WO2004011644A1

WO2004011644A1 - 体細胞相同組換えの促進方法及び特異的抗体の作製方法

Info

Publication number: WO2004011644A1
Application number: PCT/JP2003/009563
Authority: WO
Inventors: Kunihiro Ohta; Hidetaka Seo; Takehiko Shibata
Original assignee: Riken; Japan Science And Technology Agency
Priority date: 2002-07-30
Filing date: 2003-07-28
Publication date: 2004-02-05
Also published as: US20110070650A1; US8187884B2; JP4214234B2; CN1671842A; EP1536004A1; US20060183225A1; EP1536004B1; JPWO2004011644A1; EP1536004A4; CN100379862C; ATE490314T1; DE60335191D1; US7776599B2

Abstract

本発明は、免疫細胞中の抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを著しく促進させ、その結果、抗体の多様性を獲得するための新規方法を提供する。抗体遺伝子座においてＤＮＡ相同組換えが起きている免疫細胞（例えば、ＤＴ４０細胞等）をヒストンアセチル化酵素阻害剤等（例えば、トリコスタチンＡなど）と接触等させることにより、当該抗体遺伝子座におけるクロマチン構造を弛緩させることで、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを促進し、多様な抗体分子の作製を可能にする。体細胞相同組換えの促進により抗体分子が多様化された細胞集団から、適切な選別方法（例えば、抗原でコートしたビーズ等）を用いて抗原に対して特異的に結合する抗体の作製を可能にする。

Description

明細書体細胞相同組換えの促進方法及び特異的抗体の作製方法技術分野

本発明は、一般には体細胞相同組換えを促進する技術に係り、より詳細には体細胞中の遺伝子座における体細胞相同組換えを促進する方法及びかかる方法によって体細胞相同組換えが促進された免疫細胞に関する。

また、本発明は、前記の体細胞相同組換えの促進方法を利用して多様な抗体分子を作製する方法並びにかかる方法によって作成された多様な抗体にも関する。

さらに、本発明は体細胞相同組換えを促進するために使用して好適な薬剤にも関する。背景技術

従来、体細胞相同組換えは、遺伝子の多様性を産み出す要因の一つであると考えられている。例えば、ニヮトリ由来の B細胞培養株では、抗体遺伝子座において DNA組換えが起きていることが知られている（Buerstedde et al. EMBO J. (1990) 9:921-927) 。このような D A組換えを利用して種々のタンパク質因子を人工的に創り出すことが考えられるが、実際にはその組換え頻度は非常に低く、そのままではタンパク質因子の創製に利用することは困難であった。

また、抗体を作製する場合、通常ゥサギやマ.ウスなどの動物を利用するのが一般的であり、さらに多様な抗体を獲得することが望まれる場合には、多数の動物個体に対して抗原を免疫しなければならなかった。また、得られる抗体の力価も動物の個体差、抗原の性質に依存していたため、多様で高力価の抗体を安定して得ることは困難であった。

そこで、前記ニヮトリ由来の B細胞株等において生じている DN A相同組換えを利用して抗体を獲得することが考えられ、原理的にはこの手法により多様な抗体の合成が可能となると考えられる。しかし、上述の様に、 DNA相同組換え頻度が極めて低いため、特定の抗原に対する抗体を培養細胞により人工的に作製することは現実的には極めて困難であると考えられていた。

一方、近年、 XRCC2及び XRCC3 のノヅクアウト DT40細胞株 (ニヮトリ由来の B細胞株）において、体細胞突然変異の頻度が増加するという報告がなされている（Sale et al. Nature (2001) 41 2:921-926) 。このような体細胞突然変異を利用することも想定され、実際、 Ramos細胞や XRCC 2や XRCC3 のノックアウト DT4 0細胞を用いることで抗体の抗原に対する結合を上昇させる試みがなされている。しかしながら、このような方法で得られた抗体に特異性はなく、様々なタンパク質に対して結合してしまう（Cumbers et al.,Nat. B i o t e ch n o 1. ( 2002 ) 20 ( 11 ) : 1129 - 1134 ) ₀ 体細胞突然変異は生体内においては親和性の成熟（affinity maturatio n) の為に二次的に利用されるものであることから、抗体の特異性を大規模に変えることは困難であると思われる。発明の開示

本発明者らは、上記事情に鑑みて、所望の体細胞相同組換えを制御された状況下で誘起促進させる方法がないかについて鋭意研究した結果、意外にも、免疫細胞の染色体のクロマチン構造を弛緩させることで、体細胞相同組換えの頻度を大幅に高めることが可能になることを見出した。

よって、本発明は、一般には、体細胞中の遺伝子座における体細胞相同組換えを促進する方法を提供することを目的とする。

また、本発明は上記方法によつて体細胞相同組換えが促進された免疫細胞を提供することを目的とする。

さらに、本発明は、免疫細胞において生じている体細胞相同組換えを利用して多様な抗体を獲得することを可能にする抗体作製方法を提供することを目的とする。

またさらに、本発明は上記抗体作製方法により作製された多様な抗体を提供することを目的とする。

加えて、本発明は体細胞相同組換えを促進するために使用して好適な薬剤を提供することを目的とする。

しかして、本発明においては、遺伝子座において D N A相同組換えが起きている体細胞の相同組換えを、該体細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって促進することを特徴とする体細胞相同組換えの促進方法が提供される。また、かかる方法によって体細胞相同組換えが促進された免疫細胞も提供される。

また、本発明においては、抗体遺伝子座において D N A相同組換えが起きている免疫細胞から抗体を作製するに当たり、該免疫細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって、抗体遺伝子座における D NA相同組換えを促進させ、それによつて多様な抗体を獲得することを特徴とする抗体作製方法が提供される。また、かかる方法によって作成された多様な抗体も提供される。

抗体遺伝子の多様性の獲得という観点では、相同組換えは、突然変異よりも高効率であることが知られており、 XRCC2/ XRCC3 の変異株（Sale et al.， Nature (2001) 412:921-926) と比べると、より容易に抗体の高い多様性を獲得し得ると考えられる。抗体遺伝子座における体細胞相同組換えが促進された細胞であって、目的の抗体を産生する細胞が得られれば、当該細胞を培養し、維持していくことで、目的の抗体をいつでも簡便に調製することが可能となる従って、将来的には実験動物を使わずに、あらゆる抗原に対して高力価な抗体を作製する技術の確立が期待でき、病気等の治療に役立つ抗体等を高力価で継続的に提供することが可能となる。また、動物愛護の観点からも利用価値があると思われる。

本発明は、従来技術の動物を使った抗体作製に比べ、はるかに少ない量（ l 〃 g以下。動物には通常 m g レベルを免疫する）の抗原で抗体を作製することができ、作製時間の大幅な短縮も可能である (最短で 1週間。動物ではポリクローン抗体で数週間、モノクロ一ン抗体で数ケ月を要する）。さらに、作製期間の短縮による人件費の圧縮から、モノクローナル抗体におけるハイプリドーマ作製に要するコストを大幅に下げることも可能である。また、培養細胞を用いた系であるため、個体レベルで有害な因子であっても、細胞レべルで無害であるならば、抗原として使用し得る点に利点を有する。また、試験管内で抗体を作製する手法として、従来はファージデイスプレイ法などが知られているが、これらの手法は、抗体軽鎖、重鎖の可変領域遺伝子をリンカ一でつなぎ、一本鎖にしたものをファ一ジミドに組み込んだライブラリ一を用いる。本来の抗体とは、可変領域以外、極めて異なる構造を有するものであるため、実際に抗体にするためには、選別したファ一ジから遺伝子を再クローニングし、抗体の定常領域とつなげる必要がある。一方、本発明に係る方法によると、すでに I g Mの形になっていることから、すぐに抗体分子の形態で使用可能な状態にある。その後の操作は周知の方法に従うことが可能であり、例えば、既存の二次抗体などを利用することで単離、精製等を行うことができる。

さらに、通常の i n v i t r o (ファージディスプレイ法など）の手法は初期の段階で作製したライブラリ一の質（例えば、クローン数など）が重要であり、ライブラリー作製に多大な手間がかかる。このことに加えライブラリ一は一般に、繰り返し使用すると性能が低下することから、その維持も容易ではない。

本発明に係る方法によれば、単純な培養操作でライブラリーの作製が可能であり、作製されたライブラリー自体が自ら多様化していくことから、通常の培養細胞として維持管理する事ができる。またファージディスプレイ法では数回のスクリーニングが必要となる場合も多いが、本発明に係る方法によれば、 1回のスクリーニングで特異的抗体を得ることができ、容易かつ迅速に、特異的抗体を得ることができる。

本発明において使用できる免疫細胞としては、抗体遺伝子座において体細胞相同組換えが生じる細胞であれば如何なるものでも使用可能であると思われるが、好適にはニヮトリ由来の B細胞株である D T 40細胞が使用される。

クロマチン構造を弛緩させるための手段は、当業者において周知である如何なる手段でも可能であると思われるが、好ましくはヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤を対象の細胞に接触させる処理を用いることができる。かかる阻害剤はヒストン脱ァセチル化酵素を阻害すれば如何なるものでもよいが、好ましくはトリコスタチン Aが利用される。

また、クロマチン構造を弛緩させる方法としてヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤に免疫細胞を接触させる場合、ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤での処理濃度及び処理時間は、接触させる細胞が死に至らない範囲内であれば、使用可能である。具体的には、トリコス夕チン Aの場合には、処理濃度は約 0 .5 n g / m lから約 5 .0 n g / m l が好ましく、処理時間としては約 2週間から約 2年間が好ましい。

またさらに、本発明においては、遺伝子座における体細胞相同組換えを促進するための薬剤であって、ヒストン脱ァセチル化酵素の阻害剤からなる薬剤が提供される。

本発明における薬剤としては、ヒストン脱ァセチル化酵素の阻害剤であれば如何なるものでも使用可能であるが、トリコス夕チン A が最も一般的でかつ好適である。図面の簡単な説明

図 1 は、定常領域及びサザンハイブリダィゼーションのプロ一ブ領域欠失変異株作製のための模式図を示す。ブラストサイシン耐性遺伝子が挿入されたプラスミド（コンストラクト UR1 ) を用いて、非再編成軽鎖遺伝子座の定常領域付近（プローブ領域を含む）をプラストサイシン耐性遺伝子で置換させている。

図 2は、抗体軽鎖遺伝子クロマチン構造の TSA依存的なァクセシビリティ一の増加を示す。 naked DNA とは、除タンパクした同じ領域の DNAのことである。

図 3は、トリコス夕チン Aの相同組換えへの影響を示す。

(a) トリコスタチン A 1.25ng/ml存在下で 3週間培養したクローンの抗体軽鎖遺伝子可変領域の多様性を示す。

(b) トリコスタチン A非存在下で 3週間培養したクローン（No.1- No.6)の抗体軽鎖遺伝子可変領域の多様性を示す。

図 4は、トリコス夕チン Aの I g M ( + ) 細胞出現頻度への影響を示す。

(a) トリコスタチン Al.25 n gZm l存在下で培養した 5 クロ一ン（Νο·1-Νο.5)の結果を示す。

(b) トリコス夕チン A非存在下で培養した 6 クロ一ン（Νο·1-Νο. 6)の結果を示す。

図 5は、ャギ IgG磁気ビーズにセレクションを行った細胞の抗原特異性を示す。

(a) ャギ IgG磁気ビーズでセレクションを行った後の細胞のャギ IgGへの結合性を示す。左：セレクションを行わなかつた細胞集団の、ャギ IgG FITC に対する結合性の結果を示す

(unselected) 。中央：ャギ IgG と強い結合を示すクロ一ンの結果を示す（clone No.3) 。右：ャギ IgG と極めて弱い結合性しか示さないクローンの結果を示す（代表例のみ、 clone No.17)。

(b) ャギ IgGに対して強い結合を示すクローン（No.3)の他の抗原への結合性の結果を示す。上段：ストレブトアビジンに対する結合性の結果を示す（SA)。左がセレクションを行わなかった細胞集団（SA、 unselected)、右がャギ I g G に対して結合するクローン (SA、 clone No.3)の結果を示す。下段：オボアルブミン- FITC に対する結合性の結果を示す（OA)。左がセレクションを行わなかつた細胞集団（OA、 unselected), 右がャギ I g G に対して結合するクローン（SA、 clone No.3)の結果を示す。

図 6は、ヒト IgG磁気ビーズによりセレクションを行った細胞の解析結果を示す。

(a) エライザ法において強いシグナルの見られた細胞の、ヒト IgG FITC に対する結合性の結果。代表的な 3 クローン（clone7 clone8、 clone20 ) の結果を示す。

(b) (a) で示した 3 クローンに関し、結合の特異性を検討した結果を示す。ヒト IgG FITC (hlgG) 、ゥサギ IgG FITC

(rlgG) 、ャギ IgG FITC (glgG ) 、ストレプトアビジン

FITC (SA) 、オボアルブミン FITC (OA) で染色し、 FACSで解析した結果を示す。 unstainedは、染色していないもののことである。

(c) 細胞培養上清でエライザ法を行った結果である。 clone7、 clone20、セレクションを行っていない細胞 ( unselected ) について、ヒト I g G (hlgG) 、ゥサギ I g G (rlgG) 、ャギ IgG

(glgG) 、ストレプトアビジン（ S A ) 、オボアルブミン（ O A ) でコートしたィムノプレートを用い、エライザ法を行った。培養上清は、 1倍希釈から 5 0万倍希釈までの希釈系列（Dilution) をとった。発明を実施するための最良の形態

本発明の抗体作製方法は体細胞相同組換えの促進方法を一部に利用するものであるので、以下では抗体の作製方法について詳細に説明する。

前述のように、本発明の抗体作製方法においては、抗体遺伝子座において DNA 相同組換えが起きている免疫細胞を選択して培養し抗体を作製するにあたり、該免疫細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させる操作を行うことによって、抗体遺伝子座において起きている DNA相同組換えの頻度を大幅に向上させ、それによつて多様な抗体を獲得する。

よって、以下では、細胞培養、クロマチン構造の弛緩の誘導、クロマチン構造の弛緩の確認、相同組換えの確認、抗体の発現の確認について順に説明する。

細胞培養：

本発明における「免疫細胞」とは、抗体産生能を有する B細胞を指し、宿主動物の種類としては、マウス、ヒッジ、ラヅト、ニヮトリなどが含まれる（Honjo，T.，Alt， F.W. (1995). Immunoglobul in Genes , 2nd Edition (Academic Press) ) _σ 好まし、は、株化された細胞が使用され、特に好ましくは免疫細胞としては DT40 細胞が使用される。

「DT40 細胞」とは、ニヮトリ由来 B細胞の株化培養細胞であり当該細胞の保有する染色体に何らかの修飾（例えば、特定の遺伝子の組換え、挿入、削除等）を加えられた、誘導体株、サブライン (Subline ) も含む。

本発明で用いる細胞の培養条件は当該技術分野において周知の方法によって行われるが、選択される免疫細胞に適した培地、培養条件（培養温度、 co₂濃度）下で行われることは言うまでもない。しかして、選択される免疫細胞が DT40細胞である場合、例えば、培地は IMDM (Invitrogen社）を用い、培養温度は例えば 3 9 .

5 °C、 5 %の C 0₂濃度条件下で行う。培養は、細胞濃度を一定に保ちながら行い、適当な期間毎（例えば、日毎、週毎）に目的の細胞の抗体遺伝子座における体細胞相同組換えの有無を確認する。免疫細胞の抗体遺伝子座におけるクロマチン構造の弛緩の誘導：ここで用いられる「クロマチン構造の弛緩」とは、標的の遺伝子座（ここでは、抗体遺伝子座）に、相同組換えに関与する各種因子が直接或いは間接的に作用し得るように、当該遺伝子座全体のク口マチン構造を緩めることをいう。「弛緩」を引き起こす因子には、ヒストンァセチルトランスフェラ一ゼ（ HAT ) 、ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤、クロマチン構造変換因子（例えば、 Sw i/S n f タンパク質、 I s w iタンパク質、及びこれらのホモログ、及びこれらの機能複合体）などが含まれる。好ましい「弛緩」を引き起こす因子は、ヒストン脱ァセチル化酵素阻害剤である。

「ヒストン脱ァセチル化阻害剤」には、ヒストン脱ァセチル化酵素（HDAC) の活性を抑制する活性を持つ抗体などのタンパク質因子、トリコス夕チン A、ブチル酸及びバルプロ酸など小分子化合物など、当業者に知られているものであれば如何なるものも使用可能であると思われるが、最も好適にはトリコス夕チン A が使用される免疫細胞の抗体遺伝子座におけるクロマチン構造を弛緩させるために、弛緩を誘導する因子を、目的の免疫細胞中で発現させ又は該細胞と直接接触させる。弛緩を誘導する因子がタンパク質性の因子であって、細胞内で該因子を発現させてクロマチン構造の弛緩を誘起する場合、目的の細胞における該因子の発現にとって適切なプロモータ、夕—ミネ—夕、ェンハンサ一等を保持するべク夕一を目的の細胞に形質移入することにより達成される。該因子の免疫細胞内での発現は当業者にとって周知の方法によって容易に実施することが可能である（Spector, D.L., et al. (1998). Cells a Laborato ry Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press) を参照のこと）。弛緩を誘導する因子を目的の免疫細胞に直接接触させる場合は、該因子の濃度を一定に保ちながら培養する。弛緩を誘導する因子を発現させ又は接触させた細胞は、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを引き起こすために適切な時間、培養する。例えば、該因子がヒストンァセチル化酵素阻害剤のトリコス夕チン Aである場合、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを引き起こすために適切な時間は、好ましくは、約 2週間から約 2年間、より好ましくは約 2週間から約 6週間であり、最も好ましくは約 5週間であり、適切な濃度は、好ましくは、約 0.5ng/ml から約 5.0ng/ml であり、最も好ましくは、 1.25ng/ml である。

抗体遺伝子座におけるクロマチン構造変化の検出：

特定の遺伝子座領域におけるクロマチン構造の変化は、当該領域に対する DNase感受性を指標として検出するのが一般的である。上述した方法による処理を行った細胞において、目的の遺伝子座領域のクロマチン構造が弛緩すると、その部分における DNA及びクロマチン構成タンパク質（ヒストン等）間の結合に緩みが生じると考えられる。その結果、クロマチン構成タンパク質と結合していたために DNase により切断されなかった DNA部分が、クロマチン構造の弛緩により緩むことで、 DNase に対して感受性を示すようになる。クロマチン構造の変化の前後における、 DNase に対する感受性の変化は、当該領域の DN A 切断パ夕一ンを変化させることとなり、新たに生じた DNA断片をサザンプロット法等で検出することで、クロマチン構造が弛緩した遺伝子座領域を確認することができる。ここで、 DNase としては、 DNaseI、 MNase (球菌ヌクレア一ゼ）などが一般的に用いられる。

抗体遺伝子座における体細胞相同組換えの確認：

体細胞相同組換えの確認は、上述した方法による処理を行った細胞の抗体遺伝子座領域のゲノム配列を決定し、上述の処理を行っていないコントロールの細胞の抗体遺伝子座領域のゲノム配列と比較することで行う。抗体遺伝子座領域のゲノム配列の決定方法として- 一般的には、該遺伝子領域を特異的な DNA プライマ一により増幅し、増幅された DNA断片を適当な配列決定用のベクターに組込んで配列決定を行う。簡単には、目的の免疫細胞から調製したゲノム DNAの抗体遺伝子座領域を増幅するのに必要な DNA プライマ一

(例えば、目的の抗体遺伝子領域全体を含むように、該遺伝子の 5 '側近傍に正方向のプライマ一を設計し、該遺伝子の 3，側に逆方向のプライマーを設計する）を用意し、抗体遺伝子座領域を PCR 法により増幅させる。増幅させる抗体遺伝子座領域は、抗体軽鎖遺伝子又は/及び抗体重鎖遺伝子のどちらかであり、好ましくは、何れかの遺伝子の可変領域がよい。増幅に使用される DNAポリメラーゼは市販のものを用いることができるが、長い D N A鎖の伸長が可能で、かつ正確性の高いものを使用することが望ましい。抗体遺伝子座領域の増幅を行うための条件は、使用する DNAプライマーのァニール温度、使用する D N Aポリメラ一ゼの性質等に依存するが、例えば、 9 8 °C 2分間の反応後、 9 8 C 3 0秒、 5 7 °C 3 0 秒、 7 2 °C 1分を 2 7サイクル、さらに 7 2 °C で 1 5分間反応させる。反応後の増幅産物は、ァガロースゲル電気泳動で分離し、目的抗体遺伝子座領域を含む D NAのバンドを切り出し、 D N Aを回収後、配列決定用のベクターへ組込む。配列決定用のベクタ一は当該技術分野で用いられる如何なるベクターであってもよいが、例えば pCR2.1-TOPO (Invitrogen ¾) などが用いられる。上記調製された配列決定用のベクタ一中の、抗体遺伝子座領域の D N A配列を解析し、抗体遺伝子座における体細胞相同組換えを誘導していない細胞由来の対応配列と比較して、体細胞組換えの程度を測定する。抗体の発現の確認：

上述の記載に従い抗体遺伝子座における体細胞相同組換えが確認された細胞について、実際に抗体の発現が誘導されていることを確認する。

「多様な抗体」には、 I g A、 I g D, I g E , I g G I g Y 及び I g Mが含まれる。

( i ) 分泌された抗体の確認

体細胞相同組換えが行われた遺伝子座に由来する抗体が分泌型の場合、産生された抗体分子を含む培養上清について目的の抗体分子の存在を確認する。確認の方法としては、当業者にとって周知の如何なる方法によっても実施することが可能であるが、例えば、産生された抗体分子を特異的に認識する抗体による検出法（例えば、標識化した二次抗体を用いる、ウエスタンプロット法、エライザ法など）が一般的である。簡単には、培養上清をそのまま、ウエスタンプロット法、又はエライザ法等に用いることができる。産生された抗体の濃度が低い場合には、該培養上清から目的の抗体を濃縮した後、産生された抗体の確認を行うことができる。簡単には、該培養上清から硫安沈殿法（ 5 0 %硫安）等により抗体分子を濃縮沈殿させ後、抗体分子のペレットを適当なバヅファー（例えば、 P B S など）に懸濁後、同バッファーに対して透析する。透析は透析外液を数時間毎に代えながら、硫安が除かれるまで行う。得られた抗体分子に対して、当該抗体分子を特異的に認識する抗体を用い、ウェスタンブロット法により直接又は間接的に産生抗体分子の検出を行うあるいは、産生される抗体が I g Gである場合には、プロテイン A 又はプロティン Gを用いたァフィ二ティークロマトグラフィ一により直接精製することで確認してもよい。

( i i ) 細胞膜上に発現された I g Mの確認

体細胞相同組換えの促進により産生された抗体が、細胞膜上に提示される I g Mの場合、抗 I g M抗体を用いた蛍光活性化セルソ一夕一（ F A C S ) 分析によって確認することができる。

以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない実施例 1 ：トリコス夕チン A ( T S A ) 処理後の D T 4 0細胞の抗体遺伝子座領域におけクロマチン構造の解析

T S A により実際に抗体軽鎖遺伝子のクロマチン構造に変化が生じているかどうかは、球菌ヌクレアーゼ（M N a s e ) 感受性を指標とし、間接末端標識法を用いて解析した。ニヮトリ抗体遺伝子には V J組換えを起こしたものと起こしていないものが存在するが、実際に抗体産生において機能しているのは V J組換えを起こした側のみである事が知られている。しかしながら両者の配列は、ほぼ同一であることから、間接末端標識法をそのまま適用するだけでは、野生型 DT40細胞の、 VJ組換えを起こした遺伝子座のみを解析することは困難である。この問題を解決するために、 VJ組換えを起こしていない側において、サザンハイプリダイゼーションのプロ一ブとして用いる領域の周辺配列を欠失した変異株を作製し、この変異株を用いて MNase 感受性の解析を行った。

欠失変異株の作製：

抗体軽鎖遺伝子をクローニングしたプラスミド #18-4(京都大学医学系研究科、武田俊一教授より譲渡されたもの）を EcoRI で消化し. 二つ生じる断片のうち、大きい方とブラストサイシン耐性遺伝子

(武田教授より譲渡されたもの）断片をライゲートし、大腸菌にトランスフォームした。これにより、定常領域及びサザンハイブリダィゼーションのプローブとして用いる領域を含む領域が欠失し、それに代わりブラストサイシン耐性遺伝子が揷入されたプラスミド

(UR1 ) が得られた（図 1 ) 。このプラスミド約 2 0. g を Xbal で消化して直線化し、既知の手法（Buerstedde, J.M., Takeda, S. Cell. 1991 67 ( 1 )： 179 - 88. ) に従って D T40細胞に感染させ、欠失変異をもつ DT40細胞株（3H12) を作製した。

核の単離：

TSA(0 ng/ml, 0.625 ng/ml, 1.25 ng/ml, 2.5 ng/ml) をカロえた培地で 8時間培養した 10⁷-10⁸の 3H12 細胞含む培養液を 300 g_; 15分遠心し、細胞を回収したのち、 10 ml の P B S に懸濁し、再び 3 0 0 で 1 5分遠心してペレツトに回収した。その後、細胞を 4ml の Nuclear Buffer (10 mM Tris-HCl (pH8.0), 0.32 M Su crose, 5 mM MgCl₂， 1 % TritonX- 100, 0.5 mM DTT, 0.1 m M PMSF ) に懸濁後、氷上で 1 5分間放置して細胞膜を除去した。 1000 gで 5分間遠心することで核を回収した。

MNase 肖ィ匕：核のペレヅトを RSB(10 mM Tris- HC1 (pH7.5), 10 mM NaC 1, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF ) 10 ml に再懸濁した。再び 1000 gで 5分間遠心して核を回収し、 400 .1 の RS B に懸濁した。この核懸濁液の D N A濃度を Hoechst 33258 の結合で測定し、 100 . g相当の懸濁液を R S Bで 500 .1 にした。これを各細胞ごとに 4本ずつ用意した。 0.5 .1の 1 M CaCl₂、さらに MNase(0 U, 0.04 U, 0.2 U, 1 U) をカロえ、 3 7 °Cで 5分間消化後、 20 .1 の 0.5 M EDTA と 12.5 .1の 20 % SDS 2 .1 の 15 mg/ml プロティネース Kを加え、 5 0 °Cでー晚反応させた。 500 .1 のフエノールクロ口ホルムを添加し、 3 0分間、穏やかに震盪させた後、 1.5 Krpm で 5分間遠心し、上層を回収し、新しいチューブに移した。クロ口ホルム 500 .1 をさらにカロえて再び 3 0分間、震盪させ、 1.5 Krpmで 5分間遠心したのち、上層を新しいチューブに移した。 50 .1 の 3 M 酢酸ナトリウム、 1 m 1 の冷エタノールを加え、穏やかに混ぜた。 1.5 Krpmで 2 0分間遠心し、上清を除去後、 8 0 %エタノールを 500 .1加えて穏やかに混ぜ、再び 1.5 Krpmで 5分間遠心した。上清を除去し、沈澱を風乾させた。ここに 100 .1 の T E (10 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM EDTA) を加え、 5 5 °Cで 1時間保温し、その後 4 °Cで一晩放置して溶解させ o

サザンプロット解析：

サザンブロヅト解析は、 Church及び Gilbert (Church, G.M., Gilbert, W. Proc. Natl . Acad. Sci. U S A. 1984 81Γ7): 1991- 5.) の方法で行った。 20 . g相当の DNAをスピンカラム（フアルマシア社 ProbeQuant G-50) で精製した後、制限酵素 BsaAI (N E B社）で消化した。その後フヱノールクロ口ホルム抽出を行い、ェ夕ノール沈澱で D N Aを回収したのち、 TAE (40 mM Tris-aceta te, 1 mM EDTA) ノヅファー中、 1 . 5 %ァガロースゲルで電気泳動を行った。 DNAは Vacu Gene XL nucleic blotting system (Pharmacia) によりメンブレンにトランスファ一した。最初に変成バッファー（1.5 M NaCl 0.5 M NaOH) で 1 5分間変成させ次にトランスファ一バッファ一（1.5 M NaCl, 0.25 M NaOH) で 4時間かけてトランスファ一した。メンブレンは 20 X S S Cで中和した後、ノヽィブリダィゼ一シヨンファー（10 mg/ml BSA, 0.

5 M Na₂P0₄ (pH7.4), 7 % SDS 1 mM EDTA) で 6 2 C 1 時間プレハイブリダィゼーシヨンを行った。その後、し ³²P] dCTPでラベルしたプローブ 50 n g をノヽィブリダィゼーションノヅファーで

6 2 °C；、ー晚、ハイブリダィズさせた。その後、メンブレンを 6

5 °Cに加温した Wash Buffer (20 mM Na₂P0₄ (pH7.4), 1 % S DS, 1 mM EDTA ) 50 ml で 6 2 °C, 1 0分間洗浄し、これをさらに 4回繰り返して洗浄した後、メンブレンの放射活性を BAS2000 で解析した。なお、プローブ DNAは、 PCR 法（ロッシュ社、 Expa nd Hi Fidelity PCR system )を用いて作製した。その際プライマ一は、 ATCTTGCCTTCCTCATGGC (配列番号 1 ) および、 GTT TGGGTGAACGTGGTTC (配列番号 2 ) を使用し、錶型はニヮトリ抗体軽鎖遺伝子をクローニングしたプラスミド #18-4 を鏡型とした。

?1 7¾ *

各濃度の TSA存在下において（0 ng/ml, 0.625 ng/ml, 1.25ng/ ml, 2.5 ng/ml)、添加する MNase(0 U, 0.04 U 0.2 U, 1 U) 量を増加させたところ、 TSA濃度及び MNase量の増加に伴い、 V J領域が切断されて生じる DNA断片が出現することが確認された (図 2 「VJ」で示した位置のバンド、例えば、左から第 5 レ一ン目と第 1 7 レーン目を比較する）。これらのバンドは、 TSA非存在下（0 ng/ml) において MNase量を増加させても検出されなかったため（図 2、左から第 5 レーン目）、 VJ領域が MNase により切断されるためには、 TSAの存在が必要であることを示す。以上の結果から、 TSA により DT40細胞株の VJ領域（抗体軽鎖遺伝子座領域）のクロマチン構造が弛緩し、この領域への MNase のァクセシビリティーが増加したことが確認された。実施例 2 ：トリコスタチン A (TSA) による DT40細胞中の抗体遺伝子座における体細胞相同組換え促進の確認

細胞培養：

DT40細胞は、 C 0₂恒温槽にて 5 %の C 0₂、 3 9 . 5 °Cで培養した。培地は、 IMDM 培地 (Invitrogen 社）を用い、 1 0 %FBS 1 %ニヮトリ血清、ペニシリン 100単位/ ml、ストレプトマイシン 100 . g/ml, 2-メルカプトエタノール 55 . M を加えて使用したまた、トリコス夕チン A (和光純薬）は、メタノールに 5 mg/ml に溶解したものをストックとし、最終濃度が 1.25 ng/ml となるように適宜培地で希釈して用いた。

細胞表面に I g Mを発現していない DT40細胞（以下、 I g M (一）細胞）を、約 20細胞 Zml に希釈して 9 6穴プレートに 100 . 1 ずつ分注した。この際、培地にトリコス夕チン Aを 1.25 ng/ml 加えたものと、加えないものを用意した。シングルコロニーが現れるまで培養し、 5 クローン（TSA なしは 6 クローン）を新鮮な培地 2 ml を入れた 6穴プレートに移した。なお、この際 TSA濃度は当初の濃度を維持し、細胞濃度は 10⁵〜10⁶個 Zml に保ちながら培養を続けた o

ゲノム DNAの抽出：

上述の方法により 3週間培養した DT40細胞の生細胞を蛍光活性化セルソ一ターで回収した。 EPICS ELITE ESP により、生細胞 1 0万個を 1.5 ml チューブに集めた。シース液に懸濁された細胞を遠心（1000 g, 10 min)により回収し、ペレツトに直接 300 . 1 のゲノム抽出ノッファー（100 mM Tris-HCl, pH8.0, 5 mM EDTA, 0.2 % SDS, 200 mM NaCl 及び 100 . g/ml プロティネース K) を加え、 5 0 °Cで一晚消化した。翌日、 750 . 1 のエタノールをカロえ、穏やかに上下に反転させて混ぜた。ゲノム DNA を遠心（1000 g, 10 min) により回収し、 70 %エタノールで洗い、風乾した。ここに 100 . 1 の TEノッファ一 0 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 m M ED T A)を加え、 5 0 °Cで 3 0分放置した後、 4 °Cにてー晚かけて溶解させた。

抗体軽鎖遺伝子可変領域の配列の解析：

抗体軽鎖遺伝子可変領域の増幅には、 PCR (Perkin Elmer 960 0 ) を利用した。ゲノム D N A溶液 5 . 1 (細胞 5000個相当）を铸型とし、プライマ一は、上流（ CACACCTCAGGTACTCGTTGCG

(配列番号 3 ) ) 、下流（TCAGCGACTCACCTAGGACGG (配列番号 4 ) ) それぞれ 10 pmol を使用した。 Pyrobest DNA Poly merase (宝酒造）を用いて、 50 . 1 スケールで反応させた。反応条件は、 9 8 °C 2分の後、 9 8 °C 3 0秒、 5 7 °C 3 0秒、 7 2 °C

1分を 2 7サイクル行い、最後に 7 2 °C 5分反応させた。その後 ExTaq DNA Polymerase (宝酒造）を 1 . 1カ卩ぇ、 7 2 °C 1 5分反応させた後、全反応液の 20 . 1分をァガロースゲル電気泳動で分離した。軽鎖遺伝子可変領域に相当するバンドを切り出し、 Gel Extr action kit (Qiagen社）により DNAを回収後、 TOPO TA Cloni ng ki Invitrogen社）にて pCR2.1-TOPOベクタ一に組み込み、大腸菌にトランスフォーメーションした。プラスミドを抽出し、 A BI PRISM 377 DNA Sequencer (Perkin Elmer社）により配列を解析した。

結果：

増幅された抗体軽鎖遺伝子可変領域を、プラスミドベクターにクローニングしたものの配列をしらべてみたところ、図 3の結果が得られた。トリコス夕チン Aを加えて培養した細胞では、 4 2サンプルが 1 6種類に分類された（図 3 ( a)) 。この多様性は、相同組換え、遺伝子挿入、遺伝子欠失、点変異により生じたものであることが分かった。一方、トリコス夕チン A非存在下で培養した細胞では 3 0サンプル調べたかぎりでは、相同組換えは見い出されなかつた (図 3 (b )) 。以上の解析結果より、トリコスタチン Aの添加により、 DT40細胞株での抗体軽鎖遺伝子の多様性が著しく上昇したと結論付けられる。実施例 3 ：トリコス夕チン Aに I g M ( + ) D T 4 0細胞の出現頻度の促進

蛍光活性化セルソー夕一（FACS) による I S Mの発現の確認：実施例 2 に記述した方法でトリコスタチン A処理を行った I g M (― ) 細胞の約 10⁶個を含む培養液を 1.5 ml チューブにとり、遠心により該細胞を回収（1000 g、 5分）し、染色バッファ一（PBS 0.3 % BSA) 200 .1 に懸濁した。細胞を再び遠心により回収し、次に FITC ラベルした抗ニヮトリ IgM抗体（BETHYL社）を染色バッファ一で 1 /250倍希釈したものを 200 .1で懸濁し、氷上で 1 時間反応させた。細胞を遠心により回収し再び染色バッファー 200 .1 に懸濁し、これを遠心することで細胞の洗いを行った。この洗いのステップをもう一度繰りかえしたのち、細胞を 5 . g/ml のヨウ化プロビジゥム（ナカライ社）を含む染色バッファー 1 100 .1 に懸濁した。 I g Mを発現している細胞の割合は、 EPICS ELITE ESP (Beckman Coulter社）により、 1 0 0 0 0細胞を測定して算出した。その際、ヨウ化プロビジゥムにより染色される細胞は死細胞としてゲートアウトした。

結果：

一週間おきに FACS で I g Mを発現している細胞（以下、 I g M (+ )細胞）の割合を測定したところ、図 4のように、時間依存的に I g M( + )の割合が増加するものが見られた。 I g M( + )細胞は、 I g M (―)細胞が相同組換えを起こした結果生じたと考えられる。実施例 4 ：抗原特異的抗体の選択抗原磁気ビーズの作製：

磁気ビーズは Dynabeads M-280 Tosylactivated (Dynal社）を用い、抗原との共役は解説書に従った。この際、磁気スタンドは Dynal MPC (Dynal社）を用いた。ビーズ 2 0 0 〃 1 を 5 0 0 〃 1の BufferA( 0.1M Na-Phosphate pH7.4)で 3 回洗った後、 BufferA 4 0 0 〃 1 中で 2 4 0 〃のャギ 1 g G(SIGMA社）またはヒト I g G (SIGMA社）と 3 7 °Cで 2 4時間、回転により攪拌しながら反応させた。次にビーズを BufferC (10mM Na- Phosphate pH7.4, 150mM NaCl, 0.1% BSA) 5 0 0 ^ 1で 2 回洗浄した。その後 BufferD (0.2M Tris-HCl pH8.5, 0.1 %

BSA) 5 0 0 〃 1 を加え、 3 7 °Cで 4時間、回転により攪抻しながら反応させ、ブロッキングを行った。その後 5 0 0 1の

BufferC で 2 回洗浄した後、 0.02%アジ化ナトリウムを含む BufferC 4 0 0 1 に懸濁した。

抗原磁気ビーズによるセレクション：

抗原磁気ビーズによるセレクションは、 Cumbers らの方法 (Cumbers et al.,Nat. B i o t e ch n o 1. ( 2002 ) 20 ( 11 ) : 1129 - 1134) に準じた。トリコス夕チン A l . 2 5 n g/m lを含む IMDM培地で 6週間以上植え継いだ野生型 D T 4 0細胞約 5 X 1 0 ⁷個をセレクションノヅファー（1% BSA を含む PBS) 5 m l により 2 回洗浄し、さらに 1 m 1のセレクションバッファ一で洗浄した。その後細胞を 1 m 1のセレクションノ ' ヅファーに懸濁したのち、 1 〃 1相当の抗原磁気ビーズ（セレクションバヅファー l m l で 2 回洗浄したもの）に加えた。 4 °Cで 1 0分間、回転により攪拌しながら反応させた。以後の処理は、用いた抗原の種類によって若干の変更を加えているため、分割して記述する。

( i ) ャギ I g G磁気ビーズによるセレクション

ャギ I g G磁気ビーズでセレクションを行った細胞に関しては、磁気スタンドを用いて 1 m 1のセレクションノ ' ヅファーで 3 回洗浄した。その後回収した細胞を 5 0 0 1のセレクションノヅファーに懸濁したのち、 IMDM培地 1 0 m 1 に加え、これを 9 6穴プレートに 1 0 0 1 ずつ分注した。 9 6穴プレートは C0₂インキュべ一夕一中で 4 0 °Cで保温した。

(ii) ヒト I g G磁気ビーズによるセレクション

ヒト I g G磁気ビーズによるセレクションを行った細胞に関しては、磁気スタンドを用い、 2 . 5 %の Pluronic F68 (SIGMA社）を含む 1 m lのセレクションバヅファーで 3回洗浄した。その後回収した細胞を 5 0 0〃 1のセレクションノ^；ヅファーに懸濁したのち、 IMDM培地 3 0 m lに加え、これを 9 6穴プレートに 3 0 0 μ 1 ずつ分注した。 9 6穴プレートは C0₂インキュベータ一中で 4 0 °Cで保温した。

蛍光標識抗原による染色：

9 6穴プレートの 1個のゥエルに由来する細胞約 1 0 ⁶個を含む培養液をチューブにとり、遠心により細胞を回収し、セレクシヨンノヅファー 2 0 0 1で 2回洗浄した。次に FITC ラベルした抗原（ャギ I g G、ヒト I g G、ゥサギ I g G (いずれも

SIGMA社）、ストレプトアビジン ( D a k o社），オボアルブミン

(Molecular Probes ¾) をセレクションノヅファーで 1 0〃 g / m 1にしたもの 2 0 0 1で懸濁し、氷上で 1時間反応させた。細胞を遠心により回収し再びセレクションバッファ一 2 0 0〃 1に懸濁し、これを遠心することで細胞の洗いを行った。染色した細胞の蛍光強度は、 EPICS ELITE ESP(Beckman Coulter社）により測定した。

ェライザ：

ェライザは、 SOLID PHASE GUIDE (Nalge Nunc社）に準じて '†Tつすこ o Nunc-Immuno Plate MaxiSorp Surface (Nalge Nunc 社）の各ゥエルに抗原溶液（ P B Sで 5〃 g /m 1にしたもの） 2 0 0 z l を加え、室温でー晚反応させ、抗原によるプレートのコートを行った。翌日ゥエル中の液を捨て、そこにブロッキング液（ 0 . 5 %スキムミルクを含む P B S ) 2 0 0 1を加え、 1時間反応させた。その後ゥエルを ELISA洗浄液（ 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 を含む P B S ) 2 0 0 z lで 3回洗浄した。ここに細胞の培養上清等、抗体を含む溶液 1 0 0 1 をくわえ、 1時間反応させた。次に ELIS A洗浄液 2 0 0 1で 5回洗浄した。二次抗体は、 H R P標識した抗ニヮトリ I g Mャギ抗体（BETHYL社）を P B Sで 2 0 0 0倍に希釈したものを 1 0 0 2 0 0 〃 1加え、一時間反応させた。二次抗体後の洗浄は E LI S A洗浄液 2 0 0 ^ 1で 5回行った。発色反応は、 T M B + (Dako社） 1 0 0 1により行い、反応の停止は 1 M硫酸 1 0 0 〃 1 により行った。定量は、 Quant

Biomolecul ar Spectrometer vBio-Tek Instruments千土) により、 4 5 0 n mの吸光を測定した。

ェライザ用培養上清の作製：

ェライザにより力価を解析した培養上清は、血清由来の I g M等を除去するため、以下のようにして調製した培地を用いた。ニヮトリ血清（Invirtogen社）から 5 0 %飽和硫安によりィムノグロプリンを沈殿として除去し、上清を P B Sに透析した。透析により生じた体積増加を Centri Prep (Amicon社）による濃縮で補正し、抗体除去ニヮトリ血清とした。これを AIM-V無血清培地（Invitrog en社）に 3 %の濃度で加えた。ここに約 1 0 ⁶/m 1の濃度で細胞を加え、 2 日培養し、培養上清をとりェライザを行った。トリコスタチン A l . 2 5 n g/m lを含む培地で 6週間植え継いだ D T 4 0細胞約 5 X 1 0 ⁷個から、ャギ I g Gを共有結合させた磁気ビーズによりセレクションを行い、ャギ IgG に結合する細胞の選択を試みた。磁気ビーズに結合した細胞は 9 6穴プレートに分注して培養した。その後生じたコロニーに由来する細胞の抗原結合性を検討した。 F I T Cラベルしたャギ I g Gとの結合を、 9 クローンに関して FACS により解析したところ、うち 1 クローンで、強い蛍光が認められ、この細胞とャギ I g Gとの結合が示唆された (図 5 (a) ) 。次に、この結合が特異的であるかどうかを検討するために、 F I T Cラベルしたストレプトアビジン、およびォボアルブミンで同様の実験を行った。するとストレプトアビジン F I T C、オボアルブミン F I T Cいずれにおいても、蛍光強度の増大は認められず、細胞とャギ I g Gの結合は特異的なものであることが示唆された（図 5 (b) ) 。以上の結果は、トリコス夕チン A 処理により多様化した細胞表面の I g Mの中で、ャギ I g Gに特異的結合するものが生じ、それが抗原磁気ビーズにより選択されたことを示唆していると考えられる。

次に、ャギ I g G以外の抗原に対する抗体を産生する細胞を選別することが可能かどうかを検討するため、ヒト I g G磁気ビーズを用いてセレクションを行った。ここでは、陽性クローンの候補を得るために、ェライザを行った。 9 6穴プレート中の細胞培養上清 1 0 により、ヒト I g Gでコートしたィムノプレートを用いて解析したところ、 1 4個のゥエル由来の培養上清に関して、著しく強い吸光度がみられた。次にこれらのゥエル中の細胞を培養し、ヒト I g G F I T Cにより染色し、 F AC S で解析した。代表的な例の結果を図 6 fa)に示す。いずれにおいても、低いものでも数倍、高いものでは数百倍の蛍光強度の増加が認められた。また、

clone20のように単一のピークを示すものも見られたが、 clone7 や clone8のように複数のピーク、あるいはプロ一ドな分布を示すものもみられた。これらの複数のピークやブロードなピークをもつ細胞集団を限外希釈して再度クローン化してやると、明確な単一のピークを示すものが得られた（data not shown ) 。このことから clone7や clone8 のようなパターンを示すものは、 9 6穴プレートにおいて複数の陽性クローンが同一のゥエルに存在していたことを示唆していると考えられる。次に、 clone7、 8、 20 について、抗原特異性を検討した（図 6 , ( b ) ) 。ヒト I g G F I T C、ゥサギ I g G F I T C、ャギ I g G F I T C, ストレプトアビジン F I T C；、オボアルブミン F I T Cで染色し、 FACSで解析した。 clone7 と clone8 に関しては、明確なヒト I g Gに対する特異性が認められた。一方 clone20の場合、ャギ I g Gに対しても若干の結合がみられ、異種のホモログに対しても交差することが明らかになった。なお、いずのクローンもゥサギ I g G、ストレプトアビジン、オボアルプミンに対する結合は認められなかった。

さらに、 clone7および clone20 について、培養上清を用いてェライザを行った（図 6 ( c ) ) 。ヒト I g G、ゥサギ I g G、ャギ I g G、ストレプトアビジン、オボアルブミンでコートしたィムノプレートを用いたところ、 clone7、 clone8 いずれにおいてもヒト I g Gに対して反応性を示し、 clone7では 5 0倍希釈、 clone20 では 5 0 0倍希釈まで、有意なシグナルが検出された。また、 clone 20 は F ACS解析でャギ I g Gとの若干の反応性が認められたが（図 6 ( b ) ) 、 E L I S Aにおいても、弱いながら、ャギ I g Gとの反応が見られ、 FACS解析と一致した結果となった。なお、セレクションをかけていない細胞の培養上清はどの抗原に対しても特に反応は示さなかった。産業上の利用可能性

本発明に係る体細胞相同組換えの促進方法によれば、所望の体細胞相同組換えを制御された状況下で誘起促進させることができ、よつて、例えばタンパク質因子の創製に利用することが可能になる。

また、本発明に係る抗体作製方法によれば、培養細胞を用いて人ェ的に多様な抗体を作製することができる。

さらにまた、特定の疾病の治療に有効な抗体（例えば、ヒト抗体ヒト化抗体等）を生産するために作成された免疫細胞株（US Pate nt Al 20020028488 ) を用いることで、より治療効果を発揮する多様な抗体を、培養細胞系の利用により簡便かつ継続的に確保することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 遺伝子座において D N A相同組換えが起きている体細胞の相同組換えを、該体細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって促進することを特徴とする、体細胞相同組換えの促進方法。

2. 抗体遺伝子座において D N A相同組換えが起きている免疫細胞から抗体を作製するに当たり、該免疫細胞の染色体におけるクロマチン構造を弛緩させることによって、抗体遺伝子座における D NA相同組換えを促進させ、それによつて多様な抗体を獲得することを特徴とする抗体作製方法。

3. 染色体のクロマチン構造の弛緩を、細胞をヒストン脱ァセチル化酵素の阻害剤と接触させて処理することにより誘導することを特徴とする請求項 1又は 2に記載の方法。

4. 阻害剤がトリコス夕チン Aであることを特徴とする請求項 3に記載の方法。

5. トリコスタチン Aの処理濃度が約 0. 5 n g/m lから約 5. O n g/m lであり、接触処理時間が約 2週間から約 6週間であることを特徴とする請求項 4に記載の方法。

6. 細胞が D T 4 0培養細胞であることを特徴とする請求項 1ないし 5に記載の方法。

7. 請求項 1、 3、 4、 5又は 6のいずれか 1項に記載の方法により遺伝子座における体細胞相同組換えが促進された免疫細胞

8 . 請求項 2 ないし 6 のいずれか 1項に記載の方法により作製された多様な抗体。

9 . 作製された抗体が I g Mである請求項 8 に記載の抗体。

1 0 . 遺伝子座における体細胞相同組換えを促進するための薬剤であって、ヒストン脱ァセチル化酵素の阻害剤からなる薬剤。

1 1 . 阻害剤がトリコス夕チン Aである請求項 1 0 に記載の薬剤。