyond that, the A Tm / mod. (EA Lesnik, CJ Guinosso, AM Kawasaki, H. Sasmor, M. Zounes, LL and ummins, DL Ecker, P. Dan and ook,
S. M. Freier, Biochemistry 32, 7832 (1993).)。炭素数を 5つ以上のアルキル基を有 するヌクレオシドにおいては、ヌクレアーゼに対して高い耐性を獲得している（E. A. L esnik, C. J. Guinosso, A. M. Kawasaki, H. basmor, M. Zounes, L. L. し ummins, D. し Ecker, P. Dan Cook, S. M. Freier, Biochemistry 32, 7832 (1993).; B. P. Monia, E . A. Lesnik, C. Gonzalez, W. F. Lima, D. McGee, C. J. Guinosso, A. M. Kawasaki, P. Dan Cook, S. M. Freier, J. Biol. Chem. 268, 14514 (1993).; B. P. Monia, J. K. Jo hnson, H. Sasmor, L. L. Cummins, J. Biol. Chem., 271, 14533 (1996).)。また、アル キル基の末端に置換基を有するものとして、 2， -0- (2-メトキシェチル)基を有するヌク レオシド（5: 2 ' -MOE)は、メトキシェチル基のゴーシュ効果によって RNAとの親和性（S. M. Freier, Biochemistry 32, 7832 (1993).). Nucleosides with alkyl groups with 5 or more carbon atoms have acquired high resistance against nucleases (EA Lesnik, CJ Guinosso, AM Kawasaki, H. basmor, M. Zounes, LL and ummins, D. and Ecker, P. Dan Cook, SM Freier, Biochemistry 32, 7832 (1993) .; BP Monia, E. A. Lesnik, C. Gonzalez, WF Lima, D. McGee, CJ Guinosso, AM Kawasaki, P. Dan Cook, SM Freier, J. Biol. Chem. 268, 14514 (1993); BP Monia, JK Johnson, H. Sasmor, LL Cummins, J. Biol. Chem., 271, 14533 (1996)). In addition, a nucleoside having a 2, -0- (2-methoxyethyl) group (5: 2'-MOE), which has a substituent at the end of the alkyl group, has an affinity for RNA due to the Gauche effect of the methoxyethyl group. sex(
A Tm/mod.=+2°C)を向上させ、ヌクレアーゼ而性も有している（P. Martin, Helv. Chi m. Acta 78, 486 (1995).; M. Teplova, G. Minasov, V. Tereshko, G. B. Inamati, P. D an Cook, M. Manoharan, M. Egli, Nature Struct. Biol. 6, 535 (1999).)。 2，— O—ァミノ プロピル基を有するヌクレオシド (6: AP)は、 2，-0-プロピル体との同程度の親和性 ( Δ Tm/mod.=0°C)であって、 PS-ODNよりも優れたヌクレアーゼ耐性が観察されている（R . H. urilfey, B. P. Monia, L. L. Cummins, S. Freier, M. J. Greig, C. J. uuinosso, E.A Tm / mod. = + 2 ° C) and has nuclease metastases (P. Martin, Helv. Chim. Acta 78, 486 (1995) .; M. Teplova, G. Minasov, V. Tereshko, GB Inamati, P. Dan Cook, M. Manoharan, M. Egli, Nature Struct. Biol. 6, 535 (1999).). A nucleoside having a 2, —O-aminopropyl group (6: AP) has the same affinity (Δ Tm / mod. = 0 ° C) as the 2, -0-propyl compound, and has a PS-ODN Better nuclease resistance has been observed (R. H. urilfey, BP Monia, LL Cummins, S. Freier, MJ Greig, CJ uuinosso, E.
Lesnik, S. M. Manalili, V. Mohan, S. Owens, B. R. Ross, H. Sasmor, E. Wancewicz,Lesnik, S. M. Manalili, V. Mohan, S. Owens, B. R. Ross, H. Sasmor, E. Wancewicz,
K. Weiler, P. D. Wheeler, P. Dan Cook, J. Med. Chem. 39, 5100 (1996).)。その理 由として、 APの 2， -0-ァミノプロピル基のアミノ基が大腸菌由来の Klenow fragment 3 ， -5，ェキソヌクレアーゼの金属イオンの結合部位に位置し、ヌクレアーゼの触媒反応 を阻害していることが、 X線結晶構造解析から明らかになつている（M. Teplova, S. T. Wallace, V. Tereshko, u. Minasov, A. M. Symons, P. Dan COOK, M. Manoharan, M.K. Weiler, PD Wheeler, P. Dan Cook, J. Med. Chem. 39, 5100 (1996)). That reason The reason is that the amino group of AP's 2, -0-aminopropyl group is located at the binding site of Klenow fragment 3, -5, exonuclease metal ion derived from E. coli and inhibits the nuclease catalytic reaction. And X-ray crystallographic analysis (M. Teplova, ST Wallace, V. Tereshko, u. Minasov, AM Symons, P. Dan COOK, M. Manoharan, M.
Egli, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 14240 (1999).)。 Egli, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96, 14240 (1999).).
[0054] 2， -OH基を 2， -Fに置換したヌクレオシド（7: 2， - F)を有するオリゴヌクレオチドは、 N 型配座を優先して形成し、 RNAとの親和性も高くなる（A Tm/mod.=+2.5°C) (A. M. Ka wasaki, M. D. Casper, S. M. Freier, E. A. Lesnik, M. C. Zounes, L. L. Cummins, C.[0054] 2, Oligonucleotides with nucleosides (7: 2, -F) substituted with -OH groups at 2, -F form in favor of the N-type conformation and also have high affinity for RNA (A Tm / mod. = + 2.5 ° C) (AM Ka wasaki, MD Casper, SM Freier, EA Lesnik, MC Zounes, LL Cummins, C.
Gonzalez, P. Dan Cook, J. Med. Chem. 36, 831 (1993).)。しかしながら、リン酸ジェ ステル結合力もなるものはヌクレアーゼ抵抗性がな 、ので、ホスホロチォエート結合と し、ヌクレアーゼ抵抗性を持たせている（A. M. Kawasaki, M. D. Casper, S. M. Freier , E. A. Lesnik, M. C. Zounes, L. L. Cummins, C. Gonzalez, P. Dan Cook, J. Med. Chem. 36, 831 (1993).)。 Gonzalez, P. Dan Cook, J. Med. Chem. 36, 831 (1993).). However, those with phosphate ester binding ability do not have nuclease resistance, so they are phosphorothioate bonds and have nuclease resistance (AM Kawasaki, MD Casper, SM Freier, EA Lesnik, MC Zounes). , LL Cummins, C. Gonzalez, P. Dan Cook, J. Med. Chem. 36, 831 (1993).).
[0055] RNAの N型配座に完全に固定ィ匕した人工核酸として、糖部の 2 ' -酸素原子と 4 ' -炭 素原子をメチレン鎖で架橋した 2，，4，- BNA/LNA (8: bridged nucleic acids/locked nu cleic acids)が報告されている（S. Obika, D. Nanbu, Y. Hari, K. Morio, Y. In, T. Ishi da, T. Imanishi, Tetrahedron Lett., 38, 8735 (1997).; S. Obika, D. Nanbu, Y. Hari, J. Andoh, K. Morio, T. Doi, T. Imanishi.Tetrahedron Lett., 39, 5401 (1998).; A. A. Koshkin, S. K. Singh, P. Nielsen, V. K. Rajwanshi, R. Kumar, M. Meldgaard, C. E. Olsen, J. Wengel, Tetrahedron, 54, 3607 (1998).; S. Obika, T. Uneda, T. Sugimoto,[0055] 2,4, -BNA / LNA is an artificial nucleic acid that is completely anchored to the N-type conformation of RNA, with the 2'-oxygen atom and 4'-carbon atom of the sugar moiety bridged by a methylene chain. (8: bridged nucleic acids / locked nucleic acids) has been reported (S. Obika, D. Nanbu, Y. Hari, K. Morio, Y. In, T. Ishi da, T. Imanishi, Tetrahedron Lett. , 38, 8735 (1997) .; S. Obika, D. Nanbu, Y. Hari, J. Andoh, K. Morio, T. Doi, T. Imanishi. Tetrahedron Lett., 39, 5401 (1998) .; AA Koshkin, SK Singh, P. Nielsen, VK Rajwanshi, R. Kumar, M. Meldgaard, CE Olsen, J. Wengel, Tetrahedron, 54, 3607 (1998) .; S. Obika, T. Uneda, T. Sugimoto,
D. Nanbu, T. Minami, T. Doi, T. Imanishi, Bioorg. Med. Chem., 9, 1001 (2001).)。 このように核酸の糖部をメチレン鎖で架橋すると立体配座の自由度が束縛され、 2 ' ,4 ，- BNA/LNAを含むオリゴヌクレオチドは、 A Tm/mod.=+5〜8°Cと、驚異的な 2本鎖の 安定性を示す。また、 2 ' ,4' -BNA/LNAを含むオリゴヌクレオチドは、 DNAと比較し、ヌ クレアーゼに対する安定性も向上している。さらに、 2 ' ,4' -BNA/LNAのメチレン鎖を 一炭素延ばしたエチレン鎖で架橋した ENA (9: 2 ' -0,4' -C-ethylene-bridged nuclei c cids)は、 2，，4，- BNA/LNAと同程度の A Tm/mod.=+5。Cを持ち、加えて 2，，4，- BNA /LNAよりも優れたヌクレアーゼに対する安定性を有している（K. Morita, C. Hasegaw a, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. Sone, T. Ishikawa, T. Imanishi, M. Koizumi, Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 73 (2002).; K. Morita, M. Takagi, C. Hasegawa, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. Sone, T. Ishikawa, T. Imanishi, M. Koizumi, Bioorg. Med. Chem., 11 , 2211 (2003).) o糖部の 2，-酸素原子と 4，-炭素原子の架橋をプロピレン鎖にした場 合は、ヌクレアーゼ耐性は向上するが、 A Tm/mod.=+2°Cに低下してしまうことが報告 れ飞 ヽる (K. Morita, M. Takagi, C. Hasegawa, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. bone, T . Ishikawa, T. Imanishi, M. Koizumi, Bioorg. Med. Chem., 11, 2211 (2003).)。 D. Nanbu, T. Minami, T. Doi, T. Imanishi, Bioorg. Med. Chem., 9, 1001 (2001).). Thus, when the sugar part of a nucleic acid is cross-linked with a methylene chain, the degree of conformational freedom is constrained, and oligonucleotides containing 2 ′, 4, -BNA / LNA can be obtained by using A Tm / mod. = + 5-8 ° C Show tremendous duplex stability. In addition, oligonucleotides containing 2 ′, 4′-BNA / LNA have improved stability against nucleases compared to DNA. In addition, ENA (9: 2'-0,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid cids) in which the methylene chain of 2 ', 4'-BNA / LNA is bridged with an ethylene chain extended by one carbon is 2, ... 4,-A Tm / mod. = + 5, similar to BNA / LNA. Has C, plus 2,4,-nuclease stability better than BNA / LNA (K. Morita, C. Hasegaw a, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. Sone, T. Ishikawa, T. Imanishi, M. Koizumi, Bioorg. Med. Chem. Lett., 12, 73 (2002) .; K. Morita, M. Takagi , C. Hasegawa, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. Sone, T. Ishikawa, T. Imanishi, M. Koizumi, Bioorg. Med. Chem., 11, 2211 (2003).) O Sugar part 2, It has been reported that when a propylene chain is bridged between a -oxygen atom and a 4-carbon atom, the nuclease resistance is improved, but decreases to A Tm / mod. = + 2 ° C ( K. Morita, M. Takagi, C. Hasegawa, M. Kaneko, S. Tsutsumi, J. bone, T. Ishikawa, T. Imanishi, M. Koizumi, Bioorg. Med. Chem., 11, 2211 (2003). ).
RNA型修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドは、前述のように標的 RNAと安定な 2本 鎖を形成する。すべてが RNA型修飾ヌクレオチド力もなるオリゴヌクレオチド「 lly mo dified oligonucleotidesj (以後「FMO」と略す）は、 mRNAとの結合力が非常に強まるこ と力 、図 1に示したように（1) mRNAからたんぱく質が合成される翻訳の過程の阻害 、（2) mRNA前駆体力も mRNAが生成するスプライシングの過程を阻害する目的には 非常に有用である。しかしながら、 FMOと標的 RNAとの 2本鎖は、 RNase Hの基質に ならない（H. Inoue, Y. Hayase, S. Iwai, E. Ohtsuka FEBS Lett. 215, 327 (1987).; W. F. Lima, S.T. Crooke, Biochemistry 36, 390 (1997).; H. Wu, W. F. Lima, S.T. Cro oke, J. Biol. Chem. 274, 28270 (1999).)。そこで図 4Aに示したように、 RNA型修飾ヌ クレオシドと DNAからなるキメラオリゴヌクレチドがアンチセンス法で用いられて!/、る。 そのデザインとして、 wingと呼ばれる RNA型修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの両 側に配置し、 windowと呼ばれる連続した DNAを中央部に持つ「gapmer」がある。すな わち、 gapmerは、 wing-window-wingといった構造を有することになる。例えば、 RNA 型修飾ヌクレオシドとして 2， -0-メチルヌクレオシド（2， -OMe RNA)を用いた場合、 2， -OMe RNA - DNA-2 ' - OMe RNAといったキメラオリゴヌクレオチドになる。 gapmerは 、中央部分に連続した DNA領域を持っために、 gapmerと標的 RNAとの 2本鎖は RNas e Hの基質になる。この windowの DNAの長さは、用いる RNase Hによって異なり、 wing 部分に 2， -OMe RNAを用いた場合、ヒト RNase HIでは 4ヌクレオチド以上（H. Wu, W . F. Lima, S.T. Crooke, J. Biol. Chem. 274, 28270 (1999).)、大腸菌 RNase Hでは 5 ヌクレオチド以上（W. F. Lima, S.T. Crooke, Biochemistry 36, 390 (1997).)必要であ る。 window部分の DNA領域が長いほど RNase Hの基質になりやすい。 wing部分の修 飾ヌクレオチドは、標的 RNAとの親和性を高める目的であり、その長さが長いほど標 的 RNAとの親和性が高くなる。アンチセンスとしての活性で見た場合、 windowと wing の長さのバランスが必要になり、そのよいものが高活性になりうる（E. A. Lesnik, C. J. uuinosso, A. M. Kawasaki, H. Sasmor, M. Zounes, L. L. Cummins, D. L. Ecker, P. Dan Cook, S. M. Freier, Biochemistry 32, 7832 (1993).; B. P. Monia, E. A. Lesnik, C. Gonzalez, W. F. Lima, D. McGee, C. J. Guinosso, A. M. Kawasaki, P. Dan Cook , S. M. Freier, J. Biol. Chem. 268, 14514 (1993).; B. P. Monia, J. K. Johnson, H. Sa smor, L. L. Cummins, J. Biol. Chem., 271, 14533 (1996).) (図 4B)。 The RNA-type modified antisense oligonucleotide forms a stable duplex with the target RNA as described above. Oligonucleotide “lly modified oligonucleotidesj” (hereinafter abbreviated as “FMO”), which also has the ability to modify RNA-type nucleotides, has an extremely strong binding power to mRNA. As shown in Figure 1, (1) From mRNA Inhibition of the translation process of protein synthesis, (2) The ability of the precursor of mRNA is also very useful for the purpose of inhibiting the splicing process of mRNA. However, the double strand of FMO and target RNA does not become a substrate for RNase H (H. Inoue, Y. Hayase, S. Iwai, E. Ohtsuka FEBS Lett. 215, 327 (1987) .; WF Lima, ST Crooke, Biochemistry 36, 390 (1997) .; H. Wu, WF Lima, ST Crooke, J. Biol. Chem. 274, 28270 (1999).). Therefore, as shown in FIG. 4A, a chimeric oligonucleotide composed of an RNA-type modified nucleoside and DNA is used in the antisense method! The design includes a “gapmer” that has RNA-modified nucleotides called wings on both sides of the oligonucleotide and a continuous DNA called window in the middle. In other words, the gapmer has a wing-window-wing structure. For example, when 2, -0-methyl nucleoside (2, -OMe RNA) is used as an RNA-type modified nucleoside, a chimeric oligonucleotide such as 2, -OMe RNA-DNA-2'-OMe RNA is obtained. Since gapmer has a continuous DNA region in the central part, the double strand of gapmer and target RNA becomes a substrate of RNase H. The length of DNA in this window varies depending on the RNase H used. When using 2, OMe RNA in the wing part, human RNase HI has 4 nucleotides or more (H. Wu, WF Lima, ST Crooke, J Biol. Chem. 274, 28270 (1999).) E. coli RNase H requires 5 nucleotides or more (WF Lima, ST Crooke, Biochemistry 36, 390 (1997)). The longer the DNA region of the window part, the easier it becomes a substrate for RNase H Repair of wing part The decorated nucleotide is intended to increase the affinity with the target RNA, and the longer the length, the higher the affinity with the target RNA. In terms of activity as an antisense, it is necessary to balance the length of window and wing, and the good one can be highly active (EA Lesnik, CJ uuinosso, AM Kawasaki, H. Sasmor, M. Zounes, LL Cummins, DL Ecker, P. Dan Cook, SM Freier, Biochemistry 32, 7832 (1993) .; BP Monia, EA Lesnik, C. Gonzalez, WF Lima, D. McGee, CJ Guinosso, AM Kawasaki, P. Dan Cook , SM Freier, J. Biol. Chem. 268, 14514 (1993) .; BP Monia, JK Johnson, H. Sa smor, LL Cummins, J. Biol. Chem., 271, 14533 (1996).) (Figure 4B ).
[0057] 2 ' -OMe RNAは、前述のように古く力もアンチセンス研究に用いられている力 最 近 gapmerを用いた PTEN遺伝子の機能解析の例が報告されている（M. Sternberger, A. ¾cnmiedeknecht, A. Kretschmer, F. ebhardt, F. Leenaers, P . Czauderna, I. vo n Carlowitz, M. Engle, K. Giese, L. Beigelman, A. Klippel, Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 12, 131 (2002).)。この場合、両 wing部分に 7ヌクレオチドからなる 2，-OMe RNAを用い、 window部分には 9ヌクレオチドからなる PS ODNを用いて、鎖長 23ヌク レオチドカもなるアンチセンスを用いている。さらに、ェキソヌクレアーゼに対する安 定性を増すために、 3， ,5，-両末端にテトラヒドロフラン誘導体を結合させている。  [0057] As described above, 2'-OMe RNA has been reported as an example of the functional analysis of the PTEN gene using the force-related gapmer, which has been used in antisense research for a long time (M. Sternberger, A. ¾cnmiedeknecht, A. Kretschmer, F. ebhardt, F. Leenaers, P. Czauderna, I. vo n Carlowitz, M. Engle, K. Giese, L. Beigelman, A. Klippel, Antisense Nucleic Acids Drug Dev. 12, 131 ( 2002).). In this case, using two-OMe RNA consisting of 7 nucleotides in both wing parts, PS ODN consisting of 9 nucleotides in the window part, and antisense having a chain length of 23 nucleotides are used. Furthermore, in order to increase the stability against exonuclease, tetrahydrofuran derivatives are attached to both ends of 3, 3, 5 and-.
[0058] 2，- MOEを wingとして含む gapmerの数多くのアンチセンスを用いた研究が報告され ている（B. A. Zinker, C. M. Rondinone, J. M. Trevillyan, R. J. Gum, J. E. Clampit, J . F. Waring, N. Xie, D. Wilcox, P. Jacobson, L. Frost, P. E. Kroeger, R. M. Reilly, S. Koterski, T. J. Opgenorth , R. G. Ulrich, S. Crosby, M. Butler, S. F. Murray, R. A. McKay, S. Bhanot, B. P. Monia, M. R. Jirousek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11357 (2002).; H. Zhang, J. Cook, J. Nickel, R. Yu, K. Stecker, K. Myers, N. M. De an, Nature Biotechnol. 18, 862 (2000).; B. Z. Carter, R. Y. Wang, W. D. Schober, M. Milella, D. Chism, M. Andreeff, Cell Cycle. 2, 488 (2003).)。 2，- MOEをアンチセ ンス法で用いる場合、そのリン酸基は、すべてホスホロチォエート結合のものが用い られている。ヌクレアーゼ耐性を獲得するためだけではなぐ in vivoでの適応を考え た場合、ホスホロチォエート結合のものの方がアンチセンスの体内動態面で有利に なることが報告されている（R. S. Geary, T. A. Watanabe, L. Truong, S. Freier, E. A. Lesnik, N. B. Sioufi, H. Sasmor, M. Manoharan, A. A. Levin, J. Pharmacol. Exp. Th er. 296, 890 (2001).)。リン酸ジエステル結合からなる 2 ' -MOE体は、尿中から速やか に排泄されてしまうのに対し、ホスホロチォエート結合からなる 2 ' - MOE体は、高い血 中安定性を示し、肝臓、腎臓、脾臓、骨髄等、脳以外のほとんどの組織への移行性 を示す。分布量は、 PS ODNよりも優れている。現在ホスホロチォエート結合力もなる 2 ，-ΜΟΕ体は、抗腫瘍、抗炎症、抗糖尿病を目的としたアンチセンス薬としての臨床 開発されている。 [0058] 2,-A number of studies using gapmer's antisense including MOE as wing have been reported (BA Zinker, CM Rondinone, JM Trevillyan, RJ Gum, JE Clampit, J. F. Waring, N. Xie, D. Wilcox, P. Jacobson, L. Frost, PE Kroeger, RM Reilly, S. Koterski, TJ Opgenorth, RG Ulrich, S. Crosby, M. Butler, SF Murray, RA McKay, S. Bhanot, BP Monia , MR Jirousek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11357 (2002) .; H. Zhang, J. Cook, J. Nickel, R. Yu, K. Stecker, K. Myers, NM De an, Nature Biotechnol. 18, 862 (2000) .; BZ Carter, RY Wang, WD Schober, M. Milella, D. Chism, M. Andreeff, Cell Cycle. 2, 488 (2003).). 2,-When MOE is used in the anti-sense method, all phosphoric acid groups are phosphorothioate-linked. It has been reported that phosphorothioate-bound ones are more advantageous in terms of antisense pharmacokinetics when considering in vivo adaptation than just acquiring nuclease resistance (RS Geary, TA Watanabe). , L. Truong, S. Freier, EA Lesnik, NB Sioufi, H. Sasmor, M. Manoharan, AA Levin, J. Pharmacol. Exp. Ther. 296, 890 (2001).). The 2'-MOE form consisting of phosphodiester bonds is rapidly excreted from the urine, whereas the 2'-MOE form consisting of phosphorothioate bonds shows high blood stability, Shows transferability to most tissues other than brain, such as kidney, spleen, and bone marrow. The distribution is better than PS ODN. Currently, 2, -phosphorus, which also has phosphorothioate-binding ability, has been clinically developed as an antisense drug for anti-tumor, anti-inflammatory and anti-diabetic purposes.
[0059] 2，，4，- BNA/LNAも 2，- ΜΟΕと同様に wingに用い、 gapmerとしてのアンチセンスがデ ザインされている。ラット delta opioid receptor mRNAを標的とした 2，，4，- BNA/LNAを 含むアンチセンスが設計され、ラット脳脊髄液中に注射することによって opioid recept orを介した痛覚応答の抑制が観察されている（C. Wahlestedt, P. Salmi, L. Good, J. Kela, T. Johnsson, T. Hokfelt, C. Broberger, F. Porreca, J. Lai, K. Ren, M. Ossipo v, A. Kosh in, N. Jakobsen, J. Skouv, H. Oerum, M. H. Jacobsen, J. Wengel, Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 5633 (2000).)。また、 RNA polymerase IIを標的とした 2，，4， -BNA/LNAからなる FMOアンチセンスがデザインされ、 RNA polymerase IIタンパク 質の減少が観察され、さらに腫瘍移植モデルマウスを使った in vivo系で腫瘍増殖抑 制が認められている（K. Fluiter, A. L. ten Asbroek, M. B. de Wissel, M. E. Jakobs, M. Wissenbach, H. Olsson, O. Olsen, H. Oerum, F. Baas, Nucleic Acids Res. 31, 9 53 (2003).) oこの場合リン酸基を修飾することなくリン酸ジエステル結合のままで用い られており、その体内動態は主に腎臓に分布し、尿中から排泄されることが示されて いる。また RNAに対して結合力が強い 2，，4，-BNA/LNAは、 2，- OMe RNAとの mixmer を用いて、 HIV-1 TAR RNAに結合し Tatの機能を阻害できることが示されている。こ の mixmerは、 12merと短鎖長にも関わらず、 mixmerと TAR RNAは peudoknot構造を 开成し安定な複合体になる (A. Arzumanov, A. P. Walsh, V. K. Rajwanshi, R. Kumar , J. Wengel, M. J. Gait, Biochemistry 40, 14645 (2001).)。  [0059] 2,4,-BNA / LNA is used for wing as well as 2, -ΜΟΕ, and antisense as a gapmer is designed. Antisense containing 2,4, -BNA / LNA targeting rat delta opioid receptor mRNA was designed, and when injected into rat cerebrospinal fluid, suppression of pain response via opioid receptor was observed. (C. Wahlestedt, P. Salmi, L. Good, J. Kela, T. Johnsson, T. Hokfelt, C. Broberger, F. Porreca, J. Lai, K. Ren, M. Ossipo v, A. Kosh in, N. Jakobsen, J. Skouv, H. Oerum, MH Jacobsen, J. Wengel, Proc Natl Acad Sci US A. 97, 5633 (2000).). In addition, an FMO antisense consisting of 2,4, -BNA / LNA targeting RNA polymerase II was designed, and a decrease in RNA polymerase II protein was observed. Furthermore, in an in vivo system using tumor transplantation model mice Tumor growth suppression has been observed (K. Fluiter, AL ten Asbroek, MB de Wissel, ME Jakobs, M. Wissenbach, H. Olsson, O. Olsen, H. Oerum, F. Baas, Nucleic Acids Res. 31 , 9 53 (2003).) O In this case, the phosphodiester bond is used without modification, and its pharmacokinetics is mainly distributed in the kidney and may be excreted from the urine. It is shown. Also, 2,4, -BNA / LNA, which has strong binding power to RNA, has been shown to bind to HIV-1 TAR RNA and inhibit Tat function using a mixmer with 2, -OMe RNA. Yes. Despite the 12mer and short chain length, the mixmer and TAR RNA form a peudoknot structure and become a stable complex (A. Arzumanov, AP Walsh, VK Rajwanshi, R. Kumar, J. Wengel). , MJ Gait, Biochemistry 40, 14645 (2001).).
[0060] ENAにおいても、薬物の輸送に関与する有機ァ-オントランスポーターに対する ga pmerが、塩基配列がよく類似した 3つのサブタイプに対して特異的に切断できうること が示された（M. Takagi, K. Morita, D. Nakai, R. Nakagomi, T. Tokui, M. Koizumi, Bi ochemistry, 43, 4501 (2004).) 0また、 ENAと 2，- OMe RNAからなるキメラオリゴヌタレ ォチドが筋ジストロフィーの原因遺伝子であるジストロフィン遺伝子のェキソンスキッピ ング反応を促進し、治療法としての可能性が示されている（M. Yagi, Y. Takeshima, A . Surono, M. Takagi, M. Koizumi, M. Matsuo, Oligonucleotides, 14, 33 (2004).; A. S urono, T. van Khanh, Y. Takeshima, H. Wada, M. Yagi, M. Takagi, M. Koizumi, M. Matsuo, Hum. Gene. Ther., 15, 749 (2004).) 0 [0060] ENA also showed that gapmers for organic-on transporters involved in drug transport can specifically cleave three subtypes with similar base sequences (M Takagi, K. Morita, D. Nakai, R. Nakagomi, T. Tokui, M. Koizumi, Bi ochemistry, 43, 4501 (2004).) 0 Also, a chimeric oligonucleotide consisting of ENA and 2, -OMe RNA promotes the exon skipping reaction of the dystrophin gene, which is the causative gene of muscular dystrophy, and may be a therapeutic method. (M. Yagi, Y. Takeshima, A. Surono, M. Takagi, M. Koizumi, M. Matsuo, Oligonucleotides, 14, 33 (2004) .; A. S urono, T. van Khanh, Y Takeshima, H. Wada, M. Yagi, M. Takagi, M. Koizumi, M. Matsuo, Hum. Gene. Ther., 15, 749 (2004).) 0
[0061] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 11 β -水酸化ステロイド脱水素酵素 1 型をコードする核酸分子を標的とする塩基数 15〜19個のアンチセンスオリゴヌタレ ォチドである。 11 j8 -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型をコードする核酸分子としては 、配列番号 1、 16又は 18のいずれかの塩基配列を有する成熟 mRNA、成熟 mRNAの 前駆体、铸型 DNAなどを挙げることができる。 11 j8 -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型 としては、配列番号 2、 17又は 19のいずれかのアミノ酸配列を有するものなどを挙げ ることができる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列の一例を配列番 号 3に示す。なお、配列番号 3の塩基配列において、全てあるいは一部の Tは Uに置 さ換わってもよい。 [0061] The antisense oligonucleotide of the present invention is an antisense oligonucleotide having 15 to 19 bases targeting a nucleic acid molecule encoding 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1. Examples of nucleic acid molecules encoding 11 j8-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 include mature mRNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 16, or 18, a precursor of mature mRNA, and type IV DNA. Can do. Examples of the 11 j8-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 include those having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2, 17 and 19. An example of the base sequence of the antisense oligonucleotide of the present invention is shown in SEQ ID NO: 3. In the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, all or part of T may be replaced with U.
[0062] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基数は、 15〜19個である力 好ましく は 16〜18個である。  [0062] The antisense oligonucleotide of the present invention has 15 to 19 bases, preferably 16 to 18 bases.
[0063] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、糖の少なくとも 1個が 2， -0,4，- C-アル キレン化、 2，- 0-アルキル化、 2，- 0-ァルケ-ル化又は 2，- 0-アルキ-ル化されてい るものであるが、それ以外にも、糖、塩基、リン酸ジエステル結合の修飾がなされてい てもよい。糖の修飾の例としては、 D—リボフラノースの 2'- 0-アルキル化、 2，- 0-ァ ルケ-ル化若しくは 2，- 0-アルキ-ル化（例えば、 2'- 0-メチル化、 2'- 0-アミノエチ ル化、 2'- 0-プロピル化、 2'- 0-ァリル化、 2'- 0- (2-メトキシ)ェチル化、 2'- 0-ブチル ィ匕、 2'- 0-ペンチル化、 2'- 0-プロパルギル化など）、 D—リボフラノースの 2'- 0,4'- C -アルキレン化（例えば、 2'- 0,4'- C-エチレン化、 2'- 0,4'- C-メチレン化、 2'- 0,4'- C- プロピレン化、 2'- 0,4'- C-テトラメチレンィ匕、 2'- 0,4'- C-ペンタメチレンィ匕など）、 3'- デォキシ- 3'-ァミノ- 2'-デォキシ- D-リボフラノース、 3'-デォキシ- 3'-ァミノ- 2'-デォキ シ -2'-フルオロ- D-リボフラノースなどを挙げることができる。塩基の修飾の例としては 、シトシンの 5-メチル化、 5-フルォロ化、 5-ブロモ化、 5-ョード化、 N4-メチル化、チミ ジンの 5-デメチル化（ゥラシル）、 5-フルォロ化、 5-ブロモ化、 5-ョード化、アデニンの N6-メチル化、 8-ブロモ化、グァニンの N2-メチル化、 8-ブロモ化などを挙げることが できる。リン酸ジエステル結合の修飾の例としては、ホスホロチォエート結合、メチル ホスホネート結合、メチルチオホスホネート結合、ホスホロジチォエート結合、ホスホロ アミデート結合などを挙げることができる。 [0063] In the antisense oligonucleotide of the present invention, at least one of the sugars is 2, -0,4, -C-alkylated, 2, -0-alkylated, 2, -0-alkalylated or Although it is 2, -0-alkylated, other than that, sugar, base, and phosphodiester bonds may be modified. Examples of sugar modifications include 2'-0-alkylation, 2, -0-alkylation or 2, -0-alkylation of D-ribofuranose (eg, 2'-0-methyl). , 2'-0-aminoethylation, 2'-0-propylation, 2'-0-allylation, 2'-0- (2-methoxy) ethylation, 2'-0-butylyl, 2 '-0-pentylation, 2'-0-propargylation, etc.), 2'-0,4'-C-alkylenation of D-ribofuranose (eg 2'-0,4'-C-ethylenation, 2'-0,4'- C-methylenelation, 2'-0,4'- C-propyleneation, 2'-0,4'-C-tetramethylene diene, 2'-0,4'-C 3'-deoxy-3'-amino-2'-deoxy- D-ribofuranose, 3'-deoxy-3'-amino-2'-deoxy-2'-fluoro-D -Ribofuranose can be mentioned. Examples of base modifications include , Cytosine 5-methylation, 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N4-methylation, thymidine 5-demethylation (uracil), 5-fluorination, 5-bromination, 5 -Neomethylation, N6-methylation of adenine, 8-bromination, N2-methylation of guanine, 8-bromination and the like. Examples of phosphoric acid diester bond modifications include phosphorothioate bonds, methyl phosphonate bonds, methylthiophosphonate bonds, phosphorodithioate bonds, phosphoramidate bonds, and the like.
[0064] 本発明の化合物は、下記の一般式 (I)で表される。 [0064] The compound of the present invention is represented by the following general formula (I).
[0065] HO-Bg-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bg-Bc-Ba-Ba-Bt-Bg-Bt-Ba-Bg-Bt-Bgt-H (I)  [0065] HO-Bg-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bg-Bc-Ba-Ba-Bt-Bg-Bt-Ba-Bg-Bt-Bgt-H (I)
一般式 (I)において、 Bgは上記の式 (G1)又は (G2)で表される基であり、 Btは上記の式 ( T1)又は (T2)で表される基であり、 Beは上記の式 (Cl)、（C2)、（C3)又は (C4)で表される 基であり、 Baは上記の式 (A1)又は (A2)で表される基であり、 Bgtは上記の式 (GT1)又 は (GT2)で表される基であるが、ただし、一般式 (I)で表される化合物を構成する糖の うち少なくとも 1個は 2， - 0,4， -C-アルキレン化又は 2， -0-アルキル化されて!/、る。  In the general formula (I), Bg is a group represented by the above formula (G1) or (G2), Bt is a group represented by the above formula (T1) or (T2), and Be is the above A group represented by the formula (Cl), (C2), (C3) or (C4), Ba is a group represented by the above formula (A1) or (A2), and Bgt is the above formula. A group represented by (GT1) or (GT2), provided that at least one of the sugars constituting the compound represented by the general formula (I) is 2, -0,4, -C-alkylene Or 2,0-alkylated! /
[0066] 式 (Gl)、（Al)、 (CI), (C2)、（Tl)及び (GT1)中の Yについて、炭素数 1〜6のアルコキ シ、ァルケ-ルォキシ又はアルキ-ルォキシ基の例としては、メトキシ基、アミノエトキ シ基、プロポキシ基、ァリルォキシ基、メトキシェトキシ基、ブトキシ基、ペンチルォキ シ基、プロパルギルォキシ基などを挙げることができ、好適には炭素数 1〜3のアルコ キシ基である。  [0066] For Y in the formulas (Gl), (Al), (CI), (C2), (Tl) and (GT1), an alkoxy, alkoxy or alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms Examples include methoxy, aminoethoxy, propoxy, allyloxy, methoxyethoxy, butoxy, pentyloxy, propargyloxy, etc., preferably an alcohol having 1 to 3 carbon atoms. It is a xy group.
[0067] 式 (G2)、（A2)、（C3)、（C4)、（T2)及び (GT2)中の Zについて、炭素数 1〜5のアルキレ ン基の例としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基、ペンタメ チレン基などを挙げることができる。好適な Zは、単結合又はメチレン基であり、より好 適にはメチレン基である。  [0067] Examples of the alkylene group having 1 to 5 carbon atoms for Z in the formulas (G2), (A2), (C3), (C4), (T2) and (GT2) include a methylene group, ethylene Group, propylene group, tetramethylene group, pentamethylene group and the like. Z is preferably a single bond or a methylene group, more preferably a methylene group.
[0068] 一般式 (I)で表される化合物として好適なものを以下に例示する。 [0068] Suitable compounds represented by the general formula (I) are exemplified below.
[0069] (1) HO- Ge2- Te2- Ge2- 5Ce2- C- A- G- C- A- A- T- G- T- Ae2- Ge2- Te2- Ge2t- H [0069] (1) HO- G e2 - T e2 - G e2 - 5C e2 - C- A- G- C- A- A- T- G- T- A e2 - G e2 - T e2 - G e2t - H
(2) HO— Ge2— Te2— Ge2— 5Ce2— 5Ce2— A— G— C— A— A— T— G— T— Ae2— Ge2— Te2— Ge2t— H (2) HO— G e2 — T e2 — G e2 — 5C e2 — 5C e2 — A— G— C— A— A— T— G— T— A e2 — G e2 — T e2 — G e2t — H
(3) HO— Ge2— Te2— Ge2— 5Ce2— C— A— G— C— A— A— T— G— Te2— Ae2— Ge2— Te2— Ge2t— H (3) HO— G e2 — T e2 — G e2 — 5C e2 — C— A— G— C— A— A— T— G— T e2 — A e2 — G e2 — T e2 — G e2t — H
(4) HO- Ge2- Te2- Ge2- 5Ce2- 5Ce2- A- G- C- A- A- T- G- Te2- Ae2- Ge2- Te2- Ge2t- H (4) HO- G e2 - T e2 - G e2 - 5C e2 - 5C e2 - A- G- C- A- A- T- G- T e2 - A e2 - G e2 - T e2 - G e2t - H
(5) HO— Ge2— Te2— Ge2— 5Ce2— 5Ce2— Ae2— G— C— A— A— T— G— Te2— Ae2— Ge2— Te2— Ge2t— H :6) HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-Ge2-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H ：7) HO-Ge2-Te2-G-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-G-Te2-Ge2t-H (5) HO— G e2 — T e2 — G e2 — 5C e2 — 5C e2 — A e2 — G— C— A— A— T— G— T e2 — A e2 — G e2 — T e2 — G e2t — H : 6) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -5C e2 -AGCAATG e2 -T e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H: 7) HO-G e2 -T e2 - G-5C e2 -CAGCAATGTA e2 -GT e2 -G e2t -H
:8) HO-Ge2-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-G-Te2-Ge2t-H ：9) HO-Ge2-Te2-G-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-G-Te2-Ge t-H :10) HO-Ge2-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H :11) HO-Ge2-Te2-G-5Ce2-5Ce2-Ae2-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H :12) HO-Ge2-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-Ge2-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H :13) HO-G-Te2-G-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-G-Te2-Ge2t-H : 8) HO-G e2 -T e2 -G-5C e2 -5C e2 -AGCAATGTA e2 -GT e2 -G e2t -H: 9) HO-G e2 -T e2 -G-5C e2 -CAGCAATGT e2 -A e2 -GT e2 -G et -H: 10) HO-G e2 -T e2 -G-5C e2 -5C e2 -AGCAATGT e2 -A e2 -GT e2 -G e2t -H: 11) HO-G e2 -T e2 -G-5C e2 -5C e2 -A e2 -GCAATGT e2 -A e2 -GT e2 -G e2t -H: 12) HO-G e2 -T e2 -G-5C e2 -5C e2 -AGCAATG e2 -T e2 - A e2 -GT e2 -G e2t -H: 13) HO-GT e2 -G-5C e2 -CAGCAATGTA e2 -GT e2 -G e2t -H
:14) HO-G-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-G-Te2-Ge2t-H :15) HO-G-Te2-G-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H : 14) HO-GT e2 -G -5C e2 -5C e2 -AGCAATGTA e2 -GT e2 -G e2t -H: 15) HO-GT e2 -G-5C e2 -CAGCAATGT e2 -A e2 -GT e2 -G e2t -H
:16) HO-G-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H :17) HO-G-T°2-G-5Ce2-5Ce2-Ae2-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H :18) HO-G-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-Ge2-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H :19) HO-G-Te2-G-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-G-Te2-G -H : 16) HO-GT e2 -G -5C e2 -5C e2 -AGCAATGT e2 -A e2 -GT e2 -G e2t -H: 17) HO-GT ° 2 -G-5C e2 -5C e2 -A e2 -GCAATGT e2 -A e2 -GT e2 -G e2t -H : 18) HO-GT e2 -G-5C e2 -5C e2 -AGCAATG e2 -T e2 -A e2 -GT e2 -G e2t -H: 19) HO-GT e2 -G-5C e2 -CAGCAATGTA e2 -GT e2 -G -H
:20) HO-G-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-G-Te2-G -H : 20) HO-GT e2 -G -5C e2 -5C e2 -AGCAATGTA e2 -GT e2 -G -H
[21) HO- G- Te2- G- 5Ce2- C- A- G- C- A- A- T- G- Te2- Ae2- G- Te2- H [21) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - C- A- G- C- A- A- T- G- T e2 - A e2 - G- T e2 - H
:22) HO— G— Te2— G— 5Ce2— 5Ce2— A— G— C— A— A— T— G— Te2— Ae2— G— Te2— H :23) HO- G- Te2- G- 5Ce2- 5Ce2- Ae2- G- C- A- A- T- G- Te2- Ae2- G- Te2- H :24) HO-G-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-Ge2-Te2-Ae2-G-Te2-G -H :25) HO-G-Te2-G-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-A-G-Te2-G -H : 22) HO— G— T e2 — G— 5C e2 — 5C e2 — A— G— C— A— A— T— G— T e2 — A e2 — G— T e2 — H: 23) HO- G - T e2 - G- 5C e2 - 5C e2 - A e2 - G- C- A- A- T- GT e2 - A e2 - GT e2 - H: 24) HO-GT e2 -G-5C e2 -5C e2 -AGCAATG e2 -T e2 -A e2 -GT e2 -G -H: 25) HO-GT e2 -G-5C e2 -CAGCAATGTAGT e2 -G -H
:26) HO-G-Te2-G-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-A-G-Te2-G -H : 26) HO-GT e2 -G -5C e2 -5C e2 -AGCAATGTAGT e2 -G -H
:27) HO- G- Te2- G- 5Ce2- C- A- G- C- A- A- T- G- Te2- A- G- Te2 - - H : 27) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - C- A- G- C- A- A- T- G- T e2 - A- G- T e2 - - H
:28) HO- G- Te2- G- 5Ce2- 5Ce2- A- G- C- A- A- T- G- Te2- A- G- Te2- - H : 28) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - 5C e2 - A- G- C- A- A- T- G- T e2 - A- G- T e2 - - H
:29) HO- G- Te2- G- 5Ce2- 5Ce2- Ae2- G- C- A- A- T- G- Te2- A- G- Te2- G1- H :30) HO- G- Te2- G- 5Ce2- 5Ce2- A- G- C- A- A- T- Ge2- Te2- A- G- Te2- G'- H : 29) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - 5C e2 - A e2 - G- C- A- A- T- G- T e2 - A- G- T e2 - G 1 - H: 30) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - 5C e2 - A- G- C- A- A- T- G e2 - T e2 - A- G- T e2 - G'- H
31) HO-Ge2s-Te2s-Ge2s-5Ce2s-Cs-As-Gs-Cs-As-As-Ts-Gs-T -Ae2s-Ge2s-Te2s-G'31) HO-G e2s -T e2s -G e2s -5C e2s -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T -A e2s -G e2s -T e2s -G '
32) HO- Ge2s - Te2s- Ge2s- 5Ce2s- 5Ce2s- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Ts- Ae2s- Ge2s- Te2s-32) HO-G e2s -T e2s -G e2s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G e2s -T e2s-
33) HO— Ge2s - Te2s— Ge2s— 5Ce2s— Cs— As— Gs— Cs— As— As— Ts— Gs— Te2s— Ae2s— Ge2s— Te2s— ( (34) HO — T — G -5C -5C —A— G— C—A—A— T— G— T —A — G — T — G -33) HO— G e2s -T e2s — G e2s — 5C e2s — C s — A s — G s — C s — A s — A s — T s — G s — T e2s — A e2s — G e2s — T e2s — ( (34) HO — T — G -5C -5C —A— G— C—A—A— T— G— T —A — G — T — G-
H H
ピ 、 Pi
(35) HO — T — G - 5C — 5C —A — G— C—A—A— T— G— T —し ― 1 —し(35) HO — T — G-5C — 5C —A — G— C—A—A— T— G— T — And — 1 —
- H -H
n  n
(36) HO — T — G - o -5C —A— G— C—A—A— T— G — T —A — G — T — G (36) HO — T — G — o -5C —A— G— C—A—A— T— G — T —A — G — T — G
- H -H
(37) HO Ge2s- Te2s- Gs- 5Ce2s- Cs- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Ts- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2t- H(37) HO G e2s -T e2s -G s -5C e2s -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(38) HO Ge2s- Te2s- Gs- 5Ce2s- 5Ce2s- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Ts- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2し H(38) HO G e2s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s -T e2s -G e2 and H
(39) HO (39) HO
(40) HO -Ge2s-Te2s-Gs-5Ce2s-5Ce2s-As-Gs-Cs-As-As-Ts-Gs-Te2s-Ae2s-G-Te2s-Ge2t-H(40) HO -G e2s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -GT e2s- G e2t -H
(41) HO ―ハ 「 「。 — — —八 八 丁 s 丁 — -ハ s 丁 — e2t g 厂 ハ 丁 丁 (41) HO - Ha "" -. - - eighty-eight Ding Ding s - - ha s Ding - e2t g厂Ha Ding Ding
(42) HO - Ge (42) HO-G e
「ハ -j -j j "Ha -j -j j
(43) HO - Gs - Gs - 5C - -C-Asし Gsし cs - As -A-Ts - Gs (43) HO-G s -G s -5C--CA s and G s c s -A s -AT s -G s
-j -j  -j -j
(44) HO - Gs -5Ce2s- -5C°2s- - cs_ (44) HO-G s -5C e2s -- 5C ° 2s --c s _
(45)
Figure imgf000027_0001
(45)
Figure imgf000027_0001
(46) HO - Gs - Gs -5Ce2s- -5C°2s- - As_ Gs- - cs_ -A-As- -r- -j -j j j (46) HO-G s -G s -5C e2s -- 5C ° 2s --A s _ G s --c s _ -AA s --r- -j -jjj
(47) HO - Gs -Gs -5Ce2s- -5Ce2s- -Ae2s-G -C -A-A s - T (47) HO-G s -G s -5C e2s -- 5C e2s --A e2s -G -C -AA s -T
(48) HO Gs - Gs -5Ce2s- -5Ce2s- -As- - Gs- -cs- -A-As- - -ハ (48) HO G s -G s -5C e2s -- 5C e2s --A s --G s --c s --AA s ---
(49) HO Gs - Gs -5Ce2s- -C-As -Gs -cs - As -A-Ts - Gs — T s— A e2s— G s— T e2s— Gt— H (49) HO G s -G s -5C e2s --CA s -G s -c s -A s -AT s -G s — T s — A e2s — G s — T e2s — G t— H
-j / -j t j -j / -j t j
(50) HO Gs ■Te2s- - Gs - 5Ce2s- - 5Ce2s- -As- - Gs- -cs- -As-As- -j ^ -j /— t j j(50) HO G sT e2s --G s -5C e2s --5C e2s --A s --G s --c s --A s -A s --j ^ -j / — tjj
(51) HO Gs ■Te2s- - Gs - 5Ce2s- -C-As -Gs -cs - As -A-Ts - Gs (51) HO G sT e2s --G s -5C e2s --CA s -G s -c s -A s -AT s -G s
(52) HO Gs -Te2s- - Gs - 5Ce2s- - 5Ce2s- -As- - Gs- -cs- -As-As- -r- rj -j t j j ハ t(52) HO G s -T e2s --G s -5C e2s --5C e2s --A s --G s --c s --A s -A s --r- rj -jtjj
(53) HO Gs - Gs - 5Ce2s- - 5Ce - -Ae2s-G s-c s- As- A s - T (53) HO G s -G s -5C e2s --5C e --A e2s -G s -c s -A s -A s -T
ハ ハ t Ha ha t
(54) HO Gs ■Te2s- - Gs - 5Ce2s- - 5Ce2s_ -As- Gs- cs- -As-As- -r-(54) HO G sT e2s --G s -5C e2s --5C e2s _ -A s -G s -c s --A s -A s --r-
(55) HO Gs ■Te2s- - Gs - 5Ce2s- -C-As - Gs - Cs - As -A-Ts - Gs -Ts-As-Gs-Te2s-G-H (55) HO G s ■ T e2s - - G s - 5C e2s - -CA s - G s - C s - A s -AT s - G s -T s -A s -G s -T e2s -GH
(56) HO Gs ■Te2s- - Gs —丁 — — — H (56) HO G s ■ T e2s --G s —Ding — — — H
- 5Ce2s- - 5Ce2s_ -As- Gs- cs- -As-As- -r_ -5C e2s --5C e2s _ -A s -G s -c s --A s -A s --r_
(57) HO Gs - Gs - 5Ce2s- -C-As - Gs - cs - As -A-Ts - Gs — T e2s— A s— G s— T e2s— Gt— H (57) HO G s -G s -5C e2s --CA s -G s -c s -A s -AT s -G s — T e2s — A s — G s — T e2s — G t— H
(58) HO Gs -Gs - 5Ce - -5C°2s- -As- Gs- cs- -A-As- -G-T^-A-G-T^-G-H H— p— 丄— o— v—丄— o—丄— v— v— s— o— v— ^ s- -0-— 丄- OH (58) HO G s -G s -5C e --5C ° 2s --A s -G s -c s --AA s --GT ^ -AGT ^ -GH H— p— 丄 — o— v— 丄 — o— 丄 — v— v— s— o— v— ^ s- -0-— 丄-OH
H— p— 丄— O— V—丄— O—丄— V— V— S— O— V— S- ,DS- -0- — 丄- OH H— ,0— 丄— O— V— ^丄— O—丄— V— V— S— O— V— ^ s- ,DS- -0- - 丄- OH  H— p— 丄 — O— V— 丄 — O— 丄 — V— V— S— O— V— S-, DS- -0- — 丄-OH H—, 0— 丄 — O— V— ^丄 — O— 丄 — V— V— S— O— V— ^ s-, DS- -0--丄-OH
H— ,0— 丄— O— V— 丄— O—丄— V— V— S— o— v— :) s- ,DS- -0- - 丄- OH  H—, 0— 丄 — O— V— 丄 — O— 丄 — V— V— S— o— v— :) s-, DS- -0--丄-OH
H— ,0— 丄— O— V— 丄— O—丄— V— V— S— o— v— :) s- ,DS- -0- - 丄- OH  H—, 0— 丄 — O— V— 丄 — O— 丄 — V— V— S— o— v— :) s-, DS- -0--丄-OH
H— — 丄— O— V— 丄— O—丄— V— V— S— O— V— S- ,DS- -0- - 丄- OH  H— — 丄 — O— V— 丄 — O— 丄 — V— V— S— O— V— S-, DS- -0--丄-OH
H— — 丄— O— V—丄— O—丄— V— V— S— o— v— :) s- ,DS- -0- - 丄- OH  H— — 丄 — O— V— 丄 — O— 丄 — V— V— S— o— v— :) s-, DS- -0--丄-OH
H— p— 丄— O— V—丄— O—丄— V— V— S— O— V— S- ,DS- -0- - 丄- OH  H— p— 丄 — O— V— 丄 — O— 丄 — V— V— S— O— V— S-, DS- -0--丄-OH
,DS- -0- - 丄- OH  , DS- -0--丄-OH
H— ao a丄— o— 丄— o—丄— v— v— s— o v— s- ,DS- -0- — 丄- OH H— a o a丄 — o— 丄 — o— 丄 — v— v— s— ov— s-, DS- -0- — 丄-OH
H— o— 丄— o— v— 丄— o—丄— v— v— s— o— v— ^ s- ,DS- -0- — 丄- OH  H— o— 丄 — o— v— 丄 — o— 丄 — v— v— s— o— v— ^ s-, DS- -0- — 丄-OH
H— O 丄— O V— O—丄— V— V—つ S— O— V—つ s- ,DS- -0- — 丄- OH  H— O 丄 — O V— O— 丄 — V— V— One S— O— V— One s-, DS- -0- — 丄-OH
H— o 丄— o v—丄— o—丄— v— v—つ s— o— v— ^ s- ,DS- -0- — 丄- OH  H— o 丄 — o v— 丄 — o— 丄 — v— v— s— o— v— ^ s-, DS- -0- — 丄-OH
H— O— 丄— O— V—丄— O—丄— V— V— S— O— V— S- ,DS- -0- — 丄- OH  H— O— 丄 — O— V— 丄 — O— 丄 — V— V— S— O— V— S-, DS- -0- — 丄-OH
H- 0 丄- 0 V- 丄 0-丄- V- V- S- 0- V- s- s- 0- ,丄 OH  H- 0 丄-0 V- 丄 0- 丄-V- V- S- 0- V- s- s- 0-, OH OH
H- 0 丄- o v- 丄- o-丄- v- v- s- o v- s- s- o- ,1— OH  H- 0 丄-o v- 丄-o- 丄-v- v- s- o v- s- s- o-, 1—OH
H— o— 丄— o— v— 丄— o—丄— v— v— s— o— v— ^ s— ^ s— o— ,1— ― OH  H— o— 丄 — o— v— 丄 — o— 丄 — v— v— s— o— v— ^ s— ^ s— o—, 1— — OH
H— o— 丄— o— v— 丄— o—丄— v— v—つ s— o— v—つ s— ^ s— o— OH  H— o— 丄 — o— v— 丄 — o— 丄 — v— v— s— o— v— s— ^ s— o— OH
H— o— 丄— o— v—丄— o—丄— v— v—つ s— o— v— ^ s— ^ s— o— ,1— ― OH  H— o— 丄 — o— v— 丄 — o— 丄 — v— v— s— o— v— ^ s— ^ s— o—, 1— — OH
H— o 丄— o v—丄— o—丄— v— v—つ s— o— v—つ s— ^ s— o- OH  H— o 丄 — o v— 丄 — o— 丄 — v— v— s— o— v— s— ^ s— o- OH
H- 0- 丄- 0-aV- 丄- -丄- V- V-つ」 - O- V- ,1— ― OH H- 0- 丄-0- a V- 丄--丄-V- V- ""-O- V-, 1— ― OH
H- 0- 0-aV- 一 - V- V- j - - V- S- S- OH H- 0- 0- a V- One-V- V- j--V- S- S- OH
H 丄 OH  H 丄 OH
H J _ J J 丄 OH  H J _ J J 丄 OH
H _ 丄 OH  H _ 丄 OH
H a0— 丄— O— V—丄— O—丄— V— V—つ S— O— V—つ s— つ s— o— 丄 OH H a 0— 丄 —O—V— 丄 —O— 丄 —V—V—one S—O—V—one s—one s—o— 丄 OH
H J 丄 s*-^ 丄 si sつ T - n  H J 丄 s *-^ 丄 si s T-n
SS9 s OH S S 9 s OH
H J 丄 丄 si つ T - n  H J 丄 丄 si Tsu T-n
SS9 s OH S S 9 s OH
6CCTZ0/S00Zdf/X3d 93 .0S6S0/900Z OAV (87) HO- G - Te2- G- 5Ce2 - 5C- A- G- 5C- A- A - T- G- Te2 - A- G- Te2- G1- H 6CCTZ0 / S00Zdf / X3d 93.0S6S0 / 900Z OAV (87) HO- G - T e2 - G- 5C e2 - 5C- A- G- 5C- A- A - T- G- T e2 - A- G- T e2 - G 1 - H
(88) HO— G- Te2— G— 5Ce2 - 5Ce2— A— G— 5C- A - A- T— G- Te2 - A— G- Te2— - H (88) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - 5C e2 - A- G- 5C- A - A- T- G- T e2 - A- G- T e2 - - H
(89) HO- G- Te2- G- 5Ce2 - 5Ce2- Ae2- G- 5C- A - A- T- G- Te2- A- G- Te2- G1- H (89) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - 5C e2 - A e2 - G- 5C- A - A- T- G- T e2 - A- G- T e2 - G 1 - H
(90) HO- G- Te2- G- 5Ce2- 5Ce2- A- G- 5C- A- A- T- Ge2- Te2- A- G- Te2- - H (90) HO- G- T e2 - G- 5C e2 - 5C e2 - A- G- 5C- A- A- T- G e2 - T e2 - A- G- T e2 - - H
(91) HO-Ge2s-Te2s-Ge2s-5Ce2s-5Cs-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-T -Ae2s-Ge2s-Te2s-Ge2t-H(91) HO-G e2s -T e2s -G e2s -5C e2s -5C s -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T -A e2s -G e2s -T e2s -G e2t -H
(92) HO - Ge2 Te2s- Ge2s- 5Ce2s- 5Ce2 As- Gs- 5CS- As- As - Ts - Gs-Ts- Ae2 Ge2s- Te2s- Ge2t - H (92) HO-G e2 T e2s -G e2s -5C e2s -5C e2 A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A e2 G e2s -T e2s- G e2t -H
(93) HO-Ge2s-Te2s-Ge2s-5Ce2s-5Cs-As-Gs-5C -As-As-Ts-Gs-Te2s-Ae2s-Ge2s-Te2s-Ge2t- H (93) HO-G e2s -T e2s -G e2s -5C e2s -5C s -A s -G s -5C -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G e2s -T e2s -G e2t -H
(94) HO- Ge2 Te2 Ge2s - 5Ce2 5Ce2 A- G- 5C- A- A- T - G- Te2s - Ae2s - Ge2 Te2s - Ge2t- H(94) HO- G e2 T e2 G e2s -5C e2 5C e2 A- G- 5C- A- A- T-G- T e2s -A e2s -G e2 T e2s -G e2t -H
(95) HO— Ge2s— Te2 Ge2s - 5Ce2 5Ce - Ae2s— Gs— 5CS— As— As - Ts— Gs— Te2s— Ae2s - Ge2 Te2s— Ge 2t - H (95) HO— G e2s — T e2 G e2s -5C e2 5C e -A e2s — G s — 5C S — A s — A s -T s — G s — T e2s — A e2s -G e2 T e2s — G e 2t -H
(96) HO- Ge2s- Te2s- Ge2s - 5Ce2 5Ce - As - Gs - 5CS- As- As - Ts- Ge2s- Te2s- Ae2s - Ge2 Te2s- Ge 2t - H (96) HO- G e2s -T e2s -G e2s -5C e2 5C e -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A e2s -G e2 T e2s -G e 2t -H
(97) HO— Ge2 Te2s— Gs— 5Ce2s - 5CS— As— Gs - 5CS - As— As— Ts— Gs— Ts - Ae2s - Gs— Te2s— Ge2t—H(97) HO— G e2 T e2s — G s — 5C e2s -5C S — A s — G s -5C S -A s — A s — T s — G s — T s -A e2s -G s — T e2s — G e2t —H
(98) HO- Ge2 Te2 Gs- 5Ce2s - 5Ce2s - As- Gs- 5CS- As- As- Ts - Gs- Ts- Ae2s- Gs- Te2s - Ge2t- H(98) HO-G e2 T e2 G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(99) HO- Ge2s- Te2s- Gs- 5Ce2s- 5CS- As- Gs - 5CS - As- As- Ts- Gs - Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2t- H(99) HO- G e2s -T e2s -G s -5C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2t -H
(100) HO - Ge2s- Te2s- Gs - 5Ce2s- 5Ce2s- As- Gs- 5CS - As- As- Ts- Gs- Te2s - Ae2s- Gs- Te2s- Ge2t- H (100) HO-G e2s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2t -H
(101) HO-Ge2s- Te2s- Gs - 5Ce2s- 5Ce2s - Ae2s- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s - Ae2s- Gs- Te2s- Ge - H (101) HO-G e2s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2s -A e2s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e -H
(102) HO - Ge2s- Te2s- Gs - 5Ce2s- 5Ce2s- As- Gs- 5CS - As- As- Ts- Ge2 Te2s - Ae2 Gs- Te2s - Ge2t - H (102) HO-G e2s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e2 T e2s -A e2 G s- Te 2s -G e2t -H
(103) HO - Gs - Te2s - Gs— 5Ce2s - 5CS— As - Gs - 5CS— As— As— Ts - Gs - Ts - Ae2s— Gs— Te2s— Ge2t— H(103) HO-G s -T e2s -G s — 5C e2s -5C S — A s -G s -5C S — A s — A s — T s -G s -T s -A e2s — G s — T e2s — G e2t — H
(104) HO-Gs-Te2s-G -5Ce2s-5Ce2s-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-Ts-Ae2s-Gs-Te2s-Ge2t-H(104) HO-G s -T e2s -G -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(105) HO- Gs- Te2s - Gs- 5Ce2s - 5CS- As - Gs - 5CS- As- As- Ts - Gs - Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2t - H(105) HO- G s -T e2s -G s -5C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2t -H
(106) HO-Gs-Te2s-Gs-5Ce2s-5Ce2s-As-G -5Cs-As-As-Ts-Gs-Te2s-Ae2s-Gs-Te2s-Ge2t-H(106) HO-G s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G -5C s -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(107) HO- Gs- Te2s - Gs- 5Ce2s- 5Ce2 Ae2 Gs- 5CS - As- As- Ts- Gs- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2し T/JP2005/021339 (107) HO- G s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2 A e2 G s -5C S -A s -A s -T s -G s- Te 2s -A e2s -G s- Te 2s -G e2 T / JP2005 / 021339
(108) HO-Gs-Te2s-Gs-5Ce2s-5Ce2s-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Ge2s-Te2s-Ae2s-G -Te2s-Ge2t- H (108) HO-G s -T e2s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A e2s -G -T e2s -G e2t -H
(109)  (109)
(110)  (110)
(111)
Figure imgf000030_0001
(111)
Figure imgf000030_0001
丁 e2s  Ding e2s
(112) HO- Gs -Gs - 5 5Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs - Te2 Ae2s- Gs- Te2s-。し H 丁 e2s (112) HO- G s -G s - 5 5C e2s - A s - G s - 5C S - A s - A s - T s - G s - T e2 A e2s - G s - T e2s -. Shi H Ding e2s
(113) HO- Gs -Gs - 5 5Ce2s- Ae2s- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- - H 丁 e2s (113) HO- G s -G s -5 5C e2s -A e2s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s -T e2s --H Ding e2s
(114) HO-Gs - Gs - 5 5 Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Ge2s- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- Gt- H (114) HO-G s - G s - 5 5 C e2s - A s - G s - 5 C S - A s - A s - T s - G e2s - T e2s - A e2s - G s - T e2s - Gt- H
(115) HO- Gs _GS — 5Ce2s— 5CS— As— Gs 5CS— As— As一丁 s Gs—丁 s As— Gs—丁 e2s Gl— H (115) HO- G s _G S — 5C e2s — 5C S — A s — G s 5C S — A s — A s 1 s G s — Ding s A s — G s — Ding e2s G l — H
丁 e2s  Ding e2s
(116) HO- Gs - Gs - 5Ce2s- 5Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs - Ts- As- Gs- Te2s- G1- H 丁 e2s (116) HO- G s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A s -G s -T e2s- G 1 -H Ding e2s
(117) HO- Gs - Gs - 5Ce2s- 5CS- As- Gs - 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- As- Gs- Te2s- - H 丁 e2s (117) HO- G s -G s -5C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A s -G s -T e2s- -H Ding e2s
(118) HO- Gs -Gs - 5Ce2s- 5Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs - Te2 As - Gs - Te2s - - H(118) HO- G s -G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s- Te 2 A s -G s- Te 2s-- H
(119) H〇- Gs- -丁 e2S- -Gs - 5Ce2s- 5Ce2s- Ae2s - Gs- 5CS - As- As- Ts- Gs- Te2s- As- Gs- Te2s- G1- H(119) H〇- G s -- Tick e2S --G s -5C e2s -5C e2s -A e2s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A s- G s -T e2s -G 1 -H
(120) HO- Gs- -Te2s- - Gs - 5Ce2s- 5Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Ge2s- Te2s- As- Gs- Te2s- G1- H(120) HO- G s --T e2s --G s -5C e2s -5C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A s -G s -T e2s -G 1 -H
(121) HO- Ge — Tel— - Ge 1 - 5Cel- C- A- G- C- A- A- T- G- T- Ael- Gel- Tel- Gelし H (121) HO- G e - T el - - G e 1 - 5C el - C- A- G- C- A- A- T- G- T- A el - G el - T el - G el and H
^el  ^ el
(122) HO-GeI -Ge 1 - 5Cel- 5Cel- A- G- C- A- A- T- G- T- Ael- Gel- Tel- Gelt- H (122) HO-G eI -G e 1 - 5C el - 5C el - A- G- C- A- A- T- G- T- A el - G el - T el - G elt - H
^el  ^ el
(123) HO- Gel -G°し 5Cel- C- A- G- C- A-A- T- G- Tel- Ael- Gel- Tel- Gelt- H (123) HO- G el -G ° 5C el -C- A- G- C- AA- T- G- T el -A el -G el -T el -G elt -H
丁 el  Ding el
(124) HO- Gel -G°し し 5Cel-A- G- C-A-A- T- G-Tel-Ael- Gel- Tel- Gelt- H(124) HO- G el -G ° 5C el -A- G- CAA- T- GT el -A el -G el -T el -G elt -H
(125) HO- Gel Ge 5Cel- 5Cel- Ael- G- C - A- A- T- G- Tel - Ael- Gel - Tel - Gelt- H (125) HO- G el G e 5C el -5C el -A el -G- C-A- A- T- G- T el -A el -G el -T el -G elt -H
T。i  T. i
(126) HO- Gel G° - 5CeI- 5Cel- A- G- C- A- A- T- Gel- Tel- Ael- Gel- Tel- Gelt- H(126) HO- G el G ° -5C eI -5C el -A- G- C- A- A- T- G el -T el -A el -G el -T el -G elt -H
(127) HO- Gel G- 5Cel- C- A- G- C- A- A- T- G- T- Ael- G- Tel- Gelt- H (127) HO- G el G- 5C el -C- A- G- C- A- A- T- G- T- A el -G- T el -G elt -H
(128) HO- Gel G- 5Cel- 5Cel- A- G- C- A-A- T- G- T- Ael- G- Tel- Gelt - H (128) HO- G el G- 5C el -5C el -A- G- C- AA- T- G- T- A el -G- T el -G elt -H
(129) HO- Gel- Tel- G- 5Cel- C- A- G - C- A- A- T- G- Tel- Ael - G- Tel - Gelt- H (129) HO- G el -T el -G- 5C el -C- A- G-C- A- A- T- G- T el -A el -G- T el -G elt -H
(130) HO— Gel— Te G— 5Cel— 5Ce'— A— G - C— A - A— T— G— Tel— Ael— G— TeI - Gelt - H (130) HO— G el — T e G— 5C el — 5C e '— A— G-C— A-A— T— G— T el — A el — G— T eI -G elt -H
(131) HO- Gel- Tel- G- 5Cel- 5Cel- Ael- G- C- A - A- T- G- Tel- Ael- G - Tel- Gelt- H (131) HO- G el -T el -G- 5C el -5C el -A el -G- C- A-A- T- G- T el -A el -G-T el -G elt -H
(132) HO- Gel- Tel- G- 5Cel- 5Cel- A- G- C- A- A- T- Gel- Tel- Ael- G- Tel- Gelt- H (132) HO- G el -T el -G- 5C el -5C el -A- G- C- A- A- T- G el -T el -A el -G- T el -G elt -H
(133) HO- G- Tel- G-5Cel- C- A- G- C- A- A- T- G- T- Ael- G- Tel- Gelt- H (134) HO G- - -G- -5C°し 5Cel- - A- G-C-A-A-T-G-T-Ael-G-Tel-Gelt-H (133) HO- G- T el -G-5C el -C- A- G- C- A- A- T- G- T- A el -G- T el -G elt -H (134) HO G---G- -5C ° 5C el --A- GCAATGTA el -GT el -G elt -H
(135) HO G- - -G- -5C° -C-A- -G- -C-A-A-T-G-Tel-Ael-G-Tel-Gelt-H (135) HO G---G- -5C ° -CA- -G- -CAATGT el -A el -GT el -G elt -H
(136) HO G- - -G- -5C° L 5Cel- - A- G-C-A-A-T-G-Tel-Ael-G-Tel-Gelt-H(136) HO G---G- -5C ° L 5C el --A- GCAATGT el -A el -GT el -G elt -H
(137) HO G- - -G- -5C°し 5Cel- - Aeし G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- G- Tel- Gelt- H(137) HO G---G- -5C ° 5C el --A e G- C- A- A- T- G- T el -A el -G- T el -G elt -H
(138) HO G- - -G- -5C°し 5Cel- - A- G-C-A-A-T-Gel-Tel-Ael-G-Tel-Gelt-H(138) HO G---G- -5C ° 5C el --A- GCAATG el -T el -A el -GT el -G elt -H
(139) HO G- - -G- -5C° -C-A- -G- -C-A-A-T-G-T-Ael-G-Tel-G -H (139) HO G---G- -5C ° -CA- -G- -CAATGTA el -GT el -G -H
(140) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - A- G— C— A— A— T— G— T— Ael— G— Tel— — H (140) HO G- -T e -G--5C e -5C el --A- G— C— A— A— T— G— T— A el — G— T el — — H
(141) HO G- -Te -G- - 5Ce -C-A- -G- -C-A-A-T-G-Tel-Ael-G-Tel-G -H (141) HO G- -T e -G--5C e -CA- -G- -CAATGT el -A el -GT el -G -H
(142) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - A- G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- G- Tel- H (142) HO G- -T e -G--5C e -5C el --A- G- C- A- A- T- G- T el -A el -G- T el -H
(143) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - Aeし G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- G- Tel- - H(143) HO G- -T e -G--5C e -5C el --A e G- C- A- A- T- G- T el -A el -G- T el --H
(144) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - A- G- C- A- A- T- Gel- Tel- Ael- G- Tel- H(144) HO G- -T e -G--5C e -5C el --A- G- C- A- A- T- G el -T el -A el -G- T el -H
(145) HO G- -Te -G- - 5Ce -C-A- -G- -C-A-A-T-G-T-A-G-Tel-G -H (145) HO G- -T e -G--5C e -CA- -G- -CAATGTAGT el -G -H
(146) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - A- -G-C-A-A-T-G-T-A-G-Tel-G -H (146) HO G- -T e -G- - 5C e -5C el - - A- -GCAATGTAGT el -G -H
(147) HO G- -Te -G- - 5Ce -C-A- -G- -C-A-A-T-G-Tel-A-G-Tel-G -H (147) HO G- -T e -G--5C e -CA- -G- -CAATGT el -AGT el -G -H
(148) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - A- G- C- A- A- T- G- Tel- A- G- Tel- - H (148) HO G- -T e -G--5C e -5C el --A- G- C- A- A- T- G- T el -A- G- T el --H
(149) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - Ae -G-C-A-A-T-G-T^-A-G-T^-G -H (149) HO G- -T e -G- - 5C e -5C el - - A e -GCAATGT ^ -AGT ^ -G -H
(150) HO G- -Te -G- - 5Ce -5Cel- - A- G- C- A- A- T- Gel- Tel- A- G- Tel- H (150) HO G- -T e -G--5C e -5C el --A- G- C- A- A- T- G el -T el -A- G- T el -H
Is r els  Is r els
(151) HO Ge Gels - 5Cels- cs- -As-Gs-Cs-As-As-Ts-Gs-T -Aels-Gels-Tels-(151) HO G e G els -5C els -c s --A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T -A els -G els -T els-
Is sis s -~^s ~ s ^^ols Θ 1 s /-jIs sis s-~ ^ s ~ s ^^ ols Θ 1 s / -j
(152) HO Ge Gels - 5Cels- 5C (152) HO G e G els -5C els -5C
H  H
Gels n^eis eis eis s . s s s . s . s ^s s n^eis . eis eis n^eis e Gels n ^ eis eis eis s. S s s. S. S ^ s s n ^ eis. Eis eis n ^ eis e
(153) HO - T - G -5C - C -A - G - C -A -A - T - G - T -A - G - T - G(153) HO-T-G -5C-C -A-G-C -A -A-T-G-T -A-G-T-G
(154) HO Gels- Tels- Gels- 5Cels- 5Cels- A- G- C- A- A- T- G- Tels- Aels- Gels- Tels- Gelt-(154) HO G els -T els -G els -5C els -5C els -A- G- C- A- A- T- G- T els -A els -G els -T els -G elt-
Gels n^els els els els . els s s . s . s ^s s n^els . els els n^elfS s s n ^ els. Els s n ^ els.
(155) HO — T — G -5C -5C —A — G— C—A—A— T— G— T —A — G — T(155) HO — T — G -5C -5C —A — G— C—A—A— T— G— T —A — G — T
HH
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H  H
(157) HO Gels-Tels-Gs-5Cels-Cs-As-Gs-Cs-As-As-Ts-Gs-Ts-Aels-Gs-Tels-Gelt-H(157) HO G els -T els -G s -5C els -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -G elt -H
(158) HO Gels- Tels- Gs- 5Cels- 5Cels- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Ts- Aels- Gs- Tels- Gelt- 2005/021339 (158) HO G els - T els - G s - 5C els - 5C els - A s - G s - C s - A s - A s - T s - G s - T s - A els - G s - T els -G elt- 2005/021339
159) HO -Gs-5Ce -Cs-As-Gs-Cs-As-A -Ts-Gs-Tels-Aels-Gs-Tels-Gelt-H159) HO -G s -5C e -C s -A s -G s -C s -A s -A -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G elt -H
160) HO -G -T -Gs-5Ce - 5Cels - As- Gs - Cs- As- As- Ts - Gs- Tels- Aels- Gs- Tel Gelt 160) HO -G -T -G s -5C e -5C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T el G elt
161) HO -Gels-Tels-Gs-5Ce - 5Cel Aels- Gs- Cs - As- As- Ts- Gs - Tels- Aels- Gs - Tels- G 161) HO -G els -T els -G s -5C e - 5C el A els - G s - C s - A s - A s - T s - G s - T els - A els - G s - T els -G
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162) HO- Gels- Tels- Gs- 5Ce - 5Cel As- Gs - Cs- As- As- Ts - Gel Tels- Aels- Gs - Tels- Ge 162) HO-G els -T els -G s -5C e -5C el A s -G s -C s -A s -A s -T s -G el T els -A els -G s -T els- G e
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(163) HO-G!一 Te ls-G! -5Ce し Cs- As - Gs- Cs - As- As - Ts - Gs - Ts- Aels- Gs - Tels- Gelt - H(163) HO-G ! One T e ls -G ! -5C e C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -G elt -H
(164) HO - Gs ls - Gs -5C£ :-5Cels- As-Gs- Cs- As - As-Ts - Gs-Ts - Aels-Gs-Tels-Gelt-H(164) HO-G s ls -G s -5C £: -5C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -G elt -H
(165) HO-Gs - Te ls - Gs - 5Ce - Cs-As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gs- Tels- Gelt- H(165) HO-G s -T e ls -G s -5C e -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G elt -H
(166) HO - Gs - Te ls - Gs - 5Ce - 5Cels- As- Gs- Cs- As - As- Ts - Gs- Tels- Aels - Gs- Tels- Ge" - ί(166) HO-G s -T e ls -G s -5C e -5C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G e "-ί
(167) HO - Gs - Te ls - Gs - 5Ce - 5Cels- Aels- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gs- Tels- Gelt-(167) HO-G s -T e ls -G s -5C e -5C els -A els -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G elt-
(168) HO - Gs ls-Gs - 5Ce - 5Cels- As-Gs- Cs- As- As-Ts- Gels-Tels- Aels- Gs- Tels- Gelt-(168) HO-G s ls -G s -5C e -5C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G els -T els -A els -G s -T els -G elt-
(169) HO - Gs - Te ls - Gs - 5Ce -C -A -G -C -A -A -T -G -T -A^ -G -T^ -G -H(169) HO-G s -T e ls -G s -5C e -C -A -G -C -A -A -T -G -T -A ^ -G -T ^ -G -H
(170) HO - Gs s- Gs -5C° - 5Cels- As- Gs- Cs- As - As- Ts- Gs- Ts - Ael Gs- Tels - G1- H(170) HO-G ss -G s -5C ° -5C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A el G s -T els -G 1 -H
(181) HO - Gs s- Gs -5Ce - Cs- As - Gs- Cs- As- As - Ts - Gs - Tels - Aels - Gs - Tels - Gt- H(181) HO-G ss -G s -5C e -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els- Gt- H
(182) HO - Gs s - Gs - 5Ce - 5Cel As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- Ael Gs- Tels- G'- H(182) HO-G ss -G s -5C e -5C el A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A el G s -T els -G ' -H
(183) HO - Gs- s- Gs- -5Ce _5Cels- Aels- Gs - Cs- As - As- Ts- Gs- Tels- Aels - Gs- Tels- G' - H(183) HO-G s - s -G s --5C e _5C els -A els -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G '-H
(184) HO - Gs- s- Gs- - 5Ce - 5Cels- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gels- Tels- Aels- Gs- Tels - - H(184) HO-G s - s -G s --5C e - 5 C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G els -T els -A els -G s -T els --H
〔185) [185]
〔186)
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(186)
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丁  Ding
:187) HO - Gs- s- Gs- -5Cel -Cs - As— Gs— Cs— As— As— Ts Gs - Tels - As— Gs— Tels— G'— H: 187) HO-G s - s -G s --5C el -C s -A s — G s — C s — A s — A s — T s G s -T els -A s — G s — T els — G'— H
:188) HO - Gs- s - Gs- -5Cel - 5Cels- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- As- Gs- Tels - G' - H: 188) HO-G s - s -G s --5C el -5C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A s -G s- T els -G '-H
189) HO - Gs- -Tel -Gs- -5Cel -5Cels— Aels— Gs - Cs— As - As - Ts—Gs— Tels— As— Gs— Tels— G1— H189) HO-G s --T el -G s --5C el -5C els -A els -G s -C s -A s -A s -T s- G s -T els -A s -G s — T els — G 1 — H
190) HO- Gs_ -Tel -Gs- -5Cel -5Cels- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gels- Tels- As- Gs- Tels- G1- H190) HO- G s _ -T el -G s --5C el -5C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G els -T els -A s -G s -Tels -G 1 -H
191) HO- Gel - rし Gel - 5CE - 5C- A- G-5C- A- A- T- G-T- Ael- Gel- Tel- Gelし H191) HO- G el - r and G el - 5C E - 5C- A- G-5C- A- A- T- GT- A el - G el - T el - G el and H
192) HO- Gel - r 【- Gel -5Ce - 5Cel- A - G- 5C- A- A - T- G- T- Ael - Gel- Tel- Gelt- H192) HO- G el -r 【-G el -5C e -5C el -A-G- 5C- A- A-T- G- T- A el -G el -T el -G elt -H
193) HO- Gel - l- Gel - 5Ce _5C- A- G- 5C- A- A- T- G- Tel- Ael - Gel- Tel- Gelt- H193) HO- G el - l -G el -5C e _5C- A- G- 5C- A- A- T- G- T el -A el -G el -T el -G elt -H
194) HO - Gel - Gel - 5Ce -5Cel-A-G-5C-A-A-T-G-Tel-AeI-Gel-Tel-GeIt-H Η 194) HO - G el - G el - 5C e -5C el -AG-5C-AATGT el -A eI -G el -T el -G eIt -H Η
c- η_ 丄- 。 -ΟΗ (ιζζ) c- η_ 丄-. -ΟΗ (ιζζ)
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3S-Ia0-I丄 \ οθ- ΟΗ (96ΐ)3S- Ia 0- I丄 \ οθ- ΟΗ (96ΐ)
3S-Ia0-I丄 \ οθ- ΟΗ (36ΐ) CCTZ0/S00Zdf/X3d .0S6S0/900Z OAV (222) HO- Gels- T -Gels-5Cels-5C6ls-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-r-Aels-Gels-Tels-Ge - H 3S- Ia 0- I丄 \ οθ- ΟΗ (36ΐ) CCTZ0 / S00Zdf / X3d .0S6S0 / 900Z OAV (222) HO-G els -T -G els -5C els -5C 6ls -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -rA els -G els -T els -G e -H
(223) HO-Gels-T - Gels- 5Cels- 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gels- Tels- Ge - H (223) HO-G els -T - G els - 5C els - 5C S - A s - G s - 5C S - A s - A s - T s - G s - T els - A els - G els - T els -G e -H
(224) HO-Gels-T - Gels- 5Cels- 5Cels- A- G- 5C- A- A- T- G- Tels - Aels- Gels- Tels- Gelt- H (224) HO-G els -T - G els - 5C els - 5C els - A- G- 5C- A- A- T- G- T els - A els - G els - T els - G elt - H
(225) HO— Gels— T -Gels-5Cels-5Cels-Aels-Gs-5Cs-As-As-T -Gs-Tels-Aels-Gels-Tels-G elし H (225) HO—G els — T -G els -5C els -5C els -A els -G s -5C s -A s -A s -T -G s -T els -A els -G els -T els -G e l and H
(226) H〇- Gels- T - 5Cels- 5Cels- As- Gs- 5CS - As (226) H〇-G els -T-5C els -5C els -A s -G s -5C S -A s
eIt-H e It -H
(227) H〇- Gel T -Gs -5CeI 5CS- As- Gs- 5CS- As - As- Ts- Gs- Ts - Ael Gs- Tel Gelし H(227) H_〇- G el T -G s -5C eI 5C S - A s - G s - 5C S - A s - A s - T s - G s - T s - A el G s - T el G el and H
(228) HO— Gels— T Gs -5Cels-5Cels-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-Ts-Aels-G -Tels-Gelt-H(228) HO—G els —TG s -5C els -5C els -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G -T els -G elt -H
(229) HO— Gels— T - Gs 5Cels-5Cs-A -Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-Tels-Aels-G -Tels-Gelt-H(229) HO—G els — T-G s 5C els -5C s -A -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G -T els -G elt -H
(230) HO— Gels— T Gs -5CB1 -5CB15-A -Gs-5CS-As-A -Ts-Gs-Tels-Aels-Gs-Tels-Gelt H (230) HO—G els —TG s -5C B1 -5C B15 -A -G s -5C S -A s -A -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G elt H
(231) HO-Gels-T 。- G。- 5 1 - 5 1 Aels-Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels - Gs (231) HO-G els -T. -G. - 5 1 - 5 1 A els -G s - 5C S - A s - A s - T s - G s - T els - A els - G s
- H -H
(232) HO- Gels - T' し Gs- 5Cels- 5Cel As-Gs- 5CS- As- As- Ts- Gels- Tels - Aels- Gs (232) HO-G els -T 'and G s - 5 C els -5C el A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G els -T els -A els -G s
- H -H
(233) HO-G -T6 Gs- 5Cel 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Ts- Ael Gs- Tel (233) HO-G -T 6 G s -5C el 5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A el G s -T el
(234) HO-Gs-Te Gs- 5Cels- 5Cels- As- Gs- 5CS- As - As- Ts- Gs - Ts- Aels - Gs- Tels (234) HO-G s -T e G s -5C els -5C els -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els
(235) HO— Gs— Te Gs- 5Cels- 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels - Gs- Tels (235) HO- G s - T e G s - 5C els - 5C S - A s - G s - 5C S - A s - A s - T s - G s - T els - A els - G s - T els
(236) HO— Gs— Te G -5Cels-5Cels-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-Tels-Aels-Gs-Tel (236) HO- G s - T e G -5C els -5C els -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T el
(237) HO-Gs— Te: Gs-5Cels-5Cels-Aels-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-Tels-Aels-Gs-T (237) HO-G s — Te : G s -5C els -5C els -A els -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s- T
H H
(238) HO-G -G -5Cels-5Cels-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gels-Tels-Aels-Gs-T (238) HO-G -G -5C els -5C els -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G els -T els -A els -G s -T
H H
(239) HO-G -T' Gs - 5Cels- 5CS- As- Gs- 5CS - As- As- Ts- Gs- Ts- Aels- Gs- Tels- Gt- H (230) HO-G -T' Gs - 5Cels- 5Cels- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Ts- Aels- Gs- Tels- G'- H (231) HO- Gs - r S-Gf - 5Ce ls-5Cs - As- Gs- 5CS- As-As- Ts- Gs- Tels- Ael Gs- Tels- - H(239) HO-G -T 'G s -5C els -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -Gt- H (230) HO-G -T 'G s -5C els -5C els -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -G'- H (231) HO- G s -r S -G f -5C e ls -5C s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T els -A el G s- T els --H
(232) HO- Gs - r S-Gs - 5Ce ls-5Ce ls- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gs- Tels- Gt - H(232) HO- G s -r S -G s -5C e ls -5C e ls -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els -Gt-H
(233) HO- Gs -TeI S-Gs - 5Ce ls-5Ce ls- Aels - Gs- 5CS- As- As- Ts - Gs- Tels- Aels- Gs- Tels- Gt- H(233) HO- G s -T eI S -G s -5C e ls -5C e ls -A els -G s -5 C S -A s -A s -T s -G s -T els -A els- G s -T els -Gt- H
(234) HO-Gs - Tel S-Gs - 5Ce s-5Ce ls- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gels- Tels- Aels- Gs- Tels- Gt- H(234) HO-G s -T el S -G s -5C es -5C e ls -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G els -T els -A els -G s -T els -Gt- H
(235) HO- Gs -Tel S-Gs - 5Ce S-5CS - As- Gs - 5CS - As- As- Ts- Gs- Ts- As- Gs- Tels- H(235) HO- G s -T el S -G s -5C e S -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A s -G s -T els -H
(236) HO— Gs -Tel S-Gs -5CeI S-5C° ' -A -G -SC -A -A -T -G -T -A -G -T^ -G -H(236) HO— G s -T el S -G s -5C eI S -5C ° '-A -G -SC -A -A -T -G -T -A -G -T ^ -G -H
(237) HO-Gs -Tel -Gs -5CeI -5CS - As— Gs - 5CS - As— As— Ts— Gs— Tels— As - Gs— Tels— H (237) HO-G s -T el -G s -5C eI -5C S - A s - G s - 5C S - A s - A s - T s - G s - T els - A s - G s - T els — H
(238) HO-Gs -Tel S-Gs - 5Cel S-5C° ls— As— Gs— 5CS— As— As— Ts— Gs— Tels— As— Gs一 Tels - H(238) HO-G s -T el S -G s -5C el S -5C ° ls — A s — G s — 5C S — A s — A s — T s — G s — T els — A s — G s one T els -H
(239) H〇- Gs -Tel -Gs - 5Cel -5Ce ls- Aels- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tels- As- Gs- Tels- G1 - H(239) H〇- G s -T el -G s -5C el -5C e ls -A els -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T els -A s -G s -T els -G 1 -H
(240) HO- Gs- -Tel -Gs - 5Cel -5Ce 1 As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gels- Tels- As- Gs- Tels- Gし H(240) HO- G s --T el -G s -5C el -5C e 1 A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G els -T els -A s -G s -T els -G and H
(241) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (241) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -CAGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H
(242) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (242) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H
(243) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (243) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -CAGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H
(244) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (244) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H
(245) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-Ae2-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H(245) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -A e2 -GCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H
(246) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce -Ce2-A-G-C-A-A-T-Ge2-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H(246) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e -C e2 -AGCAATG e2 -T e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H
(247) HO- Ge2- Te2- G- Ce2- C- A - G- C- A- A- T- G- T- Ae2- G- Te2 - Ge2t- H (247) HO- G e2 -T e2 -G- C e2 -C- A-G- C- A- A- T- G- T- A e2 -G- T e2 -G e2t -H
(248) HO- Ge2- Te2- G- Ce2- Ce2- A- G- C - A- A - T- G- T - Ae2- G- Te2- Ge2t- H (248) HO- G e2 -T e2 -G- C e2 -C e2 -A- G- C-A- A-T- G- T-A e2 -G- T e2 -G e2t -H
(249) H〇- Ge2- Te2- G- Ce2 - C- A- G- C- A- A- T- G- Te2 - Ae2- G- Te2- Ge2t- H (249) H ○-G e2 -T e2 -G- C e2 -C- A- G- C- A- A- T- G- T e2 -A e2 -G- T e2 -G e2t -H
(250) HO— Ge2— Te2— G— Ce2 - Ce2— A— G— C - A— A - T— G— Te2— Ae2— G— Te2— Ge2t— H (250) HO— G e2 — T e2 — G— C e2 -C e2 — A— G— C-A— A-T— G— T e2 — A e2 — G— T e2 — G e2t — H
(251) HO- Ge2- Te2- G- Ce2 - Ce2- Ae2- G- C - A- A- T- G- Te2- Ae2 - G- Te2 - Ge2t - H 〔252) HO- Ge2- Te2- G- Ce2 - Ce2- A- G- C - A- A - T- Ge2- Te2- Ae2 - G- Te2 - Ge2t - H (251) HO- G e2 - T e2 - G- C e2 - C e2 - A e2 - G- C - A- A- T- G- T e2 - A e2 - G- T e2 - G e2t - H [ 252) HO- G e2 -T e2 -G- C e2 -C e2 -A- G- C-A- A-T- G e2 -T e2 -A e2 -G- T e2 -G e2t -H
:253) HO-G-Te2-G-Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-G-Te2-Ge t-H : 253) HO-GT e2 -GC e2 -CAGCAATGTA e2 -GT e2 -G et -H
:254) HO— G— Te2 - G— Ce2— Ce2— A - G— C— A - A— T— G— T— Ae2— G— Te2 - Ge2'— H : 254) HO— G— T e2 -G— C e2 — C e2 — A-G— C— A-A— T— G— T— A e2 — G— T e2 -G e2 '— H
:255) HO— G— Te2— G— Ce2— C— A— G— C— A - A— T— G— Te2— Ae2— G— Te2 - Ge2し H : 255) HO— G— T e2 — G— C e2 — C— A— G— C— A-A— T— G— T e2 — A e2 — G— T e2 -G e2
:256) H〇— G— Te2— G— Ce2— Ce2— A - G— C— A - A— T - G— Te2 - Ae2— G - Te2— Ge2t— H : 256) H ○ — G— T e2 — G— C e2 — C e2 — A-G— C— A-A— T-G— T e2 -A e2 — G-T e2 — G e2t — H
:257) HO- G-Te2- G- Ce2- Ce2- Ae2- G- C - A- A- T- G- Te2-Ae2 - G- Te2- Ge2t- H : 257) HO- GT e2 -G- C e2 -C e2 -A e2 -G- C-A- A- T- G- T e2 -A e2 -G- T e2 -G e2t -H
258) HO-G-Te2-G-Ce2-Ce2-A-G-C-A-A-T-Ge2-Te2-Ae2-G-Te2-Ge2t-H (259) HO -G-Te2-G-C°2- C- A- G- C- A- A- T- G - T- Ae2- G- Te2- - H 258) HO-GT e2 -GC e2 -C e2 -AGCAATG e2 -T e2 -A e2 -GT e2 -G e2t -H (259) HO -GT e2 -GC ° 2 -C- A- G- C- A- A- T- G-T- A e2 -G- T e2 --H
(260) HO -G-Te2-G-C°2- Ce2- A- G- C - A- A- T- G- T- Ae2- G- Te2- - H (260) HO -GT e2 -GC ° 2 -C e2 -A- G- C-A- A- T- G- T- A e2 -G- T e2 --H
(261) HO -G-Te2-G-C°2- C- A- G- C- A- A- T- G-Te2- Ae2- G- Te2- - H (261) HO -GT e2 -GC ° 2 -C- A- G- C- A- A- T- GT e2 -A e2 -G- T e2 --H
(262) HO -G-Te2-G-C°2- Ce2— A— G— C - A— A— T— G— Te2— Ae2— G— Te2— H (262) HO -GT e2 -GC ° 2 -C e2 — A— G— C-A— A— T— G— T e2 — A e2 — G— T e2 — H
(263) HO G-Te2-G-C° Ce2- Ae2- G- C- A- A- T- G- Te2- Ae2- G- Te2- Gt-H (263) HO GT e2 -GC ° C e2 -A e2 -G- C- A- A- T- G- T e2 -A e2 -G- T e2 -Gt-H
(264) HO -G-Te2-G-C°2- Ce2- A- G- C- A- A- T- Ge2- Te2- Ae2- G- Te2-〇 H (264) HO -GT e2 -GC ° 2 -C e2 -A- G- C- A- A- T- G e2 -T e2 -A e2 -G- T e2 -〇 H
(265) HO- G-Te2-G-Ce2- C-A-G-C-A-A-T-G-T-A-G-Te2-G-H (265) HO- GT e2 -GC e2 - CAGCAATGTAGT e2 -GH
(266) HO- -G-Te2-G-C°2- Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-A-G-Te2-G-H (266) HO- -GT e2 -GC ° 2 -C e2 -AGCAATGTAGT e2 -GH
(267) HO- G-T -G-C C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-A-G-Te2-G-H (267) HO- GT -GC CAGCAATGT e2 -AGT e2 -GH
(268) HO- -G-Te2-G-C°2- Ce2-A-G-C-A-A-T-G-Te2-A-G-Te2-G-H (268) HO- -GT e2 -GC ° 2 -C e2 -AGCAATGT e2 -AGT e2 -GH
(269) HO- -G-Te2-G-C°2- Ce2-Ae2-G-C-A-A-T-G-Te2-A-G-Te2-G-H (269) HO- -GT e2 -GC ° 2 -C e2 -A e2 -GCAATGT e2 -AGT e2 -GH
(270) HO- -G-Te2-G-C°2- Ce2-A-G-C-A-A-T-Ge2-Te2-A-G-Te2-G-H (270) HO- -GT e2 -GC ° 2 -C e2 -AGCAATG e2 -T e2 -AGT e2 -GH
^e2s e2s ^~,e2s ^ e2s e 2s ^ ~, e2s
(271) HO- -Ces-Cs-As-Gs-Cs-As-As-Ts-G-Ts-Ae2s-Ge2s-Te2s-Ge2t (271) HO- -C es -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -GT s -A e2s -G e2s -T e2s -G e2t
(272) HO- 1 Ce2s- Ce2s- As- Gs- Cs- As - As- Ts- Gs- Ts- Ae2s- Ge2s- Te2s- G (272) HO- 1 C e2s -C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G e2s -T e2s -G
^e2s e2s ^~,e2s ^ e2s e 2s ^ ~, e2s
(273) HO- -Ce2s-Cs-As-Gs-Cs-As-As-Ts-G-Te2s-Ae2s-Ge2s-Te2s-G (273) HO- -C e2s -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -GT e2s -A e2s -G e2s -T e2s -G
^e2s e2s ^~,e2s ^ e2s e 2s ^ ~, e2s
(274) HO- Ce2s-Ce2s-As-Gs-Cs-As-As-Ts-G-Te2s-Ae2s-Ge2s-Te2s-( (274) HO- C e2s -C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -GT e2s -A e2s -G e2s -T e2s- (
,e2s  , e2s
(275) HO- T r e2s 「e2s—「e2s— Ae2s— 「s—八 — s— Te2s— e2s—丁  (275) HO- T r e2s “e2s—“ e2s— Ae2s— “s—eight— s— Te2s— e2s—cho
H H
(276)
Figure imgf000036_0001
(276)
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H  H
e2s ^-,e2s ί 厂 e2s  e2s ^-, e2s ί 厂 e2s
(277) HO- ne2s e2t (277) HO- n e2s e2t
G — G C " A Gs— Cs— As— As— Ts— Gs— Ts— Ae2s— Gs— Tezs— Gezt— H e2s r e2s ί 厂 e2s G — GC “AG s — C s — A s — A s — T s — G s — T s — A e2s — G s — T ezs — G ezt — H e2s r e2s ί 厂 e2s
(278) HO- ns Λ e2s ne2s e2t e2s -,e2s ί i e2s (278) HO- n s Λ e2s n e2s e2t e2s-, e2s ί i e2s
(279) HO- G TB— G C"s— C A Gs— Cs— As— As— Ts— Gs— Te2s— Ae2s— Gs— Tezs— Gezt— H e2s !e2s ί i ^-, e2s (279) HO- GT B — GC ” s — CAG s — C s — A s — A s — T s — G s — T e2s — A e2s — G s — T ezs — G ezt — H e2s! E2s ί i ^-, e2s
(280) HO- ,e2s Λ e2s s e2s e2t (280) HO-, e2s Λ e2s s e2s e2t
G"-T^-G-CM-C"-A-G-C-A-A-T-G-Te"-Aes-Gs-Te's-Ge'-H e2s -,e2s ^-, £ i ^-,e2s G "-T ^ -GC M -C" -AGCAATGT e "-A es -G s -T e ' s -G e ' -H e2s-, e2s ^-, £ i ^-, e2s
(281) 2s * e2s s s Λ s Λ s ^s s e2s Λ e2s s me2s e2t ,(281) 2s * e2s ss Λ s Λ s ^ ss e2s Λ e2s s me2s e2t,
HO- e2s ,e2s ^-, £ HO- e2s, e2s ^-, £
(282) HO- G"-T"-G-C"-C"-A-Gs-Cs-As-As-Ts-Ges-Te2s-Ae2s-Gs-Te:2s-Get-H s s s Λ s Λ s s ^s . e2s s ^e2s e2t x T (282) HO- G "-T" -GC "-C" -AG s -C s -A s -A s -T s -G es -T e2s -A e2s -G s -T e: 2s -G et -H sss Λ s Λ ss ^ s. e2s s ^ e2s e2t x T
(283) HO- Ce2s-((283) HO- C e2s- (
— — ce2s— —。 。 — —丁 — Ts— Ae2s— — Ge2t— H— — C e 2s — —. . — —Ding — T s— A e 2s — — G e 2t — H
(284) HO- (285) H〇— Gs - Te2s - Gs— Ce2s— Cs - As— Gs— CS_AS— As— Ts - Gs— Te2s— Ae2 Gs— Te2s - Ge2t—(284) HO- (285) H_〇- G s - T e2s - G s - C e2s - C s - A s - G s - C S _A S - A s - T s - G s - T e2s - A e2 G s - T e2s -G e2t —
(286) H〇— Gs - Te2s - Gs— Ce2s— Ce2 As— Gs— Cs— As - As— Ts - Gs - Te2s— Ae2s— Gs - Te2s— Ge2t (286) H_〇- G s - T e2s - G s - C e2s - C e2 A s - G s - C s - A s - A s - T s - G s - T e2s - A e2s - G s - T e2s — G e2t
(287) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2s- Ae2 Gs - Cs- As - As - Ts- Gs- Te2s - Ae2s- Gs- Te2s - G(287) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A e2 G s -C s -A s -A s -T s -G s- Te 2s -A e2s -G s -T e2s -G
(288) HO— Gs - Te2 Gs— Ce2s— Ce2s— As— Gs— Cs - As - As— Ts—Ge2s— Te2s - Ae2s - Gs— Te2s - Ge (288) HO— G s -T e2 G s — C e2s — C e2s — A s — G s — C s — A s -A s — T s — G e2s — T e2s -A e2s -G s — T e2s -G e
(289) HO- Gs - Te2 Gs- Ce2s- Cs- As- Gs- Cs- As- As - Ts - Gs- Ts- Ae2s- Gs- Te2s- G1- H(289) HO- G s -T e2 G s -C e2s -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s -T e2s -G 1 -H
(290) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- Cs - As - As- Ts- Gs- Ts- Ae2s- G Te2s- G'- H(290) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -GT e2s- G'- H
(291) H〇— Gs— Te2 Gs— Cs— As— Gs— Cs— As— As - Ts - Gs— Te2s— Ae2s— Gs - Te2s—。t一 H(291) H〇— G s — T e2 G s — C s — A s — G s — C s — A s — A s -T s -G s — T e2s — A e2s — G s -T e2s — . t one H
(292) HO-Gs-Te2s-Gs-Ce2s-Ce2s-As-Gs-Cs-As-As-Ts-Gs-Te2s-Ae2s-Gs-Te2s-G -(292) HO-G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G-
(293) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2s- Ae2s - Gs - Cs- As- As - Ts- Gs- Te2s - Ae2s - Gs- Te2s-(293) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A e2s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s-
(294) HO— Gs— Te2s - Gs— Ce2s— Ce2s— As— Gs— Cs - As - As— Ts- Ge2 Te2s - Ae2s—Gs - Te2s - Gt(294) HO— G s — T e2s -G s — C e2s — C e2s — A s — G s — C s -A s -A s — T s -G e2 T e2s -A e2s — G s -T e2s -Gt
(295) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Cs- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Ts- As- Gs - Te2s- - H(295) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A s -G s- T e2s --H
(296) H〇- G Te2s - Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- Cs- As - As- Ts- Gs- Ts - As- Gs- Te2s-。 H(296) H〇-GT e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A s -G s -T e2s -. H
(297) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Cs- As- Gs - Cs- As- As- Ts- Gs- Te2s - As- Gs- Te2s- Qt- H(297) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T e2s -A s -G s- T e2s -Qt- H
(298) HO— Gs— Te2s - Gs— Ce2s— Ce2s - As - Gs— Cs— As— As— Ts— Gs— Te2s— As— Gs - Te2s— Gし H(298) HO— G s — T e2s -G s — C e2s — C e2s -A s -G s — C s — A s — A s — T s — G s — T e2s — A s — G s- T e2s — G and H
(299) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2 Ce2s - Ae2s - Gs- Cs- As- As- Ts - Gs- Te2s- As- Gs- Te2s- G1- H(299) HO- G s -T e2s -G s -C e2 C e2s -A e2s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T e2s -A s -G s -T e2s -G 1 -H
(300) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2s - As - Gs- Cs- As- As- Ts- Ge2s- Te2s- As- Gs-Te2s- Gt-H(300) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A s -G s -T e2s- Gt-H
(301) H〇- Ge2- Te2 - Ge2- Ce2- 5C - A- G- 5C- A- A- T- G- T- Ae2 - Ge2- Te2- Ge2し H(301) H_〇- G e2 - T e2 - G e2 - C e2 - 5C - A- G- 5C- A- A- T- G- T- A e2 - G e2 - T e2 - G e2 Mr. H
(302) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-5C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H 〔303) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-5C-A-G-5C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H304) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-5C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H :305) HO- Ge2- Te2 - Ge2- Ce2- Ce2- Ae2- G- 5C- A- A- T- G - Te2- Ae2 - Ge2- Te2 - Ge2t - H :306) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-5C-A-A-T-Ge2-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H :307) HO - Ge2- Te2- G- Ce2- 5C- A- G- 5C- A- A- T- G- T- Ae2- G- Te2- Ge2t- H :308) HO - Ge2- Te2- G- Ce2- Ce2- A- G- 5C- A- A - T- G - T- Ae2-G- Te2 - Ge2t-H :309) HO- Ge2- Te2- G- Ce2- 5C- A- G- 5C- A- A- T- G- Te2- Ae2- G- Te2- Ge2t- H :310) HO- Ge2- Te2- G- Ce2- Ce2- A- G- 5C- A- A- T- G- Te2- Ae2- G- Te2- Ge2t- H :311) HO- Ge2- Te2- G- Ce2- Ce2- Ae2- G- 5C- A- A- T- G- Te2- Ae2- G- Te2- Ge2し H 312) HO- Ge2- Te2- G - Ce2- Ce2- A- G- 5C- A- A- T- Ge2- Te2 - Ae2- G- Te2- Ge2t- H (302) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AG-5C-AATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (303) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -5C-AG-5C-AATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H304) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AG-5C-AATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H: 305) HO- G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -A e2 -G- 5C- A- A- T- G-T e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H: 306) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AG-5C-AATG e2 -T e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H: 307) HO - G e2 - T e2 - G- C e2 - 5C- A- G- 5C- A- A- T- G- T- A e2 - G- T e2 - G e2t -H: 308) HO-G e2 -T e2 -G- C e2 -C e2 -A- G- 5C- A- A-T- G-T- A e2 -G- T e2 -G e2t- H: 309) HO- G e2 - T e2 - G- C e2 - 5C- A- G- 5C- A- A- T- G- T e2 - A e2 - G- T e2 - G e2t - H: 310 ) HO- G e2 - T e2 - G- C e2 - C e2 - A- G- 5C- A- A- T- G- T e2 - A e2 - G- T e2 - G e2t - H: 311) HO -G e2 -T e2 -G- C e2 -C e2 -A e2 -G- 5C- A- A- T- G- T e2 -A e2 -G- T e2 -G e2 H 312) HO- G e2 -T e2 -G-C e2 -C e2 -A- G- 5C- A- A- T- G e2 -T e2 -A e2 -G- T e2 -G e2t -H
， ()εΐεϋ〇υϋ1Η¾ϋνυ5νν:νϋϋϋ Η--ι--ιι--ιι-ιι-—ι- ¾， () εϋΟ:}ϋ1Ηοϋννν3νϋϋϋ1 Η--ι-ιιιιιιιι-ι-—ι-
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, () Εΐεϋ〇υϋ1Η¾ϋνυ5νν: νϋϋϋ Η--ι--ιι--ιι-ιι-—ι- ¾, () εϋΟ:} ϋ1Ηοϋννν3νϋϋϋ1 Η--ι-ιιιιιιιιιι-ι-—ι-
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¾bs，s)Jbbsssεε ϋοΗ：：IvVsVsvh >ohL H—ιll-l-Il—llll—l- (338) HO- Ge2s- Te2s- Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Ts- Ae2 Gs- Te2 Ge2t- H¾bs, s) Jbbsssεε ϋοΗ :: IvVsVsvh> ohL H—ιll-l-Il—llll—l- (338) HO- G e2s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A e2 G s -T e2 G e2t -H
(339) HO- Ge2s- Te2s- Gs- Ce2 5CS- As- Gs - 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s - Ae2s- Gs- Te2s - Ge2t- H(339) HO- G e2s -T e2s -G s -C e2 5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(340) HO- Ge2 Te2s- Gs- Ce2 Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2t- H(340) HO- G e2 T e2s -G s -C e2 C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(341) HO- Ge2s- Te2s- Gs- Ce2s- Ce2s- Ae2s- Gs- 5CS- As- As- Ts - Gs- Te2s- Ae2s - Gs - Te2s- Ge2t - H(341) HO- G e2s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A e2s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2t -H
(342) HO- Ge2 Te2s- Gs- Ce2 Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Ge2s- Te2s- Ae2s- Gs - Te2s- Ge2t- H(342) HO- G e2 T e2s -G s -C e2 C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(343) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- 5CS- As- Gs- 5CS - As - As- Ts- Gs - Ts - Ae2s- Gs- Te2 Ge2t- H(343) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s- T e2 G e2t -H
(344) HO-Gs-Te2s-Gs-Ce2s-Ce2s-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-T -Ae2s-Gs-Te2s-Ge2t-H(344) HO-G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T -A e2s -G s -T e2s -G e2t -H
(345) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs - Te2s- Ae2s- Gs - Te2s- Ge2t - H(345) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2t -H
(346) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts - Gs - Te2s- Ae2s - Gs - Te2s- Ge2し H(346) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2 and H
(347) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- Ce2s- Ae2s- GS-5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2t- H(347) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A e2s -G S -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2t -H
(348) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Ge2s- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- Ge2t- H(348) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G e2t -H
(349) HO- Gs- Te2s- G Ce2s- 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs - Ts - Ae2s- Gs- Te2s - Gt - H(349) HO- G s -T e2s -GC e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s -T e2s- Gt-H
(350) H〇- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- 5CS - As - As - Ts- Gs - Ts - Ae2s- Gs- Te2 G1- H(350) H〇- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A e2s -G s -T e2 G 1 -H
(351) HO- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- Ae2s- Gs - Te2s- Qt- H(351) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -Qt- H
(352) H〇- Gs- Te2s- Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- 5CS- As- As - Ts - Gs - Te2s- Ae2s - Gs - Te2s- G'- H(352) H〇- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s -T e2s -G'- H
(353) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2 Ae2s- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s- - H(353) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2 A e2s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A e2s -G s -T e2s --H
(354) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2s- As- Gs- 5CS- As - As - Ts - Ge2s- Te2s- Ae2s- Gs- Te2s - Gし H(354) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A e2s -G s- T e2s -G and H
(355) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Ts- As - Gs - Te2s-。 H(355) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A s -G s- T e2s- . H
(356) HO— Gs— Te2s - Gs— Ce2s— Ce2s— As— Gs— 5CS— As - As— Ts— Gs— Ts - As - Gs— Te2s— G'— H(356) HO— G s — T e2s -G s — C e2s — C e2s — A s — G s — 5C S — A s — A s — T s — G s — T s — A s -G s — T e2s — G'— H
(357) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- 5CS- As- Gs- 5CS- As- As- Ts - Gs- Te2s- As- Gs- Te2s- - H(357) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A s -G s- T e2s --H
(358) HO- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2 As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- As- Gs- Te2s - Gし H(358) HO- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2 A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A s -G s -T e2s -G then H
(359) H〇- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2s- Ae2s- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Te2s- As- Gs- Te2s-。し H 〔360) H〇- Gs- Te2s - Gs- Ce2s- Ce2 As- Gs- 5CS- As- As - Ts- Ge2s- Te2s- As- Gs - Te2s- G'- H 〔361) HO- Gel- Tel- Gel- Cel- C- A- G- C- A- A- T- G- T- Ael- Gel- Tel- Ge" - H (359) H〇- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2s -A e2s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T e2s -A s -G s -T e2s- . H (360) H〇- G s -T e2s -G s -C e2s -C e2 A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e2s -T e2s -A s -G s -T e2s -G'- H (361) HO- G el -T el -G el -C el -C- A- G- C- A- A- T- G- T- A el -G el- T el -G e "-H
：362) HO- Gel- Tel - Gel- Cel- Cel - A- G - C- A- A- T- G- T - Ael- Gel- Tel- Gelt- H : 362) HO- G el -T el -G el -C el -C el -A- G-C- A- A- T- G- T-A el -G el -T el -G elt -H
:363) HO- Gel- Tel- Gel- Cel- C- A- G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- Gel- Tel- Gelt- H : 363) HO- G el -T el -G el -C el -C- A- G- C- A- A- T- G- T el -A el -G el -T el -G elt -H
:364) HO- Gel- Tel - Gel- Cel- Cel - A- G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- Gel - Tel- Gelt - H : 364 ) HO- G el -T el -G el -C el -C el -A- G- C- A- A- T- G- T el -A el -G el -T el -G elt -H
:365) HO- Gel- Tel - Gel- Cel- Cel - Ael- G- C- A - A- T- G- Tel- Ael- Gel- Tel- Gelt- H (366) HO- Gel- Tel- Gel- Cel- Cel- A- G- C- A- A- T- Gel- Tel- Ael : 365) HO- G el -T el -G el -C el -C el -A el -G- C- A-A- T- G- T el -A el -G el -T el -G elt- H (366) HO- G el -T el -G el -C el -C el -A- G- C- A- A- T- G el -T el -A el
(367) HO- Gel- Tel- G- Cel- C- A- G- C- A- A- T- G- T- Ael - G- T (367) HO- G el -T el -G- C el -C- A- G- C- A- A- T- G- T- A el -G- T
(368) HO— Gel— Tel— G— Cel— Cel— A— G— C— A— A— T— G— T— Ael— G— (368) HO— G el — T el — G— C el — C el — A— G— C— A— A— T— G— T— A el — G—
(369) HO— Gel— Tel— G— Cel— C— A— G— C— A— A— T— G— Tel— Ael— G— (369) HO— G el — T el — G— C el — C— A— G— C— A— A— T— G— T el — A el — G—
(370) HO- Gel- Tel- G- Cel- Cel- A- G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- G-(370) HO- G el -T el -G- C el -C el -A- G- C- A- A- T- G- T el -A el -G-
(371) HO— Gel— Tel— G— Cel— Cel— Ael— G— C— A— A— T— G— Tel - Ael— (371) HO— G el — T el — G— C el — C el — A el — G— C— A— A— T— G— T el -A el —
(372) HO- Gel- Tel- G- Cel- Cel- A- G- C- A- A- T- Gel- Tel- Ael-(372) HO- G el -T el -G- C el -C el -A- G- C- A- A- T- G el -T el -A el-
(373) HO- -G- - Tel- - G - -c- -A-G-C-A-A-T-G-T-Ael-G-Tel-Gelt-H (373) HO- -G--T el --G--c- -AGCAATGTA el -GT el -G elt -H
(374) HO- - G- - Tel- - G - ce -ceし A - G— C— A— A— T— G— T— Ael - G— Tel— Gelし H (374) HO- - G- - T el - - G - c e -c e and A - G- C- A- A- T- G- T- A el - G- T el - G el and H
(375) HO- - G- - Tel- -G - ce -c- - A— G— C— A— A— T— G— Tel— Ael— G— Tel— Ge "- H (375) HO- - G- - T el - -G - c e -c- - A- G- C- A- A- T- G- T el - A el - G- T el - G e "- H
(376) HO- -G- _Tel- - G- _ce -c£し A - G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- G- Tel- Gelt- H (376) HO- -G- _T el --G- _c e -c £ A-G- C- A- A- T- G- T el -A el -G- T el -G elt -H
(377) HO- -G- _Tel- - G- _ce -ceし Ael- G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- G- Tel- Gelt- H (377) HO- -G- _T el --G- _c e -c e A el -G- C- A- A- T- G- T el -A el -G- T el -G elt -H
(378) HO- -G- _Tel- - G- - ce -ceし八 - G- C- A-A- T- Gel- Tel-Ael- G- Tel-Gelt- H (378) HO- -G- _T el - - G- - c e -c e to eight - G- C- AA- T- G el - T el -A el - G- T el -G elt - H
(379) HO- -G- - Tel- - G- - ce -c- -A-G-C-A-A-T-G-T-Ael-G-Tel-G -H (379) HO- -G--T el --G--c e -c- -AGCAATGTA el -GT el -G -H
(380) HO- -G- - Tel- -G- - ce -ceし A - G— C— A— A— T— G— T— Ael— G— Tel— — H (380) HO- -G- - T el - -G- - c e -c e and A - G- C- A- A- T- G- T- A el - G- T el - - H
(381) HO- - G- - Tel- -G- - ceし C- -A-G-C-A-A-T-G-Tel-Ael-G-Tel-G -H (381) HO--G--T el --G--c e C- -AGCAATGT el -A el -GT el -G -H
(382) HO- - G- - Tel- -G- - ce -ceし A - G— C— A— A— T— G— Tel— Ael— G— Tel— - H (382) HO- - G- - T el - -G- - c e -c e and A - G- C- A- A- T- G- T el - A el - G- T el - - H
(383) HO- - G- - Tel- G- - ce -ceし Ael- G- C- A- A- T- G- Tel- Ael- G- Tel- G1- H (383) HO- - G- - T el - G- - c e -c e and A el - G- C- A- A- T- G- T el - A el - G- T el - G 1 - H
(384) H〇- - G- - Tel_ G- _ce -ceし A - G— C— A— A—T— Gel— Tel— Ael— G— Tel— G1— H (384) H〇--G--T el _ G- _c e -c e A-G— C— A— A—T— G el — T el — A el — G— T el — G 1 — H
(385) HO- - G- -Tel- G- _ce -c- -A-G-C-A-A-T-G-T-A-G-Tel-G -H (385) HO--G- -T el -G- _c e -c- -AGCAATGTAGT el -G -H
(386) HO- - G- -r1- - G- -ceし ceし A - G— C— A— A— T— G— T— A— G— Tel— G'— H (386) HO--G- -r 1 --G- -c e and c e A-G— C— A— A— T— G— T— A— G— T el — G'— H
(387) HO- - G- -Tel- - G- -ce -c- -A-G-C-A-A-T-G-Tel-A-G-Tel-G -H (387) HO--G- -T el --G- -c e -c- -AGCAATGT el -AGT el -G -H
(388) HO- - G- -Tel- G- -ce L ceし A - G- C- A- A- T- G- Tel- A- G- Tel- Gt- H (388) HO--G- -T el -G- -c e L c e A-G- C- A- A- T- G- T el -A- G- T el -Gt- H
(389) HO- -G- -Tel- G- - ceし ceし Ael— G— C— A— A— T— G— Tel— A— G— Tel— G1— H (389) HO- -G- -T el -G--c e and c e A el — G— C— A— A— T— G— T el — A— G— T el — G 1 — H
(390) HO- -G- -Tel- G- - ceし ceし A - G- C- A- A- T- Gel- Tel- A- G- Tel- - H (390) HO- -G- -T el -G--c e and c e A-G- C- A- A- T- G el -T el -A- G- T el --H
is T 5ls  is T 5ls
(391) H〇- -Ge Gel s-ce ls-Cs-As-Gs-Cs-As-As-T -Gs-Ts-Aels-Gels-Tels - Gelt -H (391) H〇- -G e G el s -c e ls -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T -G s -T s -A els -G els -T els -G elt -H
Is 丁 3ls  Is Ding 3ls
(392) HO- -G° Gel s-ce ls-Cels-As-Gs-Cs-As-As-Ts-Gs-T -Aels-Gels-Te ls-G° (392) HO- -G ° G el s -c e ls -C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T -A els -G els -T e ls -G °
Is 丁 5ls  Is Ding 5ls
(393) HO- -G° Gel s-ce ls-Cs-As-Gs-Cs-As-As-T -Gs-Tels-Aels-Gels-Te ls-Ge "-H (394) HO- Gels- Tels- Gels - Cels- Cels- A- G- C- A- A- T- G- Tels- Aels- Gels - Tels - Gelt- H(393) HO- -G ° G el s -c e ls -C s -A s -G s -C s -A s -A s -T -G s -T els -A els -G els -T e ls -G e "-H (394) HO- G els -T els -G els -C els -C els -A- G- C- A- A- T- G- T els -A els -G els -T els -G elt -H
(395) HO- Gels- Tels- Gels - Cels- Cels- Ael Gs - Cs- As- A Ts- Gs- Tels- Aels- Gels- Tels- Ge" - H (395) HO-G els -T els -G els -C els -C els -A el G s -C s -A s -AT s -G s -T els -A els -G els -T els -G e "-H
(396) HO- Gels- Tels- Gels - Cels- Cels- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gel Tels- Aels- Gels- Tels- Gelt - H (396) HO- G els - T els - G els - C els - C els - A s - G s - C s - A s - A s - T s - G el T els - A els - G els - T els -G elt -H
(397) HO- Gel Tels- Gs- Cels - Cs As- Gs Cs- As- As- Ts-Gs- Ts- Aels- Gs- Tels- Gelt- H (397) HO- G el T els - G s - C els - C s A s - G s C s - A s - A s - T s -G s - T s - A els - G s - T els - G elt -H
(398) HO- Gels- Tels- Gs- Cels - Cels- As- Gs- Cs- As - As - Ts- Gs- Ts- Aels - Gs- Tels- Gelt- H(398) HO-G els -T els -G s -C els -C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s- T els -G elt -H
(399) HO- Gels- Tels- Gs- Cel Cs As- Gs Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels - Gs- Tels- Gelt- H(399) HO-G els -T els -G s -C el C s A s -G s C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els- G elt -H
(400) HO- Gels- Tels- Gs- Cels- Ce's- As- Gs- C As- As- Ts- Gs- Te's- Aels- Gs- TeIS- Gelし H (400) HO- G els - T els - G s - C els - C e 's - A s - G s - CA s - A s - T s - G s - T e' s - A els - G s -TeIS -G el and H
(401) HO- Gels- Tels- Gs- Cels - Cel Aels- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gs- Tels - Gelし H(401) HO-G els -T els -G s -C els -C el A els -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G el and H
(402) HO- Gels- Tels- Gs- Cels - Cels- As- Gs- Cs- As - As - Ts- Gel Tels- Ael Gs- Tels - Gelt - H(402) HO-G els -T els -G s -C els -C els -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G el T els -A el G s -T els -G elt -H
(403) HO-G! ls-G!し ce ls-c!し As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs - Ts- Aels- Gs- Tels- Gelt- H(403) HO-G ! Ls -G ! And c e ls -c ! And A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -G elt -H
(404) HO-Gf 1 Gsし Ce ls-ce ;ls- As- Gs-Cs- As- As- Ts- Gs- Ts- Aels- Gs- Tels-Gelt- H(404) HO-G f 1 G s C e ls -c e ; ls -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s- T els -G elt -H
(405) HO-Gs - Te ls-Gs :-ce ls-cs -As-Gs-Cs-As-A-Ts-Gs-Tels-Aels-Gs-Tels-Gelt-H(405) HO-G s -T e ls -G s : -c e ls -c s -A s -G s -C s -A s -AT s -G s -T els -A els -G s- T els -G elt -H
(406) HO-Gs - Te ls-Gs - ce ls-ce ls- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gs- Tels- Gelt- H(406) HO-G s -T e ls -G s -c e ls -c e ls -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els- G s -T els -G elt -H
(407) HO- Gs - Te ls-Gs - ce ls-ce ls- Aels- Gs- Cs- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gs- Tels- Ge"- H(407) HO- G s -T e ls -G s -c e ls -c e ls -A els -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A els- G s -T els -G e "-H
(408) HO-Gs - Te: ls-Gs - ce: ls-ce ls- As- Gs- Cs- As- As- Ts- Gels- Tels - Aels- Gs- Tels- Ge"- H(408) HO-G s -T e: ls -G s -c e: ls -c e ls -A s -G s -C s -A s -A s -T s -G els -T els -A els -G s -T els -G e "-H
(409) HO- Gs Te] ls-Gs - ce: ,s-cs -A-G-C-A-A-T-G-T-A^-G-T^-G-H (409) HO- G s T e] ls -G s -c e :, s -c s -AGCAATGTA ^ -GT ^ -GH
(410) HO- Gs S-Gs - cel ls-ce '-A-G-C-A-A-T-G-T-A^-G-T^-G-H(410) HO- G s S -G s -c el ls -c e '-AGCAATGTA ^ -GT ^ -GH
(411) HO- Gs S-Gs - Ce】 s-cs - As- Gs- Cs- As- As- Ts - Gs - Tels- Aels- Gs- Tels- - H
Figure imgf000041_0001
 (411) HO- G s S -G s - C e ] s -c s - A s - G s - C s - A s - A s - T s - G s - T els - A els - G s - T els --H
Figure imgf000041_0001
(413) HO-Gs- S-Gs- - Cel s- Ce: ls— Aels— Gs— Cs - As— As— Ts— Gs— Tels - Aels— Gs— Tels— G'— H(413) HO-G s - S -G s --C el s -C e : ls — A els — G s — C s -A s — A s — T s — G s — T els -A els — G s — T els — G'— H
(414)
Figure imgf000041_0002
(414)
Figure imgf000041_0002
丁  Ding
(415) HO-Gs- S-Gs- -cel s-cs- _AS- Gs- Cs- As- As- Ts - Gs - Ts- As- Gs- Tels - - H
Figure imgf000041_0003
(415) HO-G s - S -G s --c el s -c s -_A S -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T s -A s -G s -T els --H
Figure imgf000041_0003
(417) HO - Gs- -Tel: S-Gs- - Cel: s-cs- -A-G-C-A-A-T-G-T^-A-G-T^-G-H (417) HO-G s --T el: S -G s --C el: s -c s --AGCAATGT ^ -AGT ^ -GH
(418) HO-Gs- -G-Cel: s-cel -A-G-C-A-A-T-G-T^-A-G-T^-G-H(418) HO-G s --GC el: s -c el -AGCAATGT ^ -AGT ^ -GH
(419) HO - Gs - し Gs- -cel;し cel S-Aels- Gs - Cs - As- As - Ts- Gs- Tels- As - Gs- Tels - - H
Figure imgf000042_0001
(419) HO-G s -then G s --c el; c el S -A els -G s -C s -A s -A s -T s -G s -T els -A s -G s -T els --H
Figure imgf000042_0001
(448) H〇- G- Tel- G- Cel - Cel - A - G- 5C - A - A- T- G - Tel- A- G- Tel- Gt- H (448) H_〇- G- T el - G- C el - C el - A - G- 5C - A - A- T- G - T el - A- G- T el - Gt- H
(449) HO- G- Tel- G- Cel- Cel- Ael- G- 5C- A - A- T- G- Tel- A- G-Tel- Gt- H (449) HO- G- T el -G- C el -C el -A el -G- 5C- A-A- T- G- T el -A- GT el -Gt- H
(450) HO- G - Te '- G- Cel - Ce l - A - G- 5C- A- A- T- Gel- Tel - A- G- TeI- G H (450) HO- G-T e '-G- C el -C el -A-G- 5C- A- A- T- G el -T el -A- G- T eI -GH
(451) HO- Gels - Tels- Gels- Cels- 5CS- As- Gs- 5CS - As- As- Ts- Gs- Ts- Aels- Gels- Tels- Gelt- H(451) HO-G els -T els -G els -C els -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G els- T els -G elt -H
(452) HO- Gels- Tels- Gels- Cels- Cels- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Ts- Aels- Gels- Tels- Gelt- H (452) HO- G els - T els - G els - C els - C els - A s - G s - 5C S - A s - A s - T s - G s - T s - A els - G els - T els -G elt -H
(453) HO- Gels- Tels- Gel Cels- 5CS- As- Gs- 5CS- A As- Ts- Gs- Tels- Ael Gel Tels- Gelt- H (453) HO- G els -T els -G el C els -5C S -A s -G s -5C S -AA s -T s -G s -T els -A el G el T els -G elt- H
(454) HO-Gels-Tels-Gels-Ce]s-Cels-A-G-5C-A-A-T-G-Tels-Aels-GeI s-Tels-Gelt-H(454) HO-G els -T els -G els -C e] s -C els -AG-5C-AATGT els -A els -G eI s -T els -G elt -H
(455) HO- Gels- Tels- Gel Cels- Cels- Aels - Gs- 5CS- As- As- Ts - Gs- Tels- Ael Gels Tels- Gelt - H (455) HO-G els -T els -G el C els -C els -A els -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T els -A el G els T els- G elt -H
(456) HO-Gels-Tels-Gels-CeIs-Cels-As-Gs-5Cs-As-As-T -Gels-Tels-Aels-Gels-Tels-Gelt - H (456) HO-G els -T els -G els -C eIs -C els -A s -G s -5C s -A s -A s -T -G els -T els -A els -G els -T els -G elt -H
(457) HO- Gel Tels- Gs- Cels - 5CS- As - Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Ts - Aels- Gs- Tels- Gelt- H(457) HO- G el T els -G s -C els -5C S -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -G elt -H
(458) HO-Gels-Tels-G -Cels-Cels-As-Gs-5Cs-As-As-Ts-Gs-Ts-Aels-Gs-Tels-Gelt-H(458) HO-G els -T els -G -C els -C els -A s -G s -5C s -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -G elt -H
(459) HO- Gels- Tels- Gs- Cels- Cs- As- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tels- Ae's- Gs- Te! Ge"- H(459) HO-G els -T els -G s -C els -C s -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T els -A e ' s -G s- Te! G e "-H
(460) HO - Gels- Tels- Gs - Cels - Cels- As - Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tel Aels- Gs- Tels Gelt- H b (460) HO-G els -T els -G s -C els -C els -A s -G s -5 C S -A s -A s -T s -G s -T el A els -G s -T els G elt -H b
(461) H〇- Gels- Tels- Gs- Cels- Cels- Aels- Gs- 5CS- As- As- Ts- Gs- Tels- Aels- Gs- Tels- Gelt- H(461) H〇-G els -T els -G s -C els -C els -A els -G s -5 C S -A s -A s -T s -G s -T els -A els -G s -T els -G elt -H
(462) HO - Gels- Tels- Gs - Cels - Cels- As - Gs- 5CS- As- As- Ts- Gels- Tels- Aels - Gs - Tels- Gelt - H(462) HO-G els -T els -G s -C els -C els -A s -G s -5 C S -A s -A s -T s -G els -T els -A els -G s- T els -G elt -H
(463)
Figure imgf000043_0001
(463)
Figure imgf000043_0001
Is 「el:  Is "el:
(464) HO - Gs ls-Gs :-ce -As -G!し 5CS - As- As- し Gs ! (464) HO - G s ls -G s: -c e -A s -G and 5C S - A s - A s - and G s
(465) HO - Gs ls-Gs -5 '、- _Tels— lt— H (465) HO-G s ls -G s -5 ',-_ T e ls — lt — H
- Ce: ls - Gs - 5CS - As- As - Ts - Gs — Tels— Ge r el is 厂 el;-C e: ls -G s -5C S -A s -A s -T s -G s — T e ls — G er el is 厂 el;
466) HO - Gs ls-Gs -ce] !-As - Gs - 5CS- As- As- Ts - Gs ― — Tels— Gelt—H
Figure imgf000043_0002
466) HO-G s ls- G s- c e] ! -A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G s -- T e ls - G e lt - H
Figure imgf000043_0002
.s els  .s els
(468) HO - Gs S-Gs -ceI '- As - Gs - 5CS - As- As - Ts - Ge ls- Tels- Aels- Gs- Tels - Gelt- H(468) HO-G s S- G s- c eI '-A s -G s -5C S -A s -A s -T s -G e ls -T els -A els -G s -T els- G elt -H
(469)
Figure imgf000043_0003
(469)
Figure imgf000043_0003
s ^~,els  s ^ ~, els
(470) HO - Gs Gs - cel - As- - Gs -5CS- As- As - Ts - Gs - Ts- Aels- Gs - Tels- Gt - H(470) HO-G s G s -c el -A s --G s -5C S -A s -A s -T s -G s -T s -A els -G s -T els -Gt-H
(471) HO - Gs Gs- - cel S-5CS - As- - Gs- - 5CS- As - As- Ts- - Gs- -Tels-Aels-Gs-Tels-G -H (471) HO-G s G s --c el S -5C S -A s --G s --5C S -A s -A s -T s --G s --T els -A els -G s -T els -G -H
s sis  s sis
(472) HO - Gs- -Gs- - cel - As- - Gs -5CS- As- As-Ts- -Gs- -Tels-AeIs-Gs-TeIs-G -H (473) HO- -Gs S-Gs - C (472) HO-G s --G s --c el -A s --G s -5C S -A s -A s -T s --G s --T els -A eIs -G s -T eIs -G -H (473) HO- -G s S -G s -C
(474) HO- -Gs - 1 S-Gs - C (474) HO- -G s - 1 S -G s -C
(475) HO- -Gs - 1 S-Gs - C (475) HO- -G s - 1 S -G s -C
(476) HO- -Gs - 1 S-Gs - C (476) HO- -G s - 1 S -G s -C
(477) HO- -Gs - 1 S-Gs - C (477) HO- -G s - 1 S -G s -C
(478) HO- -Gs - 1 S-Gs - C (478) HO- -G s - 1 S -G s -C
(479) HO- - Gs -τΘΐ S-Gs - C (479) HO--G s -τ Θΐ S -G s -C
(480) HO- - Gs -τΘΐ S-Gs -c (480) HO--G s -τ Θΐ S -G s -c
[0070] 上記の好適な化合物のうち、（1)- (6)は、 2，- 0,4，- C-エチレン化されたリボフラノー スを両端に 4な 、し 5個配置したものである。（7)- (12)は、（1)- (6)における 2， - 0,4， - C- エチレン化されたリボフラノース (グァニンが結合)のうちの 2個をデォキシリボフラノー ス（グァニンが結合）に代えたものである。（13)- (18)は、（1)- (6)における 2，- 0,4，- C- エチレン化されたリボフラノース (グァニンが結合)のうちの 3個をデォキシリボフラノー ス（グァニンが結合）に代えたものである。（19)- (24)は、（1)- (6)における 2，- 0,4，- C- エチレン化されたリボフラノース (グァニンが結合)のうちの 4個をデォキシリボフラノー ス（グァニンが結合）に代えたものである。（25)- (30)は、（1)- (6)における 2，- 0,4，- C- エチレン化されたリボフラノース (グァニンが結合)のうちの 4個をデォキシリボフラノー ス（グァニンが結合）に代え、 2，- 0,4，- C-エチレンィ匕されたリボフラノース（アデニン が結合）のうちの 1個をデォキシリボフラノース（アデニンが結合）に代えたものである 。（31)- (60)は、それぞれ、（1)- (30)の化合物を構成するリン酸をすベてホスホロチォェ ートに代えたものである。（61)- (120)は、それぞれ、（1)- (60)の化合物を構成するシトシ ンをすべて 5-メチルシトシンに代えたものである。（121H240)は、それぞれ、 (1H120) における 2， -0,4， -C-エチレン化されたリボフラノースをすベて 2， - 0,4， -C-メチレン 化されたリボフラノースに代えたものである。（241)-(480)は、（1)-(240)にぉける2，-0,4 ， -C-エチレン又は 2， - 0,4， -C-メチレン- 5-メチルシトシンを 2， - 0,4， -C-エチレン又 は 2 ' - 0,4' -C-メチレンシトシンに代えたものである。  [0070] Among the above preferred compounds, (1)-(6) are those in which 2, -0,4, -C-ethylenated ribofuranose is arranged at 4 or 5 ends. . (7)-(12) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (bonded with guanine) in (1)-(6). It is replaced with Su (guanine bond). (13)-(18) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (guanine linked) in (1)-(6) with deoxyribofuranos It is replaced with Su (guanine bond). (19)-(24) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (guanine bond) in (1)-(6) with 4 doxyribofuranos It is replaced with Su (guanine bond). (25)-(30) is a combination of 2,-0,4,-C-ethylenated ribofuranose (guanine linked) in (1)-(6) with 4 doxyribofuranos Substitute for one of the 2, -0,4, -C-ethyleneiated ribofuranose (adenine bound) instead of deoxyribofuranose (adenine bound) Is. In (31)-(60), all phosphoric acids constituting the compounds of (1)-(30) are replaced with phosphorothioates. In (61)-(120), the cytosine constituting the compound of (1)-(60) is all replaced with 5-methylcytosine. (121H240) replaced all 2,0,4, -C-ethylenated ribofuranose in (1H120) with 2,0,4, -C-methyleneated ribofuranose, respectively. Is. (241)-(480) is obtained by adding 2, -0,4, -C-ethylene or 2, -0,4, -C-methylene-5-methylcytosine as described in (1)-(240), -0,4, -C-ethylene or 2'-0,4'-C-methylenecytosine.
[0071] なお、本明糸田書【こお ヽて、 A、 G、 G C、 5C、 T、 A G C 5C Τ Ae2、 Ge2、 Ge2 5Ce2、 Ce2、 Te2、 Ae2s、 Ge2s、 5Ce2s、 Ce2s、 Te2s、
Figure imgf000044_0001
Gels、 5 Cels、 Cels及び Telsは、それぞれ、下記の式 (A)、（G)、（ 、（C)、（5C)、（T)、（As)、（Gs)、 ( Cs)、（5CS)、（Ts)、（Ae2)、（Ge2)、（Ge2t)、（5Ce2)、 (Te2)、（Ae2s)、（Ge2s)、（5Ce2s)、（Ce2s)、 ( Te2s)、（Ael)、（Gel)、（Gelt)、 (5Cel), (Cel)、（Tel)、（Aels)、（Gels)、 (5Cels), (Cels)及び (Tels)で 表される基である。 [0071] Incidentally, Honmyo Itoda Te Manual [freezingヽ, A, G, GC, 5C , T, AGC 5C Τ A e2, G e2, G e2 5C e2, C e2, T e2, A e2s, G e2s , 5C e2s , C e2s , T e2s ,
Figure imgf000044_0001
G els , 5 C els , C els, and T els are respectively represented by the following formulas (A), (G), (, (C), (5C), (T), (A s ), (G s ), (C s ), (5C S ), (T s ), (A e2 ), (G e2 ), (G e2t ), (5C e2 ), (T e2 ), (A e2s ), (G e2s ), (5C e2s ), (C e2s ), (T e2s ), (A el ), (G el ), (G elt ), (5 C el ), (C el ), (T el ), (A els ), (G els ), (5C els ), (C els ) and (T els ).
[化 19] [Chemical 19]
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
CCTZO/SOOZdf/X3d .0S6S0/900Z OAV
Figure imgf000046_0002
CCTZO / SOOZdf / X3d .0S6S0 / 900Z OAV
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0001
(Te2) (Tezs) (T e2 ) (T ezs )
[0074] [化 21] [0074] [Chemical 21]
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0001
(TE1) (TE1S) 本明細書において、「薬理学上許容されるその塩」とは、本発明のアンチセンスオリ ゴヌクレオチド (例えば、配列番号 3の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド)または一 般式 (I)で表される化合物の塩をいい、そのような塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩(T E1 ) (T E1S ) As used herein, the term “pharmacologically acceptable salt thereof” refers to the antisense oligonucleotide of the present invention (for example, the oligonucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 3) or A salt of a compound represented by the general formula (I), such as a sodium salt or a potassium salt.
、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ 土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金 属塩；アンモ-ゥム塩のような無機塩、 tーォクチルァミン塩、ジベンジルァミン塩、モ ルホリン塩、ダルコサミン塩、フエ-ルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジァミン 塩、 N—メチルダルカミン塩、グァ-ジン塩、ジェチルァミン塩、トリエチルァミン塩、ジ シクロへキシルァミン塩、 N, N，一ジベンジルエチレンジァミン塩、クロ口プロ力イン塩 、プロ力イン塩、ジエタノールアミン塩、 N—べンジルーフエネチルァミン塩、ピぺラジ ン塩、テトラメチルアンモ -ゥム塩、トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタン塩のような有機 塩などのアミン塩;弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハ ロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩などの無機酸塩;メタ ンスルホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級ァ ルカンルスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩のようなァ リールスルホン酸塩、酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クェン酸塩、 酒石酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩;グリシン塩、リジン塩、アルギニン 塩、オル二チン塩、グルタミン酸塩、ァスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などを挙げる ことができる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。 Alkali metal salts such as lithium salts, alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts, metal salts such as aluminum salts, iron salts, zinc salts, copper salts, nickel salts and cobalt salts; Inorganic salts such as salt, toctylamine salt, dibenzylamine salt, morpholine salt, darcosamine salt, ferroglycine alkyl ester salt, ethylenediamine salt, N-methyldarcamamine salt, guanidine salt, jetylamine salt, triethylamine Mine salt, dicyclohexylamine salt, N, N, monodibenzylethylenediamine salt, black mouth pro-in salt, pro-in salt, diethanolamine salt, N-benjirofu enethylamine salt, pipette Amine salts such as organic salts such as radine salts, tetramethylammonium salts, tris (hydroxymethyl) aminomethane salts; hydrogen fluoride Halogenated hydrohalates such as acid salts, hydrochlorides, hydrobromides, hydroiodides, inorganic acid salts such as nitrates, perchlorates, sulfates, phosphates; methanesulfonates , Lower alkenyl sulfonates such as trifluoromethane sulfonate, ethane sulfonate, aryl sulfonates such as benzene sulfonate, p-toluene sulfonate, acetate, malate, fumarate Acid salts such as glycine salt, lysine salt, arginine salt, ornithine salt, glutamate salt, aspartate salt, organic acid salt such as acid salt, succinate, citrate, tartrate, succinate, maleate Examples include salt. These salts can be produced by a known method.
[0076] なお、一般式 (I)で表される化合物は、溶媒和物 (好適には水和物）としても存在す ることができ、そのような溶媒和物も本発明に包含される。  [0076] The compound represented by the general formula (I) can also exist as a solvate (preferably a hydrate), and such a solvate is also encompassed in the present invention. .
[0077] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび一般式 (I)で表される化合物（以下、 「本発明の化合物」という）、ならびに薬理学上許容されるそれらの塩は、 11 18 -水酸 ィ匕ステロイド脱水素酵素 1型発現を抑制するための実験試薬として、あるいは医薬と して禾 lj用でさる。  [0077] The antisense oligonucleotide of the present invention and the compound represented by the general formula (I) (hereinafter referred to as "the compound of the present invention") and pharmacologically acceptable salts thereof are: Use as an experimental reagent to suppress steroid steroid dehydrogenase type 1 expression or as a pharmaceutical.
[0078] また、本発明の化合物は、糖尿病、高血圧等の代謝性疾患の治療'予防に用いる 医薬として有効である。  [0078] Further, the compound of the present invention is effective as a medicament for use in the treatment and prevention of metabolic diseases such as diabetes and hypertension.
[0079] 本発明の化合物は、市販の合成機（例えば、パーキンエルマ一社のホスホロアミダ イド法によるモデル 392)などを用いて、文献（Nucleic Acids Research, 12, 4539 (198 4))に記載の方法に準じて合成することができる。その際に用いられるホスホロアミダ イト試薬は、天然型のヌクレオシド及び 2'-0-メチルヌクレオシド（すなわち、 2'- 0-メ チルグアノシン、 2'- 0-メチルアデノシン、 2'- 0-メチルシトシン、 2'- 0-メチルゥリジン )については、巿販の試薬を用いることができる。アルキル基の炭素数が 2〜6個の 2' -0-アルキルグアノシン、アデノシン、シトシンおよびゥリジンについては、以下の通り である。 [0079] The compound of the present invention is described in the literature (Nucleic Acids Research, 12, 4539 (198 4)) using a commercially available synthesizer (for example, model 392 by the phosphoramidide method of Perkin Elmer Co., Ltd.). It can be synthesized according to the method. Phosphoramida used at that time Iit reagents include natural nucleosides and 2'-0-methyl nucleosides (ie 2'-0-methylguanosine, 2'-0-methyladenosine, 2'-0-methylcytosine, 2'-0-methyluridine). ), Commercially available reagents can be used. 2'-0-alkylguanosine, adenosine, cytosine and uridine having 2 to 6 carbon atoms in the alkyl group are as follows.
2'- 0-アミノエチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、文献（Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.)に従って合成できる。  2'-0-aminoethylguanosine, adenosine, cytosine, uridine can be synthesized according to the literature (Blommers et al. Biochemistry (1998), 37, 17714-17725.).
[0080] 2し0-プロピルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al . Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)に従って合成できる。 [0080] 2-0-propylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine can be synthesized according to the literature (Lesnik, E.A. et al. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.).
2'-0-ァリルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、巿販の試薬を用いること ができる。  Commercially available reagents can be used for 2'-0-arylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine.
[0081] 2し0- (2-メトキシ)ェチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、特許（US626 1840)または、文献（Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504.)に従って合 成できる。  [0081] 2 0- (2-Methoxy) ethylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine are either patents (US626 1840) or literature (Martin, P. Helv. Chim. Acta. (1995) 78, 486-504. Can be synthesized according to.).
[0082] 2し0-ブチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、文献（Lesnik,E.A. et al.  [0082] 2 0-butylguanosine, adenosine, cytosine, uridine are described in the literature (Lesnik, E.A. et al.
Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)に従って合成できる。  Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.).
[0083] 2し0-ペンチルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、文献（Lesnik,E.A. et a[0083] 2 0-pentylguanosine, adenosine, cytosine, uridine are described in the literature (Lesnik, E.A. et a
1. Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.)に従って合成できる。 1. It can be synthesized according to Biochemistry (1993), 32, 7832-7838.).
2'-0-プロパルギルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、巿販の試薬を用 いることがでさる。  For 2'-0-propargylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine, commercially available reagents can be used.
[0084] 2，-0-ァリルグアノシン、アデノシン、シトシン、ゥリジンは、市販の試薬を用いること ができる。  [0084] Commercially available reagents can be used for 2, -0-arylguanosine, adenosine, cytosine, and uridine.
[0085] 2 -0, 4'- C-メチレングアノシン、アデノシン、 5-メチルシトシンおよびチミジンにつ いては、 W099/14226に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が 2〜5個の 2' -0, 4'-C-アルキレングアノシン、アデノシン、 5-メチルシトシン、シトシンおよびチミジ ンにつ 、ては、 WO00/47599に記載の方法に従って製造することができる。  [0085] For 2-0, 4'-C-methyleneguanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine, 2 'having 2 to 5 carbon atoms of the alkylene group according to the method described in W099 / 14226 -0,4'-C-alkyleneguanosine, adenosine, 5-methylcytosine, cytosine and thymidine can be produced according to the method described in WO00 / 47599.
[0086] ホスホロアミダイト試薬をカップリング後、硫黄、テトラエチルチウラムジスルフイド (T ETD、アプライドバイオシステム社）、 Beaucage試薬（Glen Research社）、または、キサ ンタンヒドリドなどの試薬を反応させることにより、ホスホロチォエート結合を有するァ ンチセンスオリゴヌクレオチドを合成することができる（Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253 (1990), PCT/W098/54198)。 [0086] After coupling the phosphoramidite reagent, sulfur, tetraethylthiuram disulfide (T ETD, Applied Biosystems), Beaucage reagent (Glen Research), or An antisense oligonucleotide having a phosphorothioate bond can be synthesized by reacting a reagent such as tantalum hydride (Tetrahedron Letters, 32, 3005 (1991), J. Am. Chem. Soc. 112, 1253). (1990), PCT / W098 / 54198).
[0087] 合成機で用いるコントロールド ポア グラス（CPG)としては、 2し0-メチルヌクレオ シドの結合したものは、巿販のものを利用することができる。また、 2'- 0, 4'- C-メチレ ングアノシン、アデノシン、 5-メチルシトシンおよびチミジンについては、 W099/14226 に記載の方法に従って、アルキレン基の炭素数が 2〜5個の 2'- 0, 4'- C-アルキレン グアノシン、アデノシン、 5-メチルシトシンおよびチミジンについては、 WO00/47599に 記載の方法に従って製造したヌクレオシドを文献（Oligonucleotide Synthesis, Edited by M.J.Gait, Oxford University Press, 1984)に従って、 CPG〖こ結合することができる 。修飾された CPG (特開平 7— 87982の実施例 12bに記載）を用いることにより、 3'末 端に 2-ヒドロキシェチルリン酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。また、 3' —amino— Modifier C3 し PG, 3—amino— Modiner C7 CPG, ulycerylし PG, (ulen Resear ch), 3し specer C3 SynBase CPG 1000, 3し specer C9 SynBase CPG 1000 (link techn ologies)を使えば、 3'末端にヒドロキシアルキルリン酸基、または、アミノアルキルリン 酸基が結合したオリゴヌクレオチドを合成できる。  [0087] As the controlled pore glass (CPG) used in the synthesizer, commercially available products having 2 and 0-methyl nucleoside bonded can be used. In addition, for 2'-0, 4'-C-methylenguanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine, 2'-0 having 2 to 5 carbon atoms in the alkylene group according to the method described in W099 / 14226. , 4'-C-alkylene guanosine, adenosine, 5-methylcytosine and thymidine, the nucleoside produced according to the method described in WO00 / 47599 was determined according to the literature (Oligonucleotide Synthesis, Edited by MJGait, Oxford University Press, 1984). CPG can be combined. By using modified CPG (described in Example 12b of JP-A-7-87982), it is possible to synthesize an oligonucleotide having a 2-hydroxyethyl phosphate group bonded to the 3 ′ end. 3 '—amino—Modifier C3 and PG, 3—amino—Modiner C7 CPG, ulyceryl and PG, (ulen Resear ch), 3 and specer C3 SynBase CPG 1000, 3 and specer C9 SynBase CPG 1000 (link techn ologies) Can be used to synthesize an oligonucleotide having a hydroxyalkyl phosphate group or an aminoalkyl phosphate group bonded to the 3 ′ end.
[0088] 本発明の化合物および薬理学上許容されるその塩は、 11 β - HSD1の働きを抑制す ることができる。特に、一般式 (I)で表される化合物および薬理学上許容されるその塩 は、 RNAに対する結合力が高ぐヌクレアーゼに対する耐性が高い上に、 RNase H による mRNAの分解作用を受けることができる。従って、本発明の化合物および薬理 学上許容されるその塩は、糖尿病、高血圧等の代謝性疾患の治療'予防に有効であ る。  [0088] The compound of the present invention and a pharmacologically acceptable salt thereof can suppress the action of 11 β-HSD1. In particular, the compound represented by the general formula (I) and a pharmacologically acceptable salt thereof are highly resistant to nuclease with high binding ability to RNA, and can also be subjected to mRNA degradation by RNase H. . Therefore, the compounds of the present invention and pharmacologically acceptable salts thereof are effective for the treatment and prevention of metabolic diseases such as diabetes and hypertension.
[0089] 本発明の化合物または薬理学上許容されるその塩を糖尿病、高血圧等の代謝性 疾患の治療 ·予防剤として使用する場合には、本発明の化合物または薬理学上許容 されるその塩若しくはエステルを、それ自体あるいは適宜の薬理学上許容される賦形 剤、希釈剤などと混合し、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤若しくはシロップ剤などに より経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、貼付剤若しくは外用剤などにより非経口的 に投与することができる。 [0090] これらの製剤は、賦形剤（例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マン-トール、ソルビトール のような糖誘導体；トウモロコシデンプン、ノィレショデンプン、 α澱粉、デキストリンの ような澱粉誘導体；結晶セルロースのようなセルロース誘導体；アラビアゴム；デキスト ラン;プルランのような有機系賦形剤;軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、珪酸カ ルシゥム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウムのような珪酸塩誘導体；燐酸水素カルシゥ ムにょうな燐酸塩;炭酸カルシウムのような炭酸塩;硫酸カルシウムのような硫酸塩な どの無機系賦形剤など）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ス テアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーズヮッ タス、ゲィ蝌のようなワックス類；硼酸；アジピン酸；硫酸ナトリウムのような硫酸塩；ダリ コール；フマル酸；安息香酸ナトリウム； DLロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル 硫酸マグネシウムのようなラウリル硫酸塩：無水珪酸、珪酸水和物のような珪酸類；上 記澱粉誘導体など）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロ ピルメチルセルロース、ポリビュルピロリドン、マクロゴール、前記賦形剤と同様の化 合物など）、崩壊剤（例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチ ルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチル セルロースナトリウムのようなセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキ シメチルスターチナトリウム、架橋ポリビュルピロリドンのような化学修飾されたデンプ ン.セルロース類など）、乳化剤（例えば、ベントナイト、ビーガムのようなコロイド性粘 土；水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウムのような金属水酸化物；ラウリル硫酸ナ トリウム、ステアリン酸カルシウムのような陰イオン界面活性剤;塩ィ匕ベンザルコ -ゥム のような陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシェチ レンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルのような非イオン界面活性剤 など）、安定剤 (メチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラォキシ安息香酸エステ ル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フエ-ルエチルアルコールのようなァ ルコール類；塩化ベンザルコ -ゥム；フエノール、タレゾールのようなフエノール類；チ メロサール;デヒドロ酢酸;ソルビン酸など）、矯味矯臭剤（例えば、通常使用される甘 味料、酸味料、香料など）、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。 [0089] When the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is used as a therapeutic / preventive agent for metabolic diseases such as diabetes or hypertension, the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof. Alternatively, the ester is mixed with itself or an appropriate pharmacologically acceptable excipient, diluent, etc., and orally by tablet, capsule, granule, powder or syrup, or injection, It can be administered parenterally with suppositories, patches, or external preparations. [0090] These preparations include excipients (for example, sugar derivatives such as lactose, sucrose, sucrose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, neutral starch, alpha starch, dextrin; crystals Cellulose derivatives such as cellulose; gum arabic; dextrane; organic excipients such as pullulan; silicate derivatives such as light anhydrous silicic acid, synthetic aluminum silicate, calcium silicate, magnesium magnesium aluminosilicate; calcium hydrogen phosphate Phosphates; carbonates such as calcium carbonate; inorganic excipients such as sulfates such as calcium sulfate), lubricants (eg stearic acid, calcium stearate, magnesium stearate) Stearic acid metal salt; talc; colloidal silica; Boric acid; Adipic acid; Sulfate such as sodium sulfate; Daricol; Fumaric acid; Sodium benzoate; DL leucine; Sodium lauryl sulfate, Lauryl sulfate such as magnesium sulfate: Silicic anhydride, Silicic acid hydrate Silicic acids such as the above-mentioned starch derivatives), binders (for example, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polybutylpyrrolidone, macrogol, compounds similar to the above-mentioned excipients), disintegrating agents ( For example, low-substituted hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, cellulose derivatives such as internally cross-linked sodium carboxymethyl cellulose; carboxymethyl starch, sodium carboxymethyl starch, cross-linked polybutylpyrrole Chemically modified denpene such as cellulose; celluloses), emulsifiers (eg, colloidal clays such as bentonite and beegum; metal hydroxides such as magnesium hydroxide and aluminum hydroxide; sodium lauryl sulfate) Anionic surfactants such as calcium stearate; Cationic surfactants such as salt benzalkonium; Nonionic interfaces such as polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, sucrose fatty acid esters Activators, etc.), stabilizers (paraoxybenzoates such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol and phenolethyl alcohol; benzalkonium chloride; phenol and talesol) Phenols; Rosaru; dehydroacetic acid; and sorbic acid), flavoring agents (e.g., sweet sweetener, acidulant commonly used, such as perfumes), it is prepared in a known manner by using additives such as diluents.
[0091] 本発明の治療'予防剤は、好ましくは、 0.05〜5 μ molesZmlの本発明の化合物ま たは薬理学上許容されるその塩、 0.02〜10 %wZvの炭水化物又は多価アルコール 及び 0.01〜0.4 %wZvの薬理学上許容される界面活性剤を含有する。本発明の化 合物または薬理学上許容されるその塩の含有量の更に好ましい範囲は、 0.1〜1 oles, mlである。 [0091] The therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention is preferably 0.05 to 5 μmols Zml of the compound of the present invention. Or a pharmacologically acceptable salt thereof, 0.02 to 10% wZv carbohydrate or polyhydric alcohol and 0.01 to 0.4% wZv pharmacologically acceptable surfactant. A more preferable range of the content of the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is 0.1 to 1 oles, ml.
[0092] 上記炭水化物としては、単糖類及び Z又は 2糖類が特に好ましい。これら炭水化物 及び多価アルコールの例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラタトース、 マルトース、マン-トール及びソルビトールが挙げられる。これらは、単独で用いても、 併用してちょい。  [0092] The carbohydrate is particularly preferably a monosaccharide and a Z or disaccharide. Examples of these carbohydrates and polyhydric alcohols include glucose, galactose, mannose, latatose, maltose, mannitol and sorbitol. These can be used alone or in combination.
[0093] また、界面活性剤の好まし 、例としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノ〜トリ エステル、アルキルフエ-ルポリオキシエチレン、ナトリウムタウロコラート、ナトリウムコ ラート、及び多価アルコールエステルが挙げられる。このうち特に好ましいのは、ポリ ォキシエチレンソルビタンモノ〜トリ一エステルであり、ここにお 、てエステルとして特 に好ましいのは、ォレエート、ラウレート、ステアレート及びパルミテートである。これら は単独で用いても、併用してもよい。  [0093] Further, preferred examples of the surfactant include polyoxyethylene sorbitan mono-triester, alkylphenol polyoxyethylene, sodium taurocholate, sodium cholate, and polyhydric alcohol ester. Of these, particularly preferred are polyoxyethylene sorbitan mono-triesters, and particularly preferred as esters are oleate, laurate, stearate and palmitate. These may be used alone or in combination.
[0094] また、本発明の治療'予防剤は、更に好ましくは、 0.03〜0.09 Mの薬理学上許容さ れる中性塩、例えば、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム及び Z又は塩ィ匕カルシウムを含有 する。 [0094] Further, the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention is more preferably 0.03 to 0.09 M of a pharmacologically acceptable neutral salt such as sodium chloride salt, potassium salt and Z salt. Contains calcium.
[0095] また、本発明の治療'予防剤は、更に好ましくは、 0.002〜0.05 Mの薬理学上許容 される緩衝剤を含有することができる。好ましい緩衝剤の例としては、クェン酸ナトリウ ム、ナトリウムグリシネート、リン酸ナトリウム、トリス (ヒドロキシメチル)ァミノメタンが挙げ られる。これらの緩衝剤は、単独で用いても、併用してもよい。  [0095] Further, the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention may more preferably contain 0.002 to 0.05 M of a pharmacologically acceptable buffer. Examples of preferred buffering agents include sodium citrate, sodium glycinate, sodium phosphate, tris (hydroxymethyl) aminomethane. These buffering agents may be used alone or in combination.
[0096] さらに、本発明の治療'予防剤は、溶液状態で供給してもよい。しかし、ある期間保 存する必要がある場合等のために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを安定ィ匕して治 療効果の低下を防止する目的で通常は凍結乾燥しておくことが好ましぐその場合 は用時に溶解液 (注射用蒸留水など）で再構成 (reconstruction)して、即ち投与され る液体状態にして用いればよい。従って、本発明の治療'予防剤は、各成分が所定 の濃度範囲になるよう溶解液で再構成して使用するための、凍結乾燥された状態の ものも包含する。凍結乾燥物の溶解性を促進する目的で、アルブミン、グリシン等の アミノ酸を更に含有させてぉ 、てもよ 、。 [0096] Furthermore, the therapeutic agent / prophylactic agent of the present invention may be supplied in a solution state. However, in cases where it is necessary to preserve for a certain period of time, it is usually preferable to freeze-dry in order to stabilize the antisense oligonucleotide and prevent a decrease in the therapeutic effect. At the time of use, the solution may be reconstructed with a solution (eg, distilled water for injection), that is, in a liquid state to be administered. Therefore, the therapeutic / prophylactic agent of the present invention includes those in a lyophilized state for reconstitution with a solution so that each component is in a predetermined concentration range. For the purpose of promoting the solubility of lyophilizate, albumin, glycine, etc. You can add more amino acids.
[0097] 本発明の化合物または薬理学上許容されるその塩をヒトに投与する場合には、例 えば、成人 1日あたり約 0.1〜100 mg/kg (体重）、好ましくは 1〜50 mg/kg (体重）の投 与量で、 1回または数回に分けて経口投与または静注するとよいが、その投与量や 投与回数は、疾患の種類、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。  [0097] When the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is administered to a human, for example, about 0.1 to 100 mg / kg (body weight) per day, preferably 1 to 50 mg / kg It is recommended to administer orally or intravenously in one or several divided doses in kg (body weight), but the dose and number of doses should be changed appropriately depending on the type of disease, symptoms, age, method of administration, etc. sell.
[0098] 糖尿病患者への本発明の化合物または薬理学上許容されるその塩の投与は、例 えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、本発明の化合物または薬理学上 許容されるその塩を当業者に周知の方法で製造し、これを常法により滅菌処理し、例 えば 1200 gZmlの注射用溶液を調製する。この溶液を、患者静脈内にアンチセン スオリゴヌクレオチドの投与量が体重 1kg当たり例えば 20 mgとなるように、例えば輸 液の形で点滴投与する。投与は、例えば 1週間の間隔で 4回繰り返し、その後も、皮 下脂肪組織における 11 18 - HSD1の発現、血糖値、臨床症状を指標とした治療効果 の確認をしながら、適宜この治療を繰り返す。治療効果があり明らかな副作用が見ら れない限り、治療を継続する。  [0098] Administration of the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof to a diabetic patient can be performed, for example, as follows. That is, the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is produced by a method well known to those skilled in the art, and sterilized by a conventional method, for example, a 1200 gZml solution for injection is prepared. This solution is administered intravenously, for example in the form of an infusion, so that the dosage of antisense oligonucleotide is, for example, 20 mg / kg body weight. Administration is repeated, for example, 4 times at 1-week intervals, and thereafter this treatment is repeated as appropriate while confirming the therapeutic effect using 11 18 -HSD1 expression in the subdermal adipose tissue, blood glucose level, and clinical symptoms as indicators. . Continue treatment unless there are therapeutic effects and no obvious side effects.
[0099] 高血圧患者への本発明の化合物または薬理学上許容されるその塩の投与は、例 えば、以下のようにして行うことができる。すなわち、本発明の化合物または薬理学上 許容されるその塩を当業者に周知の方法で製造し、これを常法により滅菌処理し、例 えば 1200 gZmlの注射用溶液を調製する。この溶液を、患者静脈内にアンチセン スオリゴヌクレオチドの投与量が体重 1kg当たり例えば 20 mgとなるように、例えば輸 液の形で点滴投与する。投与は、例えば 1週間の間隔で 4回繰り返し、その後も、皮 下脂肪組織における 11 18 - HSD1の発現、血圧値、臨床症状を指標とした治療効果 の確認をしながら、適宜この治療を繰り返す。治療効果があり明らかな副作用が見ら れない限り、治療を継続する。  [0099] Administration of the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof to a hypertensive patient can be performed, for example, as follows. That is, the compound of the present invention or a pharmacologically acceptable salt thereof is produced by a method well known to those skilled in the art, and sterilized by a conventional method, for example, a 1200 gZml solution for injection is prepared. This solution is administered intravenously, for example in the form of an infusion, so that the dosage of antisense oligonucleotide is, for example, 20 mg / kg body weight. Administration is repeated, for example, 4 times at 1-week intervals, and thereafter this treatment is repeated as appropriate while confirming the therapeutic effect using 11 18-HSD1 expression in the subdermal adipose tissue, blood pressure, and clinical symptoms as indicators. . Continue treatment unless there are therapeutic effects and no obvious side effects.
実施例  Example
[0100] 以下、本発明を実施例、参考例、試験例及び製剤例によって具体的に説明する。  [0100] The present invention will be specifically described below with reference to Examples, Reference Examples, Test Examples, and Preparation Examples.
なお、これらの実施例等は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を 限定するものではない。  These examples and the like are for explaining the present invention and do not limit the scope of the present invention.
[0101] 〔実施例 1〕 HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (化合物 (1》の合 成 [0101] [Example 1] HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -CAGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H ( Synthesis of Compound (1)
核酸自動合成機（パーキンエルマ一社製 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer) を用い、 1 /z molスケールのプログラムに従って行った。各合成サイクルにおける溶媒 、試薬は、 ABI製またはプロリゴ製のものを用いた。ホスホロアミダイトの濃度は 0.1 M とした。非天然型のホスホロアミダイトは特許 3420984号の実施例 14(5， -〇-ジメトキシ トリチル -2， - 0,4， -C-エチレン- 6-N-ベンゾィルアデノシン- 3， - 0-(2-シァノエチル N ,Ν-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト)、実施例 27 (5，- 0-ジメトキシトリチル- 2，- 0,4，- C-エチレン- 2-Ν-イソブチリルグアノシン- 3， - 0-(2-シァノエチル Ν,Ν-ジイソプロピ ル)ホスホロアミダイト)、実施例 22 (5，- 0-ジメトキシトリチル- 2，- 0,4，- C-エチレン- 4- Ν-ベンゾィル -5-メチルシチジン- 3， - 0-(2-シァノエチル Ν,Ν-ジイソプロピル)ホスホ ロアミダイト）、実施例 9 (5，- 0-ジメトキシトリチル- 2，- 0,4，- C-エチレン- 5-メチルゥリ ジン- 3，-0-(2-シァノエチル Ν,Ν-ジイソプロピル)ホスホロアミダイト）、の化合物を用 いた。これらの非天然型のホスホロアミダイトの縮合時間は、 15分とした。固相担体と して、参考例 1の化合物を 1.2 mol用い、標記の化合物を合成した。  Using a nucleic acid automatic synthesizer (ABI model 394 DNA / RNA synthesizer, manufactured by PerkinElmer Co., Ltd.), it was performed according to a 1 / z mol scale program. The solvent and reagent used in each synthesis cycle were those manufactured by ABI or Proligo. The concentration of phosphoramidite was 0.1 M. Non-natural type phosphoramidites are disclosed in Example 14 (5, -O-dimethoxytrityl-2, -0,4, -C-ethylene-6-N-benzoyladenosine-3, -0- (2-Cyanoethyl N, Ν-diisopropyl) phosphoramidite), Example 27 (5, -0-dimethoxytrityl-2, -0,4, -C-ethylene-2-Ν-isobutyrylguanosine-3, -0- (2-cyanoethylΝ, Ν-diisopropyl) phosphoramidite), Example 22 (5, -0-dimethoxytrityl-2, -0,4, -C-ethylene-4-Ν-benzoyl-5 -Methylcytidine-3, -0- (2-cyanoethylΝ, Ν-diisopropyl) phosphoramidite), Example 9 (5, -0-dimethoxytrityl-2, -0,4, -C-ethylene-5-methyluri The compound of gin-3, -0- (2-cyanoethylΝ, Ν-diisopropyl) phosphoramidite) was used. The condensation time for these non-natural phosphoramidites was 15 minutes. The title compound was synthesized using 1.2 mol of the compound of Reference Example 1 as a solid phase carrier.
目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を濃アンモニア水で処理す ることによってオリゴマーを支持体力も切り出すとともに、リン原子上の保護基シァノエ チル基と核酸塩基上の保護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP- 18e ( 4.6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), p H 7.0、 B溶液：ァセトニトリル、 B%: 10%→ 50%(10min, linear gradient)； 60°C； 2 ml/min ;254應）にて精製し、 ジメトキシトリチル基を有する目的物のピークを集めた。水を 加え、減圧下留去することで、 TEAAを除いた。 80%酢酸水溶液（200 1)を加え、 20 分間放置することで、ジメトキシトリチル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち、 残渣を lmlの水に溶解し、酢酸ェチルで洗浄後、 0.45 μ mのフィルター（MILLIPORE, Ultrafree-MC)でろ過し、 目的とするオリゴヌクレオチドを得た。本化合物は、逆相 H PLC (島津製作所製 LC— 10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP- 18e (4. 6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液： 25%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B %: 30%→ 80%(10min, linear gradient)； 60°C； 2 ml/min;254 nm)で分析すると、 5.96分 に溶出された（26.2 A units) ( λ max(H O) =257 nm)。また、化合物は、負イオン ES By treating the protected oligonucleotide analog having the target sequence with concentrated aqueous ammonia, the oligomer was also excised as a support, and the protecting group cyanoyl group on the phosphorus atom and the protecting group on the nucleobase were removed. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the remaining residue was reversed-phase HPLC (LC—10VP, Shimadzu Corporation, column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 X 100 mm)), solution A: 5% acetonitrile, 0.1M triethylamine acetate Purified with aqueous solution (TEAA), pH 7.0, solution B: acetonitrile, B%: 10% → 50% (10 min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254), dimethoxytrityl group The peaks of the desired product were collected. TEAA was removed by adding water and distilling off under reduced pressure. An 80% aqueous acetic acid solution (200 1) was added and left for 20 minutes to deprotect the dimethoxytrityl group. After the solvent was distilled off, the residue was dissolved in 1 ml of water, washed with ethyl acetate, and then filtered through a 0.45 μm filter (MILLIPORE, Ultrafree-MC) to obtain the target oligonucleotide. This compound consists of reversed-phase H PLC (LC-10VP manufactured by Shimadzu Corporation, column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M triethylamine acetate aqueous solution (TEAA), pH 7.0, B solution: 25% acetonitrile, 0.1M triethylamine acetate aqueous solution (TEAA), pH 7.0, B%: 30% → 80% (10min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm) Then, it was eluted at 5.96 minutes (26.2 A units) (λ max (HO) = 257 nm). The compounds are negative ions ES
260 2  260 2
I質量分析により同定した (計算値： 5600.60、測定値： 5600.95)。  I was identified by mass spectrometry (calculated value: 5600.60, measured value: 5600.95).
[0103] 本化合物の塩基配列は、 (Gene Bank accession No. NM.005525)のヌクレオチド番 号 356-372に相補的な配列である。 [0103] The base sequence of this compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
[0104] 〔実施例 2〕 [Example 2]
HO- Ge2- Te2- Ge2- 5Ce2- 5Ce2- A- G- C- A- A- T- G- T- Ae2- Ge2- Te2- Ge2t- H (ィ匕合物 (2)) の合成 HO- G e2 - T e2 - G e2 - 5C e2 - 5C e2 - A- G- C- A- A- T- G- T- A e2 - G e2 - T e2 - G e2t - H ( I匕合(2))
実施例 1の化合物と同様に目的配列を有する実施例 2の化合物を実施例 1と同じ C PG 1.2 molを用いて合成した。脱保護後、逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、 カラム（Merck, Chromolith Performance RP— 18e (4.6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニ トリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液：ァセトニトリル、 B%: 10%→ 50%(10min, linear gradient)； 60°C； 2 ml/min;254 nm)にて精製し、 ジメトキシト リチル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、 TEAA を除いた。 80%酢酸水溶液 (200 1)を加え、 20分間放置することで、ジメトキシトリチ ル基の脱保護を行った。溶媒を留去したのち、残渣を lmlの水に溶解し、酢酸ェチル で洗浄後、 0.45 μ mのフィルター（MILLIPORE, Ultrafree- MC)でろ過し、 目的とする オリゴヌクレオチドを得た。本化合物は、逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、カラ ム（Merck, Chromolith Performance RP— 18e (4.6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニトリ ル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液： 25%ァセトニトリル、 0.1 M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B%: 30%→ 80%(10min, linear gradient ) ;60°C ;2 ml/min;254 nm)で分析すると、 6.10分に溶出された（21.1 A units) ( λ m  The compound of Example 2 having the target sequence in the same manner as the compound of Example 1 was synthesized using 1.2 mol of C PG as in Example 1. After deprotection, reverse-phase HPLC (Shimadzu LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP—18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0 B solution: acetonitrile, B%: 10% → 50% (10 min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm), and the peak of the target compound having a dimethoxytrityl group was collected. . TEAA was removed by adding water and distilling off under reduced pressure. An 80% aqueous acetic acid solution (200 1) was added and the mixture was allowed to stand for 20 minutes to deprotect the dimethoxytrityl group. After the solvent was distilled off, the residue was dissolved in 1 ml of water, washed with ethyl acetate, and then filtered through a 0.45 μm filter (MILLIPORE, Ultrafree-MC) to obtain the target oligonucleotide. This compound consists of reversed-phase HPLC (Shimadzu LC-10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0, B solution: 25% acetonitrile, 0.1 M triethylamine acetate aqueous solution (TEAA), pH 7.0, B%: 30% → 80% (10 min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm) Then, it was eluted at 6.10 minutes (21.1 A units) (λ m
260  260
ax(H O) =257 nm)。また、化合物は、負イオン ESI質量分析により同定した (計算値: 5 ax (H 2 O) = 257 nm). The compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 5
2 2
656.85、測定値： 5656.58)。  656.85, measured value: 5656.58).
[0105] 本化合物の塩基配列は、 (Gene Bank accession No. NM.005525)のヌクレオチド番 号 356-372に相補的な配列である。 [0105] The base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
[0106] 〔実施例 3〕 HO- Ge2- Te2- Ge2- 5Ce2- C- A- G- C- A- A- T- G- Te2- Ae2- Ge2- Te2- Ge2t- H (ィ匕合物 (3))の 合成 [Example 3] HO- G e2 - T e2 - G e2 - 5C e2 - C- A- G- C- A- A- T- G- T e2 - A e2 - G e2 - T e2 - G e2t - H ( I匕合(3))
実施例 1の化合物と同様に目的配列を有する実施例 3の化合物を実施例 1と同じ C PG 1.2 molを用いて合成した。脱保護後、逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、 カラム（Merck, Chromolith Performance RP— 18e (4.6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニ トリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液：ァセトニトリル、 B%: 10%→ 50%(10min, linear gradient)60°C； 2 ml/min;254 nm)にて精製し、ジメトキシトリ チル基を有する目的物のピークを集めた。水を加え、減圧下留去することで、 TEAA を除いた。 80%酢酸水溶液 (200 1)を加え、 20分間放置することで、ジメトキシトリチ ル基の脱保護を行い、溶媒を留去したのち、残渣を lmlの水に溶解し、酢酸ェチルで 洗浄後、 0.45 μ mのフィルター（MILLIPORE, Ultrafree- MC)でろ過し、目的とするォ リゴヌクレオチドを得た。逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、カラム (Merck, Chro molith Performance RP- 18e (4.6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリ ェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液： 25%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチル ァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B%: 30%→ 80%(10min, linear gradient) ; 60°C ; 2 ml/min ;254 nm)で分析すると、 5.79分に溶出された（64.4 A units) ( λ max(H O) =259 nm  The compound of Example 3 having the target sequence in the same manner as the compound of Example 1 was synthesized using 1.2 mol of C PG as in Example 1. After deprotection, reverse-phase HPLC (Shimadzu LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP—18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0 B solution: acetonitrile, B%: 10% → 50% (10 min, linear gradient) 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm) to collect the peak of the target compound having dimethoxytrityl group . TEAA was removed by adding water and distilling off under reduced pressure. Add 80% acetic acid aqueous solution (200 1) and let stand for 20 minutes to deprotect the dimethoxytrityl group. After distilling off the solvent, the residue is dissolved in lml water, washed with ethyl acetate, Filtration through a 0.45 μm filter (MILLIPORE, Ultrafree-MC) gave the desired oligonucleotide. Reversed-phase HPLC (Shimadzu LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M aqueous solution of triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0, solution B : 25% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0, B%: 30% → 80% (10min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm), 5.79 (64.4 A units) (λ max (HO) = 259 nm
260 2  260 2
)。また、本化合物は、負イオン ESI質量分析により同定した (計算値 : 5642.83、測定 値： 5642.71)。  ). In addition, this compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 5642.83, measured value: 5642.71).
[0107] 本化合物の塩基配列は、 (Gene Bank accession No. NM.005525)のヌクレオチド番 号 356-372に相補的な配列である。  [0107] The base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
[0108] 〔実施例 4〕 [Example 4]
HO- Ge2- Te2- Ge2- 5Ce2- 5Ce2- A- G- C- A- A- T- G- Te2- Ae2- Ge2- Te2- Ge2t- H (化合物 (4)) の合成 HO- G e2 - T e2 - G e2 - 5C e2 - 5C e2 - A- G- C- A- A- T- G- T e2 - A e2 - G e2 - T e2 - G e2t - H ( Compound ( 4)) Synthesis
実施例 1の化合物と同様に目的配列を有する実施例 4の化合物を実施例 1と同じ C PG 1.2 molを用いて合成した。脱保護後、逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、 カラム（Merck, Chromolith Performance RP— 18e (4.6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニ トリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液：ァセトニトリル、 B%: 10%→ 50%(10min, linear gradient)60°C； 2 ml/min ;254 nm)にて精製し、ジメトキシトリ チル基を有する目的物のピークを集めた。ジメトキシトリチル基の脱保護を行い、溶 媒を留去したのち、残渣を lmlの水に溶解し、酢酸ェチルで洗浄後、 0.45 mのフィ ルター（MILLIPORE, Ultrafree- MC)でろ過し、 目的とするオリゴヌクレオチドを得た。 逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、カラム（Merck, Chromolith Performance RP- 18e (4.6 X 100mm))、 A溶液： 5%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEA A), pH 7.0、 B溶液： 25%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B%: 30%→ 80%(10min, linear gradient) ; 60°C； 2 ml/min;254 nm)で分析すると、 5 .82分に溶出された（58.6 A units) ( λ max(H O) =259 nm)。また、本化合物は、負 The compound of Example 4 having the target sequence in the same manner as the compound of Example 1 was synthesized using 1.2 mol of C PG as in Example 1. After deprotection, reverse-phase HPLC (Shimadzu LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP—18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M aqueous triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0 B solution: acetonitrile, B%: 10% → 50% (10 min, linear gradient) 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm) The peaks of the target having a til group were collected. After deprotecting the dimethoxytrityl group and distilling off the solvent, the residue was dissolved in 1 ml of water, washed with ethyl acetate, and filtered through a 0.45 m filter (MILLIPORE, Ultrafree-MC). An oligonucleotide was obtained. Reversed-phase HPLC (Shimadzu LC—10VP, column (Merck, Chromolith Performance RP-18e (4.6 X 100mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M triethylamine acetate aqueous solution (TEA A), pH 7.0, B solution: 25% acetonitrile, 0.1M aqueous solution of triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0, B%: 30% → 80% (10min, linear gradient); 60 ° C; 2 ml / min; 254 nm) (58.6 A units) (λ max (HO) = 259 nm). In addition, this compound is negative
260 2  260 2
イオン ESI質量分析により同定した (計算値： 5698.89、測定値： 5698.78)。  It was identified by ion ESI mass spectrometry (calculated value: 5698.89, measured value: 5698.78).
[0109] 本化合物の塩基配列は、 (Gene Bank accession No. NM.005525)のヌクレオチド番 号 356-372に相補的な配列である。 [0109] The base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM.005525).
[0110] 〔実施例 5〕 化合物 (34))の合成 [Example 5] Synthesis of compound (34))
核酸自動合成機（パーキンエルマ一社製 ABI model 394 DNA/RNA synthesizer) を用い、 10 molスケールのプログラムを用いて目的配列を有する実施例 5の化合物 を合成した。各合成サイクルにおける溶媒、試薬は、 ABI製またはプロリゴ製のものを 用いた。ホスホロアミダイトの濃度は 0.1 Mとした。非天然型のホスホロアミダイトは、実 施例 1と同様に特許 3420984号に記載のものを用いた。また、硫化反応は、キサンタ ンヒドリド (東京化成）を 0.02 Mピリジン/ァセトニトリル (1/9)溶液として用いた。参考例 1記載の化合物（31 μ mol)を固相担体として用い、 DMTr基をトリクロ口酢酸によって 脱保護し、その 5'-水酸基に天然型ホスホロアミダイトユニット及び非天然型ホスホロ アミダイトユニットを用いて縮合反応を繰り返し行 、、標記の化合物を合成した。  Using the nucleic acid automatic synthesizer (ABI model 394 DNA / RNA synthesizer manufactured by Perkin Elma Co., Ltd.), the compound of Example 5 having the target sequence was synthesized using a 10 mol scale program. Solvents and reagents used in each synthesis cycle were those manufactured by ABI or Proligo. The concentration of phosphoramidite was 0.1 M. The non-natural phosphoramidite described in Patent No. 3420984 was used as in Example 1. In the sulfurization reaction, xanthan hydride (Tokyo Kasei) was used as a 0.02 M pyridine / acetonitrile (1/9) solution. The compound described in Reference Example 1 (31 μmol) was used as a solid support, the DMTr group was deprotected with trichloroacetic acid, and a natural phosphoramidite unit and a non-natural phosphoramidite unit were used for the 5'-hydroxyl group. The condensation reaction was repeated to synthesize the title compound.
[0111] 合成サイクルは以下のとおりである。  [0111] The synthesis cycle is as follows.
[0112] 1) Detritylation;トリクロ口酢酸/ジクロロメタン； 180 sec。  [0112] 1) Detritylation; Triclonal Acetic Acid / Dichloromethane; 180 sec.
[0113] 2) Coupling;ホスホロアミダイト/テトラゾール /ァセトニトリル； As, Gs, Cs, Ts部分を 合成する際は、天然型 DNAホスホロアミダイト (プロリゴ製)を用い、それらを縮合させ る合成サイクル時、送液時間 30 sec,縮合時間 40 secとした。また、 Ae2s, G°2s, 5C°2s, T e2s部分を合成する際は、実施例 1に記載の非天然型のホスホロアミダイトを用い、そ れらを縮合させる合成サイクル時、送液時間 20 sec,縮合時間 15 minとした。 [0113] 2) Coupling; phosphoramidite / tetrazole / acetonitrile; A s , G s , C s , T s parts are synthesized using natural DNA phosphoramidite (manufactured by Proligo) and condensed. During the synthesis cycle, the feeding time was 30 sec and the condensation time was 40 sec. A e2s , G ° 2s , 5C ° 2s , T When synthesizing the e2s moiety, the non-natural phosphoramidite described in Example 1 was used, and during the synthesis cycle for condensing them, the solution feeding time was 20 sec and the condensation time was 15 min.
[0114] 3) Capping; 1-メチルイミダゾール /テトラヒドロフラン、無水酢酸/ピリジン/テトラヒ ドロフラン； 65 sec。 [0114] 3) Capping; 1-methylimidazole / tetrahydrofuran, acetic anhydride / pyridine / tetrahydrofuran; 65 sec.
[0115] 4) Sulforization;キサンタンヒドリド /ピリジン/ァセトニトリル； 15 min。  [0115] 4) Sulforization; xanthan hydride / pyridine / acetonitrile; 15 min.
[0116] 目的配列を有する保護されたオリゴヌクレオチド類縁体を 5'-DMTr基をつけたまま 合成した後、濃アンモニア水で処理すること (60°C、約 5時間）によってオリゴマーを 支持体力も切り出すとともに、リン原子上の保護基シァノエチル基と核酸塩基上の保 護基をはずした。溶媒を減圧下留去し、残った残渣を逆相 HPLC (島津製作所製 LC — 10VPゝカラム（GL Science Inc., Inertsil PREP— ODS (30 X 250 mm))、 A溶液： 5%ァ セトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液： 60%ァセトニト リル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA B%: 15%→ 60%(20 min, linear gradien t) ;40°C ;20 mL/min;254 にて精製し、 18.04分に溶出する分画^^めた。溶媒 を留去した後、 80%酢酸水を加え 20分間放置し DMTr基を除去した。溶媒を留去した 後、水約 30 mLを加え、水層を酢酸ェチル約 30 mLで 3回洗浄し、水溶液留去した。 凍結乾燥を 2回繰り返し脱塩した。得られた脱塩物を、イオン交換榭脂ダウエックス（ ザ.ダウ.ケミカル.カンパ-一製， 50W-X8, 100-200 MESH)ピリジンフォームによりピ リジン塩とした後、続いてダウエックスナトリウムフォームでナトリウム塩とし、溶媒留去 後目的化合物を得た (48.7 mg) ( λ (H 0)=258 nm) [0116] After synthesizing a protected oligonucleotide analog having the target sequence with the 5'-DMTr group attached, the oligomer is also supported by treating with concentrated aqueous ammonia (60 ° C, about 5 hours). In addition to excision, the protecting group Cyanethyl group on the phosphorus atom and the protecting group on the nucleobase were removed. The solvent was distilled off under reduced pressure, and the remaining residue was subjected to reverse-phase HPLC (LC — 10VP column manufactured by Shimadzu Corporation (GL Science Inc., Inertsil PREP— ODS (30 × 250 mm)), solution A: 5% acetonitrile. 0.1M aqueous solution of triethylamine acetate (TEAA), pH 7.0, solution B: 60% acetonitrile, 0.1M aqueous solution of triethylamine acetate (TEAA B%: 15% → 60% (20 min, linear gradien t); 40 ° C; 20 mL The fraction was eluted at 18.04 minutes, and the solvent was distilled off, then 80% aqueous acetic acid was added and left for 20 minutes to remove the DMTr group. About 30 mL of water was added, and the aqueous layer was washed 3 times with about 30 mL of ethyl acetate, and the aqueous solution was distilled off.Freeze-drying was repeated twice for desalting. X (The Dow Chemical Company, 50W-X8, 100-200 MESH) Pyridine salt with pyridine foam, followed by Dowex sodium foam And sodium salt to give the solvent was distilled off after the object compound (48.7 mg) (λ (H 0) = 258 nm)
max 2 。  max 2.
[0117] 本化合物はイオン交換 HPLC (カラム Tosoh TSK-gel DEAE- 5PW(7.5 X 75 mm))； A 液： 20%ァセトニトリル、 B液: 20%ァセトニトリル、 67mMリン酸バッファー (pH6.8), 1.5M K Br, gradients液 30%→70%(10 min, linear geadient); 60°C; 2 mL/min)で分析すると 5 .40分に溶出された。本化合物は、負イオン ESI質量分析により同定した (計算値 : 595 5.96、測定値： 5955.97)。  [0117] This compound is ion-exchange HPLC (column Tosoh TSK-gel DEAE-5PW (7.5 x 75 mm)); solution A: 20% acetonitrile, solution B: 20% acetonitrile, 67 mM phosphate buffer (pH 6.8), When analyzed at 1.5 MK Br, gradients solution 30% → 70% (10 min, linear geadient); 60 ° C; 2 mL / min), it was eluted at 5.40 minutes. This compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 595 5.96, measured value: 5955.97).
[0118] 本化合物の塩基配列は、 (Gene Bank accession No. NM— 005525)のヌクレオチド番 号 356-372に相補的な配列である。  [0118] The base sequence of the present compound is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of (Gene Bank accession No. NM-005525).
[0119] 〔参考例 1〕  [Reference Example 1]
2'- 0,4'- C-エチレン- N-イソブチリルグアノシン結合- CPGの合成 特許 3420984号の実施例 26の化合物 5'-0-ジメトキシトリチル- 2'- 0,4'- C-エチレン -N-イソブチリルグアノシン（6.10 g, 8.93 mmol)を窒素気流下、無水ジクロロメタン（43 mL)に溶力し、この溶液に、コハク酸無水物（1.10 g, 11.0 mmol)、 4-ジメチルアミノビ リジン（1.35 mg, 11.0 mmol)を加え、室温で 2時間攪拌した。反応液を 0.5 Mリン酸力 リウム水溶液 (pH 5.0)で洗浄した後、溶媒を減圧下留去し、残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィーを用いて精製（ジクロロメタン:メタノール = 9： 1(V/V))し、無色ァモ ルファス状化合物（7.05 g, quant.)を得た。このうち 2.5 gを無水ジメチルホルムアミド（ 115 mL)に溶解し、この溶液に、 0- (ベンゾトリアゾール - 1-ィル) - Ν,Ν,Ν',Ν'-テトラメ チルゥ口-ゥムへキサフルォロホスフェイト（1.23 g, 3.24 mmol)、イソプロピルメチルァ ミン 705 L (4.05 mmol)、ァミノプロピル一コントロールドポアグラス（558オングスト口 ーム、粒子サイズ： 120/200メッシュ、 CPG Inc製） 10 gを加え、室温で 15時間振盪した 。 CPGをろ過し、さらにメタノール及びジクロロメタンを用いて順に洗浄し、 CPGにァプ ライドバイオシステムズ社 DNA合成機 ABI392用キヤッビング試薬 2種 (無水酢酸/ピリ ジン/テトラヒドロフラン及び 1-メチルイミダゾール /テトラヒドロフラン）をそれぞれ 20 m Lカロえ、 5分間放置した。 CPGをろ過し、メタノール及びジクロロメタンを用いて順に洗 浄し、減圧乾燥し、 目的物 (約 11 g、ジメトキシトリチル基の導入量 85 mol/g)を得 た。 Synthesis of 2'-0,4'-C-ethylene-N-isobutyrylguanosine linkage-CPG Patent 3420984 Example 26 compound 5'-0-dimethoxytrityl-2'-0,4'-C-ethylene-N-isobutyrylguanosine (6.10 g, 8.93 mmol) was added to anhydrous dichloromethane (6.10 g, 8.93 mmol) under a nitrogen stream. 43 mL), succinic anhydride (1.10 g, 11.0 mmol) and 4-dimethylaminopyridine (1.35 mg, 11.0 mmol) were added to the solution, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. The reaction mixture was washed with 0.5 M aqueous potassium phosphate solution (pH 5.0), the solvent was evaporated under reduced pressure, and the residue was purified by silica gel column chromatography (dichloromethane: methanol = 9: 1 (V / V) The colorless amorphous compound (7.05 g, quant.) Was obtained. Dissolve 2.5 g of this in anhydrous dimethylformamide (115 mL), and add 0- (benzotriazole-1-yl) -Ν, Ν, Ν ', Ν'-tetramethylyl mouth-hexane to this solution. Fluorophosphate (1.23 g, 3.24 mmol), isopropylmethylamine 705 L (4.05 mmol), aminopropyl-controlled pore glass (558 angstrom mouth, particle size: 120/200 mesh, manufactured by CPG Inc) 10 g was added and shaken at room temperature for 15 hours. CPG was filtered, washed in turn with methanol and dichloromethane, and 2 kinds of CBI reagent (Acetate / Pyridine / Tetrahydrofuran and Acetic Anhydride / Pyridine / Tetrahydrofuran) for the Biosynthesis Systems DNA Synthesizer ABI392 were added to CPG. 20 mL each and left for 5 minutes. CPG was filtered, washed successively with methanol and dichloromethane, and dried under reduced pressure to obtain the desired product (about 11 g, amount of dimethoxytrityl group introduced 85 mol / g).
〔参考例 2〕 (Reference Example 2)
HO- Te2s- Ge2s- 5Ce2s- Ge2s- Ts- Ts- Cs- As- Cs- As- Gs- As- Gs- Ge2s- Ae2s- Ge2s- Ge2t- Hの合成 11 β -HSD1を標的としない非特異的配列を有する配列を有する参考例 2の化合物 を参考例 1記載の CPG 31 /z molを用いて、実施例 5の化合物と同様に合成した。脱 保護後、逆相 HPLC (島津製作所製 LC— 10VP、カラム（GL Science Inc., Inertsil PR EP-ODS (30 X 250 mm))、 A溶液： 5%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA), pH 7.0、 B溶液： 60%ァセトニトリル、 0.1M酢酸トリェチルァミン水溶液 (TEAA) 、 B%: 15%→ 60%(20 min, linear gradient) ;40°C ; 20 mL/min;254 nm)にて精製し、 ジ メトキシトリチル基の結合したィ匕合物を含む分画を集めた。ジメトキシトリチル基の脱 保護を行い、分液し操作を行った。イオン交換榭脂ダウエックス (ザ'ダウ 'ケミカル'力 ンパニー製， 50W-X8, 100-200 MESH)ピリジンフォームによりピリジン塩とした後、続 いてダウエックスナトリウムフォームでナトリウム塩とし、溶媒留去後目的化合物を得たHO- T e2s -G e2s -5C e2s -G e2s -T s -T s -C s -A s -C s -A s -G s -A s -G s -G e2s -A e2s -G e2s- Synthesis of G e2t -H 11 Similar to the compound of Example 5 using the compound of Reference Example 2 having a nonspecific sequence that does not target β-HSD1 and using CPG 31 / z mol described in Reference Example 1. Was synthesized. After deprotection, reverse-phase HPLC (LC—10VP, Shimadzu Corporation, column (GL Science Inc., Inertsil PR EP-ODS (30 X 250 mm)), A solution: 5% acetonitrile, 0.1M aqueous solution of triethylamine acetate (TEAA) , pH 7.0, B solution: 60% acetonitrile, 0.1M triethylamine acetate aqueous solution (TEAA), B%: 15% → 60% (20 min, linear gradient); 40 ° C; 20 mL / min; 254 nm) Purified and collected fractions containing dimethoxytrityl group-bound compounds. The dimethoxytrityl group was deprotected, and the operation was separated. Ion exchange resin dowex (The 'Dow' Chemical 'force, manufactured by Impani, 50W-X8, 100-200 MESH) And converted to sodium salt with Dowex sodium foam, and the target compound was obtained after distilling off the solvent.
(34.2 mg) ( λ (H 0)=259 nm)。また、最終的に精製した本ィ匕合物は、イオン交換 H max 2 (34.2 mg) (λ (H 0) = 259 nm). The final purified compound is ion-exchanged H max 2
PLC (島津製作所製 LC 10VP、カラム（東ソ一株式会社， DEAE-5PW (10 X 50mm)) 、 A溶液： 20%ァセトニトリル水溶液、 B溶液： 20%ァセトニトリル 67mMリン酸バッファー 1.5M臭化カリウム水溶液 pH6.8 B%: 30%→ 70%(10min, linear gradient) ; 60°C； 2 ml/ min;254 nm)で分析すると、 5.21分に溶出された。また、本化合物は、負イオン ESI質 量分析により同定した (計算値： 5882.87、測定値： 5882.22)。  PLC (Shimadzu Corporation LC 10VP, column (Tosohichi Corporation, DEAE-5PW (10 X 50mm)), A solution: 20% acetonitrile aqueous solution, B solution: 20% acetonitrile 67mM phosphate buffer 1.5M potassium bromide aqueous solution When analyzed at pH 6.8 B%: 30% → 70% (10 min, linear gradient); 60 ° C .; 2 ml / min; 254 nm), it was eluted at 5.21 minutes. The compound was identified by negative ion ESI mass spectrometry (calculated value: 5882.87, measured value: 5882.22).
[0121] 〔試験例 1〕 アンチセンスオリゴヌクレオチドによる Il j8 - HSD1 mRNA抑制の評価 ヒト腎臓由来の細胞株である 293細胞（ATCC(American Type Culture Collection)か ら購入）に、ヒト 11 iS -HSDlタンパク質をコードする領域の遺伝子を、レトロウイルスシ ステム（Retro- X system,ベタトンディッキンソン社製）を用いて導入した。遺伝子導入 した細胞をピューロマイシン (和光純薬工業社製） 1 μ g/mlの濃度で 1週間処理し、 導入遺伝子を安定に高発現する細胞株を選択した。得られた細胞株に 11 jS -HSDl に対する実施例のアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、その後細胞内 11 j8 -HS DlmRNAを定量することにより、実施例の化合物による mRNA抑制効果を評価した。  [0121] [Test Example 1] Evaluation of Il j8-HSD1 mRNA suppression by antisense oligonucleotides 293 cells (purchased from ATCC (American Type Culture Collection)) and human 11 iS -HSDl A gene in a region encoding a protein was introduced using a retrovirus system (Retro-X system, manufactured by Betaton Dickinson). The transfected cells were treated with puromycin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at a concentration of 1 μg / ml for 1 week, and cell lines that stably expressed the transgene were selected. The antisense oligonucleotide of the example with respect to 11 jS -HSDl was introduced into the obtained cell line, and then the intracellular 11 j8 -HS DlmRNA was quantified to evaluate the mRNA inhibitory effect of the compound of the example.
[0122] まず、 11 β HSDlmRNA配列に対し相補的な配列を持った実施例の化合物を、ヒト 1 1 j8 - HSD1過剰発現細胞株に対して導入した。その際、担体として EPEI (フナコシ社） を使用した。導入力も 48時間経過した細胞力も全 RNAの抽出を行った。具体的には RNeasy mini (キアゲン社製）を使用し、添付プロトコールに従って細胞の溶解及び全 RNAの精製を行った。得られた全 RNAを DNAfree kit (アンビオン社製）を定法通り使 用する事によって処理し、ゲノム DNAの消化を行った。この全 RNA溶液を 0.5 1ずつ サーマルサイクラ一用マイクロチューブに分注し、 TaqMan逆転写キット（アプライドバ ィォシステムズ社製）の 10x反応バッファー 2.5 μ 10mM dNTP混合液 5 1、 25mM 硫酸マグネシウム溶液 5.5 μ 1、オリゴ- (dT)-プライマー 0.5 μ 1、 RNase阻害剤 0.5 μ 1 、逆転写酵素 0.5 /z lを加え、サーマルサイクラ一（DNAエンジン PTC- 200、 MJリサ一 チ社製）を使用して 25°Cで 10分間、 42°Cで 30分間、 95°Cで 5分間保温し、一本鎖 cDN Aの合成を行った。反応終了後、 100 1の RNaseを含まない純水をカ卩え、定量用一 本鎖 cDNA溶液とした。 [0123] 一方、ヒト 11 j8 - HSD1定量 TaqMan PCRの反応に用いるプライマーとして、下記の 配列： [0122] First, the compound of Example having a sequence complementary to the 11 β HSDlmRNA sequence was introduced into a human 11 j8-HSD1 overexpressing cell line. At that time, EPEI (Funakoshi) was used as a carrier. Total RNA was extracted from both the introduction force and the cell force after 48 hours. Specifically, using RNeasy mini (Qiagen), cell lysis and total RNA purification were performed according to the attached protocol. The obtained total RNA was treated by using a DNAfree kit (Ambion) as usual, and genomic DNA was digested. Dispense 0.51 of this total RNA solution into a microtube for thermal cycler, and use TaqMan reverse transcription kit (Applied Biosystems) 10x reaction buffer 2.5 μ 10 mM dNTP mixture 5 1, 25 mM magnesium sulfate solution 5.5 μ 1 Add oligo- (dT) -primer 0.5 μ1, RNase inhibitor 0.5 μ1, reverse transcriptase 0.5 / zl, and use a thermal cycler (DNA engine PTC-200, manufactured by MJ Research). Single-stranded cDNA was synthesized by incubation at 10 ° C for 10 minutes, 42 ° C for 30 minutes, and 95 ° C for 5 minutes. After completion of the reaction, 100 1 RNase-free pure water was added to obtain a single-stranded cDNA solution for quantification. [0123] On the other hand, the following sequences were used as primers for the human 11 j8-HSD1 quantitative TaqMan PCR reaction:
5 ' -CAGCCATGAAGGCAGTTTCTG-3 ' (配列番号 4) ；及び 5，- TCCCCCTTTGA TGATCTCCAG- 3' (配列番号 5)  5'-CAGCCATGAAGGCAGTTTCTG-3 '(SEQ ID NO: 4); and 5,-TCCCCCTTTGA TGATCTCCAG-3' (SEQ ID NO: 5)
を有するオリゴヌクレオチド (インビトロジェン社製)を用いた。  Oligonucleotides (manufactured by Invitrogen) were used.
[0124] また、 TaqMan PCRの反応に用いるプローブとして、下記の配列： [0124] Further, as a probe used for TaqMan PCR reaction, the following sequence:
5， -TGCAAGCAGCTCCAAAGGAGGAATG-3，（配列番号 6)  5, -TGCAAGCAGCTCCAAAGGAGGAATG-3, (SEQ ID NO: 6)
を有し、その 5'末端にレポーター色素 Fam, 3'末端にレポーター消光体の Tamraを結 合したオリゴヌクレオチド (TaqMan Fluorescent Probe,アプライドバイオシステムズジ ャパン社製)を用いた。  An oligonucleotide (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan) in which a reporter dye Fam was bound to the 5 ′ end and a reporter quencher Tamra was bound to the 3 ′ end was used.
[0125] また 11 β -HSD1の発現量の標準化をはかる目的よりリボソームタンパク質、 36Β4の mRNA定量を行うこととし、ヒト 36B4のプライマーとして下記の配列：  [0125] In addition, for the purpose of standardizing the expression level of 11 β-HSD1, mRNA quantification of ribosomal protein 36、4 was performed, and the following sequence as a primer for human 36B4:
5，- TCATCCAGCAGGTGTTCGA- 3，（配列番号 7) ；及び 5， -GCGAGAATGCAGA GTTTCCTC- 3，（配列番号 8)  5,-TCATCCAGCAGGTGTTCGA-3, (SEQ ID NO: 7); and 5,-GCGAGAATGCAGA GTTTCCTC-3, (SEQ ID NO: 8)
を有するオリゴヌクレオチド (インビトロジェン社製)を用いた。また、ヒト 36B4のプロ一 ブとして、下記の配列： 5 ' -ATGGCAGCATCTACAACCCTGAAGTGCT- 3，（配列番 号 9) を有し、その 5'末端にレポーター色素 Fam, 3'末端にレポーター消光体の Tam raを結合したオリゴヌクレオチド (TaqMan Fluorescent Probe,アプライドバイオシステ ムズジャパン社製)を用いた。  Oligonucleotides (manufactured by Invitrogen) were used. As a human 36B4 probe, it has the following sequence: 5'-ATGGCAGCATCTACAACCCTGAAGTGCT-3, (SEQ ID NO: 9), the reporter dye Fam at the 5 'end, and the reporter quencher Tam ra at the 3' end. Was used (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan).
[0126] これら調製した試料を用いて TaqMan PCR法による 11 β -HSD1の発現量の定量を 行った。 [0126] Using these prepared samples, the expression level of 11β-HSD1 was quantified by TaqMan PCR.
[0127] PCR反応は MicroAmp Optical 96- well Reaction Plate (アプライドバイオシステムズ ジャパン社製)上で行った。反応溶液の組成は 1ゥエル中、調製した TaqMan PCR用 铸型一本鎖 cDNA溶液 2.5 μ 1, TaqManPCR用プライマー (50 pmol/ μ 1)を正方向側、 逆方向側ともに  [0127] PCR reaction was performed on a MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (Applied Biosystems Japan). The composition of the reaction solution is 1 μl of TaqMan PCR vertical stranded cDNA solution 2.5 μ1, TaqMan PCR primer (50 pmol / μ 1) prepared in both forward and reverse directions.
0.1 1 (最終濃度 200 nM) ,TaqManPCR用プローブ（6.5 μ Μ) 0.75 μ 1 (最終濃度 19 5 nM), PCR増幅用混合液（TaqMan universal PCR master mix：アプライドバイオシ ステムズジャパン社製） 13.75 μ 1、超純水 10.3 μ 1とした。この際、検量線作成用一本 鎖 cDNA溶液は原液濃度を便宜的に 625とし、以降 5倍希釈を繰り返して濃度 625, 12 5, 25, 5, 1の 5段階の希釈系列とした。 PCR反応は TaqMan PCR専用サーマルサイク ラー'検出器 (ABI 7900：アプライドバイォシステムズジャパン社製)を用いて行った。 反応は、 50°Cで 2分間、 95°Cで 10分間保温の後、 95°Cで 15秒間、 60°Cで 1分間の反 応を 40回繰り返し、 1サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。各サイクル 毎のレポーター色素の発光量から 36B4、 11 j8 - HSD1の増幅曲線を作成した。検量 線作成用一本鎖 cDNA溶液の希釈系列の増幅曲線力も横軸に濃度、縦軸にサイク ル数をとつた検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期に ぉ 、て任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相 対的な発現量を算出した。 11 j8 - HSD1の発現量は同一サンプルにおける 36B4の発 現量の値で補正を行った。その結果、図 5に示したように 11 |8 - HSD1の発現量は実 施例 1の化合物を用いた場合、実施例 1の化合物を導入しな力つたもの（図 5中、 moc k)に比べ、 30%程度の mRNA抑制効果を示した。 0.1 1 (final concentration 200 nM), TaqMan PCR probe (6.5 μΜ) 0.75 μ 1 (final concentration 195 nM), PCR amplification mixture (TaqMan universal PCR master mix: Applied Biosystems Japan) 13.75 μ 1. Ultrapure water 10.3 μ1. At this time, one for creating a calibration curve For the strand cDNA solution, the concentration of the stock solution was conveniently set to 625, and 5 times dilution was repeated thereafter to obtain a 5-step dilution series of concentrations 625, 12 5, 25, 5, and 1. The PCR reaction was performed using a TaqMan PCR dedicated thermal cycler 'detector (ABI 7900: manufactured by Applied Systems Japan). The reaction was incubated at 50 ° C for 2 minutes and at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 reactions of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute, and the amount of reporter dye emitted per cycle. Was measured. An amplification curve of 36B4, 11 j8-HSD1 was prepared from the amount of luminescence of the reporter dye in each cycle. Create a calibration curve with the concentration curve on the horizontal axis and the number of cycles on the vertical axis for the dilution curve of the dilution series of the single-stranded cDNA solution used to create the calibration curve, and for each expression quantification sample during the logarithmic amplification phase, The number of cycles exceeding a certain amount of light emission set arbitrarily was plotted on a calibration curve, and the relative expression level was calculated. 11 The expression level of j8-HSD1 was corrected with the expression level of 36B4 in the same sample. As a result, as shown in FIG. 5, the expression level of 11 | 8-HSD1 was the result of the introduction of the compound of Example 1 when the compound of Example 1 was used (moc k in FIG. 5). Compared with, mRNA suppression effect was about 30%.
〔試験例 2〕 in vivoでの皮下脂肪の抑制評価 [Test Example 2] In vivo subcutaneous fat suppression evaluation
雄性 db/dbマウス（日本クレアより購入）は、 5週齢で購入し、 2日間の馴化期間をお いて実験に供した。馴化および試験期間にわたり 1ケージあたり 5匹で飼育され、飲水 および摂餌 (F2、船橋農場）は自由摂取とした。飼育および投与期間中の動物は、実 験動物管理室により管理されている実験動物エリア内で管理された。各群 n=5となる ように動物を振り分け、 11 jS HSD-lに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（実施例 5 の化合物）又はスクランブル配列を有するオリゴヌクレオチド (参考例 2の化合物）を 腹腔内投与した。各オリゴヌクレオチドは、 lml I 100 g体重となる投与量で最終投与 用量を与えるように生理食塩水で所定濃度に溶解したストック溶液を投与直前に調 製し、上記投与量で毎週 2回計 3週間腹腔に注射した。コントロール群は同投与量の 生理食塩水を投与した。餌 ·一般行動は毎日最低 1回チェックした。 21日目に断頭に よりマウスを屠殺して直ちに皮下脂肪組織を摘出し、液体窒素にて凍結した後一 80 °Cに保存した。 mRNA発現抑制作用を評価する目的でこれら組織から全 RNAの抽出 を行った。具体的には、皮下脂肪組織 lgに TRIzol溶液 (インビトロジヱン社製) 5mlを 加え、ポリトロンホモジナイザー（キネマティ力社製)を用いて 2万回転、 1分間破砕し た。破砕液を 2500回転、 5分間遠心分離して上清を分取し、クロ口ホルム (和光純薬ェ 業製) 1.5mlを添加して 15秒間激しく混和、室温にて 3分間静置の後 2500回転、 30分 間の遠心分離を行い、粗精製全 RNAをペレットの状態で得た。次に、 RNeasy mini (キ ァゲン社製)を使用し、添付プロトコールに従って全 RNAの精製を行った。得られた 粗精製全 RNAを buffer RLT (キアゲン社製)に終濃度 1%で 2—メルカプトエタノール (シ ダマ社製)を添加した溶液 350 μ 1で溶解し、等量の 70%EtOH (和光純薬工業製)を加 え混和した。この溶液から、添付プロトコールに従って全 RNAを精製した。得られた全 RNA溶液を DNAfree kit (アンビオン社製）を定法通り使用する事によって処理し、ゲ ノム DNAの消化を行った。この全 RNAを 0.5 μ gずつサーマルサイクラ一用マイクロチ ユーブに分注し、 TaqMan逆転写キット（アプライドバイオシステムズ社製）の 10x反応 バッファー 2.5 μ 1、 10mM dNTP混合液 5 μ 1、 25mM硫酸マグネシウム溶液 5.5 1、ォ リゴ- (dT)-プライマー 0.5 μ 1、 RNase阻害剤 0.5 μ 1、逆転写酵素 0.5 μ 1を加え、サー マルサイクラ一（DNAエンジン PTC- 200、 MJリサーチ社製）を使用して 25°Cで 10分間 、 42°Cで 30分間、 95°Cで 5分間保温し、一本鎖 cDNAの合成を行った。反応終了後、 100 1の RNaseを含まない純水をカ卩え、定量用一本鎖 cDNA溶液とした。 Male db / db mice (purchased from CLEA Japan) were purchased at 5 weeks of age and used for the experiment after a 2-day acclimation period. During the habituation and testing period, 5 animals were kept per cage, and drinking and feeding (F2, Funabashi Farm) were ad libitum. Animals during the breeding and administration period were managed in the laboratory animal area controlled by the laboratory control room. The animals were sorted so that each group had n = 5, and an antisense oligonucleotide (compound of Example 5) against 11 jS HSD-1 or an oligonucleotide having a scrambled sequence (compound of Reference Example 2) was intraperitoneally administered. Each oligonucleotide was prepared immediately before administration with a stock solution dissolved in physiological saline to give a final dose at a dose of lml I 100 g body weight. Injection into the peritoneal cavity for a week. The control group received the same dose of physiological saline. Food · General behavior was checked at least once daily. On day 21, the mice were sacrificed by decapitation and the subcutaneous adipose tissue was immediately removed, frozen in liquid nitrogen and stored at 80 ° C. Total RNA was extracted from these tissues in order to evaluate the mRNA expression inhibitory effect. Specifically, 5 ml of TRIzol solution (manufactured by Invitrogen) is added to lg of subcutaneous adipose tissue, and pulverized for 1 minute at 20,000 rpm using a Polytron homogenizer (manufactured by Kinematic Power Company). It was. Centrifuge the crushing solution at 2500 rpm for 5 minutes to collect the supernatant, add 1.5 ml of Kuroguchi Form (Wako Pure Chemical Industries), mix vigorously for 15 seconds, and leave at room temperature for 3 minutes. Centrifugation was performed at 2500 rpm for 30 minutes, and crude purified total RNA was obtained in a pellet state. Next, total RNA was purified using RNeasy mini (manufactured by Kagen) according to the attached protocol. The resulting crude purified total RNA was dissolved in buffer RLT (Qiagen) at a final concentration of 1% and 2-mercaptoethanol (Shida) was added in 350 μ1, and an equal volume of 70% EtOH (sum) (Made by Kojun Pharmaceutical Co., Ltd.) was added and mixed. Total RNA was purified from this solution according to the attached protocol. The obtained total RNA solution was treated by using a DNAfree kit (Ambion) as usual to digest genomic DNA. Dispense 0.5 μg of this total RNA into a microcycle for thermal cycler and use TaqMan reverse transcription kit (Applied Biosystems) 10x reaction buffer 2.5 μ1, 10 mM dNTP mixture 5 μ1, 25 mM magnesium sulfate solution 5.5 1, Oligo- (dT) -primer 0.5 μ1, RNase inhibitor 0.5 μ1, reverse transcriptase 0.5 μ1 was added, and thermal cycler (DNA engine PTC-200, manufactured by MJ Research) was used. Single-stranded cDNA was synthesized by incubation at 25 ° C for 10 minutes, 42 ° C for 30 minutes, and 95 ° C for 5 minutes. After completion of the reaction, 100 1 RNase-free pure water was added to obtain a single-stranded cDNA solution for quantification.
[0129] 一方、マウス 11 β -HSD1定量 TaqMan PCRの反応に用いるプライマーとして、下記 の配列： [0129] On the other hand, the following sequences were used as primers for the mouse 11 β-HSD1 quantitative TaqMan PCR reaction:
5 ' -CCTAGCTTCTCCCAAGGAGG-3 ' (配列番号 10) ；及び 5， -TCGCTTTTGCG TAGAGCTGT- 3' (配列番号 11)  5'-CCTAGCTTCTCCCAAGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 10); and 5, -TCGCTTTTGCG TAGAGCTGT-3' (SEQ ID NO: 11)
を有するオリゴヌクレオチド (インビトロジェン社製）を用いた。また、 TaqMan PCRの反 応に用いるプローブとして、下記の配列：  Oligonucleotides (manufactured by Invitrogen) were used. In addition, the following sequences are used as probes for TaqMan PCR reaction:
5 ' -TGCGCCCTGGAGATCATCAAAGG-3 ' (配列番号 12)  5 '-TGCGCCCTGGAGATCATCAAAGG-3' (SEQ ID NO: 12)
を有し、その 5'末端にレポーター色素 Fam, 3'末端にレポーター消光体の Tamraを結 合したオリゴヌクレオチド (TaqMan Fluorescent Probe,アプライドバイオシステムズジ ャパン社製)を用いた。  An oligonucleotide (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan) in which a reporter dye Fam was bound to the 5 ′ end and a reporter quencher Tamra was bound to the 3 ′ end was used.
[0130] また 11 β -HSD1の発現量の標準化をはかる目的よりリボソームタンパク質、 36Β4の mRNA定量を行うこととし、マウス 36B4のプライマーとして下記の配列：  [0130] In addition, for the purpose of standardizing the expression level of 11 β-HSD1, quantification of mRNA of ribosomal protein 36、4 was performed, and the following sequence was used as a primer for mouse 36B4:
5 ' -GCTCCAAGCAGATGCAGCA-3 ' (配列番号 13) ；及び 5， - CCGGATGTGAGG CAGCAG-3' (配列番号 14) 5'-GCTCCAAGCAGATGCAGCA-3 '(SEQ ID NO: 13); and 5, CCGGATGTGAGG CAGCAG-3 '(SEQ ID NO: 14)
を有するオリゴヌクレオチド (インビトロジェン社製)を用いた。また、マウス 36B4のプロ ーブとして、下記の配列：  Oligonucleotides (manufactured by Invitrogen) were used. In addition, as a probe for mouse 36B4, the following sequence:
5 ' -CAAGAACACCATGATGCGCAAGGC -3，（配列番号 15)  5'-CAAGAACACCATGATGCGCAAGGC-3, (SEQ ID NO: 15)
を有し、その 5'末端にレポーター色素 Fam, 3'末端にレポーター消光体の Tamraを結 合したオリゴヌクレオチド (TaqMan Fluorescent Probe,アプライドバイオシステムズジ ャパン社製)を用いた。  An oligonucleotide (TaqMan Fluorescent Probe, manufactured by Applied Biosystems Japan) in which a reporter dye Fam was bound to the 5 ′ end and a reporter quencher Tamra was bound to the 3 ′ end was used.
[0131] これら調製した試料を用いて TaqMan PCR法による 11 β -HSD1の発現量の定量を 行った。  [0131] Using these prepared samples, the expression level of 11β-HSD1 was quantified by TaqMan PCR.
[0132] PCR反応は MicroAmp Optical 96- well Reaction Plate (アプライドバイォシステムズジ ャパン社製)上で行った。反応溶液の組成は 1ゥエル中、調製した TaqMan PCR用铸 型一本鎖 cDNA溶液 2.5 μ 1, TaqManPCR用プライマー (50 pmol/ μ 1)を正方向側、逆 方向側ともに  [0132] The PCR reaction was performed on a MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate (manufactured by Applied Systems Japan). The composition of the reaction solution was 1 μl of TaqMan PCR-type single-stranded cDNA solution 2.5 μ1, TaqMan PCR primer (50 pmol / μ 1) prepared in both forward and reverse directions.
0.1 1 (最終濃度 200 nM) ,TaqManPCR用プローブ（6.5 μ Μ) 0.75 μ 1 (最終濃度 19 5 nM), PCR増幅用混合液（TaqMan universal PCR master mix：アプライドバイオシ ステムズジャパン社製） 13.75 μ 1、超純水 10.3 μ 1とした。この際、検量線作成用一本 鎖 cDNA溶液は原液濃度を便宜的に 625とし、以降 5倍希釈を繰り返して濃度 625, 12 5, 25, 5, 1の 5段階の希釈系列とした。 PCR反応は TaqMan PCR専用サーマルサイク ラー'検出器 (ABI 7900：アプライドバイォシステムズジャパン社製)を用いて行った。 反応は、 50°Cで 2分間、 95°Cで 10分間保温の後、 95°Cで 15秒間、 60°Cで 1分間の反 応を 40回繰り返し、 1サイクル毎にレポーター色素の発光量を測定した。各サイクル 毎のレポーター色素の発光量から 36B4、 11 j8 - HSD1の増幅曲線を作成した。検量 線作成用一本鎖 cDNA溶液の希釈系列の増幅曲線力も横軸に濃度、縦軸にサイク ル数をとつた検量線を作成し、各発現定量用サンプルについてはその対数増幅期に ぉ 、て任意に設定した一定の発光量を超えたサイクル数を検量線上にプロットし、相 対的な発現量を算出した。 11 j8 - HSD1の発現量は同一サンプルにおける 36B4の発 現量の値で補正を行った。その結果、図 6に示したように 11 |8 - HSD1の発現量は実 施例 5の化合物を用いた場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドを導入しなカゝつたもの (図 6中、 control)及び 11 iS -HSDlを標的としない非特異的配列を有するオリゴヌタレ ォチド (参考例 2の化合物）を投与した群に比べ、 40%程度の mRNA抑制効果を示した 0.1 1 (final concentration 200 nM), TaqMan PCR probe (6.5 μΜ) 0.75 μ 1 (final concentration 195 nM), PCR amplification mixture (TaqMan universal PCR master mix: Applied Biosystems Japan) 13.75 μ 1. Ultrapure water 10.3 μ1. At this time, the concentration of the single-stranded cDNA solution for preparing a calibration curve was adjusted to 625 for the sake of convenience, and thereafter, 5-fold dilution was repeated to obtain a 5-series dilution series of concentrations 625, 12 5, 25, 5, and 1. The PCR reaction was performed using a TaqMan PCR dedicated thermal cycler 'detector (ABI 7900: manufactured by Applied Systems Japan). The reaction was incubated at 50 ° C for 2 minutes and at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 reactions of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute, and the amount of reporter dye emitted per cycle. Was measured. An amplification curve of 36B4, 11 j8-HSD1 was prepared from the amount of luminescence of the reporter dye in each cycle. Create a calibration curve with the concentration curve on the horizontal axis and the number of cycles on the vertical axis for the dilution curve of the dilution series of the single-stranded cDNA solution used to create the calibration curve, and for each expression quantification sample during the logarithmic amplification phase, The number of cycles exceeding a certain amount of light emission set arbitrarily was plotted on a calibration curve, and the relative expression level was calculated. 11 The expression level of j8-HSD1 was corrected with the expression level of 36B4 in the same sample. As a result, as shown in FIG. 6, the expression level of 11 | 8-HSD1 was obtained by introducing the antisense oligonucleotide when the compound of Example 5 was used. (Control in Fig. 6) and 11 iS -HSDl showed a 40% mRNA inhibitory effect compared to the group administered with oligonucleotide having a non-specific sequence (compound of Reference Example 2).
[0133] (製剤例 1) [0133] (Formulation Example 1)
ソフトカプセル剤  Soft capsule
消化性油状物、例えば、大豆油、綿実油又はォリーブ油中に入れた、実施例 1の 化合物の混合物を調製し、正置換ポンプでゼラチン中に注入して、 100 mgの活性成 分を含有するソフトカプセルを得、洗浄後、乾燥する。  A mixture of the compound of Example 1 in a digestible oil such as soybean oil, cottonseed oil or olive oil is prepared and injected into gelatin with a positive displacement pump to contain 100 mg of active ingredient Soft capsules are obtained, washed and dried.
[0134] (製剤例 2) [0134] (Formulation Example 2)
錠剤  Tablets
常法に従って、 100 mgの実施例 2の化合物、 0.2 mgのコロイド性二酸化珪素、 5 mg のステアリン酸マグネシウム、 275 mgの微結晶性セルロース、 11 mgのデンプン及び 9 8.8 mgのラタトースを用いて製造する。  Manufactured using 100 mg of the compound of Example 2, 0.2 mg of colloidal silicon dioxide, 5 mg of magnesium stearate, 275 mg of microcrystalline cellulose, 11 mg of starch and 9 8.8 mg of ratatose according to conventional methods. To do.
尚、所望により、剤皮を塗布する。  If desired, a coating is applied.
[0135] (製剤例 3) [0135] (Formulation Example 3)
懸濁剤  Suspension
5 mL中に、 100 mgの実施例 1の化合物、 100 mgのナトリウムカルボキシ基メチルセ ルロース、 5 mgの安息香酸ナトリウム、 1.0 gのソルビトール溶液（日本薬局方)及び 0. 025 mLのバニリンを含有するように製造する。  In 5 mL, 100 mg of the compound of Example 1, 100 mg of sodium carboxymethylcellulose, 5 mg of sodium benzoate, 1.0 g of sorbitol solution (Japanese Pharmacopoeia), and 0.025 mL of vanillin To manufacture.
[0136] (製剤例 4) [0136] (Formulation example 4)
注射剤  Injection
1.5重量％の実施例 2の化合物を、 10容量％のプロピレングリコール中で撹拌し、次い で、注射用水で一定容量にした後、滅菌して製造した。  1.5% by weight of the compound of Example 2 was prepared by stirring in 10% by volume of propylene glycol, then making up to volume with water for injection and then sterilizing.
[0137] (製剤例 5) [0137] (Formulation example 5)
注射剤  Injection
N- ( α—トリメチルアンモ-オアセチル）一ジドデシル一 D—グルタメート クロリド（ 最終濃度 30 nmol/mL)、ジラウロイルホスファチジルコリン（最終濃度 60 nmo/mL)、 ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン（最終濃度 60 nmol/mL)及び 1.5重量％ の実施例 2の化合物を、 10容量％のプロピレングリコール中で撹拌し、次いで、注射用 水を一定容量にした後、滅菌して製造した。 N- (α-trimethylammo-oacetyl) 1-didodecyl 1-D-glutamate chloride (final concentration 30 nmol / mL), dilauroylphosphatidylcholine (final concentration 60 nmo / mL), dioleoylphosphatidylethanolamine (final concentration 60 nmol / mL) and 1.5% by weight The compound of Example 2 was stirred in 10% by volume propylene glycol and then sterilized after making the water for injection a constant volume.
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。  All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
産業上の利用可能性  Industrial applicability
[0138] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び薬理学上許容されるその塩、並びに 本発明の化合物及び薬理学上許容されるその塩は、 11 18 - HSD1の働きを抑制する ことができるので、糖尿病、高血圧等の代謝性疾患の治療'予防に有効である。 配列表フリーテキスト [0138] Since the antisense oligonucleotide of the present invention and pharmacologically acceptable salt thereof, and the compound of the present invention and pharmacologically acceptable salt thereof can suppress the action of 11 18-HSD1, It is effective in the prevention and treatment of metabolic diseases such as diabetes and hypertension. Sequence listing free text
[0139] <配列番号 1 > [0139] <SEQ ID NO: 1>
配列番号 1は、ヒト 11 j8 - HSD1の成熟 mRNAの塩基配列 (EMBL/GenBankに登録さ れている Accession No. NM_05525)を示す。  SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the mature mRNA of human 11 j8-HSD1 (Accession No. NM_05525 registered in EMBL / GenBank).
<配列番号 2>  <SEQ ID NO: 2>
配列番号 2は、ヒト 11 j8 - HSD1のアミノ酸配列 (配列番号 1の塩基配列を有する mRN Aがコードするもの)を示す。  SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of human 11 j8-HSD1 (encoded by mRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 1).
<配列番号 3 >  <SEQ ID NO: 3>
配列番号 3は、ヒト 11 jS -HSDlの DNA配列 (EMBL/GenBankに登録されている Acce ssion No. NM_005525)のヌクレオチド番号 356-372に相補的な配列である。  SEQ ID NO: 3 is a sequence complementary to nucleotide numbers 356-372 of the human 11 jS-HSDl DNA sequence (Accession No. NM — 005525 registered in EMBL / GenBank).
<配列番号 4>  <SEQ ID NO: 4>
配列番号 4は、試験例 1で用いたヒト 11 j8 - HSD1定量 TaqMan PCRの反応に用いる プライマーの塩基配列を示す。  SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of a primer used for the reaction of human 11 j8-HSD1 quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
<配列番号 5 >  <SEQ ID NO: 5>
配列番号 5は、試験例 1で用いたヒト 11 j8 - HSD1定量 TaqMan PCRの反応に用いる プライマーの塩基配列を示す。  SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of a primer used in the reaction of human 11 j8-HSD1 quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
<配列番号 6 >  <SEQ ID NO: 6>
配列番号 6は、試験例 1で用いたヒト 11 j8 - HSD1定量 TaqMan PCRの反応に用いる プローブの塩基配列を示す。  SEQ ID NO: 6 shows the base sequence of the probe used for the reaction of human 11 j8-HSD1 quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
<配列番号 7 > 配列番号 7は、試験例 1で用いたヒト 36B4mRNA定量 TaqMan PCRの反応に用いる プライマーの塩基配列を示す。 <SEQ ID NO: 7> SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of a primer used in the reaction of human 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
<配列番号 8 > <SEQ ID NO: 8>
配列番号 8は、試験例 1で用いたヒト 36B4mRNA定量 TaqMan PCRの反応に用いる プライマーの塩基配列を示す。  SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence of a primer used in the reaction of human 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
<配列番号 9 > <SEQ ID NO: 9>
配列番号 9は、試験例 1で用いたヒト 36B4mRNA定量 TaqMan PCRの反応に用いる プローブの塩基配列を示す。  SEQ ID NO: 9 shows the base sequence of the probe used for the reaction of human 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 1.
く配列番号 10 > <SEQ ID NO: 10>
配列番号 10は、試験例 2で用いたマウス 11 jS -HSDl定量 TaqMan PCRの反応に用 SEQ ID NO: 10 is used for the reaction of mouse 11 jS-HSDl quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
V、るプライマーの塩基配列を示す。 V, shows the base sequence of the primer.
<配列番号 11 > <SEQ ID NO: 11>
配列番号 11は、試験例 2で用いたマウス 11 jS -HSDl定量 TaqMan PCRの反応に用 SEQ ID NO: 11 is used for the reaction of mouse 11 jS-HSDl quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
V、るプライマーの塩基配列を示す。 V, shows the base sequence of the primer.
く配列番号 12 > <SEQ ID NO: 12>
配列番号 12は、試験例 2で用いたマウス 11 jS -HSDl定量 TaqMan PCRの反応に用 SEQ ID NO: 12 is used for the reaction of mouse 11 jS-HSDl quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
V、るプローブの塩基配列を示す。 V, shows the nucleotide sequence of the probe.
く配列番号 13 > SEQ ID NO: 13>
配列番号 13は、試験例 2で用いたマウス 36B4mRNA定量 TaqMan PCRの反応に用 SEQ ID NO: 13 is used for the mouse 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR reaction used in Test Example 2.
V、るプライマーの塩基配列を示す。 V, shows the base sequence of the primer.
く配列番号 14 > SEQ ID NO: 14>
配列番号 14は、試験例 2で用いたマウス 36B4mRNA定量 TaqMan PCRの反応に用 SEQ ID NO: 14 is used for the reaction of mouse 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
V、るプライマーの塩基配列を示す。 V, shows the base sequence of the primer.
く配列番号 15 > SEQ ID NO: 15>
配列番号 15は、試験例 2で用いたマウス 36B4mRNA定量 TaqMan PCRの反応に用 SEQ ID NO: 15 is used for the reaction of mouse 36B4 mRNA quantitative TaqMan PCR used in Test Example 2.
V、るプローブの塩基配列を示す。 V, shows the nucleotide sequence of the probe.
<配列番号 16 > <SEQ ID NO: 16>
配列番号 16は、ヒト 11 j8 - HSD1の成熟 mRNAの塩基配列 (EMBL/GenBankに登録 されている Accession No. NM_181755)を示す。 SEQ ID NO: 16 is the nucleotide sequence of the mature mRNA of human 11 j8-HSD1 (registered in EMBL / GenBank) Accession No. NM_181755).
く配列番号 17 > SEQ ID NO: 17>
配列番号 17は、ヒト 11 jS -HSDlのアミノ酸配列 (配列番号 16の塩基配列を有する m RNAがコードするもの)を示す。  SEQ ID NO: 17 shows the amino acid sequence of human 11 jS-HSD1 (encoded by the mRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 16).
く配列番号 18 > <SEQ ID NO: 18>
配列番号 22は、マウス 11 j8 - HSD1の成熟 mRNAの塩基配列 (EMBL/GenBankに登 録されている Accession No. NM_008288)を示す。  SEQ ID NO: 22 shows the base sequence of mouse 11 j8-HSD1 mature mRNA (Accession No. NM_008288 registered in EMBL / GenBank).
く配列番号 19 > SEQ ID NO: 19>
配列番号 19は、マウス 11 jS -HSDlのアミノ酸配列 (配列番号 24の塩基配列を有す る mRNAがコードするもの)を示す。  SEQ ID NO: 19 shows the amino acid sequence of mouse 11 jS-HSD1 (encoded by mRNA having the base sequence of SEQ ID NO: 24).
<配列番号 20 > <SEQ ID NO: 20>
配列番号 20は、 US20030198965に開示されているアンチセンス分子の塩基配列を 示す。  SEQ ID NO: 20 shows the base sequence of the antisense molecule disclosed in US20030198965.

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
[1] 11 β -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型をコードする核酸分子を標的とする塩基数 15 〜 19個のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチド を構成する糖の少なくとも 1個が 2，- 0,4，- C-アルキレン化、 2，- 0-アルキル化、 2' - 0-ァルケ-ル化又は 2， -0-アルキ-ル化されて!/、る前記アンチセンスオリゴヌクレオ チド又は薬理学上許容されるその塩。  [1] 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase An antisense oligonucleotide having 15 to 19 bases targeting a nucleic acid molecule encoding type 1, and at least one of the sugars constituting the antisense oligonucleotide The above-mentioned anti-alkyl is 2, -0,4, -C-alkylenated, 2, -0-alkylated, 2'-0-alkalylated or 2, -0-alkylated! / Sense oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[2] 前記 11 β -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型をコードする核酸分子が配列番号 1の塩 基配列を有する請求項 1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上許容さ れるその塩。  [2] The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to [1], wherein the nucleic acid molecule encoding the 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 has the base sequence of SEQ ID NO: 1.
[3] 前記 11 β -水酸化ステロイド脱水素酵素 1型が配列番号 2のアミノ酸配列を有する請 求項 1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上許容されるその塩。  [3] The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to claim 1, wherein the 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
[4] 配列番号 3の塩基配列を有する請求項 1〜3の 、ずれかに記載のアンチセンスオリゴ ヌクレオチド又は薬理学上許容されるその塩。 [4] The antisense oligonucleotide according to any one of claims 1 to 3, which has the base sequence of SEQ ID NO: 3, or a pharmacologically acceptable salt thereof.
[5] さらに、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成する塩基の少なくとも 1個が修飾さ れている請求項 1〜4のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理 学上許容されるその塩。 [5] The antisense oligonucleotide or a pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 4, wherein at least one of the bases constituting the antisense oligonucleotide is modified.
[6] 前記修飾塩基が 5-メチルシトシンである請求項 5記載のアンチセンスオリゴヌクレオ チド又は薬理学上許容されるその塩。 6. The antisense oligonucleotide or pharmacologically acceptable salt thereof according to claim 5, wherein the modified base is 5-methylcytosine.
[7] さらに、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを構成するリン酸ジエステル結合の少な くとも 1個が修飾されている請求項 1〜6のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌク レオチド又は薬理学上許容されるその塩。 [7] The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable product according to any one of claims 1 to 6, wherein at least one of the phosphodiester bonds constituting the antisense oligonucleotide is modified. Its salt.
[8] 前記修飾リン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合である請求項 7記載のアン チセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上許容されるその塩。 8. The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to claim 7, wherein the modified phosphodiester bond is a phosphorothioate bond.
[9] 連続した少なくとも 5個のヌクレオチドを構成する糖がすべてデォキシリボースである 請求項 1〜8のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は薬理学上許容 されるその塩。 [9] The antisense oligonucleotide or the pharmacologically acceptable salt thereof according to any one of claims 1 to 8, wherein all of the sugars constituting at least 5 consecutive nucleotides are doxyribose.
[10] 下記の一般式 (I)で表される化合物又は薬理学上許容されるその塩。  [10] A compound represented by the following general formula (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
HO-Bg-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bg-Bc-Ba-Ba-Bt-Bg-Bt-Ba-Bg-Bt-Bgt-H (I) (式中、 Bgは下記の式 (G1)又は (G2)で表される基であり、 Btは下記の式 (T1)又は (T2) で表される基であり、 Beは下記の式 (Cl)、（C2)、（C3)又は (C4)で表される基であり、 Ba は下記の式 (Al)又は (A2)で表される基であり、 Bgtは下記の式 (GTl)又は (GT2)で表さ れる基であるが、ただし、一般式 (I)で表される化合物を構成する糖のうち少なくとも 1 個は 2，- 0,4，- C-アルキレン化、 2，- 0-アルキル化、 2，- 0-ァルケ-ル化又は 2，- 0- アルキ-ル化されている。 ) HO-Bg-Bt-Bg-Bc-Bc-Ba-Bg-Bc-Ba-Ba-Bt-Bg-Bt-Ba-Bg-Bt-Bgt-H (I) (In the formula, Bg is a group represented by the following formula (G1) or (G2), Bt is a group represented by the following formula (T1) or (T2), and Be is the following formula ( Cl), (C2), (C3) or (C4), Ba is a group represented by the following formula (Al) or (A2), and Bgt is a group represented by the following formula (GTl) Or a group represented by (GT2), provided that at least one of the sugars constituting the compound represented by general formula (I) is 2, -0,4, -C-alkylenated, 2, -0-alkylated, 2, -0-alkalylated or 2, -0-alkylated.)
[化 1]  [Chemical 1]
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000071_0001
[化 2]  [Chemical 2]
[化 3] [Chemical 3]
Figure imgf000071_0002
Figure imgf000071_0002
[化 4]
Figure imgf000072_0001
[Chemical 4]
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
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Figure imgf000073_0003
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000073_0002
Figure imgf000073_0003
[化 10]
Figure imgf000074_0001
[Chemical 10]
Figure imgf000074_0001
[化 11] [Chemical 11]
Figure imgf000074_0002
Figure imgf000074_0002
[化 12]
Figure imgf000074_0003
[Chemical 12]
Figure imgf000074_0003
(式中、 Xは、それぞれ、独立に、下記の式 (XI)又は式 (Χ2)で表される基であり、 [化 13] O (Wherein X is each independently a group represented by the following formula (XI) or formula (Χ2): O
I  I
0=P—— OH c x l )  0 = P—— OH c x l)
I  I
o  o
[化 14] o [Chemical 14] o
S=P—— OH ( X 2 )  S = P—— OH (X 2)
o  o
Yは、それぞれ、独立に、水素原子、水酸基又は炭素数 1 6のアルコキシ、ァルケ -ルォキシ若しくはアルキニルォキシ基であり、 Zは、それぞれ、独立に、単結合又は 炭素数 1 5個のアルキレン基である。 ) Y is each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, or an alkoxy, alkoxy- or alkynyloxy group having 16 carbon atoms, and Z is each independently a single bond or an alkylene group having 15 carbon atoms. It is. )
[11] 下記の式 (1241- a)〜(； I244-a)又は (I274-a)の!、ずれかで表される請求項 10記載の化 合物又は薬理学上許容されるその塩。 [11] The compound according to claim 10 represented by the following formulas (1241-a) to (; I244-a) or (I274-a), or a pharmaceutically acceptable salt thereof: .
HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (1241- a) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l242-a) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l243-a) HO-Ge2-Te2-Ge2-Ce2-Ce2-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l244-a)HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -CAGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (1241- a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l242-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -CAGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l243- a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -C e2 -C e2 -AGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l244-a)
H◦— G 丁 51—厂 厂 八51 _r S _j^ (1274 H◦— G Ditch 51 — 厂 八 八51 _r S _j ^ (1274
-a) -a)
(式中、 A A Ae Ae2s G G Ge2 Ge2s Ge2t T T\ T T2 C C Ce2及び Ce2sは 、それぞれ、下記の式 (A)、（As)、（Ae2)、（Ae2s)、（G)、（Gs)、（Ge2)、（Ge2s)、（Ge2t)、（T)、（Ts)、 (Te2)、（Te2s)、（C)、（Cs)、（ )及び (Ce2s)で表される基である。 ) ( Where AAA e A e2s GGG e2 G e2s G e2t TT \ TT 2 CCC e2 and C e2s are respectively the following formulas (A), (A s ), (A e2 ), (A e2s ), ( G), (G s ), (G e2 ), (G e2s ), (G e2t ), (T), (T s ), (T e2 ), (T e2s ), (C), (C s ) , () And (C e2s ).
[化 15] [9ΐ^ ] [Chemical 15] [9ΐ ^]
Figure imgf000076_0001
CCTZ0/S00Zdf/X3d I .0S6S0/900Z OAV
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000076_0001
CCTZ0 / S00Zdf / X3d I .0S6S0 / 900Z OAV
Figure imgf000077_0001
(Ce2) (Ce2s) (C e2 ) (C e2s )
Figure imgf000077_0002
下記の式 (Il-a)〜(： I4-a)又は (134 - a)のいずれかで表される請求項 10記載の化合物又 は薬理学上許容されるその塩。
Figure imgf000077_0002
11. The compound according to claim 10 represented by any one of the following formulas (Il-a) to (: I4-a) or (134-a) or a pharmacologically acceptable salt thereof.
HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (Il-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -CAGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (Il-a)
HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-T-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l2-a) HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-C-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l3-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -5C e2 -AGCAATGTA e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l2-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -CAGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l3-a)
HO-Ge2-Te2-Ge2-5Ce2-5Ce2-A-G-C-A-A-T-G-Te2-Ae2-Ge2-Te2-Ge2t-H (l4-a) HO-G e2 -T e2 -G e2 -5C e2 -5C e2 -AGCAATGT e2 -A e2 -G e2 -T e2 -G e2t -H (l4-a)
e2s ^e2s e2s e2s e2s Λ s s s Λ s Λ s ^s s ^e2s Λ e2s e2s ^e2s e2t T T /T n e2s ^ e2s e2s e2s e2s Λ sss Λ s Λ s ^ ss ^ e2s Λ e2s e2s ^ e2s e2t TT / T n
H〇 - G - T - G - 5C - 5C -A - G - C -A -A - T - G - T -A - G - T - G - H (,13 4-a) H〇-G-T-G-5C-5C -A-G-C -A -A-T-G-T -A-G-T-G-H (, 13 4-a)
(式中、 A A Ae Ae2s G G Ge2 Ge2s Ge2t T T\ T T2 C C 5Ce2及び 5Ce2s は、それぞれ、下記の式 (A)、（As)、（Ae2)、（Ae2s)、（G)、（Gs)、（Ge2)、（Ge2s)、（Ge2t)、（T)、 (Ts )、（Te2)、（Te2s)、（C)、（Cs)、（5 )及び (5Ce2s)で表される基である。 ) (In the formula, AAA e A e2s GGG e2 G e2s G e2t TT \ TT 2 CC 5C e2 and 5C e2s are respectively represented by the following formulas (A), (A s ), (A e2 ), (A e2s ), (G), (G s ), (G e2 ), (G e2s ), (G e2t ), (T), (T s ), (T e2 ), (T e2s ), (C), (C s ), ( 5 ) and ( 5 C e2s ).
[化 17] [Chemical 17]
[8ΐ^ ] [8ΐ ^]
Figure imgf000079_0001
CCTZ0/S00Zdf/X3d LL .0S6S0/900Z OAV
Figure imgf000079_0001
CCTZ0 / S00Zdf / X3d LL .0S6S0 / 900Z OAV
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000080_0002
Figure imgf000080_0002
Figure imgf000080_0003
Figure imgf000080_0003
(5Ce2) (5Ce2s) (5C e2 ) (5C e2s )
Figure imgf000080_0004
Figure imgf000080_0004
(Te2) (T*25) (T e2 ) (T * 25 )
[13] 請求項 1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは薬理学上許容されるその塩 又は請求項 10記載の化合物若しくは薬理学上許容されるその塩を含有する、 11 /S - 水酸ィヒステロイド脱水素酵素 1型発現の抑制剤。 [13] An antisense oligonucleotide according to claim 1 or a pharmacologically acceptable salt thereof or a compound according to claim 10 or a pharmacologically acceptable salt thereof Enzyme type 1 inhibitor.
[14] 請求項 1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくは薬理学上許容されるその塩 又は請求項 10記載の化合物若しくは薬理学上許容されるその塩を含有する、医薬 組成物。 [14] The antisense oligonucleotide according to claim 1 or a pharmacologically acceptable salt thereof A pharmaceutical composition comprising the compound according to claim 10 or a pharmacologically acceptable salt thereof.
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