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WO2005001108A2 - Method and device for characterising a culture solution - Google Patents

Method and device for characterising a culture solution Download PDF

Info

Publication number
WO2005001108A2
WO2005001108A2 PCT/EP2004/007034 EP2004007034W WO2005001108A2 WO 2005001108 A2 WO2005001108 A2 WO 2005001108A2 EP 2004007034 W EP2004007034 W EP 2004007034W WO 2005001108 A2 WO2005001108 A2 WO 2005001108A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
concentration
culture
sample
organisms
culture broth
Prior art date
Application number
PCT/EP2004/007034
Other languages
German (de)
French (fr)
Other versions
WO2005001108A3 (en
Inventor
Frank Theodor Gudermann
Marc STÜRZ
Original Assignee
Innovatis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Innovatis Ag filed Critical Innovatis Ag
Publication of WO2005001108A2 publication Critical patent/WO2005001108A2/en
Publication of WO2005001108A3 publication Critical patent/WO2005001108A3/en

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12MAPPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for determining specific product formation or substrate consumption rates of cells in a culture fluid.
  • the basis for the determination of the specific formation and consumption rates is the measurement of the parameters of living cell number, cell viability and the product and substrate concentration in a cell culture sample, in which a microscopic image of the cells and an image evaluation of this image in combination with the determination the product and substrate concentration, in particular by methods of flow injection analysis, high performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis or surface plasmon resonance (SPR), or immunochemical or calorimetric methods, the culture fluid is analyzed, the analysis of the parameters of the same sample being carried out simultaneously and automatically according to the invention becomes.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • SPR surface plasmon resonance
  • Culture broths that contain living organisms are of central importance in biotechnology.
  • the cultured organisms can themselves be the desired product of the cultivation or can be used to produce specific, desired molecules as metabolic products or to break down certain, for example toxic, molecules in their metabolism.
  • Cultures of eukaryotic and prokaryotic cells are increasingly used to produce biomolecules for different purposes.
  • One example is the production of antibodies using cultures of human or animal cells for diagnostic or therapeutic purposes in medicine.
  • cell concentration the number of organisms per unit volume of the culture broth
  • viability the proportion of living organisms in the cell concentration
  • biotechnological processes are the specific and volumetric consumption and product formation rates of the organisms. These are defined as the consumption or production of substances by an organism in the culture broth per unit of time (specific) or per unit of time and volume (volumetric). They are used to characterize the actual metabolic activity of the organism. These parameters are to be determined in order to control and regulate cultivation as precisely as possible, as well as to determine termination criteria or harvest times at short intervals. If you are able to measure the productivity of a culture container or change it in short time intervals with little effort in terms of personnel and costs, the yield of the production process can be increased. The profitability of biotechnological processes is increased.
  • the invention relates to a method for automatically determining the specific consumption and production rates and an apparatus for performing the method.
  • the main claim of this patent specification aims at a method and a device for the determination of specific product and consumption rates of organisms in one Culture broth. Since these are generally eukaryotic or prokaryotic cells, only the term “cell” is used below.
  • Specific productivity is defined as the amount of product that a cell produces per unit of time and delivers to the surrounding cell culture medium. Knowing the parameter of the concentration of living cells is a prerequisite for determining specific productivity and other consumption and education rates, since only living cells are productive.
  • the concentration of living cells is defined as the number of living cells per unit volume.
  • the cell concentration is defined as the number of living and dead cells per unit volume. Viability is the percentage of living cells in the cell concentration.
  • the concentration of the product in question (usually a biomolecule) must be known in order to determine specific education or consumption rates.
  • the currently common methods for determining cell concentrations are shown below, followed by methods for measuring the product concentration.
  • Manual cell counting is the established method in industry and research for determining cell concentration and viability in samples from cell culture processes. This method has been used since the beginning of biotechnology to determine cell concentration and viability (Tennant JR (1964): Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability .; Transplantation 2: 685-694).
  • the dye trypan blue or another suitable dye is added to a cell suspension (eg methylene blue, propidium iodide, eosin). Living cells are impervious to the dye while it can penetrate dead cells. Dead cells are therefore colored by the dye. Based on the different stains, living cells can be distinguished from dead cells and counted using a counting chamber under a light microscope.
  • Automated systems (Cedex, Vi-CELL, NucleoCounter) have been on the market for a short time that automatically carry out the manual cell counting process.
  • the steps of the manual method (sample staining, transferring the colored sample into a measuring chamber, counting the colored and unstained objects in the microscopic image) have been adopted and are carried out automatically by the devices. Errors in sample handling and the subjective differentiation of living and dead cells are thus eliminated.
  • the results of the automatically working devices are more precise and user-independent compared to the manual method.
  • sample handling is limited to the provision of a sample that is fed to the device in a sample vessel.
  • This sample is automatically mixed with Trypan Blue or another suitable dye and transferred to a measuring chamber or cuvette.
  • images of the colored cell suspension are generated, which are recorded by a CCD camera.
  • Measurement results are the total concentration of cells that Concentration of living cells, the concentration of dead cells and the viability of the culture. Secondary parameters such as cell diameter, cell geometry or the number and size of cell aggregates are made available. If fluorescent dyes are used to color the cells or their cell nuclei, the resulting image can also be projected directly onto a CCD camera without a magnifying lens and then automatically evaluated by computer-aided image processing software.
  • Flow cytometry (Moore A, Donahue CJ, Hooley J, Stocks DL (1995): Apoptosis in CHO cell batch cultures: Examination by flow cytometry .; Cytotechnology 17: 1-11) can in principle be used both for cell counting and for determining the viability of the cells , as well as for the quantification of apoptosis rates (Becton Dickenson, Guava PCA system).
  • the operation of these devices and the necessary interpretation of the data received place high demands on the user of these devices. Staining with fluorescent dyes causes comparatively high running costs.
  • the method of laser diffractometry uses the property of laser light radiated into cells to scatter an angle that is inversely proportional to the size of the cells. The evaluation of the scattered light enables the cell concentration and the size distribution of the cells to be determined. Differentiation of living and dead cells is not possible.
  • Protein concentrations are very often determined by the so-called ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test (Lütkemeyer D, Büntemeyer H (1990): Kinetic ELISA measurements; Tecnorama News 1: 2-3).
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • This is an immunological test modified for the determination of solid phase bound antigens. The method is based on interactions between the specific antibody and the antigen, which are based on the key / lock principle.
  • Capillary electrophoresis Electrophoresis is the separation of charged molecules in an electrical field. Capillary electrophoresis is an electrophoretic separation process in which the separation takes place in capillaries filled with buffer. By applying high voltage (2 - 35 kV) charged molecules are separated due to different charge numbers and mobility (Jorgenson JW, Lukacs KD (1981): Zone Electrophoresis in Open-Tubular Glass Capillaries. Anal. Chem. 53: 1298-1302 Jorgenson JW , Lukacs KD (1983): Capillary Zone Electrophoresis. Science 222: 266-272).
  • Nephelometry (Owen WE, Roberts WL (2003): Performance characteristics of four immunonephelometric assays for the quantitative determination of IgA and IgM in cerebrospinal fluid. Am J Clin Pathol. 119: 689-93.) Is a quantitative analytical method. The sample to be measured is illuminated with monochromatic laser light and the scattered light is analyzed. The concentration of biomolecules can be determined by evaluating the scattered light.
  • SPR technology uses surface plasmon resonance (SPR). If an analyte to be measured binds to an immobilized receptor, the refractive index changes in the vicinity of the sensor surface on which the receptor was immobilized. (Cullen DC, Brown RG, Löwe CR (1987-88): Detection of immuno-complex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings. Biosensors. 3: 211-25.). The change in the refractive index of the sensor surface is directly proportional to the concentration of the substance binding to the receptor. Both complex formation and dissociation can be tracked "on-line" and analyzed within a very short time. The measurement process and the data evaluation require only a small amount of time compared to conventional methods and can be automated. After the analysis of the first cycle, the sensor surface is regenerated. Then the same sensor can be used again for the measurement.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the specific productivity of cells in a cell culture is one of the most important parameters for evaluating and controlling cultivation processes. It is defined as the amount of product that a cell releases into the culture medium per unit of time. Different process controls, such as batch processes, chemostat or perfusion operation, lead to different mathematical relationships for the calculation of specific productivity.
  • the ideal would be a method and a device that is capable of determining both the living cell and the product concentration quickly and, if possible, on the basis of one and to determine the same sample and from this to determine the specific productivity of the cells.
  • the invention provides a method and an apparatus for carrying out the method with which specific product formation and substrate consumption rates of organisms of a culture sample, e.g. from a bioreactor can be measured precisely and promptly.
  • the process is automated, easy to carry out and can therefore be quickly integrated into routine operations without having to train experts.
  • the method according to the invention makes it possible to automatically combine the process of determining the cell concentration and the process of determining the product or substrate concentration in order to improve the evaluation, control and regulation of the cultivation process by means of direct statements about the production and consumption rates.
  • the device according to the invention makes it possible to transfer samples from the culture to the sensors in order to examine them for the selected features.
  • the specific consumption and production rates of one or more organisms in a culture broth are determined by a simultaneous, automated cell concentration and product or substrate concentration determination.
  • a computer-aided digital image processing device is used in Used in conjunction with a standardized staining method.
  • the product or substrate analysis determination is carried out optionally via an automated flow injection analysis, capillary electrophoresis, high performance liquid chromatography or surface plasmon resonance device, or immunochemical or calorimetric methods.
  • this type of parameter determination for cell concentration and product or substrate concentration is therefore user-independent, since manual cell concentration determination (e.g. thoma chamber) and product concentration determination (e.g. ELISA test) are no longer necessary.
  • the measurement results are more precise because the parameters are determined on one and the same sample, thus eliminating scatter in the sample composition. Due to the automation, the measuring process is faster and more reproducible and less prone to errors, since the sometimes complex sample preparation (e.g. for electrophoresis) is not required by humans.
  • the method enables continuous monitoring of cultivation processes, since measurements can be carried out without problems in short time intervals. This continuous monitoring is in turn a prerequisite for continuous control or regulation to optimize the process.
  • the device according to the invention enables a culture sample to be fed to the individual analysis modules.
  • the sample of a culture broth can either be drawn manually from a culture container or several culture containers and fed manually to the analysis device (off-line operation), or fed to the analysis device via an automatic sample feeder (online operation).
  • This automatic sample supply can be designed such that one or more bioreactors are coupled to the analysis device, for example by means of a tube or hose system and corresponding valves, or the samples are supplied by a robot.
  • cell-free culture broth is automatically or continuously removed from the bioreactor, for example by using a sampling probe, and the analysis device for determining the Concentration of biomolecules fed.
  • the cell density and viability are determined either by supplying manually or automatically removed samples, for example using the method of automated image analysis, flow cytometry or fluorescence-based methods, measuring the electrical resistance or laser diffractometry.
  • methods are used which allow cell density to be measured directly in the culture process (on-line). For example, measuring the capacitance using the radio frequency method enables the density of living cells to be determined.
  • a continuous analysis of these parameters can also be carried out with an in-situ microscope, with which cell density and optionally also viability can be measured.
  • the method according to the invention can be expanded by coupling and / or exchanging it for other analysis methods in order to determine even more process parameters (e.g. nutrient content or partial pressures of gases) without using other measurement methods.
  • process parameters e.g. nutrient content or partial pressures of gases
  • cultivation processes can be further optimized.
  • the data obtained with the method can be transferred as analog signals or digitally to the control systems of the bioreactors for control and regulation.
  • the extensive data material can be used to develop new, improved models of the processes in the cultivation container, which in turn can be used for further optimization through simulation.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of a first embodiment of the device according to the invention.
  • FIG. 2 shows a second embodiment with a modified sample supply.
  • 1 shows a distributor 1 in which the sample of a culture broth is divided into sample parts.
  • Sample part I is led through the sample line 2 into the sample chamber with sample preparation 4 and prepared with suitable reagents via the reagent supply 3 for the cell concentration and viability determination.
  • the image generated by the imaging 6 is present as a signal on the control and evaluation computer 9.
  • the control and evaluation computer 9 supplies the values for the cell concentration and viability.
  • the sample part I is then passed through the waste line 8 into the waste 7 and the sample chamber 4 with sample preparation 4 is prepared for a new sample.
  • the sample part II from the distributor 1 is led through the sample line 10 into the sample chamber 4 with sample preparation, sensor chip and chip preparation 12 and prepared with suitable reagents via the reagent supply 11 for the determination of the product concentration.
  • the product concentration in sample part II is determined with the SPR detector 13.
  • the signal generated is then applied to the control and evaluation computer 9, which determines the specific product and consumption rates from the cell concentration, viability and analyte concentration.
  • the sample part II is then passed through the waste line 8 into the waste 7 and the sample chamber 4 with sample preparation, sensor chip and chip preparation 12 is prepared for a new sample.
  • the control and evaluation computer 9 controls and regulates the course of the measurements via the data line 5 and carries out the data processing, the data transfer and the data backup.
  • FIG. 2 shows a container with a culture broth 15.
  • An in-situ microscope probe 17 is inserted into the container 16.
  • the probe delivers the images from the culture broth.
  • the microscope probe 3 can also be replaced by an on-line probe for measuring the electrical capacity of the culture fluid, with which the concentration of living cells in the culture fluid can be determined.
  • the sample feed 18 into a sample chamber for the cell concentration and viability determination is thus omitted.

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Abstract

The invention relates to a method and a device for determining specific product formation rates and/or substrate consumption rates of cells in a culture solution. Determination of the specific formation and/or consumption rates is based on measurement of the parameters of the number of living cells, cell viability and the product and substrate concentration in a cell culture sample whereby the culture solution is analysed by microscopic imaging of the cells and by evaluating said imaging and by determining the product and substrate concentration, more particularly, by means of SPR (surface plasmon resonance). Analysis of the parameters of said sample is carried out simultaneously, in an automatic manner.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Charakterisierung einer KulturflüssigkeitMethod and device for characterizing a culture fluid
Beschreibungdescription
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung spezifischer Produktbildungs- bzw. Substratverbrauchsraten von Zellen in einer Kulturflüssigkeit. Basis für die Bestimmung der spezifischen Bildungs- bzw. Verbrauchsraten ist die Messung der Parameter Lebendzellzahl, Zell-Viabilität und der Produkt- und Substratkonzentration in einer Zellkulturprobe, bei der durch eine mikroskopische Abbildung der Zellen und durch eine Bildauswertung dieser Abbildung in Kombination mit der Bestimmung der Produktund Substratkonzentration insbesondere durch Verfahren der Fließinjektionsanalytik, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Kapillarelektrophorese oder Surface Plasmon Resonance (SPR) -, bzw. immunochemische oder kalorimetrische Methoden die Kulturflüssigkeit analysiert wird, wobei die Analyse der Parameter derselben Probe erfindungsgemäß gleichzeitig und automatisch durchgeführt wird.The invention relates to a method and a device for determining specific product formation or substrate consumption rates of cells in a culture fluid. The basis for the determination of the specific formation and consumption rates is the measurement of the parameters of living cell number, cell viability and the product and substrate concentration in a cell culture sample, in which a microscopic image of the cells and an image evaluation of this image in combination with the determination the product and substrate concentration, in particular by methods of flow injection analysis, high performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis or surface plasmon resonance (SPR), or immunochemical or calorimetric methods, the culture fluid is analyzed, the analysis of the parameters of the same sample being carried out simultaneously and automatically according to the invention becomes.
Anwendungsgebietfield of use
Kulturbrühen, die lebende Organismen enthalten, sind in der Biotechnologie von zentraler Bedeutung. Die kultivierten Organismen können selbst das gewünschte Produkt der Kultivierung sein oder aber dazu eingesetzt werden, um spezifische, gewünschte Moleküle als Stoffwechselprodukte zu produzieren oder um bestimmte, zum Beispiel toxische Moleküle, in ihrem Stoffwechsel abzubauen. Es werden Kulturen eukaryotischer und prokaryotischer Zellen in zunehmendem Maße herangezogen, um Biomoleküle für unterschiedliche Zwecke zu produzieren. Ein Beispiel ist die Produktion von Antikörpern mit Hilfe von Kulturen humaner oder tierischer Zellen für diagnostische oder therapeutische Zwecke in der Medizin.Culture broths that contain living organisms are of central importance in biotechnology. The cultured organisms can themselves be the desired product of the cultivation or can be used to produce specific, desired molecules as metabolic products or to break down certain, for example toxic, molecules in their metabolism. Cultures of eukaryotic and prokaryotic cells are increasingly used to produce biomolecules for different purposes. One example is the production of antibodies using cultures of human or animal cells for diagnostic or therapeutic purposes in medicine.
Damit die Organismen sich in der gewünschten Weise vermehren bzw. sich in der gewünschten Weise vermehren und die gewünschten Stoffwechselprozesse optimal ablaufen, d. h. eine optimale Produktivität erzielt wird, müssen sie möglichst optimale und auf den jeweiligen Organismus angepasste Bedingungen vorfinden. Um diese Bedingungen in den jeweiligen Kulturbehältern sicherstellen zu können und steuernd und regelnd in den Verlauf einer Kultivierung eingreifen zu können, ist die ständige Messung verschiedener Parameter über die Dauer einer Kultivierung notwendig. Insbesondere Parameter, welche die Population der Organismen im Kulturmedium betreffen, als auch Parameter, die sowohl die Konzentration von Nährstoffen und anderen Ausgangsstoffen betreffen, als auch die Konzentration von Stoffwechselprodukten im Kulturmedium.In order for the organisms to reproduce in the desired manner or to multiply in the desired manner and for the desired metabolic processes to take place optimally, ie for optimum productivity to be achieved, they must find optimal conditions that are adapted to the respective organism. In order to be able to ensure these conditions in the respective culture containers and to be able to control and regulate in the course of a cultivation, is the constant measurement various parameters over the duration of a cultivation are necessary. In particular, parameters that affect the population of organisms in the culture medium, as well as parameters that affect both the concentration of nutrients and other starting materials, and the concentration of metabolites in the culture medium.
Die wichtigsten Parameter, welche die Organismenpopulation betreffen sind die Zahl der Organismen pro Volumeneinheit der Kulturbrühe (nachfolgend Zellkonzentration genannt) und der Anteil der lebenden Organismen an der Zellkonzentration (nachfolgend Viabilität genannt). Hinzu kommen die Konzentrationen der Substrate und Produkte in der Kulturbrühe.The most important parameters that affect the organism population are the number of organisms per unit volume of the culture broth (hereinafter called cell concentration) and the proportion of living organisms in the cell concentration (hereinafter called viability). Added to this are the concentrations of the substrates and products in the culture broth.
Die zentralen Parameter zur Beurteilung des Erfolgs einer Kultivierung und die GrundlageThe central parameters for assessing the success of a cultivation and the basis
, zur Steuerung und Regelung biotechnologischer Prozesse sind die spezifischen und volumetrischen Verbrauchs- und Produktbildungsraten der Organismen. Diese sind definiert als Verbrauch bzw. Produktion von Stoffen durch einen Organismus in der Kulturbrühe pro Zeiteinheit (spezifisch), bzw. pro Zeit- und Volumeneinheit (volumetrisch). Mit ihnen wird die eigentliche Stoffwechselaktivität der Organismen charakterisiert. Diese Parameter sind für eine möglichst präzise Steuerung und Regelung einer Kultivierung, sowie zur Festlegung von Abbruchkriterien oder Erntezeitpunkten in kurzen Zeitabständen zu bestimmen. Ist man in der Lage die Produktiviät eines Kulturbehälters oder die Änderung derselben in kurzen Zeitabständen mit wenig Personal- und Kostenaufwand zu messen, kann die Ausbeute des Produktionsprozesses gesteigert werden. Die Rentabilität biotechnologischer Prozesse wird erhöht. Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur automatischen Bestimmung der spezifischen Verbrauchs- und Produktionsraten und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens., to control and regulate biotechnological processes are the specific and volumetric consumption and product formation rates of the organisms. These are defined as the consumption or production of substances by an organism in the culture broth per unit of time (specific) or per unit of time and volume (volumetric). They are used to characterize the actual metabolic activity of the organism. These parameters are to be determined in order to control and regulate cultivation as precisely as possible, as well as to determine termination criteria or harvest times at short intervals. If you are able to measure the productivity of a culture container or change it in short time intervals with little effort in terms of personnel and costs, the yield of the production process can be increased. The profitability of biotechnological processes is increased. The invention relates to a method for automatically determining the specific consumption and production rates and an apparatus for performing the method.
Stand der Technik und Nachteile des Standes der TechnikState of the art and disadvantages of the prior art
Der Hauptanspruch dieser Patentschrift zielt auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von spezifischen Produkt- und Verbrauchsraten von Organismen in einer Kulturbrühe. Da es sich dabei in der Regel um eukaryote oder prokaryote Zellen handelt, wird im Folgenden nur der Begriff „Zelle" verwendet.The main claim of this patent specification aims at a method and a device for the determination of specific product and consumption rates of organisms in one Culture broth. Since these are generally eukaryotic or prokaryotic cells, only the term “cell” is used below.
Die spezifische Produktivität ist definiert als die Menge an Produkt, die eine Zelle pro Zeiteinheit herstellt und an das sie umgebende Zellkulturmedium abgibt. Voraussetzung für die Bestimmung der spezifischen Produktivität sowie anderer Verbrauchs- und Bildungsraten ist, da nur lebende Zellen produktiv sind, die Kenntnis des Parameters der Konzentration lebender Zellen. Die Konzentration lebender Zellen ist definiert als die Anzahl lebender Zellen pro Volumeneinheit. Die Zellkonzentration ist definiert als die Anzahl lebender und toter Zellen pro Volumeneinheit. Als Viabilität bezeichnet man den prozentualen Anteil von lebenden Zellen an der Zellkonzentration.Specific productivity is defined as the amount of product that a cell produces per unit of time and delivers to the surrounding cell culture medium. Knowing the parameter of the concentration of living cells is a prerequisite for determining specific productivity and other consumption and education rates, since only living cells are productive. The concentration of living cells is defined as the number of living cells per unit volume. The cell concentration is defined as the number of living and dead cells per unit volume. Viability is the percentage of living cells in the cell concentration.
Zur Bestimmung spezifischer Bildungs- oder Verbrauchsraten muss neben der Konzentration lebender Zellen auch die Konzentration des betreffenden Produkts (in der Regel ein Biomolekül) bekannt sein. Im folgenden werden die zur Zeit gängigen Methoden zur Bestimmung von Zellkonzentrationen, gefolgt von Methoden zur Messung der Produktkonzentration dargestellt.In addition to the concentration of living cells, the concentration of the product in question (usually a biomolecule) must be known in order to determine specific education or consumption rates. The currently common methods for determining cell concentrations are shown below, followed by methods for measuring the product concentration.
Methoden zur Bestimmung der Konzentration eukaryoter oder prokaryoter Zellen in einer KulturbrüheMethods for determining the concentration of eukaryotic or prokaryotic cells in a culture broth
Zur Bestimmung von Zellkonzentrationen in Kulturflüssigkeiten werden gegenwärtig verschiedene Methoden eingesetzt. Diese werden im Folgenden kurz beschrieben:Various methods are currently used to determine cell concentrations in culture fluids. These are briefly described below:
1. Manuelle Bestimmung der Zellkonzentration1. Manual determination of the cell concentration
Das etablierte Verfahren in Industrie und Forschung zur Bestimmung der Zellkonzentration und Viabilität in Proben aus Zellkulturprozessen ist die manuellen Zellzählung. Diese Methode wird bereits seit den Anfängen der Biotechnologie zur Bestimmung der Zellkonzentration und Viabilität herangezogen (Tennant JR (1964): Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability.; Transplantation 2: 685-694). Bei der manuellen Zellzählung wird einer Zellsuspension der Farbstoff Trypan Blau oder ein anderer, geeigneter Farbstoff zugesetzt (z.B. Methylenblau, Propidiumjodid, Eosin). Lebende Zellen sind für den Farbstoff undurchlässig, während er in tote Zellen eindringen kann. Tote Zellen werden daher durch den Farbstoff eingefärbt. Anhand der unterschiedlichen Färbungen lassen sich lebende von toten Zellen unterscheiden und mit Hilfe einer Zählkammer unter einem Lichtmikroskop auszählen.Manual cell counting is the established method in industry and research for determining cell concentration and viability in samples from cell culture processes. This method has been used since the beginning of biotechnology to determine cell concentration and viability (Tennant JR (1964): Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability .; Transplantation 2: 685-694). In manual cell counting, the dye trypan blue or another suitable dye is added to a cell suspension (eg methylene blue, propidium iodide, eosin). Living cells are impervious to the dye while it can penetrate dead cells. Dead cells are therefore colored by the dye. Based on the different stains, living cells can be distinguished from dead cells and counted using a counting chamber under a light microscope.
Die Nachteile dieser Methode bestehen darin, dass die mikroskopische Auswertung der Zellfärbung sehr arbeitsintensiv, langwierig und ermüdend ist. Zum anderen ist sie stark benutzerabhängig, da die Differenzierung zwischen lebenden und toten Zellen subjektiven Schwankungen unterliegt (Farbempfinden, Ermüdungsgrad, Präzision der Zählung).The disadvantages of this method are that the microscopic evaluation of the cell staining is very labor-intensive, lengthy and tiring. On the other hand, it is strongly user-dependent, since the differentiation between living and dead cells is subject to subjective fluctuations (color sensation, degree of fatigue, precision of the count).
2. Automatisierte optische Bildanalyseverfahren zur Bestimmung der Zellkonzentration2. Automated optical image analysis methods for determining the cell concentration
Seit kurzer Zeit sind automatisierte Systeme am Markt (Cedex, Vi-CELL, NucleoCounter), die das manuelle Verfahren der Zellzählung automatisch ausführen. Die Arbeitsschritte der manuellen Methode (Probenfärbung, Überführen der gefärbten Probe in eine Messkammer, Zählen der gefärbten und ungefärbten Objekte im mikroskopischen Bild) wurden übernommen und werden von den Geräten automatisch ausgeführt. Fehler beim Probenhandling und die subjektive Differenzierung von lebenden und toten Zellen werden so eliminiert. Die Ergebnisse der automatisch arbeitenden Geräte sind im Vergleich zur manuellen Methode präziser und benutzerunabhängig.Automated systems (Cedex, Vi-CELL, NucleoCounter) have been on the market for a short time that automatically carry out the manual cell counting process. The steps of the manual method (sample staining, transferring the colored sample into a measuring chamber, counting the colored and unstained objects in the microscopic image) have been adopted and are carried out automatically by the devices. Errors in sample handling and the subjective differentiation of living and dead cells are thus eliminated. The results of the automatically working devices are more precise and user-independent compared to the manual method.
Für den Benutzer beschränkt sich das Probenhandling auf die Bereitstellung einer Probe, die dem Gerät in einem Probengefäß zugeführt wird. Diese Probe wird automatisch mit Trypan Blau oder einem anderen geeigneten Farbstoff gemischt und in eine Messkammer oder Küvette überführt. Mit einer vergrößernden Optik werden Bilder der gefärbten Zellsuspension erzeugt, die von einer CCD Kamera aufgenommen werden. Diese Bilder werden dann von einer computergestützten Bildverarbeitungssoftware ausgewertet. Messergebnisse sind die Gesamtkonzentration der Zellen, die Konzentration lebender Zellen, die Konzentration toter Zellen und die Viabilität der Kultur. Sekundäre Parameter, wie Zelldurchmesser, Zellgeometrie oder die Anzahl und Größe von Zellaggregaten werden zur Verfügung gestellt. Bei der Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen zur Färbung der Zellen oder ihrer Zellkerne kann das entstehende Bild auch direkt, ohne eine vergrößernde Optik auf eine CCD Kamera projiziert und anschließend automatisch von einer computergestützten Bildverarbeitungssoftware ausgewertet werden.For the user, sample handling is limited to the provision of a sample that is fed to the device in a sample vessel. This sample is automatically mixed with Trypan Blue or another suitable dye and transferred to a measuring chamber or cuvette. With a magnifying optic, images of the colored cell suspension are generated, which are recorded by a CCD camera. These images are then evaluated by computer-aided image processing software. Measurement results are the total concentration of cells that Concentration of living cells, the concentration of dead cells and the viability of the culture. Secondary parameters such as cell diameter, cell geometry or the number and size of cell aggregates are made available. If fluorescent dyes are used to color the cells or their cell nuclei, the resulting image can also be projected directly onto a CCD camera without a magnifying lens and then automatically evaluated by computer-aided image processing software.
Neben den auf der automatischen Aufnahme und Analyse von Zellbildern beruhenden Methoden wurden auch andere Verfahren zur Bestimmung der Zellkonzentration entwickelt. Diese nutzen spezielle Farbstoffe oder messen Umgebungsparameter, wie etwa die Änderung des elektrischen Widerstands oder der Kapazität, die sich durch die Anwesenheit von Zellen ändern. Diese sind:In addition to the methods based on the automatic recording and analysis of cell images, other methods for determining the cell concentration have also been developed. These use special dyes or measure environmental parameters, such as the change in electrical resistance or capacitance, which change due to the presence of cells. These are:
3. Durchflußzytometrie und fluoreszenzbasierte Methoden3. Flow cytometry and fluorescence-based methods
Die Durchflußzytometrie ( Moore A, Donahue CJ, Hooley J, Stocks DL (1995): Apoptosis in CHO cell batch cultures: Examination by flow cytometry.; Cytotechnology 17: 1-11) kann prinzipiell sowohl zur Zellzählung und zur Bestimmung der Viabilität der Zellen, als auch zur Quantifizierung von Apoptoseraten eingesetzt werden (Becton Dickenson, Guava PCA System). Die Bedienung dieser Geräte und die notwendige Interpretation der erhaltenen Daten setzen hohe Anforderungen an den Benutzer dieser Geräte. Die Probenfärbung mit Fluoreszenzfarbstoffen verursachen vergleichsweise hohe laufende Kosten.Flow cytometry (Moore A, Donahue CJ, Hooley J, Stocks DL (1995): Apoptosis in CHO cell batch cultures: Examination by flow cytometry .; Cytotechnology 17: 1-11) can in principle be used both for cell counting and for determining the viability of the cells , as well as for the quantification of apoptosis rates (Becton Dickenson, Guava PCA system). The operation of these devices and the necessary interpretation of the data received place high demands on the user of these devices. Staining with fluorescent dyes causes comparatively high running costs.
4. Partikelzählung auf Basis der Messung des elektrischen Wiederstands4. Particle counting based on the measurement of the electrical resistance
Diese Systeme (Coulter Counter, CASY System) nutzen die Eigenschaft von Zellen eine Widerstandsänderung in einer Messzelle herbeizuführen. Die Änderung des elektrischen Widerstands wird genutzt, um die Partikel / Zellen zu zählen und ihr Volumen zu bestimmen. (Coulter WH (1956): High speed automatic blood cell counter and cell size analyser; National Electronics Conference III, Chicago). Eine Differenzierung von lebenden und toten Zellen ist jedoch nur sehr eingeschränkt möglich. 5. RadiofrequenzmethodenThese systems (Coulter Counter, CASY System) use the property of cells to bring about a change in resistance in a measuring cell. The change in electrical resistance is used to count the particles / cells and determine their volume. (Coulter WH (1956): High speed automatic blood cell counter and cell size analyzer; National Electronics Conference III, Chicago). Differentiation between living and dead cells is, however, only possible to a very limited extent. 5. Radio frequency methods
Zellen mit intakten Plasmamembranen verhalten sich unter dem Einfluss elektrischer Felder wie Kondensatoren. Die resultierende Kapazität kann gemessen werden, sie hängt vom Zelltyp ab und ist proportional zur Konzentration lebender Zellen (Fehrenbach R, Comerbach M, Petre JO (1992): On-Iine biomass monitoring by capacitance measurement., Journal of Biotechnology 23: 303-314).Mit dieser Methode können tote Zellen nicht nachgewiesen werden Die Bestimmung der Viabilität der Probe ist nicht möglich..Dieses Verfahren kann als on-line Messung ausgelegt werden und erlaubt auch die Bestimmung der Konzentration lebender Zellen in Zellaggregaten und Microcarrierkulturen. Entsprechende Sonden sind am Markt erhältlich.Cells with intact plasma membranes behave like capacitors under the influence of electrical fields. The resulting capacitance can be measured, it depends on the cell type and is proportional to the concentration of living cells (Fehrenbach R, Comerbach M, Petre JO (1992): On-Iine biomass monitoring by capacitance measurement., Journal of Biotechnology 23: 303-314 Dead cells cannot be detected with this method. The viability of the sample cannot be determined. This method can be designed as an online measurement and also allows the concentration of living cells in cell aggregates and microcarrier cultures to be determined. Appropriate probes are available on the market.
6. Laserdiffraktometrie6. Laser diffractometry
Die Methode der Laserdiffraktometrie (Murakawa K, Kohno M, Kinoshita Y, Takeda T (1992): Application of diffractometry and a linear image sensor to measurement of erythrocyte deformability. Biorheology. Mar-Jun;29(2-3):323-35. ) nutzt die Eigenschaft von in Zellen eingestrahltem Laserlicht um einen Winkel zu streuen, der umgekehrt proportional zur Größe der Zellen ist. Die Auswertung des Streulichts ermöglicht die Bestimmung der Zellkonzentration und der Größenverteilung der Zellen. Eine Differenzierung lebender und toter Zellen ist nicht möglich.The method of laser diffractometry (Murakawa K, Kohno M, Kinoshita Y, Takeda T (1992): Application of diffractometry and a linear image sensor to measurement of erythrocyte deformability. Biorheology. Mar-Jun; 29 (2-3): 323-35 .) uses the property of laser light radiated into cells to scatter an angle that is inversely proportional to the size of the cells. The evaluation of the scattered light enables the cell concentration and the size distribution of the cells to be determined. Differentiation of living and dead cells is not possible.
Methoden zur Bestimmung der Konzentration von Biomolekülen in einer KulturbrüheMethods for determining the concentration of biomolecules in a culture broth
Zur Bestimmung von Biomolekül-Konzentrationen, insbesondere als Produkte einer Kulturbrühe, existieren unterschiedliche Verfahren. Alle im Folgenden beschriebenen Verfahren sind prinzipiell zur Bestimmung von Biomolekülkonzentrationen geeignet. Im industriellen Routineeinsatz erfordert ihre korrekte Durchführung ein hohes Maß an Expertenwissen. Diese Methoden setzen zum Teil eine langwierige und häufig mehrere Arbeitsschritte umfassende Probenvorbereitung voraus. Dies führt zu einer hohen Fehleranfälligkeit, Um die Präzision der Ergebnisse dieser Verfahren zu erhöhen, werden Experten zur Durchführung der jeweiligen Verfahren ausgebildet. Die Messergebnisse stehen zum Teil, als Beispiel sei hier der ELISA Test genannt, erst Tage oder sogar Wochen nach der Probenentnahme zur Verfügung, da im Routinebetrieb zunächst alle Proben eines Kultivierungsprozesses oder eines Abschnitts daraus gesammelt und dann zusammen gemessen werden müssen.There are different methods for determining biomolecule concentrations, in particular as products of a culture broth. In principle, all of the methods described below are suitable for determining biomolecule concentrations. In routine industrial use, their correct implementation requires a high degree of Expert knowledge. Some of these methods require lengthy sample preparation, which often involves several work steps. This leads to a high susceptibility to errors. In order to increase the precision of the results of these processes, experts are trained to carry out the respective processes. Some of the measurement results, for example the ELISA test, are only available days or even weeks after sampling, since in routine operation all samples of a cultivation process or a section thereof must first be collected and then measured together.
ELISAELISA
Sehr häufig werden Proteinkonzentrationen durch den sogenannten ELISA (Enzyme- Linked Immunosorbent Assay) Test ermittelt (Lütkemeyer D, Büntemeyer H (1990): Kinetische ELISA-Messungen; Tecnorama News 1: 2-3). Dabei handelt es sich um einen zur Bestimmung festphasengebundener Antigene modifizierten, immunologischen Test. Grundlage des Verfahrens sind Wechselwirkungen zwischen dem spezifischem Antikörper und dem Antigen, denen das Schlüssel/Schloss-Prinzip zugrunde liegt.Protein concentrations are very often determined by the so-called ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) test (Lütkemeyer D, Büntemeyer H (1990): Kinetic ELISA measurements; Tecnorama News 1: 2-3). This is an immunological test modified for the determination of solid phase bound antigens. The method is based on interactions between the specific antibody and the antigen, which are based on the key / lock principle.
Elektrophoreseelectrophoresis
Bei der Elektrophorese (Freitag R, Reif OW, Weidemann R, Kretzmer G (1996): Production of recombinant h-AT III with mammalian cell cultures using capillary electrophoresis for product monitoring. Cytotechnology 21 : 205 - 215) werden Biomoleküie in Gele eingebracht und einem elektrischen Feld ausgesetzt. Unter diesen Bedingungen setzt eine Wanderung der Moleküle ein, die von der Größe und der Ladung der einzelnen Moleküle abhängt. Auf diese Weise können Substanzen voneinander getrennt und quantifiziert werden.In electrophoresis (Freitag R, Reif OW, Weidemann R, Kretzmer G (1996): Production of recombinant h-AT III with mammalian cell cultures using capillary electrophoresis for product monitoring. Cytotechnology 21: 205 - 215), biomolecules are introduced into gels and exposed to an electrical field. Under these conditions, a migration of the molecules begins, which depends on the size and the charge of the individual molecules. In this way, substances can be separated and quantified.
Kapillarelektrophorese (CE) Die Elektrophorese ist die Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld. Die Kapillarelektrophorese ist ein elektrophoretisches Trennverfahren, bei dem die Trennung in mit Puffer gefüllten Kapillaren erfolgt. Durch Anlegen von Hochspannung ( 2 - 35 kV ) werden geladene Moleküle auf Grund unterschiedlicher Ladungszahl und Mobilität getrennt (Jorgenson JW, Lukacs KD (1981): Zone Electrophoresis in Open-Tubular Glass Capillaries. Anal. Chem. 53: 1298-1302 Jorgenson JW, Lukacs KD (1983): Capillary Zone Electrophoresis. Science 222: 266-272).Capillary electrophoresis (CE) Electrophoresis is the separation of charged molecules in an electrical field. Capillary electrophoresis is an electrophoretic separation process in which the separation takes place in capillaries filled with buffer. By applying high voltage (2 - 35 kV) charged molecules are separated due to different charge numbers and mobility (Jorgenson JW, Lukacs KD (1981): Zone Electrophoresis in Open-Tubular Glass Capillaries. Anal. Chem. 53: 1298-1302 Jorgenson JW , Lukacs KD (1983): Capillary Zone Electrophoresis. Science 222: 266-272).
4. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)4. HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
Mit dem HPLC Verfahren werden die verschiedenen Bestandteile einer Probe aufgrund der unterschiedlich starken Wechselwirkungen zwischen der Säulenmatrix und den in der Probe enthaltenen Biomolekülen getrennt. (Ozturk SS, Thrift JC, Blackie JD, Naveh D (1995): Real-time monitoring of protein secretion in mammalian cell fermentation: Measurement of monoclonal antibodies using a computer-controlled HPLC System. Biotechnology and Bioengineering 48: 201 - 206) Die getrennten Bestandteile können dann quantifiziert werden.With the HPLC method, the different components of a sample are separated due to the different interactions between the column matrix and the biomolecules contained in the sample. (Ozturk SS, Thrift JC, Blackie JD, Naveh D (1995): Real-time monitoring of protein secretion in mammalian cell fermentation: Measurement of monoclonal antibodies using a computer-controlled HPLC system. Biotechnology and Bioengineering 48: 201 - 206) Die separated components can then be quantified.
5. Fließinjektionsanalyse (FIA)5. Flow Injection Analysis (FIA)
Bei der Fließinjektionsanalyse wird eine flüssige Probe in einem flüssigen Trägerstrom, der bereits Reagenzien enthalten kann, injiziert und in einem kapillaren Leitungssystem zum kontinuierlich arbeitenden Detektor transportiert. Auf der Strecke zwischen Injektion und Detektion können sowohl chemische Reaktionen (mit oder ohne weitere kontinuierliche Reagenzienzugabe) stattfinden, als auch sonstige Techniken eingesetzt werden, die die Analyse der Probe effektiver machen, wie zum Beispiel das Einbringen von Trägermaterial auf dem eine spezifische Bindung von Zielmolekülen stattfinden kann. (Ruzicka J, Hansen E (1975): Flow injection analysis. Part I: A new concept of fast contiuous flow analysis. Anal. Chim. Acta 78, 145-157, Dan. Pat. Appl. No. 4846/74, Sept. 1974; subsequent U.S. Pat. No. 4.022.575) 6. NephelometrieWith flow injection analysis, a liquid sample is injected into a liquid carrier stream, which may already contain reagents, and transported in a capillary line system to the continuously operating detector. Along the route between injection and detection, chemical reactions (with or without further continuous reagent addition) can take place, as well as other techniques that make the analysis of the sample more effective, such as the introduction of carrier material on which a specific binding of target molecules can take place. (Ruzicka J, Hansen E (1975): Flow injection analysis. Part I: A new concept of fast contiuous flow analysis. Anal. Chim. Acta 78, 145-157, Dan. Pat. Appl. No. 4846/74, Sept 1974; subsequent U.S. Pat. No. 4,022,575) 6. Nephelometry
Die Nephelometrie (Owen WE, Roberts WL (2003): Performance characteristics of four immunonephelometric assays for the quantitative determination of IgA and IgM in cerebrospinal fluid. Am J Clin Pathol. 119: 689-93.) ist ein quantitatives analytisches Verfahren. Die zu messende Probe wird mit monochromatischem Laserlicht beleuchtet und das Streulicht analysiert. Über die Auswertung des Streulichtes kann die Konzentration von Biomolekülen bestimmt werden.Nephelometry (Owen WE, Roberts WL (2003): Performance characteristics of four immunonephelometric assays for the quantitative determination of IgA and IgM in cerebrospinal fluid. Am J Clin Pathol. 119: 689-93.) Is a quantitative analytical method. The sample to be measured is illuminated with monochromatic laser light and the scattered light is analyzed. The concentration of biomolecules can be determined by evaluating the scattered light.
SPR (Surface Plasmon Resonance)SPR (Surface Plasmon Resonance)
Die SPR-Technologie nutzt die Oberflächen-Plasmon-Resonanz (Surface-Plasmon- Resonance, SPR). Bindet ein zu messender Analyt an einen immobilisierten Rezeptor, ändert sich der refraktive Index in der Nähe der Sensoroberfläche, auf der der Rezeptor immobilisiert wurde. (Cullen DC, Brown RG, Löwe CR (1987-88): Detection of immuno- complex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings. Biosensors. 3: 211-25.). Die Änderung des refraktiven Index der Sensoroberfläche ist direkt proportional zur Konzentration der an den Rezeptor bindenden Substanz. Sowohl Komplexbildung als auch -dissoziation können "on-line" verfolgt und innerhalb kürzester Zeit analysiert werden. Der Messprozess und die Datenauswertung benötigen im Vergleich zu konventionellen Methoden nur einen geringen Zeitaufwand und sind automatisierbar. Nach der Analyse des ersten Zyklus erfolgt die Regeneration der Sensoroberfläche. Danach kann derselbe Sensor erneut zur Messung benutzt werden.SPR technology uses surface plasmon resonance (SPR). If an analyte to be measured binds to an immobilized receptor, the refractive index changes in the vicinity of the sensor surface on which the receptor was immobilized. (Cullen DC, Brown RG, Löwe CR (1987-88): Detection of immuno-complex formation via surface plasmon resonance on gold-coated diffraction gratings. Biosensors. 3: 211-25.). The change in the refractive index of the sensor surface is directly proportional to the concentration of the substance binding to the receptor. Both complex formation and dissociation can be tracked "on-line" and analyzed within a very short time. The measurement process and the data evaluation require only a small amount of time compared to conventional methods and can be automated. After the analysis of the first cycle, the sensor surface is regenerated. Then the same sensor can be used again for the measurement.
Dies macht deutlich, dass die SPR - Technologie zur Bestimmung der Konzentration von Biomolekülen in Proben aus Zellkulturprozessen gut geeignet ist (siehe auch Disley, D. M., Morill, P.R., Sproule, K., Löwe, C.R., 1999. An optical biosensor for monitoring recombinant proteins in process media. Biosensors & Bioelectronics (14) 481 - 493).This makes it clear that SPR technology is well suited for determining the concentration of biomolecules in samples from cell culture processes (see also Disley, DM, Morill, PR, Sproule, K., Löwe, CR, 1999. An optical biosensor for monitoring recombinant proteins in process media.Biosensors & Bioelectronics (14) 481-493).
Methoden zur Bestimmung der spezifischen Produktivität von Zellen in einer Kulturbrühe Die spezifische Produktivität von Zellen einer Zellkultur ist einer der wichtigsten Parameter zur Bewertung und Steuerung von Kultivierungsprozessen. Er ist definiert als die Produktmenge, die eine Zelle pro Zeiteinheit an das Kulturmedium abgibt. Unterschiedliche Prozessführungen, wie etwa Batchprozesse, Chemostat oder Perfusionsbetrieb, führen zu unterschiedlichen mathematischen Beziehungen zur Berechnung der spezifischen Produktivität.Methods for determining the specific productivity of cells in a culture broth The specific productivity of cells in a cell culture is one of the most important parameters for evaluating and controlling cultivation processes. It is defined as the amount of product that a cell releases into the culture medium per unit of time. Different process controls, such as batch processes, chemostat or perfusion operation, lead to different mathematical relationships for the calculation of specific productivity.
Zellspezifische Produktivität bei Batch Prozessen:Cell-specific productivity in batch processes:
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Zellspezifische Produktivität bei kontinuierlichem Chemostatbetrieb:Cell-specific productivity with continuous chemostat operation:
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Zellspezifische Produktivität bei Perfusionsbetrieb:Cell-specific productivity in perfusion operation:
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CSi|X: Zellspezifische Substratverbrauchs- und Produktbildungsrate [mol s"1]C S i | X : Cell-specific substrate consumption and product formation rate [mol s "1 ]
C(_ Substrat- bzw. Produktkonzentration im Frischmedium zur Zeit t0 [mol I"1]C (_ substrate or product concentration in the fresh medium at time t 0 [mol I "1 ]
Cι- Substrat- bzw. Produktkonzentration im Frischmedium zur Zeit t-, [mol I"1] c2: Substrat- bzw. Produktkonzentration im Frischmedium zur Zeit t2 [mol I"1] cst: Substrat- bzw. Produktkonzentration im „steady State" [mol I"1] t1st2: Zeitpunkte 1 bzw. 2 [s]Cι- substrate or product concentration in the fresh medium at time t-, [mol I "1 ] c 2 : substrate or product concentration in the fresh medium at time t 2 [mol I " 1 ] c st : substrate or product concentration in the "steady state" [mol I "1 ] t 1s t 2 : times 1 and 2 [s]
Xι,X2" Konzentrationen lebender Zellen zum Zeitpunkt 1 bzw. 2 [I"1]Xι, X 2 "Concentrations of living cells at time 1 or 2 [I " 1 ]
Xst: Konzentrationen lebender Zellen im „steady State"Xst: Concentrations of living cells in the "steady state"
VR: Volumen des ReaktorsV R : volume of the reactor
D: Verdünnungs- bzw. Bleedingrate [I s"1]D: Dilution or bleeding rate [I s "1 ]
P: Perfusionsrate [I s"1]P: perfusion rate [I s "1 ]
Diese Gleichungen zeigen, dass die spezifische Produktivität neben dem Reaktorvolumen und den Zu- und Abflussraten in erster Linie von den Produkt- und Zellkonzentrationen abhängt. Den Gleichungen liegt die Annahme zugrunde, das sich die spezifische Produktivität zwischen zwei Zeitpunkten linear verändert. Diese Annahme gilt umso besser, je kleiner der betrachtete Zeitraum ist. Die Genauigkeit der Bestimmung von spezifischen Verbrauchs- und Produktionsraten ist also abhängig von der Messpräzision und der Zeit, die zwischen zwei aufeinanderfolgenden Messungen der Konzentrationen von Produkt und lebenden Zellen verstreicht. Nach derzeitigem Stand der Technik existiert aber weder ein Verfahren noch eine technische Lösung, welche die ständige, genaue und prozessbegleitende Messung von spezifischen Verbrauchs- und Produktionsraten in Kulturbrühen ermöglicht.These equations show that the specific productivity, in addition to the reactor volume and the inflow and outflow rates, depends primarily on the product and cell concentrations. The equations are based on the assumption that the specific productivity changes linearly between two points in time. This assumption is all the better, the smaller the period under consideration. The accuracy of the determination of specific consumption and production rates therefore depends on the measuring precision and the time that elapses between two successive measurements of the concentrations of product and living cells. However, according to the current state of the art, there is neither a method nor a technical solution that enables the constant, accurate and process-related measurement of specific consumption and production rates in culture broths.
Stattdessen kann die spezifische Produktivität von Zellen erst mit großer Zeitverzögerung und durch den Einsatz verschiedener, voneinander unabhängiger Messsysteme bestimmt werden. Dies bringt die schon erwähnten Nachteile der Benutzerabhängigkeit, der hohen statistischen Schwankungen und der durch die vielen Arbeitssch ritte bedingten langen Analysezeiten mit sich. Jede Zeitverzögerung ist aber von großem Nachteil für die optimale Bewertung des Kulturverlaufs.Instead, the specific productivity of cells can only be determined with a long time delay and through the use of different, mutually independent measuring systems. This brings with it the disadvantages of user dependency already mentioned, the high statistical fluctuations and the long analysis times caused by the many work steps. However, any time delay is of great disadvantage for the optimal evaluation of the cultural course.
Aufgabe der ErfindungObject of the invention
Ideal wäre ein Verfahren und eine Vorrichtung, welche(s) in der Lage ist, sowohl die Lebendzellen- als auch die Produktkonzentration schnell und möglichst auf Basis ein und derselben Probe zu bestimmen und daraus die spezifische Produktivität der Zellen zu ermitteln.The ideal would be a method and a device that is capable of determining both the living cell and the product concentration quickly and, if possible, on the basis of one and to determine the same sample and from this to determine the specific productivity of the cells.
Dies gilt prinzipiell auch für alle weiteren Parameter, die außer der Lebendzellzahl, der Viabilität der Zellen und der Produktkonzentration einen Einfluss auf den Kultivierungsverlauf haben.In principle, this also applies to all other parameters which, in addition to the number of living cells, the viability of the cells and the product concentration, have an influence on the cultivation process.
Lösung der AufgabeSolution of the task
Das Verfahren und eine Vorrichtung zur Lösung dieser Aufgabe sind in den Patentansprüchen offenbart.The method and an apparatus for solving this problem are disclosed in the patent claims.
Die Erfindung stellt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Verfügung, mit dem spezifische Produktbildungs- und Substratverbrauchsraten von Organismen einer Kulturprobe, z.B. aus einem Bioreaktor, präzise und zeitnah gemessen werden können. Das Verfahren ist automatisiert, einfach auszuführen und kann daher schnell, ohne Experten ausbilden zu müssen, in den laufenden Routinebetrieb integriert werden.The invention provides a method and an apparatus for carrying out the method with which specific product formation and substrate consumption rates of organisms of a culture sample, e.g. from a bioreactor can be measured precisely and promptly. The process is automated, easy to carry out and can therefore be quickly integrated into routine operations without having to train experts.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es, automatisch den Prozess der Zeilkonzentrationsbestimmung und den Prozess der Produkt- oder Substratkonzentrationsbestimmung zu kombinieren, um so mittels direkter Aussagen über die Produktions- und Verbrauchsraten die Bewertung, Steuerung und Regelung des Kultivierungsprozesses zu verbessern.The method according to the invention makes it possible to automatically combine the process of determining the cell concentration and the process of determining the product or substrate concentration in order to improve the evaluation, control and regulation of the cultivation process by means of direct statements about the production and consumption rates.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt es, Proben aus der Kultur an die Sensoren zu übergeben, um diese nach den gewählten Merkmalen zu untersuchen.The device according to the invention makes it possible to transfer samples from the culture to the sensors in order to examine them for the selected features.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Bestimmung der spezifischen Verbrauchsund Produktionsraten von einem oder mehreren Organismen in einer Kulturbrühe durch eine gleichzeitige, automatisierte Zellkonzentration- und Produkt- bzw. Substratkonzentrationsbestimmung durchgeführt. Für die Ermittlung der Zellkonzentration in einer Kulturbrühe wird eine computergestützte digitale Bildverarbeitungseinrichtung in Verbindung mit einer standardisierten Färbemethode verwendet. Die Produkt- bzw. Substratanalysebestimmung wird wahlweise über eine automatisierte Fließinjektionsanalyse-, Kapillarelektrophorese-, High Performance Liquid Chromatography- oder Surface-Plasmon-Resonance-Vorrichtung, bzw. immunochemische oder kalorimetrische Methoden durchgeführt.In the method according to the invention, the specific consumption and production rates of one or more organisms in a culture broth are determined by a simultaneous, automated cell concentration and product or substrate concentration determination. To determine the cell concentration in a culture broth, a computer-aided digital image processing device is used in Used in conjunction with a standardized staining method. The product or substrate analysis determination is carried out optionally via an automated flow injection analysis, capillary electrophoresis, high performance liquid chromatography or surface plasmon resonance device, or immunochemical or calorimetric methods.
Diese Art der Parameterermittlung für die Zellkonzentration und Produkt- bzw. Substratkonzentration ist damit im Gegensatz zu bisherigen Verfahren benutzerunabhängig, da die manuelle Zeilkonzentrationsbestimmung (z.B. Thoma- Kammer) und Produktkonzentrationsbestimmung (z.B. ELISA-Test) entfällt. Die Messergebnisse sind präziser, weil die Ermittlung der Parameter an ein und derselben Probe durchgeführt wird und somit Streuungen in der Probenzusammensetzung eliminiert werden. Der Messvorgang ist aufgrund der Automatisierung schneller und reproduzierbarer und weniger fehleranfällig, da die zum Teil komplexe Probenaufbereitung (z.B. für die Elektrophorese) durch den Menschen entfällt.In contrast to previous methods, this type of parameter determination for cell concentration and product or substrate concentration is therefore user-independent, since manual cell concentration determination (e.g. thoma chamber) and product concentration determination (e.g. ELISA test) are no longer necessary. The measurement results are more precise because the parameters are determined on one and the same sample, thus eliminating scatter in the sample composition. Due to the automation, the measuring process is faster and more reproducible and less prone to errors, since the sometimes complex sample preparation (e.g. for electrophoresis) is not required by humans.
Das Verfahren erlaubt erstmals eine kontinuierliche Überwachung von Kultivierungsprozessen, da problemlos in kurzen Zeitintervallen gemessen werden kann. Diese kontinuierlich Überwachung ist wiederum eine Voraussetzung für eine kontinuierliche Steuerung oder Regelung zur Optimierung des Prozesses.For the first time, the method enables continuous monitoring of cultivation processes, since measurements can be carried out without problems in short time intervals. This continuous monitoring is in turn a prerequisite for continuous control or regulation to optimize the process.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht die Zufuhr einer Kulturprobe zu den einzelnen Analysemodulen. Die Probe einer Kulturbrühe kann entweder manuell aus einem Kulturbehälter oder mehreren Kulturbehältern gezogen und der Analyseeinrichtung manuell zugeführt werden (off-line Betrieb), oder über eine automatische Probenzufuhr, der Analysevorrichtung, zugeführt werden (on-line Betrieb). Diese automatische Probenzuführung kann dabei so ausgelegt sein, dass ein oder mehrere Bioreaktoren beispielsweise mittels eines Röhren- oder Schlauchsystems und entsprechenden Ventilen an die Analyseeinrichtung gekoppelt werden oder die Proben von einem Roboter zugeführt werden.The device according to the invention enables a culture sample to be fed to the individual analysis modules. The sample of a culture broth can either be drawn manually from a culture container or several culture containers and fed manually to the analysis device (off-line operation), or fed to the analysis device via an automatic sample feeder (online operation). This automatic sample supply can be designed such that one or more bioreactors are coupled to the analysis device, for example by means of a tube or hose system and corresponding valves, or the samples are supplied by a robot.
In einer anderen Ausprägung des Verfahrens wird dem Bioreaktor, beispielsweise durch den Einsatz einer Probenahme-Sonde, automatisch kontinuierlich oder diskontinuierlich, zellfreie Kulturbrühe entnommen und der Analyseeinrichtung zur Bestimmung der Konzentration von Biomolekülen zugeleitet. Die Bestimmung der Zelldichte und Viabilität erfolgt in diesem Fall wahlweise durch Zufuhr von manuell oder automatisch entnommenen Proben, zum Beispiel mit dem Verfahren der automatisierten Bildanalyse, der Durchflußzytometrie oder fluoreszenzbasierten Methoden, der Messung des elektrischen Widerstands oder der Laserdiffraktometrie. Alternativ hierzu werden Verfahren, die eine Messung der Zelldichte direkt im Kulturprozess (on-line) erlauben, eingesetzt. Zum Beispiel ermöglicht eine Messung der Kapazität mit der Radiofrequenzmethode die Bestimmung der Dichte lebender Zellen. Mit einem in-situ Mikroskop, mit dem Zelldichte und optional auch die Viabilität gemessen werden können, kann ebenfalls eine kontinuierliche Analyse dieser Parameter durchgeführt werden.In another embodiment of the method, cell-free culture broth is automatically or continuously removed from the bioreactor, for example by using a sampling probe, and the analysis device for determining the Concentration of biomolecules fed. In this case, the cell density and viability are determined either by supplying manually or automatically removed samples, for example using the method of automated image analysis, flow cytometry or fluorescence-based methods, measuring the electrical resistance or laser diffractometry. As an alternative to this, methods are used which allow cell density to be measured directly in the culture process (on-line). For example, measuring the capacitance using the radio frequency method enables the density of living cells to be determined. A continuous analysis of these parameters can also be carried out with an in-situ microscope, with which cell density and optionally also viability can be measured.
Unterschiedliche Kombinationen der verschiedenen genannten On-line- und Off-Iine- Verfahren bieten für unterschiedliche Organismen (z.B. eukaryotische oder prokaryotische Zellen) oder unterschiedliche Kultivierungsprozesse (satzweiser Betrieb, Perfusionsbetrieb oder dergleichen) jeweils die optimale Lösung.Different combinations of the various on-line and off-line processes mentioned offer the optimal solution for different organisms (e.g. eukaryotic or prokaryotic cells) or different cultivation processes (batch operation, perfusion operation or the like).
Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren durch Ankopplung von und/oder Austausch gegen andere Analysemethoden erweiterbar, um noch mehr Prozessparameter zu ermitteln (z.B. Nährstoffgehalt oder Partialdrücke von Gasen) ohne dazu andere Messmethoden zu verwenden. Mit Hilfe einer derart verbesserten Sensorik lassen sich Kultivierungsprozesse noch weiter optimieren. Die mit dem Verfahren gewonnenen Daten können als Analogsignale oder mit einer Software digital an die Kontrollsysteme der Bioreaktoren zur Steuerung und Regelung übergeben werden. Darüber hinaus kann das umfangreiche Datenmaterial dazu genutzt werden, neue, verbesserte Modelle der Vorgänge im Kultivierungsbehälter zu entwickeln, die wiederum durch Simulation zu weiteren Optimierungen genutzt werden können.In addition, the method according to the invention can be expanded by coupling and / or exchanging it for other analysis methods in order to determine even more process parameters (e.g. nutrient content or partial pressures of gases) without using other measurement methods. With the help of such improved sensors, cultivation processes can be further optimized. The data obtained with the method can be transferred as analog signals or digitally to the control systems of the bioreactors for control and regulation. In addition, the extensive data material can be used to develop new, improved models of the processes in the cultivation container, which in turn can be used for further optimization through simulation.
Zusätzliche AnalytenAdditional analytes
Neben den spezifischen Produktionsraten sind weitere Parameter bzw. Analyte zur Bewertung, Steuerung und Regelung biotechnologischer Kultivierungsprozesse von Bedeutung. Diese werden im folgenden beispielhaft und nicht abschließend aufgezählt. Die gleichzeitige und präzise Messung eines oder mehrerer dieser Parameter sind mögliche Erweiterungen des hier beschriebenen Verfahrens und der hier beschriebenen Vorrichtung.In addition to the specific production rates, other parameters or analytes are important for the evaluation, control and regulation of biotechnological cultivation processes. These are listed below by way of example and are not exhaustive. The simultaneous and precise measurement of one or more of these parameters are possible extensions of the method described here and the device described here.
Die wichtigsten Parameter sind : • die Konzentration von Nährstoffen, wie etwa Nährsalze, verschiedene Zucker, Proteine, Aminosäuren, Fette • die Konzentration an Stoffwechselprodukten (z.B. Laktat, organische Säuren, Hormonen, Proteinen, Fetten, Zuckern) • die genauen Produkteigenschaften (Bindungskonstanten, molekulare Eigenschaften des produzierten Biomoleküls, Glykosilierung und Faltung des Biomoleküls) • die Temperatur im Kultivierungsbehälter • die Partialdrücke verschiedener Gase (z.B. 02, C02) • die Konzentration an freien Wasserstoffionen (der pH-Wert)The most important parameters are: • the concentration of nutrients, such as nutrient salts, various sugars, proteins, amino acids, fats • the concentration of metabolic products (e.g. lactate, organic acids, hormones, proteins, fats, sugars) • the exact product properties (binding constants, molecular properties of the biomolecule produced, glycosylation and folding of the biomolecule) • the temperature in the cultivation container • the partial pressures of various gases (eg 0 2 , C0 2 ) • the concentration of free hydrogen ions (the pH value)
Die gleichzeitige und automatisierte Messung und Verarbeitung all dieser Parameter ermöglicht eine bisher unerreichte Präzision bei der Steuerung/Regelung von Kultivierungsprozessen.The simultaneous and automated measurement and processing of all these parameters enables unprecedented precision in the control / regulation of cultivation processes.
Auf Basis dieser Messergebnisse können neue und präzisere mathematische Modelle von Kultivierungsverläufen entwickelt werden, die für die Prozessentwicklung von großer Bedeutung sind. Ausbeute und Produktqualität können so gesteigert werden. Die Wirtschaftlichkeit biotechnologischer Prozesse kann mit den beschriebenen Verfahren drastisch erhöht werden.Based on these measurement results, new and more precise mathematical models of cultivation processes can be developed, which are of great importance for process development. Yield and product quality can be increased in this way. The economics of biotechnological processes can be drastically increased with the methods described.
Beschreibung der AusführungsbeispieleDescription of the embodiments
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen näher erläutert:The invention is explained in more detail below with reference to the drawings:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung.Fig. 1 shows a schematic representation of a first embodiment of the device according to the invention.
Fig. 2 zeigt eine zweite Ausführungsform mit einer veränderten Probenzufuhr. Fig. 1 zeigt im Anschlus an eine Probenzufuhr 18 einen Verteiler 1 , in dem die Probe einer Kulturbrühe in Probenteile aufgeteilt wird. Probenteil I wird durch die Probenleitung 2 in die Probenkammer mit Probenaufbereitung 4 geführt und mit geeigneten Reagenzien über die Reagenzienzufuhr 3 für die Zellkonzentrations- und Viabilitätsbestimmung vorbereitet. Das mit der Bildnahme 6 erzeugte Bild liegt als Signal an dem Steuer- und Auswertecomputer 9 an. Der Steuer- und Auswertecomputer 9 liefert die Werte für die Zellkonzentration und Viabilität. Anschließend wird der Probenteil I durch die Abfalleitung 8 in den Abfall 7 geleitet und die Probenkammer 4 mit Probenaufbereitung 4 auf eine neue Probe vorbereitet.2 shows a second embodiment with a modified sample supply. 1 shows a distributor 1 in which the sample of a culture broth is divided into sample parts. Sample part I is led through the sample line 2 into the sample chamber with sample preparation 4 and prepared with suitable reagents via the reagent supply 3 for the cell concentration and viability determination. The image generated by the imaging 6 is present as a signal on the control and evaluation computer 9. The control and evaluation computer 9 supplies the values for the cell concentration and viability. The sample part I is then passed through the waste line 8 into the waste 7 and the sample chamber 4 with sample preparation 4 is prepared for a new sample.
Der Probenteil II aus dem Verteiler 1 wird durch die Probenleitung 10 in die Probenkammer 4 mit Probenaufbereitung, Sensorchip und Chipaufbereitung 12 geführt und mit geeigneten Reagenzien über die Reagenzienzufuhr 11 für die Bestimmung der Produktkonzentration vorbereitet. Mit dem SPR-Detektor 13 wird die Produktkonzentration im Probenteil II ermittelt. Das erzeugte Signal liegt danach am Steuer- und Auswertecomputer 9 an, welcher aus der Zellkonzentration, Viabilität und Analytkonzentration die spezifischen Produkt- und Verbrauchsraten bestimmt. Anschließend wird der Probenteil II durch die Abfalleitung 8 in den Abfall 7 geleitet und die Probenkammer 4 mit Probenaufbereitung, Sensorchip und Chipaufbereitung 12 auf eine neue Probe vorbereitet. Der Steuer- und Auswertecomputer 9 steuert und regelt über die Datenleitung 5 den Ablauf der Messungen und führt die Datenverarbeitung, den Datentransfer und die Datensicherung durch.The sample part II from the distributor 1 is led through the sample line 10 into the sample chamber 4 with sample preparation, sensor chip and chip preparation 12 and prepared with suitable reagents via the reagent supply 11 for the determination of the product concentration. The product concentration in sample part II is determined with the SPR detector 13. The signal generated is then applied to the control and evaluation computer 9, which determines the specific product and consumption rates from the cell concentration, viability and analyte concentration. The sample part II is then passed through the waste line 8 into the waste 7 and the sample chamber 4 with sample preparation, sensor chip and chip preparation 12 is prepared for a new sample. The control and evaluation computer 9 controls and regulates the course of the measurements via the data line 5 and carries out the data processing, the data transfer and the data backup.
Fig. 2 zeigt einen Behälter mit einer Kulturbrühe 15. In den Behälter 16 ist eine in-situ- Mikroskop-Sonde 17 eingeführt. Die Sonde liefert die Bilder aus der Kulturbrühe. An die Stelle der Mikroskop-Sonde 3 kann auch eine on-line Sonde zur Messung der elektrischen Kapazität der Kulturflüssigkeit, mit der die Konzetration lebender Zellen in der Kulturflüssigkeit bestimmt werden kann, treten. Die Probenzufuhr 18 in eine Probenkammer für die Zellkonzentrations- und Viabilitätsbestimmung entfällt damit. Bezugszeichenliste2 shows a container with a culture broth 15. An in-situ microscope probe 17 is inserted into the container 16. The probe delivers the images from the culture broth. The microscope probe 3 can also be replaced by an on-line probe for measuring the electrical capacity of the culture fluid, with which the concentration of living cells in the culture fluid can be determined. The sample feed 18 into a sample chamber for the cell concentration and viability determination is thus omitted. LIST OF REFERENCE NUMBERS
1 Verteiler 17 Mikroskop-Sonde1 distributor 17 microscope probe
2 Problenleitung 18 Probenzufuhr2 sample line 18 sample supply
3 Reagenzienzufuhr3 Reagent supply
4 Probenaufbereitung4 sample preparation
5 Datenleitung5 data line
6 Bildnahme6 picture taking
7 Abfall7 waste
8 Abfallleitung8 waste line
9 Auswertecomputer9 evaluation computer
10 Probenleitung10 sample line
11 Reagenzienzufuhr11 Reagent supply
12 Chipaufbereitung12 Chip preparation
13 SPR-Detektor13 SPR detector
15 Kulturbrühe15 culture broth
16 Behälter 16 containers

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Bestimmung der spezifischen Produktbildungs- und/oder Substratverbrauchsraten von Organismen in einer Kulturbrühe, mit folgenden Merkmalen:1. A method for determining the specific product formation and / or substrate consumption rates of organisms in a culture broth, with the following features:
a) die Konzentration der Organismen in der Kulturbrühe (Zellkonzentration) und/oder der Anteil lebender Organismen an der Zellkonzentration (Viabilität) werden durch automatisierte Verfahren bestimmt,a) the concentration of the organisms in the culture broth (cell concentration) and / or the proportion of living organisms in the cell concentration (viability) are determined by automated methods,
b) die Konzentrationen von zugegebenen Substraten und/oder von Produkten der Organismen werden durch automatisierte Verfahren bestimmt,b) the concentrations of added substrates and / or products of the organisms are determined by automated methods,
c) die Ergebnisse der Schritte a) und b) werden automatisch zur Bestimmung der spezifischen Produktbildungs- und/oder Substratverbrauchsraten der Organismen verknüpft bzw. verarbeitet.c) the results of steps a) and b) are automatically linked or processed to determine the specific product formation and / or substrate consumption rates of the organisms.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Konzentrationen von zugegebenen Substraten und/oder von Produkten der Organismen2. The method according to claim 1, characterized in that the determination of the concentrations of added substrates and / or products of the organisms
- mit Verfahren - der Fließinjektionsanalytik oder - der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) oder - der Kapillarelektrophorese oder - der Surface Plasmon Resonance (SPR) oder- with methods - flow injection analysis or - high performance liquid chromatography (HPLC) or - capillary electrophoresis or - surface plasmon resonance (SPR) or
- mit immunochemischen Methoden oder- with immunochemical methods or
- mit kalorimetrische Methoden oder- with calorimetric methods or
- mit Hilfe eines automatisierten Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) oder - mit Hilfe eines automatisierten Nephelometers oder- with the help of an automated enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or - with the help of an automated nephelometer or
- mit Hilfe einer automatisierten Gel-Elektrophorese oder- with the help of automated gel electrophoresis or
- mit Hilfe von Micro-Arrays oder- with the help of micro-arrays or
- mit Hilfe von immobilisierten Enzymen durchgeführt wird. - is carried out with the help of immobilized enzymes.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Organismen in der Kulturbrühe (Zellkonzentration) und der Anteil lebender Organismen an der Zellkonzentration (Viabilität) durch Versetzen der Kulturbrühe oder einer Probe hiervon mit Farbstoff und durch computergestützte digitale Bildverarbeitung bestimmt werden.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the concentration of the organisms in the culture broth (cell concentration) and the proportion of living organisms in the cell concentration (viability) by adding the culture broth or a sample thereof with dye and by computer-aided digital image processing become.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Zellkonzentration und der Konzentration lebender Zellen auf Basis einer Messung des elektrischen Widerstands der Kulturbrühe erfolgt.4. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the cell concentration and the concentration of living cells is carried out on the basis of a measurement of the electrical resistance of the culture broth.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Zellkonzentration und der Konzentration lebender Zellen mit Hilfe von Floureszenzmarkern und/oder einem Durchflußzytometer erfolgt.5. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the cell concentration and the concentration of living cells is carried out with the aid of fluorescent markers and / or a flow cytometer.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration lebender Zellen in der Kulturbrühe bestimmt wird, auf Basis einer Messung der Kapazität der Kulturbrühe.6. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the concentration of living cells in the culture broth is determined on the basis of a measurement of the capacity of the culture broth.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkonzentration auf Basis von Laserdiffraktometrie bestimmt wird.7. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the cell concentration is determined on the basis of laser diffractometry.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Zellkonzentration oder die Bestimmung der Zellkonzentration und der Viabilität mit einem in situ-Mikroskop erfolgt, welches diese Parameter direkt im Kulturbehälter misst.8. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the cell concentration or the determination of the cell concentration and viability is carried out with an in situ microscope which measures these parameters directly in the culture container.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der spezifischen Substratverbrauchs- und Produktbildungsraten kombiniert ist mit der Bestimmung eines oder mehrerer weiterer Analyte bzw. Parameter. 9. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the determination of the specific substrate consumption and product formation rates is combined with the determination of one or more further analytes or parameters.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe der Kulturbrühe automatisch steril entnommen wird und einer Vorrichtung zur Bestimmung der spezifischen Produktbildungs- und Substratverbrauchsraten manuell oder automatisch zugeführt wird.10. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the sample of the culture broth is automatically taken sterile and a device for determining the specific product formation and substrate consumption rates is fed manually or automatically.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration lebender Zellen on-line im Kulturbehälter mit einem in situ-Mikroskop gemessen wird und eine Probe der Kulturbrühe insbesondere manuell einer Einrichtung zur Bestimmung der Substrat- und Produktkonzentrationen zugeführt wird.11. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the concentration of living cells is measured on-line in the culture container with an in situ microscope and a sample of the culture broth in particular manually fed to a device for determining the substrate and product concentrations becomes.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration lebender Zellen on-line im Kulturbehälter mit einem in situ-Mikroskop gemessen wird und eine Probe der Kulturbrühe über eine Probenahmesonde oder ein System zur automatischen Probenahme einer Einrichtung zur Bestimmung der Substrat- und Produktkonzentrationen zugeführt wird.12. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the concentration of living cells is measured on-line in the culture container with an in situ microscope and a sample of the culture broth via a sampling probe or a system for automatic sampling of a device for Determination of substrate and product concentrations is supplied.
13. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte lebender Zellen online im Kulturbehälter mit einer13. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the density of living cells online in the culture container with a
Sonde zur Messung der Kapazität der Zellkultur bestimmt wird und eine Probe der Kulturbrühe insbesondere manuell einer Einrichtung zur Bestimmung der Substrat- und Produktkonzentration zugeführt wird.Probe for measuring the capacity of the cell culture is determined and a sample of the culture broth is fed, in particular manually, to a device for determining the substrate and product concentration.
14. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder einem der weiteren Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Dichte lebender Zellen online im Kulturbehälter mit einer Sonde zur Messung der Kapazität der Zellkultur bestimmt wird und eine Probe der Kulturbrühe über eine Probenahmesonde oder ein System zur automatischen Probenahme einer Einrichtung zur Bestimmung der Substrat- und Produktkonzentration zugeführt wird.14. The method according to claim 1 or one of the further claims, characterized in that the density of living cells is determined online in the culture container with a probe for measuring the capacity of the cell culture and a sample of the culture broth via a sampling probe or a system for automatic sampling of a device is fed to determine the substrate and product concentration.
15. Vorrichtung zur automatischen Bestimmung der spezifischen Produktbildungs- und Substratverbrauchsraten von Organismen in einer Kulturbrühe, mit folgenden Merkmalen: a) eine Einrichtung bestehend aus einer Optik, einer elektronischen Flächen- oder Zeilenkamera zur Bildaufnahme, einer Einrichtung zum Versetzen der Kulturbrühe mit einem Farbstoff zur Unterscheidung von lebenden und toten Organismen und einer computergestützten digitalen Verarbeitungseinrichtung zur Bestimmung der Konzentration der Organismen in der Kulturbrühe (Zellkonzentration) und des Anteils lebender Organismen an der Zellkonzentration (Viabilität),15. Device for the automatic determination of the specific product formation and substrate consumption rates of organisms in a culture broth, with the following features: a) A device consisting of an optical system, an electronic area or line camera for image acquisition, a device for adding a dye to the culture broth to differentiate between living and dead organisms and a computer-aided digital processing device for determining the concentration of the organisms in the culture broth (cell concentration ) and the proportion of living organisms in the cell concentration (viability),
b) eine Einrichtung zur Bestimmung der Konzentration von zugegebenen Substraten und/oder von Produkten der Organismen insbesondere auf Basis der Verfahren der Fließinjektionsanalytik, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), Kapillarelektrophorese und Surface Plasmon Resonance (SPR)-, bzw. immunochemische oder kalorimetrische Methoden,b) a device for determining the concentration of added substrates and / or products of the organisms, in particular based on the methods of flow injection analysis, high performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis and surface plasmon resonance (SPR), or immunochemical or calorimetric methods .
c) ein Computersystem zur Steuerung der Messvorgänge von der Probenverteilung, der Probenvorbereitung, der Bildnahme bzw. der Detektion der zugegebenen Substrate oder Produkte der Organismen und der Datenauswertung und Datenspeicherung und zur Bestimmung der spezifischen Produktbildungs- und Substratverbrauchsraten.c) a computer system for controlling the measurement processes of the sample distribution, sample preparation, imaging or detection of the added substrates or products of the organisms and the data evaluation and data storage and for determining the specific product formation and substrate consumption rates.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe der Kulturbrühe über ein Schlauch- oder Kapillarsystem direkt aus dem Kulturbehälter oder von mehreren Kulturbehältern an eine Einrichtung zur Bestimmung der spezifischen Produktbildungs- und Substratverbrauchsraten zuführbar ist (On-Line-Anbindung).16. The apparatus according to claim 15, characterized in that the sample of the culture broth can be fed via a hose or capillary system directly from the culture container or from a plurality of culture containers to a device for determining the specific product formation and substrate consumption rates (online connection).
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe der Kulturbrühe über ein Schlauch- oder Kapillarsystem direkt aus dem Kulturbehälter oder mehreren Kulturbehältern einer Einrichtung zur Bestimmung der Substrat- und/oder Produktkonzentrationen zuführbar ist. 17. The apparatus according to claim 15 or 16, characterized in that the sample of the culture broth can be fed via a hose or capillary system directly from the culture container or several culture containers to a device for determining the substrate and / or product concentrations.
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121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase