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WO2005090399A1 - 各種細胞の増殖・分化を認識する抗体、その抗体を用いた増殖・分化の評価方法 - Google Patents

各種細胞の増殖・分化を認識する抗体、その抗体を用いた増殖・分化の評価方法 Download PDF

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WO2005090399A1
WO2005090399A1 PCT/JP2005/004932 JP2005004932W WO2005090399A1 WO 2005090399 A1 WO2005090399 A1 WO 2005090399A1 JP 2005004932 W JP2005004932 W JP 2005004932W WO 2005090399 A1 WO2005090399 A1 WO 2005090399A1
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
differentiation
cells
protein
proliferation
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/004932
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yukihiro Akao
Kenji Matsumoto
Original Assignee
Gifu International Institute Of Biotechnology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gifu International Institute Of Biotechnology filed Critical Gifu International Institute Of Biotechnology
Priority to JP2006511237A priority Critical patent/JPWO2005090399A1/ja
Publication of WO2005090399A1 publication Critical patent/WO2005090399A1/ja

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • An antibody that recognizes proliferation / differentiation of various cells an antibody for the antibody, a method for evaluating proliferation / differentiation
  • the present invention relates to a method for measuring proliferation and differentiation of various types of cells using an antibody prepared using rck / p54-derived low molecular weight peptide as an antigen.
  • rck / p54 is a protein which has been confirmed to have RNA helicase activity and which is essential for efficient translation of mRNA in Xenopus oogenesis.
  • Human rck / p54 is a gene product cloned from the chromosome 11 band q23 of the chromosomal translocation t (11; 14) (q23; q32) in the human B lymphoma cell line RC-K8.
  • the rck / p54 protein is a cytoplasmic localized protein with a molecular weight of 54 kDa, which is also 472 amino acids, and is found in all tissues in normal cells, but its expression is reduced in brain, skeletal muscle and lung tissues.
  • rck / p54 the expression of rck / p54 is enhanced in tumors that have developed, and rck / p54 cooperates with other translation initiation factors in tumor cells and is a gene involved in cell proliferation and virulence. It is speculated that it promotes the translation of mRNA (s) (general literature 1).
  • Patent Document 1 discloses the rck / p54, and a homologue protein substantially identical thereto or a protein having substantially the same action.
  • a protein is used to provide an RNA modifying protein configured to be able to change the structure of mRNA molecule in a direction to increase the protein synthesis efficiency, and is configured to easily increase the protein synthesis efficiency. It is intended to provide a protein synthesis promoter, a gene therapeutic agent configured to enhance translation efficiency of a transgene, and a cancer therapeutic agent configured to be able to effectively treat cancer. as a goal! Scold.
  • an antibody obtained using a peptide that is a partial sequence of rck / p54 protein as an antigen is prepared, and an antibody that specifically reacts with the obtained rck / p54 protein is used.
  • an antibody that specifically reacts with the obtained rck / p54 protein is used.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-289860
  • Non-patent literature 1 Cancer Research, 55, 3444-4449, 1995
  • the present invention is a means for detecting proliferation and differentiation stages of various cells and examining proliferation and differentiation of various cells based on the knowledge obtained in the process of elucidating the role of rck / p54 protein.
  • An antibody is prepared using a peptide which is a partial sequence of rck / p54 protein as an antigen, and an antibody having specific reactivity with rck / p54 protein is used to determine the role of rck / p54 protein in various cells.
  • an antibody having specific reactivity with rck / p54 protein is used to determine the role of rck / p54 protein in various cells.
  • a feature of the present invention is a small molecule peptide having the following amino acid sequence:
  • (b) Amino acid sequence This is an amino acid sequence comprising an amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in (a), or modified with monoacetic acid or the like. The following experiment was performed using the above-mentioned (a) sequence which is a partial sequence of rck / p54 protein.
  • Another feature of the present invention is an antibody characterized in that the peptide according to claim 1 is obtained as an antigen. From the amino acid sequence of rckZp54 protein, the amino acid sequence of STARTENPVI (1-10) was used for various experiments.
  • Another feature of the present invention is an antibody characterized in that an antibody obtained using the peptide of claim 1 as an antigen is a monoclonal antibody.
  • an antibody having reactivity specifically with rckZp54 protein was obtained.
  • Another feature of the present invention is a method of examining proliferation and differentiation of each type of cells characterized by using the antibody obtained in claim 2 or 3.
  • a peptide having the amino acid sequence (a) of claim 1 as an antigen, it is specifically reactive to the rckZp54 protein.
  • Monoclonal antibody was obtained.
  • Another feature of the present invention is a kit for examining proliferation and differentiation of various cells, which comprises the antibody obtained in claim 2 or 3.
  • Another feature of the present invention is a method of examining proliferation and differentiation of sperm characterized by using the antibody obtained in claim 2 or 3.
  • Another feature of the present invention is a kit for examining proliferation and differentiation of sperm, characterized in that it contains the antibody obtained in claim 2 or 3.
  • Another feature of the present invention is a method of diagnosing infertility, characterized by using the antibody obtained in claim 2 or 3.
  • Another feature of the present invention is a kit for diagnosing infertility, characterized in that it contains the antibody obtained in claim 2 or 3.
  • FIG. 1 shows the reaction of rckZp54 protein with anti-rckZp54 antibody by Western blotting.
  • FIG. 2 shows the detection of rckZp54 protein in the ovary by the fluorescent antibody method and the localization thereof.
  • FIG. 3 shows detection of rckZp54 protein in testis by fluorescent antibody method and its localization.
  • FIG. 4 shows the detection of rckZp54 protein in the epididymis by fluorescent antibody method and its localization.
  • FIG. 5 shows the results of examining the effect of progesterone administration on the expression level of rckZp54 protein.
  • FIG. 6 shows the results of examining the relationship between fertilization and the expression level of rckZp54 gene.
  • FIG. 7A shows the results of examining cell proliferation in Con-A-treated cells.
  • FIG. 7B shows the results of examining the expression of rckZp54 protein in Con-A-treated cells.
  • FIG. 8A shows the results of examining the proliferation of U937 cells in TPA-treated cells.
  • Fig. 8B is a Ding? 8 shows expression of 038 of 11937 cells in treated cells.
  • Figure 8C Figure 8C, right? The results of examining the expression of 1 ⁇ 1 ⁇ 754 protein of 11937 cells in 8 treated cells are shown.
  • the synthesis of the peptide of the present invention is carried out by well-known methods, for example, the ability to condense two successive aminoacyl groups sequentially in a predetermined order, or a fragment previously formed with an aminoacyl group and already having several aminoacyl groups. These can be obtained by synthesis by condensation of several fragments which have been pre-formed in this way, or by condensation in an appropriate order. In this case, all reactive functional groups possessed by these aminoacyl groups or fragments, in particular the activity of the carboxyl functional group, except for one of the amine functional groups and the other of the carboxyl groups (or the opposite) which usually form a peptide bond. Care is taken to pre-protect them according to methods known in peptide synthesis!
  • the aminoacyl group to be used for example, in the case of cysteine, an acetoamidomethyl group or a paramethyoxybenzyl group can be used.
  • the synthesis is C-terminal amino acid and Initiated by condensation with the amino acid corresponding to the adjacent aminoacyl group in the desired sequence, and so on, step by step, up to the N-terminal amino acid. Is preferred.
  • Another preferable synthesis method of the peptide of the present invention is a solid phase peptide synthesis method by R. D. Merrifield.
  • Merrifield's method uses a highly porous polymer resin to which the first C-terminal amino acid of the peptide chain is fixed. This amino acid is fixed to the resin via its carboxyl group, and its amine functional group is protected by, for example, t-butyl oxycarboyl group. Initial C-terminal amino acid power Once fixed in the resin this way, the protecting group of the amine functional group is removed by washing the resin with acid. If the protecting group of the phenylalanine functional group is t-butyloxycarbonyl group, the resin can be removed by treatment with trifluoroacetic acid.
  • the second amino acid is then coupled, which results in the second aminoacyl group of the desired sequence leading to the deprotected amine function of the first C-terminal amino acid fixed to the C-terminal aminoacyl group.
  • the carboxyl group of this second amino acid is activated, for example by means of dicyclohexylcarbodiimide, and the amine function is protected, for example by means of t-butyloxycarbol.
  • the first part of the desired peptide chain is obtained, which consists of two amino acids, the terminal amine function of which is protected.
  • the polyclonal antibody was prepared by mixing 100 ⁇ g / body of the partial sequence of rck / p54 obtained as described above with an equal amount of complete adjuvant, and using 5 mice every 4 weeks for 5 weeks. I was immunized. One week after the final immunization, according to a conventional method, whole blood of rabbits which produced sufficient titer of antisera was collected, followed by leaving it at 37 ° C for 1 hour and then at 4 ° C overnight. Serum is obtained by centrifuging at 3000 rpm and this is After purification by adsorption and desorption by chromatography, an anti-rckZp54 polyclonal antibody was obtained.
  • a method for obtaining a monoclonal antibody using the peptide of partial sequence of rck / p54 obtained in the present invention can be obtained according to a known method. That is, examples of mammals for immunization include mice, rats, guinea pigs, sheep, goats and the like. Of these, mice and rats are preferred because they are easy to handle.
  • the route of administration of the antigen upon immunization is not particularly limited. For example, administration can be by any route such as subcutaneous, intraperitoneal, intravenous or intramuscular. Specifically, for example, a peptide antigen is administered several times every several days for several days to BALB / c mice. The dose is 0.1 / ⁇ -100 / ⁇ at one time per animal.
  • Spleens are isolated from the mice thus immunized, and spleen cells are obtained by centrifugation. Since these cells are not proliferative, they are fused with cells having self-proliferating ability. Lymphoid cells such as myeloma cells are desirable as cells having an autoproliferative capacity. As Mie mouth cells, it is preferable to use Mie mouth cells that do not secrete antibody in the same species as the animal from which the antibody-producing cells were obtained. Examples of useful myeloma cells include Sp2Z0-aql4, P3 / NSl / l-Aq4-1, P3X63Aq8U.1 etc. in the case of mouse myeloma cells.
  • the fusion between antibody-producing cells and myeloma cells can be carried out according to a conventional method, for example, by treating these cells with a solution (or suspension) containing a cell fusion agent such as polyethylene glycol.
  • a cell fusion agent such as polyethylene glycol.
  • the ratio of antibody-producing cells to myeloma cells is preferably about 3: 1 to 10: 1 in terms of the cell number ratio.
  • the resulting fused cells are separated by limiting dilution, and the separated fused cells are grown, and antibodies produced in each well on a microplate are immobilized with the peptide of the present invention.
  • the reactivity with the rck / p54 protein can be examined by immunohistological staining to obtain a hybridoma producing a highly reactive desired antibody.
  • the monoclonal antibody obtained in this manner is obtained from a culture supernatant obtained by culturing using an appropriate medium, or from ascites fluid, serum or the like inoculated in the peritoneal cavity of a mouse etc.
  • Purified antibodies can be easily obtained by ammonium sulfate fractionation, anion exchange chromatography, affinity chromatography using protein A or the like.
  • FIG. 1 The results of examining the reactivity with the rckZp54 protein by the Western blot method using the antibody obtained as described above are shown in FIG. That is, according to a standard method, a denaturant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) was added to 1 ⁇ g of a tissue extraction sample such as an ovary and testis or epididymis and then subjected to 10% polyacrylamide gel electrophoresis. After electrophoresis, after transfer to a nylon membrane, only rck / p54 protein could be detected by visualization using a 3000-fold dilution of antibody.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • FIG. 2 shows the results of examining the localization of rckZp54 protein in the ovary or the expression at the differentiation stage. Immunohistological staining of the ovaries blocks plates containing tissue sections to block endogenous peroxidase, so 30% H 2 O and methyl alcohol 1 to 100
  • Color development was carried out by dissolving 20 mg of diaminobenzidine hydrochloride in 1000 ml by adding distilled water to 25 ml of 0.2 M trisaminomethane, 19.2 ml of 0.2 N hydrochloric acid, and further adding HO 0. 03 ml was added. Plate the above solution
  • rckZp54 protein is abundantly stained in egg cells.
  • the cytoplasm is stained a lot.
  • the oocyte on the outermost surface forms follicles and separates, but before ovulation, immature cells are present in the middle, and when ovulation occurs, they become white bodies.
  • the rckZp54 protein is highly expressed in egg cells.
  • FIG. 3 shows the results of examining the localization of rckZp54 protein in the testis or the expression at the differentiation stage in the same manner as in FIG. As a result, the rck / p 54 protein reacted with the antibody shows localization in testicular cells.
  • FIG. 4 shows the localization of rckZp54 protein in the epididymis in the same manner as FIG. 2, or The results of examining the expression at the differentiation stage are shown in FIG.
  • the rck / p54 protein reacted with the antibody shows localization in epididymal cells.
  • the epididymis is highly expressed in the nucleus as sperm matures further.
  • FIG. 5 shows changes in rckZp54 protein when a hormone (PMSG; progesterone), which is also separated from equine serum, is administered to mice.
  • the rck / p54 protein is shown to be significantly increased by progesterone administration. The results show that the rck / p54 protein is hormone dependent.
  • rck / p54 controls erong geography factor 1.
  • FIG. 6B highly expressed fertilized eggs are combined, divided, and in the order of morula, the expression of rck / p54 protein decreases.
  • the anti-ck / p54 antibody prepared using the partial sequence of rckZ P 54 protein detects infertility as a reagent for detecting the stage of cell proliferation and differentiation. It can be used as a reagent for The composition of the detection reagent may contain at least one of the above-described anti-rck / p54 antibodies, ie, the above-described polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and more preferably, various types of additives as additives.
  • Antiseptics except those that suppress the reaction of sodium azide and peroxidase
  • reagents for suppressing nonspecific reactions such as bovine serum albumin at high concentration, block ace (Snow Brand Milk Products), gelatin, skimmed milk, etc. It is desirable to use. By using such an additive, it is possible to improve the convenience, storage stability and the like of the detection reagent by simply increasing the accuracy of the rck / p54 protein detection method using the anti-rck / p54 antibody of the present invention. I can do it.
  • the ⁇ -actin was used as an internal standard control
  • the primers for RCK used the following: T-RCK forward: 5,-GGCTGGGAAAGCCATCT-3, reverse of T- RCK, c-myc forward, 5, ACATCATCATCCAGGACTG-3, c-myc revers, 5 'TTTAGCTCCGTTCCTCCTCTG 3'
  • T-RCK forward 5,-GGCTGGGAAAGCCATCT-3
  • reverse of T- RCK reverse of T- RCK
  • c-myc forward 5, ACATCATCATCCAGGACTG-3
  • c-myc revers 5 'TTTAGCTCCGTTCCTCCTCTG 3'
  • the amount of PCR production is developed by agar electrophoresis, and the intensity of the band is measured by densitometer did.
  • the expression level of rckZp54 in cell proliferation and differentiation was measured.
  • peripheral blood lymphocytes are stimulated with Con-A, the number of cells does not increase in the untreated group, as shown in Fig. 7A. It increased linearly at 48 hours after the on-A treatment.
  • the expression level of rckZp54 was significantly increased as shown in the upper row of FIG. 7B.
  • Levels of TRCK, representing total mRNA levels of RCK also correlated with protein expression.
  • the levels of c myc mRNA and protein were increased with high expression of rckZp54. This result indicates that high expression of rckZp54 positively acts on cell proliferation in response to growth factor-mediated mitogen stimulation.
  • U937 cells were examined for the expression level of rckZp54 in differentiation of cells treated with TPA, which is a stimulator of protein kinase C (PKC).
  • TPA protein kinase C
  • FIG. 8A the number of viable cells decreased after 6 hours of treatment with TPA, and as shown in FIG. 8B, expression of CD38, a delivery marker, appeared 24 hours after treatment.
  • FIG. 8C expression of c myc was reduced after 6 hours of TPA treatment.
  • the levels of rckZ45 and TRCK decreased significantly after 48 hours of treatment.
  • the anti-rck / p54 antibody prepared using the partial sequence of rckZp54 protein as a reagent for detecting cell proliferation and differentiation stages, and infertility. It can be used as a reagent for detecting cell proliferation and differentiation stages, and infertility. It can be used as a reagent for detecting cell proliferation and differentiation stages, and infertility. It can be used as a reagent for detecting cell proliferation and differentiation stages, and infertility. It can be used as a reagent for detecting

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Abstract

　本発明は、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の役割を解明する過程において得られた知見をもとに、各種細胞の増殖および分化の段階を検出するとともに、各種細胞の増殖・分化を評価する手段を提供する。 　ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の部分配列であるペプチドを抗原として抗体を作成し、ｒｃｋ/ｐ５４蛋白質と特異的に反応性を有する抗体を用いて、各種細胞に対するｒｃｋ/ｐ５４蛋白質の役割について検討を加えた結果、各種細胞の増殖及び分化を評価する手段を確立した。

Description

明 細 書
各種細胞の増殖 ·分化を認識する抗体、その抗体を用レ、た増殖 ·分ィ匕の 評価方法
技術分野
[0001] 本発明は、 rck/p54由来の低分子ペプチドを抗原として調製した抗体を用いて各 種細胞の増殖及び分ィ匕を測定する方法に関わる。
背景技術
[0002] rck/p54は、 RNAヘリカーゼ活性を有することが確認され、 Xenopus卵形成におい て、効率的な mRNAの翻訳に必須であることが確認された蛋白である。ヒト rck/p54 は、ヒト Bリンパ腫細胞株 RC— K8における染色体転座の転位点 t (11 ; 14) (q23 ;q3 2)の第 11番染色体バンド q23よりクローユングされた遺伝子産物である。 rck/p54 蛋白は、 472個のアミノ酸力もなる分子量 54kDaの細胞質限局の蛋白質であって、 正常細胞では全ての組織に認められるが、脳、骨格筋及び肺組織ではその発現は 低下している。しかし、これらの組織力も発生した腫瘍では、 rck/p54の発現は亢進 しており、 rck/p54は、腫瘍細胞では他の翻訳開始因子と協同して細胞増殖及び悪 性ィ匕に関わる遺伝子の mRNA (s)の翻訳を促進しているものと推測されている（一般 文献 1)。
[0003] 特許文献 1においては、前記 rck/p54、及びそれと実質的に同一のホモログ蛋白 又はそれと実質的に同一の作用を有する蛋白質を開示している。このような蛋白質を 用いて、蛋白合成効率を高める方向に mRNA分子の構造を変化させることができる ように構成された RNA修飾蛋白を提供すると共に、蛋白合成効率を容易に高めるよ うに構成された蛋白合成促進剤、導入遺伝子の翻訳効率を高めることができるよう〖こ 構成された遺伝子治療薬、及び癌の治療を効果的に行うことができるように構成され た癌治療薬を提供することを目的として！ヽる。
[0004] 本発明にお 、ては、 rck/p54蛋白質の部分配列であるペプチドを抗原として得ら れる抗体を調製し、得られた rck/p54蛋白質と特異的に反応する抗体を用いて、各 種細胞の増殖及び分化の段階を検出するとともに、 rck/p54の役割を解明しようとす るものである。
特許文献 1：特開 2003— 289860号公報
非特許文献 1： Cancer Research,55,3444- 3449,1995
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、 rck/p54蛋白質の役割を解明する過程において得られた知見をもとに 、各種細胞の増殖及び分化の段階を検出するとともに、各種細胞の増殖及び分化を 検査する手段を提供するものである。
課題を解決するための手段
[0006] rck/p54蛋白質の部分配列であるペプチドを抗原として抗体を作成し、 rck/p54 蛋白質と特異的に反応性を有する抗体を用いて、各種細胞に対する rck/p54蛋白 質の役割について、鋭意研究を重ねた結果、各種細胞の増殖及び分化を検査する 手段を確立した。
[0007] 本発明の特徴は、以下のアミノ酸配列を有する低分子ペプチド
(a) STARTENPVI (1-10)であって、
(b)アミノ酸配列 (a)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れ、または、モノョード酢酸等でィ匕学修飾したアミノ酸を含むアミノ酸配列である。 rck /p54蛋白の部分配列である上記 (a)配列を用いて以下の実験を行った。
[0008] 本発明の別の特徴は、請求項 1記載のペプチドを抗原として得られたことを特徴と する抗体である。 rckZp54蛋白質のアミノ酸配列より、 STARTENPVI (1-10)のァミノ 酸配列を種々の実験に用いた。
[0009] 本発明の別の特徴は、請求項 1記載のペプチドを抗原として得られた抗体がモノク ローナル抗体であることを特徴とする抗体である。請求項 1のアミノ酸配列（a)を有す るペプチドを抗原として用いることによって、 rckZp54蛋白質に特異的に反応性を 有する抗体が得られた。
[0010] 本発明の別の特徴は、請求項 2又は 3で得られた抗体を用いることを特徴とする各 種細胞の増殖及び分化を検査する方法である。請求項 1のアミノ酸配列（a)を有する ペプチドを抗原として用いることによって、 rckZp54蛋白質に特異的に反応性を有 するモノクローナル抗体が得られた。
[0011] 本発明の別の特徴は、請求項 2又は 3で得られた抗体を含有することを特徴とする 各種細胞の増殖及び分ィ匕を検査するキットである。
[0012] 本発明の別の特徴は、請求項 2又は 3で得られた抗体を用いることを特徴とする精 子の増殖及び分化を検査する方法である。
[0013] 本発明の別の特徴は、請求項 2又は 3で得られた抗体を含有することを特徴とする 精子の増殖及び分ィ匕を検査するキットである。
[0014] 本発明の別の特徴は、請求項 2又は 3で得られた抗体を用いることを特徴とする不 妊症の診断方法である。
[0015] 本発明の別の特徴は、請求項 2又は 3で得られた抗体を含有することを特徴とする 不妊症診断用のキットである。
発明の効果
[0016] rckZp54蛋白質のアミノ酸配列より、 STARTENPVI (1-10)のアミノ酸配列を有する ペプチドを抗原として免疫した結果、 rckZp54蛋白質に特異的に反応性を有する 抗体が得られた。この抗体を用いて、種々の細胞の増殖及び分化の段階を検出する ことが出来る。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]図 1は rckZp54蛋白質のウェスタンブロット法による抗 rckZp54抗体との反応 を示す。
[図 2]図 2は、蛍光抗体法による卵巣における rckZp54蛋白質の検出とその局在を 示す。
[図 3]図 3は、蛍光抗体法による精巣における rckZp54蛋白質の検出とその局在を 示す。
[図 4]図 4は、蛍光抗体法による副睾丸における rckZp54蛋白質の検出とその局在 を示す。
[図 5]図 5は、 rckZp54蛋白質の発現量に及ぼすプロゲステロン投与の影響を調べ た結果を示す。
[図 6]図 6は、受精と rckZp54遺伝子の発現量の関係を調べた結果を示す。 [図 7A]図 7Aは、 Con— A処理細胞における細胞の増殖を調べた結果を示す。
[図 7B]図 7Bは、 Con— A処理細胞における rckZp54蛋白質の発現を調べた結果 を示す。
[図 8A]図 8 Aは、 TP A処理細胞における U937細胞の増殖を調べた結果を示す。
[図 8B]図 8Bは、丁？八処理細胞にぉける11937細胞のじ038の発現を示す。
[図 8C]図 8Cは、丁？八処理細胞にぉける11937細胞の1^1^7 54蛋白質の発現を調 ベた結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
ペプチドの合成
本発明のペプチドの合成はよく知られている方法、例えば、連続するアミノアシル基 を 2つずつ順次所定の順序で縮合させる力、あるいはアミノアシル基と予め形成され 既に数個のアミノアシル基を有するフラグメントとを適当な順序で縮合させるカゝ、ある いはこのように予め形成された数個のフラグメントを縮合させることにより合成すること により得ることが出来る。その際、通常ペプチド結合が形成される一方のァミン官能 基と他方のカルボキシル基 (あるいはその反対）以外、これらのアミノアシル基又はフ ラグメントが有する全ての反応性官能基を、特にカルボキシル官能基の活性ィ匕後に お!、ては、ペプチド合成で公知の方法に従って予め保護しておくように注意を払う。 又、カルボジイミドタイプ、例えば 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル) カル ポジイミドなどの通常のカップリング試薬を使用するカップリング反応を使用することも 出来る。使用されるアミノアシル基力 さらにァミン官能基 (例えばリジンの場合)るい は別の酸官能基 (例えばグルタミン酸の場合)を有する場合、これらの官能基は、例 えばアミン官能基にっ ヽてはカルボべンゾォキシある 、は t ブチルォキシカルボ- ル基により保護され、カルボキシ官能基にっ ヽては t ブチルエステル基で保護され る。これらの操作は、他の任意の反応性官能基の保護と同様である。例えば、使用さ れるアミノアシル基 (例えばシスティンの場合、ァセトアミドメチル基あるいはパラメトキ シベンジル基を使用することができる。アミノ酸ごとに漸進的に合成する場合には、合 成は、 C 末端アミノ酸と、所望の配列における隣接のアミノアシル基に対応するアミ ノ酸との縮合により開始させ、一つひとつ段階的に N—末端アミノ酸に至るまで続け るのが好ましい。
[0019] 本発明のペプチドの別の好ましい合成方法として、 R. D.メリフィールドによる固相 ペプチド合成法が挙げられる。メリフィールドの方法は、極めて多孔性の重合体榭脂 が使用され、それにペプチド鎖の最初の C 末端アミノ酸が固定される。このアミノ酸 は、榭脂にそのカルボキシル基を介して固定され、そのアミン官能基は、例えば tーブ チルォキシカルボ-ル基などにより保護されている。最初の C 末端アミノ酸力 この ように榭脂に固定されると、ァミン官能基の保護基は、酸で榭脂を洗浄することにより 除去される。ァミン官能基の保護基が t ブチルォキシカルボニル基である場合には 、榭脂をトリフルォロ酢酸で処理することにより除去することが出来る。次いで、第 2の アミノ酸がカップリングされ、これは C 末端アミノアシル基力 鎖に固定された最初の C-末端アミノ酸の脱保護されたァミン官能基に至る所望の配列の、第 2のアミノアシ ル基を与える。好ましくはこの第 2のアミノ酸のカルボキシル基は、例えばジシクロへ キシルカルポジイミドにより活性ィ匕され、ァミン官能基は、例えば t プチルォキシカル ボ-ルにより保護されているのがよい。このようにして、所望のペプチド鎖の第 1の部 分が得られ、それは 2つのアミノ酸よりなり、その末端アミン官能基は保護されている。 前記と同様にァミン官能基を脱保護し、次いで第 2の C 末端アミノ酸の付加の条件 と同様な条件下で、第 3のアミノアシル基の固定ィ匕を行うことが可能となる。このように して、次々と、ペプチド鎖を構成するアミノ酸を、既に形成された榭脂に付着している ペプチド鎖の一部分の、毎回予め脱保護されたァミノ基に固定する。所望のペプチド 鎖が全部形成されると、ペプチド鎖を形成する異なったアミノ酸の保護基を除去し、 ペプチドを榭脂から例えばフッ化水素酸を用いて脱着して所望のペプチドを得ること が出来る。
[0020] 抗体の調製
ポリクローナル抗体の調製は、上記のようにして得られた rck/p54の部分配列のぺ プチド 100 μ g/bodyを等量のコンプリートアジュバントと混合して 5匹のゥサギに 2週 間おきに 4回免疫した。最終免疫 1週間後常法に従って、充分な力価の抗血清を産 生したゥサギの全血液を採取し、続いてこれを 37°Cにて 1時間、その後 4°Cにて一夜 放置し、 3000r.p.m.で遠心分離することにより血清を得て、これをァフィユティーカラ ムクロマトグラフィーにより吸着、脱離して精製後、抗 rckZp54ポリクローナル抗体を 得た。
[0021] 本発明で得られた rck/p54の部分配列のペプチドを用いてモノクローナル抗体を 得る方法は、公知の方法に従って得ることができる。すなわち、免疫するための哺乳 動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、羊、山羊等が例示できる。これらの うちでもマウスまたはラットが取り扱いやすく好ましい。免疫に際しての抗原の投与経 路は特に限定されない。例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内等の何れの経路でも 投与することが出来る。具体的には、例えば BALB/cマウスにペプチド抗原を数日一 数週間おきに数回投与する。投与量は一匹当たり、一回につき 0. 1 /^—100 /^を 投与する。このように免疫されたマウスより脾臓を摘出し、遠心分離により脾臓細胞を 得る。この細胞は増殖力がないので、自己増殖力を有する細胞と融合させる。自己 増殖力を有する細胞としては、ミエローマ細胞等のリンパ球様細胞が望ましい。ミエ口 一マ細胞としては、抗体産生細胞を得た動物と同種のもので抗体を分泌しな 、ミエ口 一マ細胞を用いるのが好ましい。力かるミエローマ細胞としては、例えばマウスミエ口 一マ細胞の場合、 Sp2Z0— aql4、 P3/NSl/l-Aq4-l, P3X63Aq8U. 1等が 例示できる。抗体産生細胞とミエローマ細胞等との融合は、常法に従い、例えばこれ らの細胞をポリエチレングリコール等の細胞融合剤を含む溶液 (または懸濁液)で処 理することにより実施できる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の使用割合は、細胞数 比で約 3： 1— 10： 1とするのが好ましい。
[0022] 得られた融合細胞を限界希釈法により分離し、分離した融合細胞を増殖させ、マイ クロプレート上の各ゥエルにぉ 、て産生される抗体を、本発明ペプチドを固相化した プレートを使用してエライザ法によって抗体産生の高い細胞を選別する。さらに免疫 組織染色法によって、 rck/p54蛋白質との反応性を調べ、反応性の高い所望の抗 体を産生するハイプリドーマを得ることができる。このようにして得られたノヽイブリドー マ細胞は適当な培地を用いて培養して得られる培養上清、あるいはマウス等の腹腔 内に接種した腹水、血清等から、モノクローナル抗体を得て、これを硫安分画、ィォ ン交換クロマトグラフィー、プロテイン A等を用いるァフィ-ティクロマトグラフィー等に より容易に精製抗体を得ることができる。 [0023] 抗体を用いた rck/p54蛋白質の測定
上記のようにして得られた抗体を用いて、 rckZp54蛋白質との反応性をウェスタン プロット法により調べた結果を図 1に示す。すなわち、定法にしたがって、卵巣と精巣 、副睾丸等の組織抽出検体 1 μ gにドデシル硫酸ナトリウム（SDS)等の変性剤を加 えた後、 10%のポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。電気泳動後、ナイロンメン ブランに転写した後、抗体の 3000倍希釈液を用いて可視化することによって、 rck/ p54蛋白質のみを検出することができた。
[0024] さらに、 rckZp54蛋白質の卵巣での局在性、あるいは分化段階における発現を検 討した結果を図 2に示す。卵巣の免疫組織染色は組織切片の載ったプレートを内因 性ペルォキシダーゼをブロックするため、 30%H Oとメチルアルコールを 1対 100の
2 2
割合で混合させたもので 20分間処理する。次いで、 PBS (生理食塩水）にて 3回洗 浄し、 1%BSA (牛血清アルブミン）を含む PBSで 10倍に希釈した正常馬血清でイン キュペートした後、抗体をカ卩えた。抗体は 1%BSAを含む PBSで 3000倍に希釈した ものを使用した。室温で 1時間あるいは 4°Cで一晩放置した後、 PBSで 3回洗浄した 。次いで、ペルォキシダーゼが結合したアビジン一ピオチン結合物を加えた。濃度は PBSにて 1000倍に希釈したものを、加える少なくとも 30分前に調製する。室温で 30 分間反応させた後、 PBSで 3回洗浄を行った。発色は、 0. 2Mトリスァミノメタン 25ml 、 0. 2N塩酸 19. 2mlに蒸留水をカ卩えて 1000mlとしたものに、ジァミノベンチジン塩 酸塩 20mgを溶解させて、さらに、 H Oを 0. 03mlをカ卩えた。上記の液にプレートを
2 2
7分間反応させた、その後、発色を停止した。核染色はへマトキシリンで行った。ここ で rckZp54蛋白質は卵細胞で多く染まっている。特に、細胞質に多く染まっている ことが認められる。一番表面にある卵母細胞が濾胞を作り、分ィ匕してゆくが、排卵前、 幼若細胞は中の方に存在しており、排卵をすると白体となる。この結果、 rckZp54蛋 白質は卵細胞に高発現して 、ることが明らかである。
[0025] 図 3は、図 2と同様の手法で精巣における rckZp54蛋白質の局在性、あるいは分 化段階における発現を検討した結果を図 3に示す。この結果、抗体と反応した rck/p 54蛋白質は精巣細胞における局在性を示している。
[0026] 図 4は、図 2と同様の手法で副睾丸における rckZp54蛋白質の局在性、あるいは 分化段階における発現を検討した結果を図 4に示す。この結果、抗体と反応した rck /p54蛋白質は副睾丸細胞における局在性を示している。この結果、精祖細胞に高 発現し、精子の手前から核に出現し、幼若力も成熟に従って、細胞質から核に移行 することを示している。さらに、精巣上体は精子がさらに成熟すると核に高発現してい る。
[0027] 図 5は、馬血清力も分離した発情期にでるホルモン（PMSG ;プロゲステロン）をマウ スに投与した場合の rckZp54蛋白質の変化を示している。 rck/p54蛋白質はプロ ゲステロン投与によって、有意に増加していることを示す。この結果、 rck/p54蛋白 質はホルモン依存性であることが分かる。
[0028] 受精した場合は図 6Aに示すように、転写産物を cDNAに変換し RCKプライマーに て PCRを検討すると、その産物は 27サイクルから加速度的に増加する。 rck/p54 はェロンゲイシヨン ファクター 1をコントロールしている。また、図 6Bに示すように、高 発現の受精卵は合体、分割、桑実胚の順に rck/p54蛋白質の発現が低下してくる。
[0029] 表 1は受精した卵に rck/p54遺伝子をマイクロインジェクションして子宮に戻すと、 胎児の死亡数の増加、出生数の減少が認められた。このように rck/p54遺伝子を導 入して rckZp54蛋白質の発現異常は受胎が異常になることを示している。
[0030] [表 1]
TGマウスの産子数の成縝
遺伝子名 インジェクション数 偽妊娠雌マウス 妊娠数 産子数 死亡数 ポジティブ数
A & B 7 0 1 3 4 3 1 2 1 2 2 0 i 0
% 9 1 . 2 3 0 . 2 9 + 4 5 . 5
R C K 6 2 4 2 8 2 2 1 0 7 2 7 5
% 7 8 + 5 1 7 . 1 2 5 , 2 6 . 3
D 3 6 0 1 8 1 8 1 0 0 1 一
% 1 0 0 2 7 . 8 1
»伝子 A , Bは、 R C Kを行う直前の遗伝子二つ、 .遗伝子0は、 直後の一つを示す,
マウスはいづれも C 5 7 B L / 6を用いた。 以上の結果から、 rckZP54蛋白質の部分配列のペプチドを用いて作成された抗 r ck/p54抗体は細胞の増殖及び分化の段階を検出するための試薬として、また、不 妊症を検出するための試薬として用いることが可能である。 [0032] 上記検出試薬の組成としては、上記抗 rck/p54抗体、すなわち、上記したポリクロ ーナル抗体又はモノクローナル抗体の少なくとも一方を含んでいればよいが、より好 ましくは、添加剤として各種の防腐剤（アジィ匕ナトリウム及びペルォキシダーゼの反応 を抑制するものは除く）、非特異的反応を抑制する試薬として、高濃度の牛血清アル ブミン、ブロックエース（雪印乳業製）、ゼラチン、スキムミルク、等を用いることが望ま しい。このような添加剤を用いることで、本発明の抗 rck/p54抗体を用いる rck/p54 蛋白質の検出方法の精度を上げることが出来るだけでなぐ検出用試薬の利便性や 保存性等を向上させることが出来る。
[0033] 細胞増殖と分化における rckZp 54発現レベル
全 RNAは RNAqueous— 4PCR(Ambion, Austin, TX, USA)を用いて単離した 。 RNAは Super Script II RAase H— reverse transcriptase (Invitorogen と oligo (dT) primer (Invitrogen)を用いて逆転写を行った。調製した cDNAは PCR 精製キット（Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製し、 PCRに使用した。 β—ァ クチンは内部標準コントロールとして用いた。 RCKのプライマーは次のものを利用し た、 T— RCKフォワードは、 5，— GGCTGGGAAAAGCCATCT— 3，； T— RCKのリ バース、 c—mycフォワード、 5，— ACATCATCATCCAGGACTG— 3，； c— mycリバ ース、 5'— TTTAGCTCGTTCCTCCTCTG— 3'。 PCRの産生量は寒天電気泳動 で展開し、そのバンドの強度をデンシトメ一ターで測定した。
[0034] 細胞培養、分化処理、 FACS、形態学的検討、細胞の生存率
ヒト末梢血リンパ球が健常ボランティアから Fico卜 paque(Amersham Biosciences AB,Uppsala,Sweden)を用いて採取された。 RPMI1640培地を用いて 8時間培養し、そ の後、細胞に Con- A(Sigma,St. Louis,MO,USA)を 15 gZml加えて 48時間刺激し た。 U937(T- lymphoma)細胞は 10%(v/v)加熱胎児牛血清（SIgma,Tokyo)と 2mM L— グルタミンを含む RPMI-1640培地中で、 95%空気と 5%の炭酸ガスを含む条件下、 3
, ロ^;しプ 。
[0035] 結果
細胞の増殖と分ィ匕における rckZp54の発現レベルを測定した。 Con— Aで末梢血 リンパ球を刺激すると、図 7Aに示すように細胞数は無処置群は増加しな力つた力 C on— A処理後 48時間では直線的に増加した。 rckZp54の発現レベルは、図 7Bの 上段に示すように顕著に増加して 、た。 RCKの全 mRNAレベルを表す T RCKの レベルも蛋白発現と相関していた。 c myc mRNAと蛋白のレベルは rckZp54の 高い発現に伴って増加していた。この結果から、 rckZp54の高い発現は成長因 子に仲介されたマイトジェン刺激に対して細胞増殖にポジティブに働 ヽて 、ることを 示している。
[0036] U937細胞をプロテインキナーゼ C (PKC)の刺激剤である TP Aで処理をした細胞 の分化における rckZp54の発現レベルについて検討した。図 8Aに示すように、生 細胞数は TP Aの処理 6時間後力 減少し、図 8Bに示すように、分ィ匕マーカーの CD 38の発現が処理 24時間後に現れた。さらに、図 8Cに示すように、 c mycの発現は TP A処理 6時間後力 減少した。 rckZ45と T RCKのレベルは処理 48時間後に著 明に減少した。
産業上の利用可能性
[0037] 以上の結果から、 rckZp54蛋白質の部分配列のペプチドを用いて作成された抗 r ck/p54抗体は細胞の増殖及び分ィ匕の段階を検出するための試薬として、また、不 妊症を検出するための試薬として用いることが可能である。

Claims

請求の範囲
[1] 以下のアミノ酸配列を有する低分子ペプチド
(a) STARTENPVI (1-10)
(b)アミノ酸配列 (a)において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れ、または、モノョード酢酸等でィ匕学修飾したアミノ酸を含むアミノ酸配列。
[2] 請求項 1記載のペプチドを抗原として得られたことを特徴とする抗体。
[3] 請求項 1記載のペプチドを抗原として得られた抗体がモノクローナル抗体であること を特徴とする抗体。
[4] 請求項 2又は 3で得られた抗体を用いることを特徴とする各種細胞の増殖及び分化 を検査する方法。
[5] 請求項 2又は 3で得られた抗体を含有することを特徴とする各種細胞の増殖及び分 化を検査するキット。
[6] 請求項 2又は 3で得られた抗体を用いることを特徴とする精子の増殖及び分化を検 查する方法。
[7] 請求項 2又は 3で得られた抗体を含有することを特徴とする精子の増殖及び分化を 検査するキット。
[8] 請求項 2又は 3で得られた抗体を用いることを特徴とする不妊症の診断方法。
[9] 請求項 2又は 3で得られた抗体を含有することを特徴とする不妊症診断用のキット。
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