WO2004022766A1

WO2004022766A1 - Ｌ−αーメチルシステイン誘導体の製造方法

Info

Publication number: WO2004022766A1
Application number: PCT/JP2003/010881
Authority: WO
Inventors: Takahiro Ohishi; Hirokazu Nanba; Masanobu Sugawara; Masashi Izumida; Tatsuya Honda; Kouhei Mori; Satohiro Yanagisawa; Kenji Inoue
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2002-09-06
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2004-03-18
Also published as: EP1541692A1; US20060051846A1; JPWO2004022766A1; AU2003261774A1

Abstract

ラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントインの酵素によるＤ立体選択的加水分解を利用し、医薬品中間体として有用なＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩を安価で入手容易な原料から簡便に製造できる方法を提供する。　ラセミ体の５−ハロメチル−５−メチルヒダントインの酵素によるＤ立体選択的加水分解を利用しＬ−５−ハロメチル−５−メチルヒダントインとし、硫黄化剤との反応でＬ−５−メチル−５−チオメチルヒダントインを合成しこれを加水分解することによりＬ−α−メチルシステイン誘導体またはその塩を製造する。

Description

L一 a—メチルシスティン誘導体の製造方法技術分野

本発明は、医薬品中間体として有用な L一ひ一メチルシスティン誘導体またはその塩及びそれらの製造方法、上記 L一 α—メチルシスティン誘導体の中間体である L— 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントイン及ぴその製造方法、及び L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン及びその製造法に関する。背景技術

L_ a—メチルシスティン誘導体またはその塩の製造方法としては、以下の方法が知られている。

1) 光学活性システィンとピバルアルデヒドより得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉アルキル化による方法（特表 2000— 5 1 5 1 66号公報、 W 00 1/72702号公報および WO 01/72703号公報 (US P 6403 830、 US P 6586474、 EP 1 2658 59A2, EP 1 265860 Al)

2 ) 光学活性ァラエンとべンズアルデヒドより得られる光学活性チアゾリジン化合物への不斉チォアルキル化による方法 (T e t r a h e d r o n, 1 9 99年 , 5 5卷， 10685〜 10694頁）

3 ) 光学活性バリンとァラエンより合成される光学活性ジケトピぺラジン化合物を不斉ブロモメチル化し、得られた化合物の臭素原子をアルカリ金属アルキルチォラートで置換する方法（J. O r g. C h e m. , 1 99 2年， 57卷， 5 5 68〜 55 73頁）。

4) 2—メチルー 2一プロペン一 1ーォーノレのシャープレス不斉酸化により得られる光学活性な 2—メチルダリシドールから光学活性アジリジン化合物を合成し、これにチオールを反応させる方法（J. O r g. C h em. , 1 995年， 60卷， 790〜 79 1頁）。 5) ァミノマロン酸誘導体をアルキル化した後に、豚肝臓エステラーゼ（以下 P LEと略す）による非対称化を行い、得られた光学活性エステルをチォ酢酸アルカリ金属塩と反応させる方法（J. Am. Ch em. S o c. ， 1 993年， 1 1 5巻， 8449〜 8450頁）。

6) システィン誘導体より合成されるチアゾリン化合物のメチル化により得られるラセミ体のチアゾリン化合物をキラル HP L Cにて分離精製する方法 (S y n 1 e t t. , 1 994年， 9巻， 702— 704頁）。

しかしながら、 1) ， 2) ， 3) のいずれの方法においても、プチルリチウム等の高価な塩基を用いた低温反応が含まれ、特殊な製造設備が必要である。また、 4) の方法は工程数が長くて煩雑であり、工業的に不利である。 5) の方法では P LEを用いたジエステルの非対称化を鍵工程としているが、 P LEは大量生産が困難であるため工業的規模での安定確保は難しく、実用的とは言い難い。 6 ) の方法ではチアゾリン化合物の不斉アルキル化は知られておらず、ラセミ体のキラル HP LCによる分割が不可欠であるが、不要の鏡像異性体をラセミ化して再利用することができないために生産性が低く、工業規模での製造は有利ではない。以上のように、いずれの方法においても光学活性 a—置換システィンまたはその塩の工業的製造方法としては解決すべき課題を有している。

—方、ハロアセトンから容易に得られる 5—ハロメチルー 5—メチルヒダントインを、ヒダントイナーゼによる立体選択的な加水分解により光学活性な L一 5 —ハロメチルー 5—メチルヒダントインとし、これと硫黄化剤との反応で L一 5 —メチルー 5ーチオメチルヒダントインを合成、これを加水分解することで L一 α—メチルシスティン誘導体またはその塩の効率的なプロセスを構築できると考えられるが、ヒダントイナーゼを用いた立体選択的加水分解による 5位に 2つの異なった置換基を有する光学活性ヒダントインの効率的な製造方法、および得られたヒダントインを加水分解することによる α位に 2つの異なる置換基を有する光学活性アミノ酸誘導体の製造方法は全く知られていない。

上記に鑑み、本発明の目的は、ラセミ体の 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントインのヒダントイナーゼによる D立体選択的加水分解プロセスを利用して、医薬品の中間体として有用な L—ひ一メチルシスティンおょぴその塩を安価で入手容易な原料から簡便に製造できる方法を提供することにある。発明の要約

本発明者等は上記に鑑み、鋭意検討を行った結果、安価に入手可能なハロアセトンより容易に得られる 5 ーハロメチルー 5ーメチルヒダントインをヒダントィナーゼにより D立体選択的に加水分解し光学活性な L— 5—ハロメチルー 5 —メチルヒダントインとし、これと硫黄化剤との反応で L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントインを合成、これを加水分解することにより L— α—メチルシスティン誘導体またはその塩を得る方法を見出し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は一般式（1 ) ；

(式中、 Xはハロゲン原子を表す) で表される 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントインのラセミ体を、ヒダントイナーゼにより D立体選択的に加水分解することを特徴とする、一般式（2 ) ；

(式中、 Xは前記と同じ) で表される L— 5 —ハロメチルー 5—メチルヒダントインの製造方法に関する。また本発明は、前記式（2) で表される L— 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させることを特徴とする、一般式（3) ；

(式中、 R¹は水素原子、〜じ^の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキ基、置換基を有してもよいべンジル基、じ〜じ^のアルカノイノレ基、又は Ci〜C ₂。のアルコキシカルボ二ル基を表し、 R²、 R ³はそれぞれ独立に水素原子もしくは

のアルカノィル基を表し、互いに同じまたは異なっていてもよい）で表される L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントインの製造方法に関する。

さらに本発明は、前記式 (3) で表される L一 5—メチルー 5—チオメチルヒダントインを酸またはアルカリで加水分解し、必要に応じて窒素原子、硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（4) ；

(式中、 R¹は前記と同じ）で表される L—Q! ン誘導体またはその塩の製造方法に関する。

また、本発明は前記式（2) ；

(式中、 Xは前記と同じ) で表される L— 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントインである。

更に本発明は前記式（5) ；

(式中、 R⁴は

の直鎖または 2級、あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有してもよいべンジル基、

のアルカノィル基、又はじ丄〜C₂₀のアルコキシカルボュル基を表し、 R⁵、 R ⁶はそれぞれ独立に水素原子もしくは

のアルカノィル基を表し、互いに同じまたは異なっていてもよい）で表される L一 5—メチル一 5—チオメチルヒダントインでもある。

さらに本発明は前記式（6) ；

(式中、 R ⁷は置換基を有していても良いベンジル基、 C Cs。のアルカノィル基、または C i〜 C。。のアルコキシカルボ二ル基を表す) で示される L一ひ一メチルシスティン誘導体またはその塩でもある。発明の詳細な開示

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明では、まず、前記式（1) で表されるラセミ体の 5—ハロメチルー 5—メチルヒダントインをヒダントイナーゼを用いて D立体選択的に加水分解して、前記式（2) で表される L一 5—八ロメチルー 5—メチルヒダントインを製造するラセミ体の 5ーハロメチル一 5—メチ /レヒダントイン（1) は、例えば B u c h e r e r法により容易に取得できる。すなわち相当するハロケトンをシアン化ナトリゥムあるいはシアン化力リゥムおよび炭酸アンモニゥムと水，エタノール混合溶媒中で攪拌することにより目的とするヒダントインを合成することがでさる。

本工程で用いるヒダントイナーゼとは、 5—置換ヒダントイン誘導体を加水分解して N—力ルバモイルーひ—了ミノ酸誘導体を生成する活¾：を有する酵素である。本発明で用いる立体選択的な加水分解を触媒するヒダントイナーゼとしては、動物、植物、微生物由来のものが使用できるが、工業的な利用には微生物由来のものが好ましい。微生物としては、当該酵素の生産能力を有する微生物であればいずれも利用できるが、例えば、以下の公知の、当該酵素の生産能力を有する微生物を挙げることができる。

すなわち、細菌に属するものとしてはァセトバクター属（Ac e t o b a c t e r ) 、ァク口モノくクター属 (Ac h r omo b a c t e r) 、ァェロノクター属 ( Ae r o b a c t e r 、ァクロノクテリゥム属 (Ag r o b a c t e r i um) 、アルカリゲネス属 (A l c a l i g e n e s) 、ァノレスロバクター属（A r t h r o b a c t e r) 、バチルス属（B a c i l l u s) , ブレビパクテリゥム属（ B r e v i b a c t e r i um) 、コリ不ノクテリゥム属 (C o r yn e b a c t e r i um) 、ェンテロノくクター属 (En t e r o b a c t e r) 、エノレウイニァ属（E r w i n i a) 、ェシエリヒア属（E s c h e r i c h i a) 、クレブシェラ属（K l e b s i e l l a) 、ミクロパクテリゥム属（Mi c r o b a c t e r i um) 、ミクロコッカス属（Mi c r o c o c c u s) 、プロタミノノクター属 (P r o t am i n o b a c t e r) 、プロァヮス (P r o t e u s) 、シユードモナス属（P s e u d omo n a s) 、サノレチナ属 (S a r t i n a ) 、セラチァ属（S e r r a t i a) 、キサントモナス属（Xa n t h omo n a s) 、ァェ口モナス属（Ae r omo n a s) 、フラボバクテリゥム属（F l a v o b a c t e r i um) 、リゾビゥム属（Rh i z o b i um) など、

放線菌に属するものとしてはァクチノミセス属（Ac t i n omy c e s) 、ミコバクテリゥム属（My c o b a c t e r i um) 、ノカスレディァ属 (N o c a r d i a) 、ストレプトミセス属（S t r e p t omy c e s) 、ァクチノプラネス Jh (Ac t i n o p l a n e s) 、口ドコッカス偶 (Rh o d o c o c c u s) など、

かびに属するものとしてはァスペルギルス属（As p e r g i 1 1 u s ) 、パェシロミセス属 (P a e c i l omy c e s) 、ぺニシリゥム属 (P e n i c i 1 1 i um) など、

酵母に属するものとしてはキャンディダ属（C a n d i d a) 、ピヒア属（Ph i c h i a) 、ロードトルラ厲 (Rh o d o t o r u l a) 又はトルロプシス属（ To r u l o p s i s) などがある。

好ましくは、ァグロバタテリゥム属（Ag r o b a c t e r i um) 、バチルス属（B a c i 1 1 u s) 、シユードモナス属 (P s e u d omo n a s) 又はリゾビゥム属（Rh i _Z o b i um) に属する微生物由来の酵素が挙げられる。

さらに好ましくは、ァグロバタテリゥム■スピーシーズ (Ag r o b a c t e r i um s p. ) KNK 712 (FERM B P— 1900) 、バチルス ·スピーシーズ（B a c i l l u s s p. ) KNK 245 (FERM B P-4863) 、シユードモナス ·プチダ（P s e u d omo n a s p u t i d a) I FO 12 996、シユードモナス ■ スピーシース、 (P s e u d omo n a s s p . ) ΚΝ ΚΟ 03 A (FERM Β Ρ— 3181) 又はリゾビゥム ·スピーシーズ（Rh i z o b i um s p. ) KNK 1415 (FERM BP— 4419) 由来の酵素が挙げられる。

なお、本発明中、当該ヒダントイナーゼは酵素自体、或いは本酵素活性を有する微生物若しくはその処理物等、及ぴ本酵素活性を有する形質転換微生物或いはその処理物で用いられ得る。

ここで、微生物の処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体凍結乾燥生物体、ァセトン乾燥生物体、またはそれらの菌体の破砕物を意味する。更にそれらは、酵素自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。固定ィ匕は当業者に周知の方法である架橋法、共有結合法、イオン結合法、物理的吸着法、包括法などで行い得る。酵素の固定ィ匕に使用される支持体としては、例えば、 Du o 1 i t e A568または DS 17186 (ローム 'アンド'ハース社：登録商標）などのフエノールホルムアルデヒド陰イオン交換樹脂、 Amb e r 1 i t e I RA9 35、 I RA945、 I RA901 (ローム 'アンド■ハース社：登録商標）、 L ewa t i t OC 1037 (バイエル社：登録商標）、 D i a i o n EX- 0 5 (三菱化学：登録商標）などのポリスチレン樹脂のような各種アミンゃアンモニゥム塩あるいはジエタノールァミン型の官能基を持つ各種の陰イオン交換樹脂が適している。その他、 DEAE—セルロースなどの支持体も使用することができる。固定化酵素の好適な製造方法としては、例えば、 WO96Z20275に示す方法で行い得る。すなわち、ヒダントイナーゼ活性を有する菌株の培養液を集菌、超音波などにより菌体を破砕後、得られた酵素液に例えば陰イオン交換樹脂 Du o 1 i t e A— 568を加えて攪拌して酵素を吸着させることができる。この酵素を吸着した樹脂に例えばダルタルアルデヒドなどの架橋試薬を加えて攪拌することで架橋処理を行い、さらに安定性を向上させることもできる。これらの処理を行った後に樹脂を濾集、洗浄して固定化ヒダントイナーゼを得ることができる。

ヒダントィナーゼを効率良く高生産する高活性菌を得るためには、周知のとおり、形質転換微生物を作成することが有効である。作成方法としては、例えば W O 96/20275記載のように、ヒダントイづ "一ゼ活性を示す菌株からヒダントイナーゼ遺伝子をクローニングした後、適当なベクターとの組換えプラスミドを作成して、これを用いて適当な宿主菌を形質転換することで得られる。なお、組換え DN A技術については当該分野において周知であり、例えば、 Mo 1 e c u 1 a r C l o n i n g 2 n d E d i t i o n (C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 989) 、 Cu r r e n t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y (G r e e n e P u b l i s h i n g A s s o c i a t e s a n d W i 1 e y— I n t e r s c i e n c e) に記載されてレヽる。

このようにして得られた、ヒダントイナーゼを高生産する形質転換微生物としては WO 96/20275記載の、バチルス .スピーシーズ（B a c i l l u s s p. ) KNK 245 (FERM BP— 4863) 由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシェリヒア - コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 p TH 104 (FERM BP— 4864) 、ァグロバタテリゥム 'スピーシーズ（Ag r o b a c t e r i um s p. ) KNK 712 (FERM B P— 19 00) 由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシエリヒア 'コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 p AH1043 (FERM B P-486 5) 、又はシユードモナス ·スピーシーズ（P s e u d omo n a s s p . ) K N 003 A (FERM BP— 3181) 由来のヒダントイナーゼ遺伝子を含有するェシェリヒア ' コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 P HD 301 (FERM BP— 4866) を挙げることができる。

これら形質転換体によるヒダントイナーゼの生産、あるいは、前述のヒダントイナーゼ活性を示す菌株によるヒダントイナーゼの生産は、例えば、 WO 96 20 275記載の、通常の栄養培地を用いて培養を行えば良く、必用に応じて、酵素誘導のための処理を行うこともできる。

本発明の酵素反応は以下の方法で行うことができる。基質としては前記式（1 ) で表されるラセミ体の 5—ハロメチルー 5—メチルヒダントインを用いてヒダントイナーゼ存在下、水性媒体中で反応を行う。

基質の仕込み濃度は 0. 1%以上、 90% (w/v) 以下で溶解または懸濁した状態で反応を行い、反応温度は 10°C以上、 80°C以下の適当な温度で調節し、 p H4以上、 10以下に保ちつつ暫時静置または攪拌すればよい。また、基質を連続的に添加しうる。反応は、バッチ法または連続方式で行、得る。

本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。ヒダントイナーゼとしては、前述のごとく酵素自体、或いは、本酵素活性を有する微生物若しくはその処理物等、及び本酵素活性を有する形質転換微生物或いはその処理物で用いられ得る。水性媒体としては、水、緩衝液、これらにエタノールのような水溶性有機溶媒を含む水性媒体、あるいは、水に溶解しにくい有機溶媒、たとえば、酢酸ェチル、酢酸プチル、トルエン、クロ口ホルム、 n —へキサンなどの有機溶媒を含む水性媒体との 2層系などの適当な溶媒を用いることができる。さらに必用に応じて、抗酸化剤、界面活性剤、補酵素、金属などを添加することもできる。

以上のようにして得られた L一 5 ーハロメチルー 5—メチルヒダントインは、特に精製せずにそのまま次工程に用いることができるが、光学純度、化学純度向上のためには晶析にて精製することが好ましい。

晶析に用いる溶媒としては、例えば、酢酸ェチル，メチルアルコール，ェチルアルコール，プロピルアルコール，イソプロピルアルコール， n—ブチルアルコール， s e cーブチルァノレコール， tーブチノレアノレコーノレ，アセトン，テトラヒドロフラン，ァセトニトリル等が挙げられる。これらは、単独で使用しても 2種以上の混合溶媒として用いてもよい。なかでも酢酸ェチル，又はエタノールが好ましい。また、晶析においては、収率向上の観点から貧溶媒を併用してもよく、貧溶媒の例としてはベンゼン，トルエン, へキサン，ヘプタン，シクロへキサンが挙げられ、好ましくはへキサン, ヘプタンである。

次に、前記式 ( 2 ) で表される L _ 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させて前記式（3 ) で表される L— 5—メチルー 5—チオメチルヒダントインを製造する方法について説明する。

前記式（3 ) において、 R ¹は水素原子， C ₁〜 C ₂。の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基，置換基を有してもよいべンジル基，又は C i〜 C ₂。のアル力ノィノレ基を表わす。

。〜じ ₂。の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基としてはメチル基，ェチル基，プロピル基，イソプロピル基， n—ブチル基， s e c 一ブチル基， t _プチル基，ペンチル基，へキシル基，シクロプロピル基，シクロブチル基，シクロペンチル基，シクロへキシル基などが挙げられるが、脱保護の容易さから t—プチル基が好ましい。

置換基を有してもよいべンジル基としては、ベンジル基， o —または p—メトキシベンジノレ基， o —または！）一ヒドロキシベンジノレ基， o—または ρ —ァセトキシベンジル基， p—ニトロべンジル基， 2 , 4， 6 _トリメチルベンジノレ基， 2， 4 , 6—トリメトキシベンジル基が挙げられるが、脱保護の容易さからベンジル基または p—メトキシベンジル基が好ましい。

C i C s oのアルカノィル基としてはァセチル基，プロパノィル基，プタノィル基，ペンタノィル基，へキサノィル基などが挙げられるが、導入，脱保護の容易さからァセチル基が好ましい。

C i C z。アルコキシ力ルポ-ル基としては一般的に S (硫黄）の保護基として用いられるものであれば特に制限されるものではないが、ベンジルォキシカルボニル基， t _ブチルォキシカルボニル基が好ましい。 R ² , R ³はそれぞれ独立に水素原子もしくは C i C s。のアルカノィル基を表し、互いに同じまたは異なつていてもよい。

C i C s oのアルカノィル基としてはァセチル基，プロパノィル基，ブタノィル基，ペンタノィル基，へキサノィル基などが挙げられるが、導入，脱保護の容易さからァセチル基が好ましい。

本反応で用いる硫黄化剤としては、例えば水硫化ナトリウム、水硫化力リゥム、水硫化カルシウム、水硫化バリゥム、水硫化マグネシウム、水硫化リチウム、水硫化ルビジウム等のアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の水硫化物；水硫化アンモニゥム； t—ブチルメルカプタン等のアルキルメルカプタン；ベンジノレメルカプタン、 p —メトキシベンジルメルカプタン等のァラルキルメルカプタン；チォ酢酸力リゥム、チォ酢酸等のチオアシル化合物等が挙げられる。

工業的に安価で入手が容易であることや取り扱いの簡便さおよび反応収率が良好で硫黄原子の脱保護操作が不要であることなどの点から、水硫化ナトリゥムまたは水硫化力リゥムが望ましい。なお、チォ酢酸ゃチォ酢酸力リゥム等のチォカルボン酸又はその塩を硫黄化剤として用いた場合、窒素上にァシル基が導入されることがある。

本反応は塩基の共存下に行うことが好ましく、塩基としては例えば、水酸化ナトリゥム、水酸化力リゥム、炭酸力リゥム、炭酸ナトリゥム等が挙げられる。反応溶媒としては、使用する硫黄化剤にもより特に限定されるものではないが、例えば水硫化ナトリウムまたは水硫化カリウム等を用いる場合、水またはメチノレアノレコーノレ、ェチノレアノレコーノレ、 n—ブチノレアノレコーノレ、 t—ブチノレアノレコール、イソプロピルアルコール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド、ジェチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の非プロトン性極性溶媒の群より選ばれる溶媒を単独あるいは混合して用いることが好ましい。

得られた L一 5—メチルー 5—チオメチルヒダントイン（3 ) は、特に精製操作を行わずに次工程に使用しても良いし、化学純度向上，光学純度向上のために晶析等により精製してもよい。次に、 L一 5—メチル一 5—チオメチルヒダントイン（3 ) の加水分解について説明する。

ヒダントイン部分の加水分解は酸もしくはアル力リ性水溶液のどちらでも可能であるが、ヒダントイン（3 ) における R ¹と加水分解条件によって、加水分解後に L - a -メチルシスティンもしくはその塩が得られる場合と、更に硫黄原子の脱保護が必要となる場合がある。

例えば、 R ¹が t—プチル基の場合、アルカリ性水溶液では、更なる硫黄原子の脱保護が必要となるが、塩酸による加水分解では硫黄原子の脱 t一プチル化反応が同時に進行し L— α—メチルシスティン塩酸塩が得られることがわかった。また R ¹がァセチル基の場合には酸でもアルカリでも硫黄原子の脱ァセチル化が同時に進行し、 L - α -メチルシスティンまたはその塩が得られる。さらに R ¹がべンジル基の場合、加水分解後ナトリゥム等を用いた脱保護が必要となる酸加水分解を行う場合、酸としては特に限定されないが、例えば塩酸，硫酸，硝酸，臭化水素酸，酢酸等が挙げられ、これらを単独または混酸として用いることが好ましい。

アルカリ加水分解を行う場合、アル力リの例としては水酸化ナトリウム，水酸化バリウム，水酸化リチウム，水酸化カリウム，水酸化カルシウム、炭酸ナトリゥム、炭酸力リゥム等が挙げら、反応収率の面から水酸化ナトリゥム，水酸化力リウム，水酸化バリウム，水酸化カルシウム，水酸化リチウムが特に好ましい。加水分解の反応温度については好ましくは 7 0。 Cから 1 8 0 ° Cであり、用いた溶媒の沸点以上で反応を行う場合には耐圧反応器を用い封管中で行うことが好ましい。反応温度があまり低いと反応時間が非常に長くなり数日を要するだけでなく、ジスルフィド体が副生する傾向にあり、高すぎると他の副反応も懸念されるため、加水分解は 9 0 ° Cから 1 5 0。 Cの範囲で行うことがより好ましい。

L - 5ーハロメチルー 5—メチルヒダントインへの硫黄化おょぴ加水分解は、アルカリ水溶液中、ワンポットで行うことも可能である。

用いるアルカリ水溶液としては例えば、水酸化ナトリウム，水酸化バリウム，水酸化リチウム，水酸化カリウム，水酸化カルシウム，水酸化セシウムなどが挙げられるが、水酸化ナトリウム，水酸化カリウム，水酸化リチウムが好ましい。この場合の硫黄化剤としては、特に限定されるのもではないが、例えばべンジルメノレカブタン， p—メトキシベンジルメノレカプタン， n—プチノレメルカプタン， s e c—ブチノレメノレカブタン，プロピルメルカプタンなどが挙げられるが、ベンジルメルカプタンあるいは t一プチルメルカプタンが好ましい。

反応温度は硫黄化反応は 0。 Cから 1 0 0。 Cが好ましく、特には 2 0 ° Cから

8 0 ° Cが好ましい。続く加水分解は前記と同じく好ましくは 7 0 ° Cから 1 8 0

° Cであり、更に好ましくは 9 0。 Cから 1 5 0。 Cである。

ヒダントイン（3 ) の加水分解により L— α—メチルシスティンまたはその塩を製造する場合、ジスルフイド体が副生することがあるが、その場合副生したジスルフィド体は還元剤にて、 L - α -メチルシスティンまたはその塩に戻すことができる。還元剤としては、ジスルフィド結合を切断し得るものであれば特に限定されるものではないが、例えば亜鉛，錫，マグネシウムなどの金属あるいはホスフィン化合物が挙げられる。中でも優れた切断能を有し、しかも抽出操作での除去が容易なトリァリールホスフィン又はトリアルキルホスフィン化合物が好ましく、トリフエニルホスフィンが取り扱いの容易さ，価格の面から特に好ましい。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

(参考例 1 ) 5—メチル一 5—クロロメチルヒダントインの製造法

炭酸アンモニゥム（753 g, 6. 6mo 1 ) ，シアン化ナトリウム（135 g ， 2. 75mo 1 ) を室温で蒸留水（730mL) に溶かしエタノール（730m L) を加えた。さらにクロ口アセトン（204 g, 2. 2mo l) を加え 10分間攪拌した後、 60°Cまで加熱しそのまま一晩攪拌した。反応液を室温まで放冷後、約半分の液量まで減圧下溶媒を留去した。 30 w t %水酸化ナトリゥム水溶液約 4 00 gを加え pHを 12に調整し、トルエンで洗浄した（1. 5 LX2) 。氷冷下、濃塩酸 700 gを加え pHを 7とし、酢酸ェチルにて抽出した（2LX 2) 。得られた有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥した後に減圧下濃縮し、白色固体 1 98. 5 gを得た。 HP LC分析（カラム： COSMOS I L 5 C 8 (ナカラィ社製），移動相：ァセトニトリル/ 10 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 30 /10, 流速： 0. 8m l / i n，検出波長： 210 n m，カラム温度： 40°C ) の結果、この白色固体は上記表題化合物を 1 92. 5 g (1. 2mo 1 ) を含有していた（収率 54%) 。この白色固体は精製することなく次の工程に使用した。 aH NMR (300MHz, D₂〇） 6 ： 3. 86 (d, 1 H) , 3. 75 ( d， 1 H) ， 1. 51 ( s， 3H) 。

(実施例 1) L— 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントインの製造法

WO 96/20275記載の培養方法と固定ィヒ酵素の調製方法に従い、バチルス s p. ]^1：245株（ £1^^ B P— 4863) を培養、集菌後、超音波破砕して得た酵素液に固定化用担体である陰イオン交換樹脂、 Du o 1 i t e A -568を添加して酵素を吸着させ、さらにダルタルアルデヒドで架橋処理することで固定化ヒダントイナーゼを得た。

次に、参考例 1で得たラセミ体の 5—クロロメチル一 5—メチルヒダントイン粗結晶 9. 1 g (83. 6 w t %) に水 9 lmlと 0. 5 M硫酸マンガン水溶液 0. 18 m 1を加え 20 w t %水酸化ナトリウム水溶液により p H 8. 7に調整した溶液に、上記の様にして得られた固定化ヒダントイナーゼ 32 g (湿重量）を加えて、 45 °C、 25時間攪拌して反応させた。反応中は 20 w t %水酸化ナトリウム水溶液により pHを 8. 7に保った。反応終了後、固定化ヒダントイナーゼをろ別、洗浄して得られた濾液を 6 N塩酸により p H 7に調整した後、等量の酢酸ェチルで二回抽出した。得られた酢酸ェチル層に無水硫酸ナトリウム 80 gを添加して乾燥させた後、減圧濃縮乾固して 3. 35 gの 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントインを取得した。

これを H PLC分析（カラム： CH I ROB I OT I C T (アドバンスド ' セパレーシヨン 'テクノロジーズ■ィンク社製） 2本連結，移動相：水/ェチルァルコール = 9Z1 , 流速： 0. 3m l /m i n，検出波長： 210 nm, カラム温度： 40 °C) した結果、化学純度は 91. 8 w t %_N 光学純度は 97. 0 % e e、ヒダントイン収率は 40. 5%であった。

また、得られた光学活性ヒダントインが L体であることを、実施例 8から 24に示す方法でメチルシスティンに誘導して旋光度を測定することで確認した。

(実施例 2 ) L—5—クロロメチル一 5—メチルヒダントインの製造法

ァグロバタテリゥム _{s p}. KNK712株（FERM BP— 1900) を固体培地（10 gノ 1 ポリペプトン、 l O g/1 肉エキス、 5 gZl ィーストエキス、 15 gZl、 pH7. 5) で 30°C、 48時間培養した。この菌体一白金耳を、 500m 1容坂ロフラスコに入れ 120°Cで 15分間殺菌した 50 m 1の液体培地（l O g/1 ポリペプトン、 10 g/ 1 肉エキス、 5 g/1 ィーストエキス、 pH7. 5) に植菌して 30°C、 24時間振とう培養した。次に、この培養液 1 m 1を、上記液体培地に 1 g / 1 ゥラシル、 20 m gノ 1 塩化マンガンを加えた液体培地に植菌し、 30°Cにて 24時間振とう培養した。この培養液 1 5 m 1から遠心分離により得られた菌体を 1. 5 m 1の 0. 1 M炭酸緩衝液 ( p H 8. 7) に懸濁し、ラセミ体の 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントイン 45m gと 0. 1 M硫酸マンガン水溶液 0. 015mlを添カ卩し、 10 N水酸化ナトリウム水溶液により p Hを 8. 7付近に保ち、 40 °Cで 26時間攪拌して反応させた。反応液を HP LC分析（カラム： COSMO S I L 5 C 8— MS (ナカライ社製 ) ，移動相：ァセトニトリル Z 10 mMリン酸ニ水素力リゥム水溶液 = 5/95，流速： 0. 8m 1ノ m i n，検出波長： 210 nm，カラム温度： 40°C) した結果、ヒダントインの残存率は 39%であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度を H PLC分析（実施例 1記載の分析条件）したところ 92. 7%e eであり、また、実施例 1で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較から L 体であることを確認した。

(実施例 3 ) シユードモナス属細菌を用いた L—5—クロロメチルー 5—メチルヒダントインの製造法

シユードモナス -プチダ（P s e u d omo n a s p u t i d a ) I FO 12

996を固体培地（ 10 g / 1 ポリペプトン、 2 g/ l イーストエキス、 1 g /\ 硫酸マグネシウム七水和物、 15 gZl 寒天、 pH7. 0) で 30°Cにて 24時間培養した。この菌体一白金耳を、 500m 1容坂ロフラスコ中、 120°C で 15分間殺菌した 100 m 1液体培地（ 20 g / 1 肉エキス、 6 g 1 ダリセロール、 1 g/l ゥラシル、 2 g/l リン酸二水素カリウム、 l g/1 硫酸マグネシゥム七水和物、 4 Omg/ 1 塩化カルシゥムニ水和物、 2 Omg/ 1 硫酸第一鉄七水和物、 20 m g Z 1 硫酸マンガン四〜六水和物、 20 m _g / 1 硫酸銅五水和物、 pH5. 5) に植菌し、 30°Cにて 24時間振とう培養した。この培養液 15m 1から遠心分離により得られた菌体を 1. 5m lの 0. 1 M炭酸緩衝液（pH8. 7) に懸濁し、ラセミ体の 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントイン 15mgと 0. 5M硫酸マンガン水溶液 0. 003 m 1を添加後、 10 N水酸ィ匕ナトリウム水溶液により p Hを 9. 0付近に保ちつつ、 40 °Cで 52時間攪拌して反応させた。反応液を H PLC分析（実施例 2記載の分析条件）した結果、ヒダントインの残存率は 70%であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度を HPLC分析（実施例 1記載の分析条件）したところ 26. 7%e eであり、また、実施例 1で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較から L体であることを確認した。

(実施例 4 ) バチルス属細菌を用いた L一 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントインの製造法

バチルス s p. KNK245株（FERM B P— 4863 ) の乾燥保存菌体を、 50 Om 1容坂ロフラスコ中、 120°Cで 15分間殺菌した 10 Om 1液体培地（l O gZl ポリペプトン、 l O gZl 肉エキス、 5 gZl イーストェキス、 pH7. 5) に植菌し、 45°Cにて 15時間振とう培養した。この培養液 2 m 1を、上記培地成分に更に 1 g / 1 ゥラシル、 2 Omg Ί 塩化マンガンを加えた培地に植菌し、 45 °Cにて 24時間振とう培養した。この培養液 15 m 1力ら遠心分離により得られた菌体を 1. 51111の0. 1M炭酸緩衝液（pH8. 7) に懸濁し、ラセミ体の 5—クロロメチル一 5—メチルヒダントイン 1 5mgと 0. 5 M硫酸マンガン水溶液 0. 003mlを添加後、 10 N水酸化ナトリウム水溶液により pHを 9. 0付近に保ちつつ、 40 °Cで 52時間攪拌して反応させた。反応液を H PLC分析 (実施例 2記载の分析条件) した結果、ヒダントインの残存率は 74%であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度を H PLC分析（実施例 1記載の分析条件）したところ 30. 7%e eであり、また、実施例 1で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較から L体であることを確認した。

(実施例 5 ) リゾピウム属細菌を用いた L—5—クロロメチル一 5—メチルヒタ" ントインの製造法

リゾビゥム s p. KNK 1415株（FERM BP— 441 9) の乾燥保存菌体を、 50 Om 1容坂ロフラスコ中、 120°Cで 15分間殺菌した 10 Om 1 液体培地（l O gZl ポリペプトン、 l O g/1 肉エキス、 5 g/l ィーストエキス、 pH7. 5) に植菌し、 30°Cにて 18時間振とう培養した。この培養液 lm 1を、上記培地成分に更に 1 gZ 1 ゥラシル、 2 Omg/ 1 塩化マンガンを加えた培地に植菌し、 30 °Cにて 24時間振とう培養した。この培養液 15m 1から遠心分離により得られた菌体を 1. 5 m 1の 0. 1 M炭酸緩衝液 (pH8. 7) に懸濁し、ラセミ体の 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントイン 15mgと 0. 5 M硫酸マンガン水溶液 0. 003m lを添加後、 10 N水酸化ナトリウム水溶液により p Hを 9. 0付近に保ちつつ、 40 で 32時間攪拌して反応させた。反応液を HP LC分析（実施例 2記載の分析条件）した結果、ヒダントインの残存率は 54%であった。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度を HP LC分析 ( カラム： CH I ROB I OT I C T (アドバンスド 'セパレーシヨン 'テクノ口ジーズ ·ィンク社製、 2本連結）、移動相： 0. 036Mリン酸ニ水素力リウム Zリン酸水溶液 pH2. 2、流速： 0. 5m 1 /m i n、検出波長： 210 nm 、カラム温度： 40°C) したところ 22. 5°/oe eであり、また、実施例 1で得られたヒダントインとのリテンシヨンタイムの比較から L体であることを確認した。

(実施例 6) シユードモナス S P . KNK003 A株（FERM BP— 3 181) を用いた L一 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントインの製造法シユードモナス s p. KNKO 03 A株（FERM B P— 3181 ) の乾燥保存菌体を、 50 Om 1容坂ロフラスコ中、 120°Cで 15分間殺菌した 100 m 1液体培地（ 10 g Z 1 グリセリン、 5 g/ l グルコース、 0. 3 g/ 1 イーストエキス、 3. 5 g/ l リン酸二水素カリウム、 3. 5 g/1 リン酸水素ニナトリウム、 0. 5 g/1 硫酸マグネシウム七水和物、 0. 02 g/1 塩化マンガン四水和物、 0. O l gZ l 硫酸鉄七水和物、 l g/1 炭酸カルシゥム、 3 gZl N—カノレバモイノレ一 D—ァラニン、 pH7. 0、ただしグノレコースと N—力ルバモイル一 D—ァラニンは他の成分を加熱殺菌後、ろ過滅菌して添加）に植菌し、 45 °Cにて 46時間振とう培養した。この培養液 40 m 1力ら遠心分離により得られた菌体を 1. 5m lの 0. 1M炭酸緩衝液（pH8. 7) に懸濁し、ラセミ体の 5—クロロメチル一5—メチルヒダントイン 15mgと 0. 5M硫酸マンガン水溶液 0. 003mlを添加後、 10 N水酸化ナトリウム水溶液により p H を 9. 0付近に保ちつつ、 45 °Cで 24時間攪拌して反応させた。反応液を HP L C分析（実施例 2記載の分析条件）した結果、ヒダントインの残存率は 54%であつた。さらに、反応液中ヒダントインの光学純度を H P L C分析（実施例 5記載の分析条件）したところ 65. 8 °/o e eであり、また、実施例 1で得られたヒダントインとのリテンションタイムの比較から L体であることを確認した。

(実施例 7 ) L— 5—メチルー 5—クロロメチルヒダントインの精製法

実施例 1の様にして得られた未精製 L— 5—メチルー 5—クロロメチルヒダントイン（68. 85 g) をエチルアルコール（1 37. 7mL) に溶かした後、 60° Cに加熱した。へキサンを内温が 60°Cより低くならないように注意しながら、白色の濁りが消えなくなるまでゆっくりと適下した（へキサン使用量： 105mL) 後、 _20°Cまで徐々に冷却しそのまま一 20。Cで一晚攙拌した。析出した白色結晶をろ別、メチルアルコールの 5 w t %へキサン溶液（ 250 g ) にて洗浄することにより表題化合物を化学純度 94. 6%, 光学純度 98. 3 % e eで得た（晶析回収率 94. 7%) (参考例 1記載の分析条件にて分析）。

(実施例 8) L— 5—メルカプトメチルー 5—メチルヒダントインの製造法

L— 5—クロロメチル一 5—メチルヒダントイン（1 5. 0 g, 化学純度 87 w t %, 光学純度 98. 3 % e e , 80 mm o 1 ) ，水硫化ナトリウム（60 g，純度 70 w t %) を蒸留水 150 gに溶解させ、窒素雰囲気下、 1. 5時間還流させた。室温まで放冷後、氷冷下、濃塩酸で pH=lとし、酢酸ェチルにて抽出した（ 50 OmL X 4) 。得られた有機層を無水硫酸ナトリゥムで乾燥させた後に減圧下で濃縮し、白色固体 14. 8 gを得た。 HPLC分析 ( カラム： COSMOS I L C 18 -AR (ナカライ社製），移動相：リン酸ニ水素力リウム · リン酸水溶液 ( p H 2. 0) /ァセトニトリル= 97/3, 流速： 1. 0m l /m i n，検出波長： 210 nm，カラム温度： 30°C) の結果、この白色固体は上記表題化合物を 1 1. l g (64. 5mmo 1 ) を含有していた（化学純度 75. 0%, 収率 8 0. 7%) 。

τΗ NMR (300MH z， D₂0) S ： 3. 52 (d, 1 H) , 3. 32 ( d , 1 H) , 1. 40 ( s， 3 H) 。

(実施例 9) L— 5—メルカプトメチルー 5—メチルヒダントインの精製法

L— 5—メルカプトメチルー 5—クロロメチルヒダントイン（2. 04 g, 化学純度 83. 6%, 光学純度 96. 1 % e e ) を酢酸ェチル（40mL) に 60。で溶かし、へキサンを白色の濁りが消えなくなるまでゆつくりと適下した（へキサン使用量： 90mL) 。 0。Cまで徐々に冷却しそのまま 0°Cで 1時間攪拌した。析出した白色結晶をろ別、へキサン（50mL) にて洗浄することにより、表題化合物を晶析回収率 92. 4%, 化学純度 91. 3%, 光学純度 98. 6 % e eで得た (化学純度は実施例 8記載の分析条件にて分析。光学純度分析条件；カラム： CH I RALPAK AS (ダイセル社製），移動相：イソプロパノール/へキサン = 3/7, 流速： 0. 5ml /m i n，検出波長： 210 n m, カラム温度： 30 °C

(実施例 10) L一 5—メチル一 5— t—プチルチオメチルヒダントインの製造

¾

L— 5—クロロメチノレ _5—メチノレヒダントイン（10. O O g, 61. 5 1m mo 1 ) を 10 w t %水酸化ナトリウム水溶液 100 gに溶解させた後、 t—プチルメルカプタン（10. 4mL, 92. 27 mm o 1 ) を加え、窒素下、 50。じで 3時間攪拌した。室温まで放冷後、反応液をトルエンで洗浄した（100mLX 3 ) 。濃塩酸を加え反応混合物の pHを 1〜2に調整し、生成する白色固体をろ過にて分離し、水で洗浄した（100mLX 3) 後、減圧下乾燥し、表題化合物を白色固体として得た（7. 79 g, 収率 58. 6%) (参考例 1記載の分析条件にて分析）。

^XH NMR (300MHz, CD₃OD) δ ： 2. 89 ( s , 2 H) ， 1. 4 6 ( s， 3H) , 1. 31 ( s， 9H) 。

(実施例 11) L一 5—メチルー 5一べンジルチオメチルヒダントインの製造法 L— 5—クロロメチルー 5—メチルヒダントイン（ 10 g , 61. 5mmo 1 ) を 10 w t %水酸化ナトリゥム水溶液 100 gに溶解させた後、ベンジルメルカプタン（1 1. 5m L, 98. 4mmo 1 ) を加え、窒素下、 50°Cで 3時間攪拌した。室温まで放冷後、反応液をトルエンで洗浄した（20mLX 2) 。濃塩酸を加え反応混合物の pHを 2. 0に調整し、生成する白色固体をろ過にて分離し、水で洗浄した後、減圧下乾燥し、表題化合物を白色固体として得た（14. 82 g, 収率 96. 3%) (参考例 1記載の分析条件にて分析）。 ^XH NMR (30 OMH z , CDC ") 5 ： 8. 61 (s， 1 H) , 7. 3 4-7. 26 (m, 5H) , 6. 06 (s , 1H) , 3. 76 (d, 1 H) , 3. 72 (d， 1H) ， 2. 79 (d， 1 H) , 2. 72 (d, 1 H) , 1. 45 ( s ， 3H) 。

(実施例 12) L- 1—N—ァセチル _ 5—ァセチルチオメチル _ 5—メチルヒダントインの製造法

L— 5—クロロメチノレ一 5—メチノレヒダントイン（5. 88 g , 34. 22mm o l , 化学純度 94. 6%, 光学純度 98. 3 % e e ) を窒素雰囲気下、ジメチルスルホキシド（ 137 g ) に溶解し、チォ酢酸力リウム（14. 05 g, 123. 0 mm o 1 ) を加え 70 ° Cで 21時間反応させた。室温まで放冷後、 10 %塩酸水溶液にて pH=6〜7に調整し、酢酸ェチルで抽出した。得られた有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、酢酸ェチルを減圧下留去することにより、オレンジ色の固体 12. 45 gを得た。 HPLC分析（参考例 1記載の分析条件にて分析）の結果、このオレンジ色固体は上記表題化合物を 5. 48 g (22. 43mmo 1 , 化学純度 44%) を含有していた（収率 65. 5%) 。

^XH NMR (30 ΟΜΗζ, CDC 1₃) δ ： 8. 61 (s， 1 H) , 7. 2 7 (s， 1H) ， 3. 92 (d, 1H) ， 3. 48 (d， 1H) ， 2. 54 (s， 3H) ， 2. 33 ( s , 3H) ， 1. 80 ( s , 3 H) 。

(実施例 1 3) L— 1— N—ァセチルー 5—ァセチルチオメチルー 5—メチルヒダントインの精製法

上記実施例で得られた L— 1—N—ァセチルー 5—ァセチルチオメチルー 5—ク口ロメチルヒダントイン（5. 48 g) を酢酸ェチル（22 g) に溶かし、 60。C に加熱した。へキサンを白色の濁りが消えなくなるまでゆっくりと適下し（へキサン使用量： 39. 2 g) 、室温まで放冷後、そのまま 20時間攪拌、続いて一 20。 Cまで徐々に冷却しー20°Cで 6時間攪拌した。析出した白色結晶をろ別、酢酸ェチルの 1 %へキサン溶液（39. 2 g ) にて洗浄することにより、表題化合物を晶析回収率 78. 3%, 化学純度 87. 1%, 光学純度 99. 1 % e eで得た（化学純度は参考例 1記載の分析条件にて分析。光学純度は H PLC分析（カラム： CH I RALCEL OD-H (ダイセル社製），移動相：へキサン Zイソプロパノール= 9/1 , 流速： 1. Oml /m i n，検出波長： 210 n m, カラム温度： 3 0°C) にて決定）。

(実施例 14) L一 2一べンジルチオメチルァラニンの製造法

L— 5—ベンジルチオメチル一5—メチルヒダントイン（5. 0 g , 2 Ommo

1) を 2規定水酸化ナトリウム水溶液（40 g) に溶解し、 100°Cで 2日間、攪拌した。室温まで放冷後、濃塩酸で pH= 7に調整し析出した白色結晶をろ別、水で数回洗浄した。減圧下、乾燥させた後、得られた白色結晶を¹ H NMR, HPL Cにて分析（参考例 1記載の分析条件にて分析）し、上記目的物であることを確認した（収率 78 %) 。

NMR (30 OMH z , N a OD/D₂0) δ 7. 28-7. 08 (m , 5 H) , 3. 71 ( s , 2H) , 2. 88 (d, 1 H) , 2. 72 (d, 1 H) ， 1. 31 ( s， 3 Ei) 。

(実施例 15) L_ 2— t—ブチルチオメチルァラニンの製造法

L- 5 - t—ブチノレチオメチノレー 5—メチノレヒダントイン（1. 00 g, 4. 6

2mm o 1 ) を 10 w t %水酸化ナトリゥム水溶液（14. 97 g) に溶解し、 1 10 ° Cで 3 B間、攪拌した。室温まで放冷後、 4 M塩酸で p H = 6. 5に調整し析出した白沈をろ別した。ろ液を濃縮し、生成した白色結晶をろ別後、水で数回洗浄した。減圧下、乾燥させた後、得られた白色結晶を¹ H NMR, HPLCにて分 , 析（参考例 1記載の分析条件にて分析）し、上記目的物であることを確認した（収率 78. 8 %) 。

^XH NMR (30 OMH z , N a OD/D₂0) δ ： 2. 65 (d， 1 H) ， 2. 63 (d， 1 H) , 1. 25 ( s , 12H) 。

(実施例 16) L- 2一べンジルチオメチノレアラ二ンの製造法

L一 5—クロロメチノレー 5—メチゾレヒダントイン（20 Omg, 1. 23mmo

1 ) を 10 w t %水酸化ナトリゥム水溶液 2. 0 gに溶解させた後、ベンジルメルカプタン（0. 23mL, 2. 0 mm o 1 ) を加え、窒素下、 50°Cで 5時間攪拌した。反応温度を 100。 Cに上げ、さらに 26時間攪拌した。 30 w t %水酸化ナトリウム水溶液を 1. 0 g加えさらに 24時間 1 00 °Cで攪拌し、 H P L C分析したところ、表題化合物が生成していることを確認した（収率 78. 0%) 。

(実施例 1 7) L- 2 - t—ブチルチオメチルァラニンの製造法

L一 5—クロロメチノレー 5—メチノレヒダントイン（50 1. 8mg, 3 · 08m mo l ) を l Ow t %水酸化ナトリウム水溶液 5. 0 3 gに溶解させた後、 t一ブチルメルカプタン（0. 5 5mL, 4. 87mmo 1 ) を加え、窒素下、 50°Cで 5. 5時間攪拌した。反応温度を 1 00 ° Cに上げ、 21時間攪拌した後、さらに 1 0 w t %水酸化ナトリゥム水溶液（ 5. 00 g ) を添加し、 2日間攪拌した。反応後に室温まで放冷、 4M塩酸水溶液で pH=6. 5に調整し析出した白沈をろ別した。ろ液を濃縮し、生成した白色結晶をろ別後、水で数回洗浄した。減圧下、乾燥させた後、得られた白色結晶を¹ H NMR, HP LCにて分析（参考例 1記載の分析条件にて分析）し、上記目的物であることを確認した（収率 5 3. 1 %) 。

(実施例 1 8) L _ α—メチシスティン塩酸塩の製造法

L- β—ベンジルチオメチルァラニン ( 1 g， 4. 44mmo 1 ) を窒素下、液体アンモニア（50mL) に溶解し一 78 °Cで金属ナトリウムを少しずつ加えた。溶液が青色を呈したら反応溶液が還流するまで温度を上げ、青色が消えるようであればさらに金属ナトリゥムを追加しながら 30分攪拌した。塩化アンモニゥムを青色が消え反応溶液が白色となるまで加え、温度を上げて液体ァンモニァを気化させることにより除去した。 2N塩酸水溶液で pH= 1〜2となるように調整し、水分を減圧下留去、得られた白色固体をさらに減圧下でー晚乾燥させた。白色固体に T I- IF (1 3mL) , エチルアルコール (6. 5mL) を加えてスラリー化し約 1 0 分間攪拌し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、得られた白色固体をさらに減圧下で数時間乾燥させた。エチルアルコール，トルエンより晶析を行い、得られた白色結晶（473mg) を¹ H NMR, HP LC (カラム： CAPCEL L PAK SCX (資生堂社製），移動相：リン酸ニ水素力リウム ' リン酸水溶液 ( pH2. 0) ノアセトニトリル =95/5, 流速： 0. 3m l /m i n，検出波長： 2 1 0 nm, カラム温度： 30°C) で分析したところ、上記目的物であることがわかった（収率 6 2. 6%) 。また旋光度を測定したところ、 [ひ] ^D ₂₀=8. 7 7 (c 1. 15， H₂0) であり、符号が文献値 (Te t r a h e d r o n, 1993 ， 49， 2131〜 2138, WO 98/38177) と一致することから立体が目的とする L体であることを確認した。

^XH NMR (30 OMH z， D₂0) 6 : 3. 18 (d, 1H) , 2. 89 ( d， lH) , l. 6 (s， 3H) 。

(実施例 19) L—ひ一メチルシスティン塩酸塩の製造法

L— /3— t—ブチルチオメチルァラニン（433. 9mg， 2. 27mmo 1 ) を濃塩酸（9mL) に溶解し、窒素下、 4時間還流させた。室温まで放冷後、水分を減圧下留去、得られた白色固体をさらに真空ポンプで減圧乾燥した。白色固体に THF (6mL) ，エチルアルコール (2mL) を加えてスラリー化し約 10分間攪拌し不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、得られた白色固体をさらに減圧下で数時間乾燥させた。エチルアルコール，トルエンより晶析を行い、得られた白色結晶（229mg) を¹ H NMR, HPLC (実施例 18記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物の塩酸塩であることがわかった（収率 58. 7%) 。

(実施例 20) L— α—メチルシスティン塩酸塩の製造法

L— 5—メルカプトメチル一 5—メチルヒダントイン（ 1. 0 g , 純度 89. 2 w t %, 光学純度 98. 6 % e e , 5. 57mmo 1 ) を濃塩酸 (20 g) に溶解し、窒素下、 60時間還流させた。室温まで放冷後、塩酸水溶液を減圧下留去し、 THF (5 OmL) , 1 N塩酸水溶液（5mL) およびトリフエニルホスフィン（ 2. 73 g) を加え、窒素雰囲気下、 50°Cで 2時間反応させた。室温まで放冷後、全体の容量が約 1 5となるまで濃縮し、酢酸ェチノレ（5 OmL X 3) にて洗浄しトリフエニルホスフィン，トリフエ二ノレホスフィンォキシド，未反応ヒダントインおよびその他の不純物を除去した。水相を減圧下濃縮、得られた白色固体をさらに減圧下、一晚乾燥させた。白色固体に THF (15. 6mL) ，ェチルアルコール（7. 8mL) を加えてスラリー化し約 10分間攪拌し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、表題化合物を白色固体として得た（879mg) ^XH NMR ， HPLC (実施例 18記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることがわかった（収率 92. 3%) 。 (実施例 21) L— α—メチルシスティン塩酸塩の製造法

L— 5—メルカプトメチルー 5—メチルヒダントイン（500mg，純度 89. 2 w t %, 光学純度 98. 6 % e e , 2. 78 mm o 1 ) を 30 w t %水酸化ナトリウム水溶液（5 g) に溶解し、窒素下、 36時間還流させた。室温まで放冷後、濃塩酸にて pH=lに調整し水分を減圧下留去した。 THF (3 OmL) ， 1N塩酸水溶液（3mL) およびトリフエニルホスフィン（1. 57 g) を加え、窒素雰囲気下、 50°Cで 2時間反応させた。室温まで放冷後、全体の容量が約 1/5となるまで濃縮し、酢酸ェチル（5 OmL X 3) にて洗浄しトリフエエルホスフィン，トリフエニルホスフィンォキシド, 未反応ヒダントインおよびその他の不純物を除去した。水相を減圧下濃縮、得られた白色固体をさらに減圧下、一晩乾燥させた。白色固体に THF (9. 3mL) , エチルアルコール（4. 7mL) を加えてスラリー化し約 10分間攪拌し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、表題化合物を白色固体として得た（348mg) ^XH NMR, HP LC (実施例 18記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることがわかった（化学純度 74. 1 %，収率 48. 0%) 。

(実施例 22) L— a—メチルシスティン塩酸塩の製造法

L一 1—N—ァセチノレー 5—ァセチノレチオメチノレー 5—メチノレヒダントイン（3 . 4 g, 13. 9mmo 1 ) を濃塩酸（ 34 g ) に溶解し、窒素下、 20時間還流させた。濃塩酸（34 g) を加えさらに 30時間反応させた。室温まで放冷後、塩酸水溶液を減圧下留去し、 THF (5 OmL) ， 1 N塩酸水溶液（ 5 m L ) およびトリフユニルホスフィン（2. 17 g) を加え、窒素雰囲気下、 50°Cで 2時間反応させた。室温まで放冷後、全体の容量が約 1Z5となるまで濃縮し、酢酸ェチノレにて洗浄しトリフエニルホスフィン，トリフエ-ルホスフィンォキシド，未反応ヒダントインおよびその他の不純物を除去した。水相を減圧下濃縮、得られた白色固体をさらに減圧下、ー晚乾燥させた。白色固体に THF (18mL) , ェチルアルコール (6mL) を加えてスラリー化し約 10分間攪禅し、不溶分をろ過にて除去した。母液を濃縮し、得られた白色固体をさらに減圧下で数時間乾燥させた。ェチルアルコール，トルエンより晶析を行い、得られた白色結晶（1. 02 g) を¹ H NMR, HPLC (実施例 18記載の分析条件）で分析したところ、上記目的物であることがわかった（収率 43. 0%) 。

(実施例 23) L— α—メチノレシスティン塩酸塩の製造法

L_5— t—ブチノレチオメチノレー 5—メチノレヒダントイン（202. 3mg, 0 . 935mmo 1 ) を濃塩酸（4mL) に溶解し、窒素下、 110でで26時間攪拌した。室温まで放冷後、水分を減圧下留去、得られた残渣を¹ H_NMR， HPL C (実施例 18記載の分析条件）で分析した結果、メチルシスティン収率 42. 5%、 L一 5—メルカプトメチル一 5—メチルヒダントイン収率 53. 7% であった。

(実施例 24) L— α—メチルシスティン塩酸塩の製造法

L一 5— t—ブチルチオメチルー 5—メチルヒダントイン（202. 5mg, 0 . 936mmo 1) を濃塩酸 (4mL) に溶解し、これを耐圧反応容器内に封管し、 150°Cで 26時間攪拌した。室温まで放冷後、水分を減圧下留去、得られた残渣を HPLC (実施例 18記載の分析条件) で分析した結果、 L_«_メチノレシスティン収率 46. 3%、 L— α—メチルシスティンのジスルフィド体収率 53. 7 %であった。

(参考例 2 ) L— a—メチルシスティン塩酸塩の光学純度決定法

実施例 18記載の方法で得られた L一ひ一メチルシスティン塩酸塩 (74. 9m ―— — g， 0. 44mmo 1 ) を水（3mL) に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（ 197 . 7mg) を添加し、エタノール 3 m Lを加えた。窒素置換後、クロ口炭酸べンジルエステル（0. 17mL, 1. 1 Ommo 1 ) を加え、室温で 2日間攪拌した。反応液に濃塩酸を添カ卩して p H= 1. 9とし、酢酸ェチルで抽出後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去した。これを PTLC (へキサン Z酢酸ェチル =1/1に少量の酢酸を添加）で精製し¹ H NMRにて分析したところ目的物（ 106mg, 収率 60 %) であることがわかった。これを HPLCにて分析（カラム： CHI RALCEL OD-RH (ダイセル社製），移動相：リン酸二水素力リウム · リン酸水溶液（p H2. 0) /ァセトニトリル =6/4, 流速： 1. Om 1 /m i η , 検出波長： 210 nm, カラム温度： 30°C，保持時間 19. 15分 (D) ， 22. 92分（L) ) した結果、光学純度は 98. 6%e eであった。 ^XH NMR (30 OMH z , D₂0) δ ： 7. 30— 7. 40 (m, 10 H) ， 5. 22 (s， 2H) ， 5. 10 ( s， 2 H) , 3. 60 (s, 2 H) ， 1. 63

(s, 3H) 。

産業上の利用可能性

本発明により、医薬品中間体として有用な L - メチルシスティン誘導体またはその塩を安価で入手容易な原料から簡便に製造することができる。

Claims

請求の範囲

一般式（1) ；

(式中、 Xはハ口ゲン原子を表す) で表される 5—ハロメチルー 5—メチルヒダントインのラセミ体を、ヒダントイナーゼにより D立体選択的に加水分解することを特徴とする、一般式（2) ；

(式中、 Xは前記と同じ) で表される L一 5—ハロメチルー 5—メチルヒダントイ

― ンの製造方法。

2. Xが塩素原子であることを特徴とする請求の範囲第 1記載の製造方法。

3. ヒダントイナーゼが、ァグロパクテリゥム属（Ag r o b a c t e r i um ) 、ノチノレス属 (B a c i 1 1 u s ) 、シュードモナス属 (P s e u d omo n a s) 又はリゾビゥム属（Rh i z o b i um) に属する微生物由来である請汆の範囲第 1又は第 2記載の製造方法。

4. ヒダントイ ^ "一ゼが、ァグロバクテリウム ·スピーシーズ（Ag r o b a c t e r i um s p . ) KNK712 (F ERM B P— 1 900) 、バチルス ·スピーシーズ（B a c i l l u s s p. ) KNK245 (FERM B P— 486 3) 、シユードモナス ·プチダ（P s e u d omo n a s p u t i d a) I FO 12996、シユードモナス · スピーシーズ (P s e u d omo n a s s p . ) KNKO 03 A (FERM B P— 3181) 又はリゾビゥム ' スピーシーズ（R h i z o b i urn s p. ) NK 1415 (FERM B P- 4419) 由来である請求の範囲第 1又は第 2記載の製造方法。

5. ヒダントイナーゼが、形質転換微生物ェシェリヒア 'コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 TH 104 (FERM B P-4864) 、ェシェリヒア ' コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 AH 1 043 (F ERM B P-4865) 、又はェシェリヒア 'コリ（E s c h e r i c h i a c o l i ) HB 101 PHD 301 (FERM BP— 4866) 由来である請求の範囲第 1又は第 2記載の製造方法。

6. 前記式 (2) で表される L_ 5—ハロメチノレー 5—メチノレヒダントインを、酢酸ェチル、メチルアルコール、ェチルァノレコーノレ、プロピルァノレコール、イソプ口ピルアルコール、 n—ブチノレアノレコール、 s e cーブチノレアゾレコ一ノレ、 t—プチルアルコール、アセトン、テトラヒドロフラン、及びァセトニトリルからなる群より選択される少なくとも 1種の溶媒を用いて晶析することにより、光学純度を向上させることを特徴とする L一 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントインの製造方法

7. 貧溶媒として、ベンゼン、トルエン、へキサン、ヘプタン、及ぴシクロへキ一サンからなる群から選択される少なくとも 1種の溶媒を併用する請求の範囲第 6記載の製造方法。

8 , 晶析に供する L _ 5—ハロメチル一 5—メチルヒダントインが、請求項 1記載の方法で製造されたものである請求の範囲第 6又は第 7記載の製造方法。

9. 前記式 (2) で表される L— 5—ハロメチルー 5—メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させることを特徴とする、一般式（3) ；

(式中、 R¹は水素原子、 Ci C ₂。の直鎖又は分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有しても良いベンジル基、 C₁〜C₂。のアルカノィル基を表し、 R²、 R³はそれぞれ独立に水素原子もしくは C C^のァルカノィル基、〜C₂。のアルコキシカルボ二ル基を表し互いに同じ又は異なっていてもよい）で表される L _ 5ーメチルー 5ーチオメチルヒダントインの製造方法。

10. 請求の範囲第 1から第 5のいずれかに記載の方法で得られた L一 5—ハロメチルー 5 _メチルヒダントインを硫黄化剤と反応させることを特徴とする、請求の範囲第 9記載の L一 5—メチル一 5—チオメチルヒダントインの製造方法。

1 1. 硫黄化剤として、アルカリ金属もしくはアル力リ土類金属の水硫化物、水硫化アンモニゥム、アルキルメルカプタン、ァラルキルメルカプタン、又はチォ酢酸もしくはそのアルカリ金属塩を用いることを特徴とする請求の範囲第 9 又は第 10記載の製造方法。

12. 硫黄化剤として水硫化ナトリゥム、水硫化力リゥム、チォ酢酸力リゥム、 t—プチルメルカプタン、ベンジルメルカプタン、又は p—メトキシベンジルメノレカブタンを用いることを特徴とする、請求の範囲第 9又は第 10記載の製造方法。

13. 請求の範囲第 9から第 1 2のいずれかに記載の方法で得られた前記式（ 3) で表される L— 5—メチル一 5ーチオメチルヒダントインを酸またはアル力リで加水分解および必要に応じて窒素原子，硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（4) ；

(式中、 R¹は水素原子， Ci Cs。の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有しても良いベンジル基、じ〜じ^のアルカノィル基、又は ₂₀のアルコキシ力ルポ二ル基を表す）で表される L一ひ一メチルシスティン誘導体またはその塩の製造方法。

14. 塩酸、硫酸、硝酸、臭化水素酸、酢酸、及びトリフルォロ酢酸からなる群より選択される少なくとも一種の酸を用いて加水分解を行う請求の範囲第 1

3記載の製造方法。

1 5. 水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシゥム、水酸化バリゥム、炭酸ナトリゥム、及び炭酸カリゥムからなる群より選択される少なくとも一種のアルカリを用いて加水分解を行う請求の範囲 1 3記載の

16. 前記式（2) で表される L— 5—ハロメチルー 5—メチルヒダントインと硫黄化剤をアルカリ水溶液中で反応させ硫黄化と加水分解をワンポットで行い、必要に応じて硫黄原子の脱保護を行うことを特徴とする一般式（4) ；

(式中、 R¹は水素原子、 Ci Cz。の直鎖または分岐あるいは環を形成していても良いアルキル基、置換基を有しても良いベンジル基、 Ci Ca。のアルカノィル基、 C 〜〇 ₂。のアルコキシカルボ二ル基を表す) で表される L一 α—メチルン誘導体またはその塩の製造方法。

1 7 . 請求の範囲第 1から第 5のいずれかに記載の方法で得られた L一 5 ロメチルー 5—メチルヒダントインを用いることを特徴とする請求の範囲第 1

6記載の製造方法。

1 8 . 前記式（4 ) において R ¹が水素原子である L一 α—メチルシスティンまたはその塩を製造するにあたり、副生したジスルフィド体のジスルフィド結合を還元剤を用いて切断することにより、 L一 α—メチルシスティンまたはその塩に変換することを特徴とする請求の範囲第 1 3から第 1 6のいずれかに記載の製造方法。，

1 9 . 還元剤がトリアルキルホスフィンあるいはトリァリ—ルホスフィンであることを特徴とする請求の範囲第 1 8記載の製造法。

2 0 . 還元剤がトリフエニルホスフィンであることを特徴とする請求の範囲第 1 8記載の製造法。

2 1 . 一般式（ 2 ) ；

(式中、 Xはハ口ゲン原子を表す) で表される L _ 5 ロメチルー 5—メチルヒダントイン。

2 2 . Xが塩素原子である請求の範囲第 2 1記載の化合物。

2 3 . 一般式（ 5 ) ；

(式中、 R⁴はじ〜。^の直鎮または 2級、あるいは環を形成していても良いアルキル基，置換基を有しても良いベンジル基， C₁〜C₂。のアルカノィル基，じ〜。 ₂。のアルコキシカルボニル基、 R⁵， R ⁶はそれぞれ独立に水素原子もしくは〇〜 C ₂₀のアルカノィル基を表し、互いに同じまたは異なっていてもよい）で表される L— 5—メチルー 5ーチオメチルヒダントイン。

24. R⁵, R⁶が水素原子， R⁴がベンジル基もしくは p—メトキシベンジル基である請求の範囲第 23記載の化合物。

25. R⁴, R⁶がァセチル基， R ⁵が水素原子である請求の範囲第 22記載の化合物。

26. R⁴， R⁵, R ⁶が全てァセチル基である請求の範囲第 23記載の化合物。

27. 一般式（ 6 ) ；

(式中、 R ⁷は置換基を有していても良いベンジル基，

のアルカノィル基または C₁〜C₂。のアルコキシカルボ二ル基を表す）で示される L— α—メチノレシスティン誘導体又は該化合物と酸との塩。

28. R⁷がべンジル基、 ρ—メトキシベンジ^/基またはァセチル基である請求の範囲第 27記載の化合物。

29. 酸が塩酸，臭化水素酸，硫酸， Ό— トルエンスルホン酸またはカンファースルホン酸である請求の範囲第 2 7記載の化合物。