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WO2005009470A1 - Ａｓｋ１阻害剤を有効成分とする心不全治療薬およびそのスクリーニング方法 - Google Patents

Ａｓｋ１阻害剤を有効成分とする心不全治療薬およびそのスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005009470A1
WO2005009470A1 PCT/JP2004/011124 JP2004011124W WO2005009470A1 WO 2005009470 A1 WO2005009470 A1 WO 2005009470A1 JP 2004011124 W JP2004011124 W JP 2004011124W WO 2005009470 A1 WO2005009470 A1 WO 2005009470A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ask1
heart failure
treatment
prevention
medicament
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/011124
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kinya Otsu
Kazuhiko Nishida
Osamu Yamaguchi
Yoshiharu Higuchi
Hidenori Ichijo
Original Assignee
Osaka Industrial Promotion Organization
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Osaka Industrial Promotion Organization filed Critical Osaka Industrial Promotion Organization
Priority to JP2005512123A priority Critical patent/JPWO2005009470A1/ja
Priority to US10/565,974 priority patent/US20070167386A1/en
Priority to EP04748228A priority patent/EP1661581A1/en
Publication of WO2005009470A1 publication Critical patent/WO2005009470A1/ja

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for heart failure comprising an ASK1 inhibitor as an active ingredient and a screening method thereof.
  • Heart failure is a syndrome that presents a wide variety of systemic self-objective findings due to impaired contractile dysfunction of the myocardium and is life-threatening. Patients with heart failure have reduced exercise tolerance due to their symptoms, have repeated hospitalizations for worsening heart failure, and eventually die, with a very poor prognosis. At present, diuretics, digitalis preparations, ⁇ -blockers, angiotensin converting enzyme inhibitors, angiotensin receptor inhibitors, and the like are used as pharmacotherapy for preventing and treating the onset of heart failure. Although its effect has been demonstrated in large-scale clinical trials, its effect is minor, and it is necessary to rely on heart transplantation in severe chronic heart failure. Development is awaited.
  • ventricular remodeling occurs after heart disease such as myocardial infarction, hypertension, valvular heart disease, etc.
  • heart failure is known to occur.
  • Ventricular remodeling refers to changes in left ventricular geometry, mass, volume, and function in response to myocardial damage or changes in load. The remodeling process is adaptable, but if the disorder or load is persistent and pathological, such as myocardial infarction, hypertension, valvular heart disease, etc., the process becomes maladaptive.
  • ischemia occurs without a sufficient amount of blood being supplied to the enlarged cardiomyocytes, causing myocardial contraction Myocardial dysfunction such as insufficiency may occur, resulting in heart failure syndrome with decreased cardiac output, organ circulatory disorders, venous congestion, and fluid retention.
  • myocardial dysfunction such as insufficiency may occur, resulting in heart failure syndrome with decreased cardiac output, organ circulatory disorders, venous congestion, and fluid retention.
  • the extent of left ventricular dilation during remodeling is a strong indicator of illness and mortality
  • ASK1 apoptosis signal-regulating kinase 1 protein is a mitogen-activated protein that is sensitive to reactive enzyme species.
  • a mouth Tinkina one Zekina one Zekina one peptidase (MAPKKK), N-terminal cinchona over peptidase (JNK) or c-Jun is a protein that has been identified as that activate P 38 MAP kinase (JP-1 0 — Japanese Patent Publication No.
  • ASKl protein can induce apoptosis in a variety of cells (Saitoh, M., Nishitoh, H., Fujii, M., Takeda, K “Tobiume , K., Sawada, Y "Kawabata, M” Miyazono, K. & Ichijo, H. "Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor or apoptosis signal- regulating kinase (ASK) 1) J (1998) Embo J.
  • the present invention provides a medicament for at least one of prevention and treatment of heart failure capable of suppressing the decline of heart function and the initiation of heart failure in the remodeling, a screening method thereof, at least one method of prevention and treatment of heart failure, and It is intended to provide a method for diagnosing insufficiency.
  • the present inventors have studied left ventricular remodeling after myocardial infarction and left ventricular remodeling after pressure overload, which are the most clinically relevant causes of heart failure, in ASK1 knockout mice.
  • left ventricular remodeling after myocardial infarction and left ventricular remodeling after pressure overload which are the most clinically relevant causes of heart failure, in ASK1 knockout mice.
  • ASK1 protein removal was associated with left ventricular remodeling following myocardial infarction and pressure overload.
  • ASK1 protein removal can suppress the progressive increase in the frequency of apoptosis in left ventricular remodeling after myocardial infarction and pressure overload, ASK1 protein
  • the present inventors have found that activation of protein induces apoptosis in cardiomyocytes, and that ASK1 protein is activated in the heart after myocardial infarction or pressure overload, and the present invention has been achieved.
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention is a medicament containing a compound that inhibits the function expression of ASK1 protein in cardiomyocytes as an active ingredient.
  • a method for screening a drug for one is a screening method comprising a step of selecting, from a drug candidate compound, a drug component for at least one of prevention and treatment of heart failure using inhibition of ASK1 protein function expression as an index.
  • the method for diagnosing heart failure of the present invention is a method for measuring the kinase activity or autophosphorylation ability of ASK1 protein in cardiomyocytes.
  • the functional expression of ASK1 protein can be inhibited, and thus, for example, a progressive decline in cardiac contractile function in left ventricular remodeling of heart disease can be suppressed.
  • myocardium As a medicine to prevent cardiac infarction for diseases that may cause ventricular remodeling such as infarction, hypertension, valvular heart disease, congenital heart disease, myocarditis, familial hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy It can be used, and can be used as a medicament for treating heart failure, for example, for heart failure.
  • the screening method of the present invention for example, drug discovery that is effective for prevention and treatment of heart failure can be made. Further, according to at least one of the methods of prevention and treatment of the present invention, for example, effective prevention and treatment of heart failure can be achieved. Further, according to the diagnostic method of the present invention, for example, it is possible to select an effective diagnosis and treatment method.
  • FIG. 1A is an example of a transthoracic M-mode ultrasound echocardiogram in an embodiment of the present invention
  • FIG. 1B is an example of a graph showing parameter changes in echocardiography in the embodiment of the present invention. is there.
  • FIG. 2 is an example of a photograph of a heart sample section in an example of the present invention.
  • FIG. 3A is an example of a graph showing the number of apoptotic cells in the example of the present invention
  • FIG. 3B is an example of triple staining microscopic observation in the example of the present invention
  • FIG. 4A is an example of a graph showing cell viability in the example of the present invention
  • FIG. 4B is an example of observation with a Hoechst stained microscope in the example of the present invention
  • FIG. FIG. 4D is another example of the graph showing the cell viability in the example
  • FIG. 4D is another example of the observation by the Hoechst staining microscope in the example of the present invention
  • FIG. 5A is a diagram showing an example of the measurement results of activation of ASK1 protein in the example of the present invention
  • FIG. 5B is a graph showing the phosphorylation of JNK protein and p38 protein in the example of the present invention. It is a figure showing an example of a result.
  • the ASK1 protein is, for example, a mammalian ASK1 protein, preferably a human ASK1 protein, more preferably an amino acid sequence of GenBank database accession number D84476 or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence. More preferably, the ASK1 protein has the same or substantially the same amino acid sequence as that of the patient's ASK1 protein to which the medicament of the present invention is applied.
  • the substantially identical amino acid sequence for example, the sequence homology is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, further preferably about 80% or more, and particularly preferably.
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention is not particularly limited as long as it is a medicament containing, as an active ingredient, a compound that inhibits the functional expression of ASK1 protein in cardiomyocytes. ) To (8).
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention is a medicament containing, as an active ingredient, a compound that suppresses ASK1 protein-induced apoptosis of cardiomyocytes.
  • the medicament for at least one of the prevention and treatment of heart failure of the present invention is a medicament containing, as an active ingredient, a compound that inhibits the kinase activity of ASK1 protein in cardiomyocytes. .
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure is a medicament containing, as an active ingredient, a compound that inhibits autophosphorylation of ASK1 protein in cardiomyocytes. is there.
  • the drug for at least one of the above is a drug containing, as an active ingredient, a compound that inhibits the translation of ASK1 mRNA in cardiomyocytes.
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention is a medicament containing, as an active ingredient, a compound that inhibits transcription of ASK1 gene in cardiomyocytes.
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention is a medicament comprising, as an active ingredient, a compound that inhibits a factor that activates ASK1 protein in cardiomyocytes. It is.
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention is a medicament comprising, as an active ingredient, a compound that inhibits a factor that activates ASK1 protein in cardiomyocytes. It is.
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention comprises a compound capable of suppressing a progressive decrease in cardiac function in ventricular remodeling in cardiomyocytes. It is a medicine as an active ingredient.
  • the compound that inhibits the kinase activity of ASK1 protein or the compound that inhibits autophosphorylation of ASK1 protein include, for example, an anti-ASK1 antibody specific to ASK1 protein.
  • the anti-ASK1 antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, a known antibody may be used, or a new antibody may be prepared.
  • the method for producing a polyclonal or monoclonal antibody is not particularly limited, and a conventionally known method can be used.
  • the anti-ASK1 antibody may be an antibody fragment.
  • the antibody fragment include F (ab ') 2, Fab, Fab', and Fv fragments, and these fragments may be subjected to various conventionally known modifications.
  • the anti-ASK1 antibody may be a chimeric antibody.
  • a compound that inhibits the kinase activity of the ASK1 protein examples include a dominant negative mutant of ASK1 protein.
  • the ASK1 dominant negative mutant is not particularly limited as long as it can inhibit at least one of kinase activity, autophosphorylation activity, and complexation of ASK1 protein.
  • K709M and K709R indicate that the lysine (K) at position 709 of the ASK1 protein has been replaced by methionine (M) and arginine (R), respectively, and the ASK1NT is an N-terminal region of the ASK1 protein.
  • ASK- ⁇ represents a protein consisting of 649 to 137 amino acid residues, which is the C-terminal region of ASK1 protein.
  • examples of the compound that inhibits the kinase activity of the ASK1 protein or the compound that inhibits the autophosphorylation of the ASK1 protein include thioredoxin.
  • Examples of the compound that inhibits the translation of the ASKl mRNA include, for example, antisense polynucleotides.
  • the ASKl mRNA sequence is, for example, a mammalian ASKl mRNA sequence, preferably a human ASKl mRNA sequence, more preferably the sequence of GenBank database accession number D84476, and more preferably the present invention.
  • the sequence is the same or substantially the same as the ASKl mRNA sequence of the patient to whom the drug is applied.
  • the substantially identical sequence for example, a sequence having a sequence homology of about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, More preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably 95% or more, a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence of ASK1 protein. Is raised.
  • examples of the compound that inhibits the translation of ASK1 mRNA include RNA for RNA interference.
  • examples of the RNA for RNA interference include single-stranded, double-stranded, or triple-stranded RNA having the same sequence as the ASK1 mRNA sequence, and preferably a double-stranded RNA having the same sequence as the ASK1 mRNA sequence. And more preferably a double-stranded RNA having the same sequence as the ASK1 mRNA sequence consisting of an RNA fragment of 19 to 25 nucleotides.
  • Examples of the activator of the ASK1 protein include Daxx, TRAF2, calmodulin-dependent protein kinase II (Ca2 + / calmodulin-dependent protein kinase II; CaM Kinase II), and the like.
  • Examples of such factors include MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, JNK, p38 MAPK and the like.
  • MKK4, MKK7, and JNK are preferable as the factor activated by the ASK1 protein, which is inhibited by the active ingredient.
  • the compound contained as an active ingredient in the medicament for preventing and / or treating heart failure according to the present invention includes, for example, low molecular inorganic compounds, low molecular organic compounds, DNA, RNA, peptides, proteins, lipids, sugars, and the like. And its salts and the like.
  • the compound of the active ingredient is, for example, DNA, RNA, peptide, protein or the like
  • the medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention is a vector comprising a nucleotide sequence encoding a compound as an active ingredient, wherein the nucleotide sequence is But the nucleo A medicament comprising a vector operably linked to regulatory sequences required for the expression of the peptide sequence.
  • the vector is not particularly limited as long as it is a vector capable of inserting the nucleotide sequence into a patient's body, preferably into a cardiomyocyte. For example, single-stranded, double-stranded, or circular Alternatively, a supercoiled DNA or RNA molecule can be used.
  • examples of the vector include a viral vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and pCAGGS (Genel 08, 193-200 (1991)). ), PBK-CMV> pcDNA3, pZeoSV (manufactured by Invitrogen) and the like.
  • the regulatory sequence is a nucleotide sequence required for expression of the operably linked nucleotide sequence in a patient cell, preferably in a cardiomyocyte, and is, for example, a regulatory sequence suitable for eukaryotic cells. Examples include a promoter, a polyadenylation signal, and Enhansa. Said operatively connected means that the components are juxtaposed to perform a function.
  • the medicament for prevention and / or treatment of heart failure of the present invention can be used, for example, in mammals, and preferably in humans. Further, the medicament of the present invention can be applied to diseases such as heart failure, myocardial infarction, hypertension, valvular heart disease, valvular heart disease, congenital heart disease, myocarditis, familial hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, etc. .
  • diseases such as heart failure, myocardial infarction, hypertension, valvular heart disease, valvular heart disease, congenital heart disease, myocarditis, familial hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, etc.
  • the administration route of the medicament for at least one of the prevention and treatment of heart failure of the present invention includes, for example, oral administration and parenteral administration, and the parenteral administration includes, for example, oral administration, intratracheal administration, Rectal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration ⁇ .
  • oral administration for example, oral administration, nasal preparation, transdermal preparation, rectal preparation (suppository), sublingual preparation, vaginal preparation, injection preparation (tranquilizer) , Effervescent, subcutaneous, intradermal), instillation and the like.
  • the oral administration agent include tablets, pills, powders, powders, granules, capsules, Examples thereof include solutions, suspensions, emulsions, and syrups.
  • transdermal agent examples include liquid forms such as lotions and semisolid forms such as creams and ointments.
  • the administration route and administration form of the medicament of the present invention are not limited to these, and it is desirable to use the most effective one for at least one of prevention and treatment.
  • the medicament for prevention and / or treatment of heart failure of the present invention is in a form containing the vector, that is, in the form of a so-called gene therapeutic agent, depending on the vector, the patient's body, preferably a cardiomyocyte It is preferable to introduce it into the inside.
  • examples of a method for administering the vector include an in vivo method and an ex vivo method.
  • the medicament is administered by an appropriate administration route depending on a target disease, a target organ, and the like.
  • it may be administered to a vein, artery, coronary artery, subcutaneous, intradermal, intramyocardial, or the like, or may be directly administered locally to a site recognized as a lesion.
  • the vector when the vector is a non-viral vector, the vector may be administered by, for example, a transfection method using encapsulated ribosomes or electrostatic ribosomes, the HVJ-ribosome method, the improved HVJ-ribosome method, and the receptor method.
  • One method is an intercalation method, a method using a particle gun to introduce a metal particle together with a carrier, a method using a naked-DNA direct introduction method, and an introduction method using a positively charged polymer.
  • the screening method of the medicament for at least one of the prevention and treatment of heart failure according to the present invention includes the step of inhibiting the expression of the function of the ASK1 protein as an index, using a drug candidate compound to prevent or treat heart failure.
  • the method is not particularly limited as long as it is a screening method including a step of selecting a pharmaceutical component of the following, and examples thereof include the following forms (1) to (8).
  • the method for screening a medicament for at least one of the prevention and treatment of heart failure comprises an ASK1 protein-induced apoptosis.
  • a screening method comprising a step of selecting a drug component for at least one of prevention and treatment of heart failure from a drug candidate compound using suppression of one cis as an index.
  • the method for screening a medicament for at least one of prevention and treatment of heart failure of the present invention comprises the steps of: A screening method comprising a step of selecting a pharmaceutical component for at least one of prevention and treatment of heart failure.
  • the method for screening a medicament for at least one of prevention and treatment of heart failure of the present invention comprises the steps of: This is a screening method including a step of selecting a pharmaceutical component for at least one of prevention and treatment of heart failure.
  • the method for screening a medicament for at least one of the prevention and treatment of heart failure comprises the steps of: A screening method comprising a step of selecting a pharmaceutical component for at least one of the prevention and treatment of the disease.
  • the method for screening a drug for at least one of the prevention and treatment of heart failure comprises the steps of: preventing heart failure from a drug candidate compound using inhibition of ASK1 gene transcription as an index. And a step of selecting a pharmaceutical component for at least one of the treatments.
  • the method for screening a drug for at least one of the prevention and treatment of heart failure according to the present invention comprises, using an inhibitor of an activator of ASK1 protein as an index, A screening method comprising a step of selecting a pharmaceutical component for at least one of prevention and treatment of heart failure.
  • the method for screening a drug for at least one of the prevention and treatment of heart failure according to the present invention comprises the steps of:
  • the present invention provides a screening method including a step of selecting a pharmaceutical ingredient for at least one of prevention and treatment of heart failure.
  • the method for screening a drug for at least one of the prevention and treatment of heart failure comprises the steps of: A screening method comprising a step of selecting a pharmaceutical ingredient for preventing and / or treating heart failure from a compound.
  • a screening method comprising a step of selecting a pharmaceutical ingredient for preventing and / or treating heart failure from a compound.
  • the above-mentioned screening method can be performed in silico, in vitro, and in vivo using a conventionally known method.
  • the drug component selected in the step of selecting the above-mentioned drug component may be used as it is as an active ingredient of a drug for at least one of the prevention and treatment of heart failure according to the present invention.
  • the component when it is, for example, a polynucleotide or a polypeptide, it may be used in the form of a gene therapeutic agent containing a gene encoding the polynucleotide / polypeptide as described above.
  • the drug candidate compounds include, for example, low molecular inorganic compounds, low molecular organic compounds, DNA, RNA, peptides, proteins, fats, sugars, derivatives thereof, and salts thereof.
  • a constitutively active ASK1 protein for example, ASK1-AN; ASK1 lacking amino acids 1 to 648 of the N-terminal region
  • Screening methods include selecting an agent capable of suppressing the kinase activity of ASK1 protein by collecting the ASK1 protein by immunoprecipitation and measuring its kinase activity.
  • an anti-phosphorylated ASK1 antibody Western blot using anti-phosphorylated ASK1 antibody to ASK1 protein immunoprecipitated from the cells using anti-ASK1 antibody to suppress autophosphorylation of ASK1 protein
  • screening methods to select drugs that can be used.
  • a screening method using the translation inhibition of ASK1 mRNA as an index specifically, for example, a protein is extracted from cells or animal heart in the presence of a drug candidate compound, and the expression of ASK1 protein is evaluated.
  • screening methods for selecting a drug that inhibits the translation of ASKl mRNA are described in detail below.
  • a screening method using the inhibition of the factor activated by the ASK1 protein as an index specifically, for example, cells expressing the constitutively active ASK- ⁇ or the constitutively active ASK- ⁇ are used.
  • a drug candidate compound is administered to a transgenic mouse expressing the heart, and the activity of, for example, MK3, MKK4, MK6, MKK7, JNK, p38 MAPK, etc., preferably, the activity of MKK4, MK7> JNK is evaluated.
  • the method for evaluating the activity is not particularly limited. For example, it can be performed by detecting phosphorylation of the factor using an antibody or the like.
  • screening methods are examples of the screening method of the present invention, and the screening method of the present invention is not limited thereto.
  • handling of experimental animals, cells, proteins, nucleic acids, and the like is not particularly limited, and can be performed by a conventionally known method.
  • the method for preventing and / or treating heart failure of the present invention is not particularly limited as long as it involves inhibiting the expression of the function of ASK1 protein in cardiomyocytes. For example, the following methods (1) to (6) ).
  • At least one of the methods for preventing and treating heart failure according to the present invention is at least one of the methods for preventing and treating heart failure that suppresses apoptosis induced by ASK1 protein.
  • At least one method for preventing and treating heart failure comprises at least one method for preventing and treating heart failure, which comprises inhibiting ASK1 protein kinase activity in cardiomyocytes. It is.
  • At least one of the methods for preventing and treating heart failure of the present invention comprises at least one of the methods for preventing and treating cardiac phosphorylation of ASK1 protein in cardiomyocytes. It is.
  • At least one method of preventing and treating heart failure according to the present invention comprises at least one method of preventing and treating the transcription / translation activity of ASK1 gene in cardiomyocytes. It is.
  • the method for preventing and treating heart failure of the present invention comprises the prevention comprising inhibiting at least one of an ASK1 activator and an ASK1 protein-activated factor. And at least treatment Is one of the methods.
  • the method for preventing and / or treating heart failure of the present invention comprises the step of providing a medicament for preventing and / or treating heart failure of the present invention, which is pharmaceutically acceptable. It is at least one of prophylaxis and treatment including administering an effective amount. As described above, the most effective method for at least one of the prevention and treatment can be selected as the administration method and administration form of the medicament used for at least one of these prevention and treatment methods. Further, the method for diagnosing heart failure of the present invention is a method for diagnosing, which comprises measuring the kinase activity or autophosphorylation ability of ASK1 protein in cardiomyocytes.
  • the severity and qualitative state of heart failure which may lead to heart failure or heart failure
  • the optimal method for preventing and treating heart failure can be determined.
  • Examples of the heart disease that may cause heart failure include myocardial infarction, hypertension, valvular heart disease, valvular heart disease, congenital heart disease, myocarditis, familial hypertrophic cardiomyopathy, dilated cardiomyopathy, etc.
  • myocardial infarction hypertension
  • valvular heart disease valvular heart disease
  • congenital heart disease myocarditis
  • familial hypertrophic cardiomyopathy familial hypertrophic cardiomyopathy
  • dilated cardiomyopathy etc.
  • the ASK1 knockout mouse used was the F6 generation of the previously reported C57B16 / J strain (Tobiume, K. etal. (2001) EMBO Reports 2, 222-228.), And the control wild-type mouse (WT mouse) was used. ), C57B16 / J mice of the same age were used (Japan SLC, Inc.).
  • Myocardial infarction model and thoracic transverse aortic contraction TAC; thoracic Surgical procedures for the transverse aortic constriction model were performed using 10-week-old mice.
  • the myocardial infarction is caused by ligation of the left coronary artery as described in the literature (Otsu, K. et al. (2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 302, 56-60.) TAC treatment was performed as described in the literature (Date, M. 0. et al. (2002) J. Am. Coll. Cardiol. 39, 907-12.).
  • mice were anesthetized with 2.5% avertin (avertin, 8 / g) and ultrasonography (SONOS-5500 equipped with a 15-MHz linear transducer, manufactured by Philips Medical Systems) was used. And executed.
  • the heart was Bl-imaged on a two-dimensional parasternal short-axis view, and an M-mode echocardiogram of the center of the heart, midventriclej was recorded at the level of the papillary muscle.
  • Heart rate, anterior and posterior wall thickness, left ventricular end diastolic diameter (LVIDd) and left ventricular end systolic diameter (LVIDs) were obtained from the M-mode images.
  • mice For cardiac catheterization, 10-week-old mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of a mixture of keyumin (ketamine 50-100 mg / kg) and xylazine (xylazine 3-6 mg / kg). .
  • keyumin ketamine 50-100 mg / kg
  • xylazine xylazine 3-6 mg / kg.
  • TCP-500 Millar Inc.
  • the catheter was advanced from the aorta into the left ventricle. Left ventricular pressure was digitized and processed by a computer system.
  • the heart sample was stopped at the time of diastole, immediately fixed in 3.7% formalin buffer, embedded in paraffin, and used as a 3 ⁇ 111-thick section specimen. Hematoxylin and eosin (HE) staining or Masson-trichiome staining was performed on serial sections. 1124
  • the kinase activity of the ASKl protein in vitro was measured by the immunocomplex kinase assay as described previously (IcWjo, H. et al. (1997) Science 275, 90-4.). Immunoprecipitation of endogenous ASKl was performed on 500 ⁇ g of myocardial extract as reported (Saitoh, M. et al. (1998) Embo J. 17, 2596-606.).
  • TUNEL terminal deoxyliponyl nucleotidyltransferase-zebiotin-dUTP nick end label
  • Rat ventricular myocytes from 1-2 day old Wistar rats were prepared and cultured as described in the literature (Hirotani, S. et al. (2002) Circulation 105, 509-15.).
  • Adenovirus vectors expressing the constitutively active ASKl (AdASK- ⁇ ) or ⁇ -galactosidase (AdLacZ) are as previously described (Saitoh, M. et al. (1998) Embo J. 17, 2596-606.).
  • Cardiomyocytes were infected with the recombinant adenovirus vector at a multiplicity of infection of 100 plaque forming units per cell for 1 hour. The cells were then cultured for an additional 24 or 48 hours.
  • the relative cell number is based on the Cell Counting Kit-8 based on 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yi; i-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MIT) assay. (Dojindo) was measured three times. Cell staining with Hoechst 33258 was performed by incubating the cells with 16 solutions. 4 011124
  • Activation of JNK and p38 was assessed by cardiac blot extract by Western blot using anti-phosphorylated JNK ⁇ t or anti-phosphorylated p38 antibody.
  • ASK1 knockout mouse hearts were compared to control wild type (WT) mouse hearts.
  • ASK1 knockout mice were born at the expected frequency of Mendelian inheritance and were apparently indistinguishable from control WT mice.
  • the weight of the body, left ventricle, right ventricle, and atria was compared between the ASK1 knockout mouse and the control WT mouse. The results are shown in Table 1 below. As shown in Table 1 below, no significant difference was observed between the two.
  • the heart of the ASK1 knockout mouse did not show any signs of morphological damage, and no histological examination of the heart showed any disruption or necrosis of myofibrils or ventricular fibrosis.
  • the cut surface area of the muscle cells of the ASK1 knock Kuautomausu is, in the control WT same differences mice did not (ASK knockout, a 338 ⁇ 12 1! 1 2, the control WT, 328 ⁇ 12 m 2 ).
  • Table 1 shows the results of evaluation of the left ventricular end diastolic diameter, left ventricular end systolic diameter, left ventricular diameter shortening rate, diastolic ventricular septal thickness, diastolic left ventricular posterior wall thickness, and heart rate by echocardiography. Shown in Also, at that time An example of a wall M-mode ultrasound echocardiogram is shown in the upper part of FIG. 1A. In the figure, the ASK1 knockout mouse is in the column, and the control WT mouse is in the left column. As shown in Table 1 below and FIG.
  • Heart rate (beats / min) 413 ⁇ 28 393 ⁇ 28 n.s.
  • Heart (beats / min) 528 ⁇ 14 531 ⁇ 15 ns, where max dp / di and min dp / dt are the highest pressures generated during systole and diastole, respectively. Indicates the rate of change. Data are presented as mean soil standard deviation. (Cardiac function and ventricular anatomy after myocardial infarction and TAC)
  • the left coronary artery of ASK1 knockout mouse and control WT mouse was ligated to cause myocardial infarction.
  • myocardial infarction remodeling first occurs with a side-side slippage of the muscle cells, resulting in infarct expansion and response to volume overload and neurohumoral signals.
  • the myocardium in the non-infarcted area away from the infarcted area enlarges. Initially, this helps to reduce wall stress, but ultimately, the left ventricle dilates, the left ventricular wall becomes thinner, and the contractile effect decreases.
  • FIG. 1A An example of a transthoracic M-mode ultrasound echocardiogram at that time is shown in the middle part of Fig. 1A.
  • the ASK1 knockout mouse ASK
  • the control WT mouse is in the left column.
  • LVIDd left ventricular end diastolic diameter
  • FS left ventricular diameter shortening rate
  • the left ventricular end-diastolic diameter and end-systolic diameter both increased after the treatment, but the degree of the increase was more significant in the control WT mice than in the ASK1 knockout mice (ASK ⁇ ). It was big. The rate of shortening of the left ventricle diameter decreased in both cases, but the degree of the decrease was significantly greater in the control WT mice than in the ASK1 knockout mice.
  • ASK1 knockout and control WT mice left ventricular dilatation TJP2004 / 011124
  • the lung weight and the lung-to-body weight ratio (lung / body ratio) of the control WT mice were significantly greater in the control WT mice than in the ASK1 knockout mice.
  • the ASK1 knockout was 153.3 ⁇ 3.3 mg
  • the control WT was 204.5 ⁇ 15.3 mg
  • the lung / body ratio was ASK1 knockout was 5.63 ⁇ 0.24 X It) -3
  • the control WT was 7.65 ⁇ 0.53 ⁇ liT 3 ).
  • ASK1 knockout (n U)-basal level _ 2 weeks later 4 weeks later
  • Diastolic ventricular septal thickness 0.68 ⁇ 0.03 0.34 ⁇ 0.04 * 0.37 ⁇ 0.05 #
  • Heart rate (beats / min) 625 ⁇ 20 615 ⁇ 10 566 ⁇ 14
  • Heart rate (beats / min) 604 Sat 5 613 ⁇ 4 576 ⁇ 6
  • n the number of samples, and the data are expressed as the average soil standard deviation.
  • the thoracic transverse aorta of the ASK1 knockout mouse and control WT mouse was subjected to tying (TAC) to generate pressure overload.
  • TAC tying
  • the heart activates an adaptive physiological response, taking the form of cardiac hypertrophy and reducing wall stress.
  • cardiac hypertrophy and reducing wall stress.
  • TAC-treated mice show hyperfunctional hypertrophy at 1 week later without showing any signs of heart failure.
  • prolonged or excessive exposure to mechanical stress can result in ventricular and atrial dilation and cardiac dysfunction.
  • the physiological effect of AS 1 knockout in vivo on left ventricular remodeling after pressure overload with TAC treatment was evaluated. For the evaluation, echocardiography was performed continuously before the surgical procedure, 2 weeks after the procedure, and 4 weeks after the procedure.
  • the results are shown in Table 3 below, and an example of a transthoracic M-mode ultrasonic echocardiogram at that time is shown in the lower part of FIG. 1A.
  • the ASK1 knockout mouse is on the right column
  • the control WT mouse is on the left column.
  • One example of the comparison of the left ventricular end diastolic diameter (LVIDd), the left ventricular end systolic diameter (LVIDs), and the left ventricular diameter reduction ratio (FS) 4 weeks after the treatment is shown in the lower part of FIG. 1B.
  • the heart weight and the heart-to-body weight ratio both increased to the same extent in the ASK1 knockout and control WT mice.
  • the difference was not observed (ASK1 Nokkua ⁇ bet is a 443 ⁇ 18 m 2, the control WT is, was 445 ⁇ 15 ⁇ ! A ⁇ ).
  • the left ventricular end diastolic diameter of the control WT mouse was significantly increased as compared to the ASK1 knockout mouse / sham-treated (non-TAC-treated) mouse.
  • Diastolic ventricular septal thickness (thigh) 0 ⁇ 78 ⁇ 0.03 1.00 ⁇ 0.07 1.1 ⁇ 0.02
  • diastolic left ventricular posterior wall thickness (mm) 0 ⁇ 78 ⁇ 0.04 0.91 Sat 0.03 0.85 ⁇ 0.03
  • Heart rate (beats / min 554 ⁇ 16 548 ⁇ 24 563 ⁇ 26
  • Heart rate (beats / min) 541 ⁇ 26 541 ⁇ 16 548 ⁇ 30
  • ⁇ represents the number of specimens, and data is shown as the average soil standard deviation. nd means not measured, * means P ⁇ 0.05 for sham-operated identical genotype mice, ⁇ means P for control WT mice 4 weeks after TAC ⁇ 0.05, or K0.05 for the same genotype mouse one week after TAC.
  • the right column is the heart of the ASK1 knockout mouse
  • the left column is the heart of the control WT mouse.
  • the left side is a section stained with hematoxylin-eosin (HE)
  • the right side is a section stained with Masson's trichrome
  • the bar shows 5 mm.
  • the heart of the control WT mouse 4 weeks after the treatment was clearly larger than that of the ASK1 knockout mouse.
  • the figure also shows that in the control WT mouse, a part of the area remote from the ischemic injury was replaced by fibrous tissue, whereas in the ASK1 knockout mouse, the remote area was intact. I could read.
  • fibrosis was observed between muscles and around blood vessels.Although, in the remote area of ASK1 knockout mice, only a small amount of The formation was observed.
  • infarct size was similar in both mice prepared immediately after coronary artery ligation, with the mean for ASK1 knockout mice being 51.3 ⁇ 5.7% and the mean for control WT being 49.1 ⁇ 4.9%. Therefore, it was suggested that the phenotype of ASK1 ablation was unlikely to be related to the development of collateral circulation.
  • the mechanical stress produced by TAC treatment can be estimated 7 days after TAC by measuring the pressure gradient across the stenosis in vivo.
  • TAC treatment significantly increased the pressure gradient between the two arterioles, but no significant difference was observed between ASK1 knockout mice and control WT mice (ASK1 knockout was 55.5 ⁇ 5.7 mmHg And the control WT was 57.3 ⁇ 4.6 mmHg).
  • FIG. 3 shows an example of the results of comparison between the ASK1 knockout mouse and the control WT mouse.
  • the graph in Figure 3A shows border and distant areas 1 week or 4 weeks after coronary artery ligation (left 2 panels) and TUNEL-positive cells in myocardium 1 week or 4 weeks after TAC treatment (right panel). Shows an example of the relative number of.
  • TUNEL-positive cells were cardiomyocytes.
  • An example of the result is shown in Figure 3B. As shown in the figure, TUNEL staining appears green, and anti-a-sarcomer antibody and providide iodide staining appear red. Therefore, when both figures are superimposed, if they look yellow, it can be confirmed that they are cardiomyocytes.
  • FIG. 4A is a graph of cell viability as a percentage of the number of survivors on day 0 infected with the virus. As shown in Figure 4A, overexpression of the active mutant form of ASK1 protein caused a decrease in the number of viable cells.
  • FIG. 4 (a) is a photomicrograph of the cells 48 hours after the virus infection, stained with Hoechst.
  • FIG. 4B when the active mutant ASK1 protein was overexpressed and stained with Hoechst33258, various degrees of condensed nuclear chromatin and fragmented nuclei were observed.
  • ⁇ -galactosidase was expressed, such a phenomenon was not observed.
  • the multiplicity of infection was set to 10 and the mutant ASK1 protein was expressed, cardiomyocytes were enlarged. (The need for ASK1 in apoptosis 3 ⁇ 40 2 induced)
  • ASK1 knock Confirmation was performed using cardiomyocytes of neonates from ad mouse (ASK_) and control WT mice.
  • the myocardial cells were cultured for 24 hours with 3 ⁇ 40 2 of various concentrations to measure the number of viable cells by MMT Atsusi was determined viability of the myocardial cells (%). The result is shown in FIG. 4C.
  • the resistance to 3 ⁇ 40 2 the ho UGA cardiomyocytes ASK, was superior cardiomyocytes WT.
  • FIG. 4 D shows that apoptosis was induced.
  • H 2 0 2 The activity of ASK1 protein during remodeling was confirmed.
  • the activity of ASK1 protein was measured for hearts after coronary artery ligation or TAC treatment. The results are shown in Fig. 5A.
  • FIG. 5A shows the results of the measurement of the immunocomplex assay using His-MKK6 as a substrate.
  • the upper panel shows the activation of ASK1 protein 2 days and 1 week after coronary artery ligation. Panels show ASK1 protein activation 2 days and 1 week after TAC treatment.
  • the myocardial homogenates used were myocardial homogenates extracted from untreated, untreated ASK1 knockout mice, and WT mice 2 days and 1 week after untreated, sham-treated and treated.
  • myocardial homogenates were extracted from ASK1 knockout mice 2 days and 1 week after treatment, and from WT mice 2 days and 1 week after sham treatment and treatment. did.
  • FIG. 5A it was confirmed that the ASK1 protein was significantly activated in the heart of the WT mouse after the coronary artery ligation treatment and the TAC treatment. However, no significant activation of ASK1 was observed in ASK1 knockout mice.
  • FIG. 5B is a diagram showing an example of the results of Western blot of heart cells of ASK1 knockout and WT mice against JNK and p38 after ligation treatment on the coronary artery (left side) or after TAC treatment (right side). As shown in the figure, activation of JNK and p38 was observed in the heart of the WT mouse after the coronary artery ligation treatment and the TAC treatment.
  • Chronic heart failure is one of the leading causes of death in developed countries. Also, the fact that acute coronary artery disease has been overcome by the development of CCU (coronary artery disease intensive care) and coronary angioplasty has increased the incidence of heart failure after myocardial infarction. In addition, heart failure patients are also prevalent in the hypertensive group.
  • the present invention is useful, for example, in the field of medicine for the prevention and / or treatment of heart failure and / or the method of prevention and / or treatment of heart failure, for which very great demand is expected.

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Abstract

本発明は、心室リモデリングにおける心機能低下や心不全の開始を抑制できる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬、および、そのスクリーニング方法を提供する。本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞におけるASK1タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬であり、本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、ASK1タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合物から、心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。図１に示すように、ASK1タンパク質を排除すれば、例えば、心筋梗塞や圧負荷等の後の心室リモデリングにおいて、心室拡張を減衰できるから、心不全の予防治療が可能となる。

Description

明 細
ASK1阻害剤を有効成分とする心不全治療薬およびそのスクリーニング方法 技術分野
本発明は、 ASK1阻害剤を有効成分とする心不全治療薬およびそのスクリー二 ング方法に関する。 背景技術
心不全とは、 心筋の収縮機能障害のために全身性の多彩な自 ·他覚所見を呈 する症候群であって、 生命の危険を伴うものである。 心不全の患者は、 それら の症状のため運動耐容能が低下し、 心不全増悪による入院を反復し、 最終的に は死に至り、 その予後は極めて不良である。 現在、 薬物治療として利尿薬、 ジ ギタリス製剤、 βブロッカー、 アンギオテンシン転換酵素阻害薬、 アンギオテン シン受容体阻害薬等が、 心不全発症予防や治療に用いられている。 その効果は 大規模臨床試験で実証はされているが、 その効果は軽微なものであり、 重症の 慢性心不全においては心移植に頼らざるをえない状態であるため、 新しい心不 全の治療方法の開発が待たれている。
心不全の原因は未だ十分には解明されていないが、 臨床経過としては、 例え ば、 心筋梗塞、 高血圧症、 心臓弁膜症等の心臓疾患の後に、 心室リモデリング (再構築） が生じ、 続いて、 心不全が起こることが知られている。 前記心室リ モデリングとは、 心筋の障害や、 負荷の変化に応答する左室のジオメトリ一、 質量、 容積、 機能の変化のことである。 前記リモデリングのプロセスは、 順応 性であるが、 心筋梗塞、 高血圧症、 心臓弁膜症等のように、 前記障害や負荷が 継続的で病的な場合、 前記プロセスは順応不良となる。 そうすると、 肥大した 心筋細胞に十分な量の血液が供給されずに虚血に陥り、 これが原因で心筋収縮 不全などの心筋障害が生じ、 心拍出量の低下、 臓器循環障害、 静脈鬱血、 体液 貯留などを伴う心不全症候群を来すと考えられる。 そして、 リモデリング中の 左室の拡張の程度は、 病気の状態や死亡率についての強力な指標となっている
(Patten, R. D., Udelson, J. E. &Konstam, M. A. 「心不全における心室リモデリン クと- trの" ί CVentricular remodeling and its prevention m the treatment of heart failure)」 （1998) Curr. Opin. Cardiol. 13, 162-7.参照）。
心筋梗塞後の左室リモデリングを引き起こす基礎となるメカニズムは、 ヒト 患者においても実験モデルにおいても、 筋細胞のアポト一シスの関与が示唆さ れている （Olivetti, G" Quaini, E, Sala, R.， Lagrasta, C, Corradi, D.， Bonacina,E., Gambert, S. R, Cigola, E. &Anversa, P. 「ヒト急性心筋梗塞は、心臓の生存部にお けるプログラム筋細胞死と関連する （Acute Myocardial Infarction in Humans is Associated with Activation of Programmed Myocyte Cell Death in the Surviving Portion of the Hearり」 （1996) J. Mol. Cell. Cardiol. 28, 2005-2016·、 および Cheng, W" Kajstura, J" Nitahara, J. A" Li, B.， Reiss, K" Liu, Y" Clark, W. A" Krajewski, S.， Reed, J. C.， Olivetti, G.， et al. 「ラットにおけるプログラム筋細胞死は、 梗塞後の 生存心筋細胞に影響を与える （Programmed Myocyte Cell Death Affects the Viable Myocardium after Infarction in Rats)J (1996) Exp. Cell Res. 226, 316-327.参照）。 ま た、 圧負荷に応答する心肥大の後に生じる心不全においても、 心筋細胞のアポ トーシスは、 代償性肥大と心不全との間の移行における重大なボイントである 考えられてレ る （Hirota, H" Chen, J., Betz, U. A" Rajewsky, K" Gu, Υ·, Ross, J.， Jr., Muller, W. &Chien, K. R. 「gpl30心筋細胞生存経路の欠損は、 生化学的ストレス 下における心不全の発症の決定的事象である （Loss of a gpl30 cardiac muscle cell survival pathway is a critical event in the onset of heart failure during biomechanicalstress)」 （19SI9) Cell 97, 189-98.参照）。
他方、 ASK1 (アポトーシスシグナル制御キナーゼ 1； apoptosis signal-regulating kinase 1) タンパク質は、 反応性の酵素種に感受性を示すマイトジェン活性化プ 口ティンキナ一ゼキナ一ゼキナ一ゼ （MAPKKK) であって、 c-Junの N末端キナ ーゼ (JNK)や、 P38 MAPキナーゼを活性化するものとして同定されたタンパク質 である （特開平 1 0— 0 0 0 0 9 3号公報および Ichijo， H, Nishida, R， Irie, K.， Dijike, P. T" Saitoh, M., Moriguchi,T" Takagi, M.， Matsumoto, K.， Miyazono, K. &Gotoh, Y. 「SAPK/JNKおよび p38シグナル経路を活性化する哺乳類 MAPKKK である ASK1によるアポト一シスの誘導 （Induction of apoptosis by ASKl, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways)」 （1997) Science 275, 90-94.参照）。野生型または恒常的に活性型である ASKlタンパク質 の過剰発現が、様々な細胞でアポト一シスを誘導することや (Saitoh, M., Nishitoh, H.， Fujii, M.， Takeda, K" Tobiume, K., Sawada, Y" Kawabata, M" Miyazono, K. &Ichijo, H. 「哺乳類チォレドキシンは、 アポト一シスシグナル制御キナーゼ 1 (ASK1)を直接阻害する （Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor or apoptosis signal-regulating kinase (ASK) 1)J (1998) EmboJ. 17, 2596-606.参照）、 酸化ストレ スゃ腫瘍壊死因子が誘導するアポトーシスが、 ASK—細胞で抑制されることが報 告されて る (Tobiume, K" Matsuzawa, A" Takahashi, T.， Nishitoh, H., Morita, K.-i.， Takeda, K.， Minowa, O" Miyazono, K" Noda, T. &Ichijo, H. 「 ASKlは、 JNK/p38 MAPキナーゼの持続活性化とアポトーシスに必要である （ASKl is required for sustained activations of JNK/p38 MAP kinases and apoptosis)」 （2001) EMBO Reports 2， 222-228.参照）。 しかしながら、 心不全と ASKlとの関係については、 なんら 報告されていなかった。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
そこで、 本発明は、 前記リモデリングにおける心機能低下や心不全の開始を 抑制できる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬、 そのスク リーニング方法、 心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法ならびに心 不全の診断方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
前記目的を解決するために、 本発明者は、 臨床的に心不全と最も関連性の高 い病因である心筋梗塞後の左室リモデリングと圧負荷後の左室リモデリングを、 ASK1ノックアウトマウスを利用して再現し、左室リモデリングの分子メカニズ ムを解明するという着想を得て鋭意研究を重ねた。その結果、 ASK1タンパク質 を心筋細胞から除去しても、 基底レベルでは心臓に形態学的および組織学的欠 陥が生じないこと、 ASK1タンパク質除去により、心筋梗塞および圧負荷後の左 室リモデリングにおける進行性の収縮機能低下をともなう左室拡張を抑制でき ること、 ASK1タンパク質除去により、 心筋梗塞および圧負荷後の左室リモデリ ングにおけるアポト一シスの頻度の進行的な増加を抑制できること、 ASK1タン パク質の活性化が、 心筋細胞においてアポトーシスを誘導すること、 および、 心筋梗塞や圧負荷後に、 心臓で ASK1タンパク質が活性ィ匕すること等を見出し、 本発明に到達した。
すなわち、 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬 は、心筋細胞における ASK1タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分 とする医薬であり、 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のため の医薬のスクリ一ニング方法は、 ASK1タンパク質の機能発現の阻害を指標とし て、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための 医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法であり、 本発明の心不全の 診断方法は、心筋細胞における ASK1タンパク質のキナーゼ活性または自己リン 酸化能を測定することを含む診断方法である。
発明の効果
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の医薬によれば、 ASK1 タンパク質の機能発現を阻害できるから、 例えば、 心疾患の左室リモデリング における進行性の心臓収縮機能低下を抑制できる。 したがって、 例えば、 心筋 梗塞、 高血圧症、 心臓弁膜症、 先天性心疾患、 心筋炎、 家族性肥大型心筋症、 拡張型心筋症等の心室リモデリングを生じるおそれのある疾患に対して、 心不 全予防の医薬として使用でき、 また、 例えば、 心不全に対して、 心不全治療の 医薬として使用できる。
また、 本発明のスクリーニング方法によれば、 例えば、 心不全の予防や治療 に効果的な医薬の創薬が可能となる。 また、 本発明の予防および治療の少なく とも一方の方法によれば、例えば、効果的な心不全の予防や治療が可能となる。 また、 本発明の診断方法によれば、 例えば、 効果的な診断と治療方法の選択が 可能となる。 図面の簡単な説明
図 1 Aは、 本発明の実施例における経胸壁 Mモード超音波心エコー検査図の 一例であり、 図 1 Bは、 本発明の実施例のおける心エコー検査のパラメーター 変化を示すグラフの一例である。
図 2は、 本発明の実施例における心臓試料切片の写真の一例である。
図 3 Aは、 本発明の実施例におけるアポトーシス細胞数を示すグラフの一例 であり、図 3 Bは、本発明の実施例における三重染色顕微鏡観察の一例である。 図 4 Aは、 本発明の実施例における細胞生存率を表すグラフの一例であり、 図 4 Bは、 本発明の実施例における Hoechst染色顕微鏡観察の一例であり、 図 4 Cは、 本発明の実施例における細胞生存率を表すグラフのその他の例であり、 図 4 Dは、本発明の実施例における Hoechst染色顕微鏡観察のその他の例である。 図 5 Aは、本発明の実施例における ASK1タンパク質の活性化の測定結果の一 例を示す図であり、 図 5 Bは、 本発明の実施例における JNKタンパク質および p38タンパク質のリン酸化を測定した結果の一例を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 ASK1タンパク質は、 例えば、 哺乳類の ASK1タンパク質で あり、 好ましくは、 ヒトの ASK1タンパク質であり、 より好ましくは、 GenBank データベース登録番号 D84476のアミノ酸配列もしくは前記アミノ酸配列と実質 同一のアミノ酸配列であって、 さらに好ましくは、 本発明の医薬を適用する患 者の ASK1タンパク質のアミノ酸配列と同一もしくは実質同一のアミノ酸配列か らなる ASK1タンパク質である。前記実質同一のアミノ酸配列としては、例えば、 配列の相同性が約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最 も好ましくは 9 5 %以上のァミノ配列であって、 ASK1タンパク質の活性を有す るタンパク質をコードする配列があげられる。 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬としては、 心筋細胞における ASK1タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とす る医薬であれば特に制限されないが、 例えば、 下記 （1 ) 〜 （8 ) の形態があ げられる。
( 1 ) 本発明の一形態として、 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも 一方のための医薬は、 ASK1タンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑 制する化合物を有効成分とする医薬である。
( 2 ) 本発明のその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療の少な くとも一方のための医薬は、心筋細胞における ASK1タンパク質のキナーゼ活性 を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
( 3 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞における ASK1タンパク質の自己リ ン酸化を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
( 4 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞における ASK1 mRNAの翻訳を阻害 する化合物を有効成分とする医薬である。
( 5 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞における ASK1遺伝子の転写を阻害 する化合物を有効成分とする医薬である。
( 6 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、 ASK1タンパク質を活性 化する因子を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
( 7 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬は、心筋細胞において、 ASK1タンパク質が活性 化する因子を阻害する化合物を有効成分とする医薬である。
( 8 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬は、 心筋細胞において、 心室リモデリングにお ける進行性の心機能低下を抑制できる化合物を有効成分とする医薬である。 前記 ASK1夕ンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、 または前記 ASK1夕 ンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、例えば、 ASK1タンパク質 に特異的な抗 ASK1抗体があげられる。 前記抗 ASK1抗体は、 ポリクロ一ナル抗 体でもモノクローナル抗体であってもよく、 公知の抗体を利用してもよいし、 新たに作製しても良い。 ポリクローナルまたはモノクローナル抗体の作製方法 は、特に制限されず、従来公知の方法を使用できる。また、前記抗 ASK1抗体は、 抗体断片であってもよい。前記抗体断片としては、例えば、 F(ab')2、 Fab、 Fab'、 および Fvフラグメント等があげられ、これらのフラグメントは、従来公知の種々 の修飾がなされてもよい。 さらにまた、 前記抗 ASK1抗体は、 キメラ抗体であつ てもよい。
さらに、前記 ASK1タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、 または前記 ASKlタンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、 例えば、 ASK1夕 ンパク質のドミナントネガティブ変異体があげられる。前記 ASK1ドミナントネ ガティブ変異体は、 ASK1タンパク質のキナーゼ活性、 自己リン酸化活性、 およ び複合体化の少なくとも一つを阻害できるものであれば、 特に制限されず、 例 え ば、 ASK1(K709M) 、 ASK1(K709R) 、 ASK1NT 、 ASK-AN(K709M) 、 ASK-AN(K709R)等があげられる。 前記 K709Mおよび K709R は、 ASK1タン パク質の 709番目のリジン (K)が、 それぞれメチォニン (M)およびアルギニン (R) に置換したことを表し、 前記 ASK1NTは、 ASK1タンパク質の N末端領域である 1〜 6 4 8ァミノ酸残基部分からなるタンパク質であり、前記 ASK-ΔΝは、 ASK1 タンパク質の C末端領域である 6 4 9〜1 3 7 5アミノ酸残基からなるタンパ ク質を表す。
さらにまた、 前記 ASK1タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、 または 前記 ASK1タンパク質の自己リン酸化を阻害する化合物としては、 例えば、 チォ レドキシン等があげられる。
前記 ASKl mRNAの翻訳を阻害する化合物としては、例えば、 アンチセンスポ リヌクレオチドがあげられる 前記ァンチセンスポリヌクレオチドとしては、
ASKl mRNAと相補的に対合し、 ASK1タンパク質の発現を抑制できるものであ れば、 特に制限されず、 例えば、 アンチセンス DNA、 アンチセンス RNA、 アン チセンス DNA/RNAキメラ、 およびその誘導体等があげられる。前記アンチセン スポリヌクレオチドの配列は、 ASKl niRNAの相補配列と同一または実質的に同 一であることが好ましい。本発明において、 ASKl mRNA配列は、 例えば、 哺乳 類の ASKl mRNA配列であり、 好ましくはヒトの ASKl mRNA配列であり、 より 好ましくは GenBankデータベース登録番号 D84476 の配列であり、 さらに好ま しくは本発明の医薬を適用する患者の ASKl mRNA配列と同一または実質同一の 配列である。 前記実質同一の配列としては、 例えば、 配列の相同性が約 5 0 % 以上の配列であり、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましく は 9 5 %以上の配列であって、 ASK1タンパク質のアミノ酸配列と同一もしくは 実質同一のァミノ酸配列をコードする塩基配列があげられる。
さらに前記 ASK1 mRNAの翻訳を阻害する化合物としては、 例えば、 RNA干 渉のための RNAがあげられる。 前記 RNA干渉のための RNAとしては、 例えば、 前記 ASK1 mRNA配列と同一配列の一本鎖、 二重鎖、 または三重鎖 RNAがあげ られ、 好ましくは、 前記 ASK1 mRNA配列と同一配列の二重鎖 RNAであって、 さらに好ましくは、 1 9〜 2 5ヌクレオチドの RNA断片からなる前記 ASK1 mRNA 配列と同一配列の二重鎖 RNAである。
前記 ASK1タンパク質の活性化因子としては、 例えば、 Daxx、 TRAF2, カル モジユリン依存性リン酸化酵素 II(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II； CaM Kinase II)等があげられ、 前記 ASK1タンパク質により活性化される因子と しては、 例えば、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 JNK、 p38 MAPK等があげ られる。 これらの中でも、 本発明の医薬の一形態において、 有効成分が阻害す る前記 ASK1タンパク質により活性化される因子としては、 MKK4、 MKK7、 JNK が好ましい。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬に有効成分 として含まれる化合物には、 例えば、 低分子無機化合物、 低分子有機化合物、 DNA、 RNA、 ペプチド、 タンパク質、 脂質、 糖、 これらの誘導体、 およびその 塩等が含まれる。 前記有効成分の化合物が、 例えば、 DNA、 RNA、 ペプチドお よびタンパク質等である場合、 これらをコードするヌクレオチド配列を利用で きる。 したがって、 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のため の医薬のさらなる一形態としては、 下記 （9 ) の形態があげられる。
( 9 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬は、 有効成分である化合物をコードするヌクレ ォチド配列を含むベクターであって、 前記ヌクレオチド配列が、 前記ヌクレオ チド配列の発現に必要な調節配列に作動的に連結されているベクターを含む医 薬である。 前記べクタ一としては、 前記ヌクレオチド配列を、 患者の体内、 好ましくは 心筋細胞内に挿入することが可能なベクターであれば、 特に制限されず、 例え ば、 一本鎖、 二重鎖、 環状またはスーパーコイルの DNA分子や RNA分子等を使 用できる。 具体的には、 前記ベクターとしては、 例えば、 レトロウイルスべク タ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスべ クタ一等のウイルスベクターや、 pCAGGS(Genel08,193-200(1991))、 pBK-CMV> pcDNA3、 pZeoSV (インビトロゲン社製） 等の非ウィルスベクターがあげられ る。 前記調節配列とは、 患者の細胞内、 好ましくは心筋細胞内において、 作動 的に連結された前記ヌクレオチド配列の発現に必要な塩基配列をであって、 例 えば、 真核細胞に適した調節配列としては、 プロモーター、 ポリアデニル化シ ダナル、 ェンハンサ一等があげられる。 前記作動的に連結とは、 各構成要素が 機能を果たすことができるように並置していることを表す。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬は、例えば、 哺乳類に使用でき、 好ましくは、 ヒトに使用できる。 また、 本発明の医薬は、 心不全、 心筋梗塞、 高血圧症、 心臓弁膜症、、 心臓弁膜症、 先天性心疾患、 心筋 炎、 家族性肥大型心筋症、 拡張型心筋症等の疾患に適用できる。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の投与経路 としては、 例えば、 経口投与や非経口投与があげられ、 前記非経口投与として は、 例えば、 口腔内投与、 気道内投与、 直腸内投与、 皮下投与、 筋肉内投与、 静脈内投与^があげられる。 また、 投与形態としては、 投与経路に応じて、 例 えば、 経口投与剤、 経鼻剤、 経皮剤、 直腸投与剤 （座剤）、 舌下剤、 経膣剤、 注 射剤 （経静剤、 経動剤、 皮下、 皮内）、 点滴剤等があげられる。 また、 前記経口 投与剤としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 散剤、 粉末剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 溶液、懸濁液、乳液、 シロップ剤等があげられ、前記経皮剤としては、例えば、 ローション等の液剤や、 クリームや軟膏等の半固形剤の形態があげられる。 本 発明の医薬の投与経路および投与形態は、 これらに限られることなく、 予防お よび治療の少なくとも一方に際して最も効果的なものを使用することが望まし い。
本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬が、 前記べ クタ一を含む形態、 いわゆる遺伝子治療剤の剤形を取る場合、 前記ベクターに 応じて、 患者の体内、 好ましくは心筋細胞内に導入することが好ましい。
前記ベクターが、 ウィルスベクタ一である場合、 前記ベクターの投与方法と しては、 例えば、 in vivo法や ex vivo法等があげられる。 前記 in vivo法では、 医薬 は、 目的の疾患、 標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与される。 例え ば、 静脈、 動脈、 冠状動脈、 皮下、 皮内、 心筋内等に投与してもよく、 病変と 認められる部位そのものに直接局所投与しても良い。 他方、 前記ベクターが、 非ウィルスベクターである場合、 前記べクタ一の投与方法としては、 例えば、 内包型リボソームまたは静電気型リボソームによる導入法、 HVJ-リボソーム法、 改良型 HVJ-リボソーム法、 レセプ夕一介在性導入法、 パーティクル銃で金属粒 子の担体とともに導入する方法、 naked-DNAの直接導入法、 正電荷ポリマーに よる導入法等があげられる。 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリ一 ニング方法としては、 ASK1タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候 補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を 選択する工程を含むスクリーニング方法であれば特に制限されないが、例えば、 下記 （1 ) 〜 （8 ) の形態があげられる。
( 1 ) 本発明の一形態として、 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも 一方のための医薬のスクリーニング方法は、 ASK1タンパク質が誘導するアポト 一シスの抑制を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の 少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法で ある。
( 2 ) 本発明のその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療の少な くとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、 ASK1タンパク質のキナーゼ 活性の活性阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法 である。
( 3 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、 ASK1タンパク質の自 己リン酸化の阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治 療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方 法である。
( 4 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬のスクリ一ニング方法は、 ASK1 mRNAの翻訳の 阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくと も一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
( 5 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、 ASK1遺伝子の転写の 阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくと も一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法である。
( 6 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、 ASK1タンパク質の活 性化因子の阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニング方法 である。 ( 7 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、 ASK1タンパク質に活 性化される因子の阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防およ び治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリーニン グ方法である。
( 8 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング方法は、 心室リモデリングの 進行性の心機能低下の抑制を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防 および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択する工程を含むスクリー ニング方法である。 前述のスクリーニング方法は、 インシリコ、 インビトロおよびインビポにお いて従来公知の方法を用いて行うことができる。 また、 前述の医薬成分を選択 する工程で選択された医薬成分は、 そのまま、 本発明の心不全の予防および治 療の少なくとも一方のための医薬の有効成分として利用してもよいし、 前記医 薬成分が、 例えば、 ポリヌクレオチドやポリペプチド等の場合は、 前述のよう に、 前記ポリヌクレオチドゃポリベプチドをコ一ドする遺伝子を含む遺伝子治 療剤という形態で利用してもよい。 前記薬剤候補化合物としては、 例えば、 低 分子無機化合物、 低分子有機化合物、 DNA、 RNA、 ペプチド、 タンパク質、 脂 質、 糖、 これらの誘導体、 およびその塩等が含まれる。
前記アポトーシスの抑制を指標としたスクリーニング方法としては、 具体的 には、 例えば、 恒常的に活性のある ASK1タンパク質 （例えば、 ASK-AN ; N末 端領域のアミノ酸 1〜 6 4 8を欠損した ASK1タンパク質など）を発現する細胞、 または前記恒常活性体 ASK-ΔΝを心臓に発現するトランスゲニックマウスに、 薬剤候補化合物を投与し、 アポトーシスを抑制できる薬剤を選択するスクリー ニング方法等があげられる。 1124
前記キナーゼ活性の活性阻害を指標としたスクリーニング方法としては、 具 体的には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞に ASK1活性化物質を投与 した後、 前記細胞から抗 ASK1抗体を用いて免疫沈降し ASK1タンパク質を回収 して、 そのキナーゼ活性を測定することで、 ASK1タンパク質のキナ一ゼ活性を 抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記自己リン酸化の阻害を指標としたスクリーニング方法としては、 具体的 には、例えば、薬剤候補化合物存在下にある細胞に ASK1活性化物質を投与した 後、前記細胞を試料として抗リン酸化 ASK1抗体を用いてウエスタンブロットを 行う力 または、 前記細胞から抗 ASK1抗体を用いて免疫沈降した ASK1タンパ ク質に対して抗リン酸化 ASK1抗体を用いてウェスタンブロットを行い、 ASK1 タンパク質の自己リン酸化を抑制できる薬剤を選択するスクリーニング方法等 があげあれる。
前記 ASK1 mRNAの翻訳阻害を指標としたスクリ一ニング方法としては、具体 的には、 例えば、 薬剤候補化合物存在下にある細胞または動物心臓からタンパ ク質を抽出し、 ASK1タンパク質の発現を評価することで、 ASKl mRNAの翻訳 を阻害する薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記 ASK1遺伝子の転写阻害を指標としたスクリーニング方法としては、具体 的には、 例えば、 薬剤候補化合物存在下にある細胞または動物心臓から mRNA を単離し、 ASKl mRNAの発現を評価することで、 ASK1遺伝子の転写を阻害す る薬剤を選択するスクリーニング方法等があげられる。
前記 ASK1タンパク質によつて活性化される因子の阻害を指標としたスクリー ニング方法としては、 具体的には、 例えば、 恒常活性体 ASK-ΔΝを発現する細 胞または前記恒常活性体 ASK-ΔΝを心臓に発現するトランスゲニックマウスに、 薬剤候補化合物を投与し、 例えば、 MK 3、 MKK4、 M K6、 MKK7、 JNK、 p38 MAPK等の活性、 好ましくは、 MKK4、 M K7> JNKの活性を評価することで、 ASK1タンパク質によって活性化される因子を阻害する薬剤を選択するスクリー ニング方法等があげられる。 前記活性の評価の方法は、 特に制限されず、 例え ば、 前記因子のリン酸化を、 抗体などを用いて検出することで行うことができ る。
これらのスクリーニング方法は、 本発明のスクリーニング方法の一例であつ て、 本発明のスクリーニング方法は、 これらに限定されない。 また、 前述のス クリーニング方法において、実験動物、細胞、 タンパク質、核酸等の取扱いは、 特に制限なく、 従来公知の方法にて行うことができる。 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法は、 心筋細胞にお ける ASK1タンパク質の機能発現を阻害することを含む方法であれば、特に制限 されないが、 例えば、 下記 （1 ) 〜 （6 ) の形態があげられる。
( 1 ) 本発明の一形態として、 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも 一方の方法は、 ASK1タンパク質が誘導するアポト一シスを抑制することを含む 予防および治療の少なくとも一方の方法である。
( 2 ) 本発明のその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療の少な くとも一方の方法は、心筋細胞において ASK1タンパク質のキナーゼ活性を阻害 することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
( 3 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方の方法は、心筋細胞において ASK1タンパク質の自己リン酸化 を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
( 4 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方の方法は、心筋細胞における ASK1遺伝子の転写翻訳活性を阻 害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法である。
( 5 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方の方法は、 ASK1活性化因子および ASK1タンパク質に活性化 される因子の少なくとも一方を阻害することを含む予防および治療の少なくと も一方の方法である。
( 6 ) 本発明のさらにその他の形態として、 本発明の心不全の予防および治療 の少なくとも一方の方法は、 本発明の心不全の予防および治療の少なくとも一 方のための医薬を、 薬学上許容される有効量投与することを含む予防および治 療の少なくとも一方の方法である。 これらの予防および治療の少なくとも一方の方法に用いる医薬の投与方法や 投与形態は、 前述のとおり、 予防および治療の少なくとも一方に際して最も効 果的なものを選択することができる。 また、 本発明の心不全の診断方法は、心筋細胞における ASK1タンパク質のキ ナーゼ活性または自己リン酸化能を測定することを含む診断方法である。 前記 キナーゼ活性や自己リン酸化能を測定することにより、 例えば、 心不全ゃ心不 全のおそれのある心疾患の重症度、 質的状態が診断でき、 それにより、 最適な 心不全の予防 ·治療方法が選択できる。 前記心不全のおそれのある心疾患とし ては、例えば、 心筋梗塞、 高血圧症、 心臓弁膜症、 心臓弁膜症、 先天性心疾患、 心筋炎、 家族性肥大型心筋症、 拡張型心筋症等があげられる。 以下に具体例を用いて、 本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明は、 以下 の実施例に限定されるものではない。なお、実施に際し、以下の手法を用いた。 実施例
(ASK1ノックァゥトマウスと実験モデル）
ASK1ノックアウトマウスは、既に報告のある C57B16/J系統の F6世代のものを 使用し （Tobiume, K. etal. (2001) EMBO Reports 2, 222-228.)、 その対照野生型マ ウス （WTマウス） として、年齢が同等である C57B16/Jマウスを使用した（Japan SLC，Inc.社製）。 心筋梗塞モデルおよび胸部横行大動脈縮索 （TAC； thoracic transverse aortic constriction)モデルのための外科処置は、 10週齢のマウスを使用 しておこなった。 前記心筋梗塞は、 文献に記載のとおりに、 左冠動脈の結紮処 置により引き起こし （Otsu， K. et al. (2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 302, 56-60.)、 また、 前記 TAC処置は、 文献に記載のとおりに行った （Date, M. 0. et al. (2002) J. Am. Coll. Cardiol. 39, 907-12.)。
(心エコー検査）
心エコー検査は、 マウスを 2.5 %のアバ一チン (avertin、 8 / g )で麻酔し、 ultra-sonography(15-MHzの線形変換器を備えた SONOS-5500、 Philips Medical Systems社製） を用いて実行した。 心臓は、 胸骨傍短軸方向投影診断図 (two-dimensional parasternal short-axis view)で Bl像化し、心至中央、midventriclej の Mモード心エコー図は、 乳頭筋のレベルで記録した。 心拍、 前部および後部 壁厚、 左室拡張末期径 (LVIDd)ならびに左室収縮末期径 (LVIDs)を前記 Mモ一ド 画像から得た。
(心カテーテル法による心臓機能のインビポ評価）
心カテーテル法のために、 1 0週齢のマウスを、ケ夕ミン (ketamine 50-100 mg/kg) とキシラジン (xylazine 3-6 mg/kg)との混合物を腹腔内注射して、麻酔した。次に、 前記マウスの右頸動脈を分離し、文献に記載のとおり、増幅器 (TCP-500, Millar Inc.) に接続された 1.4 French Millarカテーテルとともに力ニューレを揷入した (Nakayama, H. et al. (2002) FASEB J., 02-0474fje.)。 前記カテーテルを前記顏動脈 に挿入した後、 前記カテーテルを大動脈から左室内に進めた。 左室圧は、 デジ タル化し、 コンピュータ一システムにより処理した。
(組織学的解析）
心臓試料は、 心拡張時で停止させ、 すぐに 3.7%ホルマリンバッファーで固定 し、 パラフィンに埋め込み、 厚み 3^111の切片標本とした。 へマトキシリン 'ェ ォジン （Hematoxylin and eosin； H E) 染色またはマッソントリクローム染色 (Masson-trichiome staining) を連続切片に対して ί"Τつた。 1124
インビトロにおける ASKlタンパク質のキナーゼ活性は、以前に記載されたと おり、免疫複合体キナーゼァッセィにより測定した (IcWjo, H. et al. (1997) Science 275, 90-4.)。 内因性の ASKlの免疫沈降は、 報告のとおり、 5 0 0〃gの心筋ェキ ストラクトに対して行つた (Saitoh, M. et al. (1998) Embo J. 17, 2596-606.)。
(アポ卜一シスの評価）
アポ卜一シスの評価は、 ターミナルデォキシリポヌクレオチジルトランスフ エラ一ゼビォチン- d U T Pニックエンド標識 (TUNEL) アツセィにて行った。 前記ァッセィは、 ィンサイチュ (in-situ) アポト一シス検出キット (Takara社製） を使用して、 製造業者の取扱説明書に従い、 パラフィンに埋め込まれた心臓切 片に対して行った。 TUNEL陽性核の数は、 x40対物レンズで切片全体を調べて 数えた。 いくつかの試料については、 ヨウ化プロビジゥム （propidium iodide、 Vector Laboratories Inc社製）、 TUNEL, および、 抗 a-サルコメァ （横紋筋線維） ァクチン抗体を用いた三重染色を行った。
(新生児ラットの心室筋細胞の初代培養とサバイバルァッセィ）
1〜2日齢のウィスターネズミから得たラットの心室筋細胞を、 文献のとお りに、 調製し、 培養した (Hirotani, S. et al. (2002) Circulation 105， 509-15.)。恒常活 性体の ASKl (AdASK-ΔΝ) または βガラクトシダーゼ （AdLacZ) を発現するァ デノウィルスベクターは、以前に記載のとおりである (Saitoh, M.et al. (1998) Embo J. 17, 2596-606.)。 心筋細胞に、 前記組換えアデノウイルスベクターを、 細胞あ たり 1 0 0プラーク形成単位の感染多重度で、 1時間感染させた。 その後、 前 記細胞を、 さらに 24時間または 48時間培養した。 0日目の値を 1とした相対細 胞数は、 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yi;i-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MIT) ァッ セィに基づいた Cell Counting Kit-8 (Dojindo社製）を用いて、 3回測定した。 Hoechst 33258による細胞染色は、細胞を 1 6 の溶液でィンキュベ一トして行った。 4 011124
(MAPKリン酸化の検定）
JNKや p38の活性化は、 心筋エキストラクトを、 抗リン酸化 JNK^t体または抗 リン酸化 p38抗体を用いたウェスタンブロットにより評価した。
実験の結果は、 平均 ±標準誤差 (SEM) として示した。 対のデ一夕は、 Student's t testで評価した。 一元配置の分散分析 （ANOVA) とボンフエ口一二の多重比較
(the Bonferroni's post hoc test) または反¾測疋分散分析 (repeated measures ANOVA) を、 多重比較 （multiple comparisons) に使用した。 P < 0 . 0 5の値 は、 統計学的に有意であるとみなした。 (ASK1ノックァゥトマウスにおける心臓の特徴付け）
ASK 1のノックアウトマウスの心臓と、 対照野生型 （WT)マウスの心臓とを 比較した。 ASK1ノックアウトマウスは、期待されるメンデル遺伝の頻度で産ま れ、 外見上は、 対照 WTマウスと見分けがつかなかった。 また、 体、 左室、 右室 および心房の重さについて、 前記 ASK1ノックアウトマウスと前記対照 WTマゥ スとを比較した。 その結果を、 下記表 1に示す。 下記表 1のとおり、 両者の間に 有意な差は認められなかった。前記 ASK1ノックアウトマウスの心臓は、形態学 的傷害の徴候をなんら示さず、 前記心臓の組織学的検査においても、 筋原線維 の混乱や壊死、 または心室線維症は認められなかった。 さらに、 前記 ASK1ノッ クァゥトマウスの筋細胞の切断面領域は、前記対照 WTマウスのそれと差異はな かった （ASKノックアウトでは、 338±12 1!12であって、 対照 WTでは、 328±12 m2であった）。
次に、 ASK1のノックアウトが、 心臓機能に影響するかどうかを判断するため に、 ASK1ノックアウトマウスの心臓の性能を、 10週齢のマウスにおける心ェコ 一検査と心臓カテーテル法によって評価した。 心エコー検査による、 左室拡張 末期径、 左室収縮末期径、 左室内径短縮率、 拡張期心室中隔壁厚、 拡張期左室 後壁厚、 および、 心拍数の評価の結果を下記表 1に示す。 また、 その時の経胸 壁 M-モ一ド超音波心エコー検査図の一例を図 1 Aの上段に示す。同図において、 ASK1ノックアウトマウスはお欄であり、 対照 WTマゥスは左欄である。 下記表 1および図 1 Aに示すように、 前記評価項目において、 ASK1ノックアウトマウ スと対照 WTマウスとでは、有意な差は認められなかった。心臓カテーテル法に より得られた、 左室収縮圧、 左室拡張末期圧、 左室圧の最大一次導関数、 左室 圧の最小一次導関数、 および心拍に関する血行動態データを下記表 1に示す。 下記表 1に示すように、 前記血行動態データにおいても、 ASK1ノックアウトマ ウスと対照 WTマウスとでは、 有意な差は認められなかった。 以上の知見から、 ASK1ノックアウトマウスが、正常な心臓の全体構造および機能を有しているこ とが示唆される。
(表 1)
基底レベルにおける生理学的パラメ一夕と、心臓力テ一テル法および心ェコ一検査法に よるインビポの心臓のサイズと機能の解析。
形態測定べ一スライン ASKl-/- (n=5) WT (n=5)
体重 (g) 23.0±0.8 23.6±0.2 n. s.
心臓重量 ung) 106.8±3.8 106.0±2.2 n. s.
左室重量 （mg) 75.5±2.0 74.1±1.6 n. s.
右室重量 （mg) 20.4±2.0 18.4±0.7 n. s.
心房重量 （mg) 8.7±1.3 10.1±0.4 n. s.
脛骨長 （mm) 16.8±0.1 17.2±0.2 n. s.
左室重/体重 (mg/g) 3.29±0.07 3.14±0.06 n. s.
左室重/脛骨長 （mg/mm) 4.48±0.11 4.30±0.11 n. s.
左室収縮期圧 （!MlHg) 86.0±2.0 83.2±3.0 11. s.
左室拡張末期圧 （mmHg) 0.9±0.9 0.5±0.3 n. s.
max dp/dt (.mmHg/sec 6600±270 6320±490 Π. s.
min dp/dt (mmHg/sec) 一 5300±440 - -4900±360 n. s.
心拍 (beats/min) 413±28 393±28 n. s.
心エコー検査ベースライ ' ASK-/- (n=10) WT (n=10)
左室拡張末期径 （mm) 3.84±0.08 3.92±0.06 n. s.
左室収縮末期径 （mm) 2.33±0.06 2.37±0.06 n. s.
左室内径短縮率 （％) 39.3±0.8 39·5±0.7 n. s.
拡張期心室中隔壁厚 (mm) 0.68±0.03 0.70±0.02 n. s.
拡張期左室後壁厚 (mm) 0.62±0.04 0.65±0.03 n. s.
心お (beats/min) 528±14 531±15 n. s. な差が認められないことを表し、 max dp/diおよび min dp/dtは、 それぞれ、 収縮期おょぴ 弛緩期に発生する圧力の最高変化率を表す。 データは、 平均土標準偏差で示されている。 (心筋梗塞および TAC後の心臓機能と心室の解剖学的構造）
ASK1ノックアウトマウスと対照 WTマゥスの左冠動脈を結紮処置し、 心筋梗 塞を引き起こさせた。 心筋梗塞において、 リモデリングは、 まず、 筋細胞の側 面と側面のズレ （side-side slippage) に伴って生じ、 その結果、 梗塞が拡大し、 そして、 容積負荷と神経液性シグナルに応答して、 梗塞領域から離れた非梗塞 領域の心筋が肥大する。 初期には、 このことは、 壁のストレスを減少するのに 役立つが、 最終的には、 左室が拡張し、 左室壁が薄くなり、 収縮作用が低下す る。 前記外科的処置後の早期手術死亡率 （24時間以内） は、 ASK1ノックアウト マウスと対照 WTマウスでともにゼロであり、 7日以内の死亡率も両者の間に有 意な差は認められなかった （ASK1ノックアウトマウスが 20%であり、 対照 WT マウスが 18%であった）。死亡したマウスの全ての例において、 心臓の周囲また は胸腔を満たす過度の出血があり、 左室の破裂が死亡原因であることが認めら れた。 なお、 前記外科的処置の 1週間後から四週間後までの期間は、 マウスは死 亡しなかった。心筋梗塞後の左室リモデリングにおける、 ASK1ノックアウトの インビポにおける生理学的影響を評価した。 前記評価のために、 心エコー検査 法を、 前記外科的処置前、 前記処置の 2週間後、 および前記処置の 4週間後に、 連続的に行った。 その結果を下記表 2に示し、 そのときの経胸壁 M-モード超音 波心エコー検査図の一例を図 1 A中段に示す。 同図において、 ASK1ノックァゥ トマウス (ASK )は右欄であり、 対照 WTマウスは左檷である。 また、 前記処置 4 週間後の左室拡張末期径 (LVIDd)、 左室収縮末期径LVIDs)および左室内径短縮 率 (FS)を比較した一例を図 1 B上段に示す。同図および下記表 2に示すとおり、 処置後の左室拡張末期径および収縮末期径は、 ともに増加したが、 その増加の 程度は、 ASK1ノックァゥトマウス (ASK^)よりも対照 WTマウスが有意に大きか つた。 また、 左室内径短縮率は、 ともに減少したが、 その減少の程度は、 ASK1 ノックァゥトマウスよりも対照 WTマウスが有意に大きかった。偽処置の（左冠 動脈を結紮していない) ASK1ノックァゥトおよび対照 WTマウスでは、左室拡張 TJP2004/011124
末期径、 収縮末期径、 および、 左室内径短縮率のいずれについても、 著しい変 化は認められなかった。 左冠動脈結紮の 4週間後の対照 WTマウスの肺重量およ び肺と体の重量比 （肺/体比） は、 対照 WTマウスが ASK1ノックアウトマウスよ りも有意に大きかった（肺重量は、 ASK1ノックァゥトが、 153.3±3.3 mgであり、 対照 WTが、 204.5±15.3 mgであった。 また、 肺/体比は、 ASK1ノックアウトが、 5.63±0.24 X It)-3であり、 対照 WTが、 7.65±0.53 xliT3であった）。
(表 2)
心筋梗塞後における生理学的パラメ - '夕と、 心エコー検査法によるィ
ンピポの心臓のサイズと機能の解析。
ASK1ノックアウト（n=U) ―基底レベル _ 2週間後 4週間後
体重 （g) 24.6±1.9 25.4±1.0 27.4±2.04=
左室拡張末期径 （膽） 3.64±0.09 4.33±0.09* 4.72±0.16*†
左室収縮末期径 （腿） 2.28±0.06 3.78±0.07* 4.05±0. 卞
左室内径短縮率 （％) 39.1±1.7 12.8±0.4* 13.9±1.6=t=†
拡張期心室中隔壁厚 （膽） 0.68±0.03 0.34±0.04* 0.37±0.05#
拡張期左室後壁厚 (mm) 0.62±0.03 0.73±0.03 0.77±0.03†
収縮期血圧 (mmHg) 107±2.5 109±3.1 108±3.8
心拍 （beats/min) 625±20 615±10 566±14
対照 WT (n=8) 基底レベル _ 2週間後 一 4週間後
体重 （g) 23, 3±0.8 24.5±1.3 26.5±2.3*
左室 ί£張末期径 （mm) 3.75±0.06 5.72±0.24* 6.17±0.3*
左室収縮末期径 （删） 2.37±0.15 5.23±0.25* 5.65±0.3*
左室内径短縮率 （％) 38.8±1.0 8.8±1.0* 8.7±1.0*
拡張期心室中隔壁厚 （讓） 0.73±0.02 0.33±0.02* 0.31±0.01*
拡張期左室後壁厚 （龍） 0.65±0.06 0.48土 0.06* 0.55±0.05*
収縮期血圧 （mmHg) 104±4.8 104±3.9 106±4.0
心拍 （beats/min) 604土 5 613±4 576±6
上記表 2中、 nは、 検体数を表し、 データは、 平均土標準偏差で示され
ている。 *は、 基底レベルの同一遺伝子型マウスに対して Pく 0.05であるこ
とを表し、 †は外科的処置の 4週間後の対照 WTマウスに対して、 Pく 0.05
である。
次に、 ASK1ノックアウトマウスと対照 WTマウスの胸部横行大動脈を緊縛 (TAC) 処置し、 圧負荷を生じさせた。 圧負荷に応答して、 心臓は、 順応性の 生理的応答を活性化し、心臓肥大という形をとり、壁のストレスを減少させる。 TAC処置したマウスにおいても、 1週間後の時点では、 心不全の兆候を示すこと なく、 機能亢進肥大を示すことが知られている。 しかしながら、 長期に渡るま たは過度の機械的ストレスへの暴露は、 心室や心房の拡張および心機能異常と いう結果を招く。 TAC処置による圧負荷後の左室リモデリングにおける、 AS 1 ノックアウトのィンビポにおける生理学的影響を評価した。前記評価のために、 心エコー検査法を、 前記外科的処置前、 前記処置の 2週間後、 および前記処置の 4週間後に、 連続的に行った。 その結果を下記表 3に示し、 そのときの経胸壁 M -モ一ド超音波心エコー検查図の一例を図 1 A下段に示す。同図において、 ASK1 ノックアウトマウスは右欄であり、対照 WTマウスは左欄である。 また、 前記処 置 4週間後の左室拡張末期径 (LVIDd)、左室収縮末期径 (LVIDs)および左室内径短 縮率 (FS)を比較した一例を図 1 B下段に示す。 同図および下記表 3に示すとお り、 TAC処置 1週間後、 心臓重量および心臓と体の重量比 （心/体重量比） は、 ASK1ノックアウトおよび対照 WTマウスで、 ともに同程度増加した。 その時点 での筋細胞の切断面領域についても、差異は認められなかった（ASK1ノックァ ゥトが、 443 ± 18 m2であり、 対照 WTが、 445 ± 15〃!^であった）。 また、 前記 処置 4週間後では、対照 WTマウスの左室拡張末期径が、 ASK1ノックアウトマウ スゃ偽処置 （TAC処置をしていない） マウスに比べて著しく増加した。 左室内 径短縮率も、 ASK1ノックアウトマウスゃ偽処置マウスに比べて対照 WTマゥス において著しく減少した。 TAC処置 4週間後の肺重量および肺/体重量比は、 対 照 WTマウスで著しく増加したが、 ASK1ノックアウトマウスでは、 増加しなか つた。 (表 3)
TACによる圧負荷後における生理学的パラメ一夕と， 心エコー検査法による インビポの心臓のサイズと機能の解析。
ASK1ノックァゥト 偽処置 4週後（n=4) TAC1週後（η=5) TAC4週後（n=5) 重 (g) 30.4土 0.4 27· 1±0·8 29.9士 0.6ί
心臓重量 （mg) 146±3 193±13 218±8*
肺重量 (mg) 152±4 n.d. 162±4†
肝臓重量 （mg) 1470±50 n. d. 1310±50
心/体重量比 4.8±0.1 7.1±0.5 7.3±0·2*† 肺/体重量比 5.0±0.1 n.d. 5.4±0.1卞
肝/体重量比 49±1 n.d. 44±1
左室拡張末期径 （mm) 3.63±0.10 3.76±0.09 3.98±0.11† 左室収縮末期径 （匪） 2.09±0.04 2·24±0·07 2.32±0.11† 左室内径短縮率 （％) 42.4±2.1 40.5±1.1 41.9±2.1†
拡張期心室中隔壁厚 （腿） 0·78±0.03 1.00±0.07 1.1±0.02 卞 ， 拡張期左室後壁厚 （mm) 0·78±0.04 0.91土 0.03 0.85±0.03
心拍 (beats/min 554±16 548±24 563±26
対照 WT 偽処置 4週後 (η=3) TAC1週後（n=4) TAC4週後（n=4) 本重 （g) 27.7±0.6 26.2±0.2 28.3±0.9
心臓重量 (mg) 137±10 182±9 253±Π* ί
肺重量 (rag) 143±7 n.d. 317±4
肝臓重量 （mg) 1360±90 n.d. 1350士 140
心/体重量比 5.0±0.3 6·9±0·3 8.9士 0.3* ί 肺/体重量比 5.2±0.2 n.d. 11.1±1.1*
肝/体重量比 49±2 n.d. 47±3
左室拡張末期径 （mm) 3.76±0.21 3.64±0.08 4.91±0.19*ί 左室収縮末期径 （翻） 2.23±0.24 2.22±0.09 4.01±0.23Φ$ 左室内径短縮率 ( ) 40.0±3.5 39.1±1.5 18.5±2.1*ί 拡張期心室中隔壁厚 （mm) 0.73±0.01 0.92±0.04 0.85±0.08* 拡張期左室後壁厚 （mm) 0.67±0.07 0.84±0.05 0.79±0, 02
心拍 (beats/min) 541±26 541±16 548±30
上記表 3中、 ηは、 検体数を表し、 デ一夕は、 平均土標準偏差で示されてい る。 n.d.は、 測定していないことを表し、 *は、 偽手術の同一遺伝子型マウス に対して P〈0.05であることを表し、 †は、 TACの 4週間後の対照 WTマウスに 対して、 P〈0.05であることを表し、 まは、 TACの 1週間後の同一遺伝子型マ ウスに対して、 K0.05であることを表す。
(組織学的検査）
前記冠動脈結紮処置の 4週間後の ASK1ノックァゥ卜マウスおよび対照 WTマウ スの心臓について組織学的検査を行った。 その結果の一例を図 2の中、 上段に JP2004/011124
示す。 同図において、 右欄が ASK1ノックアウトマウスの心臓であり、 左欄が対 照 WTマウスの心臓である。 また、 各欄において、 左側が、 へマトキシリン-ェ ォジン (HE)染色した切片であり、 右側が、 マッソントリクロ一ム染色した切片 であり、 バーは、 5mmを示す。 同図が示すように、 前記処置の 4週間後の対照 WTマウスの心臓は、 ASK1ノックアウトマウスのそれと比較して明らかに大き かった。 また、 同図からは、 対照 WTマウスでは、 虚血性障害から遠隔の領域の 一部が線維性の組織に取って代わられたが、 ASK1ノックアウトマウスでは、前 記遠隔領域は無傷であることが読み取れた。対照 WTマウスの心臓の左室の残存 部分において、 筋肉間および血管周囲に線維形成が認められたが、 ASK1ノック アウトマウスの前記遠隔領域においても、 わずかであるが、 我々は、 血管周囲 の線維形成を観察した。
次に、前記 TAC処理の 4週間後の ASK1ノックァゥトマウスおよび対照 WTマウ スの心臓について組織学的検査を行った。その結果の一例を図 2の下段に示す。 同図において、 右欄が ASK1ノックアウトマウスの心臓であり、 左欄が対照 WT マウスの心臓である。 また、 各欄において、 左側が、 へマトキシリン-ェォジン (HE)染色した切片であり、右側が、マッソントリクローム染色した切片である。 同図が示すように、 前記処置の 4週間後の対照 WTマウスの心臓の拡張は明らか だったが、 ASK1ノックアウトマウスにおいては、 心室や心房の拡張が起こらな かった。 また、 前記両マウスにおいては、 血管周囲の線維形成と同様に、 筋肉 間の線維形成が、 分散して観察され、 その線維形成の程度は、 前記両マウスの 心臓で同様であった。
(機械的ストレス）
心筋リモデリングの主要な刺激は、 機械的な過負荷であるため、 冠動脈結紮 または TAC処置後における対照 WTおよび ASK1ノックアウトマウスの心臓にか かる機械的ストレスの程度を評価した。 心筋梗塞モデルでは、残存する心筋に課せられる機械的負荷は、二重積 (double product) として推定される。 L V収縮圧も心拍も、 冠動脈結紮後 1週間では、 ASK1ノックァゥトマウスと対照 WTマウスとで有意な差は認められなかった (収 縮期圧は、 ASK1ノックアウトが、 110.2±6.0 mmHgであって、対照 WTが、 108.2±2.8 mmHgであった。 心拍は、 ASK1ノックアウトが、 582±10/minであって、 対照 WTが、 559±24/minであった）。 さらに、 梗塞のサイズは、 冠動脈結紮直後に調 ベた両方のマウスにおいて同様であり、 ASK1ノックアウトマウスの平均は、 51.3±5.7%であり、 対照 WTの平均が、 49.1±4.9%であった。 したがって、 ASK1 除去による表現型は、 側副血行の発達と関係する可能性が低いことが示唆され た。
TAC処置により産生される機械的ストレスは、 TACから 7日後、 狭窄を横切 る圧力の傾斜をインビポで測定することで推定できる。 その測定の結果、 TAC 処置は 2つの類動脈間の圧力傾斜を著しく増加させたが、 ASK1ノックアウトマ ウスと対照 WTマウスとで有意な差は認められなかった (ASK1ノックァゥトが、 55.5±5.7 mmHgであり、 対照 WTが、 57.3±4.6 mmHgであった)。
(左室リモデリングにおけるアポト一シス）
左室リモデリング中に心筋細胞で増加するアポトーシスに対する ASK1除去の 効果を評価した。 冠動脈結紮または TAC処置後にアポトーシスが誘導された心 筋細胞の数えるために、 TUNELアツセィを利用した。 ASK1ノックアウトマウ スと対照 WTマウスとで比較した結果の一例を図 3に示す。 図 3 Aのグラフは、 冠動脈結紮処置から 1週または 4週後の境界領域および遠隔領域 （左 2パネル)、 ならびに TAC処理から 1週または 4週後の心筋 (右パネル)における TUNEL陽性細 胞の相対数の一例を示す。 同図に示すように、 冠動脈結紮処置では、 1週間およ び 4週間後で、梗塞の境界領域においても、 虚血障害の領域から遠隔の心筋にお いても、 TUNEL陽性細胞の数、 すなわち、 アポトーシス細胞の数は、 ASK1ノ ックアウトマウスにおいてよりも、対照 WTマウスにおいて著しく増加した。 ま た、 TAC処置後の TUNEL陽性細胞は、 左室壁に偏在しており、 その数は、 ASK1 ノックアウトマウスよりも、 対照 WTマウスにおいて著しく増加した。
前記 TUNEL陽性細胞が心筋細胞であることは、 三重染色により確認した。 そ の結果の一例を図 3 Bに示す。 同図に示すとおり、 TUNEL染色は緑色に見え、 抗 a-サルコメァ抗体およびヨウ化プロビジゥム染色は赤色に見える。 したがつ て両図を重ねた場合に黄色に見えれば心筋細胞であると確認できる。
(ASK1タンパク質の活性化によるアポトーシスの誘導）
ASK1タンパク質が、心筋細胞においてアポ卜一シスを誘導できることを確認 するために、 新生児の心筋細胞を分離し、 恒常的に活性な変異型の ASK1タンパ ク質 (AdASK(AN))または βガラクトシダーゼ (AdLacZ)を発現するアデノウィルス を、 細胞あたりのプラーク形成単位が 1 0 0の感染多重度で感染させた。 その 結果を図 4に示す。 図 4 Aは、 前記ウィルスを感染させた 0日目の生存数に対 するパーセントで表した細胞生存率のグラフである。 図 4 Aに示すとおり、 活 性変異型の ASK1タンパク質の過剰発現は、 生存細胞数の減少を引き起こした。 一方、 βガラクトシダーゼを発現させても、生存細胞数の減少は見られなかった。 図 4 Βは、 前記ウィルス感染 4 8時間後の細胞を Hoechst染色した顕微鏡写真で ある。 図 4 Bに示すとおり、 活性変異型の ASK1タンパク質の過剰発現させて Hoechst33258染色すると、 様々な程度の凝縮核クロマチンや、 断片化した核が 観察された。 一方、 βガラクトシダ一ゼを発現させても、 そのようなことは観察 されなかった。 また、前記感染多重度を 1 0にして前記変異型 ASK1タンパク質 を発現させると、 心筋細胞は肥大した。 (¾02が誘導するアポトーシスにおける ASK1の必要性）
次に、 Η202が誘導するアポトーシスにおける ASK1の必要性を、 ASK1ノック ァゥトマウス (ASK _)および対照 WTマウスの新生児の心筋細胞を用いて確かめ た。 前記心筋細胞を、 様々な濃度の ¾02とともに 24時間培養し、 MMTアツセィ により生存細胞数を測定し、前記心筋細胞の生存率 (％)を求めた。その結果を図 4 Cに示す。 図 4 Cに示すとおり、 ¾02に対する耐性は、 ASK の心筋細胞のほ うが、 WTの心筋細胞よりも優れていた。 また、 前記心筋細胞を ΙΟ^Μの ¾02で 24時間処理した後、 Hoechst染色して顕微鏡観察した写真を図 4 Dに示す。 図 4 Dに示すとおり、 観察された核の形態から、 H202によりアポトーシスが誘導さ れたことが確認された。 (冠動脈結紮処置および TAC処置後における ASK1夕ンパク質の活性化） リモデリング中における ASK1夕ンパク質の活性を確認した。冠動脈結紮処置 後または TAC処置後の心臓について、 ASK1タンパク質の活性を測定した。 その 結果を図 5 Aに示す。 図 5 Aは、 His-MKK6を基質に使用した免疫複合体アツセ ィの測定結果であって、 上段のパネルが、 冠動脈結紮処置の 2日および 1週間 後の ASK1タンパク質の活性化を示し、 下段のパネルが、 TAC処置の 2日および 1週間後の ASK1タンパク質の活性化を示す。前記上段パネルでは、 心筋ホモジ ネートは、 処置および未処置の ASK1ノックアウトマウス、 ならびに、 未処置、 偽処置および処置の 2日および 1週間後の WTマウスより抽出した心筋ホモジネ ートを使用した。 前記下段パネルでは、 心筋ホモジネートは、 処置の 2日およ び 1週間後の ASK1ノックアウトマウス、 ならびに、偽処置および処置の 2日お よび 1週間後の WTマウスより抽出した心筋ホモジネ一トを使用した。図 5 Aに 示すとおり、 WTマウスの心臓において、 冠動脈結紮処置後および TAC処置後に ASK1タンパク質が著しく活性化されることが確認された。しかしながら、 ASK1 ノックァゥトマウスでは、 有意な ASK1の活性化が認められなかつた。
また、 リモデリング中、 ASK1タンパク質の下流に存在する JNKや p38の活性 を評価するため、 各々のリン酸化状態をウェスタンブロット法を用いて測定し た。その結果を図 5 Bに示す。 図 5 Bは、冠動脈結紮処置後（左側） または TAC 処置後（右側）の、 ASK1ノックァゥトマウスおよび WTマウスの心臓細胞の JNK および p38に対するのウエスタンブロットの結果の一例を示す図である。同図に 示すとおり、 WTマウスの心臓において、冠動脈結紮処置後および TAC処置後に、 JNKや p38の活性ィ匕が認められた。一方、 ASK1ノックァゥトマウスの心臓では、 p38の活性化は、 WTマウスと同程度に観察されたが、 JNK活性化は、 有意に抑 制されていた。 従って、 リモデリングにおいては、 皿が、 ASK1の下流因子と して重要な働きを果たしていることが示唆された。 産業上の利用可能性
慢性心不全は、 先進国では主要な死亡原因の一つである。 また、 急性冠動脈 疾患が、 C C U (冠動脈疾患集中治療） や冠動脈形成術の発展によって克服さ れてきていることが、 心筋梗塞後の心不全発症を増加させている。 さらに、 心 不全患者は、 高血圧症群にも多い。 本発明は、 例えば、 このように非常に大き な需要が見込まれる心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬の 分野や心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法の分野で有用である。

Claims

請求 の 範囲
1. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、 心筋細 胞における ASK1タンパク質の機能発現を阻害する化合物を有効成分とする医薬。
2. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、 ASK1夕 ンパク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制する化合物を有効成分とす る医薬。
3. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、 Daxx、 TRAF2、カルモジュリン依存性リン酸化酵素 II、 M K3, MKK4、 MKK6、 M K7、 JNKおよび p38 MAPKからなる群から選択される少なくとも 1つを阻害する化合 物を有効成分とする医薬。
4. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬であって、 心筋細 胞における ASK1タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物、心筋細胞におけ る ASKl mRNAの翻訳を阻害する化合物、 および心筋細胞における ASK1遺伝子 の転写を阻害する化合物からなる群から選択される少なくとも一種類以上の化 合物を有効成分とする医薬。
5. 前記心筋細胞における ASK1タンパク質のキナーゼ活性を阻害する化合物が、 ASK1タンパク質のドミナントネガティブ変異体、 抗 ASK1抗体、 チォレドキシ ンからなる群から選択されるの少なくとも一種類である請求項 4に記載の医薬。
6. 前記心筋細胞における ASKl mRNAの翻訳を阻害する化合物が、
ス DNA、 アンチセンス RNA、 および RNA干渉のための RNAから選択される少な くとも一種類である請求項 4に記載の医薬。
7. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング 方法であって、 ASK1タンパク質の機能発現の阻害を指標として、薬剤候補化合 物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択す る工程を含むスクリーニング方法。
8. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリ一ニング 方法であって、 ASK1タンパク質が誘導するアポトーシスの抑制を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬 成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
9. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリ一ニング 方法であって、 ASK1タンパク質のキナーゼ活性に対する活性阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬 成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
10. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング 方法であって、 ASK1タンパク質の自己リン酸化の阻害を指標として、薬剤候補 化合物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選 択する工程を含むスクリーニング方法。
11. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング 方法であって、 ASK1遺伝子の転写翻訳の阻害を指標として、薬剤候補化合物か ら、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成分を選択するェ 程を含むスクリーニング方法。
12. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング 方法であって、 ASK1タンパク質を活性化する因子の活性阻害を指標として、薬 剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬成 分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
13. 前記 ASK1タンパク質を活性化する因子が、 Daxx、 TRAF2およびカルモジ ュリン依存性リン酸化酵素 IIからなる群から選択される少なくとも 1つである請 求項 1 2に記載のスクリ一ニング方法。
14. 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬のスクリーニング 方法であって、 ASK1タンパク質により活性化される因子の阻害を指標として、 薬剤候補化合物から、 心不全の予防および治療の少なくとも一方のための医薬 成分を選択する工程を含むスクリーニング方法。
15. 前記 ASK1夕ンパク質により活性化される因子が、 MKK3、 MKK4、 MKK6、 MKK7、 JNKおよび p38 MAPKからなる群から選択される少なくとも 1つである 請求項 1 4に記載のスクリ一二ング方法。
16. 心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、 心筋細胞にお ける ASK1タンパク質の機能発現を阻害することを含む予防および治療の少なく とも一方の方法。
17. 心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、 ASK1タンパ ク質が誘導する心筋細胞のアポトーシスを抑制することを含む予防および治療 の少なくとも一方の方法。
18. 心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、 心筋細胞にお ける ASK1タンパク質のキナーゼ活性、 心筋細胞における ASK1タンパク質の自 己リン酸化、および心筋細胞における ASK1遺伝子の転写翻訳の少なくとも一つ を阻害することを含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
19. 心不全の予防および治療の少なくとも一方の方法であって、 請求項 1から 6のいずれかに記載の予防および治療の少なくとも一方のための医薬を、 薬学 上許容される有効量投与すること含む予防および治療の少なくとも一方の方法。
20. 心不全の診断方法であって、 心筋細胞における ASK1タンパク質のキナ一 ゼ活性または自己リン酸化能を測定する工程を含む診断方法。
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