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WO2004080485A1 - 上部消化管疾患の予防・治療剤 - Google Patents

上部消化管疾患の予防・治療剤 Download PDF

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Publication number
WO2004080485A1
WO2004080485A1 PCT/JP2004/003227 JP2004003227W WO2004080485A1 WO 2004080485 A1 WO2004080485 A1 WO 2004080485A1 JP 2004003227 W JP2004003227 W JP 2004003227W WO 2004080485 A1 WO2004080485 A1 WO 2004080485A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
salt
polypeptide
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/003227
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirokazu Matsumoto
Koh Takagi
Masaaki Mori
Original Assignee
Takeda Pharmaceutical Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Pharmaceutical Company filed Critical Takeda Pharmaceutical Company
Priority to US10/548,817 priority Critical patent/US20070042947A1/en
Priority to EP04719631A priority patent/EP1602380A4/en
Publication of WO2004080485A1 publication Critical patent/WO2004080485A1/ja
Priority to US12/214,938 priority patent/US20090227501A1/en

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for upper gastrointestinal tract disease and a screening thereof. More specifically, it relates to a prophylactic / therapeutic agent for dyspepsia, bone metabolic disorder, anemia, etc., a gastric acid secretion inhibitor, a gastric acid secretion promoter and screening thereof, and also a gastric secretion test agent.
  • a prophylactic / therapeutic agent for dyspepsia, bone metabolic disorder, anemia, etc. a gastric acid secretion inhibitor, a gastric acid secretion promoter and screening thereof, and also a gastric secretion test agent.
  • Gastrointestinal disease is one of the common diseases in daily clinical practice.
  • Reflux esophagitis, gastritis and peptic ulcer are diseases closely related to gastric acid secretion.
  • Reflux esophagitis is a disease in which gastric and duodenal juices flow back into the esophagus due to impairment of the reflux prevention mechanism of the lower esophageal sphincter, causing damage to the esophageal mucosa.
  • the number of elderly people increases, the number of patients with reflux esophagitis increases.
  • the principle of treatment for these diseases is to simultaneously use aggressive factor inhibitors, protective factor potentiators, and Helicobacter pylori eradication agents.
  • aggressor inhibitors include antacids (dry aluminum hydroxide gel, magnesium oxide, etc.), anti-pepsin drugs (sucralfate, sodium sodium dybeto, etc.), acid secretion inhibitors (anticholinergic drugs, antagonists) , Proton pump inhibitors, etc.) are used clinically.
  • antacids dry aluminum hydroxide gel, magnesium oxide, etc.
  • anti-pepsin drugs salivalfate, sodium sodium dybeto, etc.
  • acid secretion inhibitors anticholinergic drugs, antagonists
  • Proton pump inhibitors etc.
  • Antagonists and proton pump inhibitors must be administered with caution to patients with impaired renal or hepatic function; side effects include shock, anaphylactic reaction, pancytopenia, thrombocytopenia, and agranulocyte.
  • side effects include shock, anaphylactic reaction, pancytopenia, thrombocytopenia, and agranulocyte.
  • Disease hemolytic anemia, granulocytopenia, anemia, toxic epidermal necrolysis, mucocutaneous ocular syndrome, rash, pruritus, liver dysfunction, jaundice, eosinophilia, gastrointestinal symptoms, headache, drowsiness and insomnia, Known dizziness, tremor, fever, total cholesterol, elevated uric acid, gynecomastia, blurred vision, edema, weakness, malaise, tongue-lip numbness, joint pain, muscle pain, hair loss, etc. .
  • GPR8 U Gand As a ligand for human GPR8 (Genomics, Vol. 28, pp. 84-91, 1995), a peptide having an ingestion effect, promotion of prolactin secretion, etc. (001/98494, J. Biol. Chem., 277) Vol., Pp. 35826-35832, 2002) (Neurope tide, referred to as GPR8 U Gand).
  • a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 7'9, or a portion thereof A gastric acid secretion inhibitor comprising a compound that inhibits the activity of a peptide or a salt thereof or a salt thereof;
  • a compound or a salt thereof which promotes the activity of a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its amide or its ester, or its salt Prevention and treatment of indigestion, bone metabolism disorder or anemia
  • a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79, or a partial peptide thereof or a salt thereof A prophylactic / therapeutic agent for dyspepsia, bone metabolism disorder or anemia containing a compound that promotes the activity of
  • It comprises a polynucleotide encoding a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amide or ester thereof, or a salt thereof.
  • a polypeptide or a salt thereof which promotes the activity of a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, its amide or its ester, or its salt Stimulates gastric acid secretion Filler
  • a gastric acid secretagogue comprising an agonist
  • a gastric secretion test agent comprising a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amide or ester thereof, or a salt thereof ,
  • a polypeptide, an amide or an ester thereof, or an amide or an ester thereof, containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 A compound that inhibits the activity of a salt or a salt thereof, (ii) an antibody against the polypeptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof, (iii) a polynucleotide encoding the polypeptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof
  • An antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or a sequence thereof; A protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by No.
  • (19) '(a) inhibits the activity of a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or its amide, its ester, or its salt, or (B) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79, or a portion thereof; Prevention and treatment of upper gastrointestinal diseases characterized by inhibiting the activity of the peptide or its salt,
  • a method for producing a gastric acid secretion inhibitor (i) a polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amide or amide thereof A compound that inhibits the activity of an ester or a salt thereof or a salt thereof, (ii) an antibody against the above-mentioned polypeptide or amide or an ester thereof or a salt thereof, (iii) a polypeptide or an amide thereof or an ester thereof or a salt thereof (Iv) SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 75, an antisense polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding If the protein contains an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79; Is a compound or a salt thereof that inhibits the activity
  • (22) (a) inhibits the activity of a polypeptide containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amide or ester thereof, or a salt thereof, or (B) a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79, or a portion thereof;
  • a method for inhibiting gastric acid secretion which comprises inhibiting the activity of a peptide or a salt thereof;
  • a method of preventing or treating dyspepsia, bone metabolism disorder or anemia characterized by promoting the activity of a protein containing one or substantially the same amino acid sequence or a partial thereof, a peptide or a salt thereof,
  • An amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 for producing a prophylactic or therapeutic agent for dyspepsia, bone metabolism disorder or anemia A compound or a salt thereof that promotes the activity of a polypeptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof, (ii) the polypeptide or an amide or an ester thereof or a salt thereof, (iii) the polypeptide (Iv) identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79 Or a compound or a salt thereof that promotes the activity of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof containing substantially the same amino acid sequence; (V) the protein or a partial peptide thereof or a salt thereof; or (vi) the protein or Use of a polynucleotide encoding the partial peptide or a salt thereof,
  • a polypeptide for producing a gastric acid secretagogue (i) a polypeptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or an amide or ester thereof Or a compound that promotes the activity of a salt thereof or a salt thereof; (ii) the polypeptide or its amide or its ester (Iii) a polynucleotide encoding the above polypeptide or its amide or its ester or its salt, (iv) SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: A protein or a salt thereof which promotes the activity of a protein or a partial peptide thereof or a salt thereof having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by 79, or (V) the above protein or a partial peptide thereof or (Vi) use of a polynucleotide encoding the above protein or a partial peptide thereof or a
  • the present invention relates to a gastric secretion test method and the like, characterized by using a compound or a salt thereof that promotes the activity of the ester or a salt thereof.
  • FIG. 1 shows the change in blood gastrin concentration by NPW administration.
  • a polypeptide having an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a human warm-blooded animal (for example, Guinea pig, rat, mouse, chick, egret, pig, sheep, pig, monkey, etc.
  • tissue present such as the brain, parts of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, cerebral basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, pituitary, stomach, ⁇ Gut, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is, for example, about 70% or more, preferably about 80% or more, and preferably about 90% or more as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. % Or more, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in addition to the above amino acid sequence, (i) 1 to 5 (preferably) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Is an amino acid sequence in which 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acids have been deleted.
  • (Ii) 1 to 5 (preferably an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) Is an amino acid sequence to which 1 to 3, more preferably 1 to 2, and more preferably 1) amino acid is added; (iii) 1 to 5 (to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1) Preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1) an amino acid sequence into which an amino acid is inserted; (iv) 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ⁇ 5 (preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2, more preferably 1 Amino amino acid sequence are substituted with other amino acids, (V) above (i) ⁇ (iv) is the amino acid sequence Nadogaa up that combines.
  • polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 examples include, for example, a polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 described above. And a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Good.
  • Examples of the activity of substantially the same quality include the activity of the polypeptide of the present invention (eg, a gastric acid secretion promoting action and the like).
  • Substantially equivalent activity indicates that the activities are qualitatively identical (eg, physiochemically or pharmacologically).
  • the measurement of gastric acid secretion promotion can be performed according to a known method.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: : 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 53 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 SEQ ID NO: 58 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 71.
  • polypeptide of the present invention include, for example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7; a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; an amino acid represented by SEQ ID NO: 9 A polypeptide having an acid sequence, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12
  • Polypeptide a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 De, SEQ ID NO: polypeptide that having a amino acid sequence represented by 30, SEQ ID NO: The polypeptide having the amino acid sequence represented by 31, A
  • polypeptide of the present invention is used in a sense that it includes a precursor polypeptide of the polypeptide of the present invention.
  • precursor polypeptide examples include, for example, a polypeptide characterized by containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. can give.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is about 80% or more, preferably about 90% or more, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. And more preferably an amino acid sequence having about 95% or more homology.
  • an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 Is an amino acid sequence in which 1 to 3 amino acids have been deleted; (ii) 1 to 100 (preferably 1 to 50, more preferably 1 to 100) amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 6 (Iii) 1-15 amino acids (preferably 1-10 amino acids, more preferably 1-10 amino acids) added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 Is an amino acid sequence having 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids, and (iv) 1 to 15 (preferably 1 to 15) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6. 10 amino acids, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids are substituted with other amino acids. Acid sequence, and Amino acid sequence that is a combination of (V) above (i) ⁇ (
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 include, for example, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: And the amino acid sequence represented by 35.
  • the precursor polypeptide include, for example, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20, a SEQ ID NO: 23 A polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35, and the like.
  • the receptor for the polypeptide of the present invention has a binding activity with the polypeptide of the present invention, and the polypeptide of the present invention activates the cell stimulating activity of the receptor-expressing cells (for example, arachidone).
  • Acid release acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation Z suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c_fos activation, pH decrease , such as those active such that promote such GTP T S binding activity) is observed and the like.
  • GPR8 SEQ ID NO: 73; Genomics, 28, 84-91, 1995
  • rat TGR26 SEQ ID NO: 75; WO 02/44368
  • amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75 A receptor containing a amino acid sequence
  • a receptor containing (4) GPR7 SEQ ID NO: 79; Genomics, 28, 84-91, 1995
  • retinal cells hepatocytes, spleen cells, neural cells, glial cells, viscera; 8 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermis Vesicles, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils Monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, hepatocytes or stromal cells, or precursors, stem cells or cancer cells of these cells, or the like.
  • immune cells eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils Monocytes
  • megakaryocytes synovial cells
  • chondrocytes bone cells
  • osteoblasts osteoclasts
  • tissues where cells exist such as the brain, various parts of the brain (eg, retina, olfactory bulb, amygdala, basal sphere, hippocampus, thalamus, hypothalamus, cerebral cortex, medulla, cerebellum), spinal cord, lower Pituitary gland, stomach, kidney, kidney, liver, gonad, thyroid, gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, gastrointestinal tract (eg, large intestine, small intestine), blood vessels, heart, thymus, spleen, submandibular gland, Peripheral blood, prostate, testicles, Ovary, placenta, uterus, bone, joint, skeletal muscle, etc., or blood cell line or its cultured cells (e.g., MEL, Ml, CTLL-2, HT-2, WEHI-3, HL-60, HL-60, bandits-1, K562, ML_1, MOLT-3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-C
  • SEQ ID NO: 73 which is substantially the same as the amino acid sequence represented by amino acid sequence.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75 includes, for example, 85% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75. And amino acid sequences having homology of at least%.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77 includes, for example, 86% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77. And amino acid sequences having homology of at least%.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9. Examples include amino acid sequences having the above homology.
  • Examples of a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79 include, for example, SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 76 Contains an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79, and is represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79 A protein having substantially the same activity as a protein having an amino acid sequence is preferred.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79 includes (i) SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79 (Ii) 1-15 amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79 (preferably 1-10, Preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acids, (iii) SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77 or SEQ ID NO: 79, the amino acid sequence represented by 1 to 15 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, (Preferably, 1 to 3 amino acids), (iv) an amino acid represented by SEQ ID NO:
  • Specific examples of the receptor of the present invention include, for example, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: A protein containing the amino acid sequence represented by 77, a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79, and the like are used.
  • the partial peptide of the receptor for the polypeptide of the present invention may be any partial peptide that can be used in a method for screening a drug or the like described below.
  • a partial peptide having an ability to bind to the polypeptide of the present invention a partial peptide containing an amino acid sequence corresponding to an extracellular region, or the like is used.
  • peptides having an amino acid sequence of 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 100 or more are preferable.
  • amino acid sequence (i) one or two or more (preferably about 1 to 10, more preferably several (1 to 5)) amino acids in the amino acid sequence are deleted, and (ii) the amino acid sequence One or more (preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 10, and still more preferably several (1 to 5)) amino acids, or (iii) the amino acid One or more (preferably about 1 to 10, more preferably several, and still more preferably about 1 to 5) amino acids in the sequence may be substituted with another amino acid.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 a partial amino acid sequence consisting of the 1st (Met) to 123rd (Phe) amino acid residues or a part thereof, and the 301st (Asn) to A partial amino acid sequence consisting of the 358th (Lys) amino acid residue or a part thereof, and a partial amino acid sequence consisting of the 548th (Tyr) to 593th (Arg) amino acid residue Contains the amino acid sequence or a part thereof, and one or more partial amino acid sequences selected from the partial amino acid sequence consisting of amino acid residues 843 (Al a) to 895 (lie) or a part thereof A partial peptide, (b) a partial amino acid sequence consisting of the 1st (Met) to 85th (Asp) amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75 or a part thereof, or a 222nd amino acid sequence (Cys ) To 329 (Al a)
  • polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention the left end is the N-terminus (amino terminus) and the right end is the C-terminus (capilloxy terminus) according to the convention of peptide labeling.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, C w alkyl group such as isopropyl or n- heptyl, for example, cyclopentyl Le, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, for example, phenyl, alpha-naphthyl C 6 _ 12 Ariru group such as, for example, benzyl, phenyl, such as phenethyl - C
  • M alkyl group or a "- C 7 such as a- Nafuchiru C M alkyl group such as naphthylmethyl - other 14 Ararukiru groups, such as pivaloyl old Kishimechiru group commonly used as an oral ester.
  • the carboxyl group may be amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the amino group of the N-terminal amino acid residue eg, methionine residue
  • may have a protecting group for example, alkanol such as formyl group, acetyl group, etc.
  • Substituent on the side chain of amino acid in the molecule are suitable protecting groups (eg If, formyl group, those protected by Asechiru like Ashiru group such as _ 6 Arukanoiru group such group), or sugar chains; etc. composite ⁇ white matter, such as so-called glycoproteins bound.
  • salts with physiologically acceptable acids eg, inorganic acids, organic acids
  • bases eg, alkali metal salts
  • physiologically acceptable acid addition salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention can be produced from the above-described human warm-blooded animal cells or tissues by a known polypeptide purification method, or a DNA encoding the polypeptide described below. It can also be produced by culturing the transformant transformed by the above method. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below. For example, it can be produced according to the methods described in WO 01/98494, WO 02/44368 and the like.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion-exchange chromatography, and ion exchange chromatography. Purification and isolation can be achieved by combining chromatography methods such as chromatography.
  • a commercially available resin for polypeptide synthesis can be usually used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl, benzhydrylamine resin, aminomethyl J3, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM Resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2,4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2 ', 4'- Dimethoxyphenyl (mocaminoethyl) phenoxy resin.
  • the amino group and the side Amino acids having appropriately protected chain functional groups are condensed on a resin in accordance with the sequence of the target polypeptide according to various known condensation methods.
  • the polypeptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired polypeptide, receptor, partial peptide or a peptide thereof. Obtain the amide form.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor (e.g., HOBt, HOOBt), or the protected amino acid may be pre-activated as a symmetric anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after it has been modified.
  • a racemization inhibitor e.g., HOBt, HOOBt
  • the protected amino acid may be pre-activated as a symmetric anhydride or HOBt ester or HOOBt ester. It can be added to the resin after it has been modified.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, alcohols such as trifluoroethanol , Sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the polypeptide bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120 to 5 appropriately.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxy carbonyl, isopolnyoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI-Z, Br-Z, and adamantyloxy.
  • Z Boc, t-pentyloxy carbonyl, isopolnyoxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI-Z, Br-Z, and adamantyloxy.
  • carbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.).
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Alkyl esterification Alkyl esterification
  • aralkyl esterification for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification
  • phenacyl esterification benzyloxycarponyl It can be protected by hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower (C ⁇ 6 ) alkanol groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, groups derived from carbonic acid such as benzyloxycarbonyl and ethoxycarbonyl groups. It is required.
  • groups suitable for etherification include, for example,., Benzyl, tetrahydropyrael, t-butyl and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B z 1, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as t one-butyl is used.
  • a protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carbonyl group of the starting material include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, phenol, 2,4; 5-triphenol, 2,4; Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ Bt)].
  • alcohols eg, phenol, 2,4; 5-triphenol, 2,4; Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with H ⁇ Bt
  • Raw material As the activated amino group, for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • Methods for removing (eliminating) protecting groups include, for example, catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, or hydrogen fluoride anhydride or methanesulfonic acid.
  • the elimination reaction by the above-mentioned acid treatment is generally carried out at a temperature of about ⁇ 20 to 40 ° C.
  • a cation scavenger such as amide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group that should not be involved in the reaction of the raw materials, the protecting group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention for example, first, after amidating and protecting the ⁇ -hydroxyl group of the amino acid at the carboxy terminal, a peptide ( (Polypeptide) after extending the chain to a desired length, a polypeptide from which only the amino-protecting group at the C-terminal of the peptide chain has been removed, and a polypeptide from which only the protecting group at the C-terminal carboxyl group has been removed. And the two polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • a desired crude polypeptide After purifying the protected polypeptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude polypeptide can be obtained.
  • This crude polypeptide can be purified using various known purification means. Then, the amide of the desired polypeptide, receptor or its partial peptide can be obtained by freeze-drying the main fraction.
  • an ester of the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention for example, after condensing the carboxyl-terminal amino acid at the carboxyl group with a desired alcohol to form an amino acid ester, the polypeptide, receptor or In the same manner as the amide of the partial peptide, a desired polypeptide, receptor or ester of the partial peptide can be obtained.
  • the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention can be produced according to a known peptide synthesis method, or, for a partial peptide of the receptor, by cleaving the receptor with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the polypeptide of the present invention, the receptor or a partial peptide or amino acid capable of constituting a partial peptide thereof is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated. By doing so, the desired peptide can be produced.
  • Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following (a) to (e).
  • polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention can be purified and isolated by a combination of recrystallization and the like.
  • the polypeptide, receptor or its partial peptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto.
  • it when it is obtained in the form of a salt, it can be converted into a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention. It may be. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the above-mentioned cells and tissues, cDNA library derived from the above-mentioned cells and tissues, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. In addition, using the prepared total RNA or mRNA fraction from the cell '
  • RT-PCR method Transcriptase Polymerase Chain Reaction
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention examples include: (a) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 0 or sequence DNA containing the base sequence represented by No.
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: No .: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66,
  • the nucleotide sequence of the present invention which has a nucleotide sequence that hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 or SEQ ID NO: 72 under high stringency end conditions, and DNA encoding a polypeptide having substantially the same activity as the
  • SEQ ID NO: 27 SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO : 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 or SEQ ID NO:
  • DNAs that can be produced are (i) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 17, respectively.
  • SEQ ID NO: 62 SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO:? 0 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 72, or (ii) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 34
  • a DNA containing a nucleotide sequence having homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more is used.
  • Hybridization can be performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When using a commercially available library, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions. Highly stringent conditions refer to, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C. . Particularly, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C. is most preferable.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 16, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 17, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 18, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 26, or the like is used.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 30 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 32, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 36 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 38, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 39, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 60, and the like.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 43 is a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 61. A etc. are used,
  • XX As the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45, a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 63 or the like is used.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 64, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 49 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 32, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 52 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 66, and the like.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 68 or the like is used.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 includes a DN containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 70.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 66, and the like.
  • the DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 57 is a DN containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • DNA encoding the polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 58 includes DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 66, and the like.
  • the DNA encoding the receptor of the present invention includes, for example, (1) a DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74, or a DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74 under high stringent conditions.
  • nucleotide sequence which hybridizes with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 under high stringency end conditions, and represented by SEQ ID NO: 77 DNA encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid to be prepared, (4) 'a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 80, or represented by SEQ ID NO: 80 DNA encoding a protein having a base sequence that hybridizes under high stringent conditions to the base sequence and encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 79, etc. If any It may be the one.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, or SEQ ID NO: 80 under high stringency end conditions include, for example, SEQ ID NO: 74, respectively. About 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and still more preferably about 95% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 or SEQ ID NO: 80. A DNA containing a base sequence having the same is used.
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). be able to.
  • the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions refer to, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 20 mM, and a temperature of about 50 to 70: preferably about 60 to 65 ° C. Particularly, the case where the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C is most preferable.
  • the DNA encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73 includes a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 74, and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 75.
  • Encodes the contained protein As a DNA, a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 76; as a DNA encoding a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 77, a base represented by SEQ ID NO: 78
  • As a DNA containing a sequence or a DNA encoding a protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 79, a DNA containing a base sequence represented by SEQ ID NO: 80 or the like is used.
  • any DNA may be used as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the partial peptide of the receptor of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, the above-described cell / tissue-derived cDNA, the above-described cell / tissue-derived cDNA library, and synthetic DNA.
  • Examples of the DNA encoding the partial peptide of the receptor of the present invention include: (1) DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 74, or represented by SEQ ID NO: 74 A partial nucleotide sequence of a DNA having a nucleotide sequence that hybridizes under high stringent conditions to a nucleotide sequence and encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 73 (2) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 76, or a base that hybridizes with the base sequence represented by SEQ ID NO: 76 under conditions of high stringency end A DNA having a partial nucleotide sequence of a DNA having a sequence and encoding a protein having substantially the same activity as the protein containing the amino acid represented by SEQ ID NO: 75; (3) DNA having a partial base sequence of DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO:
  • DNA encoding the partial peptide of the receptor of the present invention more specifically, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 73, 1st (Met) to 43rd (Phe), 101st ( 1 or 2 or more selected from partial amino acid sequences represented by Asn) to 118 (Lys), 188 (Tyr) to 213 (Arg) and 283 (Ala) to 295 (lie) DNA containing a DNA having a nucleotide sequence encoding a partial peptide containing a partial amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or DNA containing a DNA having a nucleotide sequence that hybridizes with these under highly stringent conditions, etc. Is raised.
  • the DNA encoding the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention may be labeled by a known method, specifically, isotope-labeled one, fluorescent labeling Labeled (eg, fluorescent labeling with fluorescein), biotinylated or enzyme-labeled.
  • fluorescent labeling Labeled eg, fluorescent labeling with fluorescein
  • biotinylated or enzyme-labeled e.g, a polypeptide of the present invention which has been subjected to isotope wrapping is used.
  • the DNA may be completely amplified by a known PCR method using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the polypeptide of the present invention, or it may be cloned into an appropriate vector.
  • the integrated DNA can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the polypeptide of the present invention or a DNA fragment labeled with a synthetic DNA. The hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J.
  • the DNA base sequence can be converted using a known kit, for example, Mutan TM _super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), 0DA-LAPCR method, Gapped duplex method, It can be performed according to a known method such as the Kunkel method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is depending on the purpose, or can be used by digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at the 3' end. These translation initiation codon and translation termination codon can also be added using an appropriate synthetic DNA 7 dub.
  • An expression vector for the polypeptide of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (mouth) converting the DNA fragment into an appropriate expression vector. It can be produced by connecting it downstream of one of the promoters.
  • the vector examples include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, PBR322, pBR325, pUC12, pUC13), a plasmid derived from Bacillus subtilis (eg, pUB110, pTP5, pC194), and a plasmid derived from yeast (eg, pSH19).
  • Phage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and paculovirus, as well as pA1-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, pc DNA IN eo is used.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when animal cells are used as host, SRa promoter, SV40 promoter, HIV 'LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRCK cytomegalovirus
  • the host is Escherichia
  • Bacillus such as trp promoter, lac promoter, recA promoter, APL promoter, lpp promoter, T7 promoter, etc.
  • yeast PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable.
  • polyhedrin promoter overnight, P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. Anything can be used.
  • the selection Ma one car, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [meso Bok Rekise one Bok (MTX) resistance], ampicillin phosphorus resistance ⁇ Ko (hereinafter, the Amp r sometimes abbreviated), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes referred to as Ne o r, G418 resistance), and the like.
  • dhfr gene is used as a selection marker using dhfr gene-deficient Chinese hamster cells
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention.
  • the host is Escherichia, PhoA signal sequence OmpA.
  • the signal sequence, etc. is the ⁇ amylase 'signal sequence, subtilisin signal sequence, etc.
  • the host is yeast, the MFa signal sequence, the SUC2 signal sequence, etc.
  • an insulin signal sequence, an a-interferon signal sequence, an antibody molecule and a signal sequence can be used, respectively.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia cali K12-DH1CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JMl 03 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], HB 101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], etc. are used.
  • Bacillus subtilis MI114 Gene, 24, 255 (1983)
  • 207-21 Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] and the like are used.
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD—5D, 20B—12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 1913, NCYC2036, and Pichia pastoris (Pichia pastoris) K M71 or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells for example, Sf9 cells (ATCCCRL1711), Sf21 cells (above, In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells for example, monkey cell COS-7, Vero, Chinese eight-musta cell CH0 (hereinafter abbreviated as CH0 cell), dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CH0 (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr) cell), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, etc. are used.
  • CH0 cell Chinese eight-musta cell CH0
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CH0 hereinafter abbreviated as CHO (dhfr) cell
  • mouse L cells mouse AtT-20
  • mouse myeloma cells rat GH3, human FL cells, etc.
  • Transformation of Bacillus spp. Can be performed, for example, according to the method described in Molecular & General Genetics, Vol. 168, Ilia 979).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • a liquid medium is suitable as a medium to be used for culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, power zein, meat extract, soybean meal, and potato extract.
  • Inorganic or organic substances such as liquids and inorganic substances include, for example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like.
  • yeast extract vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • an M9 medium containing glucose and casamino acids As a medium for cultivating a bacterium belonging to the genus Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids (Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972) ] Is preferred. If necessary, a drug such as, for example, 3 ⁇ -indolylacrylic acid can be added to make the promotion work efficiently.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Burkholder's minimum medium Proc. Natl. Acad. ScI. USA, 77, 4505 (1980)
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • the cultivation is usually performed at about 20 to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium is an additive such as 10% serum inactivated in Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)). Are appropriately added.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association 199, 519 (1967)], 199 medium
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • polypeptide of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane or outside the cells.
  • polypeptide of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, lysozyme and / or After the cells or cells are destroyed by freeze-thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the polypeptide by centrifugation or filtration is appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • the polypeptide contained in the culture supernatant thus obtained or the extract Can be purified by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Methods that use differences in charge methods that use differences in charge, such as ion-exchange chromatography, methods that use specific affinity, such as affinity chromatography, and methods that use hydrophobicity, such as reverse-phase high-performance liquid chromatography.
  • a method using a difference, a method using an isoelectric point difference such as an isoelectric focusing method, and the like are used.
  • the polypeptide thus obtained when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the compound can be converted into a free form or another salt by an analogous method.
  • the polypeptide produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by the action of an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginylendopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • An antibody against the polypeptide or receptor of the present invention may be any antibody capable of recognizing the polypeptide or receptor of the present invention. Any one may be used.
  • An antibody against the polypeptide or the receptor of the present invention can be produced according to a known method for producing an antibody or an antiserum using the polypeptide or the receptor of the present invention as an antigen.
  • the polypeptide or receptor of the present invention is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody by administration, itself or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. Administration is usually once every 2 to 6 weeks, 2 to 10 times in total Done to the extent.
  • Examples of the warm-blooded animal to be used include monkeys, egrets, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with the antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse, and collect the spleen or lymph node 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma By fusing antibody-producing cells contained therein with myeloma cells of the same or heterologous animals, a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting the labeled polypeptide described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Kohler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the antibody-producing cells (spleen cells) used and the number of myeloma cells is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG1000 to PEG6000) is added at a concentration of about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be performed efficiently by incubating at 30 to 37 ° C for 1 to 10 minutes.
  • hybridoma culture on a solid phase eg, microplate
  • a polypeptide (protein) antigen is adsorbed directly or together with a carrier
  • the supernatant is added, and then an anti-immunoglobulin antibody (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice) or protein A, labeled with a radioactive substance or enzyme, and solid phase is added.
  • an anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cells used for cell fusion are mice
  • protein A labeled with a radioactive substance or enzyme
  • a method for detecting monoclonal antibodies bound to the antibody adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immune glopurin antibody or protein A is adsorbed, adding a polypeptide labeled with radioactive substances, enzymes, etc. And a method of detecting a monoclonal antibody bound to the DNA.
  • monoclonal antibodies is performed according to a known method or a method analogous thereto. be able to. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as hybridomas can grow.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1-10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or for hybridoma culture None
  • a serum medium SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • SFM-101 Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually 20 to 40 t, preferably about 37.
  • the culture time is usually 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification methods (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (eg, ), Specific centrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or specific antibody purification using an active adsorbent such as protein A or protein G to dissociate the bond and obtain the antibody. Method].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (eg, ), Specific centrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase, or specific antibody purification using an active adsorbent such as protein A or protein G to dissociate the bond and obtain the antibody. Method].
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric focusing, electrophoresis, ion exchangers (
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • a immunizing antigen polypeptide antigen itself or a complex thereof with a carrier protein is prepared, and immunized against a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and the immunized animal is used to produce the polypeptide of the present invention.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance for the peptide and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio between the carrier-protein and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by crosslinking the carrier protein. If it can be efficiently cross-linked, what kind of substances may be cross-linked at any ratio, for example, ⁇ serum albumin ⁇ ⁇ thyroglobulin, hemocyanin, etc. in a weight ratio of about 1 hapten to 1 hapten 0.1-20, preferably about 1-5 You can.
  • condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier protein.
  • dartalaldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithiopyridyl group, or the like is used.
  • Can be The condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant ⁇ Incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The dose is usually given about once every 26 weeks, for a total of about 3 to 10 doses.
  • the polyclonal antibody can be collected from the blood, ascites, etc., preferably from the blood, of the warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the polyclonal antibody can be separated and purified according to the same method for separating and purifying immunoglobulin as in the above-described method for separating and purifying a monoclonal antibody.
  • DNAs of the present invention bases complementary to or substantially complementary to DNAs encoding the polypeptide, receptor or partial peptide thereof of the present invention (hereinafter, these DNAs may be abbreviated as DNAs of the present invention in some cases).
  • an antisense polynucleotide having a sequence preferably DNA
  • DNA a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to DNA of the present invention is used. Any antisense DNA may be used as long as it has an effect of suppressing the expression of the DNA.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). And about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • the complementary sequence of the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the polypeptide of the present invention is approximately 70%. % Or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more antisense DNA. It is suitable.
  • These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the antisense DNA of the present invention may contain altered or modified sugars, bases, or bonds, and may be provided in a special form such as ribosome or microsphere, or applied by gene therapy. , Can be given in added form.
  • the additional forms include polycations, such as polylysine, which act to neutralize the charge of the phosphate backbone, and lipids, which enhance the interaction with cell membranes or increase the uptake of nucleic acids (for example, hydrophobic substances such as phospholipids and cholesterol are exemplified.
  • Preferred lipids for addition include cholesterol and its derivatives (eg, cholesteryl chromate formate, cholic acid, etc.).
  • Such a substance can be attached to the 3 'end or 5' end of a nucleic acid, and can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • Other groups include cap groups specifically located at the 3 'or 5' end of nucleic acids that prevent degradation by nucleases such as exonucleases and RNases. .
  • Examples of such a capping group include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, such as glycols such as polyethylene glycol and tetraethylene glycol.
  • the inhibitory activity of antisense DNA can be measured using the transformant of the present invention, the in vivo or in vitro gene expression system of the present invention, or the in vivo or in vitro translation system of the peptide or receptor of the present invention. You can find out.
  • the following are (a) the polypeptide of the present invention, (b) the receptor of the present invention (hereinafter also including its partial peptide), (c) the DNA of the present invention, (d) the antibody of the present invention, and (e) The application of the antisense DNA of the present invention will be described.
  • the polypeptide of the present invention is a cell expressing the receptor of the present invention, for example, GPR8, GPR7, rat TGR26 or mouse TGR26. It is an endogenous ligand for the receptor of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention has a gastric acid secretion promoting action and the like.
  • the polypeptide of the present invention or the DNA of the present invention is abnormal or deficient, or when the receptor of the present invention or the DNA encoding the receptor is abnormal or deficient Examples include: dyspepsia (eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, etc.), bone metabolism disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.), anemia (eg, iron deficiency) Anemia, etc.) is likely. Accordingly, the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, as a gastric acid secretagogue, for example, for dyspepsia (eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia).
  • dyspepsia eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, etc.
  • bone metabolism disorders eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.
  • anemia eg, iron defic
  • the polypeptide of the present invention can also be used as a gastric secretion test agent.
  • the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention can be used, for example, by administering the DNA of the present invention to a patient when the polypeptide of the present invention is reduced or deficient in a living body.
  • the (mouth) cells of the present invention are introduced into the cells, and after expressing the polypeptide of the present invention, the cells are transplanted into a patient.
  • the role of the polypeptide of the present invention in the patient can be sufficiently or normally exerted.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic or therapeutic agent, the DNA is used alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like. Thereafter, it can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention can be administered as it is or in the form of a formulation with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant for promoting uptake, using a gene gun or a catheter such as a hydrogel catheter.
  • polypeptide of the present invention When used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it is purified to at least 90%, preferably at least 95%, more preferably at least 98%, further preferably at least -99%. It is preferable to use those that have been prepared.
  • the polypeptide of the present invention can be used, for example, as a tablet, capsule, elixir, microcapsule, or the like, which is sugar-coated, if necessary, or water or water. Can be used parenterally (preferably subcutaneously) in the form of an injection such as a sterile solution with other pharmaceutically acceptable liquids or a suspension.
  • the polypeptide of the present invention may be used together with physiologically acceptable carriers, flavors, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, and the like in a unit dosage form generally required for the practice of pharmaceutical preparations. It can be manufactured by mixing. The amount of the active ingredient in these preparations is adjusted so that an appropriate dose in the specified range can be obtained. '
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc. Swelling agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry.
  • a liquid carrier such as oils and fats can be further contained in the above-mentioned type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice of dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like. .
  • aqueous liquids for injection examples include physiological saline, isotonic solutions containing dextrose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • adjuvants eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • Auxiliaries such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HCO-50) Etc.).
  • examples of the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with solubilizers such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the prepared injection is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also formulated in the same manner as described above. Used orally.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity, for example, in humans or in warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bush, horses, cats, cats). , Dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the polypeptide of the present invention may vary depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like.For example, when the polypeptide of the present invention is administered subcutaneously for the purpose of treating osteoporosis, it is generally In adults (assuming a body weight of 60 kg), the polypeptide is administered at about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg per day. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the polypeptide of the present invention can be used as a gastric secretion test agent.
  • the polypeptide of the present invention is administered to a subject, and the degree of secretion of gastric juice is measured using BAO (basal acid output), MAO daximal acid output, etc. as an index. From this, the degree of residual function of gastric secretory cells, the degree of atrophy of gastric cells, etc. were determined, and the therapeutic effect of duodenal ulcer, reflux esophagitis, gastritis, gastric ulcer, atrophic gastritis, gastric cancer, etc., follow-up, recurrence, prevention This is an indicator above, and is also useful in determining the scope of surgery.
  • BAO basic acid output
  • MAO daximal acid output etc.
  • the polypeptide of the present invention has a function as a ligand of the receptor of the present invention
  • the function and activity of the polypeptide of the present invention are A compound that promotes (eg, has a gastric acid secretion promoting action, etc.) or a salt thereof is useful, for example, as a gastric acid secretagogue, etc., for example, for dyspepsia (eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia) Disease), bone metabolism disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.), and anemia (eg, iron deficiency anemia, etc.).
  • the compound or a salt thereof can be further used as a gastric secretion test agent.
  • compounds or salts thereof that inhibit the function or activity (eg, gastric acid secretion promoting action) of the polypeptide of the present invention are useful as, for example, gastric acid secretion inhibitors, mucosal protective agents, mineral absorption promoters, and the like.
  • Upper gastrointestinal disorders eg, peptic ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-El li son syndrome, etc.), gastritis, reflux Remedies for esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, gastric hyperacidity and ulcers due to postoperative stress, etc.) 'Can be used as a pylori eradication agent.
  • peptic ulcers eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-El li son syndrome, etc.
  • gastritis eg., reflux Remedies for esophagitis
  • NUD Non Ulcer Dyspepsia
  • gastric cancer gastric MALT lymphoma
  • ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs gastric hyperacidity
  • the screening can be carried out by using the polypeptide of the present invention or constructing an expression system for the recombinant polypeptide of the present invention and using the receptor binding system using the expression system.
  • Compounds that alter the binding between the polypeptide and its receptor (compounds that promote or inhibit the activity of the polypeptide of the present invention) (eg, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, etc.) Or salts thereof can be screened.
  • Such compounds may have cell stimulatory activity (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, inhibition of intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate via the receptor of the present invention) production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of C_fos, lowering of pH, GTP T S binding activity, etc. compound having an activity, etc.) that promote (i.e. polypeptide receptors Agonisuto of the present invention) And a compound having no cell stimulating activity (ie, a receptor antagonist of the polypeptide of the present invention).
  • cell stimulatory activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca2 + release, inhibition of intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate via the receptor of the present invention
  • change in cell membrane potential e.g., phosphorylation of
  • a method for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention which comprises using the polypeptide of the present invention, include the receptor of the present invention or a receptor thereof.
  • the receptor of the present invention When the polypeptide of the present invention is brought into contact with a partial peptide (hereinafter, these may be simply referred to as the receptor of the present invention) and (ii) the receptor of the present invention A compound that alters the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention, which is characterized by comparing with the case where the polypeptide and a test compound are brought into contact (the activity of the polypeptide of the present invention is promoted or Inhibitor) or a method of screening for a salt thereof.
  • a compound that activates the receptor of the present invention for example, a polypeptide of the present invention
  • a test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, cell stimulating activity via the receptor of the present invention (for example, arachidonic acid release, Acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation / suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, C-fos activation, pH decrease, GTP compounds that alter the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention, which are characterized by measuring and comparing the activity of promoting or suppressing the rS binding activity and the like (the present invention).
  • a compound that activates the receptor of the present invention was expressed on the cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor of the present invention.
  • a transformant containing the DNA encoding the receptor of the present invention is cultured with a compound that activates the receptor of the present invention and a compound that activates the receptor of the present invention,
  • Cell stimulating activity mediated by the receptor of the present invention when contacted with the receptor of the present invention expressed above e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP production / suppression
  • a compound that changes the binding property between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention compound that promote
  • polypeptide of the labeled invention [
  • SEQ ID NO: is-labeled respectively: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 3
  • the receptor of the present invention used in the screening method of the present invention may be any receptor that recognizes the polypeptide of the present invention as a ligand.
  • a membrane fraction and the like are preferred.
  • the receptor of the present invention and the like which is expressed in a large amount using a recombinant, is suitable for use in screening.
  • the above-described production method and the like are used.
  • the preparation method described later when cells containing the receptor of the present invention or the cell membrane fraction are used, the preparation method described later may be followed.
  • the cell When a cell containing the receptor of the present invention is used, the cell may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a known method.
  • the cell containing the receptor of the present invention refers to a host cell expressing the receptor of the present invention.
  • the host cell include the aforementioned Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, insect cells, animal cells, and the like.
  • Examples of the host cell that has expressed the receptor of the present invention include the same method as the above-described method for producing a transformant transformed with the expression vector containing the polypeptide of the present invention.
  • the membrane fraction refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by a known method after cell disruption.
  • Methods for crushing cells include crushing cells with a Potter-Elvehjem-type homogenizer, crushing with a single-ring blender ⁇ ⁇ ⁇ polytron (Kinematica), crushing with ultrasonic waves, French press, etc. Crushing by ejecting cells from a thin nozzle while applying pressure.
  • fractionation by centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at low speed (500-3000 ⁇ ) ⁇ ) for a short time (usually about 1-10 minutes), and the supernatant is further centrifuged at high speed (15000-30000 ⁇ 111) for 30 minutes to 2 hours.
  • the obtained precipitate is used as a membrane fraction.
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor of the present invention and membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • the amount of the receptor of the present invention in the cell or membrane fraction containing the receptor of the present invention is preferably 10 3 to 10 8 molecules per cell, more preferably 10 5 to 10 molecules per cell. is there. What The higher the expression level, the higher the ligand binding activity (specific activity) per membrane fraction, which not only enables the construction of a highly sensitive screening system, but also enables the measurement of a large number of samples in the same lot. .
  • the receptor fraction of the present invention is preferably a natural receptor fraction of the present invention, or a recombinant receptor fraction of the present invention having an activity equivalent thereto.
  • the equivalent activity means equivalent ligand binding activity and the like.
  • the labeled polypeptide for example [3 ⁇ 4], [125 1], [14 c], it can be utilized such as polypeptides labeled with like [35 s].
  • Mashiku is a polypeptide labeled with [125 1].
  • a preparation of the receptor by suspending in a suitable buffer.
  • the buffer may be any buffer such as a phosphate buffer having a pH of 4 to 10 (preferably pH 6 to 8) or a buffer such as a tris-hydrochloride buffer which does not inhibit the binding between the ligand and the receptor.
  • a surfactant such as CHAPS, Tffeen-80 TM (Kaoichi Atlas), digitonin, and dexcholate can be added to the buffer.
  • protease such as PMSF, leptin, E-64 (manufactured by Peptide Research Institute), and peptide suptin is suppressed.
  • Agents can also be added.
  • To the receptor solution 0. 01 ⁇ 10ml, added polypeptide of the labeled present invention a certain amount (5000 ⁇ 500000cpm), coexist 10_ 1 () ⁇ 10- 7 M the test compound at the same time.
  • a reaction tube containing a large excess of the unlabeled polypeptide of the present invention is also prepared to determine the non-specific binding amount (NSB).
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C, preferably 4 to 37 ° C, for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the radioactivity remaining on the glass fiber filter paper is measured using a liquid scintillation counter or an air counter. Measure with When the count (B ⁇ -NSB) obtained by subtracting the non-specific binding amount (NSB) from the count (B.) when there is no antagonistic substance is taken as 100%, the specific binding amount (B-NSB) becomes 50%, for example. % Or less can be selected as candidate compounds having competitive inhibitory ability.
  • cell stimulating activity via the receptor of the present invention for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation Z suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production Cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity to promote or suppress GTP rS binding activity, etc.
  • cell stimulating activity via the receptor of the present invention for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ release, intracellular cAMP generation Z suppression, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production Cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c-fos activation, pH reduction, activity to promote or suppress GTP rS binding activity, etc.
  • cells containing the receptor of the present invention are cultured in a multiwell plate or the like. Before screening, replace the medium with a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add test compounds, etc., incubate for a certain period of time, and then extract cells or collect supernatant. Then, the generated product is quantified according to each method. If the production of a substance (for example, arachidonic acid) as an indicator of cell stimulating activity is difficult to be assayed by a degrading enzyme contained in the cells, an assay may be performed by adding an inhibitor to the degrading enzyme. . In addition, activities such as cAMP production suppression can be detected as a production suppression effect on cells whose basic production has been increased by forskolin or the like.
  • a substance for example, arachidonic acid
  • cells expressing the appropriate receptor of the present invention are required.
  • the above-mentioned cell lines expressing the receptor of the present invention and the like are desirable.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like.
  • a screening kit for a compound that alters the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention (a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention) or a salt thereof is provided by the kit of the present invention.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following. 1. Screening reagent
  • the solution may be sterilized by filtration through a 0.45 m filter and stored at 4 ° C, or may be prepared at use.
  • CH0 cells expressing the receptor of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured for 2 days in 37, 5% CO 2 , 95% air.
  • the polypeptide of the present invention is dissolved at a concentration of lmM in PBS containing 0.1% serum albumin (manufactured by Sigma) and stored at ⁇ 20 ° C.
  • Compounds or salts thereof obtained by using the above-described screening method or screening kit can be compounds (inhibiting or promoting the binding) that alter the binding between the polypeptide of the present invention and the receptor of the present invention.
  • a compound that promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention specifically, a compound having a cell stimulating activity via the receptor of the present invention or a salt thereof (so-called receptor agonist of the present invention), or Are compounds having no such stimulating activity (so-called receptor antagonists of the present invention).
  • Such compounds include peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, and the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the specific method of evaluating whether the receptor agonist or the antagonist of the present invention is the above may be according to the following (i) or (ii).
  • test compound is brought into contact with a cell containing the receptor of the present invention, and the above-described cell stimulating activity of the receptor of the present invention is measured.
  • the compound having a cell stimulating activity or a salt thereof is the receptor agonist of the present invention.
  • a compound that activates the receptor of the present invention for example, the polypeptide of the present invention or the receptor agonist of the present invention
  • Compounds that activate the receptor and test compounds The cell stimulating activity mediated by the receptor of the present invention when the cells are brought into contact with the cells containing is measured and compared.
  • the compound capable of decreasing the cell stimulating activity of the compound that activates the receptor of the present invention or a salt thereof is the receptor agonist of the present invention.
  • the receptor agonist of the present invention has the same activity as the physiological activity of the polypeptide of the present invention on the receptor of the present invention, it can be used as a gastric acid secretion promoter similarly to the polypeptide of the present invention.
  • Useful, safe and low toxic such as dyspepsia (eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia), bone metabolism disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.) It can be used as a prophylactic or therapeutic agent for anemia (eg, iron deficiency anemia, etc.).
  • the receptor antagonist of the present invention can suppress the physiological activity of the polypeptide of the present invention on the receptor of the present invention, it is useful as, for example, a gastric acid secretion inhibitor, a mucosal protective agent, and a mineral absorption promoter.
  • Is safe and low toxic such as upper gastrointestinal disorders [eg, peptic ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zol 1 inger-El 1 son syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagus Inflammation, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs, gastric hyperacidity and ulcers due to post-operative stress, etc.), Helicobacter pylori It can be used as a fungicide.
  • upper gastrointestinal disorders eg, peptic ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zol 1 inger-El 1 son syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagus Inflammation, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcers caused by non-ster
  • the receptor agonist of the present invention can also be used as a gastric juice secretion testing agent.
  • the agonist is administered to a subject, and the degree of gastric juice secretion is measured using BAO (basal acid output), MAO (maximal acid output) and the like as indexes. From this, the degree of residual function of gastric secretory cells, the degree of atrophy of gastric cells, etc. were determined, and the therapeutic effect, follow-up, recurrence and prevention of duodenal ulcer, reflux esophagitis, gastritis, gastric ulcer, atrophic gastritis, gastric cancer, etc. In addition to being an index, it is also useful in determining the scope of surgery.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissues It is a compound selected from extracts, plasma, and the like, and is a compound that promotes or inhibits the activity or function of the polypeptide of the present invention.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the polypeptide of the present invention are used. You can.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned prophylactic / therapeutic agent, it can be carried out according to conventional means.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as the above-mentioned pharmaceuticals containing the polypeptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, higgs, bush, puppies, puppies, puppies, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.).
  • warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, higgs, bush, puppies, puppies, puppies, cats, dogs, Monkeys, chimpanzees, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, administration route and the like.
  • a compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention is administered subcutaneously for the purpose of treating reflux esophagitis, generally, in an adult (per 60 kg body weight), the compound is reduced to about 0. 1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 mg is administered. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg of body weight.
  • a compound that promotes the activity of the polypeptide of the present invention when administered subcutaneously for the purpose of treating dyspepsia, generally, in an adult (per 60 kg of body weight), the compound is used in an amount of about 0.1 to about 0.1 per day. 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg is administered. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the polypeptide or receptor of the present invention, the quantification of the polypeptide or receptor of the present invention in a test solution, particularly, quantification by a sandwich immunoassay. And so on.
  • the present invention is a.
  • one antibody reacts with the polypeptide of the present invention or an antibody that recognizes the N-terminal of the receptor, and the other antibody reacts with the C-terminal of the polypeptide or the receptor of the present invention. It is desirable that the antibody be used.
  • the polypeptide or receptor of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the polypeptide or receptor of the present invention, and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab ⁇ or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the polypeptide or the receptor of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, Bohara or Any method that detects the amount of the antibody-antigen complex by chemical or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of chromogen, May be used.
  • the nephrometry method, the competitive method, the immunometric method, and the San Germanti method are preferably used, but it is particularly preferable to use the sandwich method described below in terms of sensitivity and specificity.
  • a radioactive isotope eg, [125 1], [131 1], [3 ⁇ 4], TO, [32 P], C 33 P], [35 s]
  • Fluorescent substances eg, cyanine fluorescent dyes (eg, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, Cy7 (manufactured by Amersham Bioscience)), fluorescamine, fluorescein isothiosinate, etc.
  • enzymes Eg, 3-galactosidase, i3-darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • luminescent substances eg, luminol, luminol derivatives, luciferin, luci
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran and cell mouth, synthetic resins such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon, and glass.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the insolubilized monoclonal antibody of the present invention
  • secondary reaction another labeled monoclonal antibody of the present invention
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody is not necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving the measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction differs in the site to which the polypeptide of the present invention binds.
  • Antibodies are preferably used. That is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, such as the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen bound to the antibody (B) are separated.
  • F labeled antigen
  • B labeled antigen bound to the antibody
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a solid phase antibody is used as the first antibody
  • a solid-phase method using a soluble antibody as the first antibody and using a solid-phased antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test wave and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of the labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • Anti The original and an excess amount of the labeled antibody are allowed to react, then immobilized antigen is added, and the unreacted labeled antibody is allowed to bind to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of the label in either phase is measured to determine the amount of the antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment resulting from the antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing scattering by a laser is preferably used.
  • the polypeptide or the receptor of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • the concentration of the polypeptide or the receptor of the present invention is determined by quantifying the concentration of the polypeptide or the receptor of the present invention using the antibody of the present invention, a decrease in the concentration of the polypeptide or the receptor of the present invention is detected.
  • Pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, etc. bone Diseases such as metabolic disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.), anemia (eg, iron deficiency anemia, etc.) can be diagnosed as being likely to be affected in the future.
  • an increase in the concentration of the polypeptide or receptor of the present invention is detected, for example, upper gastrointestinal diseases [eg, peptic ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger- Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcer caused by nonsteroidal anti-inflammatory drugs, hyperacidic ulcer due to postoperative stress, etc. ] Or the likelihood of future disease is high.
  • upper gastrointestinal diseases eg, peptic ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger- Ellison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcer caused by nonsteroidal anti-inflammatory drugs, hyperacidic ulcer due to postoperative stress, etc
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide or receptor of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the polypeptide or receptor of the present invention, detection of the polypeptide or receptor of the present invention in each fraction at the time of purification, and detection of the present invention in test cells It can be used for analysis of polypeptide or receptor behavior.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys). , Etc.), the abnormality (gene abnormality) of the DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, It is useful as a diagnostic agent for a gene such as an increase or an overexpression of the DNA or mRNA.
  • warm-blooded animals e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, pigs, pigs, dogs, cats, dogs, monkeys.
  • the abnormality (gene abnormality) of the DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention can be detected, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or m
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)).
  • dyspepsia eg, It is likely to be a disease such as pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, bone metabolism disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.), and anemia (eg, iron deficiency anemia, etc.) Or, it can be diagnosed that it is likely to be affected in the future.
  • dyspepsia eg, It is likely to be a disease such as pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, bone metabolism disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.), and anemia (eg, iron deficiency anemia, etc.)
  • anemia eg, iron deficiency anemia, etc.
  • overexpression of the polypeptide of the present invention or the gene of the receptor is detected by Northern hybridization, for example, upper gastrointestinal diseases [eg, destructive ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomosis) Head ulcer, Zol linger-El lison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspeps ia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcer caused by non-steroidal inflammatory drugs, after surgery Such as stomach hyperacidity and ulcer due to stress], or the likelihood of future illness.
  • upper gastrointestinal diseases eg, destructive ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomosis) Head ulcer, Zol linger-El lison syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, NUD (Non Ulcer Dyspeps ia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcer caused by non-steroidal
  • the antisense DNA of the present invention is useful, for example, as a gastric acid secretion inhibitor, a mucosal protective agent, a mineral absorption enhancer, etc., for example, in upper gastrointestinal diseases (eg, peptic ulcers (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomosis). Head ulcers, Zollinger-Emson syndrome, etc.), gastritis, reflux esophagitis, UD (Non Ulcer Dyspepsia), gastric cancer, gastric MALT lymphoma, ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs. Excess and ulcers etc.), and can be used as helicopter and pylori eradication agents.
  • peptic ulcers eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomosis. Head ulcers, Zollinger-Emson syndrome, etc.
  • gastritis eg., gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomosis
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA is used alone or after being inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, and then used in a conventional manner. Therefore, it can be implemented.
  • the antisense DNA may be used as it is or may be formulated with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant to promote ingestion, and administered using a gene gun or a force catheter such as Hyde-mouth gel power meter.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence or expression of the DNA of the present invention in tissues or cells.
  • the antibody of the present invention (eg, a neutralizing antibody having an action of neutralizing the polypeptide of the present invention) is useful, for example, as a gastric acid secretion inhibitor, a mucosal protective agent, a mineral absorption promoter, and the like.
  • peptic ulcer e.g., gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-El li son syndrome, etc.
  • gastritis e.g., gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer, Zollinger-El li son syndrome, etc.
  • NUD Non Ulcer Dyspeps ia
  • gastric cancer stomach MALT lymphoma
  • ulcers caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs hyperacidity and ulcers due to post-operative stress, etc.
  • the agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used directly as a liquid preparation or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rats, puppies, sheep, bushes, pus, cats, Dogs, monkeys, etc.) can be administered orally or parenterally.
  • the dose varies depending on the administration subject, target disease, symptoms, administration route and the like.For example, when used for the treatment of adult reflux esophagitis, a single dose of the antibody of the present invention is usually used.
  • 0.01 to 20 mg / kg body weight preferably about 0.1 to 1 Omg / kg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mg / kg body weight, about 1 to 5 times a day, preferably 1 day It is convenient to administer by intravenous injection about 3 times. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased accordingly.
  • the antibody of the present invention can be administered by itself or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules) ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for disintegrants.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, and the like.
  • Injections include dosage forms such as intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and drip injection.
  • Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used.
  • suppository for rectal administration is prepared by mixing the above antibody or a salt thereof with a conventional suppository base.
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in the form of a dosage unit so as to conform to the dosage of the active ingredient.
  • dosage unit forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually 5 to 500 mg per dosage unit form, especially for injections. It is preferred that 5-100 mg, in other dosage forms, 10-250 mg of the above antibody is contained.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above antibody.
  • DNA transfer animal
  • Non-human having a DNA encoding an exogenous polypeptide of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or its mutant DNA (sometimes abbreviated as the exogenous mutant DNA of the present invention) Mammals are also used for screening for preventive and therapeutic agents for gastrointestinal diseases.
  • the non-human mammal having the exogenous DNA of the present invention or its mutant DNA is a non-fertilized egg, a fertilized egg, a germ cell containing a sperm and its progenitor cells. And the like, preferably in the development of non-human mammals.
  • the calcium phosphate method, electric pulse method, lipofection method, aggregation method, microinjection method, particle gun method, DEAE- It can be produced by transferring the desired DNA by the dextran method or the like.
  • the target exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a known cell fusion method.
  • non-human mammal for example, red sea lions, bushes, hidge, goats, blue herons, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, mice, rats, and the like are used.
  • a cross line a B 6 C 3 d line, a BDFi line, a B 6D 2 line, a BALB / c line, an ICR line, etc.
  • a rat eg, Wistar, SD, etc.
  • mammals humans and the like can be mentioned in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention refers not to the DNA of the present invention originally possessed by non-human mammals, but to the DNA of the present invention once isolated and extracted from the mammal.
  • a DNA having a mutation (for example, mutation) in the base sequence of the original DNA of the present invention, specifically, addition or deletion of a base, substitution with another base, etc. DNA that has been used is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal polypeptide of the present invention, for example, a DNA that expresses a polypeptide that suppresses the function of a normal polypeptide of the present invention, or the like is used. .
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • a mammal that is the same or different from the animal of interest.
  • the human D of the present invention When transferring NA, it is possible to express DNA derived from various mammals having the DNA of the present invention having high homology with the DNA (eg, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.).
  • the DNA of the present invention is obtained by microinjecting a DNA construct (eg, a vector, etc.) to which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg. Highly expressing DNA transgenic mammals can be created.
  • a DNA construct eg, a vector, etc.
  • Examples of the expression vector of the polypeptide of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moroni monoleukemia virus, vaccinia virus, and baculovirus. Animal viruses such as viruses are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the DNA expression include, for example, (a) DNA derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.). Promoters, (b) Promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, Hamus Yuichi rat mice, etc.) For example, albumin, insulin II, Peropkin II, Eras Yuichize.
  • viruses eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • Promoters derived from various mammals (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, Hamus Yuichi rat mice, etc.) For example, albumin, insulin II, Peropkin II, Eras Yuichize.
  • VNP heavy chain variable region
  • EF-1 ⁇ human polypeptide chain elongation factor 1
  • the vector preferably has a sequence (generally called terminator) that terminates transcription of the target messenger RN ⁇ in a DNA-transferred mammal, and includes, for example, virus-derived and various mammalian-derived sequences.
  • the sequence of each DNA can be used, and preferably, the simian virus SV40 or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are added 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region to further express the target exogenous DNA.
  • it can be linked to the downstream of the translation region, depending on the purpose.
  • the normal translation region of the polypeptide of the present invention is DNA derived from the liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from humans or various mammals (eg, rabbit, cat guinea pig, hamus yuichi, rat mouse, etc.). It is also possible to obtain all or part of genomic DNA from various commercially available genomic DNA libraries, or complementary DNA prepared by known methods from RNA derived from liver, kidney, thyroid cells, and fibroblasts as a raw material. I can do it.
  • an exogenous abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal polypeptide obtained from the above cells or tissues by a point mutagenesis method.
  • the translation region can be produced as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the transgenic animal after DNA transfer is not It means that all the germs and somatic cells carry the exogenous DNA of the present invention.
  • the offspring of such animals that have inherited the exogenous DNA of the present invention have the exogenous DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably maintain the exogenous DNA by mating, and is subcultured as an animal having the DNA in a normal breeding environment. I can do it.
  • Transfer of the exogenous DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in excess in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the exogenous DNA of the present invention in the germinal cells of the produced animal after DNA transfer indicates that all of the offspring of the produced animal contain the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells. Means to have.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention has an excess of the exogenous DNA of the present invention in all of its germ cells and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and finally promotes the function of endogenous normal DNA to finally obtain the polypeptide of the present invention.
  • Peptide hyperfunction may develop and can be used as a disease model animal. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention to elucidate the functional progression of the polypeptide of the present invention and the pathological mechanism of the disease associated with the polypeptide of the present invention, and to treat these diseases A study of the method is possible.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention
  • screening for a therapeutic drug for a disease associated with the polypeptide of the present invention can also be used for testing.
  • the non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the exogenous DNA is stably maintained by mating. .
  • the desired foreign DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • D NA co with promoter The structure can be prepared by a usual DNA engineering technique. Transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal.
  • the presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells. .
  • the offspring of such animals that inherit the exogenous DNA of the present invention have the abnormal DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • a homozygous animal having the introduced DNA on both homologous chromosomes is obtained, and by crossing these male and female animals, it is possible to breed so that all offspring have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high level of expression of the abnormal DNA of the present invention, and finally inhibits the function of the endogenous normal DNA, thereby finally obtaining the polymorph of the present invention.
  • Peptide may become functionally inactive and may be used as a disease model animal. For example, using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the polypeptide of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the animal with high expression of abnormal DNA of the present invention is characterized in that the function of normal polypeptide by abnormal polypeptide of the present invention in the function-inactive refractory disease of polypeptide of the present invention is A model for elucidating inhibition (dominant negative effect).
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred since the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released polypeptide of the present invention, it can be used for treatment of the polypeptide of the present invention or a functionally inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention. It can also be used for drug screening tests.
  • the DNA-transferred animal of the present invention it is possible to examine the clinical symptoms of diseases related to the polypeptide of the present invention, including the inactive type refractory type of the polypeptide of the present invention, and the like.
  • diseases related to the polypeptide of the present invention including the inactive type refractory type of the polypeptide of the present invention, and the like.
  • pathological findings in each organ of the disease model related to the polypeptide of the present invention can be obtained, and new therapeutic methods can be developed, and further, research and treatment of secondary diseases caused by the disease can be performed. Can contribute.
  • the use of the DNA-transferred animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the polypeptide of the present invention including refractory inactive type of the polypeptide of the present invention. It is possible to provide an effective and rapid screening method for a therapeutic agent for the disease by using the above-described test method and quantitative method. Further, using the DNA translocation product of the present invention or the exogenous DNA expression vector of the present invention, it is possible to examine and develop a method for treating a DNA associated with the polypeptide of the present invention. (8) Knockout animal
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated and the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention are also used for screening for a gastric acid secretion promoter and the like.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated refers to the non-human mammalian embryonic stem cells.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • Examples of the method of artificially mutating the DNA of the present invention include, for example, deleting some or all of the DNA sequence by genetic engineering techniques, and inserting or substituting another DNA. it can. With these mutations, the knockout DNA of the present invention may be prepared by, for example, shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by a non-human mammal to be used is isolated and its exon portion is a drug resistance gene typified by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or 1 ac Z (
  • the DNA sequence on or near the DNA of the present invention used as a probe for Southern hybridization analysis or the DNA sequence on the targeting vector and the DNA in the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector It can be obtained by analyzing a sequence by a PCR method using a primer as a primer and selecting a knockout ES cell of the present invention.
  • the original ES cells for inactivating the DNA of the present invention by homologous recombination may be used, or a newly established one according to the known method of Evans and Kaufma may be used.
  • an already established one as described above may be used, or a newly established one according to the known method of Evans and Kaufma may be used.
  • 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear, a pure line that substitutes them and immunologically genetically for example an object such as a background to obtain a bright et kana ES cells, C 57BLZ6 mouse or C57 8/6 0 the lack of egg collection number:?
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but in addition to this, a large number of cells can be efficiently collected by collecting embryos at the 8-cell stage and culturing them up to blastocysts. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce cumbersome culture labor.
  • a method for determining the sex of ES cells a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by a PCR method can be given as an example. If this method was used, the number of ES cells required for a karyotype analysis would have been about 10 6 cells, whereas the number of ES cells in one colony (about 50 cells) would be sufficient.
  • the primary selection of ES cells in the initial stage can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor required in the initial culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the embryonic stem cell line obtained in this manner usually has very good growth properties, but it must be carefully subcultured because it tends to lose its ability to generate an individual.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen
  • LIF 1 to 10,000 U / ml
  • 5% CO 2, 90% air 5% CO 2, 90% air
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.5%).
  • ES cells can be cultured in monolayers up to high densities or in suspension cultures to form cell clusters under appropriate conditions to produce various types of cells such as parietal, visceral and cardiac muscles.
  • DNA-deficient cell of the present invention obtained by differentiating the ES cell of the present invention is a polypeptide of the present invention or the present invention in vitro.
  • the receptor of the invention is useful in cell biology studies.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. It is.
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be prepared, for example, by introducing the targeting vector prepared as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and inducing the DNA of the targeting vector of the present invention to be inactive.
  • the DNA of the present invention can be knocked out by subjecting the converted DNA sequence to homologous recombination to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. Cells in which the DNA of the present invention was knocked out were subjected to Southern hybridization analysis or DNA hybridization using the DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, and the mouse used for the targeting vector.
  • the cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated ' is cloned by gene homologous recombination, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo is injected into a human mammal embryo or blastocyst, and the resulting chimeric embryo is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both cells having the normal DNA locus of the present invention and cells having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • all tissues are artificially mutated from a population obtained by crossing such a quinula individual with a normal individual. It can be obtained by selecting individuals composed of cells having the DNA locus of the present invention added thereto, for example, by judging the color.
  • the individual obtained in this manner is usually an individual lacking heterologous expression of the polypeptide of the present invention, and is bred with an individual lacking heterologous expression of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention.
  • homozygous individuals expressing the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention can be obtained from their offspring.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a gettering vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by a microinjection method. Compared to these transgenic non-human mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the germline can be obtained and maintained according to a conventional method. That is, by crossing male and female animals having the inactivated DNA, the inactivated DNA is A homozygous animal having both homologous chromosomes can be obtained. The obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal with one normal individual and one homozygote. By mating male and female heterozygous animals, homozygous and heterozygous animals having the inactivated DNA are bred and passaged.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated are extremely useful for producing the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention. It can be used as a model for diseases caused by inactivation of the biological activity of the receptor, and is useful for investigating the causes of these diseases and studying treatment methods.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention can be used for screening for a compound having a therapeutic / preventive effect against a disease caused by deficiency or damage of the DNA of the present invention.
  • the present invention comprises administering a test compound to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, and observing and measuring changes in the animal.
  • a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic / preventive effect on a disease caused by the disease is provided.
  • Examples of the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention used in the screening method include those described above.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.These compounds are novel compounds. Or a known compound and may be fc.
  • a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is treated with a test compound and compared with a non-treated control animal, and changes in organs, tissues, disease symptoms, etc. of the animal are indicated.
  • the therapeutic and prophylactic effects of the test compound can be tested.
  • a method for treating a test animal with a test compound for example, oral administration, intravenous injection and the like are used, and it can be appropriately selected according to the symptoms of the test animal, the properties of the test compound, and the like.
  • the dose of the test compound can be appropriately selected according to the administration method, the properties of the test compound, and the like.
  • the pylorus is ligated to a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, a test compound is administered, and changes in the gastric acid secretion of the animal are measured over time.
  • the gastric acid secretion of the test animal increases by about 10% or more, preferably about 30% or more, more preferably about 50% or more.
  • the compound can be selected as a compound having a preventive / therapeutic effect on the above-mentioned diseases.
  • Compounds obtained by using the screening method are compounds selected from the test compounds described above, and have a therapeutic / preventive effect on diseases caused by deficiency or damage of the polypeptide of the present invention. It can be used as a medicament such as a safe and low-toxic preventive / therapeutic agent for the disease. Further, a compound derived from the compound obtained by the above-mentioned screening can be used in the same manner.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids, organic acids, etc.) and bases (eg, Alkali metal And the like, among others, and a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, butyric acid, fumaric acid, maleic acid) Acids, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, butyric acid, fumaric acid, maleic acid
  • succinic acid tartaric acid
  • citric acid malic acid
  • succinic acid benzoic acid
  • methanesulfonic acid benzenesulfonic acid, etc.
  • a medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned medicament containing the polypeptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans or mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the subject of administration, the administration route, and the like. About 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg of the compound per day.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound that promotes the promoter activity of DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection.
  • the compound When administered to an adult (assuming a body weight of 60 kg) a patient with dyspepsia, the compound is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
  • the present invention provides a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention, which comprises administering a test compound to detect the expression of a repo overnight gene.
  • a method for screening an inhibitory compound or a salt thereof is provided.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention may be a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention in which the DNA of the present invention has a repo allele gene.
  • a gene which is inactivated by the introduction and which can express the reporter gene under the control of the promoter for the DNA of the present invention is used.
  • test compound examples include the same compounds as described above.
  • reporter gene As the reporter gene, the same ones as described above are used, and a 3 / 3-galactosidase gene (1 acZ), a soluble alkaline phosphatase gene, a luciferase gene and the like are preferable.
  • the repo overnight gene is under the control of the promoter for the DNA of the present invention.
  • the activity of the promoter can be detected.
  • a tissue that originally expresses the polypeptide of the present invention may J3-galactosidase is expressed instead of the polypeptide of the present invention.
  • the present method can be easily performed.
  • a reagent that is a substrate of 3-galactosidase such as 5-promo-1-chloro-3-indolyl-3-galactopyranoside (X-ga1)
  • X-ga1 5-promo-1-chloro-3-indolyl-3-galactopyranoside
  • the polypeptide-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, washed with phosphate buffered saline (PBS), and then stained with -ga1 at room temperature or at room temperature.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the i3-galactosidase reaction may be stopped by washing the tissue specimen with an ImM EDTA / PBS solution, and the coloration may be observed.
  • mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by the above screening method is a compound selected from the test compounds described above and a compound that promotes or inhibits the promoter activity on DNA of the present invention.
  • the compound obtained by the screening method may form a salt.
  • the salt of the compound include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids) and bases (eg, organic acids). Are used, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, etc.), and organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the compound or salt thereof that promotes the promoter activity over the DNA of the present invention can promote the expression of the polypeptide of the present invention and promote the function of the polypeptide. It can be used as an agent, for example, dyspepsia (eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, etc.), bone metabolism disorders (eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.), anemia ( Eg, iron deficiency anemia). Further, the compound of the present invention or a salt thereof that inhibits the promoter activity against DNA can inhibit the expression of the polypeptide of the present invention and inhibit the function of the polypeptide.
  • dyspepsia eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, etc.
  • bone metabolism disorders eg, osteoporosis, osteomalacia, etc.
  • anemia Eg, iron deficiency anemia
  • Prophylactic and therapeutic agents for Helicobacter pylori can be used as a disinfectant for pylori.
  • a compound derived from the compound obtained by the above screening can be used as well.
  • a medicament containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be produced in the same manner as the above-mentioned medicament containing the polypeptide of the present invention or a salt thereof.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or mammals (e.g., rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, sheep, bushus, dogs, dogs, cats, dogs). , Monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like.
  • the compound of the present invention that promotes the promoter activity for DNA is orally administered, it is generally used.
  • the compound In an adult patient (assuming a body weight of 60 kg), the compound is administered on a daily basis at about 0.1 to 100111, preferably at about 1.0 to 50 mg, more preferably at about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound that promotes the promoter activity for DNA of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult.
  • the dose When administered to a patient (with a body weight of 60 kg), about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg of the compound per day is intravenously injected. It is convenient to administer. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of weight per 60 kg.
  • a compound of the present invention that inhibits the promoter activity for DNA is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg) a patient, thus, the compound is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, and the like.
  • the compound of the present invention that inhibits promoter activity against DNA may be in the form of an injection.
  • the compound when administered to an adult patient (assuming a body weight of 60 kg), is administered in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day. Conveniently, it is administered by intravenous injection. In the case of other animals, the amount can be administered in terms of the weight per 60 kg.
  • the non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the promoter of the present invention, The present invention can greatly contribute to investigating the cause of various diseases caused by insufficient expression of DNA or to developing preventive and therapeutic drugs.
  • genes encoding various proteins are ligated downstream thereof, and the resulting gene is injected into an egg cell of a so-called transgenic animal (Creating a transgenic animal) makes it possible to specifically synthesize the polypeptide and examine its action in the living body. Furthermore, if a suitable repo overnight gene is bound to a portion of the above promoter and a cell line that expresses the gene is established, the production ability of the polypeptide itself of the present invention in the body can be specifically determined. It can be used as a search system for low molecular compounds that have an accelerating or inhibiting action.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-IUB Communication on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, and examples thereof are described below.
  • optical isomer of an amino acid the L-form is indicated unless otherwise specified.
  • B guanine (G), guanine (G) or thymine (T) D adenine (A), guanine (G) or thymine (T) V adenine (A), guanine (G) or cytosine (C) N adenine (A) , Guanine (G), cytosine (C) or thymine (T) or unknown or other base
  • H is or H
  • Trp or W tryptophan
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of DNA encoding a part of human GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a part of the human GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-29).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-28).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-26).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR 8 ligand (1-25).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a human GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a busbar GPR8 ligand peptide precursor.
  • [SEQ ID NO: 24] 2 shows the amino acid sequence of a porcine GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of rat GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of rat GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a rat GPR8 ligand peptide.
  • FIG. 3 shows the sequence of cDNA encoding the mouse GPR8 ligand peptide precursor.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of mouse GPR8 ligand peptide precursor.
  • 1 shows the amino acid sequence of an oxidized synthetic human GPR 8 ligand (1-23).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR 8 ligand (1-22). '
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR 8 ligand (1-20).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-19).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR 8 ligand (1-18).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-17).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (1-16).
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic rat or mouse GPR8 ligand (1-23) oxidized form.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic Fmoc-modified human GPR8 ligand (1-23).
  • [SEQ ID NO: 52] 2 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR 8 ligand (2-23).
  • Fig. 2 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR8 ligand (4-123).
  • 1 shows the amino acid sequence of a synthetic human GPR 8 ligand (15-23).
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 is shown.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 46 is shown.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 is shown.
  • [Phe 2 ] shows the amino acid sequence of human GPR8 ligand (1-20).
  • 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding rat TGR26.
  • [SEQ ID NO: 80] 1 shows the nucleotide sequence encoding human GPR7.
  • Starting amino acid resin carrier uses Wang (p-benzyloxybenzyl alcohol) resin (0.25 mmol), Fmoc-Leu, Fmoc-Gly, Fmoc-Ala, Fmoc-Arg (Pbf), Fraoc-VaK
  • Fmoc- Thr (Bu '), Fmoc- His (Trt), Fmoc-Tyr (Bu l), Fmoc- Pro, Fmoc-Ser (Bu') Fmoc-Lys (Boc), Fraoc-Phe, Fmoc - T ⁇ ( The Fmoc amino acid derivative of Boc) was sequenced with HBTU (2- (1H-benzotriazo-1-1-yl) -1-1,1,3,3-tetramethylperonium hexafluorophosphate). And condensed sequentially.
  • the protective peptide resin was dried. Deprotection of the resulting protected peptide and separation of the peptide from the resin carrier were performed by TFA treatment. The obtained crude peptide was extracted with 0.1% TFA water and freeze-dried to obtain a powder solid. Subsequently, the crude peptide was analyzed by reversed-phase high-speed chromatography (Shimadzu Corporation, preparative instrument: Model LC8A) to obtain acetonitrile-0.1% TFA water system.
  • the amino acid analysis value of the hydrolyzate obtained by hydrolyzing the purified product with 4N methanesulfonic acid containing 0.2% 3- (2-aminoamino) indole at 110 ° C for 22 hours (the theoretical value in parentheses is ) as below.
  • [Hie 2 ] human GPR8 ligand ⁇ _20) (SEQ ID NO: 71) dissolved in DMSO IO I and obtained according to the production method described in Reference Example 1 was added to a 0.1 M nickel chloride aqueous solution IO K 0.1 MHEPES ( 10 1 of 0.001% hydrogen peroxide solution in water (pH 7.6), lactoperoxidase (Sigma) 10 g / ml in 0.1 MHEPES (pH 7.6), and 40 MBq of [ l25I ] NaI After mixing and reacting at room temperature for 50 minutes, the generated [Phe 2 , 125 I-Tyr 10 ] human GPR8 ligand (1-20) was separated by HPLC under the following conditions. I took it.
  • ethyl rubamidate (Wako Pure Chemical) (1.0 g / ml / kg) was performed.
  • the abdomen was fixed on a rat operating table.
  • a gastric catheter (MedtopX2-50, outer diameter 3.5, inner diameter 2.lmm) was intubated (2 cm) into the stomach via the duodenum, the pyloric tube was ligated, the right femoral vein was released, and the vein was intubated.
  • Gastric lavage was performed using distilled water (Otsuka Pharmaceutical) heated to 37 ° C and left for about 1 hour.
  • hNPW23 was dissolved in physiological saline (Otsuka Pharmaceutical) to 80 iM. A saline was administered to the control group, and the treatment was performed in 8 cases in each group. The administration of hNPW23 and saline is performed by the Inphagyon Pump (Harvard Apparatus) at a flow rate of 1 ml / h for 30 minutes from the femoral vein. For the measurement, distilled water (1 ml) preheated to 37 ° C was injected into the stomach, and after 10 minutes, the stomach contents were collected.
  • mice Male Wistar rats (340-360 g) were fasted for 16 hours under free drinking water, then opened under ether anesthesia, pyloric ligation was performed, and the abdominal wall was closed.
  • hNPW23 was dissolved in physiological saline (2 mg / ral) and administered intraperitoneally (2 mg / kg).
  • a saline was administered to the control group, and the treatment was performed in 8 cases in each group.
  • the rat Three hours after pyloric ligation, the rat was laparotomized under anesthesia with Nembutal (40 mg / kg, Dainippon Pharmaceutical), and after ligation of the cardia, the stomach was removed.
  • the gastric fluid is collected, centrifuged (2500 rqmX IO min), and the supernatant is used to determine the gastric fluid volume (ml), gastric pH, gastric acidity (mEQ / l) and total acid secretion (Eq / kg / h) was measured.
  • the rat was laparotomized under Nembutal (40 mg / kg ip) anesthesia, blood was collected from the abdominal aorta, and the blood was placed in a 7 ml blood collection tube (containing Terumo and EDTA) and centrifuged (3000 rpm XIO min). The sample was stored frozen at -40 ° C until measurement. The blood gastrin concentration was measured using Gastrin RIA II (ABBOTT JAPAN). The F-test was performed using the average of each measurement.
  • Nembutal 40 mg / kg ip
  • the compound or its salt that inhibits the activity of the polypeptide or receptor of the present invention, the antibody of the present invention, and the antisense DNA of the present invention are low-toxic and safe, for example, gastric acid secretion inhibitor, mucosal protective agent, mineral absorption It is useful as an accelerator, etc., for example, upper gastrointestinal tract disease [eg, peptic ulcer (eg, gastric ulcer, duodenal ulcer, anastomotic ulcer,
  • the compound or its salt that promotes the activity of the polypeptide or receptor of the present invention, the polypeptide or receptor of the present invention, and the DNA of the present invention can be used, for example, as a gastric acid secretion promoter.
  • Dyspepsia eg, pituitary dyspepsia, renal dyspepsia, etc.
  • bone metabolism disorders eg, osteoporosis, osteomalacia etc.
  • anemia eg, iron deficiency anemia, etc.
  • the compound or its salt of the present invention which promotes the activity of the polypeptide or the receptor, the polypeptide or the receptor of the present invention, and the DNA of the present invention can be used as a gastric secretion test agent.
  • polypeptide or receptor of the present invention and the DNA of the present invention are also useful for screening the above-mentioned prophylactic / therapeutic agents.

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Abstract

本発明のポリペプチドまたは受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、本発明の抗体、本発明のアンチセンスＤＮＡは、低毒性で安全な、例えば胃酸分泌抑制剤、粘膜保護剤、ミネラル吸収促進剤などとして有用であり、例えば上部消化管疾患の予防・治療剤、ヘリコバクター・ピロリ除菌剤などとして、本発明のポリペプチドまたは受容体の活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドまたは受容体、本発明のＤＮＡは、例えば胃酸分泌促進剤として使用することができ、例えば、消化不良症、骨代謝障害、貧血症などの予防・治療剤として使用することができ、本発明のポリペプチドまたは受容体の活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドなどは、胃液分泌能検査剤としても使用できる。本発明のポリペプチドまたは受容体、本発明のＤＮＡは、上記予防・治療剤のスクリーニングにも有用である。

Description

明 細書 上部消化管疾患の予防 ·治療剤 技術分野
本発明は、上部消化管疾患の予防 ·治療剤およびそのスクリーニングなどに関 する。 さらに詳しくは、 消化不良症、 骨代謝障害、 貧血症などの予防 ·治療剤、 胃酸分泌抑制剤、 胃酸分泌促進剤およびこれらのスクリーニング、 さらには胃液 分泌能検査剤などに関する。 背景技術
消化管疾患は、 日常臨床診療において常見な疾患の一つである。その中で逆流 性食道炎、 胃炎および消化性潰瘍は胃酸分泌と関連が深い疾患である。逆流性食 道炎は下部食道括約筋の逆流防止機構の障害が原因で胃液や十二指腸液が食道 内に逆流することにより、食道粘膜に障害を受ける疾患である。高齢者が増える と共に、逆流性食道炎患者が増加している。また、逆流性食道炎が長期化すると、 食道下端にパレツト上皮が形成され 将来的に食道の円柱上皮癌のリスクが増加 する可能性が高い。 胃炎の原因の約 80%はへリコパクターに起因し、それ以外は 薬剤、 ストレス、 刺激性食物などとされている。 消化性潰瘍の病因は様々な因子 が絡んでいるが、 （i) へリコパクター ·ピロリの感染、 （i i) 非ステロイド性 消炎鎮痛剤の障害、 （i i i) Zol l inger- El l ison症候群のような過酸症、 の三つに 大きく分類されている。 これらの疾患治療の大原則としては攻撃因子抑制剤、 防 御因子増強剤とヘリコパクター ·ピロリの除菌剤を同時に行うことである。攻撃 因子抑制剤としては、 制酸薬 （乾燥水酸化アルミニウムゲル、 酸化マグネシウム など） 、 抗ペプシン薬 （スクラルフアート、 ェ力べトナトリウムなど） 、 酸分泌 抑制薬 （抗コリン作動薬、 拮抗薬、 プロトンポンプ抑制薬など） などが臨床で 用いられている。 ¾拮抗剤およびプロトンポンプ抑制剤が開発されてから、 上部 消化管疾患の治療に画期的な進歩をもたらした。しかしながら、酸分泌抑制剤は、 臨床では高齢者の逆流性食道炎患者など外科治療の不適患者、 へリコパクター · ピロリ感染患者の除菌後の急性胃十二指腸潰瘍、逆流性食道炎の発生および難治 性潰瘍などの治療にいずれも長期投与することになる。動物実験ではこれらの薬 剤を長期間投与すると、 胃粘膜の異常増殖を引き起こし、 カルチノ一マ （胃癌） になることが報告されている。 臨床では酸分泌抑制剤を長期間投与すると、 胃粘 膜の増殖が見られ、 さらに投与中止後に酸分泌のリバウンドにより、潰瘍の再発 などが起こる。 また、 拮抗剤やプロトンポンプ抑制剤は、 腎または肝機能障害 を持つ患者には慎重に投与することが必要であり、副作用としてはショック、 ァ ナフイラキシー反応、 汎血球減少、 血小板減少、 無顆粒球症、 溶血性貧血、 顆粒 球減少、 貧血、 中毒性表皮壊死症、 皮膚粘膜眼症候群、 発疹、 そう痒感、 肝機能 障害、 黄疸、 好酸球増多、 消化器症状、 頭痛、 眠気不眠、.眩暈、 振戦、 発熱、 総 コレステロール、 尿酸の上昇、 女性化乳房、 かすみ目、 浮腫、 脱力感、 倦怠感、 舌-口唇のしびれ感、 関節痛、 筋肉痛、 脱毛などが知られている。
一方、 ヒト GPR8 (Genomics, 28巻、 84- 91頁、 1995年） のリガンドとして、 摂 食作用、 プロラクチン分泌促進などを有するぺプチド ( 0 01/98494号公報、 J. Biol. Chem.、 277卷、 35826- 35832頁、 2002年) (Neur ope t ide , 、 GPR8 U ガンドなどと称される) が報告されている。
上述したように.,酸分泌のリバウンドが起こらず、 かつ副作用が少ない新しい 酸分泌抑制剤が望まれている 発明の開示
本発明者らは、 このような現状に鑑み、 鋭意検討した結果、 GPR8リガンドが、 ラッ卜の胃酸分泌を促進することを見出し、更に研究を重ねた結果、本発明を完 成するに至った。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル ま'たはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる上部消化管 疾患の予防 ·治療剤、
( l a ) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化合 物またはその塩を含有してなる上部消化管疾患の予防 ·治療剤、
( l ) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のアン夕ゴニストを含 有してなる上部消化管疾患の予防 ·治療剤、
( 2 ) ( 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩に対する抗体、 または （i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩に対する抗体を含有してなる上部消化管疾患の予防 ·治療剤、
( 3 ) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩をコ一ドするポリヌクレオチドの、 または (i i) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしく はその部分べプチドまたはその塩をコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列に 相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセ ンスポリヌクレオチドを含有してなる上部消化管疾患の予防 ·治療剤、
( 4 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしぐはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる胃酸分泌抑 制剤、
( 4 a ) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7' 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合 物またはその塩を含有してなる胃酸分泌抑制剤、 (4b) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩のアン夕ゴニストを含 有してなる胃酸分泌抑制剤、
(5) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる消化不良症、 骨代謝障害または貧血症の予防 ·治療剤、
(5 a) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合 物またはその塩を含有してなる消化不良症、骨代謝障害または貧血症の予防 ·治 療剤、
(5 b) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のァゴニストを含有し てなる消化不良症、 骨代謝障害または貧血症の予防 治癡剤、
(6) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩を含有してなる消化不良症、骨代謝障害または貧血症の予防 ·治療 剤、
(7) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる消化不良症、骨代謝 障害または貧血症の予防 ·治療剤、
(8) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる胃酸分泌促 進剤、
(8 a) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合 物またはその塩を含有してなる胃酸分泌促進剤、
(8 b) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のァゴニストを含有し てなる胃酸分泌促進剤、
(9) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩を含有してなる胃液分泌能検査剤、
(10) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の アミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる胃液分泌 能検査剤、
(11) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するボリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 および （または） （ii) 配列番号： 73、 配列番号： 7 5、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩を用いることを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療剤のスクリ 一二ング方法、
(12) (0 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 および （または） （ii) 配列番号： 73、 配列番号： 7 5'、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩を含有することを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療剤のスク リーニング用キッ卜、
(12 a) 上記 （1 1) 記載のスクリーニング方法または上記 （12) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる上部消化管疾患の予防 ·治療剤、 (13) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、 および （または） （ii) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わ されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを 用いることを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療剤のスクリーニング方法、 (14) (0 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩をコ一ドするポリヌクレオチド、 および (または) (ϋ) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わ されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋 白質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを 含有することを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療剤のスクリ一ニング用キ ッ卜、
(14 a) 上記 （13) 記載のスクリーニング方法または上記 (14) 記載の スクリーニング用キットを用いて得られる上部消化管疾患の予防 ·治療剤、 (15) (0 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 および （または） （ii) 配列番号： 73、 配列番号： 7 5、 配列番号： 77または配列番号： Ί 9で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩を用いることを特徴とする胃酸分泌抑制剤のスクリーニング方法、 (1 5 a) 上記 （15) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる胃酸分泌 抑制剤、 (16) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 および （または） （ii) 配列番号： 73、 配列番号： 7 5、 配列番号： Ί 7または配列番号： Ί 9で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩を用いることを特徴とする消化不良症、骨代謝障害または貧血症の 予防 ·治療剤のスクリーニング方法、
(16 a) 上記 （16) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる消化不良 症、 骨代謝障害または貧血症の予防 ·治療剤、
(17) (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 および （または） （ii) 配列番号： 73、 配列番号： 7 5、 配列番号： 77または配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩を用いることを特徴とする胃酸分泌促進剤のスクリーニング方法、
(1 7 a) 上記 （17) 記載のスクリーニング方法を用いて得られる胃酸分泌 促進剤、
(18) 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしぐはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその 塩、 （ii) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩に対する抗体、 (iii) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もし くは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌ クレオチド、 （iv) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配 列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害す る化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩に対する抗体、 (vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコ ードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基 配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与 することを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療法、
( 1 9 ) ' (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩の活性を阻害する、 または （b) 配列番号： 7 3、 配列番 号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする上部消化管疾患の予 防 ·治療法、
( 2 0 ) 胃酸分泌抑制剤を製造するための （i) 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合 物またはその塩、 (i i) 上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩に対する抗体、 (i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩をコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列 に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチ センスポリヌクレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号: 7 9で表わされるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の 活性を阻害する化合物またはその塩、 (V) 上記蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体、 (vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩をコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に 相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドの 使用、
( 2 1 ) 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその 塩、 （i i ) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩に対する抗体、 ( i i i ) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もし くは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌ クレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配 列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害す る化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩に対する抗体、 （v i ) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコ —ドするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基 配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与 することを特徴とする胃酸分泌抑制法、
( 2 2 ) (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩の活性を阻害する、 または （b) 配列番号： 7 3、 配列番 号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする胃酸分泌抑制法、 ( 2 3 ) 上部消化管疾患の予防 ·治療剤を製造するための (0 配列番号： 1 で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有す るポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性 を阻害する化合物またはその塩、 ( i i ) 上記ポリぺプチドもしくはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、 ( i i i ) 上記ポリペプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードするポリヌクレオ チドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を 含有するアンチセンスポリヌクレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7
5'、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくは その部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 (vi) 上記蛋白質もしくはその部 分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的も しくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリ 5 ヌクレオチドの使用、
( 2 4 ) 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその 塩、 (i i)上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ 0 の塩、 (i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩をコードするポリヌクレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、 (v) 上記蛋白質もしくは 5 その部分べプチドまたはその塩、 または (vi) 上記蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩をコ一ドするポリヌクレオチドの有効量を投与することを特 徵とする消化不良症- 骨代謝障害または貧血症の予防。治療法、
( 2 5 ) (a) 配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその 0 エステルまたはその塩の活性を促進する、 または (b) 配列番号： 7 3、 配列番 号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同
' 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ , プチドまたはその塩 活性を促進することを特徴とする消化不良症、骨代謝障害 または貧血症の予防 ·治療法、
5 ( 2 6 ) 消化不良症、 骨代謝障害または貧血症の予防 ·治療剤を製造するため の （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、 （i i)上記ポリペプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 (i i i) 上記ポリべプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードするポリヌ クレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配 列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進す る化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその 塩、 または（vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードす るポリヌクレオチドの使用、
( 2 7 ) 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその 塩、 (i i)上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 (i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩をコードするボリヌクレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチド またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくは その部分ペプチドまたはその塩、 または（vi) 上記蛋白質もしくはその部分ぺプ チドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの有効量を投与することを特 徵とする胃酸分泌促進法、
( 2 8 ) (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩の活性を促進する、 または （b) 配列番号： 7 3、 配列番 号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同 一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする胃酸分泌促進法、
( 2 9 ) 胃酸分泌促進剤を製造するための （i) 配列番号： 1で表されるアミ ノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合 物またはその塩、 （i i)上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩、 （i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、 （V) 上記蛋 白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 または（vi) 上記蛋白質もしくは その部分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの使用、
( 3 0 ) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩、または上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を用いることを特徴と する、 胃液分泌能検査法などに関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 NPW投与による血中ガストリン濃度の変化を示す。 値は平均値士標準 偏差 （mean土 SE) (n=8) を示す。 *は生理食塩水投与群に比べて、 P値が 0. 05 以下であることを示す。 発明を実施するための最良の形態
配列番号: 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を有するポリぺプチド (以下、本発明のポリぺプチドと称する場合がある) は、 ヒトゃ温血動物 (例えば、モルモット、 ラット、マウス、ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 塍臓 /3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八 ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂 肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細 胞； 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細 胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 または これら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存 在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大脳 基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、皮膚、 筋肉、 肺、 消 化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細胞もしくは その培養細胞（例、 MEL，M1、 CTLL_2、 HT-2、画- 3、 HL - 60、腿 -1、 K562、 ML - 1、 MOLT- 3、 MOLT- 4、 MOLT- 10、 CCRF- CEM、 TALL_1、 Jurkat, CCRT- HSB- 2、 KE_37、 SKW- 3、 丽-78、 腹 -102、 H9、 U937、 THP - 1、 HEL、 IK- 1、 CMK、 K0- 812、 MEG- 01など） に 由来するポリペプチドであってもよく、 合成ポリペプチドであってもよい。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と例えば約 7 0 %以上、 好ましくは 約 8 0 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、 好ましくは約 9 5 %以上、 より好まし くは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
特に、配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 としては、 上記のアミノ酸配列の他、 （i)配列番号： 1で表されるアミノ酸配列 中の 1〜5個 （好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1〜2個、 より好ましく は、 1個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 (i i) 配列番号： 1で表される アミノ酸配列に 1〜5個 (好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1〜2個、 よ り好ましくは、 1個) のァミノ酸が付加したアミノ酸配列、 (i i i)配列番号： 1 で表されるアミノ酸配列に 1〜 5個（好ましくは 1〜3個、 さらに好ましくは 1 〜2個、 より好ましくは、 1個) のァミノ酸が挿入されたァミノ酸配列、 (iv)配 列番号： 1で表されるアミノ酸配列中の 1〜 5個 (好ましくは 1〜3個、 さらに 好ましくは 1〜2個、 より好ましくは、 1個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換 されたアミノ酸配列、 （V) 上記（i)〜（iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあ げられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有す るポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列を有するポリぺプチドと実質的に同質の活性を有するポリぺプチドなどが好 ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリぺプチドの有する活性（例、 胃酸分泌促進作用など） などがあげられる。
実質的に同質の活性とは、 それらの活性が性質的に （例、 生理化学的に、 また は薬理学的に） 同質であることを示す。
胃酸分泌促進の測定は、 公知の方法に準じて行うことができ、 例えば、
Gastroenterology, 5巻、 43-45頁、 1945年に記載の方法またはそれに準じた方法、 後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
配列番号： 1で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列の具体例 としては、例えば、配列番号： 2、配列番号： 7、配列番号： 8、配列番号： 9、 配列番号： 10、配列番号： 1 1、配列番号： 12、 配列番号： 21、配列番号： 24、 配列番号： 25、 配列番号： 30、 配列番号： 31、 配列番号： 36、 配 列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 41、 配列番号： 42、 配列番号：
43、 配列番号： 44、 配列番号： 45、 配列番号： 46、 配列番号： 47、 配 列番号： 48、 配列番号： 49、 配列番号： 50、 配列番号： 5 1、 配列番号：
52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 56、 配 列番号： 57 配列番号： 58または配列番号： 7 1で表されるアミノ酸配列な どがあげられる。
本発明のポリぺプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有 するポリペプチド、配列番号： 21で表されるアミノ酸配列を有するポリべプチ ド、 配列番号： 7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 8 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 9で表されるァミノ 酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 配列番号： 1 1で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 12で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 24 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 25で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 30で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチド、配列番号： 31で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 3 6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 3 7 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 4 0で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 4 1で表されるアミノ酸配列を有す るポリぺプチド、配列番号： 2で表されるアミノ酸配列を有するポリぺプチド、 配列番号： 4 3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 4 4 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 4 5で ¾されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 4 6で表されるアミノ酸配列を有す るポリぺプチド、配列番号：4 7で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチド、 配列番号： 4 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 4 9 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 5 0で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 5 1で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチド、配列番号: 5 2で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 5 3で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番号： 5 4 で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 5 5で表されるアミ ノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 5 6で表されるアミノ酸配列を有す るポリペプチド、配列番号： 5 7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド および配列番号： 5 8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、 配列番 号： 7 1で表されるァミノ酸配列を有するポリべプチドなどの本発明のポリぺプ チドと特異的に結合する能力を有するポリペプチドがあげられる。
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリぺプチドの前駆体ポリぺプチド をも包含する意味で用いられる。
該前駆体ポリぺプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 6で表されるァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有することを特徴 とするポリぺプチド等があげられる。
より、 具体的には、 配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一の アミノ酸配列としては、配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と約 8 0 %以上、 好ましくは約 9 0 %以上、より好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するァミノ 酸配列などがあげられる。
特に、配列番号： 6で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列 としては、 上記のアミノ酸配列の他、 （i)配列番号： 6で表されるアミノ酸配列 中の 1〜1 5個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ま しくは、 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （i i) 配列番号： 6で 表されるアミノ酸配列に 1〜1 0 0個（好ましくは 1〜 5 0個、 さらに好ましく は 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 (i i i)配列番号： 6で表されるアミノ酸配列に 1〜1 5個 （好ましくは 1〜1 0 個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が揷入 されたアミノ酸配列、 （iv) 配列番号： 6で表されるアミノ酸配列中の 1〜1 5 個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜 3個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 （V)上記（i)〜（iv) を組み合わせたァミノ酸配列などがあげられる。
配列番号： 6で表されるァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列の具体例 としては、 例えば、 配列番号： 2 0、 配列番号： 2 3、 配列番号： 2 9または配 列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列などがあげられる。
上記前駆体ポリペプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 6で表わされ るアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号： 2 0で表されるアミノ酸配列 を有するポリペプチド、配列番号： 2 3で表されるアミノ酸配列を有するポリべ プチド、配列番号： 2 9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドおよぴ配 列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。 本発明のポリべプチドに対する受容体としては、種々の受容体のうち、本発明 のポリぺプチドと結合活性を有し、本発明のポリプチドにより該受容体発現細胞 の細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+ 遊離、 細胞内 cAMP生成 Z抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c_fosの活性化、 pHの低下、 GTP T S結合 活性などを促進する活性等） が観察されるものなどがあげられる。
具体的には、 ( 1 ) GPR8 (配列番号： 7 3 ； Genomi cs, 28巻、 84 - 91頁、 1995 年） または配列番号： 7 3で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質、 （2 ) ラット TGR26 (配列番号： 7 5 ； W0 02/44368号公報） または配列番号： 7 5で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有する受容体、 （ 3 )マウス TGR26 (配列番号： 7 7； W0 02/44368 号公報） または配列番号： 7 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を含有する受容体、 （4 ) GPR7 (配列番号： 7 9； Genomi cs, 28巻、 84- 91頁、 1995年） または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する受容体などがあげられる。 配列番号： 7 3で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を有する蛋白質、配列番号： 7 6で表わされるアミノ酸配列と同一もし くは実質的に同 のアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号： 7 7で表わされる アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質、配列 番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を有する蛋白質 (以下、 これらを本発明の受容体と称する場合がある) は、 ヒ 卜や温血動物 (例えば、 モルモット、 ラット、マウス、ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） の細胞 （例えば、 網膜細胞、 肝細胞、 脾細胞、 神経細 胞、 グリア細胞、 勝臓 ;8細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細 胞、表皮細胞、上皮細胞、 内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満 細胞 好中球、 好塩基球 好酸球 単球） 、 巨核球 滑膜細胞 軟骨細胞 骨細 胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細 胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など） もしくはそれらの細胞が存在するあ らゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 (例、 網膜、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 勝臓、 腎 蔵、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管（例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心齓 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 または血球系の細胞もしくはその培養細胞 (例、 MEL、 Ml、 CTLL- 2、 HT - 2、 WEHI- 3、 HL - 60、 匪- 1、 K562、 ML_1、 MOLT - 3、 MOLT- 4、 MOLT - 10、 CCRF - CEM、 TALL_1、 Jurkat , CCRT- HSB- 2、 KE- 37、 SKW- 3、 HUT - 78、 HUT- 102、 H9、 U937、 THP- 1、 HEL、 JK- 1、 CMK、 KO- 812、 MEG-01など) に由来する 蛋白質であってもよく、 合成蛋白質であってもよい。
配列番号： 7 3で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 配列番号： 73で表わされるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが あげられる。
配列番号： 75で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 75で表されるアミノ酸配列と 85%以上、 好ましくは 約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列など が挙げられる。
配列番号： 77で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 例えば、 配列番号： 77で表されるアミノ酸配列と 86%以上、 好ましくは 約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列など が挙げられる。
配列番号： 79で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列とし ては、 配列番号： Ί 9で表わされるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、より好ましくは約 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが あげられる。
配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表 されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 73 配列番号： 76、 配列番号： 77または配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号： 73、 配列番号： 76、 配列番号： 77または配列番号： 79で表されるァミノ 酸配列を有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表 わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 （i) 配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表されるァミノ 酸配列中の 1〜15個 （好ましくは 1~10個、 さらに好ましくは 1〜5個、 よ り好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 （ii)配列番号： 73、 配列番号： 75、 配列番号： 77または配列番号： 79で表されるァミノ 酸配列に 1〜15個 （好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜 5個、 より 好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 （iii) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるァミノ 酸配列に 1〜1 5個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より 好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 （iv)配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表されるァミノ 酸配列中の 1〜1 5個 （好ましくは 1〜1 0個、 さらに好ましくは 1〜5個、 よ り好ましくは、 1〜 3個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 (V) 上記（i)〜（iv)を組み合わせたアミノ酸配列などがあげられる。
本発明の受容体の具体例としては、 例えば、 配列番号： 7 3で表されるァミノ 酸配列を含有する蛋白質、配列番号： 7 5で表されるアミノ酸配列を含有する蛋 白質、 配列番号： 7 7で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質、 配列番号： 7 9で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質などが用いられる。
本発明のポリペプチドに対する受容体の部分ペプチド (以下、本発明の部分べ プチドと称する場合がある) としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用 いることのできる部分ペプチドであれば、 いかなるものであっていてもよいが、 好ましくは、本発明のポリペプチドに対する結合能を有する部分ペプチド、細胞 膜外領域に相当するアミノ酸配列を含有する部分ペプチド等が用いられる。本発 明の受容体の構成アミノ酸配列のうち 2 0個以上 好ましくは 5 0個以上、 より 好ましくは 1 0 0個以上のァミノ酸配列を有するぺプチドなどが好ましい。 (i) 上記アミノ酸配列中の 1または 2個以上 (好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好 ましくは数個 ( 1〜5個) ) のアミノ酸が欠失し、 ( i i ) 上記アミノ酸配列に 1 または 2個以上 （好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数個 ( 1〜5個) ) のアミノ酸が付加し、 または (i i i) 上記 アミノ酸配列中の 1または 2個以上（好ましくは 1〜1 0個程度、 より好ましく は数個、 さらに好ましくは 1〜5個程度） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され ていてもよい。
具体例としては、 )配列番号： 7 3で表されるアミノ酸配列中、 1番目（Met) 〜123番目 （Phe) のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部、 301番目 （Asn) 〜358番目 （Lys) のアミノ酸残基からなる部分アミノ酸配列もし くはその一部、 548番目 （Tyr) 〜593番目 （Arg) のアミノ酸残基からなる部分ァ ミノ酸配列もしくはその一部、 および 843番目 （Al a) 〜895番目 （l i e) のァミノ 酸残基からなる部分アミノ酸配列もしくはその一部から選択される 1または 2 以上の部分アミノ酸配列を含有する部分ペプチド、 （b) 配列番号： 7 5で表さ れるアミノ酸配列中、 1番目 （Met) 〜85番目 （Asp) のアミノ酸残基からなる部 分アミノ酸配列もしくはその一部、 または 222番目 （Cys) 〜329番目 （Al a) のァ ミノ酸残基からなる部分ァミノ酸配列もしくはその一部を含有するべプチドな どがあげられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、 ペプチド標記の慣 例に従って左端が N末端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 (力ルポキシル末端) で ある。本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドは、 C末端がカル ポキシル基 (-C00H) 、 カルポキシレート（- C00— ) 、 アミド (-C0NH2) またはエス テル (-C00R) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—プチルなどの C wアルキル基、 例えば、 シクロペンチ ル、 シクロへキシルなどの C3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフ チルなどの C6_12ァリール基、例えば、ベンジル、 フエネチルなどのフエニル— C
Mアルキル基もしくは《—ナフチルメチルなどの a—ナフチルー C Mアルキル 基などの C 7— 14ァラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるビバロイル 才キシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分べプチドが C末端以外にカルボ キシル基 (またはカルポキシレート) を有している場合、 カルボキシル基がアミ ド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この 場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。 さらに、 本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドには、 N末端 のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル 基、 ァセチル基などの アルカノィルなどの c 6ァシル基など） で保護されて いるもの、生体内で切断されて生成する N末端のグルタミン残基がピロダルタミ ン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば- 0H、 - SH、 ァミノ 基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例え ば、ホルミル基、ァセチル基などの _6アルカノィル基などの ァシル基など） で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋 白質なども含まれる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドの塩としては、 生理学 的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） などと の塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このよう な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） と の塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイ ン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホ ン酸、 ベンゼンスルホン酸) との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、前述したヒトゃ温 血動物の細胞または組織から公知のポリぺプチドの精製方法によって製造する こともできるし、後述するポリペプチドをコードする D N Aで形質転換された形 質転換体を培養することによつても製造することができる。 また、後述のぺプチ ド合成法に準じて製造することもできる。 例えば、 W0 01/98494号公報、 W0 02/44368号公報などに記載の方法に準じて製造することができる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマ トグラフィ一、イオン交換ク口マトグラフィーなどのクロマトグラフィ一を組み 合わせることにより精製単離することができる。
本発明のポリペプチド、 受容体、 その部分ペプチド、 もしくはそれらの塩、 ま たはそれらのアミド体の合成には、通常市販のポリペプチド合成用樹脂を用いる ことができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル榭脂、 ヒドロキ シメチル榭旨、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル榭 J3旨、 4 _ベンジルォ キシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹 脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリ ルアミド樹脂、 4— ( 2，， 4 ' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フエノ キシ榭脂、 4一 （2 '， 4 ' -ジメトキシフエ二ルー F m o cアミノエチル） フエノ キシ樹脂などをあげることができる。 このような樹脂を用い、 ーァミノ基と側 鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリべ プチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジ スルフィド結合形成反応を実施し、 目的のポリペプチド、 受容体、 部分ペプチド またはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジ イミド類としては、 D C C、 N, N'—ジイソプロピルカルポジイミド、 N - X チルー N'— ( 3—ジメチルァミノプロリル）カルポジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 (例えば、 H O B t、 H O O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物または H O B tエステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活 性化を行なつた後に樹脂に添加することができる。
保護ァミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリべプチ ド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド, N, N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピ ロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化 水素類、 トリフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドな どのスルホキシド類、 ピリジン, ジォキサン， テ卜ラヒドロフランなどのェ一テ ル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸 ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応 温度はポリぺプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から 適宜選択され、通常約一 2 0〜5 の範囲から適宜選択される。活性化された アミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用い たテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反 応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても 十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用い て未反応アミノ酸をァセチル化することによって、後の反応に影響を与えないよ うにすることができる。 原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Bo c、 t一ペンチルォキシ 力ルポニル、イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベン ルォキシカル ポニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエ二ル、 ジフエニル ホスフイノチオイル、 Fmo cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 t一ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2ーァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしくは環状ァ ルキルエステル化) 、 ァラルキルエステル化 (例えば、 ベンジルエステル、 4— ニトロべンジルエステル、 4 _メトキシベンジルエステル、 4—クロ口べンジル エステル、 ベンズヒドリルエステル化) 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキ シカルポニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルボニルヒドラジド化、 トリチルヒ ドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級 (C ^6) アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシ カルポニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いら れる。 また、 ェ一テル化に適する基としては、 例えば.， ベンジル基、 テトラヒド ロピラエル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12- B z 1、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4ーメトキシ -2, 3, 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、ベンジルォキシメチル、 Bum、 Bo c、 Tr t、 Fmo cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水 物、 アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペン夕クロ口フエノール、 2， 4; 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N— ヒドロキシフタルイミド、 H〇B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いら れる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジィソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約 _ 2 0〜4 O の温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソ一ル、 フ ェノール、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾ一ル、 ジメチルスルフ イド、 1 , 4—ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのようなカチ ォン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として 用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチオフェノール処理により除去され、 トリプトファンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2 一エタンジチオール、 1 , 4一ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護 基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から 適宜選択しうる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得る別の 方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ末端アミノ酸の α—力ルポキシル基を アミド化して保護した後、 アミノ基側にペプチド （ポリペプチド）鎖を所望の鎖 長まで延ばした後、該ペプチド鎖の Ν末端の ーァミノ基の保護基のみを除いた ポリぺプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリぺプチド とを製造し、 この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮 合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリべプチ ドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、所望の粗ポリべプチ ドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精 製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチド、受容体またはその部 分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得るに は、例えば、 カルポキシ末端アミノ酸のひ—カルボキシル基を所望のアルコール 類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポリペプチド、受容体またはその部分べ プチドのアミド体と同様にして、所望のポリペプチド、受容体またはその部分べ プチドのエステル体を得ることができる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドは、公知のペプチドの 合成法に従って、 あるいは受容体の部分ペプチドについては、 受容体を適当なぺ プチダーゼで切断することによって製造することができる。ぺプチドの合成法と しては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明のポリぺプチド、受容体またはその部分べプチドを構成し得る部分べプチ ドもしくはァミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保 護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造することができる。公知の縮合 方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の （a)〜 （e) に記載された方法が あげられる。
(a) M. Bodanszkyおよび M. A. Ondei t i , ペプチド ·シンセシス （Pept ide Syn thes i s) , Intersc i ence Pub l ishers, New York (1966年)
(b) Schroederおよび Luebke、 ザ'ペプチド（The Pept i de)， Academi c Press, New York (1965年）
(c) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(d)矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、
(1977年）
(e) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸啬 ·カラムクロマトダラ フィ一'液体クロマトグラフィ一'再結晶などを組み合わせて本発明のポリぺプ チド、受容体またはその部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で 得られるポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドが遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができ るし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって 遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコードする DNAと しては、前述した本発明のポリペプチド、受容体またはその部分ペプチドをコー ドする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲ ノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 前記した細胞'組織由 *の cDNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ一、合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より total RN Aまたは mRN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse
Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT-PCR法と略称する) によ つて増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコードする DNAとしては、 例えば (a) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 13、 配列番号： 14、 配列番号： 15、 配列番 号： 16、 配列番号： 17、配列番号： 18、 配列番号： 26、配列番号： 27、 配列番号： 32、配列番号： 33、配列番号： 38、配列番号： 39、 配列番号： 59、 配列番号： 6 ( 配列番号： 61、 配列番号： 62、 配列番号： 63、 配 列番号： 64、 配列番号： 65、 配列番号： 66、 配列番号： 67、 配列番号： 68、 配列番号： 69、 配列番号： Ί 0または配列番号： 72で表わされる塩基 配列を含有する DNA、 (b) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 1 3、 配列番号： 14、配列番号： 15、配列番号： 16、配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 26、 配列番号： 27、 配列番号： 32、 配列番号： 33、 配 列番号： 38、 配列番号： 39、 配列番号： 59、 配列番号： 60、 配列番号： 61、 配列番号： 62、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 65、 配 列番号： 66、 配列番号： 67、 配列番号： 68、 配列番号： 69、 配列番号： 70または配列番号： 72で表わされる塩基配列とハイストリンジエンドな条件 下でハイプリダイズする塩基配列を有し、本発明のポリぺプチドと実質的に同質 の活性を有するポリペプチドをコードする DNA、 （c) 配列番号： 5、 配列番 号： 19、 配列番号： 22、 配列番号： 28または配列番号： 34で表わされる 塩基配列を含有する DNA、 または （d) 配列番号： 5、 配列番号： 19、 配列 番号： 22、 配列番号： 28または配列番号： 34で表わされる塩基配列とハイ ストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有する DN Aなど であれば何れのものでもよい。
(i) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号'： 13、 配列番号： 14、 配列 番号： 15、 配列番号： 16、 配列番号： 17、 配列番号： 18、 配列番号： 2
6、 配列番号： 27、 配列番号： 32、 配列番号： 33、 配列番号： 38、 配列 番号： 39、 配列番号： 59、 配列番号： 60、 配列番号： 61、 配列番号： 6 2、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 65、 配列番号： 66、 配列 番号： 67、配列番号： 68、配列番号： 69、配列番号： 70または配列番号：
72で表わされる塩基配列、 または （ii) 配列番号： 5、 配列番号： 19、 配列 番号： 22、 配列番号： 28または配列番号： 34で表わされる塩基配列とハイ ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる D N Aとしては、例えば、そ れぞれ （i) 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 13、 配列番号： 14、 配列番号： 15、配列番号： 16、配列番号： 17、配列番号： 18、配列番号： 26、 配列番号： 27、 配列番号： 32、 配列番号： 33、 配列番号： 38、 配 列番号： 39、 配列番号： 59、 配列番号： 60、 配列番号： 61、 配列番号：
62、 配列番号： 63、 配列番号： 64、 配列番号： 65、 配列番号： 66、 配 列番号： 67、 配列番号： 68、 配列番号： 69、 配列番号： ？ 0または配列番 号： 72で表される塩基配列、 または （ii) 配列番号： 5、 配列番号： 19、 配 列番号： 22、 配列番号： 28または配列番号： 34で表わされる塩基配列と約
70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好 ましくは約 95 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する D N Aなどが用い られる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラリ —を使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。 ハイストリンジェン卜な条件とは、例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40m M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜70°C、 好ましくは約 60 〜 65 °Cの条件を示す。特に、 ナトリゥム濃度が約 19 mMで温度が約 65 °Cの 場合が最も好ましい。
より具体的には、
(i)配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードす る DNAとしては、配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが 用いられ、
(ii) 配列番号： 2で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DN Aとしては、配列番号： 4で表わされる塩基配列を含有する DN Aなど が用いられ、
(iii)配列番号： 7で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DNAとしては、配列番号： 13で表わされる塩基配列を含有する DNAな どが用いられ、
(iv) 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DNAとしては、配列番号： 14で表わされる塩基配列を含有する DNAな ど:^用いられ
(V)配列番号： 9で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードす る DNAとしては、配列番号： 15で表わされる塩基配列を含有する DNAなど が用いられ、
(vi) 配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、配列番号： 16で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、
(vii)配列番号： 11で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、配列番号： 17で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、
(viii) 配列番号： 12で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 18で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、 (ix) 配列番号： 24で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、配列番号： 26で表わされる塩基配列を含有する DNA などが用いられ、
(X)配列番号： 25で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコード する DNAとしては、配列番号： 27で表わされる塩基配列を含有する DNAな どが用いられ、
(xi) 配列番号： 30で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、配列番号： 32で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、
(xii)配列番号： 31で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DN Aとしては、配列番号： 33で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、
(xiii) 配列番号： 36で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 38で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xiv)配列番号： 37で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては 配列番号： 39で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、
(XV) 配列番号： 40で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DN Aとしては、配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DN Aな どが用いられ、
(xv i)配列番号： 41で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、配列番号： 59で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、
(xvii) 配列番号： 42で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 60で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xviii)配列番号： 43で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 61で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xix)配列番号： 44で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ一 ドする DN Aとしては、配列番号： 62で表わされる塩基配列を含有する DNA などが用いられ、
(XX) 配列番号： 45で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコー ドする DNAとしては、配列番号： 63で表わされる塩基配列を 有する DNA などが用いられ、
(xxi)配列番号： 46で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ一 ドする DNAとしては、配列番号： 64で表わされる塩基配列を含有する DN A などが用いられ、
(xxii) 配列番号： 47で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ —ドする DN Aとしては、配列番号： 65で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xx i i i)配列番号： 48で表わされるァミノ酸配列を含有するポリぺプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 26で表わされる塩基配列を含有する DN
Aなどが用いられ、
(xxiv) 配列番号： 49で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 32で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(XXV)配列番号： 50で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ一 ドする DNAとしては、配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DN Aな どが用いられ、
(xxvi) 配列番号： 51で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DNA などが用いられ、
(xxvii)配列番号： 52で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ドする DNAとしては、配列番号： 66で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xxviii) 配列番号： 53で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DN Aとしては、配列番号： 67で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられ、
(xx ix) 配列番号： 54で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 68で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(XXX)配列番号： 55で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ一 ドする DNAとしては、配列番号： 69で表わされる塩基配列を含有する DNA などが用いられ、
(xxxi) 配列番号： 21で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 70で表わされる塩基配列を含有する DN
Aなどが用いられ、
(xxxii)配列番号： 56で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 66で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(xxxiii) 配列番号： 57で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを コードする DNAとしては、配列番号： 3で表わされる塩基配列を含有する DN
Aなどが用いられ、
(xxx iv)配列番号： 58で表わされるァミノ酸配列を含有するボリぺプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 66で表わされる塩基配列を含有する DN Aなどが用いられ、
(XXXV) 配列番号： 7 1で表わされるァミノ酸配列を含有するポリペプチドをコ ードする DNAとしては、配列番号： 72で表わされる塩基配列を含有する D N Aなどが用いられる。
本発明の受容体をコードする DNAとしては、 例えば、 （1) 配列番号： 74 で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 74で表わされる塩基 配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、配 列番号： 73で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質をコードする DNA、 (2)配列番号： Ί 6で表される塩基配列を含有 する DNA、 または配列番号： 76で表わされる塩基配列とハイストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、配列番号： 75で表されるァ ミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコ一ドする D NA、 (3) 配列番号： 78で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列 番号： Ί 8で表わされる塩基配列とハイストリンジエンドな条件下で Λイブリダ ィズする塩基配列を有し、配列番号： 77で表されるアミノ酸を含有する蛋白質 と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA、 （4) '配列番号： 8 0で表される塩基配列を含有する DNA、 または配列番号： 80で表わされる塩 基配列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、 配列番号： 79で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有 する蛋白質をコードする DN Aなどであれば何れのものでもよい。
配列番号： 74、 配列番号： 76、 配列番号： 78または配列番号： 80で表 わされる塩基配列とハイストリンジエンドな条件下でハイブリダイズできる D N Aとしては、 例えば、 それぞれ配列番号： 74、 配列番号： 76、 配列番号： 78または配列番号： 80で表わされる塩基配列と約 70%以上、好ましくは約 80%以上、 より好ましくは約 90%以上、 さらに好ましくは約 95%以上の相 同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイプリダイゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クロ一ニング (Molecular Cloning) 2nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、ハイストリンジェントな 条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜40m M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜70 ：、 好ましくは約 60 〜65 °Cの条件を示す。特に、 ナトリウム濃度が約 19 mMで温度が約 65°Cの 場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 73で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質 をコードする DNAとしては、配列番号： 74で表わされる塩基配列を含有する DNA、配列番号： 75で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードす る DNAとしては、 配列番号： 76で表わされる塩基配列を含有する DNA、 配 列番号： 77で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNAと しては、 配列番号： 78で表わされる塩基配列を含有する DNA、 配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列を含有する蛋白質をコードする DNAとしては、配 列番号： 80で表わされる塩基配列を含有する DNAなどが用いられる。
本発明の受容体の部分ペプチドをコードする DNAとしては、前述した本発明 の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかな るものであってもよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記 した細胞 ·組織由来の c DNA、 前記した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリ 一、 合成 DNAのいずれでもよい。
本発明の受容体の部分べプチドをコードする D N Aとしては、 例えば、 (1) 配列番号： 74で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する D NA、 または配列番号： 74で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条 件下でハイブリダィズする塩基配列を有し、配列番号： 73で表されるアミノ酸 を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAの 部分塩基配列を有する DNA、 (2) 配列番号： 76で表わされる塩基配列を有 する D N Aの部分塩基配列を有する D N A、 または配列番号： 76で表わされる 塩基配列とハイストリンジエンドな条件下でハイプリダイズする塩基配列を有 し、配列番号： 75で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性 を有する蛋白質をコードする DNAの部分塩基配列を有する DNA、 (3)配列 番号： 78で表わされる塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 77で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下で ハイブリダィズする塩基配列を有し、配列番号： 75で表されるアミノ酸を含有 する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DN Aの部分塩 基配列を有する DNA、 （4)配列番号： 80で表わされる塩基配列を有する D NAの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 80で表わされる塩基配 列とハイストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする塩基配列を有し、配列 番号： 79で表されるアミノ酸を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質をコードする DN Aの部分塩基配列を有する DN Aなどが用いられる。 配列番号： 7 4、 配列番号： 7 6、 配列番号： 7 8または配列番号： 8 0で表 わされる塩基配列とハイブリダィズできる D NAは、 前記と同意義を示す。
八イブリダイゼーションの方法および八イス卜リンジエンドな条件は前記と 同様のものが用いられる。
また、本発明の受容体の部分ペプチドをコードする D NAとしてより具体的に は、配列番号： 7 3で表されるアミノ酸配列中、 1番目 （Met)〜43番目 （Phe)、 101番目 (Asn) 〜118番目 (Lys) 、 188番目 (Tyr) 〜213番目 （Arg) および 283 番目 （Ala) 〜295番目 （l ie) で表される部分アミノ酸配列から選択される 1ま たは 2以上の部分アミノ酸配列を含有する部分べプチドをコ一ドする塩基配列 を有する D NAを含有する D NA、またはこれらとハイストリンジェントな条件 下で八ィブリダイズする塩基配列を有する D N Aを含有する D N Aなどがあげ られる。
本発明のポリべプチド、受容体またはその部分べプチドをコ一ドする D NAは、 公知の方法で標識化されていてもよく、具体的にはァイソトーブラベル化された もの、 蛍光標識されたもの (例えば、 フルォレセインなどによる蛍光標識） 、 ビ ォチン化されたものまたは酵素標識されたものなどがあげられる。好ましくはァ イソトーブラペル化された本発明のポリペプチドが用いられる。
本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチド （以下、 これらポリべ プチド等をコードする D N Aのクローニングおよび発現の説明においては、これ らポリぺプチド等を単に本発明のポリぺプチドと略記する場合がある)を完全に コードする D NAのクローニングの手段としては、本発明のポリぺプチドの部分 塩基配列を有する合成 D N Aプライマーを用いて公知の P C R法によって増幅 するか、または適当なベクターに組み込んだ D N Aを本発明のポリぺプチドのー 部あるいは全領域をコードする D NA断片もしくは合成 D NAを用いて標識し たものとのハイブリダイゼーシヨンによつて選別することができる。ハイブリダ ィゼーシヨンの方法は、 例えば、 Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al . , Cold Spr ing Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと ができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載 の方法に従って行なうことができる。 DNAの塩基配列の変換は、 公知のキット、例えば、 MutanTM_super Express Km (宝酒造（株）） 、 Mutan™- K (宝酒造（株）） 等を用いて、 0DA- LAPCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なう ことができる。
クローン化されたポリペプチドをコードする DN Aは目的によりそのまま、ま たは所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用すること ができる。 該 DNAはその 5' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3'末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有し ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成 DNA 7ダブ夕一を用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （ィ)本発明のポリべプチ ドをコードする DN Aから目的とする DN A断片を切り出し、 (口）該 DNA断 片を適当な発現べクタ一中のプロモータ一の下流に連結することにより製造す ることができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド (例、 PBR322, pBR32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110， pTP 5， p C 194) ,酵母由来プラスミド （例 p SH 19， p SH 15)、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， パキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 p A 1 - 1 1、 pXTl、 pR c/CMV、 pRc/RSV、 p c DNA I N e oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモー夕一であればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 H I V ' LTRプロモー夕一、 CMVプロモータ一、 HSV-TKプロモーターなどがあ げられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 SR CKプロモ —ターなどを用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモ一ター、 l acプロモー夕一、 r e cAプロモーター、 APLプロモ一 夕一、 l ppプロモータ一、 T 7プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SP01プロモータ一、 SP02プロモータ一、 p enPプロモータ 一など、宿主が酵母である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモ一夕一、 GAPプロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞であ る場合は、 ポリヘドリンプロモ一夕一、 P 10プロモーターなどが好ましい。 発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることがで きる。 選択マ一カーとしては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f r と略称する場合がある) 遺伝子 〔メソ卜レキセ一卜 (MTX) 耐性〕 、 アンピシ リン耐性遗伝子 (以下、 Amp rと略称する場合がある) 、 ネオマイシン耐性遺 伝子 (以下、 Ne o rと略称する場合がある、 G418耐性) 等があげられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝子 を選択マ一カーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のポリペプチドの N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA ·シグナル 配列 OmpA。シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 《—ァ ミラーゼ'シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母であ る場合は、 MFa ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細 胞である場合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 a—ィンターフェロン ·シグ ナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードする DNAを含有 するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、例えば、ェシエリヒア ·コリ（Escherichia cali) K 12 - DH 1 CProc. Natl. Acad. Sci. USA, 60巻， 160(1968)〕 ， J Ml 03 [Nucleic Acids Research, 9巻, 309 (1981)〕 ， JA221 [Journal of Molecular Biology, 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 (Journal of Molecular Biology, 41巻， 459 (1969)〕 ， C 600 [Genetics, 39巻， 440(1954)〕 などが 用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis) M I 114 (Gene, 24卷， 255 (1983)〕 , 207— 21 [Journal of Biochemistry, 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22R—， NA87 - 11 A, DKD— 5D， 20 B—12、 シゾサッカロマイセス ボンべ （Schizosaccharomyces pombe) NC YC 1913, NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) K M71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia niの中 腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイ ルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N細胞； BmN細胞） などが用いられる。該 S f細胞としては、例えば、 S f 9細胞（ATCCCRL1711)、 S f 21細胞 （以上、 In Vivo, 13, 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 315巻， 592 (1985)] 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS - 7, Vero, チャイニーズ八ムスタ一 細胞 CH0 (以下、 CH0細胞と略記） ， dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CH0 (以下、 CHO (dhfr)細胞と略記） , マウス L細胞， マウス AtT- 20， マウスミエ ローマ細胞， ラット GH3, ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69巻， 2110 (1972)や Gene, 17巻, 107 (1982)などに記載の方法に従って行なうこ とができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば Molecular & General Genetics, 168 卷， Ilia 979)などに記載の方法に従つて行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 Methods in Enzymology, 194卷， 182-187 (1991) , Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA, 75巻， 1929 (1978)などに記載の 方法に従つて行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 Bio/Techno logy, 6， 47 - 55 (1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコ一ル. 263-267 (1995) (秀潤社発行) 、 Vi ro logy, 52巻， 456 (1973)に記載の 方法に従つて行なうことができる。
このようにして、ポリペプチドをコードする D NAを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、 例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカ一、 ペプトン、 力 ゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機 物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシ ゥムなどがあげられる。 また、 酵母エキス ビタミン類、 成長促進因子などを添 加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 [Journal of Exper iments in Mol ecul ar Genet ics, 431-433, Co l d Spr ing Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。 ここに必要によ りプロモ一夕一を効率よく働かせるために、例えば、 3 ιδ—インドリルアクリル 酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒア属菌の場合、培養は通常約 1 5〜 4 3 °Cで約 3〜 2 4時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 3 0〜4 0 で約6〜2 4時間行な い、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ —ルダ一（Burkholder)最小培地〔Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA, 77巻， 4505 (1980)〕 や 0 . 5 %カザミノ酸を含有する S D培地 GProc. Nat l . Acad. Sci. USA, 81 巻， 5330 α 984)〕があげられる。培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 2 0〜 3 5 °Cで約 2 4〜 7 ·2時間行ない、必要に応じて通気や撹拌 を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace' s Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962) ) に非動化した 1 0 %ゥシ血清 等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6 . 2〜6 . 4 に調整するのが好ましい。培養は通常約 2 7 で約 3〜5日間行ない、必要に応 じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜 2 0 %の胎児牛血清を含む M EM培地 [Science, 122巻， 501 (1952)〕 , DM E M培地 [Vi rology, 8巻, 396 (1959) ] , R P M I 1 6 4 0培地 [The Journal of the American Medical Associat ion 199巻， 519 (1967)〕 ， 1 9 9培地
[Proceeding of the Society for the Bi ological Medicine, 73巻， 1 (1950) 3 などが用いられる。 p Hは約 6〜8であるのが好ましい。培養は通常約 3 0〜4 0 で約1 5〜6 0時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明の ポリぺプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方 法により行なうことができる。
本発明のポリぺプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊し たのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用 いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X - 1 0 0™などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチド が分泌される場合には、培養終了後、公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを 分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるポリペプチド の精製は、 公知の分離'精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。 これら の公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィ 一などの荷電の差を利用する方法、ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなどの特 異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差 を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用い られる。
かくして得られるポリべプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法ある いはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合 には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換す ることができる。
なお、組換え体が産生するポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白 修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分 的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモ 卜リプシン、 アルギニルェンドぺプチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダ ーゼなどが用いられる。
本発明のポリペプチドまたは受容体に対する抗体（以下、単に本発明の抗体と 称する場合がある) は、本発明のボリぺプチドまたは受容体を認識し得る抗体で あれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであってもよい。 本発明のポリペプチドまたは受容体に対する抗体は、本発明のポリペプチドま たは受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従つて製造す ることができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリぺプチドまたは受容体は、温血動物に対して投与により抗体産生 が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際し て抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントァ ジュバントを投与してもよい。投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、計 2〜1 0回 程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モ ルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリがあげられるが、 マウスお よびラットが好ましく用いられる。
モノク口一ナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾 臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同 @または異種動 物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイプリドー マを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、後記の標識化 ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定 することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラー とミルスタインの方法 [Nature, 256、 495 (1975)〕 に従い実施することができ る。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール (PEG) やセンダイ ゥィルスなどがあげられるが.. 好ましくは PEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS-1、 P3U1、 SP2/0, AP- 1などの温血動物の骨 髄腫細胞があげられるが、 P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞 (脾臓細胞） 敎と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1： 1〜20： 1程度であり、 PEG (好ましくは PEG1000〜PEG6000) が 10〜80 %程度の濃度で添加され、 20〜40 ：、 好まし <は 30〜37°Cで 1〜10分間ィンキュベートすることにより効率よく細胞融 合を実施できる。
モノク口一ナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が 使用できるが、 例えば、 ポリペプチド (蛋白質) 抗原を直接あるいは担体ととも に吸着させた固相（例、マイクロプレー卜）にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識された抗免疫グロプリン抗体（細胞融合に用い られる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） または プロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免 疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養 上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識されたポリペプチドを加え、 固相に 結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加 した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハ イブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜20%の牛胎児血清を含む RPMI 1640培地、 1〜10%の牛 胎児血清を含む GIT培地 （和光純薬工業 （株） ） あるいはハイプリドーマ培養用 無血清培地 （SFM-101、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度 は、 通常 20〜40t、 好ましくは約 37 である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好 ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうことができ る。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様 にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコ一ル沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 (例、 謹) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相ある いはプロティン Aあるいはプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採 取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。 〔ポリクローナル抗 #:の作製〕
本発明のボリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従つて製造 することができる。 例えば、 免疫抗原 (ポリペプチド抗原) 自体、 あるいはそれ とキヤリァー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリぺプチドに対する 抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができ る。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合 体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリア一蛋白質とハプテンとの混合 比は、キャリアー蛋白質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良く ?·きれば、 どのようなものをどのような比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥ シ血清アルブミンゃゥシサイログロプリン、へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用 いられる。
また、ハプテンとキャリアー蛋白質の力プリングには、種々の縮合剤を用いる ことができるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステ ル、チォ一ル基、ジチォピリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュパントを投与してもよい。投 与は、 通常約 2 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜 1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水など、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。ポリク口一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことが できる。
本発明のポリペプチド、 受容体またはその部分ペプチドをコードする D NA (以下、 これらの D NAを本発明の D NAと略記する場合がある） に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンスポリヌクレオチド（好ま しくは D NA) (以下、 7ンチセンス D N Aと略記する場合がある ) としては、 本発明の D NAに相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有し、該 D NA の発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンス D N Aで あってもよい。
本発明の D NAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明の D NAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列などがあげら れる。 特に、 本発明の D NAの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のポリペプチド の N末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、 開始コドン付近の塩基配列 など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンス D N Aが 好適である。 これらのアンチセンス D NAは、公知の D NA合成装置などを用い て製造することができる。
本発明のアンチセンス D NAは、 変化せしめられたり、 修飾された糖、 塩基、 結合を含有していて良く、 リボゾーム、 ミクロスフエアのような特殊な形態で供 与されたり、遺伝子治療により適用されたり、 付加された形態で与えられること ができうる。 こうして付加形態で用いられるものとしては、 リン酸基骨格の電荷 を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用 を高めたり、 核酸の取込みを増大せしめるような脂質 （例えば、 ホスホリピド、 コレステロールなど) といつた疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい 脂質としては、 コレステロールやその誘導体 (例えば、 コレステリルクロ口ホル メート、 コール酸など） が挙げられる。 こうしたものは、 核酸の 3 '端あるいは 5 '端に付着させることができ、 塩基、 糖、 分子内ヌクレオシド結合を介して付 着させることができうる。その他の基としては、核酸の 3 '端あるいは 5 '端に特 異的に配置されたキャップ用の基で、ェキソヌクレアーゼ、 R N a s eなどのヌ クレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用 の基としては、 ポリエチレングリコール、 テトラエチレングリコールなどのグリ コールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが それ に限定されるものではない。
アンチセンス D NAの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生 体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のぺプチドまたは受容体の生体内や生体外 の翻訳系を用いて調べることができる。 以下に、 （a) 本発明のポリペプチド、 （b) 本発明の受容体 （以下、 その部分 ペプチドも含む） 、 （c) 本発明の D NA、 (d) 本発明の抗体および （e) 本発 明のアンチセンス D NAなどの用途を説明する。
( 1 )本発明のポリペプチドが関与する疾患の予防，治療剤、 胃液分泌能検査剤 本発明のポリペプチドは、 本発明の受容体、 例えば GPR8、 GPR7, ラット TGR26 またはマウス TGR26などの発現細胞の細胞刺激活性を有し、 本発明の受容体の内 因性リガンドである。本発明のポリべプチドは、胃酸分泌促進作用などを有する。 本発明のポリペプチドまたは本発明の D NAに異常があったり、欠損している 場合、または本発明の受容体または該受容体をコードする D NAに異常があった り、 欠損している場合には、 例えば、 消化不良症 （例、 下垂体性消化不良症、 腎 性消化不良症など） 、 骨代謝障害 （例、 骨粗しょう症、 骨軟化症など） 、 貧血症 (例、 鉄欠乏性貧血など） などとなる可能性が高い。 従って、 本発明のポリぺプ チドおよび本発明の D NAは、例えば、 胃酸分泌促進剤として使用することがで き、 例えば、 消化不良症 （例、 下垂体性消化不良症、 腎性消化不良症など） 、 骨 代謝障害（例、 骨粗しょう症、 骨軟化症など） 、貧血症（例、 鉄欠乏性貧血など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。本発明のポリペプチドは、 さ らに胃液分泌能検査剤としても使用できる。
本発明のポリペプチドおよび本発明の D N Aは、例えば、 生体内において本発 明のポリペプチドが減少あるいは欠損している患者がいる場合に、 (ィ)本発明 の D NAを該患者に投与し、生体内で本発明のポリぺプチドを発現させることに よって、 （口）細胞に本発明の D NAを揷入し、 本発明のポリペプチドを発現さ せた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または.ひ、） 本発明のポリべ プチドを該患者に投与することなどによって、該患者における本発明のポリぺプ チドの役割を十分に あるいは正常に発揮させることができる。
本発明の D NAを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、該 D NAを単独 あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァ ソシエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクタ一に挿入した後、常套手段 に従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D N Aは、 そ のままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体と ともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによつ て投与できる。
本発明のポリペプチドを上記の予防 ·治療剤として使用する場合は、少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましく は- 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしく はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射 剤の形で非経口的 （好ましくは皮下投与） に使用できる。 例えば、 本発明のポリ ペプチドを生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安 定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態 で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量 は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。'
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物 は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方する ことができる。
注射用の水性液としては、 例えば 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 (例えば、 D—ソルビト一ル、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムな ど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール (例えば、 ェ夕ノ ールなど) 、 ポリアルコール (例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレング リコールなど） 、 非イオン性界面活性剤 (例えば、 ポリソルべ一ト 80™、 HCO-50 など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが あげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどと併用 してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液な ど） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定 剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例 えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよ い。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明の D NAが挿入されたべクタ一も上記と同様に製剤化され、通常、 非経 口的に使用される。
このようにし T得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。 本発明のポリペプチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、例えば、 骨粗しょう症の治療の目的で本発明のポリペプチドを 皮下投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） においては、 一日につき該 ポリペプチドを約 0. l〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0 〜20mg投与する。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与するこ とができる。
本発明のポリペプチドは、 胃液分泌能検査剤として使用できる。本発明のポリ ペプチドを被験者に投与し、 胃液の分泌程度を、 BAO (basal acid output) 、 MAO daximal acid output) などを指標とし、 測定する。 これより、 胃液分泌細胞 の機能残存程度、胃細胞の萎縮程度などが判明し、十二指腸潰瘍、逆流性食道炎、 胃炎、 胃潰瘍、 萎縮性胃炎、 胃癌などの治療効果、 経過観察、 再発、 予防の上で 一指標となるとともに、 手術範囲を決める際にも有用である。
( 2 ) 胃酸分泌促進または阻害作用を有する医薬候補化合物のスクリーニング 本発明のポリぺプチドは本発明の受容体のリガンドとしての機能などを有す るため、 本発明のポリペプチドの機能 ·活性を促進する （例、 胃酸分泌促進作用 を有するなど) 化合物またはその塩は、 例えば、 胃酸分泌促進剤などとして有用 であり、例えば、消化不良症 (例、下垂体性消化不良症、腎性消化不良症など)、 骨代謝障害 （例、 骨粗しょう症、 骨軟化症など） 、 貧血症 （例、 鉄欠乏性貧血な ど） などの予防 ·治療剤などとして使用できる。 該化合物またはその塩は、 さら に、 胃液分泌能検査剤としても使用することができる。
一方、 本発明のポリペプチドの機能，活性 （胃酸分泌促進作用など） を阻害す る化合物またはその塩は、 例えば胃酸分泌抑制剤、 粘膜保護剤、 ミネラル吸収促 進剤などとして有用であり、 例えば上部消化管疾患 〔例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰 瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zol l inger- El l i son症候群など） 、 胃炎、 逆流 性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspeps ia) .、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド 系抗炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 の 予防'治療剤、 へリコパク夕一 'ピロリ除菌剤などとして使用できる。
該スクリーニングは、本発明のポリペプチドを用いるか、 または組換え型本発 明のポリペプチドの発現系を構築し、該発現系を用いたレセプ夕一結合アツセィ 系を用いることによって、本発明のポリペプチドとその受容体との結合性を変化 させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物） （例 えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物など） またはその塩をスクリーニングすることができる。 このような化合物には、本発 明の受容体を介して細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン 遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成 抑制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c_fosの活性化、 pHの 低下、 GTP T S結合活性などを促進する活性など） を有する化合物 （即ち本発明の ポリぺプチドの受容体ァゴニスト ) と該細胞刺激活性を有しない化合物 (即ち本 発明のポリペプチドの受容体アンタゴニスト） などが含まれる。 「本発明のポリ ぺプチドとの結合性を変化させる」 とは、本発明のポリペプチドとの結合を阻害 する場合と本発明のポリぺプチドとの結合を促進する場合の両方を包含するも のである。
本発明のポリぺプチドを用いることを特徴とする本発明のポリぺプチドの活 性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法の具体例と しては、 ω 本発明の受容体またはその部分ペプチド (以下、 これらを単に本 発明の受容体と略称する場合がある ) に、本発明のポリぺプチドを接触させた場 合と （i i) 上記した本発明の受容体に、 本発明のポリペプチドおよび試験化合物 を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のポリペプチドと 本発明の受容体の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促 進または阻害する化合物） またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。 上記スクリーニング方法においては、 （i) 上記した本発明の受容体に、 本発 明のポリペプチドを接触させた場合と （i i) 上記した本発明の受容体に、 本発明 のポリペプチドおよび試験化合物を接触させた場合における、例えば該本発明の 受容体に対する該ポリペプチドの結合量、細胞刺激活性などを測定して、 比較す る。
上記スクリ一二ング方法のさらなる具体例としては、
(a) 標識された本発明のポリペプチドを、 上記した本発明の受容体に接触させ た場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を本発明の受容体 に接触させた場合における、標識された本発明のポリペプチドの本発明の受容体 に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリぺプチドと本 発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促 進または阻害する化合物） またはその塩のスクリーエング方法、
(b) 標識された本発明のポリペプチドを、 本発明の受容体を含有する細胞また は該細胞の膜画分に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび 試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞め膜画分に接触させ た場合における、標識された本発明のポリぺプチドの該細胞または該膜画分に対 する結合量を測定し、比較することを特徴とする本発明のボリぺプチドと本発明 の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進ま たは阻害する化合物) またはその塩のスクリーニング方法、
(c) 標識された本発明のポリペプチドを 本発明の受容体をコードする D NA を含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受 容体に接触させた場合と、標識された本発明のポリペプチドおよび試験化合物を 本発明の受容体をコ一ドする D N Aを含有する形質転換体を培養することによ つて細胞膜上に発現した本発明のポリペプチドの受容体に接触させた場合にお ける、標識された本発明のポリペプチドの本発明の受容体に対する結合量を測定 し、比較することを特徴とする本発明のポリぺプチドと本発明の受容体との結合 性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合 物） またはその塩のスクリーニング方法、
(d) 本発明の受容体を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチド） を 本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明の受容体を活性化す る化合物および試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合 における、 本発明の受容体を介した細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、細胞内 Ca2+遊離、細胞内 cAMP生成/抑制、細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 C- fosの 活性化、 pHの低下、 GTP r S結合活性などを促進する活性または抑制する活性など） を測定し、比較することを特徴とする本発明のポリぺプチドと本発明の受容体と の結合性を変化させる化合物（本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害す る化合物） またはその塩のスクリーニング方法、 および
(e) 本発明の受容体を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドなど） を本発明の受容体をコードする DNAを含有する形質転換体を培養することに よって細胞膜上に発現した本発明の受容体に接触させた場合と、本発明の受容体 を活性化する化合物および試験化合物を、本発明の受容体をコードする DNAを 含有する形質転換体を培養することによつて細胞膜上に発現した本発明の受容 体に接触させた場合における、 本発明の受容体を介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成/抑 制、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 c-fosの活性化、 pHの低下、 GTP τ S結合活性などを促進する活性ま たは抑制する活性など） を測定し、 比較することを特徴とする本発明のポリぺプ チドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発明のボリぺプチドの 活性を促進または阻害する化合物)またはその塩のスクリーニング方法などであ る。
標識された本発明のポリペプチドの好ましい具体例は、 〔|251〕 でそれぞれ標 識された配列番号： 1、配列番号： 2、配列番号： 7、配列番号： 8、配列番号： 9、 配列番号： 10、 配列番号： 1 1、 配列番号： 12、 配列番号： 21、 配列 番号： 24、 配列番号： 25、 配列番号： 30、 配列番号： 31、 配列番号： 3
6、 配列番号： 37、 配列番号： 40、 配列番号： 41、 配列番号： 42、 配列 番号： 43、 配列番号： 44、 配列番号： 45、 配列番号： 46、 配列番号： 4
7、 配列番号： 48、 配列番号： 49、 配列番号： 50、 配列番号： 51、 配列 番号： 52、 配列番号： 53、 配列番号： 54、 配列番号： 55、 配列番号： 5 6、 配列番号： 57、 配列番号： 58または配列番号： 71で表されるアミノ酸 配列を有するポリぺプチドなどが挙げられる。 上記スクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
まず、本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の受容体としては、本発明 のポリぺプチドをリガンドとして認識するものであれば何れのものであっても よいが、 ヒトゃ温血動物の臓器の膜画分などが好適である。 しかし、 特にヒト由 来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとし ては、 組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。 本発明の受容体を製造するには、 前述の製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるい は該細胞膜画分などを用いる場合、 後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うこと ができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞 をいうが、 該宿主細胞としては、 前述の大腸菌、 枯草菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物 細胞などが挙げられる。 また、 本発明の受容体を発現した宿主細胞は、 前述の本 発明のポリペプチドを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体の製 造方法と同様の方法などがあげられる。
膜画分としては、細胞を破碎した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含ま れる画分のことをいう。細胞の破碎方法としては、 Po t t er—E lvehj em型ホモジナ ィザ一で細胞を押し潰す方法、 ヮ一リングブレンダーゃポリトロン (Kinemat i ca 社製） による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞 を細いノズルから噴出させることによる破碎などがあげられる。細胞膜の分画に は、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として 用いられる。 例えば、 細胞破碎液を低速 （500〜3000π)ΐη) で短時間 （通常、 約 1 〜10分） 遠心し、 上清をさらに高速 （15000〜30000卬111) で通常 30分〜 2時間遠心 し、 得られる沈澱を膜画分とする。 該膜画分中には、 発現した本発明の受容体と 細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、 1細胞 当たり 103〜108分子であるのが好ましく、 105〜 分子であるのが好適である。な お、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 （比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量 の試料を測定できるようになる。
本発明のポリぺプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発 明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前 記の （a) 〜 （c) を実施するためには、 適当な本発明の受容体画分と、 標識され た本発明のポリペプチドなどが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然 型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の 受容体画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリガンド結合活性 などを示す。標識されたポリペプチドとしては、例えば〔¾〕、 〔1251〕、 〔14c〕、 〔35s〕などで標識されたポリぺプチドなどを利用することができる。 このうち好 ましくは、 〔1251〕 で標識されたポリぺプチドである。
具体的には、本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる 化合物のスクリーニングを行うには、まず本発明の受容体を含有する細胞または 細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファ一に懸濁することによりレセ プ夕ー標品を調製する。 ノ ッファーには、 pH4〜10 (望ましくは pH6〜8) のリン 酸バッファー、 トリス—塩酸バッファーなどのリガンドとレセプ夕一との結合を 阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、非特異的結合を低減させ る目的で、 CHAPS、 Tffeen-80™ (花王一アトラス社） 、 ジギトニン、 デォキシコレ —卜などの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。 さらに、 プロテア一 ゼによる本発明の受容体や本発明のポリペプチドの分解を抑える目的で P M S F、 ロイぺプチン、 E - 64 (ぺプチド研究所製) 、 ぺプス夕チンなどのプロテア一 ゼ阻害剤を添加することもできる。 0. 01〜10mlの該レセプター溶液に、 一定量 (5000〜500000cpm) の標識された本発明のポリペプチドを添加し、 同時に 10_1() 〜10— 7Mの試験化合物を共存させる。 非特異的結合量 （NSB) を知るために大過剰 の未標識の本発明のポリぺプチドを加えた反応チューブも用意する。 反応は 0〜 50°C、望ましくは 4〜37°Cで 20分〜 24時間、望ましくは 30分〜 3時間行う。反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維濾紙 に残存する放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターまたはァ—カウンター で計測する。拮抗する物質がない場合のカウント（B。）から非特異的結合量（NSB) を引いたカウント （B^-NSB) を 100%とした時、 特異的結合量 （B-NSB) が例えば 50%以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質どして選択すること ができる。
本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発 明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）をスクリーニングする前 記の （d) 〜 （e) の方法を実施するためには、 本発明の受容体を介する細胞刺激 活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞 内 cAMP生成 Z抑制、細胞内 cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c-fosの活性化、 pHの低下、 GTP r S結合活性などを促 進する活性または抑制する活性など）を公知の方法または市販の測定用キットを 用いて測定することができる。具体的には、. まず、 本発明の受容体を含有する細 胞をマルチウエルプレート等に培養する。スクリ一二ングを行うにあたっては前 もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試 験化合物などを添加して一定時間ィンキュベートした後、細胞を抽出あるいは上 清液を回収して、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活 性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が 細胞が含有する分 解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアツセ ィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリ ンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用と して検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体 を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、 前述の 本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、 例えばペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化 合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。 本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物（本発 明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物）またはその塩のスクリ一 ニング用キットは、本発明の受容体またはその塩、本発明の受容体の部分べプチ ドまたはその塩、本発明の受容体を含有する細胞、 あるいは本発明の受容体を含 有する細胞の膜画分、 および本発明のポリペプチドを含有するものである。 本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。 1. スクリーニング用試薬
(a) 測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製) に、 0.05%のゥシ血清アルブ ミン （シグマ社製） を加えたもの。
？し径 0.45 mのフィルターで濾過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調製 しても良い。
(b) 本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させた CH0細胞を、 12穴プレートに 5X105個/穴で継代 し、 37 、 5% C02、 95% airで 2日間培養したもの。
(c) 標識リガンド
〔¾〕 、 〔1 1〕 、 〔"C〕 、 〔 〕 などで標識された本発明のポリペプチドを 適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを 4t:あるいは- 20 にて保存し、用時に 測定用緩衝液にて 1 Mに希釈する。
(d) リガンド標準液
本発明のポリぺプチドを 0.1¾ゥシ血清アルプミン (シグマ社製) を含む PBS で lmMとなるように溶解し、 - 20°Cで保存する。
2. 測定法
(a) 12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、 測定用緩衝液 lmlで 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。
(b) 10—3〜10_1()Mの試験化合物溶液を 5^1加えた後、 標識された本発明のぺプチ ドを 5 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的結合量を知るためには試験 化合物の代わりに 10_¾の本発明のポリぺプチドを 5 n 1加えておく。
(c) 反応液を除去し、 lmlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識 された本発明のポリペプチドを 0.2NNaOH- 1% SDSで溶解し、 4mlの液体シンチレ —夕一 A (和光純薬製） と混合する。
(d) 液体シンチレ一シヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次式で求める。
PMB= [ (B-NSB)/(B0-NSB) ] X 100
PMB ： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB ： Non-speci f ic Binding (非特異的結合量）
B0 ：最大結合量
上記スクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化 合物またはその塩は、本発明のポリぺプチドと本発明の受容体との結合を変化さ せる （結合を阻害あるいは促進する）化合物 （本発明のポリペプチドの活性を促 進または阻害する化合物)であり、具体的には本発明の受容体を介して細胞刺激 活性を有する化合物またはその塩 (いわゆる本発明の受容体ァゴニスト) 、 ある いは該刺激活性を有しない化合物 (いわゆる本発明の受容体アンタゴニスト)で ある。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、 発酵生産物などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公 知の化合物であってもよい。
上記本発明の受容体ァゴニス卜であるかアンタゴニストであるかの具体的な 評価方法は以下の (i) または (i i) に従えばよい。
(i) 前記 （a) 〜 （c) のスクリーニング方法で示されるバインディング ·アツ セィを行い、 本発明のポリペプチドと本発明の受容体との結合性を変化させる (特に、 結合を阻害する)化合物を得た後、 該化合物が上記した本発明の受容体 を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化 合物またはその塩は本発明の受容体ァゴニストであり、該活性を有しない化合物 またはその塩は本発明の受容体アン夕ゴニストである。
(i i) (a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、 上記本発明 の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物または その塩は本発明の受容体ァゴニストである。
(b)本発明の受容体を活性化する化合物 （例えば、 本発明のポリペプチドまたは 本発明の受容体ァゴニストなど）を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた 場合と、本発明の受容体を活性化する化合物および試験化合物を本発明の受容体 を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活 性を測定し、 比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性 を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アン夕ゴニス卜である。 上記本発明の受容体ァゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリぺプ チドが有する生理活性と同様の作用を有しているので、本発明のポリペプチドと 同様に胃酸分泌促進剤として有用であり、 安全で低毒性な、 例えば、 消化不良症 (例、 下垂体性消化不良症、 腎性消化不良症など） 、 骨代謝障害 （例、 骨粗しよ う症、 骨軟化症など） 、 貧血症 （例、 鉄欠乏性貧血など） などの予防 ·治療剤な どとして使用することができる。
上記本発明の受容体アンタゴニストは、本発明の受容体に対する本発明のポリ ぺプチドが有する生理活性を抑制することができるので、例えば胃酸分泌抑制剤、 粘膜保護剤、 ミネラル吸収促進剤などとして有用であり、 安全で低毒性な、 例え ば上部消化管疾患 〔例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zol 1 inger-El 1 i son症候群など）、胃炎、逆流性食道炎、 NUD (Non Ul cer Dyspeps i a)、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレ スによる胃酸過多および潰瘍など〕 の予防 ·治療剤、 ヘリコバクタ一 ·ピロリ除 菌剤などして使用することができる。
上記本発明の受容体ァゴニストは、 胃液分泌能檢查剤としても使用できる。該 ァゴニストを被験者に投与し、 胃液の分泌程度を、 BAO (basal ac id output) 、 MAO (maximal acid output) などを指標とし、 測定する。 これより、 胃液分泌細 胞の機能残存程度、 胃細胞の萎縮程度などが判明し、 十二指腸潰瘍、 逆流性食道 炎、 胃炎、 胃潰瘍、 萎縮性胃炎、 胃癌などの治療効果、 経過観察、 再発、 予防の 上で一指標となるとともに、 手術範囲を決める際にも有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などか ら選ばれた化合物であり、本発明のポリぺプチドの活性または機能を促進または 阻害する化合物である。 '
該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用 いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られ る化合物を上述の予防 ·治療剤として使用する場合、常套手段に従って実施する ことができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様に して、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸 濁液剤などとすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、 ヒトまたは 温血動物（例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー トなどにより差異はある。例えば、逆流性食道炎の治療の目的で本発明のポリべ プチドの活性を阻害する化合物を皮下投与する場合、 一般的に成人 (体重 60kg 当たり) においては、 一日にっき該化合物を約 0. 1〜 100m g、 好ましくは約 1. 0 〜50m g、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 他の動物の場合も、 体重 60kg 当たりに換算した量を投与することができる。例えば、消化不良症の治療の目的 で本発明のポリぺプチドの活性を促進する化合物を皮下投与する場合、一般的に 成人 （体重 60kg当たり） においては 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ま しくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 他の動物の場合も、 体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 3 ) 本発明のポリペプチドの定量
本発明の抗体は、本発明のポリぺプチドまたは受容体を特異的に認識すること ができるので、被検液中の本発明のポリペプチドまたは受容体の定量、特にサン ドィッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のポリペプチドまたは 受容体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリぺプ チドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリぺプチドの定 量法、 および (i i)被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検波中の本発明のポリペプチドまたは受容体の 定量法を提供する。
上記（i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のポリペプチドまたは受 容体の N端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドまたは受容 体の C端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリぺプチドまたは受容体に対するモノク口一ナル抗体を用い て本発明のポリペプチドまたは受容体の定量を行うことができるほか、組織染色 等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、抗体分子そのものを用 いてもよく、また、抗体分子の F (ab' ) 2、 Fab\あるいは Fab画分を用いてもよい。 本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドまたは受容体の定量法は、 特に 制限されるべきものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 ボリペプチド量） に対応した抗体、坊原もしくは抗体—抗原複合体の量を化学的または物理的手段 により検出し、これを既知量の钪原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より 算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。例えば、 ネフロメト リ一、競合法 ィムノメトリック法およびサンドイツチ法が好適に用いられるが 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。 標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 放射性同位元素 （例、 〔1251〕 、 〔1311〕 、 〔¾〕 、 TO 、 〔32P〕 、 C33P] 、 〔35s〕 など） 、 蛍光物質 〔例、 シァニン蛍光色素 （例、 Cy2、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Cy7 (アマシャムバイオ サイエンス社製） など） 、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネー トなど〕 、 酵素 （例、 3—ガラクトシダーゼ、 i3—ダルコシダーゼ、 アルカリフ ォスファタ一ゼ、パーォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素など）、発光物質（例、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなど) 、 ピオチン、 ランタニド元素などが用いられる。 さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合 にピオチン一アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、 また通常ポ リペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用い る方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セル口一スなどの 不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あ るいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液 を反応させ（1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を 反応させ（2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することによ り被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。 1次反応と 2次 反応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行な つてもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、サンドィツチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗 体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、測定感度を向上させる 等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノク口一ナル抗体は、本発明のポリぺ プチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、 1次反 応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のポリぺプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノク口一ナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、ィムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。 競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、未反応の標識抗原（F ) と、抗体と結合した標識抗原 (B ) とを分離し (B / F分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検波中の抗原量を定量する。 本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、 B ZF分離をポリエチレングリコ ール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1抗体として 固相化抗体を用いるか、 あるいは、第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体とし て固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、被検波中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザ一の散乱を利用するレーザーネフロメトリー などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特 別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を 構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書など を参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ」 （講談社 昭和 49年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 (講談社、 昭和 54年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 53年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 57年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院 昭和 62年発行） 、 rMethods in ENZYM0L0GYJ Vol. 70 (I匪漏 chemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)) 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0). 同 書 Vol. 84(1匪漏 chemical Techniques (Part D : Selected Immunoassays))、 同 書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E ： Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)) 同書 Vol. 121 (Immunochemical
Techniques (Part I ： Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (以 上、 アカデミックプレス社発行）などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリべプチ ドまたは受容体を感度良く定量することができる。
本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度を定量する ことによって、本発明のポリぺプチドまたは受容体の濃度の減少が検出された場 合、 例えば、 消化不良症 （例、 下垂体性消化不良症、 腎性消化不良症など） 、 骨 代謝障害（例、 骨粗しょう症、 骨軟化症など） 、 貧血症（例、 鉄欠乏性貧血など） などの疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。 また、本発明のポリペプチドまたは受容体の濃度の増加が検出された場合には、 例えば上部消化管疾患 〔例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰 瘍、 Zol l inger- El l ison症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspeps ia)、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多おょぴ潰瘍など〕 などの疾病である、 または将来 罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリべ プチドまたは受容体を検出するために使用することができる。 また、本発明のポ リペプチドまたは受容体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の 各分画中の本発明のポリペプチドまたは受容体の検出、被検細胞内における本発 明のポリぺプチドまたは受容体の挙動の分析などのために使用することができ る。
( 4 ) 遺伝子診断薬
本発明の D N Aは 例えば、 プロ一プとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 (例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明のポリペプチドをコ一ド する D NAまたは mR NAの異常 (遺伝子異常) を検出することができるので、 例えば、 該 D NAまたは mR NAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 D N Aまたは m R N Aの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用であ る。
本発明の D NAを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブ リダィゼーシヨンや PCR- SSCP法 （Genomics, 第 5巻， 874—879頁 （1989年） 、
Proceedings of the Nat ional Academy of Sc iences of USA, 第 86巻， 2766- 2770 頁 （1989年） ） などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイプリダイゼーシヨンにより本発明のポリべプチドまたは 受容体の遺伝子の発現低下が検出された場合は、 例えば、 消化不良症 （例、 下 垂体性消化不良症、 腎性消化不良症など） 、 骨代謝障害 （例、 骨粗しょう症、 骨 軟化症など）、貧血症（例、鉄欠乏性貧血など）などの疾病である可能性が高い、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、ノーザンハイブリダィゼーションにより本発明のポリペプチドまたは受 容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、 例えば、 上部消化管疾患 〔例、 消 化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zol l inger- El l ison症候群 など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 NUD (Non Ulcer Dyspeps ia) 、 胃癌、 胃 MALTリン パ腫、非ステロイド系坊炎症剤に起因する潰瘍、手術後ストレスによる胃酸過多 および潰瘍など〕 などの疾病である可能性が高い、 または将来罹患する可能性が 高いと診断することができる。
( 5 ) ァンチセンス D N Aを含有する医薬
本発明のアンチセンス D NAは、 例えば胃酸分泌抑制剤、 粘膜保護剤、 ミネラ ル吸収促進剤などとして有用であり、例えば上部消化管疾患〔例、消化性潰瘍 (例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zol l inger-Emson症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道炎、 UD (Non Ulcer Dyspeps ia) 、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロ ィド系抗炎症剤に起因する潰瘍 手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍な ど〕 の予防 ·治療剤、 へリコパクター ·ピロリ除菌剤などとして使用できる。 例えば、該アンチセンス D N Aを用いる場合、該アンチセンス D N Aを単独あ るいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソ シエーテツドウィルスベクターなどの適当なベクターに揷入した後、常套手段に 従って実施することができる。 該アンチセンス D N Aは、 そのままで、 あるいは 摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺 伝子銃やハイド口ゲル力テ一テルのような力テーテルによつて投与できる さらに、該アンチセンス D NAは、 組織や細胞における本発明の D NAの存在 やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用 することもできる。
( 6 ) 本発明の抗体を含有する医薬 本発明の抗体 （例、 本発明のポリペプチドを中和する作用を有する中和抗体） は、 例えば胃酸分泌抑制剤、 粘膜保護剤、 .ミネラル吸収促進剤などとして有用で あり、 例えば上部消化管疾患 〔例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻 合部潰瘍、 Zol l inger- El l i son症候群など)、胃炎、逆流性食道炎、 NUD (Non Ul cer Dyspeps i a)、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 の予防'治療剤、 へリコパク夕 一 ·ピロリ除菌剤などとして使用できる。
本発明の抗体を含有する上記疾患の剤は、そのまま液剤として、 または適当な 剤型の医薬組成物として、 ヒ卜または哺乳動物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与する ことができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルートなどによって も異なるが、 例えば、 成人の逆流性食道炎の治療のために使用する場合には、 本 発明の抗体を 1回量として、 通常 0. 01〜20mg/kg体重程度、 好ましくは 0. 1〜 1 Omg/kg体重程度、 さらに好ましくは 0. 1〜 5mg/kg体重程度を、 1日 1〜 5回程度、 好ましくは 1日 1〜3回程度、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非 経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状 が特に重い場合には その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散 剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤などが あげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通 常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、 綻剤 用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウム などが用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤などが用いられ、 注射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの 剤形を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体また はその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁また は乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩 水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （例、 プロピレンダリ コ一ル、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 80、 HC0-50 (polyoxyethylene (50mol) adduct of hydrogenated cas tor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いら れ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用しても よい。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用 いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによ つて調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成'分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 (アンプル) 、 坐剤などが例示され、 そ れぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜500mg、 とりわけ注射剤では 5〜100mg、その 他の剤形では 10〜250mgの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。 ( 7 ) D NA転移動物
外来性の本発明のポリペプチドをコードする D N A (以下、本発明の外来性 D NAと略記する） またはその変異 D NA (本発明の外来性変異 D N Aと略記する 場合がある） を有する非ヒト哺乳動物も、 消化管疾患の予防 ·治療剤などをスク リーニングするために用いられる。
本発明の外来性 D NAまたはその変異 D NAを有する非ヒト哺乳動物 （以下、 本発明の D N A転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始 原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、 非ヒト哺乳動物の発生におけ る胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般 に 8細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクルガン法、 DEAE—デキス トラン法などにより目的とする DN Aを転移することによって作出することが できる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに 目的とする本発明の外来性 DNAを転移し、細胞培養、組織培養な'どに利用する こともでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融 合させることにより本発明の D N A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、ま た、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス (例えば、 純系として、 C 57B L/6系統， DBA2系統など、交雑系として、 B 6 C 3 エ系統， BDFi系統， B 6D 2 系統， BALB/c系統， I CR系統など）またはラット (例えば、 W i s t a r, SDなど) などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒ卜などがあげられる。
本発明の外来性 DN Aとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の DN A ではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをいう。 本発明の変異 D N Aとしては、元の本発明の D N Aの塩基配列に変異（例えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の付加、 欠損、 他の塩基への置 換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含まれる。
該異常 DN Aとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させる DN Aを意 味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発 現させる DN Aなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳 動物由来のものであってもよい。本発明の DN Aを対象動物に転移させるにあた つては、該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した D N Aコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒト D NAを転移させる場合、これと相同性が高い本発明の DNAを有する各種哺乳動 物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の DN Aを発現させうる各種プロモ一ターの下流に、本発明のヒ卜 DN Aを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を対象哺乳動物の受精 卵、例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明 の DNAを高発現する DN A転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯 草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテリオフ ァージ、モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスま たはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌 由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが 好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモー夕一としては、 例えば、 (a) ウィル ス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモ 一ター、 (b) 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス 夕一 ラット マウスなど） 由来のプロモー夕一 例えば、 アルブミン、 インス リン I I、ゥロプラキン I I、エラス夕一ゼ..エリスロポエチン、エンドセリン、 筋クレアチンキナ一ゼ、 グリア線維性酸性蛋白質、 ダルタチオン S—トランスフ エラ一ゼ、 血小板由来成長因子 j8、 ケラチン K l， K 1 0および K 14、 コラ一 ゲン I型および I I型、サイクリック AMP依存蛋白質キナーゼ ]3 Iサブュニッ ト、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アル力リフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウム 利尿性因子、 内皮レセプターチ口シンキナーゼ (一般に T i e 2と略される) 、 ナトリウムカリウムアデノシン 3リン酸化酵素 （Na, K-ATP a s e) 、 二 ュ一口フィラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナ ーゼ 1組織インヒピタ一、 MHCクラス I抗原 （H— 2 L)、 H— r a s、 レニ ノ、、 ド一パミン ;3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダーゼ （TPO) 、 ポリぺプ チド鎖延長因子 1ひ (EF- 1 ) 、 β了クチン、 ひおよび) 3ミオシン重鎖、 ミ オシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎蛋白質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免. 疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオ グロビン、 卜ロボニン (：、 平滑筋 αァクチン、 プレブ口エンケフアリン Α、 バソ プレシンなどのプロモータ一などが用いられる。なかでも、全身で高発現するこ とが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 (EF- 1 α) のプロモーター、 ヒトおよびニヮトリ ;8ァクチンプロモーター などが好適である。
上記べクタ一は、 DNA転移哺乳動物において目的とするメッセンジャ一 RN Αの転写を終結する配列（一般にターミネタ一と呼ばれる） を有していることが 好ましく、例えば、 ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用 いることができ、好ましくは、 シミアンウィルスの SV40夕一ミネ夕一などが 用いられる。
その他、目的とする外来性 DNAをさらに髙発現させる目的で各 DNAのスプ ライシングシグナル、 ェンハンサ一領域、真核 DNAのィントロンの一部などを プロモーター領域の 5'上流、 プロモータ一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3， 下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、 ゥサギ ィヌ、 ネコ モルモット、 ハムス夕一、 ラット マウスなど） 由来の肝 臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNAラ イブラリ一よりゲノム DNAの全てあるいは一部として、 または肝臓、 腎臓、 甲 状腺細胞、線維芽細胞由来 RNAより公知の方法により調製された相補 DNAを 原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 DN Aは、 上記の細胞ま たは組織より得られた正常なポリぺプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法によ り変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる DNAコンストラクトとして、前記 のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常 の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 DN Aの転移は、対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 DN A転移後の作出動 物の胚芽細胞において、本発明の外来性 DNAが存在することは、作出動物の後 代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D NAを保持 することを意味する。本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物の子孫は その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性 D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性 D NAを安定に保持することを確認して、該 D N A保有動物として通常の飼育環 境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性 D N Aの転移は、対象哺乳動物の胚芽 細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 D NA転移後の作 出動物の胚芽細胞において本発明の外来性 D N Aが過剰に存在することは、作出 動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを 過剰に有することを意味する。本発明の外来性 D N Aを受け継いだこの種の動物 の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性 D N Aを過剰に有 する。
導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、この雌雄 の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に有するように繁 殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物は、本発明の正常 D NAが高発現 させられており、内在性の正常 D N Aの機能を促進することにより最終的に本発 明のポリぺプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物とし て利用することができる。例えば、 本発明の正常 D NA転移動物を用いて、 本発 明のポリぺプチドの機能宂進症や、本発明のポリぺプチドが関連する疾患の病態 機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。 また、本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明の ポリぺプチドの増加症状を有することから、本発明のポリぺプチドに関連する疾 患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来 性 D N Aを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育 環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的とする外来 D NAを前述のブラ スミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモータ一との D NAコ ンストラク卜は、通常の D NA工学的手法によって作製することができる。受精 卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞およ び体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚芽細 胞において本発明の異常 D NAが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚 芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有することを意味する。本発 明の外来性 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細 胞の全てに本発明の異常 D NAを有する。導入 D N Aを相同染色体の両方に持つ ホモザィゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子 孫が該 D N Aを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常 D NAを有する非ヒ卜哺乳動物は、本発明の異常 D NAが高発現 させられており、内在性の正常 D NAの機能を阻害することにより最終的に本発 明のポリぺプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物 として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患 を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発 明のポリぺプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ボリぺプチドに よる正常ポリペプチドの機能阻害 （dominant negat ive作用） を解明するモデル となる。
また、本発明の外来異常 D NAを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のポ リぺプチドの増加症状を有することから、本発明のポリぺプチドまたはの機能不 活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記 2種類の本発明の D NA転移動物のその他の利用可能性として、例 えば、
(a) 組織培養のための細胞源としての使用、
(b) 本発明の D NA転移動物の組織中の D NAもしくは R N Aを直接分析する 、 または D NAにより発現されたポリペプチド組織を分析すること よる、本 発明のポリぺプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリぺプチドとの 関連性についての解析、 (c) D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使 用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(d) 上記 （c) 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤の スクリーニング、 および
(e) 本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられ る。
さらに、本発明の D NA転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活 性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器にお けるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾 患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の D NA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシンな どの蛋白質分解酵素により、遊離した D NA転移細胞の取得、その培養またはそ の培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、本発明のポリペプチド 産生細胞の特定化、 アポトーシス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれら におけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、本発 明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明の D NA転移動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活 性型不応症を含む、本発明のポリぺプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行な うために、 上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬 のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、本発明の D NA転移動 物または本発明の外来性 D N A発現べクタ一を用いて、本発明のポリペプチドが 関連する疾患の D N A治療法を検討、 開発することが可能である。 ( 8 ) ノックアウト動物
本発明の D N Aが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞および本発明の D Ν·Α発現不全非ヒト哺乳動物も、胃酸分泌促進剤などをスクリーニングするため に用いられる。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳 動物が有する本発明の D NAに人為的に変異を加えることにより、 D NAの発現 能を抑制するか、もしくは該 D N Aがコードしている本発明のポリペプチドの活 性を実質的に喪失させることにより、 D N Aが実質的に本発明のポリペプチドの 発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト D NAと称することがある） 非 ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的 手法により該 D NA配列の一部又は全部の削除、他 D NAを揷入または置換させ ることによって行なうことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読 み取り枠をずらしたり、プロモータ一あるいはェキソンの機能を破壊することに より本発明のノックアウト D NAを作製すればよい。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明の D NA不活性化 E S細胞または本発明のノックァゥト E S細胞と略記する）の具体 例としては、例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明の D N Aを単離 し、そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子 を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいは 1 a c Z ( |3—ガラクトシダーゼ遺伝子）、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ遺伝子） を代表とす るレポーター遺伝子等を挿入することによりェキソンの機能を破壊するか、ある いはェキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させる D N A配列 (例え ば、 polyA付加シグナルなど） を揷入し、 完全なメッセンジャー R NAを合成で きなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築した D N A配列 を有する D N A鎖 (以下、 夕一ゲッティングベクターと略記する) を、 例えば相 同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られた E S細胞について本発明の D N A上あるいはその近傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイ ゼ一ション解析あるいはターゲッティングベクタ一上の D NA配列とターゲッ ティングベクタ一作製に使用した本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列 をプライマ一とした P C R法により解析し、本発明のノックアウト E S細胞を選 別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明の D N Aを不活化させる元の E S細胞とし ては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知 Evans と Kaufmaの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、 マウスの ES細 胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細胞が使用されているが、 免疫学的 背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明 らかな ES細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57BLZ6マウスや C57 8 / 6の採卵数の少なさを0：6八 2との交雑にょり改善した80?1マゥス (C 57 BLZ6と DBA/2との F を用いて樹立したものなども良好に用 いうる。 BDFiマウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に 加えて、 C 57 BLZ6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細 胞は病態モデルマウスを作出したとき、 C 57 BL 6マウスとバッククロスす ることでその遣伝的背景を C 57BL/6マウスに代えることが可能である点 で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用す るが、これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率 よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、通常雄の ES細胞の方が生殖 系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、煩雑な培養の手間を削減するため にもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、 PCR法により Y染色体上の性 決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その 1例としてあげることができる。 この方法を使用すれば、 従来、 核型分析をするのに約 106個の細胞数を要して いたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 (約 50個） で済むので、 培養初 期における E S細胞の第一次セレクシヨンを雌雄の判別で行なうことが可能で あり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減 できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色 体数の確認等により行うことができる。得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100%が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、 ES細 胞の遺伝子をノックアウトした後、 正常細胞 (例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 4 0である細胞） に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発 生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例え ば、 S T O繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で LIF (l〜10000U/ml) 5 存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、 5 %炭酸ガス、 95 %空気または 5 %酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気)で約 37°Cで培養するなどの方法で培養し、、継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 （通常 0. 001〜0. 5%トリプシン/ 0. l〜5mM EDTA、. 好ましくは約 0. 1 %トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに用意し たフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代は、 通常 10 〜3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常な細胞が見受け られた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 または細 , 胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々 のタイプの細胞に分化させることが可能であり [Nature第 292巻、 154頁、 19815 年、 Proc. Nat l . Acad. Sc i . U. S. A. 第 78卷、 7634頁、 1981年；ジャーナル ·ォ ブ ·ェンブリオロジ一 'アンド 'ェクスペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87 卷、 27頁 1985年〕、本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の D N A発 現不全細胞は、インビトロにおける本発明のポリぺプチドまたは本発明の受容体 の細胞生物学的検討において有用である。
0 本発明の D N A発現不全非ヒ卜哺乳動物は、該動物の mR N A量を公知方法を 用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別する ' ことが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、 前述のようにして作製し5 たターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導 入によりターゲッティングベクターの本発明の D N Aが不活性化された D N A 配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上 の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明の D N A をノックアウトさせることができる。 本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、本発明の D N A上またはその近 傍の D N A配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析または夕 —ゲッティングベクター上の D N A配列と、ターゲッティングベクターに使用し たマウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とをプライマーと した P C R法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用 いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明の D NAが不活性化'された細胞株 をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物 胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の 子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明の D N A座をもつ細胞と人為的 に変異した本発明の D N A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物で ある。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D N A座をもつ場合、この ようなキヌラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての 組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等により選別することにより得られる。 このように して得られた個体は、通常、本発明のポリぺプチドのへテロ発現不全個体であり、 本発明のポリぺプチドまたは本発明の受容体のへテロ発現不全個体同志を交配 し、それらの産仔から本発明のポリペプチドまたは本発明の受容体のホモ発現不 全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法 で D NA溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクターを染色体内に導 入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランス ジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明の D NA座 に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、交配により 得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して通常の 飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわち、 該不活化 D N Aの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化 D N Aを 相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。得られたホモザィゴ —ト動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴ一ト複数になるような 状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザィゴ一ト動物の 雌雄を交配することにより、該不活化 D N Aを有するホモザィゴートおよびへテ ロザィゴ一ト動物を繁殖継代する。
本発明の D N Aが不活性化された非ヒ卜哺乳動物胚幹細胞は、本'発明の D NA 発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。
また、本発明の D N A発現不全非ヒ卜哺乳動物は、本発明のポリペプチドまた は本発明の受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明の ポリペプチドまたは本発明の受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病の モデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
( 8 a )本発明の D NAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効 果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の D NAの欠損や損傷など に起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物のスクリーニングに用い ることができる。
すなわち、本発明は 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を 投与し、 該動物の変化を観察，測定することを特徴とする、 本発明の D NAの欠 損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する化合物またはその 塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明の D NA発現不全非ヒト哺 乳動物としては、 前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成 化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿などがあ げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であって fcよい。
'具体的には、本発明の D N A発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、 無処理の対照動物と比較し、 該動物の各器官、 組織、 疾病の症状などの変化を指 標として試験化合物の治療 ·予防効果を試験することができる。. 試験動物を試験化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈注射 などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択す ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 試験化合物の性質な どにあわせて適宜選択することができる。
例えば、 胃酸分泌促進剤をスクリーニングする場合、本発明の D NA発現不全 非ヒト哺乳動物に、 幽門を結紮し、 試験化合物を投与し、 該動物の胃酸分泌量の 変化を経時的に測定する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験 動物の胃酸分泌量が約 1 0 %以上、好ましくは約 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上上昇した場合、試験化合物を上記の疾患に対して予防 ·治療効果を有 する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選 ばれた化合物であり、本発明のポリぺプチドの欠損や損傷などによって引き起こ される疾患に対して治療 ·予防効果を有するので、 該疾患に対する安全で低毒性 な予防 ·治療剤などの医薬として使用することができる。 さらに、 上記スクリー ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。 該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物 の塩としては、生理学的に許容される酸（例 無機酸、有機酸など）や塩基（例、 アル力り金属など)などとの塩が用い.られ、 とりわけ生理学的に許容される酸付 加塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 (例えば、 塩酸、 リン 酸、 臭化水素酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プ 口ピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 篠酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用 いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記 した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。 このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。 該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、例えば、該化合物を皮下投与する場合、一般的に成人（体重 60kg として） の患者においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜100mg、好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D NAに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通 常成人（体重 60kgとして） の消化不良症患者に投与する場合、 一日につき該化合 物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 〜 20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜 10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。
( 8 b )本発明の D NAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合 物をスクリーニング方法
本発明は、 本発明の D N A発現不全非ヒ卜哺乳動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一夕一遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明の D NAに対する プロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニン グ方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物と しては、前記した本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明の D N Aがレポ一夕一遣伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝 子が本発明の D N Aに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いら れる。
試験化合物としては、 前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、 /3 _ガラクトシダ ーゼ遺伝子（1 a c Z ) 、 可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフ ェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明の D N Aをレポーター遺伝子で置換された本発明の D N A発現不全非 ヒ ·ト哺乳動物では、レポ一夕一遺伝子が本発明の D N Aに対するプロモーターの 支配下に存在するので、レポ一夕一遺伝子がコードする物質の発現をトレースす ることにより、 プロモータ一の活性を検出することができる。 例えば、本発明のポリペプチドをコードする D NA領域の一部を大腸菌由来の β一ガラクトシダーゼ遺伝子 （ 1 a c Ζ ) で置換している場合、 本来、 本発明の ポリぺプチドの発現する組織で、本発明のポリぺプチドの代わりに j3—ガラクト シダーゼが発現する。従って、 例えば、 5—プロモー 4一クロロー 3—インドリ ルー 3—ガラクトピラノシド （X— g a 1 ) のような) 3—ガラクトシダーゼの基 質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物 生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリべ プチド欠損マウスまたはその組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、リン 酸緩衝生理食塩液 ( P B S ) で洗浄後、 - g a 1を含む染色液で、 室温または 3 7 :付近で、 約 3 0分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を I mM E D T A/P B S溶液で洗浄することによって、 i3—ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mR NAを検 出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試 験化合物から選ばれた化合物であり、本発明の D N Aに対するプロモー夕一活性 を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物 の塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸など） や塩基 （例、 有機酸 など）などとの塩が用いられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし い。 このような塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素 酸、 硫酸など） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香 酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など) との塩などが用いられる。 本発明の D N Aに対するプロモ一夕一活性を促進する化合物またはその塩は、 本発明のポリぺプチドの発現を促進し、該ポリぺプチドの機能を促進することが できるので、 例えば、 胃酸分泌促進剤として使用することができ、 例えば、 消化 不良症 （例、 下垂体性消化不良症、 腎性消化不良症など） 、 骨代謝障害 （例、 骨 粗しょう症、 骨軟化症など） 、 貧血症 （例、 鉄欠乏性貧血など） などの予防-治 療剤として使用することができる。 また、本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその 塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害する ことができるので、 例えば胃酸分泌抑制剤、 粘膜保護剤、 ミネラル吸収促進剤な どとして有用であり、 例えば上部消化管疾患 〔例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十 二指腸潰瘍、 吻合部潰瘍、 Zol l inger-El l i son症候群など） 、 胃炎、 逆流性食道 炎、 腿 (Non Ulcer Dyspeps ia) 、 '胃癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド系抗炎 症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレスによる胃酸過多および潰瘍など〕 の予防 · 治療剤、 ヘリコバクタ一 ·ピロリ除菌剤などとして使用できる。
さらに、上記スクリ一ニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に 用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記 した本発明のポリペプチドまたはその塩を含有する医薬と同様にして製造する ことができる。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は哺乳動物 (例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥ シ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど) に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、例えば、本発明の D NAに対するプロモーター活性を促進する 化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重 60kgとして）の患者においては、 ー日にっき該化合物を約0. 1〜100111 、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましく は約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量は 投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、 例えば、 本発明の D NAに対する プロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人 （体重 60kgとして） の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、好ましくは約 0. l〜20mg程度、より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静脈注射により投与するのが 好都合である。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与すること ができる。
一方、 例えば、本発明の D N Aに対するプロモーター活性を阻害する化合物を 経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 60kgとして） の患者においては、 一日に つき該化合物を約 0. 1〜100mg、 好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0 〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明の D NAに対するプロモー夕 一活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重 60kgとして） の患者に投 与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜30mg程度、 好ましくは約 0. 1〜20mg 程度、 より好ましくは約 0. l〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合で ある。他の動物の場合も、体重 60kg当たりに換算した量を投与することができる。 このように、本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の D NAに対 するプロモータ一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ一 ニングする上で極めて有用であり、本発明の D NA発現不全に起因する各種疾患 の原因究明または予防 ·治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のポリペプチドのプロモータ一領域を含有する D NAを使って、 その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注 入していわゆるトランスジエニック動物 (遺伝子移入動物) を作成すれば、 特異 的にそのポリぺプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能とな る。 さらに上記プロモ一夕一部分に適当なレポ一夕一遣伝子を結合させ、 これが 発現するような細胞株を榭立すれば、本発明のポリぺプチドそのものの体内での 産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系と して使用できる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 IUPAC-IUB Commi ss ion on Biochemical Nomenc l atureによる略号あるいは当該分 野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。 またアミノ酸に関 し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
D NA デォキシリポ核酸
c D NA 相補的デォキシリポ核酸
• A アデニン
T チミン
G グァニン C .
I
R アデニン （A) またはグァニン （G)
Y チミン （T) またはシ卜シン （C)
M アデニン （A) またはシトシン （C)
K グァニン （G) またはチミン （T)
S グァニン (G) またはシトシン (C)
w アデニン （A) またはチミン （T)
B グァニン (G) 、 グァニン (G) またはチミン （T) D アデニン （A) 、 グァニン (G) またはチミン （T) V アデニン (A) 、 グァニン (G) またはシトシン (C) N アデニン (A) 、 グァニン （G) 、 シトシン (C) もしく はチミン (T) または不明もしくは他の塩基
RNA リボ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸
dATP デォキシアデノシン三リン酸
dTTP デォキシチミジン三リン酸
dGTP デォキシグアノシン三リン酸
dCTP デォキシシチジン三リン酸
ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸
SDS ドデシル硫酸ナトリウム
BHA
pMBHA P—メチルベンズヒドリルァミン
T o s P-トルエンスルフォニル
B z 1
•Bom ベンジルォキシメチル
B o c t一ブチルォキシカルポニル
DCM HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
DCC TFA トリフルォロ酢酸
D I EA ジィソプロピルェチルアミン
B S A ゥシ血清アルブミン
CHAP S 3— 〔 （3—コラミドプロピル） ジメチルアンモニォ〕
1一プロパンスホナ一卜
G 1 y又は G ：グリシン
A 1 a又は A ：ァラニン
V a 1又は V ：パリン
L e u又は L ：ロイシン
I 1 e又は I ：ィソロイシン
S e r又は S ：セリン
Th r又は T ：スレオニン
Cy s又は C ：システィン
M e t又は M ：メチォニン
G 1 u又は E ：グル夕ミン酸
A s p又は D ：ァスパラギン酸
Ly s又は K ： リジン
A r g又は R ：アルギニン
H i s又は H
P h e又は F ：フエ二ルァラニン
Ty r又は Y ：チロシン
T r p又は W ： トリプトファン
P r o又は P ：プロリン
As n又は N ：ァスパラギン
G 1 n又は Q ：グルタミン
p G 1 u ： ピログルタミン酸
Ty r (I) ： 3—ョードチロシン DMF N， N—ジメチルホルムアミド
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルボニル
T r t トリチル
P b f 2, 2, 4, 6, 7-·
一 5—スルホニル
C 1 t 2—クロロトリチル
t—ブチル
Me t (O) メチォニンスルフォキシド 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
ヒト GPR 8リガンドペプチド (hNPW23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
ヒト GPR8リガンドぺプチド (hNPW30) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 3〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
配列番号： 2で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
ヒト GPR 8リガンドペプチド前駆体の一部をコードする DNAの塩基配列を 示す。
〔配列番号： 6〕
ヒト G P R 8リガンドぺプチド前駆体の一部のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 7〕
合成ヒト GPR8リガンド （1— 29) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 8〕
合成ヒト GPR8リガンド （1— 28) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 9〕
合成ヒト GPR8リガンド （1— 27) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 10〕
合成ヒト GPR8リガンド （1— 26) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 1 1〕
合成ヒト GPR 8リガンド （1— 25) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 12〕
合成ヒト GPR 8リガンド （1— 24) のアミノ酸配列を示す。 '
〔配列番号： 13〕
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
配列番号： 8で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
配列番号： 9で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 10で表されるァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
配列番号： 11で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
配列番号： 12で表されるアミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
ヒ卜 GPR 8リガンドペプチド前駆体をコードする cDNAの塩基配列を示す。 〔配列番号： 20〕
ヒト G P R 8リガンドぺプチド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 21〕
ブ夕 GPR 8リガンドペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ブ夕 G P R 8リガンドぺプチド前駆体をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
ブ夕 G P R 8リガンドぺプチド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 24〕 ブタ G P R 8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 25〕
ブタ G P R 8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 26〕
配列番号： 24で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
配列番号： 25で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
ラット GPR 8リガンドペプチド前駆体をコードする c DNAの配列を示す。 〔配列番号： 29〕
ラット GP R 8リガンドぺプチド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 30〕
ラット GPR 8リガンドぺプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 31〕
ラット GPR 8リガンドペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 32〕
配列番号： 30で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 33]
配列番号： 31で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
マウス GPR 8リガンドぺプチド前駆体をコードする c D N Aの配列を示す。
〔配列番号： 35〕
マウス GPR 8リガンドぺプチド前駆体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 36〕
マウス GPR 8リガンドペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 37〕
マウス GPR 8リガンドペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 38〕
配列番号： 36で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 39〕
配列番号： 37で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 40〕
合成ヒト GPR 8リガンド （1— 23) 酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 41〕
合成ヒト GPR 8リガンド （1— 22) のアミノ酸配列を示す。 '
〔配列番号： 42〕
合成ヒト GPR8リガンド （1— 21) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 43〕
合成ヒト GPR 8リガンド (1-20) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 44〕
合成ヒト GPR 8リガンド (1- 19) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 45〕
合成ヒト GPR 8リガンド (1 - 18) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 46〕
合成ヒト GPR8リガンド (1- 17) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 47〕
合成ヒト GPR8リガンド (1- 16) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号 : 48〕
合成 GPR8リガンド (1-23) 酸化体のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 49〕
合成ラットまたはマウス GPR 8リガンド (1 -23)酸化体のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 50〕
合成 Fmoc化ヒト GPR 8リガンド （1— 23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 51〕
合成 [N^Acetyl-Trp1] —ヒト GPR 8リガンド （1— 23) のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 52〕 合成ヒト GPR 8リガンド （2— 23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 53〕
合成ヒト GPR8リガンド （4一 23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 54〕
合成ヒト GPR8リガンド （9— 23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 55〕
合成ヒト GPR 8リガンド （15— 23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 56〕
合成 [N-Acetyl-Tyr2] —ヒト GPR 8リガンド (2-23) のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 57〕
合成 [D-Trp1] —ヒ卜 GPR8リガンド (1-23) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 58〕
合成 [Ν-3-Indolepropanoyl-Tyr2] —ヒト GPR8リガンド (2-23) のアミ ノ酸配列を示す。
〔配列番号： 59〕 .
配列番号： 41で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 60〕
配列番号： 42で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 61〕
配列番号： 43で表されるァミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 62〕
配列番号： 44で表されるァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を示す。
〔配列番号： 63〕
配列番号： 45で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 64〕
配列番号： 46で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 65〕
配列番号： 47で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 66〕
配列番号： 52で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 67〕 '
配列番号： 53で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 68〕
配列番号： 54で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 69〕
配列番号： 55で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 70〕
配列番号： 21で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 71〕
[Phe2] ヒ卜 GPR8リガンド (1-20) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 72〕
配列番号： 71で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。 〔配列番号： 73〕
ヒト GPR 8のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 74〕
配列番号： 73で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 75〕
ラット TGR26のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 76〕
ラット TGR26をコードする cDN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 77〕
マウス TGR26のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 78〕
マウス TGR26をコードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 79〕
ヒト GPR7のァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 80〕 ヒト GPR7をコードする塩基配列を示す。 以下に参考例および実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、 これら は本発明の範囲を限定するものではない。
参考例 1
[Phe2] ヒト GPR8リガンド （1-20) (配列番号： 71) の製造 '
アプライドバイオシステムズ社のペプチド自動合成機 （ABI 433モデル） を使 用し、プログラムに従って C端より逐次 Fmoc法によりペプチド鎖を延長し目的の 保護べプチド樹脂の合成を行った。
出発アミノ酸樹脂担体は Wang (p-benzyloxybenzyl alcohol) 樹脂 (0.25mmol) を使用し、 Fmoc - Leu、 Fmoc-Gly、 Fmoc - Ala、 Fmoc - Arg(Pbf)、 Fraoc-VaK
Fmoc- Thr (Bu')、 Fmoc- His (Trt)、 Fmoc-Tyr (Bul) , Fmoc- Pro、 Fmoc-Ser (Bu') Fmoc-Lys (Boc)、 Fraoc-Phe, Fmoc - T卬 (Boc)の Fmocアミノ酸誘導体を HBTU (2- (1H 一べンゾトリアゾ一ル—1一ィル）一 1， 1,3， 3—テトラメチルゥロニゥム へキサ フルォロホスフェート） によりシークェンスにしたがつて逐次縮合した。
樹脂上へのぺプチドの構築が終了後、保護べプチド樹脂を乾燥した。得られた 保護べプチドの脱保護処理とぺプチドの樹脂担体からの切り離しは TFA処理によ つて行なった。 得られた粗ぺプチドは 0.1 % TFA水によって抽出し、 凍結乾燥に より粉末固体として得た。続いて、粗べプチドを逆相高速ク口マトグラフィー（島 津製作所、 分取装置：モデル LC8A) によりァセトニ卜リル— 0.1 % TFA水の系
(15-35%、 80分） を用いて分取精製を行なって目的とする精製ペプチド 35 mgを 得た。
精製物を 0.2% 3- (2 -ァミノエヂル）インドールを含む 4N メタンスルホン酸に よって 110°C · 22時間の条件で加水分解して得た加水分解物のアミノ酸分析値は (括弧内は理論値） 以下のとおり。
Thr (1) 0.93, Ser (1) 0.92, Gly (2) 2.03, Ala (3) 3.09, Val (2) 1.90, Leu (2) 2.02, Tyr (1) 1.02, Phe (1) 1.00, His (2) 1.91, Lys (1) 0.98， Trp (1) 0.88, Arg (2) 2.06, Pro (1) 1.02
純度は HPLCにより 98.8%と算出された。 また、 質量分析値は 2266.6 (理論値 2266.6) であった。 参考例 2
ラクトパーォキシダーゼ法を用いた [Phe2, 125I-Tyr10]ヒト GPR8リガンド (1-20) の作製
DMSO IO Iに溶かした、 参考例 1に記載した製法に準じて得られた [Hie2] ヒ ト GPR8リガンド α_20) (配列番号： 71) lO nmolを、 0.1 M塩化ニッケル水溶液 IO K 0.1 MHEPES (pH 7.6)に溶かした 0.001 %過酸化水素水 10 1、 0.1 MHEPES (pH 7.6)に溶かしたラクトパーォキシダーゼ (シグマ社) 10 g/mlを 10 1、 お よび [l25I]NaI 40 MBq (NENライフサイエンスプロダクツ社） 10 1を混合して室 温で 50分間反応させた後、 生成した [Phe2, 125I-Tyr10] ヒト GPR8リガンド（1-20) を以下の条件の HPLCにより分取した。
用いたカラムは、 ODS-80TM (4.6 minx 15 cm) (ト一ソ一社）.. 溶出液 Aとして 10% ァセトニトリル /0.1% TFA、 溶出液 Bとして 60%ァセトニトリル /0.1% TFAを用 い、 0-0 (2 min)、 0-27 (5 min)、 27-32 (40 min) %B/A+Bのグラディエント溶 出法を行なった。 流速は 1 mL/min、 カラム温度は 40°C、 検出は 215 MIとした。 こ の HPLC条件では., [Phe2, 125ト Tyr10] ヒト GPR8リガンド（1-20)は 25分付近に溶出 した。 実施例 1
11NPW23静脈投与によるラットの胃酸分泌に対する作用
Wistar系雄性ラット (日本チャルズリバー、 320〜360g) を自由飲水下で 16時 間絶食後、 力ルバミド酸ェチル （和光純薬） を腹腔内投与し （1.0g/ml/kg)、 麻 酔下にてラット手術台に固定して開腹した。 胃カテーテル （MedtopX2- 50、 外径 3.5匪、 内径 2. lmm) を十二指腸経由で胃内に （2cm) 挿管し、 幽門管を結紮後、 右大腿静脈を遊離し、 静脈挿管した。 37°Cに加温した蒸留水 （大塚製薬） を用い て胃内洗浄を行い、 約 1時間放置した。 hNPW23を生理食塩水 （大塚製薬） に 80 iM となるように溶解した。 対照群には生理食塩水を投与し、 各群 8例で行なった。 hNPW23および生理食塩水の投与は、 インフェージヨンポンプ （Harvard Apparatus) を用いて、 1 ml/hの流速で 30分間大腿静脈より行なった。測定は、 胃内にあらかじめ 37°Cに加温したの蒸留水 （1ml) を注入しておき、 10分後、 そ の胃内容液を採集した。各々採集した胃液に、 30 1の Bromthymol blue indi cator solut ion (BTB、 和光純薬） を加え、 0. IN NaOH溶液を用いて当量点 (PH 7. 0) に 達するまでに消費した NaOH量（消耗量）を測定し、胃酸分泌量を算出した。 hNPW23 投与前後の胃酸分泌量を計測し、 投与前後の胃酸分泌量変化の比率' (%) をもつ て T-検定を行なった。
hNPW23投与による胃酸分泌量の変動は、 次式に従って表記した。
胃酸分泌量 Eq) =0. IN NaOHX消耗量 （ ）
(%) = (hNPW23投与後胃酸分泌量） I (hNPW23投与前胃酸分泌量） X 100 胃酸分泌量変化の結果は、 対照群が 103. 7 土 5. 1 %であったのに対して、 11?«^23投与群は145. 6 土 8. 5 %であり、 hNPW23投与群は P値 0. 01以下をもって有 意に胃酸分泌量が増加した。 値は平均値土標準誤差 （mean土 SE) を示す。
これより明らかなように、 hNPW23投与群の胃酸分泌量は対照群に比較し、有意 に増加した。 実施例 2
幽門結紮ラットにおける PW23投与による胃液量、 胃液 pH、酸度および胃酸分 泌量に対する作用
Wi s tar系雄性ラット (340〜360g) を自由飲水下で 16時間絶食後、 エーテル麻 酔下にて開腹し、 幽門結紮術を行い、 腹壁を閉じた。 hNPW23を生理食塩水に溶解 (2 mg/ral) し、 腹腔内投与 (2 mg/kg) した。 対照群には生理食塩水を投与し、 各群 8例で行なった。 幽門結紮 3時間後にラットをネンブタール (40 mg/kg, 大日 本製薬）麻酔下にて開腹し、噴門部を結紮後、胃を摘出した。胃内容液を採集し、 遠心 (2500 rqmX I O min) 後、 その上清を用いて、 胃液量 （ml) 、 胃内 pH、 胃酸 度 （mEQ/l) および総酸分泌量（ Eq/kg/h)を測定した。
1 mlの胃液に 30 1の BTB (和光純薬） 溶液を加え、 0. IN NaOH溶液を滴下し、 当量点 （PH 7. 0) に達するまでに消費した NaOH量を測定し、 酸度および総酸分泌 量を算出した。 胃液 pHは、 Twin pHメ一ター B- 212 (堀場製作所） を用いて測定した。
各測定値は以下の式に従って算出し、 T-検定を行なった。
酸度 (mEq/l)=0.1N NaOHX消耗量 ( 1) /胃液 (1000^1)
総酸分泌量 （ Eq/kg/h)=酸度 X胃液量/体重/時間
結果を表 1に示す。
〔表 1〕
胃内 PH 胃液量 （ml) 酸度 (mEq/1) 総酸分泌量 Eq/kg/h) 対照群 1.12±0.08 4.0±0.7 69.4±6.2 294.6±86.6
hNPW23 0.83±0.03=l= 7.9±1.2* 96.0±4.2 747.4±121.5
表の値は平均値土標準誤差 （Mean土 SE) で示す。
*は対照群に比べて、 p値が 0.05以下であることを示す。
* *は対照群に比べて、 p値が 0.01以下であることを示す。 ラットに hNPW23を投与 （静脈、 腹腔内） すると、 酸分泌量は有意に増加するこ とから、 hNPW23は胃酸分泌促進作用を有することがわかる。 実施例 3
幽門結紮ラットにおける hNPW23投与によるガストリン分泌量に対する作用 上記実施例 2と同様に Wistar系雄性ラット (340〜360g) を自由飲水下で 16時 間絶食後、エーテル麻酔下にて開腹し、幽門結紮術を行い、腹壁を閉じた。應23 を生理食塩水に溶解 （2 mg/ml) し、 腹腔内投与した。 対照群には生理食塩水を 投与し、 各群 8例で行なった。 幽門結紮 3時間後ラットをネンブタール (40 mg/kg ip) 麻酔下にて開腹し、 腹部大動脈から採血し、 血液を 7mlの採血管 （テルモ、 EDTA含有） に入れ、 遠心 （3000 rpmXIO min) し、 計測するまで- 40°Cに冷凍保 管した。 血中ガストリン濃度の測定はガストリン RIA ΚΙΤΠ (ABBOTT JAPAN)を用 いて測定した。 各測定値の平均値をもって F-検定を行なった。 2000 g/kg投与 群において血中ガストリン濃度が有意に上昇したことから、 NPWの胃酸分泌促進 作用にはガストリンが関与し、 NPWがガストリン分泌促進作用を有していること が明らになった。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドまたは受容体の活性を阻害する化合物またはその塩、本 発明の抗体、 本発明のアンチセンス D NAは、 低毒性で安全な、 例えば胃酸分泌 抑制剤、 粘膜保護剤、 ミネラル吸収促進剤などとして有用であり、 例えば上部消 化管疾患 〔例、 消化性潰瘍 （例、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍、 吻合部 瘍、
Zol l inger-El 1 i son症候群など)、胃炎、逆流性食道炎、麵（Non Ulcer Dyspeps ia)、 胃癌、 胃 MALTリンパ腫、 非ステロイド系抗炎症剤に起因する潰瘍、 手術後ストレ スによる胃酸過多および潰瘍など〕 の予防 ·治療剤、 へリコパクター ·ピロリ除 菌剤などとして使用できる。
本発明のポリぺプチドまたは受容体の活性を促進する化合物またはその塩、本 発明のポリペプチドまたは受容体、本発明の D NAは、例えば胃酸分泌促進剤と して使用することができ、 例えば、 消化不良症 (例、 下垂体性消化不良症、 腎性 消化不良症など）、骨代謝障害（例、骨粗しょう症、骨軟化症など）、貧血症（例、 鉄欠乏性貧血など） などの予防 ·治療剤として使用することができる。 さらに、 本発明のポリぺプチドまたは受容体の活性を促進する化合物またはその塩、本発 明のポリペプチドまたは受容体、本発明の D NAは、 胃液分泌能検査剤として使 用できる。
本発明のポリペプチドまたは受容体、 本発明の D N Aは、 上記予防 ·治療剤の スクリーニングにも有用である。

Claims

請求 の 範囲
1 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ たはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる上部消化管疾 患の予防 ·治療剤。
2 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩に対する抗体、 または（i i)配列番号： Ί 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまた はその塩に対する抗体を含有してなる上部消化管疾患の予防 ·治療剤。
3 . (0 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のァミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの、 または （i i)配列番号： 7
3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくは その部分ぺプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相 補的もしくは実質的に相補的 塩基配列またはその一部を含有するアンチセン スポリヌクレオチドを含有してなる上部消化管疾患の予防 ·治療剤。
4 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる胃酸分泌抑制 剤。
5 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる消化不良症、骨 代謝障害または貧血症の予防 ·治療剤。
6 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩を含有してなる消化不良症、骨代謝障害または貧血症の予防'治療剤。
7 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩をコードするポリヌクレオチドを含有してなる消化不良症、骨代謝障 害または貧血症の予防 ·治療剤。
8 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる胃酸分泌促進 剤。
9 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルま たはその塩を含有してなる胃液分泌能検査剤。
1 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる胃液分泌能
1 1 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、および（または） （i i)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療剤のスクリ一二 ング方法。
1 2 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、および（または） （i i)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩を含有することを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療剤のスクリ一 ニング用キッ卜。
1 3 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、 および（または） （i i) 配 列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： Ί 9で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質もしくはその部分べプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを用 いることを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療剤のスクリーニング方法。
1 4. (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、 および（または） （i i) 配 列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わさ れるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白 質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドを含 有することを特徴とする上部消化管疾患の予防'治療剤のスクリーニング用キッ
1 5 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、および（または） （i i)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする胃酸分泌抑制剤のスクリーニング方法。
1 6 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、および（または） （i i)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする消化不良症、 骨代謝障害または貧血症の予 防 ·治療剤のスクリーニング方法。
1 7 . (i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのァミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、および（または） .(i i)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする胃酸分泌促進剤のスクリーニング方法。
1 8 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i)上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩 に対する抗体、 (i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレ ォチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番 号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を阻害する化 合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体、 (vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコード するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列 またはその一部を含有するァンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与する ことを特徴とする上部消化管疾患の予防 ·治療法。
1 9 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩の活性を阻害する、 または（b)配列番号： Ί 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一も し.くは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする上部消化管疾患の予防'治療 法。
2 0 . 胃酸分泌抑制剤を製造するための （i) 配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリべプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物 またはその塩、 (i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩に対する抗体、 （i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に 相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセ ンスポリヌクレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活 性を阻害する化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチド またはその塩に対する抗体、 (vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたは その塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相 補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドの使 用。
2 1 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するボリぺプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 (i i)上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩 に対する抗体、 (i i i) 上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは 実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレ ォチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番 号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列 を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化 合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に 対する抗体、 (vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコード するポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列 またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を投与する ことを特徴とする胃酸分泌抑制法。
2 2 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩の活性を阻害する、 または（b)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはそめ部分べプチ ドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする胃酸分泌抑制法。
2 3 . 上部消化管疾患の予防 ·治療剤を製造するための （i) 配列番号： 1で 表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を 阻害する化合物またはその塩、 (i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもし <はそのエステルまたはその塩に対する抗体、 (i i i) 上記ポリペプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコ一ドするポリヌクレオチ ドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含 有するァンチセンスポリヌクレオチド、 (iv)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまた はその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその 部分ペプチドまたはその塩に対する抗体、 (vi) 上記蛋白質もしくはその部分べ プチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしく は実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌク レオチドの使用。
2 4. 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのァ ミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、 (i i)上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 (.i i i) 上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩をコードするポリヌクレオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配 列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩、 または（vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドま たはその塩をコ一ドするポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とす る消化不良症、 骨代謝障害または貧血症の予防 ·治療法。
2 5 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一'のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩の活性を促進する、 または（b)配列番号： 7 3、 配列番号：
7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする消化不良症、骨代謝障害また は貧血症の予防 ·治療法。
2 6 . 消化不良症、 骨代謝障害または貧血症の予防《治療剤を製造するための
(i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミ ノ酸配列を含有するポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、 （i i)上記ポリぺプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 (i i i) 上記ポリペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩をコードするポリヌク レオチド、 （iv) 配列番号： 7 3、 配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列 番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配 列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたはその塩の活性を促進する 化合物またはその塩、 （V)上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 または（vi)上記蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポ リヌクレオチドの使用。
2 7 . 哺乳動物に対して、 （i) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのァ ミ.ドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、
(i i)上記ポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
(i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩をコードするポリヌクレオチド、 （iv) 配列番号'： 7 3、 配列番号： 7 5、 配 列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチドまたは その塩の活性を促進する化合物またはその塩、 （V) 上記蛋白質もしくはその部 分ペプチドまたはその塩、 または（vi) 上記蛋白質もしくはその部分ペプチドま たはその塩をコードするポリヌクレオチドの有効量を投与することを特徴とす る胃酸分泌促進法。
2 8 . (a) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩の活性を促進する、 または（b)配列番号： 7 3、配列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分べプチ ドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする胃酸分泌促進法。
2 9 . 胃酸分泌促進剤を製造するための （i) 配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するポリペプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物 またはその塩、 (i i)上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩、 (i i i) 上記ポリペプチドもしくはそのァミドもしくはそのェ ステルまたはその塩をコードするポリヌクレオチド、 (iv) 配列番号： 7 3、 配 列番号： 7 5、 配列番号： 7 7または配列番号： 7 9で表わされるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部 分べプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、 (V) 上記蛋白 質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、 または（vi) 上記蛋白質もしくはそ の部分べプチドまたはその塩をコ一ドするポリヌクレオチドの使用。
3 0 . 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ酸配列を含有するポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル ま.たはその塩、または上記ポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を用いることを特徴とす る、 胃液分泌能検査法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7763716B2 (en) 2003-05-28 2010-07-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibody against NPW

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001098494A1 (fr) * 2000-06-21 2001-12-27 Takeda Chemical Industries, Ltd Ligand de gpr8 et son adn

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1403281B1 (en) * 2001-06-14 2008-07-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Novel ligand and dna thereof
AU2003218713A1 (en) * 2002-03-22 2003-10-08 Bayer Aktiengesellschaft Diagnostics and therapeutics for diseases associated with homo sapiens g - protein - coupled receptor 7 (gpr7)
WO2003081234A2 (en) * 2002-03-26 2003-10-02 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with homo sapiens g - protein - coupled receptor 8 (gpr8)
US20060134109A1 (en) * 2002-09-09 2006-06-22 Nura Inc. G protein coupled receptors and uses thereof
EP1627888A4 (en) * 2003-05-28 2007-04-18 Takeda Pharmaceutical ANTIBODY AND ITS USE

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001098494A1 (fr) * 2000-06-21 2001-12-27 Takeda Chemical Industries, Ltd Ligand de gpr8 et son adn

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BREZILLON S. ET AL: "Identification of natural ligands for the orphan G protein-coupled receptors GPR7 and GPR8", J. BIOL CHEM, vol. 278, no. 2, 10 January 2003 (2003-01-10), pages 776 - 783, XP002247965 *
See also references of EP1602380A4 *
SHIMOMURA Y. ET AL: "Identification of neuropeptide W as the endogenous ligand for orphan G-protein-coupled receptors GPR7 and GPR8", J. BIOL. CHEM., vol. 277, no. 39, 27 September 2002 (2002-09-27), pages 35826 - 35832, XP002961094 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7763716B2 (en) 2003-05-28 2010-07-27 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibody against NPW

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