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WO2005045425A1 - Método y aparato para la determinación de la viabilidad celular - Google Patents

Método y aparato para la determinación de la viabilidad celular Download PDF

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Publication number
WO2005045425A1
WO2005045425A1 PCT/ES2004/000492 ES2004000492W WO2005045425A1 WO 2005045425 A1 WO2005045425 A1 WO 2005045425A1 ES 2004000492 W ES2004000492 W ES 2004000492W WO 2005045425 A1 WO2005045425 A1 WO 2005045425A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
channel
flow
cells
gravitational field
cell viability
Prior art date
Application number
PCT/ES2004/000492
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Lluis Puignou Garcia
Ramsés SANZ JURADO
M. Teresa Galceran Huguet
Original Assignee
Universidad De Barcelona
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad De Barcelona filed Critical Universidad De Barcelona
Priority to EP04798219A priority Critical patent/EP1688740A1/en
Publication of WO2005045425A1 publication Critical patent/WO2005045425A1/es

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1429—Signal processing
    • G01N15/1433—Signal processing using image recognition
    • G—PHYSICS
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    • G01N30/0005—Field flow fractionation
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    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N2015/1486—Counting the particles

Definitions

  • This invention relates to the field of cell analysis and, in particular, to a method and an apparatus for determining cell viability.
  • the FFF allows the separation of the sample components within a narrow, tape-shaped channel, placed in a conventional liquid chromatography system.
  • the channel comprises two parallel and flat plates which experience the action of an externally generated perpendicular field.
  • the different interactions of the components of the sample with the external field allow these components to be concentrated or brought to one of the plates by means of flow lines of the carrier liquid at different speeds. Migration through the channel of the sample components at different speeds causes separation.
  • GrFFF gravitational field flow fractionation
  • flow cytometry In the area of wine production and beer production, new methods have recently been proposed for the determination of the viability of fermentation yeasts based on flow cytometry ("flow cytometry, FC)" (cf. P. Malacrino et al., “Rapid detection of viable yeasts and bacteria in wine by flow cytometry", J. Micobiol. Methods 2001, vol. 45, pp. 127-134; M. Bouix et al., “Rapid assessment of yeast viability and yeast vitality during alcoholic fermentation ", J. Inst. Brew. 2001, vol. 107, pp. 217-225). These methods are fast and a great deal of information can be obtained. However, flow cytometry is an expensive technique and requires laborious maintenance of the equipment.
  • a new method of determining cell viability is provided, using gravitational field fractionation and fluorescence detection flow, comprising the steps of: a) dispersing the sample containing the cells in a liquid carrier and stain the cells with a detectable fluorophore; b) inject the treated sample into the gravitational field and flow fractionation device 10 (cf. FIG. ⁇ 0); c) detect the cells by measuring the emitted fluorescence; and d) process the emission data to determine the number of viable cells.
  • the sample is dispersed in a carrier liquid by sonication.
  • the carrier liquid is a buffered saline solution and, more preferably, a phosphated buffered saline solution (PBS).
  • PBS phosphated buffered saline solution
  • the carrier liquid is used also as a mobile phase.
  • the method of the present invention uses as propidium iodide fluorophores ("propidium iodide", Pl), fluorescein diacetate (“fluorescein diacetate”, FDA), carboxyfluorescein diacetate (“carboxy fluorescein diacetate", cFDA) , calcein, or SYTO 13, a well-known green fluorescence dye of the nucleic acid type (cf.
  • the gravitational field and flow fractionation device 10 used to carry out the method of the invention comprises: two parallel plates 1 and 2, separated by a sheet 15 where the channel 3 is located, and joined by a rigid and undeformable mount; b) an entrance to channel 5; and c) an exit from channel 6.
  • the processing of the emission data is done with a calibration curve.
  • the calibration curve is obtained by representing the peak area versus non-viable cells corresponding to several standard solutions. More preferably, the number of viable cells per gram is calculated using the results of the non-viable cells and the concentration of the sample solutions in number of cells. The concentration data of the sample solutions can be obtained by Coulter counter.
  • the calibration curve is obtained by representing the peak area versus viable cells corresponding to several standard solutions. More preferably, the number of viable cells per gram is obtained directly from the calibration curve. Even more preferably, standard solutions have a well defined cell viability. Even more preferably, the cell viability of standard solutions is determined by combining flow cytometry and Coulter counter techniques. Accurate results of cell viability are obtained using both calibration curves, without significant differences between them.
  • the cells are yeast cells. In another specific embodiment the cells are bacteria cells.
  • the suitability of the new method was tested with several strains of commercial yeasts The validation of the method was performed by comparing the viability values obtained by GrFFF with those obtained using the flow cytometry / Coulter counter techniques. Accurate linearity (0.15-6 g / l), good repeatability (relative relative deviation (RSD): 2.4%) and detection limit low enough to detect 2 x10 4 non-viable cells were obtained.
  • the method of the present invention can be carried out with an apparatus that allows the determination of cell viability, which is also part of the present invention.
  • the apparatus is illustrated by the example of FIG. 11, and has the following parts: a) a pumping system 7; b) a storage liquid carrier compartment 8; c) a channel 9 chamber containing the gravitational field and flow fractionation device 10; d) an injection system to introduce the sample and the liquid 11; e) a fluorescence detection system comprising a flow cell 12 and a fluorescence detector 13; and f) a data acquisition and processing system 14 to obtain the results of cell viability.
  • the gravitational field and flow fractionation device 10 comprises: a) two parallel plates 1 and 2, separated by a sheet 15 where the channel 3 is located, and joined by a rigid mount and ndeformablei_b) an entrance to the channel 5; and c) a channel 6 outlet.
  • the plates 1 and 2 are made of plastic and the sheet 15 is made of polyester, polystyrene or teflon.
  • the rigid and non-deformable frame is formed by several longitudinal bars 4 and several cross bars 16. More preferably, the longitudinal bars 4 and the transverse bars 16 of the mount are made of aluminum since a more homogeneous distribution around the channel contour when pressed. Even more preferably, the output of channel 6 is connected to a flow cell 12 of a fluorescence detection system.
  • FIG. 1 is a flow cytometry pattern obtained for a standard yeast (1.40 g / l) using FDA and Pl as fluorophores.
  • the X axis shows the response of the FDA (viable cells) and the Y axis shows the response of the Pl (non-viable cells).
  • FIG. 2 is a calibration curve of a standard yeast solution.
  • the Y axis represents the peak area (PA) and the X axis the concentration of non-viable cells (NVC) of the standard that varies between 0.2 g / l and 4 g / l.
  • PA peak area
  • NVC non-viable cells
  • FIG. 3 is a flow cytometry pattern obtained for the Enoferm BDX yeast strain.
  • FIG. 4 is a flow cytometry pattern obtained for the yeast strain Uvaferm ALB.
  • FIG. 5 is a flow cytometry pattern obtained for the yeast strain Uvaferm BC.
  • FIG. 6 is a GrFFF fractogram obtained for the Enoferm BDX yeast strain.
  • FIG. 7 is a GrFFF fractogram obtained for the yeast strain Uvaferm ALB.
  • FIG. 8 is a GrFFF fractogram obtained for the yeast strain Uvaferm BC.
  • FIG. 9 is a calibration curve of a standard yeast solution.
  • the Y axis represents the peak area (PA) and the X axis the concentration of viable cells (VC).
  • FIG. 10 is a general scheme of the GrFFF If ⁇ device
  • FIG. 11 is a general scheme of the instrumentation system.
  • the samples used were commercial dry and active yeasts, which were vacuum packed and kept at 4 ° C for good preservation. Twelve types of Saccharomvces were analyzed: S. cerevisiae (Intec Red, Intec Cerevisiae, Uvaferm BM45, Uvaferm VRB, Uvaferm BC, Uvaferm ALB, Enoferm BDX, Actiflore, Bourgoblanc), S. bavanus (Intec Bayanus, Enoferm QA23) and S. uvarum (Uvaferm UVA).
  • S. cerevisiae Intec Red, Intec Cerevisiae, Uvaferm BM45, Uvaferm VRB, Uvaferm BC, Uvaferm ALB, Enoferm BDX, Actiflore, Bourgoblanc
  • S. bavanus Intec Bayanus, Enoferm QA23
  • S. uvarum Uvaferm UVA
  • FIG. 11 shows a scheme of an apparatus according to the present invention.
  • the GrFFF device used corresponds basically to that of FIG. 10. This consists of two plastic plates 1 and 2, separated by a polyester sheet 15 where the channel 3 is located, and joined by an aluminum frame composed of several longitudinal bars 4 and several cross bars 16.
  • the dimensions of the channel Tape type used were 0.0151 cm thick, 2 cm wide and 30 cm long with a dead volume of 831 ⁇ l.
  • the quantity of sample injected was 20 ⁇ l introduced into the channel by means of an injection valve (mod. 7125 Rheodyne, Cotati, CA, USA) with an injection flow of 0.2 ml / min generated by an HPLC pump (mod. 510, Waters, Milford, MA, USA) for 45 seconds.
  • the output of channel 6 was connected to a detection system comprising a flow cell 12 and a fluorescence detector 13. All experiments were carried out using a fluorescence detector (mod. FP-1520, Jasco Corporation, Tokyo, Japan) with a 1O0 gain and an attenuation 64. An isotonic saline phosphate buffer (PBS) at pH 7.4 was used as the mobile phase. The experiments were done at room temperature.
  • PBS isotonic saline phosphate buffer
  • Sample treatment Yeast samples were resuspended in PBS at pH 7.4 and sonicated for 2 minutes. The concentration of the sample was in the range of 1 to 3 g / l according to the concentration values normally used in the warehouses.
  • Pl propidium iodide
  • 960 ⁇ l of the yeast dispersion were fortified with 40 ⁇ l of the 1 mg / ml concentration solution of Pl.
  • the incubation time was 1 minute at room temperature. After this time, the samples were immediately injected into the GrFFF system to be analyzed.
  • FC Flow cytometry
  • the instrument calibration consists of an optical alignment based on the optimized signal of 10 nm fluorescent drops (Flowcheck, Epics Division, Coulter Corp., Hialeah, FL, USA). To control the stability of the instrument, time against fluorescence was used. The excitation of the sample was done with an air-cooled argon ion laser at 488 nm and 15 mW of power. The instrument was configured with the standard configuration; linear dispersion (FS) was collected, lateral dispersion (SS), green fluorescence (525 nm) for FDA and red fluorescence (675 nm) for Pl.
  • FS linear dispersion
  • SS lateral dispersion
  • Green fluorescence 525 nm
  • 675 nm red fluorescence
  • the red fluorescence emitted by Pl was collected through a 675 bandpass filter; the photomultiplier tube voltage was set to 886 V.
  • the green fluorescence was collected using a 550-pitch long-pass dichroic filter and a 525 pass-band filter; The photomultiplier tube voltage was set to 654 V. Fluorescence was plotted in logarithmic histograms.
  • Sample treatment Yeast samples were resuspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) to obtain a final concentration of 10 6 cells / ml. A 1 ml aliquot of each yeast solution was introduced into a test tube, and then the FDA was added to each test tube until a final concentration of 10 ⁇ g / ml was obtained. The incubation time was 10 minutes at room temperature. Then, a solution of Pl (1 mg / ml) was also added to each test tube until a final concentration of 40 ⁇ g / ml was obtained. Finally, 1 minute of additional incubation was applied at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the final concentration of the yeast solutions in cell numbers was obtained using a Coulter Multisizer II counter (Coulter Corp., Hialeah, FL, USA) with 256 channels and using an opening size of 70 ⁇ m. The counted range was 1.4 to 30.1 ⁇ m. Instrumental calibration was performed with 18.5 ⁇ m polystyrene latex (Coulter Electronics, Luton, UK) according to the instruction manual of the instrument.
  • Sample treatment the suspensions of active and dry yeast from 0.2 to 3.5 g / l in PBS were sonicated for 2 minutes and then diluted 1: 1000 with the specific isotonic reagent (Isoton II, Coulter Corp.) previously filtered in a 0.2 ⁇ m pore filter.
  • the analytical volume was 500 ⁇ l and all measurements were performed in triplicate at room temperature. Calibration of the fractionation method by qravitational field and flow
  • yeast solutions were prepared from a Saccharomvces cerevisiae strain at different cell concentrations.
  • the yeast strain used as a standard for calibration was a commercial yeast strain available in the active and dry yeast form, Intec Red, and the sample concentration was 0.2 to 3.5 g / l within the linearity range of the method (0.15 to 6 g / l).
  • To obtain the cell concentration and the percentage of cell viability two classic techniques were used.
  • the Coulter counter was used and the results were expressed in cells / ml. Then, the same standard was stained with FDA and Pl to obtain the percentage of cell viability by flow cytometry. As an example, FIG.
  • the GrFFF calibration was performed by injecting seven standard solutions into the system after staining them with Pl.
  • the GrFFF allowed an efficient separation of the fluorescent dead volume preventing the interference of excess fluorophore in the sample matrix.
  • the FDA was not used as a fluorophore in the GrFFF because it was not stable enough in the mobile phase.
  • a high signal due to FDA hydrolysis prevented the detection of stained cells, the calibration curve of the GrFFF system was obtained on a graph X, Y, the peak areas of the fractograms obtained by GrFFF with Pl versus the non-viable cells, calculated from FC and CC as discussed above. Peak area values are also shown in Table 1.
  • FIG. 2 shows the calibration curve obtained for the standard Intec Red yeast.
  • Table 1 Data obtained for the calibration of the GrFFF method with the strain of Intec Red yeast as standard. Pl was used as fluorophore.
  • FIG. 6 shows as an example the fractograms obtained for three commercial yeast samples, Enoferm BDX, Uvaferm ALB and Uvaferm BC analyzed by GrFFF.
  • the largest area corresponds to the yeast strain Uvaferm ALB and means that there is a high number of non-viable cells in the sample.
  • the integration of the sample peaks was performed to obtain non-viable cells / g for each sample by external calibration. Viable cells / g were calculated for each sample using non-viable cell results and CC data. Viability results were expressed as viable cells / g.
  • FIG. 3, FIG. 4 and FIG. 5 illustrate the results obtained by FC.
  • Flow cytometry shows the region of viable cells (+ FDA) and the region of non-viable cells (+ Pl). For these samples, respectively, a viability of 35.9%, 52.8% and 43.8%.
  • the Coulter counter was used and the results were expressed in cells / ml.
  • Table 2 Viable yeast data obtained with the classic flow cytometry method.
  • Table 3 Viable yeast data obtained using the GrFFF method.
  • the repeatability and detection limit expressed as the number of non-viable cells per mi were calculated.
  • the repetitiveness of the measurements with GrFFF, CC and FC was established by performing five consecutive analyzes of the Intec Red sample chosen as standard. The best repeatability was obtained for CC (0.5% RSD) and similar values were obtained for FC and GrFFF, 2.5% RSD and 2.4% RSD, respectively.
  • the detection limit of the proposed GrFFF method was calculated from the calibration curve as the lowest level of concentration that gives an area equal to the ordinate value in the origin plus three times the estimated standard deviation.
  • the value obtained was 10 6 non-viable cells / ml, corresponding to 2 x 4 4 cells injected into the GrFFF device.

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Abstract

La invención comprende un método para la determinación de la viabilidad celular y un aparato especialmente diseñado para la aplicación de este método. El método utiliza la técnica de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo ('gravitational field flow fractionation', GrFFF) con detección de fluorescencia, y es adecuado para las cepas de levaduras comerciales. Funciona adecuadamente como lo demuestra la comparación de los resultados de viabilidad celular obtenidos mediante el GrFFF con los obtenidos utilizando las técnicas de citometría de flujo y de contador Coulter. Proporciona una buena linealidad, repetitibilidad, y un límite de detección suficientemente bajo para detectar 2 x 104 células no viables. Además, el GrFFF puede ser fácilmente implementado en un sistema convencional de cromatografía de líquidos. Así, la sencillez y bajo coste del aparato lo hace ser una alternativa valiosa a los comerciales basados en técnicas de citometría de flujo y contador Coulter.

Description

Método y aparato para la determinación de la viabilidad celular
Esta invención se refiere al campo de análisis celular y, en particular, a un método y un aparato para la determinación de la viabilidad celular.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
En los últimos años ha habido un incremento en la aplicabilidad de técnicas de separación para la caracterización de muestras que van desde macromoléculas hasta micropartículas tales como células. Una de las técnicas más versátiles de separación por elución que se aplica para la caracterización de estas muestras es el fraccionamiento por campo y flujo ("field flow fractionation", FFF) (cfr. J.C. Giddings et al., "Field-Flow Fractionation-analysis of macromolecular, colloidal, and particulate materials", Science 1993, vol. 260, pp.1456-1465).
La FFF permite la separación de los componentes de la muestra dentro de un canal estrecho, en forma de cinta, colocado en un sistema convencional de cromatografía de líquidos. El canal comprende dos placas paralelas y planas las cuales experimentan la acción de un campo perpendicular generado externamente. Un flujo laminar, generado por una bomba de alta presión cuando pasa a través del canal, crea un perfil de flujo parabólico en el espesor del canal. Las diferentes interacciones de los componentes de la muestra con el campo externo permiten concentrar o llevar estos componentes hacia una de las placas mediante líneas de flujo del líquido portador a distintas velocidades. La migración a través del canal de los componentes de la muestra a diferentes velocidades produce la separación.
Pueden distinguirse diferentes tipos de técnicas de FFF según la naturaleza del campo externo aplicado. Una de estas técnicas es el fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo ("gravitational field flow fractionation", GrFFF), un tipo de FFF de sedimentación que emplea el campo gravitatorio terrestre aplicado perpendicularmente al canal. A través de los años, el GrFFF ha demostrado ser adecuado para la caracterización de micropartículas de varios tamaños y origen diferente, y de muestras vivas. Esta técnica es muy ventajosa para la clasificación celular, debido a su simplicidad, riesgo reducido de degradación de la muestra y bajo coste. En diversas áreas de la industria alimentaria, las levaduras se utilizan frecuentemente en procesos de fermentación tales como la producción de pan y derivados, la elaboración de cerveza, y la producción de productos lácteos y vino. Recientemente se han desarrollado nuevas metodologías para la caracterización de levaduras secas y activas comerciales del vino utilizando el fraccionamiento por campo y flujo (cfr. p.ej. R. Sanz et al., "Gravitational Field-Flow Fractionation for the characterisation of active dry wine yeast", J. Chromatoqr. A 2001 , vol. 919, pp. 339-347). Las mejoras más importantes en la industria de levaduras están relacionadas con el desarrollo de cepas de levaduras seleccionadas. En la elaboración de vino, la transformación del mosto en vino es esencialmente un proceso microbiológico porque las levaduras, normalmente del género Saccharomvces, generalmente conducen la fermentación alcohólica. Para monitorizar la realización de las fermentaciones basadas en levaduras, se necesita una evaluación de la calidad de la levadura y, por consiguiente, se requiere una determinación de la viabilidad celular de la levadura. Se han utilizado diversos métodos para la determinación de la viabilidad celular, tales como el teñido de azul de metileno y la evaluación de unidades de colonias formadas (cf. e.g. R. Seward et al., "The effects of ethanol, hexan-1-ol, and 2- phenylethanol on eider yeast growth, viability, and energy status; synergistic inhibition", J. Inst. Brew. 1996, vol. 102, pp. 439-443). Sin embargo, estos métodos son laboriosos, conllevan tiempos de análisis largos y están limitados por la subjetividad.
En el área de producción de vino y de producción de cerveza, recientemente se han propuesto nuevos métodos para la determinación de la viabilidad de levaduras en proceso de fermentación basados en citometría de flujo ("flow citometry, FC) (cfr. P. Malacrino et al., "Rapid detection of viable yeasts and bacteria in wine by flow cytometry", J. Micobiol. Methods 2001 , vol. 45, pp. 127-134; M. Bouix et al., "Rapid assessment of yeast viability and yeast vitality during alcoholic fermentation", J. Inst. Brew. 2001 , vol. 107, pp. 217- 225). Estos métodos son rápidos y se puede obtener una gran cantidad de información. Sin embargo, la citometría de flujo es una técnica cara y requiere un mantenimiento laborioso de los equipos. También se han aplicado métodos basados en la separación dielectroforética combinada con FFF para la separación en continuo de células viables y no viables de levaduras, pero tienen el inconveniente de que se necesita un equipo sofisticado (cfr. G.H. Markx et al., "Dielectrophoretic separation of cells: continuous separation", Biotechnoloqy and Bioen ineerinq 1995, vol. 45, pp. 337-343).
Más recientemente, se ha propuesto un método de electroforesis capilar para la determinación de la viabilidad celular de diferentes microorganismos (cfr. Daniel W. Armstrong et al., "Determination of Cell Viability in Single or Mixed Samples Using Capillary Electrophoresis Laser-lnduced Fluorescence Microfluidic Systems", Analvtical Chemistrv 2001. vol. 73, pp. 4551-4557). Sin embargo, se requiere una instrumentación cara y tiempos de análisis largos para las muestras de levaduras. Así, sería altamente deseable disponer de una técnica más económica y simple para determinar la viabilidad celular, que evite o minimice algunos de los inconvenientes anteriormente mencionados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método y un aparato específicamente diseñado para utilizar este método, los cuales superan algunos de los problemas encontrados en la técnica actual. En la invención se combinan exactitud y simplicidad manteniendo un bajo coste. Así, corno parte de la invención se proporciona un nuevo método de determinación de la viabilidad celular, utilizando el fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo con detección de fluorescencia, que comprende los pasos de: a) dispersar la muestra que contiene las células en un líquido portador y teñir las células con un fluoróforo detectable; b) inyectar la muestra tratada en el dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo 10 (cfr. FIG. Λ 0); c) detectar las células midiendo la fluorescencia emitida; y d) procesar los datos de emisión para determinar el número de células viables.
En una realización preferida, la muestra se dispersa en un líquido portador por sonicación. Preferiblemente, el líquido portador es una solución salina tamponada y, más preferiblemente, una solución salina tarnponada de fosfato ("phosphated buffered saline solution", PBS). El líquido portador se utiliza también como fase móvil. En otra realización preferida, el método de la presente invención utiliza como fluoróforos ioduro de propidio ("propidium iodide", Pl), diacetato de fluoresceína (" fluorescein diacetate", FDA), diacetato de carboxifluoresceína ("carboxy fluorescein diacetate", cFDA), calceína, o SYTO 13, un colorante de fluorescencia verde bien conocido de tipo ácido nucleico (cfr. R.P. Haughland, "Nucleic acid detection"; En M.T.Z. Spence (ed.), "Handbook of fluorescent probes and research chemicals", Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, US, 1996, pp.143-168). El fluoróforo más preferido es el ioduro de propidio.
En otra realización preferida, el dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo 10 utilizado para llevar a cabo el método de la invención comprende: dos placas paralelas 1 y 2, separadas por una lámina 15 donde está ubicado el canal 3, y unidas mediante una montura rígida e indeformable; b) una entrada al canal 5; y c) una salida del canal 6.
En otra realización preferida, el procesado de los datos de emisión se hace con una curva de calibración. Preferiblemente, la curva de calibración se obtiene representando el área de pico frente a las células no viables correspondientes a varias soluciones estándar. Más preferiblemente, el número de células viables por gramo se calcula utilizando los resultados de las células no viables y la concentración de las soluciones de la muestra en número de células. Los datos de concentración de las soluciones de la muestra pueden obtenerse por contador Coulter. También preferiblemente, la curva de calibración se obtiene representando el área de pico frente a las células viables correspondientes a varias soluciones estándar. Más preferiblemente, el número de células viables por gramo se obtiene directamente de la curva de calibración. Aún más preferiblemente, las soluciones estándar tienen una viabilidad celular bien definida. Todavía aún más preferiblemente, la viabilidad celular de las soluciones estándar se determina combinando las técnicas citometría de flujo y contador Coulter. Se obtienen resultados precisos de viabilidad celular utilizando ambas curvas de calibración, sin diferencias significativas entre ellas.
En una realización específica de la presente invención, las células son células de levadura. En otra realización específica las células son células de bacteria. La idoneidad del nuevo método se probó con varias cepas de levaduras comerciales. La validación del método se realizó comparando los valores de viabilidad obtenido por GrFFF con aquéllos obtenidos utilizando la técnicas citometría de flujo/ contador Coulter. Se obtuvo linearidad precisa (0.15-6 g/l), buena repetitibilidad (desviación relativa estándar ("relative standard deviation", RSD): 2.4%) y límite de detección suficientemente bajo para detectar 2 x104 células no-viables.
El método de la presente invención puede ser llevado a cabo con un aparato que permite la determinación de la viabilidad celular, el cual también forma parte de la presente invención. El aparato se ilustra por el ejemplo de la FIG. 11 , y tiene las siguientes partes: a) un sistema de bombeo 7; b) un compartimento de almacenamiento del líquido portador 8; c) una cámara del canal 9 que contiene el dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo 10; d) un sistema de inyección para introducir la muestra y el líquido 11; e) un sistema de detección de fluorescencia que comprende una célula de flujo 12 y un detector de fluorescencia 13; y f) un sistema de adquisición y tratamiento de datos 14 para obtener los resultados de viabilidad celular.
El dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo 10 comprende: a) dos placas paralelas 1 y 2, separadas por una lámina 15 donde está ubicado el canal 3, y unidas mediante una montura rígida e ¡ndeformablei_b) una entrada al canal 5; y c) una salida del canal 6. Preferiblemente, las placas 1 and 2 son de plástico y la lámina 15 es de poliester, poliestireno o teflon. También preferiblemente, la montura rígida y no deformable está formada por varias barras longitudinales 4 y varias barras transversales 16. Más preferiblemente, las barras longitudinales 4 y las barras transversales 16 de la montura son de aluminio ya que se obtiene una distribución más homogénea alrededor del contorno del canal cuando se aprieta. Aún más preferiblemente, la salida del canal 6 se conecta a una célula de flujo 12 de un sistema de detección de fluorescencia.
El uso de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo con detección de fluorescencia para determinar la viabilidad celular tiene la ventaja de ser mucho más económico y simple que otras técnicas conocidas en el estado de la técnica. Además, el GrFFF puede ser fácilmente implementado en un sistema de cromatografía de líquidos convencional. Puede ser aplicado a cualquier tipo de levadura y no es destructivo. Así, la facilidad y bajo coste de la fabricación del aparato de la presente invención lo hace una alternativa valiosa a los comerciales basados en citometría de flujo.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, ad itivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aq uí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 es un patrón de citometría de flujo obtenido para una levadura estándar (1.40 g/l) utilizando FDA y Pl como fluoróforos. El eje X muestra la respuesta del FDA (células viables) y el eje Y muestra la respuesta del Pl (células no viables).
La FIG. 2 es una curva de calibración de una solución de levadura estándar. El eje Y representa el área de pico (PA) y el eje X la concentración de células no viables (NVC) del estándar que varía entre 0.2 g/l y 4 g/l.
La FIG. 3 es un patrón de citometría de flujo obtenido para la cepa de levadura Enoferm BDX .
La FIG. 4 es un patrón de citometría de flujo obtenido para la cepa de levadura Uvaferm ALB.
La FIG. 5 es un patrón de citometría de flujo obtenido para la cepa de levadura Uvaferm BC.
La FIG. 6 es un fractograma de GrFFF obtenido para la cepa de levadura Enoferm BDX.
La FIG. 7 es un fractograma de GrFFF obtenido para la cepa de levadura Uvaferm ALB. La FIG. 8 es un fractograma de GrFFF obtenido para la cepa de levadura Uvaferm BC.
La FIG. 9 es una curva de calibración de una solución estándar de levadura. El eje Y representa el área de pico (PA) y el eje X la concentración de células viables (VC).
La FIG. 10 es un esquema general del dispositivo de GrFFF Ifλ
La FIG. 11 es un esquema general del sistema de instrumentación.
EXPOSICIÓN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIÓN
Muestras de levadura:
Las muestras utilizadas eran levaduras secas y activas comerciales, las cuales estaban empaquetas al vacío y mantenidas a 4 °C para su buena conservación. Se analizaron doce tipos de Saccharomvces: S. cerevisiae (Intec Red, Intec Cerevisiae, Uvaferm BM45, Uvaferm VRB, Uvaferm BC, Uvaferm ALB, Enoferm BDX, Actiflore, Bourgoblanc), S. bavanus (Intec Bayanus, Enoferm QA23) y S. uvarum (Uvaferm UVA).
Técnica de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo (GrFFF)
La FIG. 11 muestra un esquema de un aparato según la presente invención. El dispositivo de GrFFF utilizado corresponde básicamente al de la FIG. 10. Este consiste en dos placas de plástico 1 y 2, separadas por una lámina de poliéster 15 donde está ubicado el canal 3, y unidas mediante una montura de aluminio compuesta por varias barras longitudinales 4 y varias barras transversales 16. Las dimensiones del canal tipo cinta utilizado fueron 0.0151 cm de espesor, 2 cm de ancho y 30 cm de largo con un volumen muerto de 831 μl. La cantidad de muestra inyectada fue de 20 μl introducida en el canal mediante una válvula de inyección (mod. 7125 Rheodyne, Cotati, CA, USA) con un flujo de inyección de 0.2 ml/min generado mediante una bomba HPLC (mod. 510, Waters, Milford, MA, USA) durante 45 segundos. Después del tiempo de inyección se paró el flujo para permitir la relajación de las células de levadura; el tiempo de parada fue de 2 minutos. El flujo de elución fue de 0.2 ml/min. La salida del canal 6 se conectó a un sistema de detección que comprende una célula de flujo 12 y un detector de fluorescencia 13. Todos los experimentos se llevaron a cabo utilizando un detector de fluorescencia (mod. FP-1520, Jasco Corporation, Tokyo, Japan) con una ganancia 1O0 y una atenuación 64. Como fase móvil se utilizó un tampón fosfato salino isotónico (PBS) a pH 7.4. Los experimentos se hicieron a temperatura ambiente.
Tratamiento de la muestra: Las muestras de levadura se resuspendieron en PBS a pH 7.4 y se sonicaron durante 2 minutos. La concentración de la muestra estaba comprendida en el intervalo de 1 a 3 g/l de acuerdo con los valores de concentración que normalmente se utilizan en las bodegas. Para teñir las células de levadura con yoduro de propidio (Pl), 960 μl de la dispersión de levadura fueron fortificados con 40 μl de la solución de Pl de concentración 1 mg/ml. El tiempo de incubación fue de 1 minuto a temperatura ambiente. Después de este tiempo, las muestras fueron inmediatamente inyectadas en el sistema GrFFF para ser analizadas.
Técnica de citometría de flujo (FC) utilizada para un ensayo comparativo
Para comparar el método GrFFF desarrollado para la estimación de la viabilidad celular, se realizaron análisis de las mismas muestras de levadura mediante FC en combinación con los fluoróforos. Se usaron dos fluoróforos específicos, diacetato de fluoresceína (FDA) y yoduro de propidio (Pl). FDA proporciona información relativa a las células viables. Por el contrario, Pl aporta información de las células no viables. Todos los análisis se realizaron utilizando un citómetro de flujo Coulter Epics® XL (Coulter Corporation, Hialeah, Florida, USA) operando a una presión de 25,6 x 103 N/m2. El fl ujo para las levaduras se mantuvo por debajo de 900-1000 eventos por segundo, para evitar coincidencias. La calibración del instrumento consiste en un alineamiento óptico basado en la señal optimizada de gotas fluorescentes de 10 nm (Flowcheck, Epics División, Coulter Corp., Hialeah, FL, USA). Como control de la estabilidad del instrumento se utilizó tiempo frente a fluorescencia. La excitación de la muestra se hizo con un láser de iones de argón refrigerado por aire a 488 nm y 15 mW de potencia. El instrumento se configuró con la configuración estándar; se recogió la dispersión lineal (FS), dispersión lateral (SS), fluorescencia verde (525 nm) para FDA y fluorescencia roja (675 nm) para Pl.
La fluorescencia roja emitida por el Pl se recogió a través de un filtro con paso de banda de 675; el voltaje del tubo fotomultiplicador se configuró a 886 V. La fluorescencia verde se recogió utilizando un filtro dicroico de paso largo a 550 y un filtro de banda de paso a 525; el voltaje del tubo fotomultiplicador se configuró a 654 V. La fluorescencia se representó en histogramas logarítmicos.
Tratamiento de muestra: las muestras de levadura se resuspendieron en tampón fosfato salino (PBS, pH 7.4) para obtener una concentración final de 106 células/ml. Se introdujo una alícuota de 1 mi de cada solución de levadura en un tubo de ensayo, y luego se añadió el FDA a cada tubo de ensayo hasta obtener una concentración final de 10 μg/ml. El tiempo de incubación fue de 10 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadió también una solución de Pl (1 mg/ml) a cada tubo de ensayo hasta obtener una concentración final de 40 μg/ml. Finalmente, se aplicó 1 minuto de incubación adicional a temperatura ambiente.
Contador Coulter (CC)
La concentración final de las soluciones de levadura en número de células se obtuvo utilizando un contador Coulter Multisizer II (Coulter Corp., Hialeah, FL, USA) con 256 canales y utilizando un tamaño de apertura de 70 μm. El intervalo contado fue de 1.4 a 30.1 μm. La calibración instrumental se realizó con látex de poliestireno de 18.5 μm (Coulter Electronics, Luton, UK) según el manual de instrucciones del instrumento.
Tratamiento de la muestra: se sonicaron las suspensiones de levadura activa y seca desde 0.2 a 3.5 g/l en PBS durante 2 minutos y luego se diluyeron 1 :1000 con el reactivo específico isotónico (Isoton II, Coulter Corp.) previamente filtrado en un filtro de poro 0.2 μm. El volumen analítico fue de 500 μl y todas las medidas se realizaron por triplicado a temperatura ambiente. Calibración del método de fraccionamiento por campo qravitatorio y flujo
Se prepararon siete soluciones estándar de levadura a partir de una cepa Saccharomvces cerevisiae a diferentes concentraciones de células. La cepa de levadura utilizada como estándar para la calibración fue una cepa de levadura comercial disponible en la forma levadura activa y seca, Intec Red, y la concentración de muestra fue de 0.2 a 3.5 g/l dentro del intervalo de linealidad del método (0.15 to 6 g/l). Para obtener la concentración celular y el porcentaje de viabilidad celular se utilizaron dos técnicas clásicas. Para la concentración total de células se utilizó el contador Coulter y los resultados se expresaron en células/ml. Luego, el mismo estándar se tiñó con FDA y Pl para obtener el porcentaje de viabilidad celular por citometría de flujo. Como ejemplo, la FIG. 1 muestra el esquema FC obtenido para la solución estándar de Intec Red (1.40 g/l) en 2-D (eje x, respuesta FDA y eje y, respuesta Pl). En la parte izquierda está la región positiva para las células teñidas con Pl y a la derecha la región positiva para las células teñidas con FDA. Para Intec Red un 62.2% de viabilidad fue obtenido utilizando ambos fluoróforos sin diferencias significativas entre ellos. Las células no viables totales/ml y las células viables totales/ml se calcularon por combinación de los datos del contador Coulter y de citometría de flujo. Los resultados para cada estándar se muestran en la Tabla 1.
La calibración del GrFFF se realizó inyectando en el sistema siete soluciones estándar después de teñirlas con Pl. El GrFFF permitió una eficiente separación del volumen muerto fluorescente impidiendo la interferencia del exceso de fluoróforo en la matriz de muestra. El FDA no se utilizó como fluoróforo en el GrFFF porque no fue lo bastante estable en la fase móvil. Una señal alta debido a la hidrólisis del FDA impedía la detección de las células teñidas, la curva de calibración del sistema de GrFFF se obtuvo en una gráfica X,Y, las áreas de pico de los fractogramas obtenidos mediante el GrFFF con Pl frente a las células no viables, calculadas a partir de FC y CC como se ha comentado anteriormente. Los valores del área de pico se muestran también en la Tabla 1. La FIG. 2 muestra la curva de calibración obtenida para la levadura estándar Intec Red.
Tabla 1 : Datos obtenidos para la calibración del método GrFFF con la cepa de levadura Intec Red como estándar. Se utilizó Pl como fluoróforo.
Figure imgf000013_0001
Ensayo comparativo utilizando el método GrFFF y el método FC para la determinación de la viabilidad celular de las levaduras vínicas comerciales
Se analizaron varias muestras de diferentes tipos de levadura del vino activa y seca, de S. cerevisiae, S. bayanus y S. uvarum con un amplio intervalo de viabilidad, de 19% a 86%, utilizando el método GrFFF desarrollado. También se analizaron por citometría de flujo. Se analizaron once levaduras comerciales de diferentes Saccharomvces. Se utilizó yoduro de propidio (Pl) como fluoróforo. Las muestras tratadas se inyectaron en el canal GrFFF. Las FIG. 6, FIG. 7 y FIG. 8 muestran a modo de ejemplo los fractogramas obtenidos para tres muestras de levaduras comerciales, Enoferm BDX, Uvaferm ALB y Uvaferm BC analizadas por GrFFF. El área mayor corresponde a la cepa de levadura Uvaferm ALB y significa que hay un número elevado de células no viables en la muestra. Se realizó la integración de los picos de las muestras para obtener por calibración externa las células no viables/g para cada muestra. Se calcularon las células viables/g para cada muestra utilizando los resultados de las células no viables y los datos de CC. Los resultados de viabilidad se expresaron como células viables/g. Las FIG. 3, FIG. 4 y FIG. 5 ilustran los resultados obtenidos mediante FC. La citometría de flujo muestra la región de células viables (+ FDA) y la región de células no viables (+ Pl). Para estas muestras se obtuvo respectivamente una viabilidad del 35.9%, 52.8% y 43.8%. Para la concentración celular total se utilizó el contador Coulter y los resultados se expresaron en células/ml.
Se realizó también para cada muestra una determinación directa de las células viables (VC)/g mediante el GrFFF sin utilizar los datos del contador Coulter. Se utilizó una curva de calibración (FIG. 9) con la concentración de células viables obtenida a partir de los datos de FC y CC para el estándar Intec Red. Los resultados obtenidos por FC/CC se resumen en la Tabla 2. Los resultados obtenidos por ambos métodos, el GrFFF en combinación con el CC (GrFFF/CC) y los resultados directos a partir del GrFFF, se muestran en la Tabla 3.
Tabla 2: Datos de levaduras viables obtenidos con el método clásico de citometría de flujo.
Figure imgf000014_0001
Tabla 3: Datos de levaduras viables obtenidos mediante el método GrFFF.
Figure imgf000015_0001
Validación del método
Para validar el método GrFFF para la determinación de la viabilidad celular de levaduras, se calcularon la repetitividad y el límite de detección expresado como número de células no viables por mi. Se llevó a cabo una comparación estadística entre los resultados obtenidos del análisis de once cepas de levadura diferentes utilizando GrFFF y FC, ambas combinadas con CC, y los resultados directos a partir de GrFFF. En primer lugar, la repetitividad de las medidas con GrFFF, CC y FC se estableció realizando cinco análisis consecutivos de la muestra Intec Red escogida como estándar. La mejor repetitividad fue obtenida para CC (0.5 % RSD) y valores similares se obtuvieron para FC y GrFFF, 2.5% RSD y 2.4% RSD, respectivamente. Estos resultados muestran que ambos métodos, el método de referencia (FC) y el nuevo método (GrFFF), proporcionarían resultados con la misma incertidumbre (2.5% RSD) para la determinación de células no viables.
El límite de detección del método GrFFF propuesto, expresado como células no viables, se calculó a partir de la curva de calibración como el nivel más bajo de concentración que da un área igual al valor de la ordenada en el origen más tres veces la desviación estándar estimada. El valor obtenido fue de 106 células no viables/ml, correspondiendo a 2 x104 células inyectadas en el dispositivo de GrFFF. Se aplicaron dos pruebas estadísticas para comparar ambos métodos analíticos, la prueba t para medias de dos muestras pareadas y el análisis de la varianza (ANOVA dos factores con una sola muestra por grupo). Para la prueba t para medias de dos muestras pareadas la ¿.calculada (n=11 ) fue de 0.47, que fue más pequeño que el valor de la t crítica (0.05, 11), 2.23. Además, en ANOVA el valor de la F calculada para los métodos fue de 0.22, a diferencia del valor de la F crítica, el cual fue de 4.96. Ambas pruebas estadísticas indicaron que no existían diferencias significativas a un nivel de confianza del 95% entre los resultados obtenidos utilizando GrFFF y FC/CC.
Para comparar los resultados del método GrFFF directo con los obtenidos utilizando FC/CC, se aplicaron las mismas pruebas estadísticas. Los análisis estadísticos de los resultados, prueba t para medias de dos muestras pareadas (t calculada 0.68, t crítica 2.23), ANOVA (F crítica 4.96, F calculada 0.46) mostraron que no existen diferencias significativas entre el procedimiento GrFFF simplificado y el método de referencia FC/CC.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método de determinación de la viabilidad celular que utiliza la técnica de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo con detección de fluorescencia, que comprende las etapas de:
a) dispersar una muestra que contiene dichas células en un líquido portador y teñir las células con un fluoróforo detectable;
b) inyectar la muestra tratada en un dispositivo fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo (10);
c) detectar las células midiendo la fluorescencia emitida; y
d) procesar los datos de emisión para determinar el número de células viables.
2. Método según la reivindicación 1 , donde la dispersión de la muestra en el líquido portador se realiza por sonicación.
3. Método según la reivindicación 2, donde el líquido portador es una solución salina tamponada.
4. Método según la reivindicación 3, donde la solución salina tamponada es una solución salina tamponada de fosfato.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el fluoróforo se selecciona entre el grupo que consiste en ioduro de propidio, diacetato de fluoresceína, diacetato de carboxifluoresceína, calceína y SYTO 13.
6. Método según la reivindicación 5, donde el fluoróforo es ioduro de propidio.
7. Método según la reivindicación 1 , donde el dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo (10) comprende: a) dos placas paralelas (1) y (2), separadas por una lámina (15) donde está ubicado el canal (3), y unidas mediante una montura rígida e indeformable; b) una entrada al canal (5); y c) una salida del canal (6).
8. Método según la reivindicación 7, donde las placas (1) y (2) son de plástico.
9. Método según la reivindicación 7, donde la lámina (15) está hecha de un material seleccionado entre el grupo formado por poliester, poliestireno y teflon.
10. Método según la reivindicación 7, donde la montura rígida e indeformable está compuesta por varias barras longitudinales (4) y varias barras transversales (16).
11. Método según la reivindicación 10, donde las barras longitudinales (4) y las barras transversales (16) están hechas de aluminio.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 7-11 , donde la salida del canal (6) se conecta a una célula de flujo (12) de un sistema de detección de fluorescencia.
13. Método según la reivindicación 1 , donde el procesado de los datos de emisión se hace con una curva de calibración.
14. Método según la reivindicación 13, donde la curva de calibración se obtiene representando el área de pico frente a la concentración de células no viables correspondientes a varias soluciones estándar.
15. Método según la reivindicación 14, donde el número de células viables por gramo se calculan utilizando los resultados de células no viables y la concentración de las soluciones de la muestra expresada como número de células.
16. Método según la reivindicación 13, donde la curva de calibración se obtiene representando el área de pico frente a la concentración de células viables correspondientes a varias soluciones estándar.
17. Método según la reivindicación 16, donde el número de células viables por gramo se obtiene directamente de la curva de calibración.
18. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, donde las soluciones estándar tienen una viabilidad celular bien establecida.
19. Método según la reivindicación 18, donde la viabilidad celular de las soluciones estándar se determinan por combinación de las técnicas de citometría de flujo y de contador Coulter.
20. Método según la reivindicación 1 , donde las células son células de levaduras.
21. Método según la reivindicación 1 , donde las células son células de bacterias.
22. Aparato para la determinación de la viabilidad celular, que comprende: a) un sistema de bombeo (7); b) un compartimento de almacenamiento del líquido portador (8); c) una cámara (9) que contiene un dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo (10); d) un sistema de inyección para introducir la muestra y el líquido portador (11); e) un sistema de detección de fluorescencia que comprende una célula de flujo (12) y un detector de fluorescencia (13); y f) un sistema de adquisición y tratamiento de datos (14) para obtener los resultados de viabilidad celular.
23. Aparato según la reivindicación 21 , donde el dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo (10) comprende: a) dos placas paralelas (1) y (2), separadas por una lámina (15) donde está ubicado el canal (3), y unidas mediante una montura rígida e indeformable; b) una entrada al canal (5); y c) una salida del canal (6).
24. Aparato según la reivindicación 23, donde las placas (1) y (2) son de plástico.
25. Aparato según la reivindicación 23, donde la lámina (15) está hecha de un material seleccionado entre el grupo formado por poliester, poliestireno y teflon.
26. Aparato según la reivindicación 23, donde la montura rígida e indeformable está compuesta por varias barras longitudinales (4) y varias barras transversales (16).
27. Aparato según la reivindicación 26, donde las barras longitud ¡nales (4) y las barras transversales (16) son de aluminio.
28. Aparato según cualquiera de las reivindicaciones 23-27, donde la salida del canal (6) se conecta a una célula de flujo (12) de un sistema de detección de fluorescencia.
29. Dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo (10) para llevar a cabo el método de la reivindicación 1 y para la integración en el aparato de la reivindicación 21 que comprende: a) dos placas paralelas (1) y (2), separadas por una lámina (15) donde está ubicado el canal (3), y unidas mediante una montura rígida e indeformable compuesta por varias barras longitudinales (4) y varias barras transversales
(16); b) una entrada al canal (5); y c) una salida del canal (6).
30. Dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo según la reivindicación 29, donde las placas (1) y (2) son de plástico.
31. Dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo según la reivindicación 29, donde la lámina (15) está hecha de un material seleccionado entre el grupo formado por poliester, poliestireno y teflon.
32. Dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo según la reivindicación 29, donde la montura rígida e indeformable está compuesta por varias barras longitudinales (4) y varias barras transversales (16).
33. Dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo según la reivindicación 32, donde las barras longitudinales (4) y las barras transversales (16) están hechas de aluminio.
34. Dispositivo de fraccionamiento por campo gravitatorio y flujo según cualquiera de las reivindicaciones 29-33, donde la salida del canal (6) se conecta a una célula de flujo (12) de un sistema de detección de fluorescencia.
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