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WO2004018678A1 - 癌の予防・治療剤 - Google Patents

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Publication number
WO2004018678A1
WO2004018678A1 PCT/JP2003/010532 JP0310532W WO2004018678A1 WO 2004018678 A1 WO2004018678 A1 WO 2004018678A1 JP 0310532 W JP0310532 W JP 0310532W WO 2004018678 A1 WO2004018678 A1 WO 2004018678A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
protein
amino acid
acid sequence
cancer
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/010532
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Takafumi Ishii
Koji Yamamoto
Eiji Sunahara
Shuji Sato
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company Limited filed Critical Takeda Pharmaceutical Company Limited
Priority to EP03792750A priority Critical patent/EP1536010A4/en
Priority to US10/525,105 priority patent/US7723496B2/en
Priority to CA002496236A priority patent/CA2496236A1/en
Priority to AU2003257631A priority patent/AU2003257631A1/en
Publication of WO2004018678A1 publication Critical patent/WO2004018678A1/ja

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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein, a preventive / therapeutic agent for cancer, a diagnostic agent, and the like.
  • Recent advances in microarray and oligonucleotide array technologies have enabled comprehensive analysis of gene expression. It has also been predicted that the disease state of cancer can be evaluated using gene microarray profiling data. In fact, it has been reported that leukemia can be classified by gene expression profile in leukemia. By clarifying the gene expression profiles of individual cancer tissues and accumulating the classifications, it is possible to predict the responsiveness to specific cancer treatments and to discover new drug discovery target proteins for specific cancers. It is considered possible.
  • the expression level of the protein is reduced for a newly diagnosed antigen-positive patient; It is possible to induce antitumor activity by methods such as suppressing functions, and (iii) eliciting a host immune response against the protein. At the same time, it is anticipated that patients who are diagnosed as antigen-negative will be able to quickly switch to another treatment method, and that there will be no need to put unnecessary burden on patients. As described above, expression profile analysis is expected to make a significant contribution to the molecular diagnosis of cancer and the development of molecularly targeted therapeutics.
  • the FU20539 gene (GenBank Accession on No. AK000546) is a gene cloned from a library derived from the human gastric cancer cell line KAT0III, and encodes a protein consisting of 774 amino acids (GenBank Accession on No. AK000546). BAA91245).
  • the FLJ13515 gene (GenBank Accession No. AK023577) is a gene cloned from a library derived from human placenta, and encodes a protein consisting of 639 amino acids (GenBank Accession No. BAB14613). This tamper is. It has an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence from 136 to 774 of the protein encoded by the FLJ20539 gene, but the amino acid at position 440 has been replaced with lysine from dalminic acid. Furthermore, a mouse gene (GenBank Accession No. BC006896) showing homology to these two human genes has been cloned from a library derived from mouse breast cancer tissue and encodes a protein consisting of 1018 amino acids. (GenBank Accession No. AAH06896). This mouse gene has about 83% nucleotide sequence homology and about 86% amino acid sequence homology to FLJ13515 gene.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, have found a gene whose expression is significantly increased in cancer tissues. As a result of further study based on this finding, the present invention was completed.
  • Amino acid represented by SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, 'SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the sequence or a salt thereof,
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28,
  • an antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary or substantially complementary to the polynucleotide according to (4) or a part thereof,
  • a kit for screening a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein according to (1) comprising the protein according to (1) or a partial peptide thereof or a salt thereof,
  • An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to
  • Cancer is colon, breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney cancer
  • the medicine according to the above (35) which is a brain tumor or a hematological tumor
  • Cancer is colon, breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney cancer
  • the diagnostic agent according to the above (36) which is a brain tumor or a hematological tumor
  • a cancer comprising a compound which inhibits the expression of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof which has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No. 27 or a salt thereof.
  • a cancer prevention / treatment agent screen characterized by using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 27, or a partial peptide thereof or a salt thereof. Ning method,
  • kits for screening a therapeutic agent for preventing or treating cancer comprising a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27, or a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • An agent for preventing or treating cancer which can be obtained by using the screening method according to (39) or the screening kit according to (40).
  • a prophylactic or therapeutic agent for cancer characterized by using a polynucleotide encoding a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 or a partial peptide thereof. Screening method,
  • An agent for preventing or treating cancer which can be obtained by using the screening method according to (42) or the screening kit according to (43).
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 2
  • a screening method for an apoptosis promoting agent which comprises using a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 27, a partial peptide thereof, or a salt thereof;
  • FIG. 1 is a diagram showing a hydrophobicity plot of TACT427-A.
  • FIG. 2 is a diagram showing a hydrophobicity plot of TACT 427-A2.
  • FIG. 3 is a diagram showing a hydrophobicity plot of TACT427-B.
  • FIG. 4 is a diagram showing a hydrophobicity plot of TACT 427-2B.
  • FIG. 5 is a diagram showing a hydrophobicity plot of TACT427-C.
  • FIG. 6 is a diagram showing a hydrophobicity plot of TACT427-C2. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is a human Cells of warm-blooded animals (eg, guinea pigs, rats, mice, chickens, egrets, bushes, hidges, horses, monkeys, etc.) (eg, hepatocytes, spleen cells, nerve cells, glial cells, gland cells, Bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 70% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequences having a homology of 90% or more, most preferably about 95% or more, may be mentioned.
  • Examples of a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 1 However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is preferable.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 70% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. Amino acid sequences having a homology of 90% or more, most preferably about 95% or more, may be mentioned.
  • amino acid sequences having about 95% or more homology are particularly preferred.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 4 However, a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is preferable.
  • amino acid sequence For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more with respect to the amino acid sequence from 577th to 594th of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 Also, most preferably, an amino acid sequence having about 95% or more homology is exemplified.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 described above. And the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 Preferred are proteins having substantially the same activity as the contained protein.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. % Or more, most preferably about 95% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include, for example, a protein having the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 described above. However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is preferable.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, and particularly preferably about 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15. % Or more, most preferably about 95% or more homology.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably the amino acid sequence at positions 47 to 296 of the amino acid sequence. Also include amino acid sequences having about 95% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 described above. However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is preferable.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 % Or more, most preferably about 95% or more homology.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably the amino acid sequence at positions 43 to 292 of the amino acid sequence. Also include amino acid sequences having about 95% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 described above. And a protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is preferable.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20. Is an amino acid sequence having about 90% or more, most preferably about 95% or more homology. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 70% or more of the amino acid sequence from the 47th to the 296th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 Amino acid sequences having a homology of 90% or more, most preferably about 95% or more, and the like can also be mentioned.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 described above. And a protein having substantially the same activity as that of the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 is preferable.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 Is an amino acid sequence having about 90% or more, most preferably about 95% or more homology.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 70% or more with respect to the amino acid sequence from the 43rd to 292nd amino acid sequence. Amino acid sequences having a homology of 90% or more, most preferably about 95% or more, and the like can also be mentioned.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 described above. And a protein having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is preferred.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25. % Or more, most preferably about 95% or more homology.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably the amino acid sequence at positions 47 to 296 of the amino acid sequence. Include amino acid sequences having about 95% or more homology.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 include, for example, a protein having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 described above. However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is preferable.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, and particularly preferably about 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27. % Or more, most preferably about 95% or more homology.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably the amino acid sequence from the 43rd to 292nd amino acid sequence. Also include amino acid sequences having about 95% or more homology.
  • Examples of the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 include, for example, the protein containing the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by the aforementioned SEQ ID NO: 27 However, a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is preferable.
  • substantially equivalent activities include chloropoxidase activity. I can do it. Substantially identical indicates that the properties are qualitatively (eg, physiologically or pharmacologically) equivalent. Therefore, it is preferable that the black mouth peroxidase activity is equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.1 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • Cloguchi peroxidase activity may be performed according to a known method. For example, see Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), Vol.241, pp.63-1768 (1966). It can be measured according to the method described or a method analogous thereto.
  • Examples of the protein used in the present invention include (i) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20, 1 or 2 or more (eg, about 1 to 100, preferably about 1 to 30, preferably 1) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • the amino acid sequence is inserted, deleted or substituted as described above, the position of insertion, deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (potassium terminus) according to the convention of peptide notation.
  • the proteins used in the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, have carboxyl groups (-COOH), carboxylates (one COO—), amides (one C ⁇ NH 2 ) or ester ⁇ -COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl, n - C M alkyl group such as butyl, for example, C 3 cyclopentyl
  • the cyclo such cyclohexyl - 8 cycloalkyl group for example, phenyl, alpha-naphthyl of which C 6 - 12 Ariru group, e.g., benzyl, phenyl, such as phenethyl - C 7 _ 14 such as C alkyl group - a- naphthyl, such as ( ⁇ _ 2 ⁇ alkyl group or a flying one naphthylmethyl
  • an aralkyl group, a pirachiyloxymethyl group and the like are used.
  • the protein used in the present invention has a lipoxyl group (or lipoxyl group) other than the C-terminus
  • the protein in which the lipoxyl group is amidated or esterified may also be a protein used in the present invention.
  • the ester in this case for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected by a protecting group (eg, a formyl group, an acetyl group, etc., a C alkanol group, etc., etc.).
  • a protecting group eg, a formyl group, an acetyl group, etc., a C alkanol group, etc., etc.
  • Protected, cleavable N-terminal darminin residue generated by cleavage in vivo, oxidized darminin, substituents on the side chains of amino acids in the molecule are protected by an appropriate protecting group (for example, C w acyl group such as C w alkyl group such as formyl group and acetyl group). Or complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound.
  • protein used in the present invention include, for example, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, and a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the partial peptide of the protein used in the present invention is the partial peptide of the protein used in the present invention described above, and preferably has the same properties as the protein used in the present invention described above. Any one may be used.
  • At least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably 100 or more, most preferably A peptide having an amino acid sequence of 200 or more is used.
  • one or more (preferably about 1 to 10 and more preferably (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted.
  • Or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably a number (1 to 5)) amino acids are added to the amino acid sequence;
  • Or 1 or 2 or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, more preferably about 1 to 5) amino acids are inserted into the amino acid sequence; or
  • One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the amino acid sequence may be substituted with another amino acid.
  • the C-terminus may be any one of a hydroxyl group (—COOH), a carboxylate (—C ⁇ —), an amide (—C ⁇ NH 2 ), and an ester (—COOR). You may.
  • the partial peptides used in the present invention include those used in the present invention described above. Similar to proteins, those having a carbonyl group (or carboxylate) other than at the C-terminus, and those in which the amino group at the N-terminal amino acid residue (eg, methionine residue) is protected by a protecting group , A glutamine residue generated by cleavage of the N-terminal side in vivo and oxidized with oxalic acid, a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule protected by an appropriate protecting group, or a sugar chain Complex peptides, such as so-called glycopeptides, to which are bound, are also included.
  • the partial peptide used in the present invention can also be used as an antigen for producing an antibody.
  • the salts of proteins or partial peptides used in the present invention include salts with physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids) and bases (eg, alkali metal salts).
  • physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • acid addition salts that are chemically acceptable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, for
  • the protein or its partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced from the above-mentioned human or warm-blooded animal cell or tissue by a known method for purifying a protein, or a DNA encoding the protein can be obtained by the following method. It can also be produced by culturing a transformant containing the same. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, or ion exchange chromatography. Purification and isolation can be achieved by a combination of chromatography methods.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • a resin for protein synthesis examples include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydro Xymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,, 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2,, 4,1-dimethoxyphenyl Fmoc amino Ethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid appropriately protected with an ⁇ -amino group and a side chain functional group is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • the protein or partial peptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein or partial peptide or their amide. I do.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (eg, HO Bt, HO OB t) or may be pre-formed as a symmetric anhydride or HO BT ester or HO OB t ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • a racemization inhibitor eg, HO Bt, HO OB t
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpiperidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane, and tetrahydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; or an appropriate mixture thereof. .
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the protein bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isopolnyoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C1-1Z, Br-Z, and adaman.
  • Tyloxycarbonyl, trifluoroacetic acid, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the carboxyl group may be, for example, an alkyl esterified (eg, a linear, branched or cyclic alkyl such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl).
  • an alkyl esterified eg, a linear, branched or cyclic alkyl such as methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl.
  • Esterification aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarponyl hydrazide , T-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • aralkyl esterification eg, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-cyclobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification eg, benzyloxycarponyl hydrazide , T-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • groups suitable for this esterification include groups derived from carbonic acid such as lower (C 6 ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl group, and ethoxycarbonyl group. Is used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydroxyvinyl group, a t-butyl group and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz and C 1 2 - Bz l, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • a protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Activated carbonyl groups of the raw material include, for example, the corresponding acid anhydride Substances, azides, active esters [alcohols (eg, pen phenol phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HO NB, N-hydroxysuccinimide , N-hydroxyfurimide, ester with HOB t)].
  • active esters eg, pen phenol phenol, 2,4,5-trichloro phenol, 2,4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HO NB, N-hydroxysuccinimide , N-hydroxyfurimide, ester with HOB t
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoramide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., and sodium in liquid ammonia Reduction is also used.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Another method for obtaining an amide form of a protein or partial peptide is, for example, first protecting a carboxy-terminal amino acid with a desired amino acid by amidating and protecting a peptide (protein) chain at the amino group side. After removing the protein chain, the protein or partial peptide from which only the protecting group for the N-terminal ⁇ -amino group of the peptide chain has been removed and the protein or partial peptide from which only the protecting group for the C-terminal carbonyl group have been removed. And the protein or peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude protein or peptide can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain the desired protein or peptide amide.
  • an ester of a protein or peptide for example, after condensing the carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, a desired protein is prepared in the same manner as in the amide of a protein or peptide. It is possible to obtain an ester of quality or a peptide.
  • the partial peptide or a salt thereof used in the present invention can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein used in the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or an amino acid capable of constituting the partial peptide used in the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the desired peptide. can do.
  • Examples of the known condensation method and elimination of the protecting group include, for example, the methods described in ⁇ to (V) below.
  • the polynucleotide encoding the protein used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the protein used in the present invention.
  • it is DNA.
  • the DNA may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA from cells and tissues described above, cDNA library from cells and tissues described above, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • a reverse preparation was performed using an otalRNA or mRNA fraction prepared from the above-described cell 'tissue.
  • RT-PCR method Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • DNA encoding the protein used in the present invention examples include, for example,
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 under high stringent conditions DNA encoding a protein having a base sequence and having substantially the same properties as a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10;
  • a protein comprising a nucleotide sequence which hybridizes under high stringent conditions to the nucleotide sequence represented by 16 and having substantially the same properties as the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 D NA, which codes
  • (X) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 or a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 under high stringent conditions; Any DNA may be used as long as it encodes a protein having substantially the same properties as the protein containing the amino acid sequence represented by No. 27.
  • DNA that can be hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and about 7 nucleotides.
  • DNA containing a base sequence having a homology of 0% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 Particularly preferred is a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more.
  • a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 under high stringency conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 Particularly, DNA containing a nucleotide sequence having homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used. For example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, most preferably about 90% or more with respect to the nucleotide sequence at positions 1728 to 1782 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8. DNA containing a nucleotide sequence having a homology of 95% or more can also be used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 under high stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11. Particularly preferably, a DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • Examples of a DNA that can be hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 under eight stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 Above, particularly preferably DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • DNA that can be redisused include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • DNA containing a base sequence having a property is used.
  • Examples of the DNA that can be hybridized with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 under eight stringent end conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 and about 70% or more, preferably about 80% As described above, DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is particularly preferably used.
  • Examples of the DNA which can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 under high stringent conditions include, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 23 Particularly preferably, a DNA containing a base sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 and about 70% or more, preferably about 80% or more. Particularly preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 under high stringency conditions include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 and about 70% or more, preferably about 80% or more. Particularly preferably, a DNA containing a nucleotide sequence having a homology of about 90% or more, most preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization is performed by a method known per se or a method similar thereto, for example, For example, it can be carried out according to the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringency conditions.
  • High stringency conditions refer to, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° (preferably about 60 to 65 ° C.). In particular, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a DNA or sequence containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 DNA containing the nucleotide sequence represented by No. 3
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 Contains DNA, etc.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 or the base represented by SEQ ID NO: 9 DNA containing the sequence,
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 11 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 12 DNA containing
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16 or the base represented by SEQ ID NO: 19 DNA containing the sequence,
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19 Such as DNA containing
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 may be a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 or Is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 24,
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 23 or the base represented by SEQ ID NO: 24 DNA containing the sequence,
  • DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 Such as DNA containing
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 29 And the like containing DNA.
  • the polynucleotide (eg, DNA) encoding the partial peptide used in the present invention may be any polynucleotide containing the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide used in the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-mentioned cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide used in the present invention include: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: DNA having a part of the DNA containing the base sequence represented by: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 , SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 or hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 under high stringent conditions
  • a DNA containing a portion of a DNA encoding a protein having a base sequence to be used and encoding a protein having substantially the same activity as the protein of the present invention may be used.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28 DNA that can hybridize with the base sequence represented by has the same significance as described above.
  • DNA can be cloned by amplifying the DNA by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the nucleotide sequence encoding the protein of the present invention, or by incorporating DNA into an appropriate vector. Selection can be carried out by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the whole region of the protein of the present invention or a fragment labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be converted using PCR, a known kit, for example, Mutan TM -Super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the 0DA-LA PCR method.
  • the method can be carried out according to a method known per se, such as the gapped duplex method or the Kunkel method, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned protein can be used as it is depending on the purpose, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 'end, and may have TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3, terminal. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the expression vector of the protein of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into a promoter of an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting downstream.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, pSHl9, pSHl5
  • pacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, paculovirus, etc.
  • pXTl, pRc / CMV, pRcZRSV, pcDNAI-Neo, etc. are used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter cytomegalovirus
  • the host is Bacillus, such as trp promoter, lac promoter, recA promoter overnight, ⁇ ⁇ promo-even, lpp promoter, T7 promoter overnight, etc.
  • the host is yeast, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired.
  • Selection methods include, for example, a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] gene and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp 1). there), the neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Ne o r, G418 resistance), and the like.
  • dh fr gene as a selectable marker using dh fr gene-deficient Chinese hamster cells
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal of the protein of the present invention. If the host is Escherichia, PhoA * signal Sequence: 0 Immediate A signal sequence, etc., if the host is Bacillus, a single amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. ⁇ Insulin signal sequence and ⁇ -interferon when the host is an animal cell, such as a signal sequence. Signal sequences, antibody molecules, signal sequences, etc. can be used.
  • a transformant can be produced using the thus constructed vector containing the DNA encoding the protein of the present invention.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • genus Escherichia include, for example,
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, 24, 255 (1983)
  • 207-21 Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used. .
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH22R—, ⁇ 87-11 A, DKD—5D, 20 B—12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC 2036, Pichia pastoris (Pichia pastoris) K # 71 or the like is used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brass icae or cells derived from Est igmena acrea are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (Vaughn, J., et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, Vol. 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), and dh ⁇ r gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter CHO (dh fr)).
  • CHO cell Chinese hamster cell CHO
  • CHO fr dh ⁇ r gene-deficient Chinese hamster cell CHO
  • mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeloma cells, mouse ATDC5 cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Transformation of insect cells or insects can be performed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, by the method described in Cell Engineering Annex 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263-267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973). It can be done according to the law. '
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • Nitrogen sources inorganic substances and others.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, and power.
  • Inorganic or organic substances such as zein, meat extract, soybean meal, and potato extract, and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride, and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acid As a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in
  • the cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)) to which an additive such as immobilized 10% pepsin serum or the like is appropriately added is used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually about 27 for about 3 to 5 days, with aeration and agitation as needed.
  • the culture medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], a DMEM medium [Virology , 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the protein of the present invention can be produced in the cells, in the cell membrane, or outside the cells of the transformant.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells When extracting the protein of the present invention from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culturing, suspended in an appropriate buffer, and subjected to sonication, lysozyme and Z or freeze-thawing. After the cells or cells are destroyed by the method described above, a method of obtaining a crude protein extract by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.
  • methods using charge differences such as ion-exchange chromatography, methods using specific affinities such as affinity chromatography, and reversed-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method utilizing a difference in hydrophobicity such as isoelectric focusing
  • a method utilizing isoelectric point difference such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the protein thus obtained when the protein thus obtained is obtained as a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein is obtained as a salt, a method known per se or The compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily modified or partially modified by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. Can also be removed.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotoribsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the protein of the present invention thus produced can be measured by enzymatic immunoassay western blotting using a specific antibody.
  • the antibody against the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can recognize the protein or partial peptide or a salt thereof used in the present invention. You may.
  • An antibody against the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof (hereinafter sometimes simply referred to as the protein of the present invention in the description of the antibody) uses the protein of the present invention as an antigen, It can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the protein of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site where the antibody can be produced by administration, itself or together with a carrier and a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times.
  • the warm-blooded animals used include, for example, monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing the antibody-producing cells contained therein with myeloma cells of the same or different species, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • Fusion operations are known methods, for example, It can be performed according to the method of Lustein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • Cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C, for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen for monoclonal antibody-producing hybridomas.
  • the hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) to which a protein antigen is directly or adsorbed with a carrier, and Anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mouse) or protein A, and a monoclonal bound to a solid phase Antibody detection method,
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mouse
  • a monoclonal bound a solid phase Antibody detection method
  • Add the hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed add proteins labeled with radioactive substances, enzymes, etc., and bind to the solid phase. Examples include a method for detecting a clonal antibody.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow a hybridoma.
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or A serum-free medium for hybridoma culture (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40, preferably about 37X.
  • the culturing time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% CO2.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as in the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody) You can do it.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE) Absorption / desorption method, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen binding Solid phase or specific purification method of collecting antibody only with an active adsorbent such as protein A or protein G and dissociating the bond to obtain the antibody
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced by a method known per se or a method analogous thereto. For example, a immunized bovine (protein antigen) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and immunization is performed on a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance against the antibody and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of carrier and hapten are determined by the efficiency of antibodies against hapten immunized by cross-linking with a carrier. If possible, any material may be cross-linked at any ratio. For example, serum serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. are used in a weight ratio of about 0.1 to 1 for hapten. -20, preferably about 1-5. In addition, various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde-carpoimide, a maleimide active ester, a thiol group, or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the dose is usually given about every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times in total.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • An antisense polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to a sequence or a part thereof includes a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention.
  • Any antisense polynucleotide may be used as long as it contains a nucleotide sequence complementary to or a part thereof and has an effect of suppressing the expression of the DNA, and antisense DNA is preferable.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, about 70% of the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 9%
  • Base sequences having 0% or more, and most preferably about 95% or more homology, and the like can be mentioned.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal site of the protein of the present invention for example, An antisense polynucleotide having about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology with the complementary strand of (Mouth)
  • an antisense polynucleotide that directs RNA degradation by RNaseH it is about 70% or more, preferably about 80% or more, complementary to the entire nucleotide sequence of the DNA of the present invention including introns. More preferably, antisense polynucleotides each having a homology of about 90% or more, most preferably about
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:
  • An antisense polynucleotide having a base sequence complementary to the sequence or a part thereof is exemplified.
  • An antisense polynucleotide is usually composed of about 10 to 40 bases, preferably about 15 to 30 bases.
  • the phosphate residues (phosphates) of each nucleotide constituting antisense DNA are changed to, for example, chemically modified phosphate residues such as phosphorothioate, methylphosphonate, and phosphorodithionate. It may be substituted.
  • the sugar (doxylipose) of each nucleotide may be substituted with a chemically modified sugar structure such as 2′-dimethylation, and the base (pyrimidine, purine) may also be chemically modified.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the protein gene of the present invention is cloned or determined based on the nucleotide sequence information of DNA encoding the protein.
  • a polynucleotide can hybridize with the RNA of the protein gene of the present invention and inhibit the synthesis or function of the RNA, or through the interaction with the protein-related RNA of the present invention.
  • the expression of the protein gene of the present invention can be regulated and controlled.
  • Polynucleotides that are complementary to the selected sequence of the protein-associated RNA of the present invention, and polynucleotides that can specifically hybridize with the protein-associated RNA of the present invention, are used in vivo and in vitro. It is useful for regulating and controlling the expression of the protein gene of the present invention, and is also useful for treating or diagnosing diseases and the like.
  • the term “corresponding” refers to a specific sequence of nucleotides, base sequences or nucleic acids, including genes. It means having the same sex or being complementary.
  • the “correspondence” between a nucleotide, base sequence or nucleic acid and a peptide (protein) is a nucleotide
  • the 3 'end palindromic region and the 3 end hairpin loop may be selected as preferred regions of interest, but any region within the protein gene may be selected as the region of interest.
  • the relationship between the target nucleic acid and a polynucleotide complementary to at least a part of the target region is as follows: The relationship between the target nucleic acid and the polynucleotide capable of hybridizing with the target is
  • Antisense polynucleotides include polynucleotides containing 2-dexoxy-D-reports, polynucleotides containing D-reports, other types of polynucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or non-polynucleotides.
  • Other polymers having a nucleotide backbone eg, commercially available protein nucleic acids and synthetic sequence-specific nucleic acid polymers
  • other polymers containing special bonds provided that such polymers are found in DNA or RNA
  • Base pairing including nucleotides having a configuration that allows base attachment
  • RNA hybrids can be double-stranded DNA, single-stranded DNA, double-stranded RNA, single-stranded RNA, and even DNA: RNA hybrids, and can further comprise unmodified polynucleotides (or unmodified oligonucleotides). Nucleosides), and also those with known modifications, such as those with labels, caps, methylated, and one or more natural nucleotides as analogs known in the art.
  • Substituted, modified with an intramolecular nucleotide such as one having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, , Phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases, nucleases, inhibitors, It has a side chain group such as xin, antibody, signal peptide, poly-L-lysine, etc. and sugar (eg, monosaccharide), etc.
  • an intramolecular nucleotide such as one having an uncharged bond (eg, methylphosphonate, phosphotriester, phosphoramidate, olebamate, etc.), a charged bond or a sulfur-containing bond (eg, , Phosphorothioate, phosphorodithioate, etc., such as proteins (nucleases,
  • nucleoside may include not only those containing purine and pyrimidine bases, but also those having other modified heterocyclic bases. Such modifications may include methylated purines and pyrimidines, acylated purines and pyrimidines, or other heterocycles.
  • modified nucleotides and modified nucleotides may also be modified at the sugar moiety, e.g., where one or more hydroxyl groups have been replaced with halogens, aliphatic groups, etc., or ethers, amines, etc. May be converted to a functional group of
  • the antisense polynucleotide (nucleic acid) of the present invention is an RNA, a DNA, or a modified nucleic acid (RNA, DNA).
  • modified nucleic acid include, but are not limited to, a sulfur derivative of a nucleic acid, a thiophosphate derivative, and a polynucleoside amide, which is resistant to degradation of oligonucleoside amide.
  • the antisense nucleic acid of the present invention can be preferably designed according to the following policy.
  • the antisense nucleic acid is more stable in the cell, the cell permeability of the antisense nucleic acid is greater, the affinity for the target sense strand is greater, and if toxic, the Minimize the toxicity of sense nucleic acids.
  • the antisense nucleic acids of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, may be provided in special forms such as ribosomes or microspheres, may be applied by gene therapy, It could be given in additional form.
  • the addition forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge on the phosphate backbone, and interaction with cell membranes.
  • Hydrophobic substances such as lipids that increase or increase the uptake of nucleic acids (eg, phospholipids, cholesterol, etc.).
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically arranged at the 3 'end or the 5' end of nucleic acids for preventing degradation by nucleases such as exonuclease and RNase. Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of the antisense nucleic acid can be examined using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the protein of the present invention.
  • the nucleic acid can be applied to cells by various methods known per se.
  • the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter, sometimes abbreviated as the protein of the present invention
  • the DNA encoding the protein or partial peptide of the present invention hereinafter referred to as D NA
  • an antibody against the protein or partial peptide of the present invention or a salt thereof hereinafter may be abbreviated as the antibody of the present invention
  • an antisense polynucleotide of the DNA of the present invention hereinafter may be referred to as “antibody”. , which may be abbreviated as an antisense polynucleotide of the present invention).
  • a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the gene of the protein of the present invention, or a medicament containing an antibody against the protein of the present invention includes, for example, Colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, Prevention and treatment of cancer such as liver cancer, biliary tract fatigue, spleen cancer, renal cancer, bladder cave, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor or blood tumor (preferably, prevention of breast cancer, lung cancer, etc.) ⁇ Therapeutic agent) can be used as an apoptosis promoter for cancer cells.
  • the expression of the protein of the present invention is enhanced in cancer tissues. Further, when the activity of the protein of the present invention (eg, clonal peroxidase activity) is inhibited, cancer cells undergo apoptosis. Accordingly, the compounds or salts thereof that inhibit the activity of the protein of the present invention include, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer such as testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor or blood tumor. Preferred are preventive and therapeutic agents for breast cancer, lung cancer and the like. Further, the compound or its salt that inhibits the activity (eg, chloroperoxidase activity) of the protein of the present invention can also be used, for example, as an apoptosis promoting agent for cancer cells.
  • the activity of the protein of the present invention eg,
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for screening for a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein of the present invention, which comprises using the protein of the present invention.
  • a chloropa oxidase activity of a cell capable of producing the protein of the present invention a chloropa oxidase activity of a cell capable of producing the protein of the present invention
  • a mixture of a mixture of the cell capable of producing the protein of the present invention and a test compound a screening method for a compound or a salt thereof which inhibits the activity of the protein of the present invention, which is characterized by comparing the activity with oral oxidase, is used.
  • the chloropoxidase activity is measured, and the activity of adding chlorine to monochlorodimedone to produce dichlorodimedone is compared as an index.
  • Chloropoxidase activity can be measured by a known method, for example, in Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.), Vol. 241, pp. 1763-68 (1966). Year) Measure according to the method described.
  • a host transformed with a vector containing DNA encoding the protein of the present invention described above is used.
  • animal cells such as COS 7 cells, CHO cells, and HEK293 cells are preferably used.
  • a transformant in which the protein of the present invention is expressed on a cell membrane by culturing by the method described above is preferably used.
  • the method for culturing cells capable of expressing the protein of the present invention is the same as the above-described method for culturing the transformant of the present invention.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • the protein of the present invention has a Clos lipase activity of about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably, as compared with the case of the above (i).
  • a test compound that inhibits about 50% or more can be selected as a compound that inhibits the activity of the protein of the present invention.
  • the compound having the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention is useful as a safe and low-toxic drug for suppressing the physiological activity of the protein of the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, and animal tissue extracts. It is a compound selected from liquids, plasma, etc.
  • the salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the peptide of the present invention are used.
  • compounds that inhibit the expression of the gene of the protein of the present invention or salts thereof for example, breast cancer, colon breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer It can be used as a preventive / therapeutic agent for cancer such as stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor or blood tumor.
  • a preventive / therapeutic agent for cancer such as stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor or blood tumor.
  • it is a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer, lung cancer and the like.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the expression of a gene encoding the protein of the present invention is used, for example, as an apoptosis promoter for cancer cells. Can also be used.
  • the polynucleotide (eg, DNA) of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that inhibits expression of the protein gene of the present invention.
  • the screening method includes (iii) culturing cells capable of producing the protein of the present invention, and (iv) culturing cells capable of producing the protein used in the present invention in the presence of the test compound. There is a screening method characterized by performing comparison with the case.
  • the expression level of the gene (specifically, the amount of the protein of the present invention or the amount of mRNA encoding the protein) in the cases (iii) and (iv) is measured and compared.
  • test compound and cells having the ability to produce the protein of the present invention include the same cells as described above.
  • the amount of the protein is measured by a known method, for example, using an antibody that recognizes the protein of the present invention, and analyzing the protein present in a cell extract or the like according to a method such as Western analysis, ELISA, or a method analogous thereto. Can be measured.
  • the amount of mRNA is measured by a known method, for example, as a probe, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28, as a Northern hybridization using a nucleic acid containing the nucleotide sequence or a part thereof, or as a primer SEQ ID NO: 2, sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 or nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 Alternatively, it can be measured according to a PCR method using a nucleic acid containing a part thereof or a method analogous thereto.
  • the screening kit of the present invention contains the protein or partial peptide used in the present invention or a salt thereof, or a cell capable of producing the protein or partial peptide used in the present invention.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention include the test compounds described above, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, and plant extracts.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the protein of the present invention are used.
  • the compound that inhibits the activity of the protein of the present invention or a salt thereof, and the compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene of the present invention are, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, and gastric cancer, respectively. , Liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, visceral cancer, brain tumor or blood tumor, etc. It is useful as a prophylactic / therapeutic agent, etc.) or as an apoptosis promoter for cancer cells.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to a conventional method.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a method known per se and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the field of formulation.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • compositions for parenteral administration for example, injections, suppositories, etc. are used. Includes dosage forms such as internal injections. Such injections are prepared according to a method known per se, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above compound or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants, etc.
  • propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (5 O mol) adduct of hydrogenated cast oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration is prepared by mixing the above compound or a salt thereof with a usual suppository base.
  • compositions are conveniently prepared in dosage unit forms to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg, especially It is preferable that the compound contains 5 to 100 mg for an injection and 10 to 25 mg for the other dosage forms.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above compound.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, bush, puppies, puppies, pests, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.) orally or parenterally.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • its salt is orally administered, generally in adults (with a body weight of 60 kg)
  • the compound or its salt is used in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 mg per day.
  • the single dose of the compound or a salt thereof may vary depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, for the purpose of treating breast cancer, the expression of the gene of the protein of the present invention is intended.
  • a compound or a salt thereof is administered to an adult (with a body weight of 6 kg) usually in the form of an injection, the compound or a salt thereof is used in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 0.1 mg per day. It is convenient to administer mg20 mg, more preferably about 0.1-1 Omg, by injection to the cancerous lesion. For other animals, the equivalent dose per 60 kg body weight can be administered.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the protein of the present invention, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly for quantification by sandwich immunoassay.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter, sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited. Any method that detects the amount of the original or antibody-antigen complex by chemical or physical means, and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen Method may be used. For example, nephrometry, a competition method, an immunometric method and a sandwich method are suitably used, but in terms of sensitivity and specificity, it is particularly preferable to use a sandwich method described later.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used. Radioisotopes, if example embodiment, [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], and the like are used [14 c].
  • an enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • the luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the test solution is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction By measuring the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier, the mass of the protein of the present invention in the test wave can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at a time interval.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is an antibody in which the binding site of the protein of the present invention is different. Is preferably used.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention
  • the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method or a nephrometry.
  • a competition method after the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen bound to the antibody (B) are separated.
  • BZF separation Measure the amount of B or F label and quantify the amount of antigen in the test solution.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody a solid phase antibody is used as the first antibody
  • An immobilization method using a soluble antibody as the first antibody and using an immobilized antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting the antigen with an excess amount of the labeled antibody, the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the ordinary conditions and procedures in each method.
  • review and written documents For example, edited by Hiro Irie, “Radio Nonotsusei” (Kodansha, published in Showa 49), edited by Hiroshi Irie, “Radio Imunoatsushi” (Kodansha, published in 1954), Eiji Ishikawa et al.
  • the protein of the present invention can be quantified well by using the antibody of the present invention.
  • an increase in the concentration of the protein of the present invention is detected by quantifying the concentration of the protein of the present invention using the antibody of the present invention, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus Cancer, such as cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor or blood tumor, or may be affected in the future Can be diagnosed as high.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • a subject such as a body fluid or a tissue.
  • detecting the protein of the present invention in each fraction during purification, and analyzing the behavior of the protein of the present invention in test cells, etc. Can be used.
  • the DN DN of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, horses, cats, dogs, monkeys) by using them as probes. , Chimpanzees, etc.)
  • Abnormalities (genetic abnormalities) of DNA or mRNA encoding the DNA or its partial peptide can be detected, for example, damage to the DNA or mRNA, sudden mutation or reduced expression, or DNA or mRNA It is useful as a gene diagnostic agent for NA increase or overexpression.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be carried out, for example, by the well-known Northern Eighth hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989). 9 years), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Vol. 86, 276-6-2770 pages (1989)).
  • Northern hybridization or when DNA mutation is detected by PCR-SSCP method, for example, colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, Diagnosing a high likelihood of cancer such as esophageal, stomach, liver, biliary, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney, brain or blood tumors Can be.
  • the antisense polynucleotide of the present invention which complementarily binds to the DNA of the present invention and can suppress the expression of the DNA, has low toxicity, and has the function of the protein of the present invention or the DNA of the present invention in vivo. It can suppress the effect, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for cancer such as visceral cancer, brain tumor or hematological tumor. Preferably, it is a preventive or therapeutic agent for breast cancer, lung cancer and the like. Further, the antisense polynucleotide of the present invention can also be used, for example, as an apoptosis promoter for cancer cells.
  • the above antisense polynucleotide When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, accelerator, etc., it can be formulated and administered according to a method known per se.
  • the antisense polynucleotide may be used alone or in a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associate.
  • a suitable vector such as a virus vector
  • the vector is inserted into a human or mammal (eg, rat, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.) in a conventional manner.
  • a human or mammal eg, rat, puppies, higgs, bushes, puppies, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the antisense polynucleotide can be administered as it is or in the form of a formulation together with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, and can be administered by a gene gun or a catheter such as a hide mouth gel catheter.
  • they can be aerosolized and administered topically into the trachea as an inhalant.
  • the antisense polynucleotide is formulated alone or in combination with a carrier such as liposome (injection), and is intravenously, subcutaneously, etc. May be administered.
  • the dose of the antisense polynucleotide varies depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.
  • the antisense polynucleotide of the present invention is administered for the purpose of treating breast cancer, it is generally used in adults. (Body weight 6 O kg), the antisense polynucleotide is administered at about 0.1 to 10 O mg per day.
  • the antisense polynucleotide can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence of the DNA of the present invention in a tissue or a cell and the state of expression thereof.
  • RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention a double-stranded RNA containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, a lipozyme containing a part of the RNA encoding the protein of the present invention, etc.
  • the expression of the gene of the present invention can be suppressed and the function of the protein used in the present invention or the DNA used in the present invention in a living body can be suppressed, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer Prevention and treatment of cancer such as adenocarcinoma, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain cancer or blood tumor (preferably It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer, lung cancer, etc.) and as an apoptosis promoter for cancer cells.
  • cancer such as adenocarcinoma, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain cancer or blood tumor (preferably It can be used as a prophylactic / therapeutic agent for
  • the double-stranded RNA can be designed and produced based on the sequence of the polynucleotide of the present invention according to a known method (eg, Nature, 411, 494, 2001).
  • Lipozyme can be prepared by known methods (eg, TRENDS in Molecular Medicine, Vol. 7, p. 221, 2001) based on the sequence of the polynucleotide of the present invention. For example, it can be produced by linking a known lipozyme to a part of the RNA encoding the protein of the present invention. Part of the RNA encoding the protein of the present invention includes a portion (RNA fragment) close to the cleavage site on the RNA of the present invention, which can be cleaved by a known lipozyme.
  • RNA or lipozyme When used as a therapeutic agent, it can be formulated and administered in the same manner as the antisense polynucleotide.
  • the antibody of the present invention has a cancer cell growth inhibitory action or an apoptosis promoting action, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophagus cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer
  • a prophylactic and therapeutic agent eg, vaccine, etc.
  • cancer such as uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor or blood tumor.
  • it is a prophylactic / therapeutic agent for breast cancer, lung cancer and the like.
  • the antibody of the present invention can be used, for example, as an apoptosis promoter for cancer cells.
  • the prophylactic / therapeutic agent for the above-mentioned diseases which contains the human body of the present invention, has low toxicity, and it can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form in humans or mammals (eg, rats, It can be administered orally or parenterally (eg, intravascular, subcutaneous, etc.) to ⁇ egrets, sheep, pigeons, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.). Preferably, it can be administered as a vaccine according to a standard method.
  • the antibody of the present invention may be administered as it is, or may be administered as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the antibody of the present invention or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such a pharmaceutical composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for parenteral administration include, for example, injections, suppositories, vaccines, and the like.
  • Injections are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, intravenous, etc. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • the antibody of the present invention or a salt thereof may be used. It can be prepared by dissolving, suspending or emulsifying a sterile aqueous liquid or oily liquid used for usual injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing budose sugar and other adjuvants and the like are used.
  • propylene glycol, polyethylene glycol), a nonionic surfactant eg, polysorbate 80, ⁇ CO-50 (polyoxyethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated castor oil)] and the like may be used in combination.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in a suitable ampoule.
  • a suppository for rectal administration may be prepared by mixing the antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, and capsules (including soft capsules). Syrup, emulsion, suspension and the like.
  • Such a composition is manufactured by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient commonly used in the field of formulation.
  • carriers and excipients for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the parenteral or oral pharmaceutical compositions described above are conveniently prepared in dosage unit forms to be compatible with the dosage of the active ingredient.
  • Such dosage unit forms include, for example, tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the content of the antibody is usually about 5 to 50 mg per dosage unit dosage form, especially about 5 to 10 mg for injection, and about 10 to 250 mg for other dosage forms. .
  • the dosage of the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent or modulator containing the antibody of the present invention varies depending on the administration subject, the target disease, the symptoms, the administration route and the like.
  • a single dose of the antibody of the present invention is usually about 0.01-2 OmgZkg body weight, preferably 0.1-: about L OmgZkg body weight, and more preferably about 0.1-5 mgZkg body weight. It is conveniently administered by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. Other parenteral injections In the case of administration and oral administration, an equivalent amount can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibody of the present invention can be administered by itself or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above antibody or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or vehicle.
  • a composition is provided as a dosage form suitable for oral or parenteral administration (eg, intravascular injection, subcutaneous injection, etc.).
  • compositions may contain other active ingredients as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • the protein of the present invention can be used as a cancer vaccine to activate the immune system of cancer patients.
  • so-called adoptive immunotherapy or the like in which a strong antigen-presenting cell (eg, a dendritic cell) is cultured in the presence of the protein of the present invention, phagocytosed the protein, and then returned to the patient's body, can be preferably applied.
  • the dendritic cells returned to the body can kill cancer cells by inducing and activating cancer antigen-specific cytotoxic T cells.
  • the protein of the present invention may be used, for example, for colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, stomach cancer It can also be safely administered to mammals (eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, pigs) as vaccine preparations for the prevention or treatment of cancers such as cancer, brain tumors or hematological tumors.
  • mammals eg, humans, monkeys, mice, rats, rabbits, pigs
  • the vaccine formulation usually contains the protein of the invention and a physiologically acceptable carrier.
  • the carrier include liquid carriers such as water, saline (including physiological saline), buffers (eg, phosphate buffer), and alcohols (eg, ethanol).
  • the vaccine preparation can be prepared according to a usual vaccine preparation manufacturing method.
  • the protein of the present invention is dissolved or suspended in a physiologically acceptable carrier.
  • the protein of the present invention and a physiologically acceptable carrier may be separately prepared, and used at the time of use.
  • Pectin preparations include, in addition to the protein of the present invention and a physiologically acceptable carrier, adjuvants (eg, aluminum hydroxide gel, serum albumin, etc.), preservatives (eg, thimerosal, etc.), soothing agents (eg, Glucose, benzyl alcohol, etc.).
  • adjuvants eg, aluminum hydroxide gel, serum albumin, etc.
  • preservatives eg, thimerosal, etc.
  • soothing agents eg, Glucose, benzyl alcohol, etc.
  • cytotoxicity eg, interleukins such as interleukin-2, interferons such as interferon-a, etc.
  • the protein of the present invention When used as a vaccine preparation, the protein of the present invention may be used as an active form, or the protein of the present invention may be denatured to enhance antigenicity.
  • the protein of the present invention is usually denatured by heat treatment or treatment with a protein denaturant (eg, formalin, guanidine hydrochloride, urea).
  • the resulting vaccine preparation has low toxicity, and may be usually administered as an injection, for example, subcutaneously, intradermally, or intramuscularly, or may be locally administered to or near a cancer cell mass.
  • the dose of the protein of the present invention varies depending on, for example, the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.For example, when the protein of the present invention is subcutaneously administered to an adult (body weight of 6 O kg) suffering from cancer.
  • the dose is usually about 0.1 to 300 mg, preferably about 100 to 300 mg per time.
  • the vaccine preparation may be administered once, but the vaccine preparation may be administered 2 to 4 times at intervals of about 2 weeks to about 6 months in order to increase the amount of antibody produced. (7) DNA transfer animal
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention). And a non-human mammal having the same.
  • the present invention (1) a non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof,
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, the Lipofection method It can be produced by transferring the desired DNA by coagulation, microinjection, particle gun, DEAE-dextran, etc.
  • the exogenous DNA of the present invention intended for somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like can be transferred and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • non-human mammal for example, porcupine, pig, hidge, goat, porcupine, dog, cat, guinea pig, eight-star, mouse, rat and the like are used.
  • rodents with relatively short ontogenesis and biological cycle in terms of the creation of disease animal model systems, and easy to breed rodents especially mice (for example, pure strains such as C57B L / 6 strain, DBA2 strain, etc.)
  • a BeCS Fi strain, a BDFi strain, a B6D two strain, a BALBZc strain, an ICR strain, etc.) or a rat (eg, Wistar, SD, etc.) are preferable.
  • Examples of the “mammal” in the recombinant vector that can be expressed in mammals include humans in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • the mutant DNA of the present invention includes a mutation (eg, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention. DNA that has undergone exchange or the like is used, and abnormal DNA is also included.
  • a mutation eg, mutation
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of the normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal which is the same or different from the animal of interest.
  • a mammal which is the same or different from the animal of interest.
  • the human DNA of the present invention when transferred, it is derived from various mammals having the DNA of the present invention that are highly homologous to the DNA (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • Microinjection of a DNA construct eg, a vector, etc. to which a human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing the DNA of the present invention into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be created.
  • Examples of the expression vector of the protein of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, a bacteriophage such as ⁇ phage, a retrovirus such as Moroni leukemia virus, a vaccinia virus or a baculovirus. Animal viruses such as viruses are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates the expression of DNA include, for example, (i) DNA derived from virus (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.).
  • virus eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • Promo evening (ii) Promo evening from various mammals (human, egret, dog, cat, guinea pig, hams, rat, mouse, etc.), such as albumin, insulin II, perobrakin II, Elastase, erythropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor / 3, keratin Kl, 1 ⁇ 10 and 1114, collagen I Type and type II, cyclic AMP-dependent protein kinase) Bunite, dystrophin, tartrate-resistant alfa lipophosphatase, atrial sodium diuretic factor, endothelial receptor stoichiokinase (generally abbreviated as Tie 2), sodium potassium adenosine 3 kinase (Na, K-ATPase) ), Neurofilament light chain, meta-oral thione
  • cytomegalovirus promoter capable of high expression throughout the whole body
  • a human peptide chain elongation factor 1 (EF-lo!) Promoter a human and a chicken / 3-actin promoter, and the like are preferable.
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of a messenger RNA of interest in a DNA-transferred mammal (generally referred to as Yuichi Minei Yuichi).
  • the sequence of each DNA derived can be used, and preferably, SV40 terminator of Simian virus or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of the eukaryotic DNA, etc. are used to further express the target exogenous DNA at the 5 'upstream of the promoter region, the promoter region and the translation region. It is also possible to link between them or 3 ′ downstream of the translation region depending on the purpose.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is derived from the liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.). It is possible to obtain all or part of genomic DNA from DNA and various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblast-derived RNA as raw materials. I can do it.
  • the exogenous abnormal DNA is Alternatively, the translation region of a normal protein obtained from a tissue can be modified by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which it is linked to the downstream of the promoter and, if desired, to the upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after DNA transfer indicates that the progeny of the animal produced and the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Means to keep.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain exogenous DNA by mating, and should be subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. Can be done.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all of the offspring of the produced animal contain the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Means to have.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and finally promotes the function of endogenous normal DNA, thereby finally obtaining the protein of the present invention. It may develop hyperfunction and can be used as a model animal for the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. It is possible.
  • a preventive / therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention for example, Colorectal cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor or blood tumor, etc. It can also be used for screening tests for cancer prevention and treatment.
  • a non-human mammal having the foreign abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the foreign DNA is stably maintained by mating. I can do it. Further, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germinal cells of the animal produced after the transfer of DNA means that all the offspring of the animal produced have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal cells and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed the cells so that all offspring have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high level of expression of the abnormal DNA of the present invention, and finally inhibits the function of endogenous normal DNA to thereby ultimately convert the protein of the present invention. It may become functionally inactive refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA highly expressing animal of the present invention can be used to inhibit the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention in the function-inactive refractory disease of the protein of the present invention (dominant negative activity). Action).
  • the mammal into which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred Since it has increased protein symptoms, it is a prophylactic / therapeutic agent for the protein or function-inactive refractory of the present invention, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen It can also be used for screening tests for prophylactic and therapeutic agents for cancers such as cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, and blood tumor.
  • cancers such as cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor, and blood tumor.
  • cells of a tissue having DNA are cultured by standard tissue culture techniques, and these are used to study the function of cells from tissues that are generally difficult to culture,
  • each organ is removed from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells by using a protease such as trypsin. It is.
  • the protein-producing cell of the present invention can be identified, its relationship with apoptosis, differentiation or proliferation, or its signal transduction mechanism can be examined, and its abnormalities can be examined. It is an effective research material for elucidating proteins and their effects.
  • the functional inactivity of the protein of the present invention In order to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including type refractory disease, an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease using the above-described test methods and quantification methods, etc. Can be provided.
  • the transgenic animal of the present invention or the vector expressing the exogenous DNA of the present invention it is possible to examine and develop a DNA treatment method for a disease associated with the protein of the present invention. .
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the DNA is inactivated by introducing a reporter gene (eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli), and the reporter gene controls the promoter for the DNA of the present invention.
  • a reporter gene eg, a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli
  • the non-human mammal according to item (6) which can be expressed under
  • a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of DNA of the present invention which comprises administering a test compound to the animal according to (7) and detecting the expression of a reporter gene.
  • a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated is an artificially mutated DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, whereby the DNA expression ability is suppressed, or By substantially eliminating the activity of the protein of the present invention encoded by the DNA, the DNA substantially expresses the protein of the present invention.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells hereinafter, abbreviated as ES cells
  • knockout DNA of the present invention J
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be carried out, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated include, for example, DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be isolated, and a neomycin resistance gene, a drug resistance gene represented by a hygromycin resistance gene, or 1acZ (j3_galactosidase gene) Insertion of a repo overnight gene, such as cat (chloramphenicylacetyltransferase gene), disrupts exon function, or terminates transcription of the gene in the intron between exons.
  • a array of a repo overnight gene such as cat (chloramphenicylacetyltransferase gene), disrupts exon function, or terminates transcription of the gene in the intron between exons.
  • a DNA sequence constructed to disrupt the gene Abbreviated as a "getting vector” into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination method, and using the obtained ES cells as a probe with a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe for Southern hybridization analysis or targeting vector.
  • a probe for Southern hybridization analysis or targeting vector By analyzing the upper DNA sequence and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the preparation of the targeting vector by PCR using primers, and selecting the knockout ES cells of the present invention, Obtainable.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, or according to the known Evans and Kaufma method. May be newly established. For example, in the case of mouse ES cells, currently, 129 ES cells are generally used. Since the epidemiological background has not been established, C57BL / 6 mice and C57BLZ6 have been used for the purpose of obtaining ES cells that have a pure and immunologically clear genetic background. BDFi mice that have improved the low number of eggs collected by crossing with DBA / 2 (such as those established using F of C57BLZ6 and DBA / 2) can also be used successfully. In addition to the advantage of a large number of eggs and the robustness of the eggs, it has C57BL / 6 mice as its background. It can be used advantageously in that the genetic background can be replaced by C57BLZ6 mice by backcrossing with mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but in addition to this, a large number of cells can be efficiently collected by collecting 8-cell embryos and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce the complexity of culturing.
  • An example of a method for determining the sex of ES cells is a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR. With this method, the number of ES cells in a colony was about 1 (about 50), compared to about 10 6 cells for karyotype analysis.
  • the primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor required in the initial culture.
  • the embryonic stem cell line obtained in this way usually has very good growth potential, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ability to generate individuals.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen, in the presence of UF (1-10000 ⁇ / ⁇ )
  • Culture at about 37 ° C in 5% carbon dioxide gas, 90% air
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5mM EDTA, preferably Single cells are treated by about 0.1% trypsin / ImM EDTA
  • Such subculturing is usually performed every 1 to 3 days. At this time, it is desirable to observe the cells and discard the cultured cells if morphologically abnormal cells are found.
  • ES cells can be transformed into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH MJ Evans and MH
  • DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention can be used for cell biology of the protein of the present invention in the in vivo mouth. It is useful in
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level.
  • non-human mammal those similar to the above can be used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be obtained, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the DNA of the present invention into the targeting vector.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by homologous recombination of the inactivated DNA sequence with the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. it can.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be subjected to Southern hybridization analysis or overnight hybridization using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe.
  • the DNA sequence on the getter vector and the DNA sequence of a neighboring region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used for the getter vector can be determined by PCR analysis using primers as primers.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage of non-human cells.
  • the chimeric embryo is injected into a mammalian embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudo-pregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal comprising both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially altered DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a chimeric individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the added DNA locus of the present invention, for example, by judging coat color.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals with heterozygous expression of the protein of the present invention, which are crossed with individuals without heteroexpression of the protein of the present invention. An individual lacking homo-expression can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a getter vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the nucleus of an egg cell by a microinjection method.
  • a transgenic non-human mammal of the present invention by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination.
  • the animal individual obtained by mating can confirm that the DNA has been knocked out, and can carry out rearing in an ordinary rearing environment. .
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, a homozygous animal having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA can be bred. Breeding and passage of mouth-Zigot animals.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are very useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
  • non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, diseases caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Since it can be a model, it is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening a compound having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by DNA deficiency or damage of the present invention.
  • the present invention provides a method for administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal. And a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect against diseases caused by the above, for example, cancer.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound. '
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound, compared with a non-treated control animal, and changes in each organ, tissue, disease symptoms, etc. of the animal are used as indicators. Therapeutic and prophylactic effects of test compounds can be tested.
  • test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • test compound is administered to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and the difference in the degree of onset of cancer and the cure of cancer are compared with the group not administered with the test compound. Observe the difference over time in the above tissue.
  • the disease symptom of the test animal is improved by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the test compound can be selected as a compound having a therapeutic / preventive effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the test compounds described above, and has a therapeutic / preventive effect against a disease caused by a deficiency or damage of the protein of the present invention. It can be used as a safe and low toxic prophylactic and therapeutic agent. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be used similarly.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, alkali metals, etc.). And the like, and particularly preferred are physiologically acceptable acid addition salts.
  • salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) And succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • the dose of the compound or a salt thereof depends on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound when the compound is orally administered, in general, in an adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer patient, the compound is about 0.1 to 100 mg per day, preferably about 1. 0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration target, target disease, etc.
  • the dose can be administered in terms of the body weight of 6 O kg.
  • the present invention relates to an activity of a promoter for DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of a DNA of the present invention and detecting expression of a repo overnight gene.
  • the non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention, in which the DNA of the present invention introduces a repo overnight gene.
  • a reporter gene which can be expressed under the control of a promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • the reporter gene is coded because the reporter gene is under the control of the promoter of the DNA of the present invention. By tracing the expression of the active substance, it is possible to detect the activity of the promoter overnight.
  • a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is When the protein is replaced with the galactosidase gene (1 ac.Z), galactosidase is originally expressed instead of the protein of the present invention in the tissue where the protein of the present invention is expressed. Therefore, for example, the present invention can be easily performed by staining with a reagent serving as a substrate for ⁇ 8_galactosidase, such as 5-promo 4-chloro-3-indolyl] 3-galactopyranoside (X-gal). It is possible to observe the expression state of the protein in the animal body.
  • a reagent serving as a substrate for ⁇ 8_galactosidase such as 5-promo 4-chloro-3-indolyl] 3-galactopyranoside (X-gal). It is possible to observe the expression state of the protein in the animal body.
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde and the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature or at room temperature. After reacting at about 7 ° C for about 30 minutes to 1 hour, the i3-galactosidase reaction can be stopped by washing the tissue sample with ImM EDTA / PBS solution, and the coloration can be observed. . Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the compound or a salt thereof obtained by the above screening method is a compound selected from the test compounds described above, and is a compound that promotes or inhibits the promoter overnight activity against DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt
  • the salt of the compound may be a physiologically acceptable acid (eg, an inorganic acid) or a base (eg, an alkali metal).
  • physiologically acceptable acid addition salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.) and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Succinic acid tartaric acid,
  • the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity for DNA can inhibit the expression of the protein of the present invention or inhibit the function of the protein, for example, colon cancer, breast cancer, lung cancer, prostate cancer, It is useful as a prophylactic / therapeutic agent for cancers such as esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor and blood tumor.
  • cancers such as esophageal cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, kidney cancer, bladder cancer, uterine cancer, testicular cancer, thyroid cancer, kidney cancer, brain tumor and blood tumor.
  • a compound derived from the compound obtained by the above screening can also be used.
  • a drug containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned drug containing the protein of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys).
  • mammals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, Monkeys.
  • the dose of the compound or its salt may vary depending on the target disease, the subject of administration, the route of administration, and the like.For example, when the compound of the present invention that inhibits the promoter activity against DNA is orally administered. In general, in an adult (assuming a body weight of 60 kg) breast cancer patient, the compound is used in an amount of about 0.1 to 10 Omg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. Administer. In the case of parenteral administration, the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.For example, the compound of the present invention that inhibits the activity of the promoter against DNA may be in the form of an injection.
  • the compound When administered to an adult (assuming a body weight of 6 O kg) breast cancer patients, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg per day. Conveniently, 1 to 1 Omg is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of the weight per 6 O kg of body weight.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the promoter of the DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the cause or prevention of various diseases caused by DNA expression deficiency of the invention.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof and injected into an egg cell of an animal to produce a so-called transgenic animal (Creating a transgenic animal) will allow the protein to be specifically synthesized and its effects on the organism to be studied.
  • the protein of the present invention has the action of specifically promoting or inhibiting the ability to produce the protein itself in the body. 'Can be used as a search system for low molecular compounds.
  • bases, amino acids and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the relevant field, examples of which are described below.
  • optical isomer for an amino acid the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • EGTA Ethylene glycol-bis- (beta aminoethyl ether) tetraacetic acid
  • [SEQ ID NO: 7] 2 shows the amino acid sequence of hCP 1762319.
  • Example 3 shows the base sequences of the antisense oligonucleotides used in Example 2, Example 19, Example 20, and Example 21.
  • Example 3 shows the base sequences of the antisense oligonucleotides used in Example 2, Example 19, Example 20, and Example 21.
  • 1 shows the nucleotide sequence of DNA including the full-length gene encoding TACT 427-A and TACT 427-A2.
  • TACT427 shows the amino acid sequence of B2.
  • FIG 13 shows the nucleotide sequence of primer 7 used in Examples 6, 7, 8, and 20.
  • 15 shows the nucleotide sequence of primer 18 used in Examples 6, 7, 8, and 20.
  • Example 7 shows the nucleotide sequence of TaqMan probe 1 used in Example 6, Example 7, Example 8, and Example 20.
  • Example 13 shows the nucleotide sequences of sense oligonucleotides used in Examples 19, 20, and 21.
  • the transformant Escherichia coli TOPI 0 / 47427A / pCR-Bluntll-T0P0 obtained in Example 4 described below has been used since December 3, 2002, 1-1 1-1 Tsukuba-Higashi, Ibaraki Pref. 305-8566) at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) under the deposit number FERM BP-8253.
  • the gene expression level was normalized using the median expression level of all genes whose expression was detected by the oligonucleotide microarray as 1, ND; not detected
  • Gene expression level is determined by oligonucleotide microarray
  • a human non-small cell lung cancer cell line NCI-H460 purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) was added to RPMI-1640 medium (containing 25 mM HEPES) (Invitrogen) with 10% fetal bovine serum (ATCC). And seeded on a 96-well flat-bottomed tissue culture plate (BD Falcon) at a density of 4000 cells / well. After culturing at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, antisense oligonucleotides were transfected.
  • ATCC American Type Culture Collection
  • FLJ20539 gene SEQ ID NO: 2
  • hCP50177 gene which is a FLJ20539-related gene
  • hCP1762319 gene which is a FLJ20539-related gene
  • FLJ13515 gene SEQ ID NOS: 1 1
  • TACT427-A gene (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 4 or Example 5 described below 6
  • TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18)
  • TACT427-B gene (SEQ ID NO: 21)
  • TACT427-B2 gene (SEQ ID NO: 23)
  • TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26)
  • TACT427-A gene obtained in Example 4 or Example 5 described below 6
  • TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18)
  • TACT427-B gene SEQ ID NO: 21
  • TACT427-B2 gene (SEQ ID NO: 23)
  • TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26)
  • TACT427-A gene (SEQ ID NO: 1) obtained in Example 4 or Example 5 described below 6)
  • TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18)
  • TACT427-B gene (SEQ ID NO: 21)
  • TACT427-B2 gene (
  • HPLC purification was used for the introduction experiment (hereinafter, abbreviated as antisense oligonucleotide).
  • antisense oligonucleotide As a control, the reverse sequence (SEQ ID NO: 14) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 13 was similarly phosphorothioated, purified by HPLC, and used (hereinafter abbreviated as control oligonucleotide).
  • Antisense oligonucleotides or control oligonucleotides are diluted with Opti-MEM (Invitrogen), and FuGENE6 reagent (Roche Diagnostics) is added at a ratio of 4 times (4 L / zzg oligonucleotide). The solution was left at room temperature for 30 minutes. This oligonucleotide solution was added to the plate at a rate of 40 / well. The final concentration of the oligonucleotide was adjusted to 140 nM. After culturing for another 3 days under the above conditions, Cell Death Detection ELISA TM S Kit
  • the apoptosis-inducing activity of the above oligonucleotides was measured using (Roche Diagnostics) according to the attached protocol.
  • Cis induction activity ( ⁇ 405 — ⁇ 492 )
  • the human non-small cell lung cancer cell line NCI-H460 used in Example 2 was suspended in the same medium as in Example 2, and a 24-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) was used at a cell density of 24,000 cells / well. Seeded. After culturing overnight at 37 in a 5% carbon dioxide gas stream, antisense oligonucleotides and control oligonucleotides were transfected. The amount of the oligonucleotide solution added was adjusted to 390 / L / well, and the final concentration of the oligonucleotide was adjusted to 200 nM.
  • the cDNA corresponding to 10 ng in 1 RM RM was converted into type II, and two types of primers (primer 1 (SEQ ID NO: 30) and primer 1 (SEQ ID NO: 31)) and SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)
  • FLJ20539 gene SEQ ID NO: 2
  • hCP50177 gene related to FLJ20539 SEQ ID NO: 5
  • hCP1762319 gene related to FLJ20539 SEQ ID NO: 8
  • FLJ13515 gene SEQ ID NOS: 1 1
  • TACT427-A gene SEQ ID NO: 16
  • TACT427-A2 gene SEQ ID NO: 18
  • TACT427-B gene SEQ ID NO: 18
  • the expression amount of the / 3-actin gene contained in the same amount of type III cDNA was measured using TaqMan] 3-actin Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard.
  • the expression level of the 10 genes was 0.10% of the expression level of the j8-actin gene, whereas the antisense oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 13 was administered.
  • the expression level was 0.046%, indicating a statistically significant (P ⁇ 0.05) decrease in the expression level.
  • control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) administration group was 0.088%, and no statistically significant decrease in the expression level was observed as compared with the non-transfection group.
  • the results showed that a decrease in the expression level of the above 10 genes induced apoptosis of the human lung cancer cell line.
  • PCR was carried out using two kinds of primers [primer 3 (SEQ ID NO: 32) and primer 1 (SEQ ID NO: 33)].
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was as follows: cDNA 1 ⁇ 1 was used as type III, 6.25 U of PfuTurbo DNA Polymerase (STRATAGENE), primer 3 (SEQ ID NO: 32) and primer 1 (SEQ ID NO: 33).
  • STRATAGENE PfuTurbo DNA Polymerase
  • primer 3 SEQ ID NO: 32
  • primer 1 SEQ ID NO: 33
  • PCR reaction product was purified using a PCR Purification Kit (QIAGEN). This was subcloned into the plasmid vector PCR-Bluntll-T0P0 (Invitrogen) according to the instructions of the Zero Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (Invitrogen). This was introduced into Escherichia coli TOP10, and clones having cDNA were selected in LB agar medium containing kanamycin. As a result of analyzing the sequence of each clone, the nucleotide sequences of cDNAs represented by SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 21 were obtained.
  • the nucleotide sequence at positions 1 to 160 and 2483 to 2755 of the full length gene sequence of FU20539 represented by SEQ ID NO: 3 is added to the 5 'end and 3' end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21, respectively.
  • the base sequence thus obtained is shown in SEQ ID NO: 24.
  • a plasmid having a DNA fragment having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 is a plasmid having a DNA fragment having the nucleotide sequence represented by TACT427-A / pCR-Blntl-T0P0, and SEQ ID NO: 21 was named TACT427-B / pCR_B1until-T0P0.
  • a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 15) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 was named TACT427-A.
  • a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 20) encoded by the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 21 was designated as TACT427-B.
  • the transformant into which the plasmid TACT427-A / PCR-Bluntl-T0P0 was introduced was transformed into Escher ichia col 1: 0? 10/47427 eight 0-81111 ⁇ 11- [0? 0 and plasmid TACT427-B. / pCR-Blunt l l- T0P0-introduced transformant into Escherichia coli
  • the 833th g of the DNA encoding TACT427-A (SEQ ID NO: 16) is a and the 1482th g is In c, the 1590th a is replaced with g, the 2473th g is replaced with a, the 2476th g is replaced with c, and the 2909th t is replaced with c, and the 1015-1017 age is deleted.
  • SEQ ID NO: 17 shows a sequence in which the first to fourth amino acid sequences of the amino acid sequence of TACT427-A are deleted.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is named TACT427-A2.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding TACT427-A2 is shown in SEQ ID NO: 18.
  • TACT427-B2 A sequence in which the amino acid sequence at positions 1 to 4 of the amino acid sequence of TACT427-B is deleted Column number: shown in 22
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 is designated as TACT427-B2.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding TACT427-B2 is shown in SEQ ID NO: 23.
  • the nucleotide sequence of DM encoding TACT427-A (SEQ ID NO: 16) is
  • nucleotide sequence of the DNA encoding FLJ20539 (SEQ ID NO: 2).
  • nucleotide sequence at positions 1 to 138 and 889 to 3072 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 the nucleotides at positions 1 to 138 and 139 to 2322 of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 Correspond to each other, and show 99.3% and 100% homology in each partial sequence, respectively.
  • the nucleotide sequence of A encoding FLJ20539 (SEQ ID NO: 2) is based on the absence of the nucleotide sequence corresponding to positions 139 to 888 of the nucleotide sequence of DNA encoding TACT427-A (SEQ ID NO: 16). This sequence is a sequence specific to TACT427-A. -
  • TACT427-A Compared to TACT427-A, TACT427-A2, TACT427-B and TACT427-B2 show the highest homology to FLJ20539 and have similar base substitutions and deletions of base sequences.
  • Fig. 1 shows the hydrophobicity plot of TACT427-A
  • Fig. 2 shows the hydrophobicity plot of TACT427-A
  • Fig. 3 shows the hydrophobicity plot of TACT427-B2.
  • the sex plots are shown in Figure 4 respectively.
  • Example 5 Cloning of cDNA encoding TACT427-C and TACT427-C2 derived from human lung cancer cell line NCI-H522 and determination of nucleotide sequence Human non-small cell lung cancer cell line NCI-H522 (purchased from ATCC) in RPMI-1640 medium
  • QIAGEN RNeasy Mini Total RNA Kit
  • reverse transcription was performed using TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems) according to the attached protocol to obtain cDNA.
  • the cDNA obtained here was designated as type III, and a PCR reaction was carried out using two kinds of primers [primer 5 (SEQ ID NO: 34) and primer 6 (SEQ ID NO: 35)].
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was prepared using the above cDNA as type III, and PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase.
  • nucleotide sequences at positions 1 to 160 and 2483 to 2755 of the full length gene sequence of FU20539 represented by SEQ ID NO: 3 were added to the 5 'end and 3' end of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26, respectively.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 29.
  • a plasmid having a DNA fragment having the base sequence of SEQ ID NO: 26 was designated as TACT427-C / pCR-Bluntll-TOP0.
  • a protein containing the amino acid sequence (SEQ ID NO: 25) encoded by the nucleotide sequence of DNA represented by SEQ ID NO: 26 was designated as TACT427-C.
  • Val at position 491 of the amino acid sequence of TACT427- ⁇ corresponds to Met, Glu at position 825 to Lys, and 826 at position 826.
  • Ala is replaced by Pro
  • 970th Val is replaced by Ala
  • 340th Ser is deleted.
  • the base sequence of the DNA encoding TACT427-A (SEQ ID NO: 16) has the 504th a and the 939th a g, 1471 g to a, 1482 g to c, 1590 a to g, 2473 g to a, 2476 g to c, 2909 t to c Each has been replaced and the ages 1015 to 1017 have been deleted.
  • SEQ ID NO: 27 shows a sequence in which the first to fourth amino acid sequences of TACT427-C are deleted.
  • the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is named TACT427-C2.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding TACT427-C2 is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding TACT427-C (SEQ ID NO: 26) showed the highest homology to the nucleotide sequence of the DNA encoding FU20539 (SEQ ID NO: 2) in humans.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 is represented by positions 1 to 138 and 139 to 2322.
  • the third base sequence corresponds, and shows 99.3% and 99.5% homology in each partial sequence, respectively.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoded by FLJ20539 (SEQ ID NO: 2) lacks the DNA nucleotide sequence corresponding to positions 139 to 885 represented by TACT427-C (SEQ ID NO: 26). , TACT427-C-specific sequence.
  • TACT427-C2 shows the highest homology to FU20539 and has a similar nucleotide sequence deletion.
  • amino acid sequence of amino acids 734-791 of TACT427-C (SEQ ID NO: 25) and the amino acids 730-787 of amino acid sequence of TACT427-C2 (SEQ ID NO: 27) are both amino acid domains.
  • a motif search site, SMART (hi tp: // smart t. Embl-heidelberg. De /), has a chloropaxoxidase motif, suggesting that it has clonal lopoxidase activity.
  • the TACT427-A gene (SEQ ID NO: 16), the TACT427-A2 gene (SEQ ID NO: 18), the TACT427-B gene (SEQ ID NO: 21), the TACT427-B2 gene (SEQ ID NO: : 23), TACT427-C gene (SEQ ID NO: 26) and TACT427-C2 gene (SEQ ID NO: 28) may be collectively abbreviated as TACT427 gene.
  • TACT427-A protein (SEQ ID NO: 1'5), TACT427-A2 protein (SEQ ID NO: 17), TACT427-B protein (SEQ ID NO: 20), TACT427-B2 protein (SEQ ID NO: 22), TACT427-C
  • the protein (SEQ ID NO: 25) and TACT427-C2 protein (SEQ ID NO: 27) may be collectively abbreviated as TACT427 protein.
  • composition of the reaction solution in the reaction was determined using the above cDNA 11 as type II,
  • the total amount of the above genes was about 7 times and about 16 times that of the surrounding normal tissues in 2 out of 4 human breast cancer tissues, respectively, and in 2 out of 3 human lung cancer tissues compared to the surrounding normal tissues, respectively.
  • About 3 times, about 2 times, human colorectal cancer tissue about 4 times out of 5 cases, about 2 times, about 8 times, about 3 times, about 4 times higher than surrounding normal tissues, respectively, 2 out of 3 human rectal cancer tissues Approximately 10 times and 5 times higher than the surrounding normal tissue in 2 cases, and 3 times higher than the surrounding normal tissue in 2 out of 5 human ovarian cancer tissues, respectively. It showed about 20 times the expression level.
  • Example 6 Expression of the gene used in Example 6 in cancer tissue and normal tissue by using the cDNA prepared from human lung cancer tissue (purchased from Direct Clinical Access and BioClinical Partners) as type III in the same manner as in Example 6. A comparison of the amounts was made.
  • the composition of the reaction solution in this reaction was the same as that in Example 6, except that 1 l of the above cDNA was used as a type III PCR reaction.
  • 3-actin gene contained in the cDNA 11 was calculated using TaqMan TM Human iS-actin Control Reagents (Applied Biosystems) and used as an internal standard.
  • the total amount of the above genes was about 144 times, about 3 times and about 3 times higher in 8 of 10 human lung cancer tissues than in normal lung tissues in the samples of Direct Clinical Access. It increased 5 times, about 4 times, about 4 times, about 13 times, about 3 times, and about 19 times, and markedly increased expression in human lung cancer tissues.
  • Human colon cancer cell line C0CM1 Human non-small cell lung cancer cell line VMRC-LCD and human prostate cancer cell line PC3 were purchased from JCRB. These cell lines may be used in Examples 9 and subsequent Examples.
  • RNA was prepared.
  • cDNA was prepared by a reverse transcription reaction using a random primer.
  • the genes FLJ20539 gene SEQ ID NO: 2
  • hCP50177 gene SEQ ID NO: 5
  • hCP1762319 gene SEQ ID NO: 8
  • FLJ13515 gene SEQ ID NO: 1
  • the copy number of the ⁇ -actin gene contained in 1 ng of the total RNA was calculated and used as an internal standard.
  • [Table 6] shows the relative expression rates obtained by standardizing the expression level of the whole gene with the expression level of the / 3-actin gene. Thirteen cancer cell lines in which the total amount of the above gene expression exceeded 1% of the ⁇ -actin gene expression amount were found, and high expression of the above gene in the cancer cell lines was confirmed.
  • An expression vector for animal cells expressing a protein obtained by fusing 3 ⁇ FLAG fragment to the C-terminus of TACT427-A protein and TACT427-B protein was constructed.
  • TACT427-A / pCR-Blunt 11-T0P0, TACT427-B / pCR-Blunt 11-T0P0, and p3xFLAG-CMV-14 (Sigma) obtained in Example 4 were treated with restriction enzymes EcoRI and Xbal. After separation by gel gel electrophoresis, DNA fragments corresponding to TACT427-A, TACT427-B and p3xFLAG-CMV-14 were collected and purified using Gel Extraction Kit (QIAGEN). Each DNA fragment was subjected to a ligation reaction using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio), and then introduced into E. coli TOP10, and selected in LB agar medium containing ampicillin. Analysis of the sequences of individual clones revealed that the TACT427-A protein
  • An expression vector for animal cells expressing the TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15) was constructed.
  • PCR reaction was performed using Primer 9 (SEQ ID NO: 39) and Primer 10 (SEQ ID NO: 40).
  • the composition of the reaction solution used was 200 ng of p3xFLAG_TACT427-A as type III, and 2.5 U of Pfu Turbo Hot Start DNA Polymerase (STRATAGENE) and 9 U of primer.
  • peptides 1 to 3 Based on the amino acid sequence of the TACT427 protein, the following three peptides (peptides 1 to 3) consisting of 15 amino acids were synthesized using the Fmoc solid phase synthesis method.
  • amino acid sequence of peptide 1 [Gly-Ser-Gly_Glu-Glu-Asn-Asp-Pro-Gly_Glu-Gin-Ala-Leu-Pro-Cys (SEQ ID NO: 41)] is the TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15). ) Is a sequence in which Cys has been added to the C-terminal of the amino acid sequence from the 220th to the 233rd position.
  • amino acid sequence of peptide 2 [G1yProA1aG1uG1yPr0-A1aG1uProA1aA1aG1uA1aSer-Cys (SEQ ID NO: 42)] is TACT427- This is a sequence in which Cys has been added to the C-terminal of the amino acid sequence from position 517 to position 530 of protein A (SEQ ID NO: 15).
  • the amino acid sequence of peptide 3 [Gly-Ser_Vat Gly-Gly-Asn-Thr-Gly-Vat Arg-Gly-Lys-Phe-Glu-Cys (SEQ ID NO: 43)] is the TACT427-A protein (SEQ ID NO: 43). : This is a sequence obtained by adding Cys to the C-terminal of the amino acid sequence from position 800 to position 813 in 15). Whole lysate was conjugated to mosaicin (KLH) as a carrier protein, and used as an antigen to prepare a rabbit polyclonal antibody as follows.
  • KLH mosaicin
  • the immunized animal was a male male egret KBL: JW (1 week old, Oriental yeast).
  • the first sensitization was complete Freund's adjuvant (Difco) suspension.
  • the second and subsequent times were incomplete Freund's adjuvant (Difco)
  • the suspension was used.
  • Sensitization is subcutaneous back injection A single sensitization was performed using 0.5 mg of each antigen, and was repeated three times every 14 days after the first sensitization. On the 52nd day after the first sensitization, blood samples were collected under anesthesia to obtain about 50 ml of serum.
  • the serum thus obtained was concentrated by ammonium sulfate salting out method, and the entire amount of the obtained crude IgG fraction was purified by a protein A affinity column (Amersham-Bioscience) to obtain peptide 1, peptide Approximately 223 mg, approximately 495 mg, and approximately 390 mg of purified IgG were obtained from a heron immunized with 2 or peptide 3. Furthermore, IgG fractions that bind to each of the immunogenic peptides immobilized on the column were obtained using purified IgG II lmg for peptide 1, purified 248 nig for peptide 2 and 195 mg of purified IgG for peptide 3 as materials.
  • TACT427-A protein SEQ ID NO: 15
  • the detection of the TACT427-A protein was performed using the rabbit serum containing the peptide antibody prepared in Example 11.
  • Ox cells were suspended in 9 ml of Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and seeded on a 10 cm diameter petri dish. After culturing overnight at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream, mix with FuGene6 Transfection Reagent 18 ⁇ 1 (Roche Diagnostics) and 0PTI-MEM I (Invitrogen) in advance and mix with room temperature. Then, p3xFLAG-TACT427-A 6 / g, which had been left for 15 minutes at, was added, and the culture was continued under the same conditions.
  • RIPA buffer 50 Tris-HCl buffer, H7.5, 150 mM sodium chloride, l% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% Deoxycholic acid, Complete TM taplets (Roche Diagnostics), Phosphatase Inhibitor Cocktail 1-2 (Sigma)] 8001. Left at C for 15 minutes. This The RIPA buffer was recovered, and the supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes was used as a cell-free extract, and 201 was subjected to 303_? 66 on a 7.5% acrylamide gel.
  • RIPA buffer 50 Tris-HCl buffer, H7.5, 150 mM sodium chloride, l% Triton X-100, 0.1% SDS, 1% Deoxycholic acid, Complete TM taplets (Roche Diagnostics), Phosphatase Inhibitor Cocktail 1-2 (Sigma)
  • the proteins separated by electrophoresis are transferred to a clear blot P membrane (ATT0) according to a conventional method, and then transferred to a blocking solution (Tris buffered saline, 0.1% Tween-20, 5% skim milk). Left at room temperature for hours.
  • a blocking solution Tris buffered saline, 0.1% Tween-20, 5% skim milk.
  • three kinds of egret serum containing the peptide antibodies AS-2480, AS-2481 or AS-2482 prepared in Example 11 were diluted 100-fold in a blocking solution, and added at 4 ° C.
  • an HRP-labeled bovine IgG antibody (Amersham Bioscience) was diluted with a blocking solution to 100,000-fold and left at room temperature for 1 hour in a secondary antibody solution. Detection was performed according to the protocol attached to ECL plus (Amersham-Bioscience).
  • Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience) suspension (1 ml) was added to 1 ml of the cell-free extract prepared by the same procedure as in Example 12 using p3xFLAG-TACT427-A obtained in Example 9. (Suspended in a volume of RIPA buffer) and 50 Persimmon serum 31 were added, and the mixture was stirred at 4 ° C overnight.
  • egret serum any one of three kinds of egret serum containing the peptide antibodies AS-2480, AS-2481 or AS-2482 prepared in Example 11 was used.
  • the cell-free extract was prepared according to the method described in Example 12.
  • the cell-free extract was prepared according to the method described in Example 12.
  • A549, NCI-H226, NCI-H522 and ZR-75-1 cell-free extracts each containing 1 ml of Protein G-Sepharose 4FF (Aiersham-Bioscience) suspension (suspended in an equal volume of RIPA buffer) ) And 3 g of the peptide antibody AS-2482 prepared in Example 11 and stirred at 4 ° C.
  • lxlO HEK293 cells derived from human fetal kidney were suspended in Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH), and 2 slides of L-poly-D-resin-coated culture slides were prepared. (BD Falcon). Similarly 5xl0 4 pieces A human non-small cell lung cancer cell line NCI-H460 was suspended in RPMI1640 medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH) and a 2 ⁇ L-poly-D-lysine coated culture slide was prepared.
  • mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) diluted to 10 g / ml with PBS containing 1% BSA, react at room temperature for 45 minutes, wash with PBS, then contain 1% BSA Alexa488-labeled anti-mouse IgG antibody (Molecular Probes) diluted to 10 g / ml with PBS was added. After reacting again at room temperature for 45 minutes, the plate was washed with PBS, and observed with a fluorescence microscope.
  • TACT427-A protein was expressed on the cell membrane in both HEK293 and NCI-H460.
  • the pcDNA3.1 (+)-TACT427-A plasmid was introduced into HEK293 cells, and 10 xg / ml of AS-2480, AS-2481 and AS-2482 were used as primary antibodies, and lOg / ml of When the localization of TACT427-A protein was examined using Alexa488-labeled anti-Peacock IgG antibody (Molecular Probes) as a secondary antibody, it was revealed that the protein was also expressed on the cytoplasmic membrane.
  • Alexa488-labeled anti-Peacock IgG antibody Molecular Probes
  • p3xFLAG-TACT427_A plasmid was introduced into HEK293 cells, and after 48 hours, the protein exposed on the cell surface was labeled with biotin using the Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics).
  • the Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics).
  • 1 ml of the cell-free extract prepared according to the method of Example 12 and mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma) 3 immunoprecipitation was performed according to the method of Example 13 and SDS ⁇ PAGE was performed.
  • TACT427 protein Localization of TACT427 protein (Piotin labeling)
  • A549 non-small cell lung cancer cell line which was seeded on a Petri dish with a diameter of 1 Ocm and cultured to subconfluency, was washed with PBS, then added PBS containing 3% BSA and 5mM EDTA, left at room temperature for 15 minutes, and A549 cells was dispersed. Next, buffer A [HBSS (Hanks' Balanced Salt) containing 2% fetal calf serum (JRH) and 0.1% sodium azide
  • Solut ions, Invitro en)] suspend A549 cells to a concentration of lxlO 6 cells / ml, and prepare AS-2482 or non-immune egret IgG (Jackson Was added and left on ice for 5 hours. Subsequently, after washing the cells with buffer A, lOg / ml The cells were suspended in buffer A containing Alexa488-labeled anti-Peacock IgG antibody (Molecular Probes) and left on ice for 1.5 hours. After washing again with buffer A, analysis was performed with FACScan (BD Biosciences). As a result, A549 cells were stained specifically for the egret peptide antibody AS-2482. It was revealed that it was expressed above.
  • Human non-small cell lung cancer cell lines other than NCI-H460 described in Example 2 it was examined whether apoptosis was induced by introduction of antisense oligonucleotide.
  • Human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226 (both purchased from ATCC) were added to Kaighn's modified F-12 Nutrient Mixture (Invitrogen) and RPMI-1640 medium (Invitrogen) containing 25 mM HEPES, respectively.
  • the cells were suspended in a medium supplemented with 10% bovine fetal serum (JRH) and seeded on a 96-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) at a cell density of 1 ⁇ 10 4 cells / well. After culturing overnight at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, oligonucleotides were introduced.
  • JRH bovine fetal serum
  • the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) used in Examples 19, 20, and 21 described below has a sequence complementary to the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) described in Example 2. After being phosphorothioated, it was purified by HPLC and used (hereinafter abbreviated as sense oligonucleotide).
  • the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14), and sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) obtained in Example 2 were used. ), 0.05 g of each, together with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 0.81, 0PTI-MEM I
  • the apoptosis-inducing activity of the oligonucleotide was measured according to the protocol attached to Cell Death Detection ELISA PLUS (Roche Diagnostics).
  • the antisense oligonucleotide was a negative control, showed 1.65-fold and 3.03-fold apoptosis-inducing activities, respectively, and showed a statistically significant difference ( ⁇ 0.01).
  • FLJ20539 gene (SEQ ID NO: 2), hCP50177 gene (SEQ ID NO: 5), hCP1762319 gene (SEQ ID NO: 8) and FLJ13515 in human non-small cell lung cancer cell lines ⁇ 549 and NCI-H226 by introduction of antisense oligonucleotides Gene (SEQ ID NO: 11) and TACT427 gene mRNA expression decrease
  • the human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI-H226 were each suspended in the same medium as in Example 19, and 7.5 ⁇ 10 4 cells / A well for the A549 cell line and NCI-H226 for the NCI-H226 cell line.
  • the cells were seeded on a 24-well flat bottom tissue culture plate (BD Falcon) at a cell density of 5 ⁇ 10 4 cells. After culturing at 37 ° C overnight in a 5% carbon dioxide gas stream, the oligonucleotide was Exceeded.
  • the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 1
  • RPMI-1640 medium (Invitrogen) 1251 containing 25 mM HEPES containing 30% fetal calf serum (JRH) was added.
  • cDNA was prepared from total RNA by reverse transcription using random primers.
  • FLJ20539 gene SEQ ID NO: 2
  • hCP50177 gene SEQ ID NO: 5
  • hCP1762319 gene SEQ ID NO: 8
  • the expression levels of the FLJ13515 gene SEQ ID NO: 11
  • the TACT427 gene were measured.
  • the internal standard was measured using TaqMan TM jS-actin Control Reagents (Applied Biosystems).
  • the relative expression ratio () of the above gene to 0-actin gene expression amount is When the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13) was introduced, the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) or the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) used as the negative control was introduced. The expression level was remarkably decreased, and a statistically significant (P ⁇ 0.01) decrease in the expression level was observed (Table 7).
  • Human non-small cell lung cancer cell lines A549 and NCI H226 were suspended in the same medium as each Example 19, 2.25X10 6 pieces in the A549 cell line, NCI-H226 in cell lines 1.45X 10 6 cells with a diameter of 10cm Seeded on Petri dishes (BD Falcon). After overnight culture at 37 ° C. in a 5% carbon dioxide gas stream, the oligonucleotides were transfected.
  • each of the antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 13), the control oligonucleotide (SEQ ID NO: 14) and the sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 44) was Mix with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 96 1 and 6 ml of Opti-MEM I (Invitrogen), It was left at room temperature for 20 minutes. The whole volume of the mixture was added to A549 cells whose medium had been exchanged to 6 ml of 0 ⁇ - ⁇ I (Invitrogen) in advance, and the culture was further continued for 3 hours. Then, 10% fetal bovine serum (JRH) was added. The medium was replaced with 15 ml of Kaighn's modified F-12 Nutrient Mixture (Invitrogen).
  • Opti-MEM I Invitrogen
  • 601 Invitrogen
  • OTTI-MEM I Invitrogen
  • Example 12 After the transfection, the culture was further continued for 24 hours, 48 hours, and 72 hours, and then a cell-free extract was prepared according to the method of Example 12. The protein concentration of the obtained cell-free extract was measured using a BCA Protein Assay Kit (Pierce), and the protein concentration in each cell-free extract was adjusted. 100 g of the cell-free extract of the A549 cell line and 140 g of the cell-free extract of the NCI-H226 cell line were subjected to SDS-PAGE and Western plotting according to the method of Example 12 respectively. AS-2482 prepared in Example 11 was used as the primary antibody at a concentration of 3 g / ml, and the HRP-labeled anti-Egret IgG antibody was used as the secondary antibody.
  • A31 cells Balb3T3-A31 (hereinafter abbreviated as A31 cells).
  • Five 1.25xl0 A31 cells were suspended in 2.5 ml of Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal calf serum (JRH) and 50 g / ml gentamicin (Invitrogen). After seeding the wells, the cells were cultured overnight at 37 ° C under a 5% carbon dioxide gas stream. After replacing the medium with 2.5 ml of the same medium and continuing the culture for 4 hours, FuGENE6 Transfusion Reagent 3.8 / i 1 (Roche Diagnostics) and OPTI-MEM I
  • Example 13 Western blotting was performed using a mouse anti-FLAG M2 antibody (Sigma, diluted 1000-fold), and a 3xFLAG tag was added to the C-terminal of the TACT427-A protein (SEQ ID NO: 15). A cell line TACT-1 that constitutively expresses the protein added with was obtained.
  • TACT-1 and its parental A31 cells obtained in Example 22 were subjected to a Dulbecco's modified minimal minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH) and 50 g / ml gentamicin (Invitrogen). suspended and seeded on 6Xl0 96 well plate for three to become by Usorezore tissue culture per Ueru in ml. After culturing at 37 ° C in a 5% carbon dioxide gas stream, ⁇ after adding the topoisomerase I inhibitor camptothecin (Wako Pure Chemical) or the protein synthesis inhibitor anisomycin (Wako Pure Chemical) to various concentrations. The medium was replaced and the culture was continued.
  • Invitrogen Dulbecco's modified minimal minimal medium
  • JRH fetal bovine serum
  • Invitrogen 50 g / ml gentamicin
  • phosphorylation of MAP kinase involved in the anti-apoptosis action was performed on A31 cells. Compared to the strain. Dulbecco's modified Eagle's minimal medium (Invitrogen) containing 10% fetal bovine serum (JRH) and 50 g / ml gentamicin (Invitrogen) was used for A31 cells, and 0.6 mg was added to the same medium for TACT-1 cells.
  • Invitrogen Dulbecco's modified Eagle's minimal medium
  • JRH fetal bovine serum
  • Invitrogen 50 g / ml gentamicin
  • the cells were cultured at 37C in a 10% diameter petri dish (BD Falcon) in a 5% carbon dioxide gas stream. When the cell density reached about 80% confluence, the medium was replaced with the above medium containing 1 g / ml anisomicin (Wako Pure Chemical), and culturing was continued at 37 ° C for 1, 4 and 8 hours.
  • Each of these cells was ice-cooled in PBS (Ca, Wash twice with 10 ml (without Mg) and 0.5 ml of cell lysis buffer [1% Triton X-100, 1% dexocholic acid, 0.05% SDS, 5.25 mM EGTA, Complete TM tablets without EDTA (Roche Diagnostics), Phosphatase inhibitor cocktail-2 (Sigma), and 5 (M1 Tris / HCl buffer, 'H7.5] containing 150 mM sodium chloride were added and left at 4 ° C for 20 minutes.
  • the lysate was collected and centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C to remove the precipitate.5x concentrated SDS-PAGE sample buffer containing 10% 2-mercaptoethanol in 80 l of this lysate Add 20 1 (Bio Rad) and heat for 5 minutes at 95 ° C. Dilute the 5 l cell lysate 10-fold with distilled water and follow the procedure of Micro BCA protein assay reagent (Pierce). Measure the protein concentration and use appropriate sample buffer (Bio Rad) containing 1% 2-mercaptoethanol for SDS-PAGE.
  • the protein concentration was adjusted by dilution
  • the total protein M / ig was subjected to SDS-PAGE on a 7.5% polyacrylamide gel, and then transferred to a PVDF membrane
  • the transferred membrane was TTBS containing 5% skim milk (0.1% After blocking for 1 hour at room temperature with TBS containing Tween 20), the cells were washed twice with TTBS for 10 minutes, followed by anti-ERK1 / 2 antibody (Cell signaling) or anti-phosphorylated ERK1 / 2 antibody (Cell signaling).
  • Cell signaling anti-ERK1 / 2 antibody
  • Cell signaling anti-phosphorylated ERK1 / 2 antibody
  • the developed film was read as an image with a lumino image analyzer LAS-IOOOplus (FUJIFILM), and phosphorylated ERK1 and phosphorylated using the attached image gauge software.
  • the band intensity of oxidized ERK2 was quantified.
  • the phosphorylation of ERK1 in TACT-1 cells was calculated for each of the treatment times (2 hours, 4 hours, and 8 hours) with the band intensity of A31 cells as 100% and the increase in TACT-1 cell phosphorylation.
  • Enhanced rates are 164%, 150% and 158%, enhanced phosphorylation of ERK2 The rates were 130%, 137% and 172%.
  • a cell lysis buffer containing Cocktail-1 0.2 ml was added, and the mixture was left at 4 ° C for 15 minutes.
  • the cell lysate was collected with a scraper and centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C to remove the precipitate.
  • 201 1 of a 5-fold concentrated SDS-PAGE sample buffer (Bio Rad) containing 5% 2-mercaptoethanol was added, and the mixture was heated at 95 ° C for 5 minutes.
  • the cell lysis buffer was diluted 20 times with distilled water, and the cell lysate was diluted 20-fold with a 20-fold dilution.
  • the protein concentration was measured according to the formulation of Micro BCA protein assay reagent (Pierce).
  • the protein used in the present invention is specifically expressed in cancer cells and is one of diagnostic markers for cancer. Therefore, a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the protein, a compound or a salt thereof that inhibits the expression of the protein gene Salts include, for example, colon, breast, lung, prostate, esophagus, stomach, liver, biliary tract, spleen, kidney, bladder, uterus, testis, thyroid, kidney, brain tumor Or it can be safely used as a therapeutic agent for the prevention of cancer such as blood tumors. Preferably, it is a prophylactic or therapeutic agent for breast cancer, lung cancer and the like. Further, the compound or its salt that inhibits the activity of the protein or the compound or its salt that inhibits the expression of the protein gene can be used safely, for example, as a cancer cell apoptosis promoter.
  • the antisense polynucleotide or antibody of the present invention can inhibit the expression and activity of the protein used in the present invention.
  • Prevention of cancer such as biliary tract cancer, spleen cancer, renal cancer, bladder cancer, uterine cancer, testis cancer, thyroid cancer, thyroid cancer, brain tumor or blood tumor. It can be used safely as a therapeutic agent, preferably as a preventive or therapeutic agent for breast cancer, lung cancer, etc., or as an apoptosis-promoting agent for cancer cells.

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Abstract

　配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７、配列番号：１０、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２５または配列番号：２７で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、該タンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物、該タンパク質またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体などは、癌などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などとして有用である。

Description

明 細 書 癌の予防 ·治療剤 技術分野
本発明は、 新規タンパク質、 癌の予防 ·治療剤および診断薬などに関する。 背景技術
近年のマイクロアレイ ·オリゴヌクレオチドアレイ技術の進歩により、 遺伝子 現の網羅的な解析が可能となってきた。 癌においても遺伝子のマイクロアレイ プロフアイリングデータでその病態が評価しうることも予見され、 実際、 白血病 においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告 されている。 また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、 その分 類を積み重ねることによって、 特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定 の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考 えられる。 具体的には、 ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められ る場合には、 新たに抗原陽性と診断された患者に対して （i) その発現量を低下 させる、 （i i) 機能を抑制する、 （i i i) 該タンパク質に対する宿主免疫応答を 顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。 これと同時 に、 抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるな ど、 患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。 以上のように発現 プロファイル解析は、 癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなし うるものと期待されている。
一方、 FU20539遺伝子 （GenBank Access i on No. AK000546) は、 ヒト胃癌細胞 株 KAT0I I I由来のライブラリーからクローニングされた遺伝子であり、 774ァミノ 酸からなるタンパク質をコードしている （GenBank Access i on No. BAA91245) 。
FLJ 13515遺伝子 (GenBank Access i on No. AK023577) は、 ヒト胎盤由来のライブ ラリーからクロ一ニングされた遺伝子であり、 639アミノ酸からなるタンパク質 をコードしている （GenBank Access i on No. BAB14613) 。 このタンパ々質は . FLJ20539遺伝子によってコードされるタンパク質の 136番目から 774番目までのァ ミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有しているが、 440番目のアミノ酸はダル 夕ミン酸からリジンに置換されている。 さらに、 これら 2種類のヒト遺伝子に相 同性を示すマウス遺伝子 （GenBank Accession No. BC006896) がマウス乳癌組織 由来のライブラリ一からクロ一ニングされており、 1018アミノ酸からなるタンパ ク質をコードしている （GenBank Accession No. AAH06896) 。 このマウス遺伝子 は FLJ13515遺伝子に対して塩基配列で約 83%、 アミノ酸配列で約 86%の相同性を 有している。
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、 癌細胞の増殖阻害を誘導する安全 な薬剤が切望されている。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 癌組織で 発現が顕著に増加する遺伝子を見出した。 この知見に基づいて、 さらに検討を重 ねた結果、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 1 5、'配列番号： 17、 配列 番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表される ァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質 またはその塩、
(2) 配列番号： 1 5、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列からなるタンパク 質またはその塩、
(3) 上記 （1) 記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(4) 上記 （1) 記載のタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
(5) DNAである上記 （4) 記載のポリヌクレオチド、
( 6 ) 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列 番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 26または配列番号： 28で表される 塩基配列を含有する上記 （5) 記載のポリヌクレオチド、
(7) 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 26または配列番号： 28で表される塩基配列からなるポリヌクレオ チド、
(8) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有する組換え クタ一、
(9) 上記 （8) 記載の組換えベクターで形質転換され 形質転換体、
(10) 上記 （9) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （1) 記載のタンパク質 またはその部分ペプチドを生成 '蓄積せしめることを特徴とする上記 （1) 記載 のタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法、
(11) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有してなる医薬、
(12) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬、
(13) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、
(14) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 に対する抗体、
(14 a) 癌の予防 ·治療作用を有する上記 （ 14) 記載の抗体、 ,
(14b) アポト一シス促進活性を有する上記 （14) 記載の抗体、
(14 c) 癌細胞のアポ卜一シス促進活性を有する上記 （14) 記載の抗体、
(15) 上記 （14) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(16) 上記 （14) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(17) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(18) 上記 （17) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医
(19) 上記 （14) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （1) 記載の タンパク質の定量方法、 ，
(20) 上記 （19) 記載の定量方法を用いることを特徴とする上記 （1) 記 載の夕ンパク質の機能が関連する疾患の診断方法、
(21) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を用いることを特徴とする、 上記 （1) 記載のタンパク質の活性を阻害する化合 物またはその塩のスクリーニング方法、
(22) 上記 （1) 記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩 を含有してなる、 上記 （1) 記載のタンパク質の活性を阻害する化合物またはそ の塩のスクリーニング用キット、
(23) 上記 （21) 記載のスクリーニング方法または上記 （22) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質の活性を 阻害する化合物またはその塩、
(24) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 上記 (1) 記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリー ニング方法、
(25) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 上記 （1) 記載 のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キ ット、
(26) 上記 （24) 記載のスクリーニング方法または上記 （25) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のタンパク質遺伝子の 発現を阻害する化合物またはその塩、
(27) 上記 （23) または上記 （26) 記載の化合物またはその塩を含有し てなる医薬、
(28) 配列番号： 1または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチ ドをコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な 塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド、
(29) 上記 （28) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医 薬、
(30) 上記 （28) 記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診 断薬、
(31) 配列番号： 1または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体、
(32) 上記 （31) 記載の抗体を含有してなる医薬、
(33) 上記 （31) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(34) 配列番号： 1または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチ ドをコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる診断薬、 ^
(35) 癌の予防 ·治療剤である上記 （11) 、 （12) 、 （15) 、 (1 8) 、 （27) 、 （29) または （32) 記載の医薬、
(35 a) 癌が、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍また は血液腫瘍である上記 （35) 記載の医薬、
(35 b) 乳癌または肺癌の予防 ·治療剤である上記 （32) 記載の医薬、
(36) 癌の診断薬である上記 （13) 、 （16) 、 （30) 、 （33) また は （34) 記載の診断薬、
(36 a) 癌が、 大腸癥、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆 道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍また は血液腫瘍である上記 （36) 記載の診断薬、
(37) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活 性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、 ，
(38) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺 伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤、
(39) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用 いることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリ一二ング方法、
(40) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 1 5、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含 有することを特徴とする癌の予防'治療剤のスクリーニング用キット、
(41) 上記 （39) 記載のスクリーニング方法または上記 （40) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤、
(42) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 1 5、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： '2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァ ノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌ クレオチドを用いることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法、
(43) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 1 5、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌ クレオチドを含有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キ ッ卜、 '
(44) 上記 （42) 記載のスクリーニング方法または上記 （43) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤、
(45) アポト一シス促進剤である上記 （1 1) 、 （12) 、 （15) 、 (1 8) 、 （27) 、 （29) または （32) 記載の医薬、
(45 a) 癌細胞のアポトーシス促進剤である上記 （1 1) 、 （12) 、 (1 5) 、 （18) 、 （27) 、 （29) または （32) 記載の医薬、
て 46) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 1 5、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用 いることを特徴とするアポト一シス促進剤のスクリーニング方法、
(47) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号：127で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドをコードするポリヌ クレオチドを用いることを特徴とするアポト一シス促進剤のスクリーニング方法、 (48) 哺乳動物に対して、 （i) 上記 （14) もしくは上記 （31) 記載の 抗体、 (ii) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配 列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の 活性を阻害する化合物またはその塩、 または （iii) 該タンパク質の遺伝子の発 現を阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予 防 ·治療方法、
(49) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列 番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 2 5または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活 性を阻害する、 または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする 癌の予防 ·治療方法、
(50) 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 （i) 上記 （14) もしくは上 記 （31) 記載の抗体、 (ii) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配 列番号： 10、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または.（iii) 該タンパ ク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用などを提供する。 _
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図面の簡単な説明
図 1は、 TACT427— Aの疎水性プロットを表す図である。
図 2は、 TACT 427— A 2の疎水性プロットを表す図である。
図 3は、 TACT427— Bの疎水性プロットを表す図である。
図 4は、 TACT 427- 2 Bの疎水性プロットを表す図である。
図 5は、 TACT427—Cの疎水性プロットを表す図である。
図 6は、 TACT427—C 2の疎水性プロットを表す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明で用いられる配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配 列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質 （以下、 本発明のタンパク質また は本発明で用いられるタンパク質と称することもある） は、 ヒトゃ温血動物 （例 えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 細 胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免 疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細 胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の 前駆細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあらゆ る組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 fl萃臓、 腎臓、 肝臓、 生 殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小 腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、 合成タンパ ク質であってもよい。 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列の 4 7番目から 2 9 6番目のアミノ酸配列に対して約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 4で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァ ミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列の 5 7 7番目から 5 9 4番目のアミノ酸配列に対して約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同 性を有するァミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 7で表されるアミノ酸配列と 実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を 含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 8 0%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性 を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 10で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 10で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
配列番号： 15で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 8 0%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性 を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 15で表されるァ ミノ酸配列の 47番目から 296番目のアミノ酸配列に対して約 70%以上、 好 ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95% 以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号： 15で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 15で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 15で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 17で表されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性 を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 17で表されるァ ミノ酸配列の 43番目から 292番目のアミノ酸配列に対して約 70%以上、 好 ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95% 以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
配列番号： 2 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 2 0で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 2 0で表されるァ ミノ酸配列の 4 7番目から 2 9 6番目のアミノ酸配列に対して約 7 0 %以上、 好 ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号： 2 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2 0で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 0で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性 を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 2 2で表されるァ ミノ酸配列の 4 3番目から 2 9 2番目のアミノ酸配列に対して約 7 0 %以上、 好 ましくは約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 % 以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 2 2で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 8 0%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性 を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 25で表されるァ ミノ酸配列の 47番目から 296番目のアミノ酸配列に対して約 70%以上、 好 ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95% 以上の相同性を有するァミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号： 25で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 25で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 25で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 8 0%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性 を有するアミノ酸配列などが挙げられる。 例えば、 配列番号： 27で表されるァ ミノ酸配列の 43番目から 292番目のアミノ酸配列に対して約 70%以上、 好 ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95% 以上の相同性を有するアミノ酸配列なども挙げられる。
配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有 するタンパク質としては、 例えば、 前記の配列番号： 27で表されるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、 配列番号： 27で表されるアミノ酸 配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
アミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National
Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；マトリクス =BLOSUM62；フ ィル夕リング =0FF) にて計算することができる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 クロロパ一ォキシダーゼ活性などが挙 げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が性質的に.（例、 生理学的に、 また は薬理学的に） 同質であることを示す。 したがって、 クロ口パーォキシダ一ゼ活 性が同等 （例、 約 0. 01〜100倍、 好ましくは約 0. 1〜10倍、 より好ま しくは 0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の程度、 タンパク 質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
クロ口パーォキシダ一ゼ活性の測定は、 公知の方法に準じて行えばよく、 例え ば、 ジャーナル ォブ バイオロジカル ケミストリー (J. Biol. Chem. ) 241 巻、 Π63〜1768頁 （1966年） などに記載の方法またはそれに準じる方法に従って 測定することができる。
また、 本発明で用いられるタンパク質としては、 例えば、 （i) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番号： 15、 配列番号： 1 7、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好まし くは 1〜30個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜 5) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番 号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるァ ミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好ましくは 1〜30 個程度、 好ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミ ノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番 号： 7、 配列番号： 10、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列 に 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好ましくは 1〜30個程度、 好 ましくは 1〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5) 個） のアミノ酸が挿入 されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 1、 配列番号： 4、.配列番号： 7、 配列 番号： 10、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 2 2、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜100個程度、 好ましくは 1〜30個程度、 好ましくは 1 〜10個程度、 さらに好ましくは数 （1~5) 個） のアミノ酸が他のアミノ酸で 置換されたアミノ酸配列、 または （V) それらを組み合わせたアミノ酸配列を含 有するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている場合、 の揷入、 欠失または置換の位置としては、 とくに限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末端 (ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明で用いられる タンパク質は、 C末端がカルボキシル基 (- C O O H) 、 カルポキシレート（一 C O O— ) 、 アミド （一 C〇NH 2) またはエステル 〈― C O O R) の何れであ つてもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n -ブチルなどの C Mアルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シ クロへキシルなどの C3—8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルな どの C6— 12ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル—（^_2ァ ルキル基もしくはひ一ナフチルメチルなどの a—ナフチル— C アルキル基など の C 7_14ァラルキル基、 ピバ口ィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （または力ルポ キシレ一卜) を有している場合、 力ルポキシル基がァミド化またはエステル化さ れているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。 この場合のエステル としては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明で用いられるタンパク質には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メ チォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C アルカノィルなどの ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断 されて生成する N末端のダル夕ミン残基がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内 のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一〇H、 — S H、 アミノ基、 イミダゾール 基、 イン,ドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C wアル力ノィル基などの C wァシル基など） で保護されてい るもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質な ども含まれる。 本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表 されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配 列を含有するタンパク質、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番 号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 1 7で表さ れるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列番号： 2 0で表されるアミノ酸配 列を含有するタンパク質、 配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列を含有するタ ンパク質、 配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、 配列 番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。 本発明で用いられるタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明で用 いられるタンパク質の部分ペプチドであって、 好ましくは、 前記した本発明で用 いられるタンパク質と同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。 例えば、 本発明で用いられるタンパク質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 さらに好ましくは 7 0個以上、 より好まし' くは 1 0 0個以上、 最も好ましくは 2 0 0個以上のアミノ酸配列を有するぺプチ ドなどが用いられる。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1または 2 個以上 （好ましくは、 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のァ ミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは 1 〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ま しくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 ( 1〜5 ) 個） のアミノ酸が挿入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましくは数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、 本発明で用いられる部分ペプチドは C末端が力ルポキシル基 （― C O O H) 、 カルポキシレー卜 (一 C〇〇— ) 、 アミド （一 C〇NH 2) またはエステ ル （一 C O O R) の何れであってもよい。
さらに、 本発明で用いられる部分ペプチドには、 前記した本発明で用いられる タンパク質と同様に、 C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルポキシレート） を有しているもの、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が 保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残 基がピ口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な 保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなど の複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いること ができる。
本発明で用いられる ンパク質または部分ペプチドの塩としては、 生理学的に 許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などとの塩 が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩と しては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、 前 述したヒトゃ温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法に よって製造することもできるし、 タンパク質をコードする D N Aを含有する形質 転換体を培養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド 合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマ トグラフィ一、 イオン交換ク口マトグラフィ一などのクロマトグラフィーを組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、 またはそ のアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルアミン榭脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルァ ルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロ キシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4— ( 2， ， 4 ' —ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4 - ( 2， ， 4， 一ジメトキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエノキシ樹 脂などを挙げる とができる。 このような樹脂を用い、 α—ァミノ基と側鎖官能 基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の配列通りに、 自体公知 の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からタンパク質 または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに高希釈溶液 中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク質もしくは部分 ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各種活 性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジィ ミド類としては、 D C C、 N, N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N -ェチ ル _ N，— ( 3—ジメチルァミノプロリル) カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 HO B t， HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HO B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性 化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド， N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピ 口リドンなどの酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン, ジォキサン， テトラヒドロフランなどのエーテ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応 温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応 を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十 分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて 未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を与えないよう にすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Bo c、 t—ペンチルォキシ カルボニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベンジルォキシカル ポニル、 C 1一 Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニル ホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
カルボキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 (例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4- ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4一クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルポニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによつて保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステルイ匕に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 (Cト 6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシ カルボ二ル基、 エトキシカルポニル基などの炭酸から誘導される基などが用いら れる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒド ロビラ二ル基、 t—ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz し C 12- Bz l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキシ -2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum, Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2 , 4 , 5―トリクロ口フエノール、 2 , 4ージニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 HO N B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフ夕ルイミド、 H O B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸 ミドが用いら れる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルアミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0 °C〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスル フイド、 1 , 4—ブタンジチオール、 1 , 2一エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリブトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 —エタンジチオール、 1， 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸のひ一力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチ ド鎖の N末端の α—ァミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分べプチ ドと C末端の力ルポキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ぺプ チドとを製造し、 これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒 中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得ら れた保護夕ンパク質またはべプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護 基を除去し、 所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。 'この粗夕 ンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍 結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができ る。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキシ末端 アミノ酸の《—力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステル とした後、 タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、 所望のタンパク 質またはべプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、 自体公知のペプチドの 合成法に従って、 あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なぺプチダーゼ で切断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例 えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明で用 いられる部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的の ペプチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としては、 例 えば、 以下の ω 〜 （V) ,に記載された方法が挙げられる。
(i) M. Bodanszky および M. A. Ondet t i , ペプチド 'シンセシス （Pept ide Synthes is) , Intersc ience Publ ishers, New York (1966年)
(i i) Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド（The Pept i de) , Academic Press, New York (1965年）
(i i i) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(iv) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年）
(V) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出。蒸留 'カラムクロマトダラ フィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明で用いられ る部分べプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られる部分べプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、 前述 した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであれ ばいかなるものであってもよい。 好ましくは DNAである。 DNAとしては、 ゲ ノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来の cDNA、 前記した細胞'組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞'組織より otalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT— PCR法と略称す る） によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、
(0 配列番号： 2で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 2 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基 配列を含有し、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実 質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、
(ii) 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 5 で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基 配列を含有し、 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実 質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、
(iii) 配列番号： 8で表される塩基配列を含有す ¾DNA、 または配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩 基配列を含有し、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と 実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする DNA、
(iv) 配列番号： 11で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 11で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N A、
(v) 配列番号： 1 6で表される塩基配列を含有する D N A、 または配列番号：
1 6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 1 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NA、
(vi) 配列番号： 1 8で表される塩基配列を含有する D N A、 または配列番号： 1 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 1 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N A、
(vi i) 配列番号： 2 1で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番 号： 2 1で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズ する塩基配列を含有し、 配列番号： 2 0で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D NA、
(vi i i) 配列番号： 2 3で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番 号： 2 3で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズ する塩基配列を含有し、 配列番号： 2 2で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N A、
(ix) 配列番号： 2 6で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 2 6で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 2 5で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N A、
(X) 配列番号： 2 8で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 2 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする 塩基配列を含有し、 配列番号： 2 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク 質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードする D N Aであれば何れの ものでもよい。
配列番号： 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下で八ィプリ ダイズできる D N Aとしては、 例えば、 配列番号： 2で表される塩基配列と約 7 0%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好まし くは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。 配列番号： 5で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 5で表される塩基配列と約 7 0%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好まし くは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Αなどが用いられる。 例えば、 配列番号： 5で表される塩基配列の 139番目から 888番目の塩基配 列に対して約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以 上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAな ども用いられる。
配列番号： 8で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 8で表される塩基配列と約 7 0%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好まし くは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。 例えば、 配列番号： 8で表される塩基配列の 1728番目から 1782番目の塩 基配列に対して約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 9 0%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する D NAなども用いられる。
配列番号： 11で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 11で表される塩基配列と 約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いら れる。
配列番号： 16で表される塩基配列と八イストリンジェントな条件下で八イブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 16で表される塩基配列と 約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いら れる。
配列番号： 18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 18で表される塩基配列と 約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いら れる。 '
配列番号： 21で表される塩基配列と八イストリンジエンドな条件下で八イブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 21で表される塩基配列と 約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いら れる。
配列番号： 23で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 23で表される塩基配列と 約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いら れる。
配列番号： 26で表される塩基配列とハイストリンジエンドな条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 26で表される塩基配列と 約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いら れる。
配列番号： 28で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 28で表される塩基配列と 約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用いら れる。
塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用レ 、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；フィルタリング =0N;マッチスコア =1；ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー 'クロ一ニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なう ことができる。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に 記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン トな条件に従つて行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40m M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 ° (、 好ましくは約 60 〜 65 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65での 場合が最も好ましい。
より具体的には、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するタン パク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 2で表される塩基配列を含有す る DN Aまたは配列番号： 3で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、
(ii) 配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする DNAとしては、 配列番号： 5で表される塩基配列を含有する DNAまたは配列 番号： 6で表される塩基配列を含有する DNAなどが、
(iii) 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 8で表される塩基配列を含有する DNAまたは配 列番号： 9で表される塩基配列を含有する DNAなどが、
(iv) 配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 11で表される塩基配列を含有する DNAまたは 配列番号： 12で表される塩基配列を含有する DNAなどが、
(V) 配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 16で表される塩基配列を含有する DN Aまたは 配列番号： 19で表される塩基配列を含有する DNAなどが、
(vi) 配列番号： 17で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 18で表される塩基配列を含有する DNAまたは 配列番号： 19で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、
(vii) 配列番号： 20で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコ一ド する DNAとしては、 配列番号： 21で表される塩基配列を含有する DNAまた は配列番号： 24で表される塩基配列を含有する DNAなどが、
(viii) 配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコード する DNAとしては、 配列番号： 23で表される塩基配列を含有する DN Aまた は配列番号： 24で表される塩基配列を含有する DNAなどが、
(ix) 配列番号： 25で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 26で表される塩基配列を含有する DNAまたは 配列番号： 29で表される塩基配列を含有する DN Aなどが、
(X) 配列番号： 27で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 28で表される塩基配列を含有する DNAまたは 配列番号： 29で表される塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド （例、 DN A) としては、 前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列 を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲ ノム DNAライブラリ一、 前記した細胞 ·組織由来の cDNA、 前記した細胞 · 組織由来の cDNAライブラリ一、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 例えば、 配列 番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 11、 配列番号： 16、 配 列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番号： 23、· 配列番号： 26または配列番 号： 28で表される塩基配列を含有する DNAの一部分を有する DNA、 または 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 11、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 26または配列 番号： 28で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダィ ズする塩基配列を含有し、 本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有する夕 ンパク質をコードする DN Aの一部分を含有する DN Aなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 11、 配列番号： 1 6、 配列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 26または 配列番号： 28で表される塩基配列とハイブリダィズできる DNAは、 前記と同 意義を示す。
ハイプリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同 様のものが用いられる。
本発明で用いられるダンパク質、 部分ペプチド （以下、 これらをコードする D NAのクローニングおよび発現の説明においては、 これらを単に本発明の夕ンパ ク質と略記する場合がある） を完全にコードする DN Aのクローニングの手段と しては、 本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成 DN A プライマーを用いて PCR法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み 込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A断 片もしくは合成 DNAを用いて標識したものとのハイブリダィゼーシヨンによつ て選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュ ラー .クロ一ニング （Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができ る。 また、 市販のライブラリ一を使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法 に従って行なうことができる。
DNAの塩基配列の変換は、 PCR、 公知のキット、 例えば、 Mutan™- super Express Km (宝酒造 （株） ） 、 Mutan™- K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 0DA - LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる 方法に従つて行なうことができる。
クロ一ン化されたタンパク質をコ一ドする DN Aは目的によりそのまま、 また は所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用することが できる。 該 DN Aはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての AT Gを有し、 ま た 3， 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有して いてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAァ ダブターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現べクタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質を コードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を 適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること ができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 PBR322, pBR 32 5, pUC 12， pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 10, pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9, pSHl 5) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， パキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 ρΑ1— 11、 pXTl、 pR c/CMV、 pRcZRSV、 p cDNA Iノ Ne oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモ一夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対 応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を 宿主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモータ一、 LTR プロモータ一、 CMVプロモー夕一、 HSV-TKプロモーターなどが挙げられ る。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SRaプロ モーターなどを用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 l a cプロモーター、 r e cAプロモ一夕一、 λΡ^プロモ —夕一、 l ppプロモーター、 T 7プロモ一夕一などが、 宿主がバチルス属菌で ある場合は、 SPOlプロモ一ター、 SP02プロモ一夕一、 p enPプロモ一 夕一など、 宿主が酵母である場合は、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモータ ―、 GAPプロモータ一、 ADHプロモ一夕一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞 である場合は、 ポリヘドリンプロモータ一、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マ一力一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遺伝子 （以下、 Amp1"と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 （以下、 Ne orと略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のタンパク質の N 端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA *シグナル配 列、 0即 A ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ一アミ ラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である 場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞 である場合には、 インシュリン ·シグナル配列、 α—インタ一フエロン。シグナ ル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする DN Αを含有する ベクタ一を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア *コリ
(Escherichia coli) K 12 - DH 1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60 巻， 160(1968)〕 ， JM103 [Nucleic Acids Research, 9巻， 309(1981)〕 ， J A 221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517(1978)〕 ， HB 101
[： Journal of Molecular Biology, 41巻， 459(1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39 巻， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔Gene， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 -21 [Journal of Biochemistry, 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22R— , ΝΑ87 - 11 A, DKD— 5D, 20 B— 12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NC YC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) K Μ71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが A cNP Vの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brass icae由来の細胞または Est igmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori 細胞； BmN細 胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 2 1細胞 （以上、 Vaughn, J上ら、 In Vivo, 13, 213- 217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 Nature, 315 巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7, Ve r o, チヤィニ一ズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） ， dh ί r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r") 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， マウス ATDC 5細胞， ラット GH3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻， 107(1982)などに記載の方法に従って行なうこ とができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 Molecular & General
Genetics, 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従つて行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194巻， 182 -
187(1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75巻, 1929(1978) などに記載の方法 に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Technology, 6， 47- 55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコ一ル. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Virology, 52巻, 456 (1973)に記載の方 法に従って行なうことができる。'
このようにして、 タンパク質をコードする DNAを含有する発現ベクターで形 質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ' リカー、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどが挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添 加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , Journal of Experiments in
Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York
1972) が好ましい。 ここに必要によりプロモータ一を効率よく働かせるために、 例えば、 3 ]3—インドリルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシエリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜43°Cで約 3〜24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ —ルダ一 （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0.5 %カザミノ酸を含有する S D培地 [Bitter, G. A. ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81巻， 5330(1984)〕 が挙げられる。 培地の pH は約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 201：〜 35 で約 24〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、
Grace's Insect Medium (Grace, T. C.C., Nature, 195, 788 (1962)) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 で約 3〜 5日間行 ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地 [Science, 122巻， 501 (1952)〕 ， DME M培地 [Virology, 8巻， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical Association 199巻， 519 (1967)〕 , 199培地
[Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73卷， 1(1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 3 0 °C〜 4 0 °Cで約 1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のタン パク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の方法 により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したの ち、 遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられ る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのタンパク質変性剤や、 トリトン X - 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよい。 培養液中にタンパク質が 分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上 清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の 精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 こ れらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する 方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーな 'どの特異的親和性を利用する方法、 逆相高速液体ク口マトグラフィーなどの疎水 性の差を利用する方法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など が用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体公知の方法あ るいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場 合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に 変換することができる。
なお、 組換え体が産生するタンパク質を、 精製前または精製後に適当な蛋白修 飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的 に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモト リブシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ一 ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザィム ィムノアツセィゃウェスタンプロッティングなどにより測定することができる。 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗 体は、 本発明で用いられるタンパク質もしくは部分べプチドまたはその塩を認識 し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであって もよい。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 抗 体の説明においては、 これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある） に対する抗体は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または 抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノク口一ナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の夕ンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位に それ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を 高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投 与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウ ス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスおよびラットが好 ましく用いられる。
モノク口一ナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化夕 ンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定する ことにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ一ラーとミ ルスタインの方法 〔Nature、 256、 495 (1975)] に従い実施することができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセンダイゥ ィルスなどが挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 S P 2/0, AP— 1な どの温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用 いられる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1 〜20 ： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 37 °C で 1〜 10分間ィンキュベ一トすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体ととも 吸着させた固 相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物 質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクロ一ナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従って行 なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地として は、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例 えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPM I 16 40培地、 1〜 10 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ） あ るいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM— 101、 日水製薬 （株） ） な どを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40 、 好ましくは約 37 X である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。 ( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブリン の分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 ィ オン交換体 （例、 D E A E) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合 固相あるいはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体の みを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことが できる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクロ一ナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従 つて製造することができる。 例えば、 免疫坊原 （タンパク質抗原） 自体、 あるい はそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体 の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のタンパク質 に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造するこ とができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複 合体に関し、 キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合 比は、 キヤリァ一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれ ば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アル ブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜 5の割合でカプルさせる方法が用いられる。 また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドゃカルポジィミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。
ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。 抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことがで きる。
本発明で用いられるタンパク質または部分ペプチドをコードするポリヌクレオ チド （例、 DNA (以下、 アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、 こ れらの DNAを本発明の DNAと略記する場合がある） ） の塩基配列に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌク レオチドとしては、 本発明のポリヌクレオチド （例、 DNA) の塩基配列に相補 的な、 または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、 該 DNAの発 現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアンチセンスポリヌクレオ チドであってもよく、 アンチセンス DNAが好ましい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 9
0%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げら れる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全塩基配列うち、 （ィ） 翻訳阻害を指向 したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、 本発明のタンパク質の N末端部位 をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列など） の相補 鎖と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最 も好ましくは約 95 %以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、 (口） RNa s eHによる RN A分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチド の場合は、 イントロンを含む本発明の DN Aの全塩基配列の相補鎖と約 70%以 上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適であ る。
具体的には、 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 1 1、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番 号： 26または配列番号： 28で表される塩基配列を含有する DNAの塩基配列 に相補的な、 もしくは実質的に相補的な塩基配列、 またはその一部分を有するァ ンチセンスポリヌクレオチド、 好ましくは例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 1 1、 配列番号： 1 6、 配列番号： 1 8、 配列番号： 2 1、 配列番号： 2 3、 配列番号： 2 6または配列番号： 2 8で表される塩基配 列を含有する D NAの塩基配列に相補な塩基配列、 またはその一部分を有するァ ンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、 1 0〜4 0個程度、 好ましくは 1 5〜 3 0個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、 ァンチセンス D N Aを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基 （ホスフェート） は、 例えば、 ホスホ ロチォエート、 メチルホスホネート、 ホスホロジチォネートなどの化学修飾りん 酸残基に置換されていてもよい。 また、 各ヌクレオチドの糖 （デォキシリポー ス） は、 2 ' —〇一メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、 塩基部分 （ピリミジン、 プリン） も化学修飾を受けたものであってもよく、 配列 番号； 2で表される塩基配列を有する D NAにハイブリダィズするものであれば いずれのものでもよい。 これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、 公知の D N A合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、 本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害すること のできるアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化した、 あるいは 決定されたタンパク質をコードする D NAの塩基配列情報に基づき設計し、 合成 しうる。 かかるポリヌクレオチド （核酸） は、 本発明のタンパク質遺伝子の R N Aとハイプリダイズすることができ、 該 R N Aの合成または機能を阻害すること ができるか、 あるいは本発明のタンパク質関連 R N Aとの相互作用を介して本発 明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御することができる。 本発明のタンパク 質関連 R NAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 および本発明の夕 ンパク質関連 R N Aと特異的にハイブリダィズすることができるポリヌクレオチ ドは、 生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節 ·制御する のに有用であり、 また病気などの治療または診断に有用である。 用語 「対応す る」 とは、 遺伝子を含めたヌクレオチド、 塩基配列または核酸の特定の配列に相 同性を有するあるいは相補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 塩基配列ま たは核酸とペプチド （タンパク質） との間で 「対応する」 とは、 ヌクレオチド
(核酸） の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド （タンパク 質） のアミノ酸を通常指している。 タンパク質遺伝子の 5 ' 端ヘアピンループ、 5 ' 端 6—べ一スペア ·リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリペプチド翻訳開始コ ドン、 タンパク質コード領域、 O R F翻訳終止コドン、 3 ' 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドロ一ム領域、 および 3， 端ヘアピンループは好ましい対象領域として 選択しうるが、 タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。 目的核酸と、 対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係 は、 対象物とハイブリダィズすることができるポリヌクレオチドとの関係は、
「アンチセンス」 であるということができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、 2ーデォキシ— D—リポースを含有しているポリヌクレオチド、 D -リポースを 含有しているポリヌクレオチド、 プリンまたはピリミジン塩基の N—グリコシド であるその他のタイプのポリヌクレオチド、 あるいは非ヌクレオチド骨格を有す るその他のポリマ一 （例えば、 市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核 酸ポリマー） または特殊な結合を含有するその他のポリマ一 （但し、 該ポリマー は D N Aや R N A中に見出されるような塩基のペアリングゃ塩基の付着を許容す る配置をもつヌクレオチドを含有する） などが挙げられる。 それらは、 2本鎖 D NA、 1本鎖 D N A、 2本鎖 R NA、 1本鎖 R NA、 さらに D NA : R NAハイ ブリツドであることができ、 さらに非修飾ポリヌクレオチド （または非修飾オリ ゴヌクレオチド） 、 さらには公知の修飾の付加されたもの、 例えば当該分野で知 られた標識のあるもの、 キャップの付いたもの、 メチル化されたもの、 1個以上 の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、 分子内ヌクレオチド修飾のされ たもの、 例えば非荷電結合 （例えば、 メチルホスホネート、 ホスホトリエステル、 ホスホルアミデート、 力ルバメートなど） を持つもの、 電荷を有する結合または 硫黄含有結合 （例えば、 ホスホロチォエー卜、 ホスホロジチォエートなど） を持 つもの、 例えばタンパク質 （ヌクレア一ゼ、 ヌクレア一ゼ ·インヒビ夕一、 トキ シン、 抗体、 シグナルペプチド、 ポリ一 L—リジンなど） や糖 （例えば、 モノサ ッカライドなど） などの側鎖基を有しているもの、 イン夕一カレント化合物 （例 えば、 ァクリジン、 ゾラレンなど） を持つもの、 キレート化合物 （例えば、 金属、 放射活性をもつ金属、 ホウ素、 酸化性の金属など） を含有するもの、 アルキル化 剤を含有するもの、 修飾された結合を持つもの （例えば、 αァノマー型の核酸な ど） であってもよい。 ここで 「ヌクレオシド」 、 「ヌクレオチド」 および 「核 酸」 とは、 プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、 修飾されたその 他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。 こうした修飾物は、 メチ ル化されたプリンおよびピリミジン、 ァシル化されたプリンおよびピリミジン、 あるいはその他の複素環を含むものであってよい。 修飾されたヌクレオチドおよ び修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、 例えば、 1個以 上の水酸基がハロゲンとか、 脂肪族基などで置換されていたり、 あるいはエーテ ル、 ァミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド （核酸） は、 R NA、 D NA、 あるい は修飾された核酸 （R NA、 D NA) である。 修飾された核酸の具体例としては ,核酸の硫黄誘導体ゃチォホスフェート誘導体、 そしてポリヌクレオシドアミドゃ オリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、 それに限定さ れるものではない。 本発明のアンチセンス核酸は次のような方針で好ましく設計 されうる。 すなわち、 細胞内でのアンチセンス核酸をより安定なものにする、 ァ ンチセンス核酸の細胞透過性をより高める、 目標とするセンス鎖に対する親和性 をより大きなものにする、 そしてもし毒性があるならアンチセンス核酸の毒性を より小さなものにする。
こうして修飾は当該分野で数多く知られており、 例えば J. Kawakami et al .， Pharm Tech Japan, Vo l . 8, pp. 247, 1992 ; Vol . 8, pp. 395, 1992 ; S, T.
Crooke et al . ed. , Ant i sense Research and Appl i cat i ons, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンス核酸は、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結 合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供与 されたり、 遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられることが できうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷を 中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、 細胞膜との相互作用を 高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コ レステロールなど） といった疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂 質としては、 コレステロールやその誘導体 （例えば、 コレステリルクロ口ホルメ ート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。 その他の基としては、 核酸の 3 ' 端あるいは 5 ' 端に 特異的に配置されたキャップ用の基で、 ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどの ヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。 こうしたキャップ 用の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグ リコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、 そ れに限定されるものではない。
アンチセンス核酸の阻害活性は、 本発明の形質転換体、 本発明の生体内や生体 外の遺伝子発現系、 あるいは本発明のタンパク質の生体内や生体外の翻訳系を用 いて調べることができる。 該核酸それ自体公知の各種の方法で細胞に適用できる。 以下に、 本発明のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩 （以下、 本発 明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質または部分べプチ ドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記する場合がある） 、 本発明 のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩に対する抗体 （以下、 本発明の 抗体と略記する場合がある） 、 および本発明の D NAのアンチセンスポリヌクレ ォチド （以下、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドと略記する場合がある) の用途を説明する。
本発明のタンパク質は、 癌組織で発現が増加するので、 疾患マーカ一として利 用することが出来る。 すなわち、 癌組織における早期診断、 症状の重症度の判定、 疾患進行の予測のためのマーカ一として有用である。 よって、 本発明のタンパク ンパク質の活性を阻害する化合物もしくはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子 の発現を阻害する化合物もしくはその塩、 または本発明のタンパク質に対する抗 体を含有する医薬は、 例えば、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道疲、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱窟、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤 （好ましくは、 乳癌、 肺癌などの 予防 ·治療剤） 、 癌細胞のアポト一シス促進剤として使用する とができる。 ( 1 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスク.,リーニング
本発明のタンパク質は癌組織で発現が亢進してしており、 さらに、 本発明のタ ンパク質の活性 （例、 クロ口パーォキシダーゼ活性） を阻害すると癌細胞がアポ ト一シスを起こす。 従って、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物または その塩は、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道 癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または 血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤として使用することができる。 好ましくは、 乳 癌、 肺癌などの予防 ·治療剤である。 また、 本発明のタンパク質の活性 （例、 ク ロロパーォキシダーゼ活性） を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 癌細胞 のアポト一シス促進剤として使用することもできる。
したがって、 本発明のタンパク質は、 本発明のタンパク質の活性を阻害する化 合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発明の タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供す る。
具体的には、 例えば、 （i) 本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞 のクロロパ一ォキシダーゼ活性と、 （i i) 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞と試験化合物の混合物のク口口バーオキシダ一ゼ活性とを比較するこ とを特徴する本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法が用いられる。
上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i) と （i i) の場合において、 クロロパ一ォキシダーゼ活性を測定し、 monochlorodimedoneに塩素を付加して dichlorodimedoneを生成する活性を指標として比較する。
クロロパ一ォキシダーゼ活性は、 公知の方法、 例えば、 ジャーナル ォブ バ ィォロジカル ケミストリー （J. Biol . Chem. ) 241巻、 1763頁〜 Π68頁 （1966 年） 記載の方法に従って測定する。
本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 例えば、 前述した 本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有するベクターで形質転換された宿 主 （形質転換体） が用いられる。 宿主としては、 例えば、 C O S 7細胞、 C H O 細胞、 H E K 2 9 3細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。 該スクリーニン グには、 例えば、 前述の方法で培養することによって、 本発明のタンパク質を細 胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。 本発明のタンパク質を発 現し得る細胞の培養方法は、 前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。 試験化合物としては、 例えばペプチド、 タンパク質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れる。
例えば、 上記 （i i) の場合における本発明のタンパク質のクロ口パ一ォキシダ ーゼ活性を、 上記 (i) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の活 性を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する活性を有する化合物は、 本発明のタンパ ク質の生理活性を抑制するための安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などか ら選ばれた化合物である。 該化合物の塩としては、 前記した本発明のペプチドの 塩と同様のものが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質の遺伝子も、 癌組織において発現が増加するので、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩も、 例えば乳 癌、 大腸 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍など の癌の予防 ·治療剤として使用することができる。 好ましくは、 乳癌、 肺癌など の予防 ·治療剤である。 また、 本発明のタンパク質をコ一ドする遺伝子の発現を 阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 癌細胞のアポトーシス促進剤として使 用することもできる。
したがって、 本発明のポリヌクレオチド （例、 DNA) は、 本発明のタンパク 質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬 として有用である。
スクリーニング方法としては、 （iii) 本発明のタンパク質を産生する能力を 有する細胞を培養した場合と、 （iv) 試験化合物の存在下、 本発明で用いられる タンパク質を産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特 徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、 （iii) と （iv) の場合における、 前記遺伝子の発現量 (具体的には、 本発明のタンパク質量または前記タンパク質をコードする mRN A量） を測定して、 比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、 上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、 公知の方法、 例えば、 本発明のタンパク質を認識する 抗体を用いて、 細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、 ウエスタン解析、 EL I S A法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
mRNA量の測定は、 公知の方法、 例えば、 プロ一ブとして配列番号： 2、 配 列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 11、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 26または配列番号： 28で表さ れる塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダィゼ一 シヨン、 あるいはプライマ一として配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 11、 配列番号： 1 、 配列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番 号： 23、 配列番号： 26または配列番号： 28で表される塩基配列またはその 一部を含有する核酸を用いる P C R法またはそれに準じる方法に従い測定するこ とができる。
例えば、 上記 （iv) の場合における遺伝子の発現を、 上記 （iii) の場合に比 ベて、 約 20%以上、 好ましくは 30%以上、 より好ましくは約 50%以上阻害 させる試験化合物を、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物とし て選択することができる。 本発明のスクリーニング用キットは、 本発明で用いられるタンパク質もしくは 部分ペプチドまたはその塩、 または本発明で用いられるタンパク質もしくは部分 ペプチドを産生する能力を有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非 ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物またはその塩であり、 本発明のタンパク 質の活性を阻害する化合物またはその塩、 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を 阻害する化合物またはその塩である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用い られる。
本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 および本発明の夕 ンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩はそれぞれ、 例えば大腸 癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀 胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の治 療-予防剤 （好ましくは、 乳癌、 肺癌などの予防 ·治療剤） として、 または癌細 胞のアポト一シス促進剤として有用である。
本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、 常套手段に従つ て製剤化することができる。
例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カブ セル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などがあげられ る。 かかる組成物は自体公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用 いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤用の 担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムなど が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤、 関節 内注射剤などの剤形を包含する。 かかる注射剤は、 自体公知の方法に従って、 例 えば、 上記化合物またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油 性液に溶解、 懸濁または乳化することによって調製する。 注射用の水性液として は、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いら れ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコ一 ル （例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性 剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0、 H C O— 5 0 (polyoxyethylene ( 5 O mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液として は、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジ ル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製された注射液は、 通常、 適 当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる坐剤は、 上記化合物またはそ の塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 0 m g、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 0 m g、 その他の剤形では 1 0〜2 5 O m gの上記化合物が含有されていること が好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記化合物との配合により好ましくない相互作用を 生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して経口的にまたは非経口的に投与 することができる。 ' 該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のタンパク質の 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を経口投与する場合、 一般的に成人 (体重 6 0 k gとして） においては、 一日につき該化合物またはその塩を約 0 . 1〜1 0 O m g、 好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0 ~ 2 Omg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該ィヒ合物またはその塩の 1回投与 量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で 本発明のタンパク質の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩を注射剤の形 で通常成人 （体重 6 O kgとして） に投与する場合、 一日につき該化合物または その塩を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜 20 m g、 より好ましく は約 0. 1〜1 Omgを癌病変部に注射により投与するのが好都合である。 他の 動物の場合も、 体重 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 本発明のタンパク質の定量
本発明の抗体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法による定量 などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検波および標識化された本発明のタンパク質とを競合 的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割合を測定 することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量法、 および
(ii) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検波中の本発明のタンパク質の定量法を提供する。 上記 （ii) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端部を 認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する抗体であ ることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモノ クローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行な えるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗 体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F(ab')2 、 Fab'、 あ るいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべきも のではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した抗体、 抗 原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これ を既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であ れば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリー、 競合法、 ィム ノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、 感度、 特異性の点 で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素としては、 例 えば、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 〔14c〕 などが用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 0—ガラクトシダーゼ、 β—グ ルコシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素 酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォ レツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ル ミノ一ル、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどが用いられる。 さ らに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いること もできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常夕 ンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる 方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不 溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 ある いはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検波中の本発明の夕ンパク質量を定量することができる。 1次反応と 2次反応 は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なって もよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 ま た、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗体 に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる等 の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。 本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次 反応と 2次反応に用いられる本発明のモノク口一ナル抗体は、 本発明の夕ンパク 質の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反応お よび 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発 明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好まし くは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメ卜リック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗.体と結合した標識抗原 （B) とを分離し
(BZF分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量す る。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレング リコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体と して固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体 として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザ一ネフロメトリーな どが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の測定系を構築 すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書などを参 照することができる。 例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYJ Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A) ) > 同書 Vol . 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C))、 同書 Vol . 8 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)) 同書 Vol . 92 (Immunochemical Techniques (Part E:Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) ) ¾ 同書 Vol . 121 (Immunochemical
Techniques (Part I： Hybr idoma Technology and Monoc lonal Ant ibodies) ) (以上、 ァカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパク質 を 度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量することに よって、 本発明のタンパク質の濃度の増加が検出された場合、 例えば大腸癌、 乳 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌である、 ま たは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明のタンパ ク質を検出するために使用することができる。 また、 本発明のタンパク質を精製 するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のタンパク質 の検出、 被検細胞内における本発明のタンパク質の挙動の分析などのために使用 することができる。
( 3 ) 遺伝子診断薬
本発明の D N Αは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） における本発明のタンパク 質またはその部分ペプチドをコードする D N Aまたは m R N Aの異常 （遺伝子異 常） を検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mR NAの損傷、 突 然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは mR NAの増加あるいは発現過多な どの遺伝子診断薬として有用である。
本発明の D NAを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザン八 イブリダィゼ一シヨンや P C R—S S C P法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5 巻， 8 7 4〜8 7 9頁 （1 9 8 9年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル ·アカデミー♦ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスエー （Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America) , 第 8 6巻， 2 7 6 6〜2 7 7 0頁 （1 9 8 9年） ） などにより実施することができる。 例えば、 ノ一ザン八ィブリダイゼーシヨンにより発現過多が検出された場合や P C R— S S C P法により D NAの突然変異などが検出された場合は、 例えば大 腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌で ある可能性が高いと診断することができる。
( 4 ) アンチセンスポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明の D N Aに相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制することができる本 発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、 生体内における本発明の タンパク質または本発明の D NAの機能や作用を抑制することができるので、 例 えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 勝臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍など の癌の予防 ·治療剤として使用することができる。 好ましくは、 乳癌、 肺癌など の予防'治療剤である。 また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは例えば、 癌細胞のアポトーシス促進剤として使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防 ·治療剤、 促進剤などして使 用する場合、 自体公知の方法に従って製剤化し、 投与することができる。
また、 例えば、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロゥ ィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウ ィルスべクタ一などの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトま たは哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルな ど） に対して経口的または非経口的に投与することができる。 該アンチセンスポ リヌクレオチドは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学 的に認められる担体とともに製剤化し、 遺伝子銃やハイド口ゲルカテーテルのよ うなカテーテルによって投与できる。 あるいは、 エアロゾル化して吸入剤として 気管内に局所投与することもできる。
さらに、 体内動態の改良、 半減期の長期化、 細胞内取り込み効率の改善を目的 に、 前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体と ともに製剤 （注射剤） 化し、 静脈、 皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はあるが、 例えば、 乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンス ポリヌクレオチドを投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 O k g ) においては、 一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約 0 . 1〜1 0 O m g投与する。 さらに、 該アンチセンスポリヌクレオチドは、 組織や細胞における本発明の D N Aの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブと して使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、 本発明のタンパク質をコードす る R NAの一部を含有する二重鎖 R NA、 本発明のタンパク質をコードする R N Aの一部を含有するリポザィムなども、 本発明の遺伝子の発現を抑制することが でき、 生体内における本発明で用いられるタンパク質または本発明で用いられる D NAの機能を抑制することができるので、 例えば、 大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立 腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤 （好ましくは、 乳癌、 肺癌などの予防 ·治療剤） 、 癌細胞のアポトーシス促進剤などとして使用 することができる。
二重鎖 R NAは、 公知の方法 （例、 Nature, 411巻， 494頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リポザィムは、 公知の方法 (例、 TRENDS in Molecul ar Medic ine, 7巻, 221頁， 2001年） に準じて、 本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造するこ とができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコードする R NAの一部に公知のリ ポザィムを連結することによつて製造することができる。 本発明のタンパク質を コードする R N Aの一部としては、 公知のリポザィムによって切断され得る本発 明の R NA上の切断部位に近接した部分 （R NA断片） が挙げられる。
上記の二重鎖 R NAまたはリポザィムを上記予防。治療剤として使用する場合、 7ンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、 投与することができる。
( 5 ) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明の抗体は、 癌細胞の増殖阻害作用あるいはアポトーシス促進作用を有し、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍など の癌の予防 ·治療剤 （例、 ワクチンなど） として使用することができる。 好まし くは、 乳癌、 肺癌などの予防 ·治療剤である。 また、 本発明の抗体は、 例えば、 癌細胞のアポトーシス促進剤として使用することもできる。
本発明の钪体を含有する上記疾患の予防 ·治療剤、 促進剤は低毒性であり、 そ のまま液剤として、 または適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは哺乳動物 (例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して 経口的または非経口的 （例、 血管内投与、 下投与など） に投与することができ る。 好ましくはワクチンとして定法に従って投与することができる。
本発明の抗体は、 それ自体を投与しても良いし、 または適当な医薬組成物とし て投与しても良い。 投与に用いられる医薬組成物としては、 本発明の抗体および その塩と薬理学的に許容され得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであ つても良い。 このような医薬組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形とし て提供される。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤、 ワクチン等が用 いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射 剤等の剤形を包含しても良い。 このような注射剤は、 公知の方法に従って調整で きる。 注射剤の調整方法としては、 例えば、 上記本発明の抗体またはその塩を通 常注射剤に用いられる無菌の水性液、 または油性液 ίこ溶解、 懸濁または乳化する ことによって調製できる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブド ゥ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 80、 Η CO— 50 (polyoxyethylene (5 Omol) adduct of hydrogenated castor oil) ] 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用 いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用して もよい。 調製された注射液は、 適当なアンプルに充填されることが好ましい。 直 腸投与に用いられる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合す ることによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 (糖衣錠、 フィルムコ一ティング錠を含む) 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 (ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 この ような組成'物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通常用いられる 担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。 錠剤用の担体、 賦形剤とし ては、 例えば、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウムが用いられる。 上記の非経口用または経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 このような投薬単位の剤形 としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤が挙げ られる。 抗体の含有量としては、 投薬単位剤形当たり通常 5〜50 Omg程度、 とりわけ注射剤では 5〜10 Omg程度、 その他の剤形では 10〜250mg程 度の上記抗体が含有されていることが好ましい。
本発明の抗体を含有する上記予防 ·治療剤、 調節剤の投与量は、 投与対象、 対 象疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の乳癌の治 療 '予防のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0.0 1〜2 OmgZk g体重程度、 好ましくは 0.1〜： L OmgZk g体重程度、 さ らに好ましくは 0. l〜5mgZkg体重程度を、 1日 1〜5回程度、 好ましく は 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投 与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に 重い場合には、 その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記抗体またはその塩と薬理学的に許 容され得る担体、 希釈剤もしくは陚形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与 （例、 血管内注射、 皮下注射など） に適する剤形として提 供される。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。
( 6 ) 本発明のタンパク質を含有する医薬
本発明のタンパク質は癌で過剰に発現していることから、 癌患者の免疫系を活 性化するために本発明のタンパク質を癌ワクチンとして用いることもできる。 例えば、 強力な抗原提示細胞 （例、 樹状細胞） を本発明のタンパク質存在下に 培養し、 該タンパク質を貪食させた後に、 再び患者の体内に戻す、 所謂養子免疫 療法などを好ましく適用し得る。 体内に戻された榭状細胞は癌抗原特異的な細胞 障害性 T細胞を誘導、 活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能であ る。
また、 本発明のタンパク質は、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍 臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防または治療のためのワクチン製剤と して、 安全に、 哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ブタ） に 投与することもできる。
該ワクチン製剤は、 通常、 本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる 担体を含有する。 担体としては例えば、 水、 食塩水 （生理食塩水を含む） 、 緩衝 液 （例、 リン酸緩衝液） 、 アルコール （例、 ェタノ一ル） などの液体の担体があ げられる。
ワクチン製剤は、 通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができ る。 通常、 本発明のタンパク質は、 生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁 される。 また、 本発明のタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調 製し、 用時それらを混合して用いてもよい。
ヮクチン製剤には、 本発明のタンパク質および生理学的に許容されうる担体に 加え、 アジュバント （例、 水酸化アルミニウムゲル、 血清アルブミンなど） 、 防 腐剤 （例、 チメロサールなど） 、 無痛化剤 （例、 ブドウ糖、 ベンジルアルコール など） などを配合させてもよい。 また、 本発明のタンパク質に対する抗体産生を 促進させるために、 例えばサイト力イン （例、 インターロイキン— 2などのイン 夕一ロイキン類、 インターフェロンーァなどのインタ一フエロン類など） をさら に配合させてもよい。
ワクチン製剤として用いる際、 本発明のタンパク質は活性体として用いてもよ いが、 抗原性を高めるために本発明のタンパク質を変性させてもよい。 本発明の タンパク質の変性は、 通常、 加熱処理、 タンパク変性剤 （例、 ホルマリン、 塩酸 グァニジン、 尿素） による処理により行われる。
得られたワクチン製剤は低毒性であり、 通常注射剤として、 例えば皮下、 皮内、 筋肉内に投与してもよく、 また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよ い。
本発明のタンパク質の投与量は、 例えば対象疾患、 投与対象、 投与ルートなど によって異なるが、 例えば本発明のタンパク質を癌に罹患した成人 （体重 6 O k g ) に皮下的に注射剤として投与する場合、 1回当たり通常 0 . l m g〜3 0 0 m g程度、 好ましくは 1 0 0 m g〜3 0 O m g程度である。 ワクチン製剤の投与 回数は 1回でもよいが、 抗体産生量を高めるために、 約 2週間〜約 6ヶ月の間隔 をあけて、 該ワクチン製剤を 2〜4回投与することもできる。 ( 7 ) D NA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のタンパク質をコードする D NA (以下、 本発明の 外来性 D N Aと略記する） またはその変異 D N A (本発明の外来性変異 D NAと 略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、 ( 1 ) 本発明の外来性 D N Aまたはその変異 D N Aを有する非ヒ卜哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、'および
(4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物において 発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期 前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作出することがで きる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目 的とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用するこ ともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により 融合させることにより本発明の D N A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、 ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C57B L/6系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B eCS Fi系統， BDFi系 統， B 6D 2 系統, BALBZc系統， I CR系統など) またはラッ卜 (例 えば、 Wi s t a r， SDなど） などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えべクタ一における 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DNA ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた D NAなどが用いられ、 また、 異常 D NAも含まれる。
該異常 D N Aとしては、 異常な本発明のタンパク質を発現させる D N Aを意味 し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させ る D N Aなどが用いられる。
本発明の外来性 D NAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。 本発明の D N Aを対象動物に転移させるにあた つては、 該 D NAを動物細胞で発現させうるプロモーター φ下流に結合した D N Αコンストラクトと.して用いるのが一般に有利である。 例えば、 本発明のヒト D NAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の D N Aを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の D NAを発現させうる各種プロモーターの下流に、 本発明のヒト D N Aを結合した D NAコンストラクト （例、 ベクタ一など） を対象哺乳動物の受精 卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の D N Aを高発現する D N A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草 菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファ一ジなどのパクテリオファ ージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた はバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由 来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラス ドなどが好 ましく用いられる。
上記の D NA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 （i) ウィル ス （例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する D NAのプロモ —夕一、 （i i) 各種哺乳動物 （ヒ卜、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス 夕一、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモー夕一、 例えば、 アルブミン、 インス リン I I、 ゥロブラキン I I、 エラス夕ーゼ、 エリスロポエチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 ダルタチオン S—トラン スフエラーゼ、 血小板由来成長因子 /3、 ケラチン K l， 1^ 1 0ぉょび11 1 4、 コ ラーゲン I型および I I型、 サイクリック AM P依存タンパク質キナーゼ) 3 Iサ ブュニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォスファタ一ゼ、 心房ナ トリウム利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ （一般に T i e 2と略さ れる） 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na, K-ATP a s e) 、 ニューロフィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタロブ 口ティナ一ゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン ]3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ペプチド鎖延長因子 1ひ （EF— 1 ひ） 、 β了ゥチン、 αおよび j3ミオシン重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋ひァクチン、 プレブ口エンケフアリン A、 バソプレシンなどのプロモータ一などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現す ることが可能なサイトメガロウィルスプロモータ一、 ヒトペプチド鎖延長因子 1 (EF— l o!) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ /3ァクチンプロモータ一 などが好適である。 '
上記べクタ一は、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー RN Aの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネ夕一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、 例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの SV40ターミネタ一などが 用いられる。
その他、 目的とする外来性 DNAをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 DNAのイントロンの一部などを プロモー夕一領域の 5'上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 ' 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、 ヒ卜または各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスなど） 由来の肝 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAラ イブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、 線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DN Aは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変 異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前記 のプロモ一ターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D NAの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出動 物の胚芽細胞において、 本発明の外来性 D NAが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを保持 することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により外来性 D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D N A転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、 作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過 剰に有することを意味する。 本発明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の 子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁殖 継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D NAの機能を促進することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデル動物として 利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D N A転移動物を用いて、 本発明 のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の 解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連^"る疾患に 対する予防 ·治療剤、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝 臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 脬臓癌、 脳 腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも利用可能 である。
一方、 本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のプラス ミドに組み込んで原料として用いることができる。 プロモーターとの D NAコン ストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受精卵 細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および 体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細胞 において本発明の異常 D NAが存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽 細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有することを意味する。 本発明 の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞および体細胞 の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホ モザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫 が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高発現 させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終的に本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物と して利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D NA転移動物を用いて、 本 発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療 方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正 常タンパク質の機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデルとなる。 また、 本発明の外来異常 D N Aを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の夕 ンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質または機能不活性型 不応症に対する予防 ·治療剤、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍 臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防 ·治療剤のスクリーニング試験にも 利用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、 例 えば、
(i) 組織培養のための細胞源としての使用、
(i i) 本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析する 、 または D NAにより発現されたペプチド組織を分析することによる、 本発明 のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性につい ての解析、
(i i i) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを 使用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv) 上記 （i i i) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬 剤のスクリーニング、 および
(V) 本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症などを含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べるこ とができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるよ り詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患によ る二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どのタンパク質分解酵素により、 遊離した D N A転移細胞の取得、 その培養また はその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発明のタンパク 質産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるい ίま増殖との関連性、 またはそれ らにおけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明の夕ンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうた めに、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾患治療薬のス クリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の DN Α転移動物ま たは本発明の外来性 DN A発現べクタ一を用いて、 本発明のタンパク質が関連す る疾患の DNA治療法を検討、 開発することが可能である。
(8) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本 発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
■ すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、 .
(2) 該 DNAがレポ一夕一遺伝子 （例、 大腸菌由来の) 3—ガラクトシダ一ゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化された第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが不活性化された該 DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
(7) 該 DNAがレポ一ター遺伝子 （例、 大腸菌由来の )3—ガラクトシダーゼ遺 伝子） を導入することにより不活性化され、 該レポ一タ一遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモーターの制御下で発現しうる第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト哺乳動物、
(9) 'ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト哺乳動物、 および
(1 0) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポーター遺伝子の発 現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の DN Aに人為的に変異を加えることにより、 DNAの発現 能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコードしている本発明のタンパク質の活性 , を実質的に喪失させることにより、 DNAが実質的に本発明のタンパク質の発現 能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称することがある） 非ヒト 哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） をいう。 J
非ヒ卜哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的 手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DNAを揷入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、 プロモータ一あるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト D N Aを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明の D NA不活性化 ES細胞または本発明のノックアウト ES細胞と略記する） の具体 例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の DNAを単離 し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは 1 a c Z (j3_ガラクトシダ一ゼ遺伝 子） 、 c a t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子) を代 表とするレポ一夕一遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、 あるいはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる DN A配列
(例えば、 p o 1 y A付加シグナルなど) を挿入し、 完全なメッセンジャー RN Aを合成できなくすることによって、 結果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列を有する DNA鎖 （以下、 夕一ゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について 本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブ リダィゼーシヨン解析あるいはターゲッティングベクタ一上の DNA配列とター ゲッティングべクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配 列をプライマーとした PC R法により解析し、 本発明のノックアウト ES細胞を 選別することにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞とし ては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また公知 Evansと Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免 疫学的背景がはつきりしていないので、 これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背 景が明らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57 BL/6マウスや C 57 BLZ 6の採卵数の少なさを DBA/ 2との交雑により改善した BDFi マウス （C 57 BLZ6と DBA/2との F を用いて樹立したものなども良 好に用いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという 利点に加えて、 C 57 BL/6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた E S細胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BL/ 6マウスとバックク ロスすることでその遺伝的背景を C 57 BLZ 6マウスに代えることが可能であ る点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初 期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であ り、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減で さる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。 得られる ES細胞の染色体数は正常数の 100 %が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクロ一ニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発 生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要である。 例え ば、 STO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で UF (1〜10000 ϋ/πιΐ) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37°Cで培養するなどの方法で培養し、 継代時に は、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0.001〜0.5%トリプシン/0.1〜 5mM EDTA, 好ましくは約 0.1 %トリプシン /ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新 たに用意したフィ一ダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代 は、 通常 1〜3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細 胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋などの 種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H.
Kaufman, Nature第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Martin Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル ·ォ ブ ·ェンブリオロジー 'アンド 'ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の DNA発現不 全細胞は、 インビト口における本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において 有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mRNA量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と区別する ことが可能である。
該非ヒ卜哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作製し たタ一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導 入によりターゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A配 列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の 本発明の DN Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、 本発明の D N Aを ノックアウトさせることができる。
本発明の DN Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の DN A上またはその近 傍の D N A配列をプロ一ブとしたサザンハイブリダイゼーション解析または夕一 ゲッティングベクター上の D NA配列と、 夕一ゲッティングベクターに使用した マウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた 場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが不活性化された細胞株をク ローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚ま たは胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮 に移植する。 作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変 異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。 該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、 この ようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コートカラ一の判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、 本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発 明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D N A溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクタ一を染色体内に導入 したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これらのトランスジ エニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座に 変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D N Aがノックアウトされている個体は、 交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の飼 育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られたホモザィゴ —ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1 , ホモザィゴート複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 ヘテロザィゴート動物の 雌雄を交配することにより、 該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ 口ザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明のタンパク質により 誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の 不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及 び治療法の検討に有用である。
( 8 a ) 本発明の： D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリ一ニングに用い ることができる。
すなわち、 本発明は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察 ·測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病、 例えば癌などに対して治療 ·予防効果を有する化 合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳 動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などが あげられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であつ てもよい。 '
具体的には、 本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、 試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、 試験動物の症状、 試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓 癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍 などの癌に対して治療 ·予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、 本 発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、 試験化合物非投与 群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察す る。
該スクリーニング方法において、 試験動物に試験化合物を投与した場合、 該試 験動物の上記疾患症状が約 1 0 %以上、 好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましく は約 5 0 %以上改善した場合、 該試験化合物を上記の疾患に対して治療 ·予防効 果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、 本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こさ れる疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒性な 予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリー二 ングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸など） や塩基 （例、 アルカリ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピ オン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられ る。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 該化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 kgとして） の乳癌患者においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜100 mg、 好ましくは約 1. 0〜5 Omg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与 する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患 などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60 kgとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. ；!〜 2 Omg、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omgを 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 体重 6 O kg当 たりに換算した量を投与することができる。
(8 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合 物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒ卜哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の DN Aに対するプ 口モータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方 法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、 前記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、 本発明の D NAがレポ一夕一遺伝子を導入することにより不活性ィ匕され、 該レポーター遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモータ一の制御下で発現しうるものが用いられ る。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 前記と同様のものが用いられ、 ]3—ガラクトシダ ーゼ遺伝子 （1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の DN Aをレポーター遺伝子で置換された本発明の DN A発現不全非ヒ ト哺乳動物では、 レポーター遺伝子が本発明の DN Aに対するプロモ一ターの支 配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースする ことにより、 プロモ一夕一の活性を検出することができる。
例えば、 本発明のタンパク質をコードする D N A領域の一部を大腸菌由来の β 一ガラクトシダ一ゼ遺伝子 （ 1 a c .Z ) で置換している場合、 本来、 本発明の夕 ンパク質の発現する組織で、 本発明のタンパク質の代わりに ガラクトシダー ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—プロモー 4—クロロー 3—インドリル一 ]3 —ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような ι8 _ガラクトシダーゼの基質とな る試薬を用いて染色することにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内に おける発現状態を観察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損 マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン酸緩衝生理 食塩液 ( P B S ) で洗浄後、 X— g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 °C付近 で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D TA/P B S 溶液で洗浄することによって、 i3—ガラクトシダーゼ反応を停止させ、 呈色を観 察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検出しても よい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、 本発明の D N Aに対するプロモ一夕一活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、 該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 アル力 リ金属など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が 好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭ィ匕 水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン 酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安 息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用いられる。 本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、 本発明の夕ンパク質の発現の阻害、 該タンパク質の機能を阻害することができる ので、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液 腫瘍などの癌の予防 ·治療剤として有用である。
さらに、 上記スクリ一二ングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。 該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、 前記 した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造すること ができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。
該ィ匕合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモー夕一活性を阻害する 化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） の乳癌患者に おいては、 一日につき該化合物を約 0.1〜10 Omg、 好ましくは約 1. 0〜 5 Omg, より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場 合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例 えば、 本発明の DN Aに対するプロモータ一活性を阻害する化合物を注射剤の形 で通常成人 （体重 6 O kgとして） の乳癌患者に投与する場合、 一日につき該化 合物を約 0. 01〜3 Omg、 好ましくは約 0. 1〜 20 mg、 より好ましくは 約 0. 1〜1 Omgを静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場 合も、 体重 6 O kg当たりに換算した量を投与することができる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 本発明の DNAに対 するプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリー二, ングする上で極めて有用であり、 本発明の DNA発現不全に起因する各種疾患の 原因究明または予防 ·治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のタンパク質のプロモー夕一領域を含有する DNAを使って、 そ の下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、 これを動物の卵細胞に注 入していわゆるトランスジエニック動物 （遺伝子移入動物） を作成すれば、 特異 的にそのタンパク質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能となる。 さらに上記プロモ一夕一部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、 これが発現 するような細胞株を樹立すれば、 本発明のタンパク質そのものの体内での産生能 力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用 ' できる。 本明細書において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC- IUB Commission on Biochemical Nomenclature による略号あるいは当該分野におけ る慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異 性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグァノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
EGTA ：エチレングリコール-ビス - (ベータアミノエチルェ テル） 四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
Leu
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン Cy s
Me t メチォニン
G 1 u ダル夕ミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
Ph e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n ダル夕ミン
P G 1 u ピログルタミン酸
S e c (selenocysteine) また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。 '
Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
Ph フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) 一力ルポキサミド基
To s P-トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
Cl2- Bzl 2, 6—ジクロ口べンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル C 1一 z ： 2—クロ口べンジルォキシカルポニル
B r -Z ： 2—ブロモベンジルォキシカルボニル
B o c ： t—ブトキシカルボニル
DNP ：ジニトロフエニル
T r t ： 卜リチレ
Bum ： t一ブトキシメチル
Fm o c ： N- 9—フルォレニルメトキシカルポ二 ：ル
HOB t
HOOB t ： 3， 4ージヒドロー 3—ヒドロキシー 4
1, 2, 3一べンゾトリアジン
HONB 1-ヒドロキシ- 5-ノルポルネン -2， 3-ジカルポキシイミド DCC 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
. 〔配列番号： 1〕
FL J 20539のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を有する FL J 20539をコードする DN Aの塩基配列を示す。 '
〔配列番号： 3〕
FL J 20539をコードする全長遺伝子を含む DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 4〕
h C P 50177のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 5〕
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列を有する h CP 50177の DNAの塩 基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
hCP 50177の全長遺伝子を含む DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕 hCP 1762319のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有する h CP 1762319の DNA の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
hCP 1762319の全長遺伝子を含む DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
F L J 13515のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 11〕
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有する FL J 13515をコードす る DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
FL J 13515をコ一ドする全長遺伝子を含む DNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 13〕
実施例 2、 実施例 19、 実施例 20および実施例 21で用いられたアンチセン スオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 2、 実施例 19、 実施例 20および実施例 21で用いられたアンチセン スオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列垂号： 15〕
TACT 427一 Aのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 15で表されるアミノ酸配列を有する TACT 427一 Aをコード する D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
TACT 427一 A 2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 18〕
配列番号： 17で表されるアミノ酸配列を有する TACT 427— A 2をコー ドする D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 19〕
TACT 427— Aおよび TACT 427—A 2をコードする全長遺伝子を含 む D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
TACT427— Bのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 21〕
配列番号： 20で表されるアミノ酸配列を有する TACT 427— Bをコード する DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
TACT427— B 2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 23〕
配列番号： 22で表されるアミノ酸配列を有する TACT427 -B 2をコ一 ドする DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕
TACT 427— Bおよび TACT 427 -B 2をコードする全長遺伝子を含 む DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
TACT427— Cのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 26〕
配列番号： 25で表されるアミノ酸配列を有する TACT427—Cをコード する D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
TACT 427—C 2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 28〕
配列番号： 27で表されるアミノ酸配列を有する TACT427— C 2をコ一 ドする D N Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
TACT 427— Cおよび TACT 427 -C 2をコードする全長遺伝子を含 む DN Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 30〕
実施例 3で用いられたプライマ一 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 31〕
実施例 3で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 32〕
実施例 4で用いられたプライマー 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 33〕
実施例 4で用いられたプライマ一 4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
実施例 5で用いられたプライマ一 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 35'〕
実施例 5で用いられたプライマー 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 36〕
実施例 6、 実施例 7、 実施例 8、 および実施例 20で用いられたプライマー 7 の塩基配列を示す。
〔配列番号： 37〕
実施例 6、 実施例 7、 実施例 8、 および実施例 20で用いられたプライマ一 8 の塩基配列を示す。
〔配列番号： 38〕
実施例 6、 実施例 7、 実施例 8、 および実施例 20で用いられた TaqManプロ一 ブ 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 39〕
実施例 10で用いられたプライマ一 9の塩基配列を示す。
〔配列番号： 40〕
実施例 10で用いられたプライマー 10の塩基配列を示す。
〔配列番号： 41〕
実施例 11で用いられたペプチド 1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 42〕
実施例 1 1で用いられたぺプチド 2のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 43〕
実施例 1 1で用いられたぺプチド 3のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 44〕
実施例 19、 実施例 20および実施例 21で用いられたセンスオリゴヌクレオ チドの塩基配列を示す。 後述の実施例 4で得られた形質転換体 Escherichia coli TOPI 0/47427A/pCR- Bluntll- T0P0は、 2002年 12月 3日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305-8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに 寄託番号 FERM BP- 8253として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体 Escherichia' coli TOP10/47427B/pCR- Bluntll- T0P0は、 2002年 12月 3日から茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに 寄託番号 FERM ΒΡ-8254として寄託されている。
後述の実施例 5で得られた形質転換体 Escherichia coli T0P10/47427 C/pCR- Bluntll- T0P0は、 2002年 12月 3日から茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵 便番号 305- 8566) の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに 寄託番号 FERM BP- 8255として寄託されている。 以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、 本発明はそれに限定 されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキユラ一 クロ一ニング（Molecular cloning, 2nd, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 年）に記載されている方法に従った。 【実施例 1】
遺伝子発現解析
乳癌組織および肺癌組織で特異的に発現亢進している遺伝子群を明らかにする ため、 乳癌組織 8例、 正常乳房組織 4例から抽出された total RNA (表 1 ) 、 およ び肺癌組織 4例、 正常肺組織 5例から抽出された total RNA (表 3) を材料とし、 oligonucleotide microarray (Human Genome U95A, U95B, U95C, U95D, U95E; Af fyme t r i x社） を用いて遺伝子発現解析を行つた。
実験方法は、 Affymetrix社の実験手引き書 (Expression analysis technical manual) に従った。 その結果、 乳癌組織 （lot.0009 - 192 - 00101、 lot.0009-192- 00120、 lot.0009-192-00153、 lot.0009-192-00178) および肺癌組織 （lot.0009- 192-00122、 lot.0011 - 192- 01293、 lot.0011-192-01297) においてそれぞれ正常 乳房組織、 正常肺組織に比べ、 （1) FLJ20539遺伝子 （配列番号： 2) 、 ， FU20539関連遺伝子である hCP50177遺伝子 （配列 号： 5) 、 FU20539関連遺伝 子である hCP1762319遺伝子 （配列番号： 8) ならびに FU13515遺伝子 （配列番 号： 11) 、 および （2) 後述の実施例 4または実施例 5で得られた TACT427- A遺 伝子 （配列番号： 16) 、 TACT427- A2遺伝子 （配列番号： 18) 、 TACT427-B遺 伝子 （配列番号： 21) 、 TACT427-B2遺伝子 （配列番号： 23) 、 TACT427- C遺 伝子 （配列番号： 26) ならびに TACT427-C2遺伝子 （配列番号： 28) の発現亢 進が検出された （表 2および表 4) 。
〔表 1〕
RNAを抽出した組織 販冗兀 .
乳がん組織 (lot.0009-192-00101) BioCl mical Partners 社
乳がん組織 (lot.0009-192-00120) BioClinical Partners 社
乳がん組織 (lot.0009-192-00153) BioClinical Partners 社
乳がん組織 (lot.0009-192-00155) BioClinical Partners 社
乳がん組織 (lot.0009-192-00157) BioClinical Partners 社
乳がん組織 (lot.0009-192-00178) BioClinical Partners 社
乳がん組織 (lot.0011-192-01284) BioClinical Partners 社
乳がん組織 (lot.0011-192-01287) BioClinical Partners 社
正常乳房組織 (lot.0008-192-00404) BioCl inical Partners 社
正常乳房組織 (lot.0008-192-00422) BioClinical Partners 社
正常乳房組織 (lot.0009-192-00153) BioClinical Partners 社
正常乳房組織 (lot.0011-192-01286) BioClinical Partners 社 〔表 2〕 乳がん組織 (lot.0009-192-00101) 3.7
乳がん組織 (lot.0009-192-00120) 9.0
乳がん組織 (lot.0009-192-00153) 2.1
乳がん組織 (lot.0009-192-00155) . ND
乳がん組織 (lot.0009-192-00157) 0.54
乳がん組織 (lot.0009-192-00178) 2.1
乳がん組織 (lot.0011-192-01284) ND
乳がん組織 (lot.0011-192-01287) ND
正常乳房組織 (lot.0008-192-00404) ND
正常乳房組織 (lot.0008-192-00422) ND
正常乳房組織 (lot.0009-192-00153) 1.6
正常乳房組織 (lot.0011-192-01286) 1.2
遺伝子発現量は、 oligonucleotide microarrayで発現が 検出された全遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した ND; not detected
〔表 3〕
RNAを抽出した組織 販冗兀
肺がん組織 (lot.0009· -192-00122) BioClinical Partners 社 肺がん組織 (lot.0011- -192-01285) BioCl inical Partners 社 肺がん組織 (lot.0011· -192-01293) BioCl inical Partners 社 肺がん組織 (lot.0011- -192-01297) BioCl inical Partners 社 正常肺組織 (lot.0009- -192-00150) BioCl inical Partners 社 正常肺組織 (lot.0009- -192-00168) BioClinical Partners 社 正常肺組織 (lot.0011- -192-01283) BioCl inical Partners 社 正常肺組織 (lot.0011- -192-01285) BioCl inical Partners 社 正常肺組織 (lot.0011 -192-01297) BioCl inical Partners 社 〔表 4〕
組織 遺伝子発現 j
肺がん組織 (lot.0009-192-00122) 2.8
肺がん組織 (lot.0011-192-01285) 0.67
肺がん組織 (lot.0011-192-01293) 1.3
肺がん組織 (lot.0011-192-01297) 1.5
正常肺組織 (lot.0009-192-00150) ND
正常肺組織 (lot.0009-192-00168) 0.38
正常肺組織 (lot.0011-192-01283) ND
正常肺組織 (lot.0011-192-01285) ND
正常肺組織— (lot.001卜 192-01297) _ ND _
遺伝子発現量は、 oligonucleotide microarrayで発現が
検出された全遺伝子の発現量の中央値を 1として標準化した。
ND; not detected
【実施例 2】
ヒト肺癌細胞株のアポト一シス誘発
本発明の夕ンパク質遺伝子の発現を抑制することにより、 ヒト肺癌細胞株のァ ポトーシスが誘発されるか否かを調べた。
まず、 アメリカンタイプカルチャーコレクション (ATCC) より購入したヒト非 小細胞肺癌細胞株 NCI- H460を、 RPMI- 1640培地 （25mM HEPES含有） （Invitrogen 社） に牛胎仔血清 （ATCC) を 10%加えた培地で懸濁し、 1ゥエル当たり 4000個の 細胞密度で 96穴平底組織培養プレート (BDファルコン社) に播種した。 5%炭酸 ガス気流中、 37°Cでー晚培養した後、 アンチセンスオリゴヌクレオチドをトラン スフエクションした。
具体的には、 （1) FLJ20539遺伝子 （配列番号： 2) 、 FLJ20539関連遺伝子で ある hCP50177遺伝子 （配列番号： 5) 、 FLJ20539関連遺伝子である hCP1762319遺 伝子 （配列番号： 8) ならびに FLJ13515遺伝子 （配列番号： 1 1) 、 および
(2) 後述の実施例 4または実施例 5で得られた TACT427- A遺伝子 （配列番号： 1 6) 、 TACT427-A2遺伝子 （配列番号： 18) 、 TACT427- B遺伝子 （配列番号： 2 1) 、 TACT427-B2遺伝子 （配列番号： 23) 、 TACT427- C遺伝子 （配列番号： 2 6) ならびに TACT427-C2遺伝子 （配列番号： 28) のタンパク質コード領域配列 または 3 ' 非翻訳領域にハイブリダイズするァンチセンスォリゴヌクレオチド配 列 （配列番号： 1 3) を設計後、 phosphorothioate化オリゴヌクレオチドを合成 し、 HPLC精製して導入実験に用いた （以下、 アンチセンスオリゴヌクレオチドと 略する） 。 コントロールとしては、 配列番号： 13で示される塩基配列のリバ一 ス配列 （配列番号： 14) を同様に phosphorothioate化し、 HPLC精製して用いた (以下、 コントロールオリゴヌクレオチドと略する） 。
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコント口一ルォリゴヌクレオチドを、 Opti-MEM (Invitrogen社) で希釈し、 さらに FuGENE6試薬 (Roche Diagnostics 社） を 4倍量 （4 L/zzgオリゴヌクレオチド） の割合で加えた混合液を室温で 30 分間放置した。 このオリゴヌクレオチド溶液を、 1ゥエル当たり 40 の割合で プレートに添加した。 オリゴヌクレオチドの終濃度は 140 nMとなるよう調整した。 上記の条件で更に 3日間培養した後、 Cell Death Detection ELISA™Sキット
(Roche Diagnostics社） を用いて、 添付プロトコ一ルに従い上記オリゴヌクレ ォチドのアポト一シス誘導活性を測定した。
その結果、 ァンチセンスォリゴヌクレオチドは陰性対照として用いたコント口 ールオリゴヌクレオチドに比べ、 約 2.8倍のアポト一シス誘導活性を示し、 統計 学的に有意な差 =0.0005) を示した （表 5) 。
〔表 5〕
アポ! ^一シス誘導活性 （Α 405— Α 492)
平均値 標準偏差
ブランク 0. 297 0. 053
コント口ールォリゴヌクレ才チド 0. 764 0. 096
(配列番号： 1 4)
ァンチセンス才リゴヌクレ才チド 1. 57 0. 093
(配列番号： 1 3) 【実施例 3】
ァンチセンスオリゴヌクレオチド導入による NCI-H460のアポト一シス誘導 アンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、 （1) F 20539遺伝子 （配列番 号： 2) 、 FLJ20539関連遺伝子である hCP50177遺伝子 （配列番号： 5) 、
FLJ20539関連遺伝子である hCP1762319遺伝子 （配列番号： 8) ならびに FU13515 遺伝子 （配列番号： 1 1) 、 および （2) 後述の実施例 4または実施例 5で得ら れた TACT427- A遺伝子 （配列番号： 16) 、 TACT427- A2遺伝子 （配列番号： 1 8) 、 TACT427- B遺伝子 （配列番号： 21) 、 TACT427- B2遺伝子 （配列番号： 2 3) 、 TACT427- C遺伝子 （配列番号： 26) ならびに TACT427-C2遺伝子 （配列番 号： 28) の発現量が低下するか否か調べた。
実施例 2で用いたヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI-H460を実施例 2と同じ培地に懸 濁し、 1ゥエル当たり 24, 000個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート （BDファ ルコン社） に播種レた。 5%炭酸ガス気流中、 37 で一晩培養した後、 アンチセ ンスオリゴヌクレオチドとコントロ一ルオリゴヌクレオチドをトランスフエクシ ヨンした。 オリゴヌクレオチド溶液の添加量は 1ゥエル当たり 390 /Lとし、 オリ ゴヌクレオチドの終濃度は 200 nMとなるよう調整した。 トランスフエクシヨン後、 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで 24時間培養を継続した後に RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを抽出した。 約 400 ngの! タル RNAを铸 型として、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems社) を用いて添付プロトコ一ルに従い逆転写反応を行った。 1 タル RMにして 10 ng に相当する cDNAを铸型とし、 2種類のプライマー 〔プライマー 1 (配列番号： 3 0) およびプライマ一 2 (配列番号： 31) 〕 と SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems社） を用いて、 (1) FLJ20539遺伝子 (配列番号： 2) 、 FLJ20539関連遺伝子である hCP50177遺伝子 （配列番号： 5) 、 FLJ20539関連遺伝 子である hCP1762319遺伝子 （配列番号： 8) ならびに FLJ13515遺伝子 （配列番 号： 1 1) 、 および （2) 後述の実施例 4で得られた TACT427- A遺伝子 （配列番 号： 16) 、 TACT427- A2遺伝子 （配列番号： 18) 、 TACT427- B遺伝子 （配列番 号： 2 1) 、 TACT427- B2遺伝子 （配列番号： 23) 、 TACT427- C遺伝子 （配列番 号： 26) ならびに TACT427-C2遺伝子 （配列番号： 28) の発現コピ一数を測定 した。
同量の铸型 cDNA中に含まれる /3-ァクチン遺伝子発現量を TaqMan ]3- actin Control Reagents (Applied Biosystems社) を用いて測定し内部標準とした。 7 ンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフエクシヨンしない場合には、 上記 10 遺伝子の発現量は j8-ァクチン遺伝子の発現量の 0.10%であったのに対し、 配列 番号： 13で示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド投与群では 0.046%であ り統計学的に有意 （P≤0.05) な発現量低下が認められた。 一方、 コントロール オリゴヌクレオチド （配列番号： 14) 投与群では 0.088%であり非トランスフ ェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。 この結 果より、 上記 10遺伝子の発現量の低下によりヒト肺癌細胞株のアポトーシスが誘 発されたことが示された。
【実施例 4】
ヒト脳由来タンパク質 TACT427-A、 TACT427-A2, TACT427-Bおよび TACT427-B2を コードする cDNAのクロ一ニングと塩基配列の決定
ヒト脳 Marathon- Ready cDNA (CL0NTECH社） を铸型とし、 2種のプライマー 〔プ ライマー 3 (配列番号： 32) およびプライマ一 4 (配列番号： 33) 〕 を用い て PCR反応を行った。 該反応における反応液の組成は、 上記 cDNA 1^1を铸型とし て使用し、 PfuTurbo DNA Polymerase (STRATAGENE社） 6.25U、 プライマー 3 (配 列番号： 32) およびプライマ一 4 (配列番号： 33) を各 1.0 M、 dNTPsを 200 βΜ および fu Buffer (STRATAGENE社） を 5〃1加え、 50 1の液量とした。 PCR 反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 10秒、 55°C · 30秒、 72°C · 6分のサイクルを 40回 繰り返した。 該 PCR反応産物を PCR Purification Kit (QIAGEN社） を用いて精製 した。 これを Zero Blunt T0P0 PCRクローニングキット （Invitrogen社） の処方 に従いプラスミドベクター PCR- Bluntll- T0P0 (Invi trogen社） へサブクローニン グした。 これを大腸菌 TOP10に導入し、 cDNAを持つクローンをカナマイシンを含 む LB寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 配列番 号： 1 6および配列番号： 2 1で表される cDNAの塩基配列をそれぞれ得た。
配列番号： 3で表される FLJ20539全長遺伝子塩基配列の 1〜160番目および 2483 〜2755番目の塩基配列を、 配列番号： 1 6で表される塩基配列の 5，端および 3'端 にそれぞれ付加した塩基配列を、 配列番号： 1 9に示す。
配列番号： 3で表される FU20539全長遺伝子塩基配列の 1〜160番目および 2483 〜2755番目の塩基配列を、 配列番号： 2 1で表される塩基配列の 5'端および 3'端 にそれぞれ付加した塩基配列を、 配列番号： 2 4に示す。
配列番号： 1 6で表される塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを TACT427- A/pCR- Blunt l l- T0P0と、 配列番号： 2 1で表される塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを TACT427- B/pCR_B 1 unt i l -T0P0と名付けた。
配列番号： 1 6で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 1 5 ) を含有するタンパク質を TACT427-Aと命名した。
配列番号： 2 1で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番号： 2 0 ) を含有するタンパク質を TACT427-Bと命名した。
さらに、 プラスミド TACT427-A/PCR- Blunt l l- T0P0が導入された形質転換体を Escher ichia col i 1：0?10/47427八 0 -81111^ 11-[0?0と、 プラスミド TACT427- B/pCR- Blunt l l- T0P0が導入された形質転換体を Escherichia col i
TOP10/47427B/pCR-Blunt 11- TOPOとそれぞれ命名した。
TACT427-Bのアミノ酸配列 （配列番号： 2 0 ) では、 TACT427-Aのアミノ酸配列
(配列番号： 1 5 ) の 278番目の Argが Ginに、 825番目の Gluが Lysに、 826番目の Alaが Proに、 970番目の Valが Alaにそれぞれ置換され、 340番目の Serが欠失して いる。
TACT427- Bをコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 1 ) では、 TACT427- Aを コードする DNAの塩基配列 （配列番号： 1 6 ) の 833番目の gが aに、 1482番目の g が cに、 1590番目の aが gに、 2473番目の gが aに、 2476番目の gが に、 2909番目の t が cにそれぞれ置換され、 1015〜1017番目の ageが欠失している。
TACT427-Aのァミノ酸配列の 1〜4番目のァミノ酸配列が欠失している配列を配 列番号： 1 7に示す。 配列番号： 1 7で示されるアミノ酸配列を有するタンパク 質を TACT427- A2と命名する。 TACT427- A2をコ一ドする DNAの塩基配列を配列番 号： 1 8に示す。
TACT427- Bのァミノ酸配列の 1〜4番目のァミノ酸配列が欠失している配列を配 列番号： 2 2に示す。 配列番号： 2 2で示されるアミノ酸配列を有するタンパク 質を TACT427-B2と命名する。 TACT427-B2をコードする DNAの塩基配列を配列番 号： 2 3に示す。
TACT427- Aをコードす DMの塩基配列 （配列番号： 1 6 ) は、 ヒトでは
FLJ20539をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) に最も高い相同性を示し た。 配列番号： 1 6で表される塩基配列の 1〜138番目および 889〜3072番目の塩 基配列に対しては、 配列番号： 2で表される塩基配列の 1〜138番目および 139〜 2322番目の塩基配列が対応し、 各部分配列において、 99. 3%および 100%の相同 性をそれぞれ示す。 FLJ20539をコードする Aの塩基配列 （配列番号： 2 ) は、 TACT427-Aをコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 1 6 ) .の 139〜888番目に相当 する塩基配列を欠いていることより、 この配列は TACT427-Aに特異的な配列であ る。 -
TACT427-A2, TACT427-Bおよび TACT427-B2についても、 TACT427-Aと同様に、 FLJ20539に最も高い相同性を示し、 かつ、 同様な塩基置換および塩基配列の欠失 を有する。
TACT427- Aのアミノ酸配列 （配列番号： 1 5 ) の 735〜792番目までのアミノ酸 配列、 TACT427- A2のアミノ酸配列 （配列番号： 1 7 ) の 731〜788番目までのァ ミノ酸配列、 TACT427- Bのアミノ酸配列 （配列番号： 2 0 ) の 734〜791番目まで のアミノ酸配列、 および TACT427- B2のアミノ酸配列 （配列番号： 2 2 ) の 730〜 787番目までのアミノ酸配列は、 ともにアミノ酸ドメインモチーフ検索サイト
SMART (ht tp：〃 smart. emb卜 hei delberg. de/) での検索で、 クロ口パ一ォキシダ —ゼモチーフを有することからクロロパ一ォキシダ一ゼ活性を持つと考えられる。
TACT427- Aの疎水性プロット図を 〔図 1〕 に、 TACT427-A2の疎水性プロット図 を 〔図 2〕 に、 TACT427- Bの疎水性プロット図を 〔図 3〕 に、 TACT427- B2の疎水 性プロット図を 〔図 4〕 にそれぞれ示す。
【実施例 5】 ' ヒト肺癌細胞株 NCI- H522由来タンパク質 TACT427- Cおよび TACT427- C2をコード する cDNAのクローニングと塩基配列の決定 ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H522 (ATCCより購入） を RPMI-1640培地
(Invitrogen社） に牛胎仔血清を 10%加えた培地で培養し、 RNeasy Mini Total RNA Ki t (QIAGEN社） を用いてトータル RNAを抽出した。 1 ^一タル RNAを铸型とし て、 TaqMan Reverse Transcription Reagents (Applied Biosystems社) を用レ て添付プロトコ一ルに従い逆転写反応し cDNAを得た。 ここで得られた cDNAを錶型 とし、 2種のプライマ一 〔プライマー 5 (配列番号： 34) およびプライマー 6 (配列番号： 35) 〕 を用いて PCR反応を行った。 該反応における反応液の組成 は上記 cDNAを铸型として使用し、 PfuTurbo Hotstart DNA Polymerase
(STRATAGENE社） 2.5 U、 プライマー 5 (配列番号： 34) およびプライマ一 6 (配列番号： 35) を各 1.0^M、 dNTPsを 200/ M、 および GC Bufferl (TaKaRa 社） を 10^1加え、 20 1の液量とした。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C · 30秒、 60°C · 20秒、.72 · 3分のサイクルを 35回繰り返した。 該 PCR反応産物をァガロー スゲルにて電気泳動後、 MinElute Gel Extraction Kit (QIAGEN社） を用いて精 製した。 これを Zero Blunt T0P0 PCRクロ一ニングキット （Invi trogen社） の処 方に従いプラスミドベクター pCR-Bluntll-TOPO (Invi trogen社） へサブクロ一二 ングした。 これを大腸菌 TOP10に導入し、 cDNAを持つクロ一ンをカナマイシンを 含む LB寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 配列番 号： 26で表される cDNAの塩基配列を得た。
配列番号： 3で表される FU20539全長遺伝子塩基配列の 1〜160番目および 2483 〜2755番目の塩基配列を、 配列番号： 26で表される塩基配列の 5'端および 3'端 にそれぞれ付加した塩基配列を、 配列番号 29 ：に示す。
配列番号： 26で表される塩基配列を有する DNA断片を有するプラスミドを TACT427- C/pCR- Bluntll- T0P0と名付けた。
配列番号： 26で表される DNAの塩基配列がコードするアミノ酸配列 （配列番 号： 25) を含有するタンパク質を TACT427- Cと命名した。
プラスミド TACT427-C/pCR-B 1 until - T0P0が導入された形質転換体を、
Escherichia coli TOP10/47427C/pCR- Bluntll- T0P0と命名した。
TACT427-Cのアミノ酸配列 （配列番号： 25) では、 TACT427- Αのアミノ酸配列 (配列番号： 1 5) の 491番目の Valが Metに、 825番目の Gluが Lysに、 826番目の 10532
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Alaが Proに、 970番目の Valが Al aにそれぞれ置換され、 340番目の Serが欠失して いる。
TACT427- Cをコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 6 ) では、 TACT427- Aを コードする DNAの塩基配列 （配列番号： 1 6 ) の 504番目の aがじに、 939番目の aが gに、 1471番目の gが aに、 1482番目の gが cに、 1590番目め aが gに、 2473番目の gが aに、 2476番目の gが cに、 2909番目の tが cにそれぞれ置換され、 1015〜1017番目 の ageが欠失している。
TACT427 - Cのアミノ酸配列の 1〜4番目のアミノ酸配列が欠失している配列を 配列番号： 2 7に示す。 配列 号： 2 7で示されるアミノ酸配列を有するタンパ ク質を TACT427- C2と命名する。 TACT427- C2をコードする DNAの塩基配列を配列番 号： 2 8に示す。
TACT427- Cをコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 6 ) は、 ヒトでは FU20539をコードする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) に最も高い相同性を示し た。 配列番号： 2 6で表される塩基配列の 1〜138番目および 886〜3069番目の DNA 塩基配列に対しては、 配列番号： 2で表される塩基配列の 1〜138番目および 139 番目〜 2322番目の塩基配列が対応し、 各部分配列において、 99. 3%および 99. 5% の相同性をそれぞれ示す。 FLJ20539コードする DNAの塩基配列 （配列番号： 2 ) は、 TACT427- C (配列番号： 2 6 ) で表される 139〜885番目に相当する DNA塩基配 列を欠いていることより、 この配列は、 TACT427 - Cに特異的な配列である。
TACT427-C2についても、 TACT427- Cと同様に FU20539に最も高い相同性を示し、 かつ同様な塩基配列の欠失を有する。
TACT427- Cのアミノ酸配列 （配列番号： 2 5 ) の 734〜791番目までの配列およ び TACT427- C2のアミノ酸配列 （配列番号： 2 7 ) の 730〜787番目までの配列は、 ともにアミノ酸ドメインモチーフ検索サイト SMART (hi tp://smar t. embl- heidelberg. de/) での検索でクロロパ一ォキシダーゼモチーフを有することから ク口ロパ一ォキシダーゼ活性を持つと考えられる。
TACT427- Cの疎水性プロット図を 〔図 5〕 に、 TACT427- Cの疎水性プロット図を 〔図 6〕 に示す。 【実施例 6】
以下の実施例において、 TACT427- A遺伝子 （配列番号： 16) 、 TACT427- A2遺 伝子 （配列番号： 18) 、 TACT427- B遺伝子 （配列番号： 21) 、 TACT427- B2遺 伝子 （配列番号： 23) 、 TACT427-C遺伝子 （配列番号： 26) および TACT427 - C2遺伝子 （配列番号： 28) をまとめて TACT427遺伝子と略記することもある。
TACT427- Aタンパク質 （配列番号： 1'5) 、 TACT427-A2タンパク質 （配列番 号： 17) 、 TACT427-Bタンパク質 （配列番号： 20) 、 TACT427-B2タンパク質 (配列番号： 22) 、 TACT427-Cタンパク質 （配列番号： 25) および TACT427- C2タンパク質 （配列番号： 27) をまとめて TACT427タンパク質と略記すること もある。 ヒト癌組織における遺伝子発現量の検討 （その 1) )
ヒト癌患者組織 （乳癌、 肺癌、 大腸癌、 直腸癌、 卵巣癌） 由来の Matched Tumor/Normal cDNA Pair (CLONTECH社） を铸型として、 FAM標識した TaqManプロ ーブを用いた定量的 PCR反応を行うことにより、 癌組織と正常組織での FLJ20539 遺伝子 （配列番号： 2) 、 hCP50177遺伝子.（配列番号： 5) 、 hCP1762319遺伝子 (配列番号： 8) ならびに FU13515遺伝子 （配列番号： 11) 、 および実施例 4 または実施例 5で得られた TACT427遺伝子の発現量を測定した。
該反応における反応液の組成は、 上記 cDNA 1 1を铸型として使用し、
TaqMan™ Universal PCR Master Mix (Applied Biosyst ems社） を 7.5 1、 プラ イマ一 7 (配列番号： 36) およびプライマー 8 (配列番号： 37) を各 0.5 M、 TaqManプローブ 1 (配列番号： 38) を 100 nMとなるよう加え、 15^1の液量と した。 PCR反応は、 50°C · 2分、 95°C · 10分の後、 95°C · 15秒、 60°C · 1分のサイ クルを 40回繰り返した。
その結果、 上記遺伝子の総量は、 ヒト乳癌組織 4例中 2例で周辺正常組織に比べ それぞれ約 7倍、 約 16倍の、 ヒト肺癌組織 3例中 2例で周辺正常組織に比べそれぞ れ約 3倍、 約 2倍の、 ヒト大腸癌組織 5例中 4例で周辺正常組織に比べそれぞれ約 2 倍、 約 8倍、 約 3倍、 約 4倍の、 ヒト直腸癌組織 3例中 2例で周辺正常組織に比べ約 10倍、 約 5倍の、 ヒト卵巣癌組織 5例中 2例で周辺正常組織に比べそれぞれ約 3倍、 約 20倍の発現量を示した。
これより、 上記遺伝子の総量は、 癌組織において顕著に発現上昇していること がわかる。 【実施例 7】
ヒト癌組織における遺伝子発現量の検討 （その 2 )
ヒト肺癌組織 (Direct Clinical Access社、 および BioClinical Partners社よ り購入） より調製した cDNAを铸型として実施例 6と同様の方法により、 癌組織、 および正常組織における実施例 6で用いた遺伝子の発現量の比較を行った。 該反応における反応液の組成は上記 cDNA 1 lを铸型として使用し、 実施例 6 と同一条件で PCR反応を行った。 並行して TaqMan™ Human iS-actin Control Reagents (Applied Biosystems社) を用いて上記 cDNA 1 1に含まれる |3-ァクチ ン遺伝子のコピ一数を算出し内部標準とした。 13 -ァクチン遺伝子発現量で標準 化した場合、 上記遺伝子の総量は、 Direct Clinical Access社のサンプルでは、 正常肺組織に比べてヒト肺癌組織 10例中 8例で約 144倍、 約 3倍、 約 5倍、 約 4倍、 約 4倍、 約 13倍、 約 3倍、 約 19倍に増加しており、 ヒト肺癌組織における顕著な発 現上昇がみられた。
また、 BioClinical Partners社のサンプルでは、 上記遺伝子の総量が ;3 -ァク チン遺伝子発現量の 1 %を超えるものが、 正常肺組織では 7例中 1例であったのに 対し、 ヒト肺癌組織では 11例中 5例と高頻度に認められた。
これより、 上記遺伝子がヒト肺癌組織において顕著に発現上昇していることが 示された。
【実施例 8】
ヒト培養細胞株における遺伝子発現量の検討
以下で使用される脳腫瘍細胞株 SK-N- MC、 SK-N- AS、 SK-N-BE, SK-N-DZ, SK-N- FI、 SK-N - SH、 D341 Med、 Daoy、 DBTRG- 05MG、 U-118 MG、 U-87 MG、 CCF-STTGlお よび SW 1088；ヒト乳癌細胞株 HCC1937、 ZR - 75- 1、 AU565、 MCF- 7および) ffi)A-MB- 231；ヒト大腸癌細胞株 Caco - 2、 C0L0 201、 C0L0 205、 COLO 32画、 HCT- 8、 HT- 29、 LoVo、 LSI 23、 SNU-CK SK - CO- 1、 SW 403、 SW 48、 SW 480、 SW 620、 SW 837 および SW 948； ヒト胎児腎臓細胞株 HEK293； ヒト小細胞肺癌細胞株 NCI- HI 87、 NCI - H378、 NCI-H526, NCト翻、 CI-H1672, NCI— H1836、 NCI-H2227 NCI-N417 および SHP-77；ヒト非小細胞肺癌細胞株 A549、 NCI-H23, NCI-H226, NCト讓、 NCト画、 CI-H522, NCI-H66K NCト删、 NCI-H1155, NCI-H1299, NCI- H1395、 NCI-H1417, NCI— H1435、 NCI— H1581、 NCI-H165 NCI— H1703、 NCI-H1793, NCI - H1963、 NCI-H2073, NCI-H2085, NCI-H2106, NCI-H2228, NCI-H2342および NCI - H2347； ヒト卵巣癌細胞株 ES- 2、 Caov - 3、 MDAH2774, 腿： 0VCAR3、 0V_90、 SK-0V- 3、 T0V-112Dおよび T0V-21G；ヒト滕臓癌細胞株 PANC - 1、 MIA- PaCa - 2、 AsPC- 1、 BxPC- 3、 Capan- 1および Capan- 2；ヒト前立腺癌細胞株 DU 145；ヒト網膜芽腫細胞 株 WERI-Rb- 1および Y79； ヒト精巣癌細胞株 Cates- 1Bの 86株は、 ATCCより購入し た。 ヒト正常気道上皮細胞 SAECおよびヒト正常前立腺上皮細胞 HPrECは、
Clonetics社より購入した。 ヒト大腸癌細胞株 C0CM1、 ヒト非小細胞肺癌細胞株 VMRC-LCDおよびヒト前立腺癌細胞株 PC3は、 JCRBより購入した。 これら細胞株は 実施例 9以降の実施例でも用いることがある。
上記記載の細胞株 91辟より RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社） を用いて ] ^一タル RNAを調製した。 この! タル RNAを铸型として TaqMan Reverse
Transcription Reagents (Applied Biosystems社） の添付プロトコ一ルに従い、 ランダムプライマ一を用いた逆転写反応で cDNAを調製した。 この cDNAを铸型とし て定量的 PCR反応を行うことにより、 遺伝子 FLJ20539遺伝子 （配列番号： 2) 、 hCP50177遺伝子 （配列番号： 5) 、 hCP1762319遺伝子 （配列番号： 8) ならびに FLJ13515遺伝子 （配列番号： 1 1) 、 および TACT427遺伝子の発現量の検討を行 つに。
該反応は上記トータル RNA 5 ngより得られた cDNAを鎵型として使用し、 実施例 6と同様の方法により行った。 並行して TaqMan™ Human )3-actin Control
Reagents (Applied Biosystems社) を用いて上記トータル RNA 1 ngに含まれる β -ァクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、 /3-ァクチン遺伝子発現量で標準ィヒした相対的発 現率を 〔表 6〕 に示す。 上記遺伝子発現量の総量が β -ァクチン遺伝子発現量の 1 %を超える癌細胞株が 13株見出され、 上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。
〔表 6〕
Figure imgf000093_0001
【実施例 9】 組換え型完全長夕ンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築 （その 1 )
TACT427-Aタンパク質および TACT427- B夕ンパク質の C末端に 3xFLAG夕グを融合 したタンパク質を発現する動物細胞用発現ベクターを構築した。
実施例 4で得た TACT427- A/pCR-Blunt 11- T0P0、 TACT427-B/pCR-Blunt 11- T0P0、 および p3xFLAG-CMV- 14 (Sigma社） を制限酵素 EcoRIおよび Xbalにて処理し、 ァガ ロースゲル電気泳動で分離後、 TACT427- A、 TACT427-Bおよび p3xFLAG- CMV- 14に相 当する DNA断片を回収し、 Gel Extrac t ion Ki t (QIAGEN社）を用いて精製した。 そ れぞれの DNA断片を DNA Ligat ion Ki t ver. 2 (Takara Bio社） を用いてライゲー シヨン反応を行った後、 大腸菌 TOP 10に導入し、 アンピシリンを含む LB寒天培地 中で選択した。 個々のクローンの配列を解析した結果、 TACT427- Aタンパク質
(配列番号： 1 5 ) 、 および TACT427-Bタンパク質 （配列番号： 2 0 ) をコード する cDNA配列を有する動物細胞用発現べク夕一 p3xFLAG- TACT427- A、 および p3xFLAG- TACT427-Bを得た。 【実施例 1 0】
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築 （その 2 )
TACT427- Aタンパク質 （配列番号： 1 5 ) を発現する動物細胞用発現べクタ一 を構築した。
実施例 9で得られた p3xFLAG-TACT427- Aを铸型とし、 プライマ一 9 (配列番 号： 3 9 ) およびプライマー 1 0 (配列番号： 4 0 ) を用いて PCR反応を行った。 該反応における反応液の組成は p3xFLAG_TACT427-A 200 ngを铸型として使用し、 Pfu Turbo Hots tar t DNA Polymerase (STRATAGENE社） を 2. 5 U、 プライマー 9
(配列番号： 3 9 ) およびプライマー 1 0 (配列番号： 4 0 ) を各 1 M、 dNTPs を 200 M、 および GC Buf fer I (Takara Bio社） を 25 1加え、 の液量とし た。 PCR反応は、 95°C · 1分の後、 95°C . 15秒、 60°C · 15秒、 72°C · 3分のサイク ルを 25回繰り返し行った。 次に PCR Puri f icat ion Ki t (QIAGEN社) にて該 PCR反 応産物を精製した後、 制限酵素 Xbalおよび EcoRIにて処理した。 pcDNA3. 1 (+)
(Invi trogen社） も制限酵素 Xbalおよび EcoRIにて処理した。 これらをァガロー スゲル電気泳動で分離後、 TACT427-Aタンパク質をコードする塩基配列を含む DNA 断片と PCDNA3.1 (+)に相当する DNA断片をそれぞれ回収し、 Gel Extraction Ki QIAGEN社）を用いて精製した。 それぞれの DNA断片を DNA Ligation Kit ver.2 (Takara Bio社） を用いてライゲーシヨン反応を行った後、 大腸菌 T0P10に導入 し、 アンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した。 個々のクローンの配列を解析 した結果、 TACT427-Aタンパク質をコードする cDNA配列を有する動物細胞用発現 ベクタ一 PCDNA3.1 (+)-TACT427_Aを得た。
【実施例 1 1】
ペプチド抗体の作製と精製
TACT427タンパク質のアミノ酸配列に基づき、 15アミノ酸からなる以下の 3種の ペプチド （ペプチド 1〜3) を Fmoc固相合成法を用いて合成した。
ペプチド 1のアミノ酸配列 〔Gly- Ser-Gly_Glu-Glu-Asn- Asp- Pro- Gly_Glu- Gin- Ala- Leu- Pro- Cys (配列番号： 41) 〕 は、 TACT427-Aタンパク質 （配列番号： 1 5) の 220番目から 233番目までのアミノ酸配列の C末端に、 Cysを付加した配列 である。
ペプチド 2 [G 1 y-P r o-A 1 a-G 1 u-G 1 y-P r 0 -A 1 a-G 1 u-P r o-A 1 a-A 1 a-G 1 u-A 1 a-S e r- Cys (配列番号： 42) 〕 のアミノ酸配列は、 TACT427- Aタンパク質 （配列番号： 15) の 517番目から 530番目までのアミノ酸配列の C末端に、 Cysを付加した配 列である。
ぺプチド 3のアミノ酸配列 〔Gly- Ser_Va卜 Gly- Gly - Asn-Thr- Gly- Va卜 Arg-Gly - Lys-Phe-Glu-Cys (配列番号： 43) 〕 は、 TACT427-Aタンパク質 （配列番号： 1 5) の 800番目から 813番目までのアミノ酸配列の C末端に、 Cysを付加した配列 である。 ホールリンぺットへモシァニン (KLH) をキャリアータンパク質として結合させ 抗原とし、 以下のように、 ゥサギポリクローナル抗体を作製した。
免疫動物は雄性ゥサギ KBL: JW (1 1週齢、 オリエンタル酵母） 一羽を用 い、 初回感作は完全フロインドアジュバンド （Difco社） 懸濁液、 2回目以降は不 完全フロインドアジュパンド （Difco社） 懸濁液を用いた。 感作は背部皮下注射 により行い、 1回の感作には各抗原 0. 5mgを用い、 初回感作後 14日毎に 3回繰り返 した。 初回感作後 52日目に麻酔下類動脈採血を行い、 血清約 50 mlを得た。 この ようにして得られた血清を硫酸アンモニゥム塩析法により濃縮し、 得られた粗 IgG画分全量をプロテイン Aァフィ二ティ一カラム （Amersham- Biosc ience社） に より精製し、 ペプチド 1、 ペプチド 2またはペプチド 3を免疫したゥサギから、' それぞれ約 223 mg、 約 495 mgおよび約 390 mgの精製 IgGを得た。 さらにペプチド 1に対する精製 IgG l l lmg, ぺプチド 2に対する精製 IgG 248nigおよびべプチド 3 に対する精製 IgG 195mgを材料として、 各々の免疫源ペプチドを固定ィヒしたカラ ムに結合する IgG画分を取得した。 固定化には各ペプチドの C末端の Cysを利用し、 ホウ酸緩衝液を用いてセファロ一スカラム （Amersham- Bioscience社） にカップ リングした。 カラムからの溶出には 8M尿素/リン酸緩衝化生理食塩水 (PBS) を 用いた。 溶出液を PBSに対して透析して尿素を除いた後、 限外濃縮、 フィルター ろ過滅菌することにより、 ペプチド 1、 ペプチド 2およびペプチド 3に対するァ フィニティ一精製抗体 AS-2480、 AS- 2481および AS-2482を、 約 3. 7 mg、 約 0. 69 mg および約 17 mgずつ取得した。
【実施例 1 2】
ゥサギペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティング
TACT427-Aタンパク質 （配列番号： 1 5 ) の検出は、 実施例 1 1で作製したぺ プチド抗体を含むゥサギ血清を用いて行った。 ヒト胎児腎臓由来 HEK293細胞
1. Ox 個を 10%牛胎仔血清 （JRH社） を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地 (Invi t rogen社） 9 mlに懸濁し、 直径 10 cmのペトリディッシュに播種した。 5% 炭酸ガス気流下、 37°Cで一晩培養した後、 予め FuGene6トランスフエクシヨン試 薬 18 ^ 1 (Roche Di agnos t ics社) および 0PTI- MEM I (Invi trogen社） と混合し室 温で 15分間放置しておいた p3xFLAG- TACT427-A 6 / gを添加し同条件で培養を継続 した。 2日後に細胞を PBSで洗浄後、 氷冷した RIPA緩衝液 〔50 トリス ·塩酸緩 衝液、 H 7. 5、 150 mM塩化ナトリウム、 l %Tri ton X- 100、 0. 1 %SDS、 1 %デォ キシコール酸、 Complete™タプレツト (Roche Di agnos t ics社) 、 Phosphatase Inhibi tor Cocktai l-2 (Sigma社） 〕 800 1を添加し 4。Cで 15分間放置した。 この RIPA緩衝液を回収し、 15, 000 rpmで 20分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液と し、 20 1を7. 5 %ァクリルァミドゲルでの303_? 66に供した。 泳動分離したタン パク質は、 常法に従いクリアブロット P膜 （ATT0社） に転写した後、 ブロッキン グ溶液 （トリス緩衝化生理食塩水、 0. 1 % Tween- 20、 5 %スキムミルク） 中に 1 時間室温放置した。 次に実施例 1 1で作製したペプチド抗体 AS- 2480、 AS- 2481ま たは AS- 2482を含む 3種類のゥサギ血清を、 ブロッキング溶液中で各々 100倍に希 釈して加え、 4°Cにてー晚ィンキュベートし、 続いて HRP標識坊ゥサギ IgG抗体 (Amersh am-B i o s c i enc e社） をブロッキング溶液で 10万倍に希釈した 2次抗体溶液 中で 1時間室温放置した。 検出は ECL plus (Amersham-Biosc ience社） の添付プロ トコ一ルに従い行った。
ぺプチド抗体 AS- 2480、 AS-2481または AS- 2482を含む 3種類のゥサギ血清のいず れを用いても、 分子量 150M)近傍の位置に TACT427- Aタンパク質に由来する特異的 なバンドが認められた。 【実施例 1 3】
ぺプチド抗体を用いた免疫沈降
' 実施例 1 1で作製したペプチド抗体を用いて、 TACT427- Aタンパク質に対する 免疫沈降を非変性状態にて行った。
実施例 9で得た p3xFLAG- TACT427- Aを用いて実施例 1 2と同様の操作で調製し た無細胞抽出液 1 mlに、 Protein G-Sepharose 4FF (Amersham-Bioscience社） 懸 濁液 （等容量の RIPA緩衝液で懸濁したもの） 50 1とゥサギ血清 3 1とを加え、 4°Cにて一晩撹拌を行った。 ゥサギ血清としては、 実施例 1 1で作製したぺプチ ド抗体 AS- 2480、 AS- 2481または AS-2482を含む 3種類のゥサギ血清のいずれかを用 いた。 Protein G-Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液にて洗浄後、 1 % 2 -メ ルカプトエタノールを含む SDS-PAGE用サンプルバッファー （Bio Rad社） 50 lに 懸濁し 95°Cで 5分間加熱した後、 1を 7. 5%アクリルアミドゲルでの SDS- PAGE に供した。 検出は実施例 1 2に記載の方法に準じた。 但し一次抗体としてマウス 抗 FLAG M2抗体 （Sigma社） をブロッキング溶液で 10 g/mlとなるよう希釈したも の、 二次抗体として HRP標識抗マウス IgG抗体 （Amersham-Biosc ience社） をプロ ッキング溶液で 5万倍に希釈したものを用いた。 ペプチド抗体 AS- 2480、 AS- 2481 または AS- 2482を含む 3種類のゥサギ血清のいずれを用いて免疫沈降を行った場合 にも、 分子量 150kD近傍に TACT427- Aタンパク質に由来する特異的なバンドが認め られた。
これより、 ペプチド抗体 AS- 2480、 AS- 2481および AS- 2482は、 未変性の TACT427- Aタンパク質と結合することが明らかとなった。
【実施例 1 4】
癌細胞株における TACT427タンパク質の発現検討
直径 10cmのペトリディッシュに播種した肺癌細胞株 A549、 NCI-H226ならびに NCI-H522および乳癌細胞株 ZR- 75- 1を PBSで洗浄後、 実施例 1 2に記載の方法に従 い無細胞抽出液を作製した。 A549、 NCI-H226, NCI-H522および ZR-75- 1の無細胞 抽出液各々 lmlに、 Protein G-Sepharose 4FF (Aiersham- Biosc i ence社） 懸濁液 (等容量の RIPA緩衝液で懸濁したもの） と、 実施例 1 1で作製したぺプチ ド抗体 AS- 2482を 3 g加え、 4°Cにてー晚撹拌を行った。 Protein G-Sepharose 4FF共沈殿画分を RIPA緩衝液にて洗浄後、 1 % 2-メルカプトエタノ一ルを含む SDS-P AGE用サンプルバッファー （Bio Rad社） 1に懸濁し 95 :で 5分間加熱し た後、 20 1を 7. 5 %アクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。 ペプチド抗体 AS-2482を用いて実施例 1 2に記載の方法に準じて検出を行った。
A549、 NCI-H226, NCI-H522および ZR- 75- 1のいずれにおいても、 分子量 150kD近 傍に、 TACT427タンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
これより、 上記タンパク質が上記 5種類の癌細胞株で発現していることが明ら かとなつた。 【実施例 1 5】
TACT427-Aタンパク質の局在性検討 （細胞染色） ，
ヒト胎児腎臓由来 HEK293細胞 lxlO5個を 10%牛胎仔血清 （JRH社） を含むダルべ ッコ改変型イーグル最少培地 （Invi trogen社） に懸濁し、 2ゥエルポリ- D-リジ ンコ一トカルチヤ一スライド （BDファルコン社） に播種した。 同様に 5xl04個の ヒト非小細胞肺癌細胞株 NCI- H460を 10%牛胎仔血清 （JRH社） を含む RPMI1640培 地 （Invitrogen社） に懸濁し 2ゥエルポリ- D-リジンコートカルチヤ一スライド
(BDファルコン社） に播種した。 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで一晩培養した後、 予め FuGene6トランスフエクシヨン試薬 (Roche Diagnostics社） および OPT I -MEM I (Invitrogen社） と混合し室温で 15分間放置しておいた p3xFLAG- TACT427-A 1.33iigを添加し同条件で培養を継続した。 2日後に細胞を PBSで洗浄 後、 10%中性ホルマリン緩衝液を加え室温で 30分間固定した。 その後 PBSで 0.1% に希釈した Triton X- 100を加え室温で 5分放置した後、 再び PBSで洗浄し、 更に 1% BSAを含む PBSを加え 4でで 24時間放置し、 抗体の非特異的結合サイトをプロ ックした。 次に 1% BSAを含む PBSで 10 g/mlとなるよう希釈したマウス抗 FLAG M2抗体 （Sigma社） を加え、 室温で 45分間反応させてから PBSで洗浄し、 続いて 1 % BSAを含む PBSで 10 g/mlとなるよう希釈した Al exa488標識抗マゥス IgG抗体 (Molecular Probes社） を加えた。 再び室温で 45分間反応させてから PBSで洗浄 した後、 蛍光顕微鏡により観察した。
その結果、 TACT427-Aタンパク質は、 HEK293、 NCI- H460のいずれにおいても細 胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
また同様の方法で HEK293細胞に、 pcDNA3.1(+)- TACT427- Aプラスミドを導入し、 10 xg/mlの AS - 2480、 AS-2481および AS- 2482を一次抗体として、 lO g/mlの Alexa488標識抗ゥサギ IgG抗体 （Molecular Probes社） を二次抗体として用いて、 TACT427-Aタンパク質の局在性を調べたところ、 同じく細胞質膜上に発現してい ることが明らかとなった。
【実施例 16】
TACT427-A夕ンパク質の局在性検討 （ピオチン標識）
実施例 12と同様の方法で、 HEK293細胞に p3xFLAG-TACT427_Aプラスミドを導 入し、 48時間後に細胞表層上に露出したタンパク質を Cellular Labeling and Immunoprecipitation Kit (Roche Diagnostics社) を用いてビォチン標識を行つ た。 さらに実施例 12の方法に従い調製した無細胞抽出液 1 mlとマウス抗 FLAG M2抗体 （Sigma社） 3 とを用いて実施例 1 3の方法に従って免疫沈降し SDS - PAGEを行った。 HRP標識したストレプトアビジン 1^ 11&111-8103(^ 61^ 6社） を用 いて検出したところ、 分子量 150kD近傍に TACT427-Aタンパク質に由来するバンド が認められ、 TACT427-A夕ンパク質が細胞質膜上に発現することが明らかとなつ た。
【実施例 1 7】
TACT427タンパク質の局在性検討 （ピオチン標識）
直径 10cmのペトリディッシュに播種したヒト非小細胞肺癌細胞株 A549、 NCI- H226および NCI- H522の細胞表層上に露出しているタンパク質を Cel lular
Label ing and Immunoprecipi tat ion Ki t (Roche Diagnos t ics社) を用いて匕ォ チン標識を行った。 さらに実施例 1 2の方法に従い調製した無細胞抽出液 1 mlと ゥサギペプチド抗体 AS-2482 3 gとを用いて実施例 1 3の方法に従って免疫沈降 し SDS- PAGEを行った。 HRP標識したストレプトアビジン （Amersham- Biosci ence 社） を用いて検出したところ、 A549、 NCI- H226および NCI- H522のいずれにおいて も、 分子量 150kD近傍に TACT427- Aタンパク質、 TACT427-A2タンパク質、 TACT427 - Bタンパク質、 TACT427-B2タンパク質、 TACT427-Cタンパク質および TACT427-C2夕 ンパク質に由来するバンドが認められた。
これより、 TACT427タンパク質が細胞質膜上に発現していることが明らかとな つ 。
【実施例 1 8】
TACT427タンパク質の局在性検討 （FACS解析）
直径 1 Ocmのペトリディッシュに播種しサブコンフルェントにまで培養したヒト 非小細胞肺癌細胞株 A549を PBSで洗浄後、 3% BSAおよび 5mM EDTAを含む PBSを加 え室温で 15分間放置し A549細胞を分散した。 次に緩衝液 A 〔2%牛胎仔血清 （JRH 社） および 0. 1 %アジ化ナトリウムを含む HBSS (Hanks ' Balanced Sal t
Solut ions, Invi tro en社） 〕 で lxlO6個 /mlの濃度になるように A549細胞を懸濁 し、 終濃度 5 // g/mlとなるように AS-2482または非免疫ゥサギ IgG (Jackson社) を 加え、 氷上に 5時間放置した。 続いて緩衝液 Aで細胞を洗浄した後、 lO g/mlの Alexa488標識抗ゥサギ IgG抗体 (Molecular Probes社） を含む緩衝液 Aで懸濁し、 氷上にて 1.5時間放置した。 緩衝液 Aで再び洗浄後、 FACScan (BDバイオサイェン ス社） にて解析した。 その結果、 ゥサギペプチド抗体 AS- 2482特異的に A549細胞 が染色され、 TACT427- Aタンパク質、 TACT427-A2タンパク質、 TACT427- Bタンパク 質、 TACT427-B2タンパク質、 TACT427-Cタンパク質および TACT427-C2タンパク質 が細胞質膜上に発現していることが明らかとなった。
【実施例 19】
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株 A549およ び NCI- H226のアポトーシス誘導
実施例 2に記載の NCI- H460以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセ ンスオリゴヌクレオチド導入によりアポト一シスが誘発されるか否かを検討した。 ヒト非小細胞肺癌細胞株 A549および NCI- H226 (いずれも ATCCより購入） を、 そ れぞれ Kaighn's改変 F- 12 Nutrient Mixture (Invitrogen社) および 25mM HEPES 含有 RPMI-1640培地 （Invi trogen社） に牛胎仔血清 （JRH社） を 10%加えた培地で 懸濁し、 1ゥエル当たり 1X104個の細胞密度で 96穴平底組織培養プレート （BDフ アルコン社） に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、 オリゴ ヌクレオチドを導入した。
以下に述べる実施例 1 9、 20および 21で用いたセンスオリゴヌクレオチド (配列番号： 44) は、 実施例 2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド （配 列番号： 13) に相補的な配列を有するように設計し、 phosphorothioate化した 後、 HPLC精製して用いた （以下、 センスオリゴヌクレオチドと略する） 。
具体的には、 A549細胞の場合には、 実施例 2で得られたアンチセンスオリゴヌ クレオチド （配列番号： 13) 、 コントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) 、 およびセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 44) 、 それぞれ 0.05 gをリポフエクトァミン 2000 (Invitrogen社） 0.8 1と共に、 0PTI- MEM I
(Invitrogen社） 50^1と混合し、 室温で 20分間放置した。 予め 0PTI-MEM I (Invitrogen社） 50^ 1に培地交換しておいた A549細胞に該'混合液中を全量添加 し、 更に 3時間培養を継続した後、 10%牛胎仔血清 （JRH社） を含む Kaighn's改変 F-12 Nutrient Mixture (Invi trogen社） 100 1に培地交換した。
NCI- H226細胞の場合では、 アンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3) 、 コントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) 、 およびセンスオリ ゴヌクレオチド （配列番号： 44) のそれぞれ 0.13 gを、 ォリゴフェクトアミ ン （Invi trogen社） 0.8 1と共に、 OPTI- MEM I (Invi trogen社） 50 1と混合し、 室温で 20分間放置した。 予め OPTI- MEM I (Invitrogen社） 50^1に培地交換して おいた NCI- H226細胞に該混合液を全量添加し、 更に 3時間培養を継続した後、 30%牛胎仔血清 （IRH社） を含む 25iiiM HEPES含有 RPMI-1640培地 （Invitrogen社） 50j lを添加した。
オリゴヌクレオチドを導入して更に 2日間培養した後、 Cell Death Detection ELISAPLUS(Roche Diagnostics社）の添付プロトコールに従い、 上記オリゴヌクレ ォチドのアポト一シス誘導活性を測定した。
その結果、 両細胞株においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象とし ベ、 それぞれ 1.65倍および 3.03倍のアポトーシス誘導活性を示し、 統計学的に有 意な差 （Ρ≤0·01) を示した。
【実施例 20】
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株 Α549およ び NCI-H226における FLJ20539遺伝子 (配列番号： 2) 、 hCP50177遺伝子 （配列番 号： 5) 、 hCP1762319遺伝子 （配列番号： 8) ならびに FLJ13515遺伝子 （配列番 号： 1 1) 、 および TACT427遺伝子の mRNA発現量低下
実施例 3に記載の NCI-H460以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセ ンスオリゴヌクレオチド投与により、 上記遺伝子の mRNA発現量が低下するか否か 調べた。
ヒト非小細胞肺癌細胞株 A549および NCI- H226をそれぞれ実施例 19と同じ培地 に懸濁し、 1ゥエル当たり A549細胞株では 7.5X104個、 NCI- H226細胞株では
5 X104個の細胞密度で 24穴平底組織培養プレート (BDファルコン社) に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、 オリゴヌクレオチドを ェクシヨンした。
具体的に、 A549細胞株では、 アンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3) 、 コントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) 、 およびセンスオリ ゴヌクレオチド （配列番号： 44) のそれぞれ 0.84 をリポフエクトァミン 2000 (Invitrogen社） 3.2 1と共に、 Opt i -MEM I (Invi trogen社） 200 1と混 合し、 室温で 20分間放置した。 予め OPTI-MEM I (Invi trogen社） 200 1に培地 交換しておいた A549細胞に該混合液を全量添加し、 更に 3時間培養を継続した後、 10%牛胎仔血清 （JRH社） を含む Kaighn s改変 F-12 Nutrient Mixture
(Invi trogen社） 500 1に培地交換した。
NCI- H226細胞の場合では、 アンチセンスオリゴヌクレオチド (配列番号： 1
3) 、 コントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) 、 およびセンスオリ ゴヌクレオチド （配列番号： 44) のそれぞれ 0.13 gを、 ォリゴフェクトアミ ン （Invitrogen社） 2 1と共に Opt i- MEM I (Invi trogen社） 125 1と混合し、 室温で 20分間放置した。 予め 0PTI- MEM I (Invi trogen社） 125^ 1に培地交換して おいた NCI- H226細胞に該混合液を全量添加し、 更に 4時間培養を継続した後、
30%牛胎仔血清 （JRH社） を含む 25mM HEPES含有 RPMI- 1640培地 （Invitrogen社） 125 1を加えた。
オリゴヌクレオチドをトランスフエクシヨンし、 更に 16時間培養を継続した後 に、 RNeasy Mini Total RNA Kit (QIAGEN社) を用いて A549細胞および NCI- H226 細胞から！ タル RNAを抽出した。 TaqMan™ Reverse Transcription Reagents
(Applied Biosystems社） の添付プロトコールに従い、 ランダムプライマーを用 いた逆転写反応によってトータル RNAから cDNAを調製した。 ト一タル RNA 5 ngか ら調製した cDNAを铸型とし、 実施例 6と同様の方法により FLJ20539遺伝子 （配列 番号： 2) 、 hCP50177遺伝子 （配列番号： 5) 、 hCP1762319遺伝子 （配列番号： 8) ならびに FLJ13515遺伝子 （配列番号： 1 1) 、 および TACT427遺伝子の発現 量を測定した。 同量の铸型 cDNA中に含まれる) 3-ァクチン遺伝子発現量を
TaqMan™ jS-actin Control Reagents (Applied Biosystems社) を用いて測定し 内部標準とした。
0 -ァクチン遺伝子発現量に対する上記遺伝子の相対的発現量比率 ( ) は、 陰性対照として用いたコントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) また はセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 44) を導入した場合に比べて、 アン チセンスオリゴヌクレオチド (配列番号： 1 3) を導入した場合に顕著に低下し ており、 統計学的に有意 （P≤0.01) な発現量低下が認められた （表 7) 。
この結果より、 ヒト非小細胞肺癌細胞株 A549および NCI- H226においても、 FU20539遺伝子 （配列番号： 2) 、 hCP50177遺伝子 （配列番号： 5) 、
hCP1762319遺伝子 （配列番号： 8) ならびに FU13515遺伝子 （配列番号： 1 1) 、 および TACT427遺伝子の mRM発現量低下により、 アポ卜一シスが誘発されたこと が示された。
〔表 7〕
Figure imgf000104_0001
【実施例 21】
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入による A549および NCI- H226における TACT427タンパク質の発現量低下
ヒト非小細胞肺癌細胞株 A549および NCI- H226をそれぞれ実施例 19と同じ培地 に懸濁し、 A549細胞株では 2.25X106個、 NCI-H226細胞株では 1.45X 106個の細胞 を直径 10cmのペトリディッシュ （BDファルコン社） に播種した。 5%炭酸ガス気 流中、 37°Cで一晩培養した後、 オリゴヌクレオチドをトランスフエクシヨンした。 具体的には、 A549細胞株では、 アンチセンスオリゴヌクレオチド (配列番号： 1 3) 、 コント口一ルオリゴヌクレオチド （配列番号： 14) およびセンスオリ ゴヌクレオチド （配列番号： 44) のそれぞれ 5.8 gを、 リポフエクトァミン 2000 (Invitrogen社) 96 1と共に、 Opti-MEM I (Invitrogen社） 6 mlと混合し、 室温で 20分間放置した。 予め 0ΡΠ-ΜΕΜ I (Invi trogen社） 6 mlに培地交換してお いた A549細胞に該混合液を全量添加し、 更に 3時間培養を継続した後、 10%牛胎 仔血清 (JRH社) を含む Kaighn' s改変 F - 12 Nutr ient Mixture (Invi trogen社） 15 mlに培地交換した。
NCI- H226細胞株では、 アンチセンスオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 3 ) 、 コントロールオリゴヌクレオチド （配列番号： 1 4 ) およびセンスオリゴヌクレ ォチド （配列番号： 4 4) のそれぞれ 9. 7 gを、 オリゴフエクトァミン
(Invi trogen社） 60 1と共に Opt i- MEM I (Invi trogen社） 3. 75 mlと混合し、 室温で 20分間放置した。 予め OTTI-MEM I (Invi trogen社） 3. 75 mlに培地交換し ておいた NCI-H226細胞に該混合液を全量添加し、 更に 4時間培養を継続した後、 30%牛胎仔血清 （JRH社） を含む 25mM HEPES含有 RMI- 1640培地 （Invi trogen社） 3. 75 mlを加えた。
トランスフエクシヨン後、 更に 24時間、 48時間、 72時間培養を継続した後に、 実施例 1 2の方法に従い無細胞抽出液を調製した。 得られた無細胞抽出液のタン パク質濃度を BCA Protein Assay Ki t (Pi erce社） にて測定し、 各無細胞抽出液 中のタンパク質濃度をそろえた。 A549細胞株の無細胞抽出液 100 z g、 および NCI - H226細胞株の無細胞抽出液 140 gを、 実施例 1 2の方法に準じて SDS-PAGEおよび ウェスタンプロッティングをそれぞれ行った。 一次抗体として実施例 1 1で作製 した AS-2482を 3 g/mlの濃度で、 二次抗体として HRP標識抗ゥサギ IgG抗体
11^ 31^111-8103(^ 61^6社） を用いた。 検出は Super Signal™ Wes t Femto
Maximum Sens i t ivi ty Subs trate (Pierce社） を用いて添付のマニュアルに従つ た。
その結果、 両細胞株ともァンチセンスオリゴヌクレオチドを導入した場合にの み、 TACT427タンパク質がほぼ消失しているのが確認され、 かつ、 該タンパク質 の消失は 24時間で認められた。 また、 同時にサイトケラチン 8タンパク質の発現 量を抗ヒトサイトケラチン 8抗体 （Oncogene社） を用いたウエスタンプロッティ ング法で調べたが、 いずれのオリゴヌクレオチド処理でも発現量減少は認められ なかった。 これより、 TACT427タンパク質発現量の特異的低下により、 ヒト肺癌 細胞株のァポト一シスが誘発されたことが示された。 【実施例 22】
組換え型完全長タンパク質の安定発現細胞株の樹立
TACT427-Aタンパク質 （配列番号： 1 5) の C末端に 3xFLAGタグを融合した夕 ンパク質を構成的に発現する細胞株の樹立をマウス胎仔由来線維芽細胞株
Balb3T3-A31 (以後、 A31細胞と略記する) を用いて行った。 A31細胞 1.25xl05個 を 10%牛胎仔血清 （JRH社） および 50 g/ml ゲンタマイシン （Invi trogen社） を含むダルベッコ改変型イーグル最少培地 （Invitrogen社） 2.5 mlに懸濁し、 6 穴プレートの 1ゥエルに播種した後、 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで一晩培養した。 さらに同じ培地 2.5 mlに培地交換し 4時間培養を継続した後、 予め FuGENE6トラン スフエクシヨン試薬 3.8/i 1 (Roche Diagnostics社） および OPTI-MEM I
(Invitrogen社） 93.3 1と混合し室温で 15分間放置しておいたプラスミド p3xFLAG-TACT427-A 1.25 zgを添加し培養を継続した。 翌日にトリプシン · EDTA (Invitrogen社） を用いて細胞を回収し、 0.5 mg/mlの G418 (Promega社) を含む 上記培地 （G418選択培地） 10 mlに懸濁し、 直径 10 cmのペトリディッシュに播種 した。 G418選択培地で培養を継続し 2回継代培養した後、 1ゥエルあたり細胞 100 個 （培地容量 0.1 ml) の割合から始まる 2倍希釈系列を 12系列作成し 96穴プレー トにそれぞれ播種し、 3日ごとに G418選択培地を交換しながら培養を継続した。 ゥエルあたり 0.8個〜 3.2個の細胞が増殖しコロニーを形成したゥエルから 11日後 に細胞を回収し、 24穴プレートの 2ゥエルに等しく播種した。 G418選択培地でコ ンフルェントになるまで培養を轔続した後、 1ゥエル分の細胞をスクレイパ一で 回収し、 1% 1% 2-メルカプトエタノールを含む SDS-PAGE用サンプルバッファ一 (Bio Rad社） 40 1に懸濁した。 95°Cで 5分間加熱処理した後、 12 1を 10%ァク リルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した。 実施例 13で記載した方法に準じ、 マウ ス抗 FLAG M2抗体 （Sigma社、 1000倍希釈) を用いてウエスタンブロッテイングを 行い、 TACT427- Aタンパク質 （配列番号： 1 5) の C末端に 3xFLAGタグが付加した タンパク質を構成的に発現する細胞株 TACT- 1を得た。
【実施例 23】 TACT- 1のアポ卜一シス耐性能の評価
実施例 22で得られた TACT- 1およびその親株 A31細胞を 10%牛胎仔血清 （JRH 社） および 50 g/mlゲンタマイシン （Invitrogen社） を含むダルベッコ改変型ィ —ダル最少培地 (Invitrogen社) 0.1 mlに懸濁し 1ゥエルあたり 6xl03個になるよ うそれぞれ組織培養用 96穴プレートに播種した。 5%炭酸ガス気流下、 37°Cで」 晚培養した後、 トポイソメラーゼ I阻害剤カンプトテシン （Wako Pure Chemical 社） あるいはタンパク質合成阻害剤ァニソマイシン （Wako Pure Chemical社） を 種々の濃度になるよう添加した上記培地に交換し培養を継続した。 24時間後に Cell Death Detection ELISA (Roche Diagnostics社） を用いてアポ 1 シ スを検出した。 終濃度 1 g/mlのカンプトテシン添加により TACT- 1に誘発された アポ! ^一シスは、 同じ条件で A31に認められたアポ] ^一シスの 56 %にとどまった また終濃度 1 g/mlのァニソマイシン添加により TACT- 1に誘発されたアポト一シ スは、 同じ条件で A31に認められたアポト一シスの 69%にとどまった。 以上の結 果は、 カンプトテシンやァニソマイシンによって誘発されるアポト一シスに対し、 TACT-1細胞が耐性になっていることを示しており、 TACT427- A強制発現によりァ ポト一シス耐性能を獲得することが明らかとなった。
【実施例 24】
TACT- 1における ERK1/2リン酸化増強
実施例 23で記載した TACT- 1細胞株のアポト一シス耐性現象のメカニズムを調 ベる一環として、 抗アポト一シス作用に関与する MAPキナーゼ、 即ち ERK1/2タン パク質のリン酸化を A31細胞株と比較した。 A31細胞には 10%牛胎仔血清 （JRH 社） および 50 g/ml ゲンタマイシン （Invitrogen社） を含むダルベッコ改変型 イーグル最少培地（Invitrogen社）を用い、 TACT- 1細胞には同培地に更に 0.6 mg/ml G418 (Promega社) を添加したものを用いて、 直径 10 cmのペトリディッシ ュ（BD ファルコン社）で 5%炭酸ガス気流中、 37Cで培養した。 細胞密度が約 80% コンフルェントになった時点で、 1 g/ml ァニソマイシン （Wako Pure Chemical 社） を含む上記培地に交換し、 37°Cで 1時間、 4時間および 8時間培養を続けた。 ァニソマイシン処理前の細朐も含めて、 これらそれぞれの細胞を氷冷した PBS(Ca、 Mg不含） 10 mlで 2回洗浄し、 0.5 mlの細胞溶解用緩衝液 〔1% Triton X- 100、 1% デォキシコール酸、 0.05% SDS、 5.25mM EGTA, EDTA不含 Complete™タブレツ ト (Roche Diagnostics社) 、 Phosphatase inhibitor cocktail-2 (Sigma社) 、 150mM塩化ナトリゥムを含む 5(M1 トリス ·塩酸緩衝液、' H7.5〕 を加えて 4°Cで 20分間放置した。 スクレイパーを用いて細胞破碎液を回収し、 4°C、 15000回転で 20分間遠心分離して沈殿物を除去した。 この細胞破碎液 80 lに 10% 2 -メルカプ トエタノールを含む 5倍濃縮 SDS- PAGE用サンプルバッファ一 （Bio Rad社） を 20 1加え、 95°Cで 5分間加熱した。 なお、 5 l細胞破碎液を蒸留水で 10倍希釈し、 Micro BCA protein assay reagent (Pierce社）の処方に準じてタンパク質濃度を 測定し、 1% 2-メルカプトエタノールを含む SDS-PAGE用サンプルバッファ一 (Bio Rad社） で適宜希釈してタンパク質濃度を揃えた。 総タンパク質 M/igを 7.5% ポリアクリルアミドゲルでの SDS- PAGEに供した後、 PVDF膜に転写した。 転 写した膜は 5%スキムミルクを含む TTBS (0.1% Tween 20を含む TBS) で室温、 1 時間ブロッキングした後、 10分間の TTBS洗浄を 2回行った。 その後、 抗 ERK1/2抗 体 (Cell signaling社) または抗リン酸化 ERK1/2抗体 (Cell signaling社） を 5% BSA (Sigma社） を含む TTBSでそれぞれ 5000倍または 1000倍に希釈した一次抗 体液を用いて 4°Cでー晚反応させた後、 10分間の TTBS洗浄を 4回行った。 次に、 5% スキムミルクを含む TTBSで 10000倍に希釈した HRP標識抗ゥサギ IgG抗体 (Amersham Bioscience社）を添加し室温で 1時間保温した後、 10分間の TTBS洗浄を 4回行った。 ECL plus試薬 (Amersham Bioscience社） を用いて ERK1/2タンパク質 およびリン酸化 ERK1/2タンパク質に相当するバンドを検出した結果、 TACT- 1細胞 株では A31細胞株と比べ、 ァニソマイシン添加で誘導される ERK1/2タンパク質の . リン酸化、 即ち活性化が増強されていた。 TACT- 1細胞における ERK1/2活性化亢進 程度を求めるため、 現像したフィルムをルミノイメージアナライザー LAS - lOOOplus (FUJIFILM社） で画像として読み取り、 付属のイメージゲージソフトゥ エアを用いてリン酸化 ERK1とリン酸化 ERK2のバンド強度をそれぞれ数値化した。 ァニソマイシン処理時間 （2時間、 4時間および 8時間） 毎に、 A31細胞のバンド強 度を 100 %として TACT- 1細胞のリン酸化亢進率を算出したところ、 TACT - 1細胞に おける ERK1のリン酸化亢進率は 164%、 150%および 158%、 ERK2のリン酸化亢進 率は 130%、 137%および 172%であった。
この結果から、 TACT-1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムの一つが ERK1/ の活性化増強作用であることが明らかとなった。 【実施例 25】
TACT- 1における P38MAPKリン酸化促進 '
実施例 23で記載した TACT- 1細胞株のアポトーシス耐性現象のメカニズムを調 ベる一環として、 P38MAPKのリン酸化を A31細胞株と比較した。
8xl05個の A31細胞または TACT- 1細胞を、 10%牛胎仔血清 （JRH社） および 50 g/ml ゲンタマイシン （Invitrogen社） を含むダルベッコ改変型イーグル最少培 地 （Invitrogen社） 5 mlに懸濁し、 直径 6 cmのペトリディッシュ（BD ファルコン 社)に播種した。 5%炭酸ガス気流中、 37°Cで一晩培養した後、 終濃度 g/mlと なるようァニソマイシン （Wako Pure Chemical社） を添加し直ちに培養を継続し た。 ァニソマイシン添加前あるいは添加後 15分、 30分および 60分後の細胞を 1 mM オルトバナジン（V)酸ナトリウム （Wako Pure Chemical社） を含む PBS 5 mlで 1回 洗浄した後、 実施例 12に記載の RIPA緩衝液に Phosphatase Inhibitor
Cocktail-1を加えた細胞溶解用緩衝液を 0.2 ml添加し 4°Cで 15分間放置した。 ス クレイパーで細胞破碎液を回収し 4°C、 15000回転で 5分間遠心分離して沈殿物を 除去した。 この細胞破碎液 80 lに 5% 2 -メルカプトエタノールを含む 5倍濃縮 SDS- PAGE用サンプルバッファ一 （Bio Rad社） を 20 1加え、 95°Cで 5分間加熱し た。 なお、 上記細胞溶解用緩衝液を蒸留水で 20倍に希釈した溶液で細胞破碎液 15 lを 20倍希釈し、 Micro BCA protein assay reagent (Pierce社）の処方に準じ てタンパク質濃度を測定し、 タンパク質濃度がほぼ揃っていることを確認した。 総タンパク質約 14 gを 5%— 20% ポリアクリルアミドグラジェントゲルでの SDS-PAGEに供した後、 PVDF膜に転写した。 転写した膜は 5%スキムミルクを含む TTBS (0.1% Tween 20を含む TBS) で室温、 1時間ブロッキングした後、 5分間の TTBS洗浄を 3回行った。 その後、 抗 P38MAPK抗体 (Cell signaling社） または抗リ ン酸化 P38MAPK抗体 (Cell signaling社） を 5% BSA (Sigma社） を含む TTBSで 1000倍に希釈した一次抗体液を用いて 4°Cで一晩反応させた。 続いて、 5分間の TTBS洗浄を 3回行った後に、 5 %スキムミルクを含む TTBSで 5000倍に希釈した HRP 標識抗ゥサギ IgG抗体 (Amersham Bi osc i ence社）を添加し室温で 1時間保温した。 再び、 5分間の TTBS洗浄を 3回行い、 過剰量の抗体を取り去った後に、 ECL plus試 薬 （Amersham Bi osc i ence社） を用いて p38MAMタンパク質およびリン酸化
P38MAPKタンパク質に相当するバンドを検出した。 A31細胞では P38MAPKタンパク 質のリン酸化はァニソマイシン添加後 30分でようやく微かに認められたのに対し、 TACT- 1細胞ではァニソマイシン添加後 15分で明らかに強く認められ、 P38MAPK夕 ンパク質のリン酸化、 即ち活性化が速やかに誘導されることが判明した。
この結果から、 TACT- 1細胞株のアポ卜一シス耐性現象のメカニズムの一端を P38MAPKの活性化増強作用が担つていることが示唆された。 産業上の利用可能性
本発明で用いられるタンパク質は、 癌細胞に特異的に発現し、 癌の診断マーカ 一であり、 したがって、 該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 該 タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 大腸癌、 乳 癌、 肺癌、 前立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣癌、 甲状腺癌、 塍臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防 -治 療剤として安全に使用することができる。 好ましくは、 乳癌、 肺癌などの予防' 治療剤である。 さらに、 該タンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩、 該 タンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、 例えば、 癌細胞のァ ポトーシス促進剤として安全に使用することもできる。
また、 本発明のアンチセンスポリヌクレオチドや抗体は、 本発明で用いられる タンパク質の発現や活性を阻害することができ、 例えば大腸癌、 乳癌、 肺癌、 前 立腺癌、 食道癌、 胃癌、 肝臓癌、 胆道癌、 脾臓癌、 腎癌、 膀胱癌、 子宮癌、 精巣 癌、 甲状腺癌、 滕臓癌、 脳腫瘍または血液腫瘍などの癌の予防。治療剤、 好まし くは、 乳癌、 肺癌などの予防 ·治療剤として、 あるいは癌細胞のアポト一シス促 進剤として安全に使用することができる。

Claims

請求 の 範 囲
1. 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番 号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質ま たはその塩。
2. 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配 列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質 またはその塩。
3. 請求項 1記載の夕ンパク質の部分べプチドまたはその塩。
4. 請求項 1記載のタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌク レオチドを含有するポリヌクレオチド。
5. DNAである請求項 4記載のポリヌクレオチド。
6. 配列番号： 5、 配列番号： 8、 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番 号： 21、 配列番号： 23、 配列番号： 26または配列番号： 28で表される塩 基配列を含有する請求項 5記載のポリヌクレオチド。
7. 配列番号： 16、 配列番号： 18、 配列番号： 21、 配列番号： 23、 配 列番号： 26または配列番号： 28で表される塩基配列からなるポリヌクレオチ ド。
8. 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えべクター。
9. 請求項 8記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
10. 請求項 9記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質または その部分ペプチドを生成 ·蓄積せしめることを特徴とする請求項 1記載のタンパ ク質またはその部分ペプチドまたはその塩の製造法。
11. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含 有してなる医薬。
12. 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
13. 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
14. 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対 する抗体。
1 5 . 請求項 1 4記載の抗体を含有してなる医薬。
1 6 . 請求項 1 4記載の抗体を含有してなる診断薬。
1 7 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基 配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
1 8 . 請求項 1 7記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
1 9 . 請求項 1 4記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のタンパ ' ク質の定量方法。
2 0 . 請求項 1 9記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項 1記載の夕 ンパク質の機能が関連する疾患の診断方法。
2 1 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用 いることを特徴とする、 請求項 1記載の夕ンパク質の活性を阻害する化合物また はその塩のスクリーニング方法。
2 2 . 請求項 1記載のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含 有してなる、 請求項 1記載のタンパク質の活性を阻害する化合物またはその塩の スクリーニング用キット。
2 3 . 請求項 2 1記載のスクリーニング方法または請求項 2 2記載のスクリー ニング用キットを用いて得られる、 請求項 1記載のタンパク質の活性を阻害する 化合物またはその塩。
2 4. 請求項 4記載のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする、 請求項 1 記載のタンパク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング 方法。
2 5 . 請求項 4記載のポリヌクレオチドを含有してなる、 請求項 1記載のタン パク質遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
2 6 . 請求項 2 4記載のスクリーニング方法または請求項 2 5記載のスクリー ニング用キットを用いて得られる、 請求項 1記載のタンパク質遺伝子の発現を阻 害する化合物またはその塩。
2 7 . 請求項 2 3または請求項 2 6記載の化合物またはその塩を含有してなる
28. 配列番号： 1または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩 基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
29. 請求項 28記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
30. 請求項 28記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
31. 配列番号： 1または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド またはその塩に対する抗体。
32. 請求項 31記載の抗体を含有してなる医薬。
33. 請求項 31記載の抗体を含有してなる診断薬。 '
34. 配列番号： 1または配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチド をコ一ドするポリヌクレオチドを含有してなる診断薬。
35. 癌の予防 ·治療剤である請求項 1 1、 請求項 12、 請求項 15、 請求項 18、 請求項 27、 請求項 29または請求項 32記載の医薬。
36. 癌の診断薬である請求項 13、 請求項 16、 請求項 30、 請求項 33ま たは請求項 34記載の診断薬。
37. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性 を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
38. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝 子の発現を阻害する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防 ·治療剤。
39. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用い ることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリ一ニング方法。
40. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有 することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キット。
41. 請求項 39記載のスクリーニング方法または請求項 40記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤。
42. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドを用いることを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング方法。
43. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコ一ドするポリヌク レオチドを含有することを特徴とする癌の予防 ·治療剤のスクリーニング用キッ 卜。
44. 請求項 42記載のスクリーニング方法または請求項 43記載のスクリー ニング用キットを用いて得られうる癌の予防 ·治療剤。
45. アポトーシス促進剤である請求項 1 1、 請求項 12、 請求項 15、 請求 項 18、 請求項 27、 請求項 29または請求項 32記載の医薬。
46. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用い ることを特徴とするアポトーシス促進剤のスクリーニング方法。
47. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分べプチドをコードするポリヌク レオチドを用いることを特徴とするアポ卜一シス促進剤のスクリーニング方法。
48. 哺乳動物に対して、 （i) 請求項 14もしくは請求項 31記載の抗体、 (ii) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性 を阻害する化合物またはその塩、 または （iii) 該タンパク質の遺伝子の発現を 阻害する化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする癌の予防 ·治 療方法。
49. 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番号： 10、 配列番 号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25 または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性 を阻害する、 または該タンパク質の遺伝子の発現を阻害することを特徴とする癌 の予防 ·治療方法。
50. 癌の予防 ·治療剤を製造するための、 （i) 請求項 14もしくは請求項 31記載の抗体、 (ii) 配列番号： 1、 配列番号： 4、 配列番号： 7、 配列番 号： 10、 配列番号： 15、 配列番号： 17、 配列番号： 20、 配列番号： 22、 配列番号： 25または配列番号： 27で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 または （iii) 該タンパク質の 遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩の使用。
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