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WO2004005540A2 - Verwendungen von an ngal bindenden substanzen zur diagnose und behandlung von krebserkrankungen - Google Patents

Verwendungen von an ngal bindenden substanzen zur diagnose und behandlung von krebserkrankungen Download PDF

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Publication number
WO2004005540A2
WO2004005540A2 PCT/DE2003/001986 DE0301986W WO2004005540A2 WO 2004005540 A2 WO2004005540 A2 WO 2004005540A2 DE 0301986 W DE0301986 W DE 0301986W WO 2004005540 A2 WO2004005540 A2 WO 2004005540A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
ngal
substance
protein
cancer
cells
Prior art date
Application number
PCT/DE2003/001986
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English (en)
French (fr)
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WO2004005540A3 (de
Inventor
Gunda Herberth
Edgar Dahl
Katrin Sparbier
Anke Stein
Esmeralda Heiden
Irina Klamann
Stafan Taudien
Andreas Rump
Rosemarie Lichtner
Bernd Hinzmann
André ROSENTHAL
Thomas Specht
Christian Pilarsky
Original Assignee
Metagen Pharmaceuticals Gmbh
Gunda Herberth
Edgar Dahl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Metagen Pharmaceuticals Gmbh, Gunda Herberth, Edgar Dahl filed Critical Metagen Pharmaceuticals Gmbh
Priority to AU2003245858A priority Critical patent/AU2003245858A1/en
Publication of WO2004005540A2 publication Critical patent/WO2004005540A2/de
Publication of WO2004005540A3 publication Critical patent/WO2004005540A3/de

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • Ngal-binding substances for the diagnosis and treatment of cancer.
  • the invention relates to new uses of Ngal or sequences derived therefrom for screening for substances which bind to it, and to the use of substances which bind to Ngal for the diagnosis and / or treatment of tumor diseases.
  • Ngal also called Lipocalin-2 (LCN2)
  • LCL2 Lipocalin-2
  • LCN2 Lipocalin-2
  • fr ⁇ lp small lipophilic molecules and formyl peptides
  • Ngal was identified by screening a human genome library with Ngal cDNA as a gene with 7 exons (JB Cowland et al., Genoics 45: 17-23 (1997)). The primary Tran ⁇ script has a length of 3696 nucleotides and the processed transcript is 809 nucleotides long.
  • L. Kjeldsen et al. (2000) is expression von Ngal has been described in various human normal tissues. Ngal is located on chromosome 9q34 (P. Chan et al., Genomics 23: 145-150 (1994)). Cloning and expression of human Ngal cDNA, which originates from bone marrow and ovary cell lines, is described in the reference S. Bartsch et al. , FEBS Lett 9: 255-259 (1995).
  • Findings from paired tumor / normal tissues are not known for other types of cancer.
  • Cancer especially ovarian, colon, lung and uterine cancer, is a disease of increasing incidence with increasing age. So far, this tumor disease has been diagnosed essentially pathologically and mostly treated by removal. Removal of organs has various adverse effects on a patient. Improved diagnosis and treatment of this type of cancer, especially without the need to remove the organ, is therefore highly desirable.
  • the invention is based on the technical problem of specifying pharmaceutical compositions for the diagnosis and / or treatment of cancer and means for identifying them.
  • the invention teaches the use of a nucleic acid coding for Ngal and / or a Ngal peptide or protein for the detection of cancer, in particular of ovarian, colon, lung and / or uterine cancer, or for the detection of a risk of the disease of cancer. in particular of ovarian, colon, lung and / or uterine cancer, a tissue sample (of the tissue in question) being examined for overtranscription of Ngal RNA or for overexpression of a Ngal protein.
  • a coding on for Ngal nucleic acid or binding of NGAL protein or peptide detector substance, preferably containing a reporter group can be used, in which binding • said nucleic acid and / or said protein or peptide to the detector substance is detected semi-quantitatively or quantitatively.
  • the invention further teaches the use of a Ngal RNA or a Ngal protein or peptide for screening for substances binding to it, in particular prospective active substances for inhibiting said RNA or said protein or peptide or prospective detector substances, whereby a prospective substance or a mixture of such prospective substances is contacted with said RNA or said protein or peptide, whereby binding events are determined with a binding assay, and wherein a binding prospective substance, if necessary after deconvolution, as for detection and / or treatment of cancer, in particular of ovarian, colon, lung and / or uterine cancer, is appropriately selected.
  • the invention teaches the use of a substance inhibiting or binding to Ngal for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of cancer, in particular ovarian, colon, lung and / or uterine cancer.
  • the substance can be an antibody which, for example, by immunizing a non-human mammal with a Ngal peptide or protein, or with Ngal cDNA, or with cells transiently or stably transfected with Ngal cDNA (eg tumor cell lines, NIH3T3, CHO, COS), or with tumor cells expressing endogenous Ngal or with Ngal produced in insect cells, or a phage display is antibody.
  • the substance can also be a facial expression compound of an antibody against an Ngal peptide or protein.
  • the substance can be an aptamer, an antisense RNA, an inhibitory RNAi, or a ribozyme.
  • the substance can additionally carry a cytotoxic and / or immunostimulating component.
  • the pharmaceutical composition can be prepared for systemic or local application in tissue containing tumor cells.
  • the invention can be used in the context of a method for diagnosing cancer, in particular ovarian, colon, lung and / or uterine cancer, an embodiment of a detector substance with a reporter group being applied to the tissue to be examined, the tissue to be examined Tissue is then subjected to a detection method stage which is sensitive to the reporter group, and in the case of detection of a defined minimum value of the reporter group in the tissue the tissue is qualified as containing tumor cells, and a method for the treatment of cancer, in particular of ovarian, Colon, lung and / or uterine cancer, a pharmaceutical composition according to the invention being administered to a patient in a physiologically effective dose.
  • the invention is based on the knowledge that Ngal is overexpressed or is differentially expressed in tumors, ie in said tumor tissues the expression is higher compared to (paired) normal cells of the same tissue, and the technical teaching that can be derived therefrom that Ngal can be used as a target molecule in the diagnosis and therapy of this disease. Ngal can therefore serve as a marker for the identification of tumor cells in said tumor tissues.
  • the inhibition of Ngal offers the possibility to intervene in the tumor-specific Ngal associations with other processes in the tumor cells and thus ultimately to disrupt the metabolism that is specific to the tumor cells and to die or at least die contribute to inhibiting the growth of tumor cells.
  • tissue sample which is identified as tumor tissue by other methods before treatment with a pharmaceutical composition according to the invention and to examine the tissue sample for expression or overexpression of Ngal.
  • tissue sample for expression or overexpression of Ngal.
  • it can be tested for Ngal dependence with a detector substance according to the invention for diagnosis in vivo. If expression or overexpression of Ngal with respect to normal tissue of the same type is found, the use of the pharmaceutical composition according to the invention is indicated.
  • the substance binding to Ngal additionally carries a cytotoxic and / or immunostimulating component. This ultimately leads to the fact that almost exclusively tumor cells are killed, either by the cytotoxicity or by attack by the stimulated immune system, while normal cells are practically completely preserved in the tissue.
  • the binding substance itself does not have to have an inhibitory effect on Ngal-, since the binding substance then only has to function as a marker which carries the components to target tumor cells. If a cytotoxic and / or immunostimulating component is used, it will be particularly recommended if the pharmaceutical composition is prepared for local application in tissue containing tumor cells, for example for injection.
  • Ngal protein in a screening process for the determination of the secretion of Ngal-modulating substances.
  • This can be done, for example, in such a way that Ngal-expressing cells, in particular Ngal-expressing tumor cells of the tumor types mentioned, are cultivated in a medium, with incubation before or during the cultivation with a prospective secretion-inhibiting substance or with a mixture of such substances the medium is analyzed for Ngal after a defined cultivation period, optionally after the medium has been separated from the cells, and the substance, if appropriate after deconvolution, is selected if the amount of Ngal detected in the medium falls below a defined limit value.
  • the actual secretion path is irrelevant, since only the secretion as such is the selection criterion.
  • the defined limit can be determined by culturing under the same conditions, but without incubation with a prospective substance that inhibits secretion.
  • a secretion rate which is at least 10%, preferably at least 50%, most preferably at least 90%, below the reference secretion rate can be used as the selection criterion.
  • Ngal protein in a screening method for finding a Ngal-inhibiting but not its secretion-inhibiting substance, wherein Ngal-expressing cells are cultivated in a medium, before or during the cultivation with a substance selected according to claim 3 or with a mixture such substances is incubated, the medium being analyzed for Ngal after a defined cultivation period, optionally after separation of the medium from the cells, and the substance being selected, if appropriate after deconvolution, if the amount of Ngal detected in the medium is a defined one Limit exceeded.
  • the above statements apply analogously to further training.
  • This embodiment of the invention is based on the finding that secreted Ngal induces apoptosis in at least some immune cells which play a role in tumor defense.
  • Ngal has a paracrine effect.
  • secreted Ngal also has an autocrine effect on the proliferation of tumor cells, ie proliferation is induced by secreted Ngal.
  • the secretion of Ngal consequently has an undesirable synergistic effect, namely on the one hand promoting proliferation in the case of tumor cells and on the other hand inducing apoptosis in immune cells which attack tumor cells.
  • two therapeutic approaches follow from this, namely: i) inhibition of Ngal in the tumor cells themselves, which ultimately also prevents secretion or only inactive Ngal is secreted, and / or ii) inhibition of secreted Ngal, ie outside the tumor cells, which on the one hand results in a Induction of the proliferation of the tumor cells does not occur and, on the other hand, the immune cells attacking the tumor cells are protected against Ngal-induced apoptosis.
  • the active ingredient must be membrane permeant, ii) inhibit the Secre ⁇ tion of Ngal; such an active ingredient does not necessarily (but can also) reach into the intracellular Ngal Formation, but inhibits the membrane passage formed Ngal ⁇ , iii) inhibition of predominantly or exclusively extracellular Ngal; such an active ingredient is not or only poorly permeable to membranes (eg antibodies).
  • the natural immune response to the tumor is (re-) activated.
  • tumor cells e.g. human ovarian tumor samples
  • tumor cells e.g. human ovarian tumor samples
  • granulocytes and transfected insect cells secrete both the monomer and a dimer.
  • this can be used diagnostically for the detection of tumor cells, namely by detecting the secretion predominantly or exclusively as a monomer.
  • therapeutic use can take place in that, for example, a di erization, as a homo- or as a heterodimer, is induced, the dimer thus induced being biologically inactive or inactivated.
  • Ngal is used for all human isoforms, known or new, based on nucleic acids or amino acids.
  • Be ⁇ interfered with comprises are also disclosed in the context of this description, short sequences which originate from the isoforms, for example, immunization sequences. Further comprising also includes homologues, wherein the homologated ⁇ energy at least 80%, preferably more than 90%, most preferably more than 95%.
  • nucleic acid sequences complementary or allelic variants are also included.
  • sequences are included which only represent partial sequences of the explicitly open sequences, for example one exon or several exons, or sequences complementary thereto, with the proviso that, in the case of the nucleic acids, these partial sequences are of sufficient length for hybridization with a nucleic acid according to the invention, have at least 50 bases and, in the case of the proteins or peptides, bind to a protein- or peptide-specific target molecule with at least the same affinity.
  • all nucleic acids hybridizing with nucleic acids according to the invention are included, namely those which are under stringent conditions (for example 5 ° C. to 25 ° C.
  • the invention also includes expression cassettes, ie one or more of the nucleic acid sequences according to the invention with at least one control or regulatory sequence.
  • Such an expression cassette can also comprise a sequence for a known protein, a fusion protein being formed in the course of the translation from a known protein and a protein or peptide according to the invention.
  • Antisense sequences to the above nucleic acid sequences are also included.
  • RNA as well as correlating DNA and vice versa are included, as are genomic DNA as well as correlated cDNA and vice versa.
  • Ngal include nucleic acids or proteins or
  • peptides also include partial sequences thereof, with a minimum length of 12 nucleotides, preferably 30 to 90 nucleotides, in the case of the nucleic acids and a minimum length of 4 amino acids, preferably 10 to 30 amino acids , in the case of peptides or proteins.
  • the terms of detection and / or treatment of tumor diseases also include the detection and / or treatment of metastases from primary tumors in other tissues.
  • treatment also includes prophylaxis.
  • An inhibitor is a compound or substance which either inhibits the formation of Ngal or reduces the activity of Ngal formed, based on the Ngal activity in the absence of the inhibitor.
  • an inhibitor can be a substance that interferes with the Ngal cascade.
  • an inhibitor can be a substance which binds with the Ngal formed, in such a way that further physiological interactions with endogenous substances are at least reduced.
  • Mimicry molecules are compounds that simulate the variable region, in particular the binding region of an antibody, and bind to a target molecule in the same place as the underlying antibody.
  • antibody includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, non-human, human and Humanized antibodies, as well as phage display antibodies, but also chimeric antibodies and anti-idiotypic antibodies, as well as specific fragments of the light and / or heavy chain of the variable region of the underlying antibodies of the above type.
  • the production or production of such antibodies with predetermined immunogens is accordingly Average specialist well familiar and need not be explained in more detail.
  • the term antibody also includes bispecific antibodies. Bispecific antibodies combine a defined immune cell activity with a specific tumor cell recognition, whereby tumor cells are killed.
  • a bispecific antibody binds on the one hand to a trigger molecule of the immune effector cell (eg CD3, CD16, CD64) and on the other hand to antigens of the tumor target cell.
  • a trigger molecule of the immune effector cell eg CD3, CD16, CD64
  • Counter ions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable "solutions (IV, IP, IM) and preparations with protracted release of active ingredient, in the production of which conventional auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavorings, sweeteners and solubilizers are used.
  • the auxiliaries are magnesium carbonate, titanium dioxide, lactose, mannitol and other sugars, talc, milk protein, Gela ⁇ tine, starch, cellulose and its derivatives, animal and vegetable oils such as cod liver oil, sunflower, peanut or sesame oil, polyethylene glycols and solvents such as sterile water and mono- or polyhydric alcohols, for example glycerin.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be produced by mixing at least one Ngal inhibitor according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carrier and, if appropriate, other suitable active substances, additives or auxiliaries with a defined inhibitor dose and preparing the desired dosage form.
  • Tumor cells express Ngal differentially if normal cells of the same tissue type do not express it. Tumor cells overexpress Ngal specifically or differentially if Ngal is expressed at least twice as much as normal cells of the same tissue.
  • Cytotoxic components or groups are compounds which directly or indirectly induce apoptosis or lead to necrosis or at least inhibit growth.
  • radioisotopes for example 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu
  • such groups or compounds can in particular be cytostatics which are used in tumor therapy.
  • Alkylant 'ien eg mechlorethamine, ifosfamide, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, alkyl, busulphan, nitrosoureas, carmustine,' lomustine, ustin Se, triazenes, dacarbazine
  • antimetabolites eg, folic acid antagonists, methotrexate , Pyrimidine analogs, fluorouracil, fluoro-esoxyuridine, cytarabine, gemcitabine, purine analogs, mercapturin
  • mitosis inhibitors e.g.
  • Antibiotics e.g. Dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, anthracycline, bleomycin, L-asparaginase
  • platinum complex compounds e.g. cisplatin
  • hormones and related compounds e.g. adrenal cortex steroids, aminogluthetimide, gestagens, estrogens, androgens, anti-estrogens, danalotoxins, tamoxifen, tamoxifen).
  • the coupling takes place in such a way that the affinity for ngal is reduced by no more than 90%, preferably 50%, based on the substance without a cytostatic group, and the cytostatic effect of the group is not reduced by more than 90%, preferably 50%, based on the compound without substance.
  • An immunostimulating component is usually a protein or an effective component thereof, which stimulates cells of the immune system.
  • cytokines such as M-CSF, GM-CSF, G-CSF, interferons, such as IFN-alpha, -beta, -ga ma, interleukins such as IL-1 to -16 (except -8), human LIF, Cher ⁇ okines such as Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 and IL-8.
  • a reporter group is an atom, molecule or a compound which, in conjunction with an assay based thereon, enables the detection of the reporter group and the compound or substance thus connected to the reporter group.
  • reporter groups and associated detection methods are: 32P labeling and intensity measurement using phosphoimager. Many other examples are known to the person skilled in the art and do not need to be listed in detail.
  • a substance that binds to Ngal can be a substance that binds a Ngal protein or a Ngal RNA.
  • Definitions expanded in the context of the above definition in relation to the narrow sense of the word also include the specific terms in the narrow sense of the word.
  • the indications breast cancer or ovarian cancer can be excluded in certain contexts, particularly in the case of sequence identity of partial sequences.
  • FIG. 1 Cancer profiling array for overexpression in uterine tumor tissue
  • FIG. 3 various hammerhead ribozymes against Ngal
  • FIG. 4 various antisense RNA against Ngal
  • FIG. 5 inhibitory RNA (RNAi) against Ngal
  • Figure 6 Ngal sequences, amino acid sequence (SEQ ID 1, 6a) with suitable labeling Immunization sequences (SEQ ID 3 and 4) and nucleic acid sequence (SEQ ID 2),
  • Figure 7 Western blot of lysates and cell culture supernatants expressing different Ngal
  • FIG. 8 immunohistochemical detection of 2 uterine carcinomas
  • Figure 9 Proliferation assay in a colon tumor line.
  • Example 1 Ngal overexpression in uterine tumor tissue.
  • the Ngal coding sequence was labeled with 32P by random hexamer priming and onto a cancer profiling array from Clontech, which contains 240 cDNA library pairs, each pair for one tumor and one
  • FIG. 1 A patient's normal tissue stands. The results are shown in FIG. 1. It can be seen that overexpression takes place in uterine tumor tissue compared to normal tissue. This finding is quantified in FIG. 2. Accordingly, 56% (25 out of 44) of the pairs of uterine tissue examined show an at least 2-fold overexpression of Ngal.
  • an anti-Ngal antibody in vivo (Mouse model).
  • An anti-Ngal antibody is labeled with a marker molecule (e.g. radioisotope).
  • a marker molecule e.g. radioisotope
  • 1-2 * 10 ⁇ 6 Ngal-transfected human cells are transplanted into NMRI nude mice. 30 days after the transplant, labeled antibodies are injected into the mice. The control animals are treated with an irrelevant antibody. A few hours after application of the antibody, the animals are sacrificed and tissue sections are made from all organs. These sections are examined for the presence of labeled anti-Ngal 7 antibody.
  • the anti-Ngal antibodies are polyclonal or monoclonal antibodies against human Ngal protein, by cDNA immunization or conjugated with a carrier protein, grown in rat or rabbit and affinity-purified.
  • Suitable immunization sequences are shown in FIG. 6a and the sequences SEQ ID 3 and 4.
  • the full-length cDNA (FIG. 6b) can also be used.
  • Example 3 In the unhistochemical detection of tumor cells.
  • FIGS. 8a, b show results with anti-Ngal antibodies from the rat in two uterine carcinomas (paraffin sections). Sections with anti-Ngal antibodies are shown below, while the negative controls assigned above are shown with a staining with pre-immune serum from the rat.
  • FIG. 3 shows various hammerhead ribocytes which cut Ngal at the points shown and thus inhibit or at least reduce the activity of any translation products (SEQ ID 5 and "6; Hammerhead).
  • FIG. 4 shows various antisense sequences for Ngal RNA (SEQ ID 7 and 8).
  • FIG. 5 shows a PCR product for the generation of Ngal-specific, double-stranded RNAi.
  • PCR primers for the generation of RNAi samples are shown in bold. In capital letters is a T7 RNA polymerase Promoter and lower case letters a Ngal-specific nucleotide sequence shown.
  • Example 6 Proliferation assay on a colon tumor cell line.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verwendungen von Ngal zur Diagnose und Behandlung von Krebs sowie zum Screenen nach Substan­zen für solche Zwecke.

Description

Verwendungen von an Ngal bindenden Substanzen zur Diagnose und Behandlung von Krebserkrankungen.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue Verwendungen von Ngal oder daraus abgeleiteten Sequenzen zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, sowie die Verwendung von an Ngal bin- denden Substanzen zur Diagnose und/oder Behandlung von Tumor-Erkrankunge .
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Ngal, auch Lipocalin-2 (LCN2) genannt, ist ein Protein, welches in den Granulozyten mit der neutrophilen Gelatinase assoziiert ist (L. Kjeldsen et al . , J Biol Chem, 268:10432-10432 (1993) und weist ein Molekulargewicht von ca. 25 kD auf. Es wird vermutet, daß Ngal auf inflammato- rische Reaktionen modulierend wirkt und an kleine lipo- phile Moleküle und Formylpeptide (frαlp) , welche von Bakterien abgeleitet sind, bindet. Letzteres konnte allerdings von einer anderen Gruppe experimentell nicht bestätigt werden (D.H. Goetz et al . , Biochemistry, 39:1935-1945 (2000) ) .
Ngal wurde durch Sreenen einer humanen Genombibliothek mit Ngal cDNA als ein Gen mit 7 Exons identifiziert (J.B. Cow- land et al . , Geno ics 45:17-23 (1997)). Das primäre Tran¬ skript hat eine Länge von 3696 Nukleotiden und das prozessierte Transkript ist 809 Nukleotide lang. In der Literaturstelle L. Kjeldsen et al . , (2000) ist Expression von Ngal in verschiedensten humanen Normalgeweben beschrieben worden. Ngal liegt auf Chromosom 9q34 (P. Chan et al., Genomics 23:145-150 (1994)). Klonierung und Expression humaner Ngal cDNA, welche aus Knochenmark und Ovar Zelllinien stammt, ist in der Literaturstelle S. Bartsch et al . , FEBS Lett 9:255-259 (1995), beschrieben.
Hohe Ngal Pegel wurden in Adenocarcinomen der Lunge, des Dickdarms und des Pankreas gefunden. Dagegen sind Ngal Pegel in Renalzellcarzino a verschiedener Subtypen und Prostatatumoren niedrig. Lymphoma und Thymustumore waren in immunhistochemischen Versuchen Ngal-negativ (A. Friedl et al., The Histoche ical Journal 31:433-441 (1999). Gemäß der Literaturstellen US-5, 627, 034, US-5,773,290 und US-5, 846, 739 und US-A-726725 ist die Proliferation von Brustkrebszellen mit Ngal Überexpression korreliert. Ein Zusammenhang mit Ovartumor ist in der Literaturstelle O-99/53040 offenbart.
Erkenntnisse aus gepaarten Tumor-/Normalgeweben sind für andere Krebsarten nicht bekannt.
Krebs, insbesondere Ovar-, Kolon-, Lungen- und Uteruskrebs ist eine mit zunehmendem Alter mit beachtlicher Incidenz auftretende Erkrankung. Bislang wird diese Tumorerkrankung im wesentlichen pathologisch diagnostiziert und meist durch Entfernung behandelt. Die Entfernung von Organen hat verschiedene nachteilige Effekte auf einen Patienten. Eine verbesserte Diagnose und Behandlung dieser Krebsart, ins- besondere ohne das Erfordernis einer Entfernung des Orga- nes, ist daher in hohe Maße wünschenswert. Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, phar- rαazeutische Zusammensetzungen zur Diagnose und/oder zur Behandlung von Krebserkrankungen anzugeben sowie Mittel zu deren Identifizierung.
Grundzüge der Erfindung sowie bevorzugte Ausführungsbeispiele.
Die Erfindung lehrt die Verwendung einer für Ngal codierenden Nukleinsäure und/oder eines Ngal Peptids oder Pro- teins zur Detektion von Krebs, insbesondere von Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Krebs, insbesondere von Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, wobei eine Gewebeprobe (des betreffenden Gewebes) auf Übertranskrip- tion von Ngal RNA oder auf Überexpression eines Ngal Proteins untersucht wird. Eine an für Ngal codierende Nukleinsäure oder eine an Ngal Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, kann verwendet werden, wobei Bindung • besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird.
Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung einer Ngal RNA oder eines Ngal Proteing oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekon- volutierung, als zur Detektion und/oder Behandlung von Krebs, insbesondere von Ovar- Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, geeignet selektiert wird.
Die Erfindung lehrt schließlich die Verwendung einer Ngal inhibierenden oder daran bindenden Subtanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, insbesondere von Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs. Die Substanz kann ein Antikörper sein, welcher beispielsweise durch Immunisierung eines nichtmenschlichen Säugetiers mit einem Ngal Peptid oder Protein, oder mit Ngal cDNA, oder mit mit cDNA von Ngal tran- sient oder stabil transfizierten Zellen (z.B. Tumorzelllinien, NIH3T3, CHO, COS) , oder mit endogen Ngal expri ierenden Tumorzellen oder mit in Insektenzellen hergestelltem Ngal erhältlich ist, oder ein Phage-Display Antikörper ist.
Die Substanz kann aber auch eine Mimikriverbindung eines Antikörpers gegen ein Ngal Peptid oder Protein sein. Die Substanz kann schließlich ein Aptamer, eine antisense RNA, eine inhibitorische RNAi, oder ein Ribozym sein. Die Substanz kann zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente tragen. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann zur systemischen oder lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet sein. Die Erfindung läßt sich im Rahmen eines Verfahrens zur Diagnose einer Krebserkrankung, insbesondere von Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, verwenden, wobei eine Detektorsubstanz in einer Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detek- tionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird, sowie eines Verfahrens zur Behandlung einer Krebserkrankung, insbesondere von Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, wobei eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Ngal, überex- pri iert ist bzw. differenziell exprimiert wird in Tumoren, i.e. in besagten Tumorgeweben ist die Expression höher, verglichen mit (gepaarten) normalen Zellen gleichen Gewebes, und der daraus herleitbaren technische Lehre, daß Ngal als Zielmolekül bei der Diagnostik und Therapie dieser Erkrankung eingesetzt werden kann. Ngal kann also als Marker zur Identifizierung von Tumorzellen in den besagten Tumorgeweben dienen. Auf der anderen Seite bietet die Inhibierung von Ngal, insbesondere auch bei lokaler Applikation, die Möglichkeit, in die Tumor-spezifischen Ngal Assoziationen mit anderen Prozessen in den Tumorzellen einzugreifen und somit letztendlich den tumorzellenspezi- fisch veränderten Stoffwechsel zu stören und zu einem Absterben oder zumindest einer Wachstumshemmung der Tumorzellen beizutragen. Im Rahmen der Erfindung kann es sich empfehlen, im Vorfeld einer Behandlung mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eine Probe aus einem Gewebe, welches als Tumorgewebe mit anderen Methoden identifiziert ist, zu entnehmen und die Gewebeprobe auf Expression bzw. Überexpression von Ngal zu untersuchen. Alternativ kann mit einer erfindungsgemäßen Detektorsubstanz zur Diagnose in vivo auf Ngal Abhängigkeit getestet werden. Wird eine Expression bzw. Überexpression von Ngal gegenüber Normal- gewebe gleichen Typs festgestellt, so ist die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung indiziert .
Handelt es sich bei dem Tumor um einem Typus, bei welchem Tumorzellen Ngal exprimieren, Normalzellen gleichen Gewebetyps jedoch nicht, so ist es besonders bevorzugt, wenn die an Ngal bindende Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente trägt. Dies führt dann letztendlich dazu, dass praktisch ausschließlich Tu- morzellen getötet werden, sei es durch die Zytotoxizität, sei es durch Angriff durch das stimulierte Immunsystem, während Normalzellen in dem Gewebe praktisch vollständig erhalten bleiben. In dieser Ausführungsform braucht die bindende Substanz selbst nicht inhibierend auf Ngal- zu wirken, da die bindende Substanz dann lediglich als Marker funktionieren muß, welcher die Komponenten zu Ziel- Tumorzellen trägt. Im Falle des Einsatzes einer zytotox- ischen und/oder immunstimulierenden Komponente wird es sich besonders empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusam- mensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist, beispielsweise zur Inj ektion. Von selbstständiger Bedeutung im Rahmen der Erfindung ist eine Verwendung eines Ngal Proteins in einem Screening Verfahren zur Findung von die Sekretion von Ngal modulierenden Substanzen. Dies kann beispielsweise dergestalt er- folgen, daß Ngal exprimierende Zellen, insbesondere Ngal exprimierende Tumorzellen der genannten Tumorarten, in einem Medium kultiviert werden, wobei vor oder während der Kultivierung mit einer prospektiven, die Sekretion inhibierende Substanz oder mit einer Mischung solcher Sub- stanzen inkubiert wird, wobei das Medium nach einer definierten Kultivierungsdauer auf Ngal analysiert wird, optional nach Abtrennung des Mediums von den Zellen, und wobei die Substanz, ggf. nach Dekonvolution, selektiert wird, wenn die Menge detektierten Ngal im Medium einen definierten Grenzwert unterschreitet. Bei dieser Ausführungsform ist der tatsächliche Sekretionsweg irrelevant, da nur die Sekretion als solche das Selektionskriterium ist. Der definierte Grenzwert kann durch Kultivierung unter gleichen Bedingungen, jedoch ohne Inkubation mit einer prospektiven, die Sekretion inhibierenden Substanz, ermittelt werden. Als Selektionskriterium kann eine Sekretionsrate angesetzt werden, welche zumindest 10%, vorzugsweise zumindest 50%, höchstvorzugsweise zumindest 90%, unterhalb der Referenz-Sekretionsrate liegt.
Von weiterhin selbstständiger Bedeutung ist die alternative Verwendung eines Ngal Proteins in einem Screening Verfahren zur Findung einer Ngal inhibierenden aber nicht dessen Sekretion inhibierenden Substanz, wobei Ngal exprimierende Zellen in einem Medium kultiviert werden, wobei vor oder während der Kultivierung mit einer gemäß Anspruch 3 selektierten Substanz oder mit einer Mischung solcher Substanzen inkubiert wird, wobei das Medium nach einer definierten Kultivierungsdauer auf Ngal analysiert wird, optional nach Abtrennung des Mediums von den Zellen, und wobei die Substanz, ggf. nach Dekonvolution, selek- tiert wird, wenn die Menge detektierten Ngal im Medium einen definierten Grenzwert überschreitet. Zu weiteren Ausbildungen gelten die vorstehenden Ausführungen analog.
Diese Ausführungsform der Erfindung beruht auf der Erk- enntnis, daß sezerniertes Ngal in zumindest einigen Immunzellen, welche bei der Tumorabwehr eine Rolle spielen, Apoptose induziert. Insoweit hat Ngal parakrine Wirkung. Sezerniertes Ngal hat bezüglich der Proliferation von Tumorzellen jedoch auch autokrine Wirkung, i.e. Prolifera- tion wird durch sekretiertes Ngal induziert. Die Sekretion von Ngal hat folglich eine unerwünschten synergistischen Effekt, nämlich einerseits Proliferationsförderung im Falle der Tumorzellen und andererseits Induktion der Apoptose in Immunzellen, die Tumorzellen angreifen. Hieraus folgen grundsätzlich zwei therapeutische Ansätze, nämlich: i) Inhibierung von Ngal in den Tumorzellen selbst, wodurch letztlich auch die Sekretion unterbleibt oder nur inaktives Ngal sekretiert wird, und/oder ii) Inhibierung von sekretiertem Ngal, i.e. außerhalb der Tumorzellen, wodurch einerseits eine Induktion der Proliferation der Tumorzellen unterbleibt und andererseits die die Tumorzellen angreifenden Immunzellen vor Ngal induzierter Apoptose geschützt werden. Es ergeben sich somit potentielle Wirkstofe mit den folgenden Grundeigenschaften: i) In- hibierung von Ngal in der Tumorzelle; hierfür muß der Wirkstoff membrangängig sein, ii) Inhibierung der Sekre¬ tion von Ngal; ein solcher Wirkstoff greift nicht not¬ wendigerweise (kann aber auch) in die intrazelluläre Ngal Bildung ein, sondern inhibiert den Membrandurchtritt gebildeten Ngalε, iii) Inhibierung von vorwiegend oder ausschließlich extrazellulären Ngal; ein solcher Wirkstoff ist nicht oder nur schlecht membrangängig (z.B. Antikör- per) . Letztendlich erfolgt somit neben der Inhibierung der pro-proliferativen Wirkung des Ngal auf Tumorzellen auch eine (Re-) Aktivierung der natürlichen Immunantwort auf den Tumor.
Im Rahmen der Erfindung ist auch gefunden worden, daß Tumorzellen (z.B. humane Ovartumorproben) praktisch ausschließlich Ngal in monomerer Form sezernieren, während beispielsweise Granulozyten und transfizierte Insektenzellen sowohl das Monomer als auch ein Dimer sezernieren. Dies kann einerseits diagnostisch genutzt werden zum Nachweis von Tumorzellen und zwar durch Nachweis der Sezern- ierung überwiegend oder ausschließlich als Monomer. Des weiteren kann eine therapeutische Nutzung dadurch erfolgen, daß beispielsweise eine Di erisierung, als Homo- oder als Heterodimer, induziert wird, wobei das so induzierte Dimer biologisch inaktiv bzw. inaktiviert ist.
Definitionen.
Im Rahmen dieser Beschreibung wird die Bezeichnung Ngal für alle humanen Isoformen, bekannt oder neu, auf Nukleinsäuren- oder Aminosäurenbasis, verwendet. Mit diesen Be¬ griffen mit umfaßt sind auch die im Rahmen dieser Beschreibung offenbarten kurzen Sequenzen, welche aus den Isoformen stammen, beispielsweise Immunisierungssequenzen. Weiterhin mit umfaßt sind auch Homologe, wobei die Homolo¬ gie zumindest 80%, vorzugsweise mehr als 90%, höchstvorzugsweise mehr als 95%, beträgt. Im Falle der Nukleinsäuresequenzen sind auch komplementäre oder al- lelische Varianten mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen der explizit offen- harten Sequenzen, beispielsweise ein Exon oder mehrere Exons, oder komplementärer Sequenzen hierzu darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende Länge, zumindest 50 Basen, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide mit zumindest gleicher Affinität an ein protein- oder pep- tidspezifisches Zielmolekül binden. Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfaßt, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (z.B. 5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al . , A labo- ratory anual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expres- sionskassetten umfaßt, i.e. eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen umfaßt. Schließlich sind RNA sowie damit korrelierende DNA und umgekehrt umfaßt, ebenso wie geno- mische DNA als auch korrelierte cDNA und umgekehrt.
Im Zusammenhang mit erfindungsge äßen Verwendungen umfassen die Begriffe der Ngal Nukleinsäuren oder Proteine bzw. Peptide neben den Volllängen der offenbarten Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen hieraus, und zwar mit einer Mindestlänge von 12 Nukleotiden, vorzugsweise 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der Nuklein- säuren und einer Mindestlänge von 4 Aminosäuren, vorzugsweise 10 bis 30 Aminosäuren, im Falle der Peptide oder Proteine.
Die Begriffe der Detektion und/oder der Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere der angegebenen Tu- morarten, umfassen auch die Detektion und/oder Behandlung von Metastasen aus Primärtumoren in sonstigen Geweben. Der Begriff der Behandlung umfaßt auch die Prophylaxe.
Als Inhibitor ist eine Verbindung oder Substanz bezeichnet, welche entweder die Bildung von Ngal inhibiert oder gebildetes Ngal in der Aktivität reduziert, bezogen auf die Ngal Aktivität in Abwesenheit des Inhibitors. Insofern kann ein Inhibitor einerseits eine Substanz sein, welche in der Entstehungskaskade von Ngal inhibierend eingreift. Auf der anderen Seite kann ein Inhibitor eine Substanz sein, welche mit gebildetem Ngal eine Bindung eingeht, und zwar dergestalt, dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen Substanzen zumindest reduziert sind.
Mimikry-Moleküle sind Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bindungsbereich eines Antikörpers, nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmoleküls binden, wie der zu Grunde liegende Antikörper.
Der Begriff der Antikörper umfaßt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, nicht-humane, humane und humanisierte Antikörper, sowie Phage-Display-Antikörper, aber auch chimäre Antikörper und antiidiotypische Antikörper sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu werden. Weiterhin umfaßt der Begriff der Antikörper bispezifische Antikörper. Bispezifische Antikörper kombinieren eine definierte Immunzellaktivität mit einer spezifischen Tumorzellerkennung, wodurch Tumorzellen getötet werden. Ein bispezifischer Antikörper bindet einerseits an ein Auslösemolekül der Immun- Effektorzelle (z.B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an Antigene der Tumorzielzelle.
Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium infrage. Geeigente feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder inj izierbare" Lösun- gen (i.V., i.p., i.m.) sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxyd, Lac- tose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gela¬ tine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Ngal Inhibitor in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.
Tumorzellen exprimieren Ngal differenziell, wenn Normalzellen des gleichen Gewebetyps dieses nicht exprimieren. Tumorzellen überexprimieren Ngal spezifisch bzw. differen- ziell, wenn Ngal im Vergleich zu Normalzellen des gleichen Gewebes zumindest in doppelter Menge exprimiert wird.
Zytotoxische Komponenten bzw. Gruppen sind Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten bzw. zu Nekrose führen oder zumindest wachstumshemmend wirken. Solche Gruppen bzw. Verbindungen können neben Radioisotopen (z.B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu) insbesondere Zytostatika sein, welche in der Tumortherapie eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind: Alkylant'ien (z.B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil, Cyclophos- phamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitroso- harnstoffe, Carmustin, ' Lomustin, Se ustin, Triazene, Dacarbazin) , Antimetaboliten (z.B. Folsäure-Antagonisten, Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluord- esoxyuridin, Cytarabin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercap- topurin) , Mitosehemmer (z.B. Vincaalkaloide, Voncristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel, Protaxel) , Epipodophyl- lotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid) , Antibiotika (z.B. Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L-Asparaginase) , Platinkomplexverbindungen (z.B. Cisplatin) , Hormone und verwandte Verbindungen (z.B. Nebennierenrindensteroide, Aminogluthetimid, Gestagene, Östrogene, Androgene, Antiöstrogene, Tamoxifen, Sterio- danaloga, Fluta id) . Bei Bindung einer solchen Verbindung mit einer an ngal bindenden Substanz erfolgt die Kopplung dergestalt, daß die Affinität zu ngal um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Substanz ohne zyto- statische Gruppe, reduziert ist und die zytostatische Wirkung der Gruppe um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Verbindung ohne Substanz, reduziert ist .
Eine immunstimulierende Komponente ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Interferone, wie IFN-alpha, -beta, -ga ma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Cherαokine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8.
Eine Reportergruppe ist ein Atom, Molekül oder eine Verbindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestell- ten Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labeling und Intensitätsmessung mittels Phosphoimager . Viele weitere Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und bedürfen nicht der detaillierten Aufzählung. Eine an Ngal bindende Substanz kann eine Substanz sein, welche ein Ngal Protein oder eine Ngal RNA bindet.
Im Rahmen der vorstehenden Definition gegenüber dem engen Wortsinn erweiterte Begriffsbestimmungen umfassen auch die bestimmten Begriffe im engen Wortsinn.
Optional können die Indikationen Brustkrebs oder Ovarkrebs in bestimmten Zusammenhängen, insbesondere im Falle von Sequenzidentität von Teilsequenzen, insoweit ausgeschlossen sein.
Beispiele.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich beovrzugte Ausführungsformen darstellenden Beispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1: Cancer profiling array zur Überexpression in Uterustumorgewebe,
Figur 2 : Quantitative Auswertung zum Gegenstand der Figur
1,
Figur 3: verschiedene Hammerhead Ribozyme gegen Ngal,
Figur 4: verschiedene antisense RNA gegen Ngal,
Figur 5: inhibitorische RNA (RNAi) gegen Ngal,
Figur 6: Ngal-Sequenzen, Aminosäurensequenz (Seq.-ID 1, 6a) mit Markierung geeigneter Immunisierungssequenzen (Seq.-ID 3 und 4) und Nukleinsäuresequenz (Seq.-ID 2),
Figur 7: Western Blot von Lysaten und Zellkulturüber- ständen verschiedener Ngal exprimierender
Zelllinien,
Figur 8: immunhistochemischer Nachweis von 2 Uteruskarzi- nomen, und
Figur 9: Proliferationsassay in einer Kolontumorzeillinie.
Beispiel 1: Ngal Überexpression in Uterustumorgewebe.
Die Ngal Codierungssequenz wurde mit 32P durch random hex- amer priming gelabelt und und auf ein cancer profiling array von Clontech, welches 240 cDNA Bibliothekspaare en- thält, wobei jedes Paar für jeweils ein Tumor- und ein
Normalgewebe eines Patienten steht. Die Ergebnisse sind in der Figur 1 gezeigt. Man erkennt, daß ein Überexpression in Uterustumorgewebe, verglichen mit Normalgewebe, stattfindet. Dieser Befund ist quantifiziert in der' Figur 2. Demach zeigen 56% (25 aus 44) der untersuchten Uterusgewebepaare eine zumindest 2-fache Überexpression von Ngal.
Beispiel 2: Nachweis von Ngal mittels Antikörpern
In diesem Beispiel wird die Markierung eines Tumors bzw. seiner Metastasen durch einen anti-Ngal-Antikörper in vivo (Mausmodell) beschrieben. Ein anti-Ngal-Antikörper wird mit einem Markermolekül (z. B. Radioisotop) markiert. In NMRI-Nacktmäuse werden 1-2*10Λ6 Ngal-transfizierte humane Zellen transplantiert . 30 Tage nach der Transplantation , wird den Mäuse markierter Antikörper injiziert. Die Kontrolltiere werden mit einem nicht relevanten Antikörper behandelt. Wenige Stunden nach der 7λntikörperapplikation werden die Tiere getötet und aus allen Organen Gewebeschnitte angefertigt. Diese Schnitte werden auf die Gegenwart von markiertem anti-Ngal 7Λntikörper untersucht.
Bei den anti-Ngal Antikörpern handelt es sich um polyklon- ale oder monoklonale Antikörper gegen humanes Ngal Protein, durch cDNA-Immunisierung oder konjugiert mit einem Trägerprotein, in Ratte oder Kaninchen gezogen und affinitätsgereinigt .
Geeignete Immunisierungssequenzen sind in der Figur 6a sowie den Sequenzen Seq.-ID 3 und 4 angegeben. Auch kann mit der Vollängen cDNA (Fig. 6b) gearbeitet werden.
Beispiel 3: Im unhistochemischer Nachweis von Tumorzellen.
Primäre Tumoren werden aus den Patienten mit Uterus- und/ oder Ovartumoren isoliert und als Paraffin bzw. Gefrierschnitte präpariert. Diese Schnitte werden mit einem anti- Ngal-Antikörper auf die Überexpression von Ngal in Tumorzellen untersucht. Die i munhistologische Untersuchung mit dem Ngal-Antikörper zeigt höhere Expression von Ngal in den Tumorzellen im Vergleich zu umliegenden Normal¬ gewebe. Die Untersuchung erfolgt im Einzelnen durch Inkubation mit dem anti-Ngal Antikörper als primärem Antikörper aus Kaninchen oder Ratte, einem biotinyliertem sekundären anti-Kaninchen oder anti-Ratten Antikörper und einer Streptavidin-gekoppelten Meerrettichperoxidase . Die Färbung erfolgt mit mit AEC als chromogenen Substrat (rote Färbung) . Die Gegenfärbung erfolgt mit Hemalaun-Lösung (blaue Färbung) . Es sind maligne und nichtmaligne Zellen unterscheidbar, wobei die malignen Zellen eine starke Färbung, i.e. hohen Ngal Gehalt, aufweisen, während die nichtmalignen Zellen nur moderat gefärbt sind.
In den Figuren 8a, b sind Ergebnisse mit anti-Ngal Antikörpern aus der Ratte in zwei Uteruskarzinomen (Paraffinschnitte) dargestellt. Jeweils unten sind Schnitte mit anti-Ngal Antikörpern zu sehen, während jeweils oben zugeordnete Negativkontrollen mit einer Färbung mit Prä- Immunserum aus der Ratte dargestellt sind.
Beispiel 4: RNA-Inhibitoren
In der Figur 3 sind verschiedene Hammerhead Ribozy e dargestellt, die Ngal an den dargestellten Stellen schneiden und so die Aktivität eventueller Translationsprodukte inhibieren oder zumindest reduzieren (Seq.-ID 5 und" 6; Hammerhead) .
Die Figur 4 zeigt verschiedene antisense Sequenzen für Ngal RNA (Seq.-ID 7 und 8) .
Figur 5 zeigt ein PCR-Produkt für die Generierung von Ngal-Spezifischen, doppelsträngigen RNAi . In Fettdruck sind PCR-Primer für die Generierung von RNAi Proben dargestellt. In Großbuchstaben ist ein T7 RNA-Polymerase Promotor und Kleinbuchstaben eine Ngal-spezifische Nuk- leotidsequenz dargestellt.
Beispiel 5: Sekretion von Ngal
Es wurden Kolontumorzellinien (HT29) und Ovartumorzell- linien (SK0V3 und OV90) in 0,5% FCS-haltigem Zellkulturmedium kultiviert. Nach einer Kultivierungsdauer von 1 Stunde sowie 12 Stunden wurden Kulturüberstände entnommen und mitmeinem Filter aufkonzentriert . Nach einer Proteinbestimmung wurden 16μg/μl Protein / Laufbahn auf ein 12%iges BisTris-Gel aufgetragen. Mit Ngal-spezifischen Antikörpern aus Ratte oder Kaninchen wurde auf dem Blot die 25 kD Bande für Ngal identifiziert. Die Ergebnisse (anti-Ngal Antikörper aus Ratte) sind in der Figur 7 dargestellt (SN = Überstand, lys = Lysat) . Man erkennt, daß in den Überständen der Zelllinien HT29 und SKOV3 eine Anreicherung von Ngal stattgefunden hat. Folglich wird Ngal konstitutiv sezerniert.
Beispiel 6: Proliferationsassay an Kolontumorzelllinie.
Zellen der Kolontumorzelllinie HT29 wurden ohne besondere Zugabe, mit EGF (10 ng/ml) , mit HGF (20 ng/ml) und mit Ngal (= otll5) in Konzentrationen von 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, oder 200 ng/ml für 72 h inkubiert. Die Proliferation wurde mittels des MTT Assays bestimmt. Dieser As- say beruht auf der Reduktion von Tetrazoliumsalz zu Formazan in metabolisch aktiven Zellen. Die Auswertung erfolgte photometrisch. Man erkennt, daß Ngal eine mit EGF oder HGF vergleichbare Wirkung zeigt, i.e. daß extrazellulär vorliegendes Ngal die Proliferation der Tumorzellen fördert.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer für Ngal codierenden Nukleinsäure und/oder eines Ngal Peptids oder Proteins zur Detektion von Krebs, insbesondere vom Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Krebs, insbesondere vom Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, wobei eine Gewebeprobe auf Übertranskription von Ngal RNA oder auf Überexpression eines Ngal Proteins untersucht wird.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei eine an für Ngal cod- ierende Nukleinsäure oder eine an Ngal Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, verwendet wird, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird.
3. Verwendung einer Ngal RNA oder eines Ngal Proteins oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter RNA oder besagtem Protein oder Peptid oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter RNA oder besagtem Protein oder Pep- tid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay
Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolu- tierung, selektiert wird. Verwendung einer Ngal inhibierenden oder daran bindenden Substanz, vorzugsweise einer gleichzeitig die Sekrektion von Ngal nicht inhibierenden Substanz, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, insbesondere vom Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz ein Antikörper ist, welcher durch Immunisierung eines nichtmenschlichen Säugetiers mit einem Ngal Peptid oder Protein, oder mit Ngal cDNA, oder mit mit cDNA von Ngal transient oder stabil transfizierten Zellen, insbesondere Tumorzelllinien, NIH3T3, CHO, COS, oder mit endogen Ngal exprimierenden Tumorzellen oder mit in Insektenzellen hergestelltem Ngal erhältlich ist, oder ein Phage- Display Antikörper ist.
6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz eine Mimikriverbindung eines Antikörpers gegen ein Ngal Peptid oder Protein ist.
7. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Substanz, ein Aptamer, eine antisense RNA, oder ein Ribozym ist.
8. Verwendung nach einem der /Ansprüche 4 bis 7, wobei die Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder immunstimulierende Komponente trägt.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 8, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur systemischen oder lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist.
10. Verfahren zur Diagnose einer Krebserkrankung, insbe- sondere vom Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, wobei eine Detektorsubstanz in einer
Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird.
11. Verfahren zur Behandlung einer Krebserkrankung, insbesondere vom Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der /Ansprüche 4 bis 9 in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird.
12. Verwendung eines Ngal Proteins in einem Screening Ver- fahren zur Findung von die Sekretion von Ngal modulierenden Substanzen.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei Ngal exprimierende Zellen in einem Medium kultiviert werden, wobei vor oder während der Kultivierung mit einer prospektiven, die Sekretion inhibierende Substanz oder mit einer Mischung solcher Substanzen inkubiert wird, wobei das Medium nach einer definierten Kultivierungsdauer auf Ngal analysiert wird, optional nach Abtrennung des Mediums von den Zellen, und wobei die Substanz, ggf. nach Dekonvolution, selektiert wird, wenn die Menge detektierten Ngal im Medium einen definierten Grenzwert unterschreitet.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der definierte Grenzwert durch Kultivierung unter gleichen Bedingungen, jedoch ohne Inkubation mit einer prospektiven, die Sekretion inhibierenden Substanz bestimmt wird.
15. Verwendung einer mit einem Verfahren nach einem der
Ansprüche 12 bis 14 selektierten Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, insbesondere von Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs.
16. Verwendung eines Ngal Proteins in einem Screening Verfahren zur Findung einer Ngal inhibierenden aber nicht dessen Sekretion inhibierenden Substanz, wobei Ngal exprimierende Zellen in einem Medium kultiviert wer¬ den, wobei vor oder während der Kultivierung mit einer gemäß Anspruch 3 selektierten Substanz oder mit einer Mischung solcher Substanzen inkubiert wird, wobei das Medium nach einer definierten Kultivierungsdauer auf Ngal analysiert wird, optional nach Abtrennung des Mediums von den Zellen, und wobei die Substanz, ggf. nach Dekonvolution, selektiert wird, wenn die Menge detektierten Ngal im Medium einen definierten Grenzwert überschreitet.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der definierte Grenzwert durch Kultivierung unter gleichen Bedingungen, jedoch ohne Inkubation mit einer prospektiven, die Sekretion inhibierenden Substanz bestimmt wird.
18. Verwendung einer mit einem Verfahren nach einem der Ansprüche 12, 13 oder 14 selektierten Substanz zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, insbesondere von Ovar-, Kolon-, Lungen- und/oder Uteruskrebs.
PCT/DE2003/001986 2002-07-02 2003-06-12 Verwendungen von an ngal bindenden substanzen zur diagnose und behandlung von krebserkrankungen WO2004005540A2 (de)

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