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WO2003100423A2 - Biopuce presentant une organisation amelioree - Google Patents

Biopuce presentant une organisation amelioree Download PDF

Info

Publication number
WO2003100423A2
WO2003100423A2 PCT/FR2003/001574 FR0301574W WO03100423A2 WO 2003100423 A2 WO2003100423 A2 WO 2003100423A2 FR 0301574 W FR0301574 W FR 0301574W WO 03100423 A2 WO03100423 A2 WO 03100423A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
elementary
sites
biochip
identification
peripheral zone
Prior art date
Application number
PCT/FR2003/001574
Other languages
English (en)
Other versions
WO2003100423A3 (fr
Inventor
Marc Cuzin
Bernard Mandrand
Philippe Cleuziat
Hafid Abaibou
Original Assignee
Apibio
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Apibio filed Critical Apibio
Priority to AU2003255599A priority Critical patent/AU2003255599A1/en
Publication of WO2003100423A2 publication Critical patent/WO2003100423A2/fr
Publication of WO2003100423A3 publication Critical patent/WO2003100423A3/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding

Definitions

  • the present invention relates to biochips, and more particularly the mode of organization of its binding sites, to serve as tools in molecular biological analysis.
  • biochip is meant a functional unit, for single use or not, generally implemented for the purposes of molecular biological determination, arranged for and / or intended to cooperate with at least one distinct and complementary device or instrument, and receiving a sample of interest, liquid or fluid, immobile or in motion, suspected of containing at least one target species, in suspension or in solution, for example a biomolecule, possibly labeled, and delivering at least one output signal in relation to the presence, and / or the nature, and / or the structure, and / or the quantity of said target species.
  • This biochip includes at least:
  • the material or the material of the support is inert, and not substantially electrically conductive, at least according to said operating surface, in the sense that said material practically does not interact with the sample, and in particular the target species, by strong bond of the covalent chemical bond type, or by weak bond, for example hydrogen bond, other interactions of physical type, such as surface tension, not being otherwise excluded;
  • the material constituting such a support is for example silicon, a glass, or a plastic material, for example a thermoset or thermoplastic synthetic resin, for example a polypropylene, a polystyrene or a polyacrylamide resin,
  • this treatment may for example consist of a coating with a layer of an electronic conductive polymer, for example modified polypyrrole, according to the techniques described in the documents FR 2703359, WO9422889, EPO 691 978, FR 2 787 582, EP 1 141 391, and WO 0036145,
  • a set of connections, or circuit, for example electrical, with the various elementary sites respectively said set of connections being arranged to connect each elementary site individually, independently from the other elementary sites, for example by addressing (see document FR-A-2741475), said set of connections is for example an electrical circuit multiplexed with electrodes and counter-electrodes disposed respectively in said elementary sites;
  • This biochip can also comprise, in an integrated manner or not with the operating surface and its ligands or probes, various means, brought to the scale of the biochip, conventionally used in the laboratory, for:
  • the support comprises a set of channels and / or sinks, for example reactive, linked together and with the circulation cavity or stay, as well as various reagents or treatment agents, in the dry or liquid state, arranged on the support according to the circulation and the treatment or treatments retained for the sample starting point or sample of interest.
  • biochips for example of the order of 1 mm 2 to a few cm 2 , normally require, for their production or production, the implementation of techniques known as “micro” or “nano-technologies”, for example by lithography or micro-machining.
  • the Applicant does not intend to be limited to particular dimensions, in particular of the order of ⁇ m or of nm, when it uses the term "biochip" in the present description and in the appended claims, considering that the same structure or the same arrangement as that defined below can be implemented with dimensions of the order of a few mm 2 , as with much larger dimensions.
  • a biochip as considered by the present invention can not function autonomously, except to embark with it its own source of energy.
  • this biochip is designed to cooperate, for example removably, on the one hand with external means making it possible to circulate or remain, in contact with the operating surface and the ligands, the liquid sample of interest, but also other fluids or liquids such as washing liquid, and on the other hand with means for detecting and processing the output signal (s), the whole being generally controlled and controlled, by external electronic means, analog or IT, for example according to any processing logic or flowchart.
  • biomolecule any entity, in particular biochemical, or biological, identical to or derived from any molecular species existing in nature.
  • biopolymers for example DNA, RNA, oligo and polynucleotides, functional or structural proteins, peptides, oligo and polypeptides, polysaccharides, etc.
  • marking or “marked” is meant the characteristic according to which a marker, that is to say a substituent or residue allowing, is fixed on an entity, for example the target species, covalently or otherwise, with or without the help of an external means, such as illumination, with or without a subsequent step, such as contacting a substrate, to produce a signal, previously called the output signal.
  • the preferred markers according to the present invention are:
  • fluorophores for example fluorescein, cyanine, phycoerythrin - luminophores: luminol, isoluminol, ABEI (_N-4-amino-butyl-N- ethyl-isoluminol)
  • determination is meant the identification, qualitative and / or quantitative, the detection, the description (for example sequencing), the separation, or the enrichment of the target species, which can be called “analyte” in the case qualitative and / or quantitative identification.
  • the expression “determination” means any sequencing of a DNA or polypeptide type biomolecule.
  • the output signal or signals considered by the present invention may have any suitable nature, depending on the markers used, and the type of detection required. They may be light, visible or invisible, electrical, electro-optical, electrochemical, etc. signals. Furthermore, these signals may, if necessary, be detected separately, taking into account, on the one hand, the addressing elementary sites of the biochip, and on the other hand of the connection assembly respectively with the various elementary sites, possibly present on the biochip.
  • ligand any entity, cellular, biological, or biomolecule having an affinity, specific or not, for a target species. Affinity expressing that it forms, under the conditions (in particular temperature, pH, ionic strength, etc.) of bringing the target species into contact with the ligand, a stable pairing or complex between said target species and said ligand.
  • a ligand mention will be made of any oligonucleotide capable of binding by weak bonds, in this case it is said to hybridize, with a strand of DNA (target species), comprising a sequence complementary to that of the ligand.
  • Each ligand is attached or anchored at each elementary site of the biochip, optionally after functionalization of the operating surface of the support, by any suitable means, for example chemical, by covalent bond, for example by means of a spacer arm, or by adsorption, absorption, etc.
  • the binding of the ligands can be carried out according to the electrochemical techniques described in documents FR 2789401, EP 1 152 821 and WO 0047317, FR2 742 451, EP 0 868 464 and WO 9722648.
  • target species any cell, biological or biochemical species capable of binding by weak bond to one or more ligands.
  • biochips are tools, simple or complex, well suited to all kinds of molecular biology analysis; confer “DNA chips: a new tool for genetic analysis and diagnostics". M.Cuzin. Clinical and Biological Transfusion 2001; 8: 291-6. "How to make a DNA chip” Mickael C Pirrung. Angew.chem.lnt.ed 2002, 41, 1276, 1289.
  • a biochip as described above is placed at the bottom of a well, for example a micro-titration plate, within which the liquid sample comprising the target species is introduced, stays, then is discharged.
  • the object of the present invention is to organize the operating surface, the network of elementary sites, and the ligands or probes of the biochip, so as to be able not only to determine one or more target species, but also to control on the support of the biochip this determination and its operating conditions.
  • the subject of the invention is a biochip embedding the means making it possible to control the biological determination carried out principally with said biochip.
  • the present invention relates to a biochip, for which the output signals, for example of the light type, are not disturbed by the geometrical environment of said biochip, whatever the elementary site considered.
  • a biochip according to the invention generally comprises a support, one useful face of which comprises an operating surface with a network of elementary sites disposed on the operating surface and a multiplicity of ligands each fixed in multiple number at respectively different elementary sites.
  • the elementary sites are distributed between, on the one hand, a central zone assigned to the biological determination of at least one target species, comprising active elementary sites, each comprising in multiple numbers so-called active ligands, respectively different , intervening directly in the biological determination, and a peripheral zone (5) circumscribing at least in part the central zone, comprising elementary so-called control sites, comprising where appropriate so-called control ligands.
  • the contour of the operating surface has a generally polygonal shape, for example rectangular, with rounded angles.
  • the elementary sites are distributed between a central zone whose contour has a generally polygonal shape, for example rectangular, and the peripheral zone circumscribing at least partially the central zone, whose contour usually has the shape of a line broken, for example rectangular, open or closed, said peripheral zone having angles free of all elementary sites.
  • FIG. 1 represents a biochip according to the invention, seen from above and on an enlarged scale, diagrammatically FIG. 2 and FIG. 3 represent the deposition plans of ligands or probes in biochips identical to the representation according to FIG. 1.
  • a biochip according to the invention comprises a support (2) of which a useful face (2a), for example upper, comprises a operating surface (3) supporting a network of elementary sites (Xn), arranged on said surface, and a multiplicity of ligands (not shown, and therefore not numerically referenced), each fixed in multiple number at respectively different elementary sites.
  • the elementary sites each identified by a letter (A to Z) and by a number (0 to 13) are distributed between, on the one hand a central zone 4, of rectangular shape, corresponding to the rows A to H and columns 1 to 12, assigned to a biological determination of at least one target species, comprising elementary so-called active sites, since it intervenes directly in the biological determination of the target species, each comprising in multiple number of said ligands active for the same reasons, respectively different, and on the other hand a peripheral zone (5), constituted by rows I and Z and columns 0 and 13, circumscribing at least partially the central zone (4), comprising sites so-called control elementals, possibly including so-called control ligands, in the sense that said sites and ligands are not directly involved in the biological determination of said target species, and so optional a number y of elementary sites called identification of the type of biochip thus produced.
  • biochips identical to that described with reference to FIG. 1 and to the preceding description.
  • biochips are produced and obtained from a silicon-based support, according to the technique generally described in documents FR2787582, EP1141391 and WO0036145 with the following main essential steps:
  • a) Structuring of a substrate so as to obtain microcuvettes on this substrate comprising in their bottom a layer of a material capable of initiating and promoting the adhesion thereon of a film of a pyrrole copolymer functionalized by electropolymerization
  • c) Direct or indirect fixing of a biological probe on the functionalized pyrrole by injection of a solution of the biological probe, optionally into one or more microcuvette (s) in the presence of chemical reagents necessary for the direct, or indirect, fixation of this biological probe on the functionalized pyrrole.
  • yeast lies on the one hand in that it is an ancestral eukaryotic organism, and on the other hand in its organizational proximity of the genome with that of higher eukaryotic cells. In addition, it is easy to manipulate and its genome is fully sequenced (6430 genes distributed on 16 chromosomes). It is also well documented and widely used as a biological model in pharmacology, toxicology and oncology studies.
  • RNAs (approximately 20 ⁇ g) of the test and reference samples are back-transcribed using the Superscript II Reverse-Transcription kit.
  • cDNAs thus labeled are purified on Microcon filters according to the manufacturer's recommendations (Milipore Corp., Canton, Massa.).
  • the probes were chosen using OLIGO 6 software which takes into account their affinity, their percentage of G-C and their Tm (melting temperature). Initially, these probes terminated by an amino group were qualified on a glass slide with PCR products and cDNA. The single probes thus retained are 50 seas on which was grafted a spacer of type dT 10 terminated by a pyrrole group in position 5 ′.
  • the addressing is carried out using pyrrole monomers whose nitrogen is substituted by 50-mer oligonucleotides synthesized and checked beforehand. All the probes will carry at their 5 'end a spacer of the dT10 type adjacent to the polypyrrole group and which ensures maximum accessibility.
  • the 128 microelectrodes are successively addressed according to the deposition plan described in the present invention.
  • the electrocopolymerization takes place in an aqueous solution containing an inert salt: 0.2 M LiCIO4 as electrolyte and a mixture of pyrrole 20 mM and 1 ⁇ M of ODN-pyrrol.
  • the electropolymerization takes place under a potential of 1 V vs / DHW. Between each deposit, the chip is thoroughly rinsed with deionized water. At the end of this stage, the matrix is dried, stored under Argon at 4 ° C. until it is used.
  • Hybridization solution (100 ⁇ l) is composed of: 1 ⁇ l of biotinylated target (10 ⁇ M); 99 ⁇ l of hybridization buffer (1.3% Denhart 5X; 66.7% Salmon sperm; 31.9% of buffer A)
  • the hybridization is carried out as follows: 20 ⁇ l of the hybridization solution are deposited on the chip. The chip is then covered with a coverslip for maximum sealing. Incubation is carried out for 45 minutes at 45 ° C. in a humid chamber.
  • the post-hybridization washing is carried out with 4 ⁇ 25 ⁇ l of the buffer (0.01 M PBS; 0.534 M NaCl; 2.7 mM KCI; 0.05% Tween 20). Streptavidin-Phycoerythrin (0.1 mg / ml) is used for 10 min in the dark for development.
  • Post-revelation washes are carried out in 4 X 25 ⁇ l of washing buffer.
  • Buffer A PBS: 0.02 M; NaCl
  • nucleotide sequences of pyrrole probes and calibrators (the probe number corresponds to its position on the coding sequence of the corresponding gene).
  • the probe deposition plan is shown in Figure 2, in the central zone (4) corresponding to rows A to H, and to columns 1 to 12. This arrangement reproduces exactly the format of the 96 positions of a microtiter plate. It retains the indexing which serves as a reference for those skilled in the art.
  • FIG. 4 shows the specificity of the hybridization signals on a Micam® chip in the presence of long PCR fragments.
  • fig 4 a Hybridization ACT 560 Bio (6 ng / ⁇ l)
  • fig 4 b Hybridization Gre 36 Bio (6 ng / ⁇ l)
  • fig 4 c Hybridization Rps 38 Bio (3 ng / ⁇ l) + T3 (Plectovirus) (0.5 ng / .mu.l)).
  • The% standard responses are ranged between 80 and 100% as shown in the table below.
  • Hybridization is carried out at 45 ° C. for 1 h 30 min in the MICAM hybridization buffer from 15 ⁇ l of the aliquot fraction of a purified PCR product (alkaline phosphatase, exonuclease I) and fragmented (digestion with a restriction enzyme).
  • the target species is a genomic fragment of a patient comprising the exons of interest of the p53 or Kras genes.
  • the addressing is carried out from pyrrole monomers whose nitrogen is replaced by oligonucleotide sequences whose size is between 15-30 seas previously synthesized. All the probes will carry at their 5 'end a linker which follows the polypyrrole grouping thus ensuring maximum accessibility.
  • the 96 microelectrodes are successively addressed according to the deposition plan described in FIG. 3.
  • the electrocopolymerization takes place in an aqueous solution containing an inert salt: 0.2M LiCIO 4 as the electrolyte and a mixture of pyrrole 20mM and 1 ⁇ M of ODN-pyrrol.
  • the electropolymerization takes place at a potential of 1 V vs / DHW. Between each deposit, the chip is rinsed with deionized water. At the end of this process, the matrix is dried, stored under Argon at 4 ° C until it is used.
  • the operating procedure for the implementation of the biochip previously described with a view to detecting the mutations previously defined, comprises the following essential steps:
  • Hybridization is carried out at 45 ° C. for 1 h 30 min in the MICAM hybridization buffer from 15 ⁇ l of the aliquot fraction of a purified PCR product (alkaline phosphatase, exonuclease I) and fragmented (digestion with a restriction enzyme).
  • the post-hybridization washing is done with 4 X 250 ⁇ l of PBS.
  • the extension is carried out for 1 H 30 min at 45 ° C. in the presence of Thermosequenase (8U), of the buffer of thermosequenase, of ddNTP (10 ⁇ M final) including one biotinylated.
  • the post-extension washes are done for 2 X 90 sec with H2O at
  • Streptavidin-Phycoerythrin (0.1 mg / ml) is used for 10 min in the dark for development.
  • the post-revelation washes are carried out in 4 X 250 ⁇ l of washing buffer.
  • each elementary identification site (10) comprises a marker fixed or linked via the pyrrole, capable of generating an identification signal, for example a light signal.
  • the combination of identification signals obtained during the processing of the biochip, generates an identification code in binary format.
  • the sites 7; 8 and 11 have a marker attached or linked via the pyrrole (1), then that the other sites in row I do not have one (0).
  • two elementary sites (11 and 12) called positive control and negative control respectively, predetermined in positions (D0 and C0) respectively comprise a ligand capable of binding with the target species, and a ligand not capable of binding with said target species, under the conditions of contact with binding between the above-mentioned target species and the other ligands in the central zone (4).
  • the ligands attached in zones 11 and 12 are each different from the ligands or probes present in the central zone (4).
  • This arrangement makes it possible to validate the stages of preparation of the biological sample to be studied and / or the stage of hybridization
  • These can be elementary quality control sites of the detection system, for example comprising a pyrrole - oligonucleotide - biotin on which avidin is capable of clinging to the avidin coupled to a marker.
  • an elementary site (15), said to be untreated, predetermined in position (E0), remains free from any treatment, and or an elementary site (16), said to be treated, predetermined in position
  • These elementary identification sites comprise respectively different quantities (from 10 4 to 10 9 molecules) of one or more species of markers. This arrangement makes it possible to establish a calibration of the reading.
  • the support (2) comprises a member (19), said polarizing, deposited in the peripheral zone (5) on the support (2), which can consist of an additional elementary site, and which makes it possible to identify in relative position the biochip (1).
  • the elementary sites are one hundred and twenty-eight in number and distributed along two orthogonal axes, namely in eight rows referenced A to H along an axis, and twelve columns referenced 2 to 11, along another perpendicular axis.
  • the peripheral zone (5) comprises two lines or rows referenced Z and I, and two columns referenced 0 and 13, surrounding the central zone (4) of rectangular shape.

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Abstract

Biopuce (1) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3) avec un réseau de sites élémentaires (Xn) disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisé en ce que les sites élémentaires sont distribués entre une zone centrale (4) affectée à une détermination biologique, et une zone périphérique (5) circonscrivant ladite zone centrale, présentant des angles exempts de tout site élémentaire.

Description

BIOPUCE PRESENTANT UNE ORGANISATION AMELIOREE
La présente invention concerne les biopuces, et plus particulièrement le mode d'organisation de ses sites de liaison, pour servir d'outils en analyse biologique moléculaire.
Par « biopuce », on entend un ensemble fonctionnel, à usage unique ou non, généralement mis en œuvre aux fins d'une détermination biologique moléculaire, agencé pour et/ou destiné à coopérer avec au moins un appareil ou instrument distinct et complémentaire, et recevant un échantillon d'intérêt, liquide ou fluide, immobile ou en mouvement, suspecté de contenir au moins une espèce cible, en suspension ou en solution, par exemple une biomolécule, éventuellement marquée, et délivrant au moins un signal de sortie en relation avec la présence, et/ou la nature, et/ou la structure, et/ou la quantité de ladite espèce cible. Cette biopuce comprend au moins :
- un support comportant une face utile comprenant une surface opératoire au contact de l'échantillon ; le matériau ou la matière du support est inerte, et non substantiellement conducteur de l'électricité, au moins selon ladite surface opératoire, au sens où ledit matériau n'interagit pratiquement pas avec l'échantillon, et en particulier l'espèce cible, par liaison forte du type liaison chimique covalente, ou par liaison faible, par exemple liaison hydrogène, d'autres interactions de type physique, telles que tension superficielle, n'étant pas par ailleurs exclues ; le matériau constitutif d'un tel support est par exemple du silicium, un verre, ou une matière plastique, par exemple une résine de synthèse thermodurcie ou thermoplastique, par exemple un polypropylène, un polystyrène ou une résine polyacrylamide,
- un réseau ou matrice de sites élémentaires distribués de manière méthodique ou ordonnée sur la surface opératoire, à la manière de pixels, selon au moins deux axes de référence, chaque site élémentaire étant adressé, c'est-à-dire identifié par des coordonnées qui lui sont uniques dans tout repère formé par les axes de références ; ces sites élémentaires sont eux- mêmes traités ou non, en vue de la fixation ou de l'ancrage des ligands, dont il sera question ci-après ; ce traitement peut par exemple consister en un revêtement avec une couche d'un polymère conducteur électronique, par exemple polypyrrole modifié, selon les techniques exposées dans les documents FR 2703359 , WO9422889, EPO 691 978, FR 2 787 582, EP 1 141 391 , et WO 0036145,
- le cas échéant, un ensemble de connexions, ou circuit, par exemple électrique, avec respectivement les différents sites élémentaires, ledit ensemble de connexions étant agencé pour relier individuellement chaque site élémentaire, de manière indépendante par rapport aux autres sites élémentaires, par exemple par adressage (conférer le document FR- A- 2741475), ledit ensemble de connexions est par exemple un circuit électrique multiplexe d'électrodes et contre-électrodes disposées respectivement dans lesdits sites élémentaires ;
- une multiplicité de ligands, ou sondes, identiques attachés ou ancrés, par tous moyens appropriés, dans chaque site élémentaire;
- éventuellement, des moyens formant avec la surface opératoire une cavité de circulation ou séjour de l'échantillon liquide, comportant au moins une entrée et une sortie pour ce dernier ;
- éventuellement, des moyens d'observation, transmission, ou émission du signal ou des signaux de sortie, correspondant à la liaison de l'espèce cible avec les ligands, respectivement en un ou plusieurs sites de liaison ; Cette biopuce peut en outre comprendre, de manière intégrée ou non avec la surface opératoire et ses ligands ou sondes, différents moyens, ramenés à l'échelle de la biopuce, classiquement utilisés en laboratoire, pour :
- obtenir ou préparer l'échantillon d'intérêt, à partir d'un autre échantillon dit de départ, par dénaturation, séparation, concentration, purification, etc. ;
- traiter l'échantillon d'intérêt, par exemple par amplification, et/ou marquage avec un marqueur, avant sa mise en contact avec les ligands ou sondes ;
- traiter le ou les complexes formés entre l'espèce cible et respectivement le ou les ligands, par exemple par marquage, afin d'obtenir, simultanément ou postérieurement à la formation des complexes, respectivement le ou les signaux de sortie.
Lorsque la biopuce, ou « biochip », ou "micro-array", est associée ou comprend en outre ces moyens de laboratoire, dans le secteur technique concerné, on parlera alors de « labopuce » (ou « lab on a chip »). En pareil cas, le support comprend un ensemble de canaux et/ou puits, par exemple réactionnels, reliés entre eux et avec la cavité de circulation ou séjour, ainsi que divers réactifs ou agents de traitement, à l'état sec ou liquide, disposés sur le support en fonction de la circulation et du ou des traitements retenus pour l'échantillon de départ ou l'échantillon d'intérêt. Les dimensions de ces biopuces, par exemple de l'ordre de 1 mm2 à quelques cm2, requièrent normalement pour leur réalisation ou production, la mise en œuvre de techniques dites « micro » ou « nano-technologies », par exemple par lithographie ou micro-usinage.
Mais la Demanderesse n'entend pas être limitée à des dimensions particulières, notamment de l'ordre du μm ou du nm, lorsqu'elle utilise le terme « biopuce » dans la présente description et dans les revendications en annexe, considérant que la même structure ou le même agencement que celui défini ci- après peut être mis en œuvre avec des dimensions de l'ordre de quelques mm2, comme avec des dimensions beaucoup plus importantes. Bien entendu, une biopuce telle que considérée par la présente invention ne peut fonctionner de manière autonome, sauf à embarquer avec elle sa propre source d'énergie. Par conséquent, cette biopuce est agencée pour coopérer, par exemple de façon amovible, d'une part avec des moyens extérieurs permettant de faire circuler ou séjourner, en contact de la surface opératoire et des ligands, l'échantillon liquide d'intérêt, mais aussi d'autres fluides ou liquides.tels que liquide de lavage, et d'autre part avec des moyens de détection et de traitement du ou des signaux de sortie, le tout étant en général contrôlé et commandé, par des moyens électroniques extérieurs, analogiques ou informatiques, par exemple selon toute logique ou organigramme de traitement.
Par « biomolécule », on entend toute entité, en particulier biochimique, ou biologique, identique à ou dérivée de toute espèce moléculaire existant dans la nature. Au rang des biomolécules considérées par la présente invention, on peut citer certains biopolymères, par exemple l'ADN, l'ARN, les oligo et polynucleotides, les protéines fonctionnelles ou structurales, les peptides, les oligo et polypeptides, les polysaccharides, etc.
Par « marquage » ou « marqué », on entend la caractéristique selon laquelle on fixe sur une entité, par exemple l'espèce cible, de manière covalente ou autre, un marqueur, c'est-à-dire un substituant ou reste permettant, avec ou sans l'aide d'un moyen extérieur, tel qu'illumination, avec ou sans étape postérieure, telle que mise en contact avec un substrat, de produire un signal, dit précédemment signal de sortie.
Les marqueurs préférés selon la présente invention sont :
- les haptènes (exemple : la biotine fixant un conjugué streptavidine-phycoérythrine)
- les fluorophores par exemple fluorescéine, cyanine, phycoérythrine - les luminophores : luminol, isoluminol, ABEI (_N-4-amino-butyl-N- ethyl-isoluminol)
- les enzymes : par exemple d'oxydation d'un chromogène ; conférer horse-radish peroxydase, phosphatase alcaline
Par « détermination », on entend l'identification, qualitative et/ou quantitative, la détection, la description (par exemple séquençage), la séparation, ou l'enrichissement de l'espèce cible, pouvant être appelée « analyte » dans le cas d'une identification qualitative et/ou quantitative. Ressortent selon la présente invention de l'expression « détermination », tout séquençage d'une biomolécule du type ADN ou polypeptide.
Le ou les signaux de sortie considérés par la présente invention peuvent avoir toute nature appropriée, en fonction des marqueurs mis en œuvre, et du type de détection requis. Il peut s'agir de signaux lumineux, visibles ou invisibles, électriques, électro-optiques, électrochimiques, etc.... Par ailleurs, ces signaux peuvent le cas échéant être détectés séparément, compte tenu, d'une part de l'adressage des sites élémentaires de la biopuce, et d'autre part de l'ensemble de connexion respectivement avec les différents sites élémentaires, éventuellement présents sur la biopuce.
Par « ligand », on entend toute entité, cellulaire, biologique, ou biomolécule ayant une affinité, spécifique ou non, pour une espèce cible. Affinité exprimant qu'il se forme, dans les conditions (notamment température, pH, force ionique, etc.) de la mise en contact de l'espèce cible avec le ligand, un appariement ou complexe stable entre ladite espèce cible et ledit ligand. A titre d'exemple de ligand, on citera tout oligonucléotide susceptible de se lier par liaisons faibles, on dira dans ce cas de s'hybrider, avec un brin d'ADN (espèce cible), comportant une séquence complémentaire avec celle du ligand. Chaque ligand est attaché ou ancré en chaque site élémentaire de la biopuce, éventuellement après fonctionnalisation de la surface opératoire du support, par tout moyen approprié, par exemple chimique, par liaison covalente, par exemple par l'intermédiaire d'un bras espaceur, ou par adsorption, absorption, etc.
S'agissant de sites élémentaires revêtus comme indiqué précédemment avec un polymère de type polypyrrole modifié ou polythiophène, et électriquement adressés, la fixation des ligands peut être effectuée selon les techniques électrochimiques décrites par les documents FR 2789401 , EP 1 152 821 et WO 0047317, FR2 742 451 , EP 0 868 464 et WO 9722648.
Par espèce cible, on entend toute espèce cellulaire, biologique, ou biochimique, susceptible de se lier par liaison faible à un ou plusieurs ligands.
S'agissant d'une biopuce, en l'état actuel du secteur technique considéré, on peut distinguer deux voies d'obtention de ligands respectivement différents, fixés chacun en nombre multiple respectivement sur les différents sites élémentaires :
- une voie in situ, qui consiste, par une série d'opérations successives, incrémentées, à synthétiser sur la surface opératoire elle-même, les différents ligands, ensemble, motif élémentaire par motif élémentaire, par exemple mer par mer, à partir d'un premier motif fixé en différents sites élémentaires, et ce dans l'ordre des séquences respectivement retenues pour les différents ligands ; à cet égard, on se référera aux documents FR 2703359, EP 0 691 978, W09422889, US 5744305, US 6 015 880, WO 9525116, et EP 0 750 629,
- et une voie ex situ, qui consiste à synthétiser ou obtenir les ligands respectivement différents en dehors de la surface opératoire, et à fixer chacun en nombre multiple les différents ligands dans leurs sites élémentaires respectivement différents, par des méthodes d'impression (avec ou sans contact) ou par activation électrique différenciée, car adressée, desdits sites élémentaires ; conférer les documents FR 2703359, EP 0 691 978 et
WO9422889, WO 0151689, US 6 090 933.
Aujourd'hui, les biopuces sont des outils, simples ou complexes, bien adaptés à toutes sortes d'analyse de biologie moléculaire ; conférer "DNA chips : a new tool for genetic analysis and diagnostics". M.Cuzin. Transfusion clinique et Biologique 2001 ; 8:291-6. "How to make a DNA chip" Mickael C Pirrung. Angew.chem.lnt.ed 2002, 41, 1276, 1289. De manière générale, une biopuce telle que décrite précédemment est disposée au fond d'un puits, par exemple d'une plaque de micro-titration, au sein duquel l'échantillon liquide comprenant l'espèce cible est introduit, séjourne, puis est évacué. La présente invention a pour objet d'organiser la surface opératoire, le réseau des sites élémentaires, et les ligands ou sondes de la biopuce, en sorte de pouvoir, non seulement déterminer une ou plusieurs espèces cibles, mais également contrôler sur le support de la biopuce cette détermination et ses conditions opératoires. En d'autres termes, l'invention a pour objet une biopuce embarquant les moyens permettant de contrôler la détermination biologique effectuée à titre principal avec ladite biopuce.
Par ailleurs, la présente invention a pour objet une biopuce, pour laquelle les signaux de sortie, par exemple de type lumineux, ne sont pas perturbés par l'environnement géométrique de ladite biopuce, quelque soit le site élémentaire considéré.
Une biopuce selon l'invention comprend de manière générale un support dont une face utile comprend une surface opératoire avec un réseau de sites élémentaires disposé sur la surface opératoire et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents.
Selon l'invention, les sites élémentaires sont distribués entre, d'une part une zone centrale affectée à la détermination biologique d'au moins une espèce cible, comprenant des sites élémentaires actifs, comportant chacun en nombre multiples des ligands dits actifs, respectivement différents, intervenant directement dans la détermination biologique, et une zone périphérique (5) circonscrivant au moins en partie la zone centrale, comprenant des sites élémentaires dits de contrôle, comportant le cas échéant des ligands dits de contrôle. Préférentiellement, le contour de la surface opératoire a une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, avec des angles arrondis. Et, à titre d'exemple, à cette fin, les sites élémentaires sont distribués entre une zone centrale dont le contour a une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, et la zone périphérique circonscrivant au moins en partie la zone centrale, dont le contour a généralement la forme d'une ligne brisée, par exemple rectangulaire, ouverte ou fermée, la dite zone périphérique présentant des angles exempts de tous sites élémentaires.
La présente invention est maintenant décrite, par référence au dessin annexé, dans lequel : la figure 1 représente une biopuce selon l'invention, vue de dessus et à échelle agrandie, de manière schématique la figure 2 et la figure 3 représentent les plans de dépôts de ligands ou sondes dans des biopuces à l'identique de la représentation selon figure 1. Conformément à la figure 1 , une biopuce selon l'invention comprend un support (2) dont une face utile (2a), par exemple supérieure, comprend une surface opératoire (3) supportant un réseau de sites élémentaires (Xn), disposés sur la dite surface, et une multiplicité de ligands (non représentés, et par conséquent non référencés numériquement), fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents.
Comme le montre la figure 1 , les sites élémentaires repérés chacun par une lettre (A à Z) et par un chiffre (0 à 13) sont distribués entre, d'une part une zone centrale 4, de forme rectangulaire, correspondant aux rangées A à H et aux colonnes 1 à 12, affectée à une détermination biologique d'au moins une espèce cible, comprenant des sites élémentaires dits actifs, car intervenant directement dans la détermination biologique de l'espèce cible, comprenant chacun en nombre multiple des ligands dits actifs pour les mêmes raisons, respectivement différents, et d'autre part une zone périphérique (5), constituée par les rangées I et Z et les colonnes 0 et 13, circonscrivant au moins en partie la zone centrale (4), comprenant des sites élémentaires dits de contrôle, comprenant le cas échéant des ligands dits de contrôle, au sens où lesdits sites et ligands n'interviennent pas directement dans la détermination biologique de ladite espèce cible, et de manière optionelle un nombre y de sites élémentaires dits d'identification du type de biopuce ainsi réalisé. Comme montré par la Figure 1 , le contour de la surface opératoire
(3) a donc une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, avec des angles arrondis. Et à cette fin, tous les sites élémentaires (Xn), sont distribués entre la zone centrale (4) et la zone périphérique (5), précédemment définie, circonscrivant au moins en partie la zone centrale (4), et dont le contour a généralement la forme d'une ligne brisée par exemple rectangulaire, ouverte ou fermée, cette zone périphérique (5) présentant des angles exempts de tous sites élémentaires.
A titre d'exemples, on décrit ci-après l'obtention, la construction et l'utilisation de biopuces identiques à celle décrite par référence à la figure 1 et à la description précédente. Ces biopuces sont réalisées et obtenues à partir d'un support à base de silicium, selon la technique généralement décrite dans les documents FR2787582, EP1141391 et WO0036145 avec les étapes principales essentielles suivantes :
a) Structuration d'un substrat de manière à obtenir sur ce substrat des microcuvettes comprenant dans leur fond une couche d'un matériau capable d'initier et de promouvoir l'adhésion sur celle-ci d'un film d'un copolymère de pyrrole fonctionnalisé par électropolymérisation, b) Electropolymérisation collective, de manière à former un film électropolymérisé d'un copolymère de pyrrole et de pyrrole fonctionnalisé sur le fond desdites microcuvettes, sur la couche dudit matériau, à partir d'une solution de pyrrole et de pyrrole fonctionnalisé, en présence de réactifs chimiques approprié pour ladite électropolymérisation, c) Fixation directe, ou indirecte, d'une sonde biologique sur le pyrrole fonctionnalisé, par injection d'une solution de la sonde biologique, au choix dans une ou plusieurs microcuvette(s) en présence de réactifs chimiques nécessaires à la fixation directe, ou indirecte, de cette sonde biologique sur le pyrrole fonctionnalisé.
Exemple 1 Modèle biologique pour la mise en évidence des profils différentiels des ARN messagers et leur seuil de détection
Dans le but de mettre en évidence les changements qui s'opèrent au niveau des profils des ARNs messagers au sein d'une unité biologique (par exemple entre deux situations physiologiques différentes), nous avons mis en place un modèle biologique renfermant des gènes dont les niveaux d'expression impliquent trois classes d'ARN messager 1.ARNm très abondant (10 %) ; 2.ARNm moyennement abondant (1%) ; 3. ARNm faiblement abondant (de l'ordre d'une copie ou plus). Nous avons choisi le système de détoxication du cadmium chez la levure (Saccharomyces cerevisiae) comme modèle biologique. En effet, ce système bien documenté renferme dix gènes dont les niveaux d'expression répondent parfaitement à nos critères. Ces dix gènes sont répartis en 5 classes suivant leur réponse à la présence du cadmium :
Classe constitutive : Act1 (1 X), Opi3 (1 X) Classe moyennement induite : Ynl208W, Ydr411C ( = 5 X) Classe fortement induite : Seo1, Gre1 (>30 X) Classe moyennement réprimée : Rps31, Krr1 (≡1/5 X) Classe fortement réprimée : Yef3, YJI200C (≡1/16 X) Tableau 1 : Nombre de copies d'ARNm par cellule correspondant à ces gènes
Figure imgf000010_0001
(D'après la référence Holstege ét al. (1998) Cell 95 :717-728). Les séquences codantes de ces 10 gènes ont été extraites du site web SGD dédié au génome complet de la levure (http://qenome- www.stanford.edu/ Saccharomyces/, Deval A. Lashkavi et al. (1997) PNAS 94 :13057-13062).
Le choix de la levure réside d'une part du fait que c'est un organisme eucaryote ancestral, et d'autre part dans sa proximité organisationnelle du génome avec celui des cellules eucaryotes supérieurs. De plus, il est facile à manipuler et son génome est entièrement séquence (6430 gènes répartis sur 16 chromosomes). Il est aussi bien documenté et largement utilisé comme modèle biologique dans des études de pharmacologie, de toxicologie et d'oncologie.
Culture des levures, extraction des ARNs totaux et marquage des
ADNc
Cette étude a été réalisée en utilisant la souche YPH499 (MAT α ura3-52 his3-Δ200 ade2-101 uaa trpi - Δ 63 Iys2-801 uag Ieu2- Δ 1 ). Les cellules ont été cultivées en milieu liquide YPD contenant 6.7 g/l de base azotée de levure et 5 g/l de sulfate d'ammonium sans acides aminés (Qbiogen, France), 2% glucose, 30 mg/l d'uracil, d'adenine, de lysine, d'histidine, de tryptophane et de leucine. La croissance s'effectue jusqu'au milieu de la phase exponentielle (DO600 = 0.4) à 30 °C, puis les cellules sont exposées à 1 mM CD2+ pendant 1 h (Fauchon et al., 2002), récoltées, lavées deux fois dans 10 ml d'eau stérile et resuspendues dans le tampon S ( Sorbitol, tampon phosphate, et 1 μl de Mercaptoethanol). L'ajout de Zymoliase (100U/mL) dans du tampon S pendant 30 min à 30°C permet la destruction de la paroi cellulaire. L'extraction des ARNs totaux est réalisée à l'aide du TRIAZOL (Abgene®, UK). L'intégrité des ARNs est contrôlée sur gel d'agarose et par spectrophotomètre à 260 et 280 nm.
Les ARNs totaux (environ 20 μg) des échantillons test et référence sont rétro-transcrits en utilisant le kit Superscript II Reverse-Transcription
(Invitrogen Corporation ; Carlsbad-CA) en présence des dNTPs et d'un dNTP- biotin. Les ADNc ainsi marqués sont purifiés sur des filtres Microcon suivant les recommandations du fabriquant (Milipore Corp., Canton, Massa.).
II. Choix de sondes pyrroles
Les sondes ont été choisies à l'aide du logiciel OLIGO 6 qui tient compte de leur affinité, de leur pourcentage de G-C et de leur Tm (température de fusion). Dans un premier temps, ces sondes terminées par un groupement aminé ont été qualifiées sur lame de verre avec des produits PCR et de l'ADNc. Les sondes uniques ainsi retenues sont des 50 mers sur lesquelles a été greffé un spacer de type dT 10 terminé par un groupement pyrrole en position 5'.
III Choix de calibrateurs Les calibrateurs internes C1 (Porphyromonas gingivalis W83), C2
(Arabidopsis Thaliana) et C3 (Plectovirus) ont été choisis suivant les mêmes critères fixés pour les sondes pyrroles de la levure. Ces calibrateurs ainsi que les cibles uniques correspondantes ne possèdent aucune homologie significative avec nos séquences d'intérêt en l'occurrence celles du génome de la levure. Les cibles des calibrateurs C1 , C2 et C3 sont ajoutées dans cet ordre à des concentrations permettant d'obtenir des signaux croissant avec des facteurs de 102.(exp : Signal C3 = (Signal C2)2 = (Signal C1 )4. Ceci permettra d'estimer le nombre de copies cibles présentent dans l'échantillon biologique d'intérêt. IV. Adressage des sondes pyrroles
L'adressage est réalisé à partir des monomères pyrroles dont l'azote est substituée par des oligonucléotides 50 mers synthétisés et contrôlés préalablement. Toutes les sondes seront porteuses en leur extrémité 5' d'un espaceur de type dT10 adjacent au groupement polypyrrole et qui assure une accessibilité maximum. Les 128 microélectrodes sont successivement adressées selon le plan de dépôt décrit dans la présente invention. L'électrocopolymérisation a lieu dans une solution aqueuse contenant un sel inerte : 0,2 M LiCIO4 comme électrolyte et un mélange de pyrrole 20 mM et 1 μM de ODN-pyrrol. L'electropolymérisation s'effectue sous un potentiel de 1 V vs/ECS. Entre chaque dépôt la puce est abondement rincée à l'eau déionisée. A la fin de cette étape la matrice est séchée, stockée sous Argon à 4 °C jusqu'à son utilisation.
V. Hybridation sur puce MICAM
Solution d'hybridation (100 μl) est composée de : 1 μl de cible biotinylée (10 μM) ; 99 μl de tampon d'hybridation (1 ,3% Denhart 5X ; 66,7% Sperme de Saumon ; 31 ,9% du tampon A)
L'hybridation est réalisée comme suit : On dépose 20 μl de la solution d'hybridation sur la puce. La puce est ensuite recouverte d'une lamelle pour une étanchéité maximale. L'incubation se fait pendant 45 minutes à 45°C dans une chambre humide.
Le lavage post-hybridation se fait avec 4 X 25μl du tampon (0,01 M PBS ; 0,534 M NaCI ; 2,7 mM KCI ; 0, 05 % Tween 20). la Streptavidine-Phycoérythrine (0.1mg/ml) est utilisée pendant 10 min à l'obscurité pour la révélation.
Les lavages post-révélation se font dans 4 X 25μl de tampon de lavage.
Tampon A : PBS : 0,02 M ; NaCI
Séquences nucléotidiques des sondes pyrroles et des calibrateurs (le numéro de la sonde correspond à la position de celle-ci sur la séquence codante du gène correspondant).
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000016_0001
Le plan de dépôt des sondes est montré à la figure 2, dans la zone centrale (4) correspondant aux rangées A à H , et aux colonnes 1 à 12. Cette disposition reproduit exactement le format des 96 positions d'une plaque de microtitration. Il conserve l'indexation qui sert de référence à l'homme du métier.
Résultats sur Produits PCR :
Dans un premier temps nous avons vérifié les étapes d'hybridation avec des produits PCR longs de l'ordre de 500 pb. Les signaux résultant sont bien spécifiques entre la sonde et le produit PCR qui la couvre (Fig. 4). La figure 4 montre la spécificité des signaux d'hybridation sur puce Micam® en présence de longs fragments PCR. (fig 4 a : Hybridation ACT 560 Bio (6 ng/μl) fig 4 b : Hybridation Gre 36 Bio (6 ng/μl) fig 4 c : Hybridation Rps 38 Bio (3 ng/μl) + T3 (Plectovirus) (0.5 ng/μl)). Les réponses en % d'étalon sont rangées entre 80 et 100% comme le montre le tableau ci-dessous.
Étalon 1361
Figure imgf000017_0001
Exemple 2
Détection des mutations ponctuelles par mini-séquençage des gènes p53 et K-ras, les plus fréquemment décrites dans les cancers humains colo-rectaux
Ces mutations ponctuelles sont définies dans le tableau ci-après.
Figure imgf000017_0002
ACAS CTTAATGTCA CGCACGATTTCCC
AGAATGCCA
P72S GAGGCTGCTCCCC Humain
GCTGGTGCAG P72AS GGGCCACG Humain
GCACATGACG
175S1 GAGGTTGTGAGG Humain
CAGCACATGAC
175S2 GGAGGTTGTGAGGC Humain
GCTCATGGTGG
175AS1 GGGCAGC Humain
CGCTCATGGTGG
175AS2 GGGCAG Humain
TGCATGGGCGGC
248S1 ATGAAC Humain
GCATGGGCGGCA
248S2 TGAACC Humain
GATGGTGAGGAT
248AS1 GGGCCTCC Humain
GATGATGGTGAG
248AS2 GATGGGCCTC Humain
CTGAATATAAACT
TGTGGTAGTT
12S1 GGAGCT Humain
TGAATATAAACTT
GTGGTAGTTGGA
12S2 GCTG Humain
GGCACTCTTG
12AS1 CCTACGCCAC Humain
AGGCACTCTT
12AS2 GCCTACGCCA Humain 13S1
Figure imgf000018_0001
Humain
Figure imgf000018_0002
Figure imgf000019_0001
L'hybridation est réalisée à 45°C pendant 1 H 30 min dans le tampon d'hybridation MICAM à partir de 15 μl de la fraction aliquote d'un produit de PCR purifié (phosphatase alcaline, exonucléase I) et fragmenté (digestion par une enzyme de restriction).
Dans les tableaux précédents, les sondes sens et anti-sens sont décrites par leurs séquences respectives, et constituent les ligands actifs au sens de la définition générale de l'invention explicitée précédemment. L'espèce cible est quant à elle un fragment génomique d'un patient comprenant les exons d'intérêts des gènes p53 ou Kras.
L'adressage est réalisé à partir des monomères pyrroles dont l'azote est remplacé par des séquences d'oligonucléotides dont la taille est comprise entre 15-30 mers synthétisés préalablement. Toutes les sondes seront porteuses en leur extrémité 5' d'un linker qui suit le groupement polypyrrole assurant ainsi une accessibilité maximum. Les 96 microélectrodes sont successivement adressées selon le plan de dépôt décrit figure 3. L'électrocopolymérisation a lieu dans une solution aqueuse contenant un sel inerte : 0.2M LiCIO4 comme électrolyte et un mélange de pyrrole 20mM et 1 μM de ODN-pyrrol. L'electropolymérisation a lieu à un potentiel de 1 V vs/ECS . Entre chaque dépôt la puce est rincée à l'eau déionisée. A la fin de ce process la matrice est séchée, stockée sous Argon à 4 °C jusqu'à son utilisation.
Le plan de dépôt des sondes sens et anti-sens est montré à la figure 3 , dans la zone centrale (4) correspondant aux rangées A à H , et aux colonnes 1 à 12. Cette disposition reproduit exactement le format des 96 positions d'une plaque de microtitration. Il conserve l'indexation qui sert de référence à l'homme du métier.
Avec un échantillon génomique d'un patient, obtenu par exemple après amplification, le mode opératoire pour la mise en œuvre de la biopuce précédemment décrite, en vue de détecter les mutations précédemment définies, comporte les étapes essentielles suivantes :
L'hybridation est réalisée à 45°C pendant 1 H 30 min dans le tampon d'hybridation MICAM à partir de 15 μl de la fraction aliquote d'un produit de PCR purifié (phosphatase alcaline, exonucléase I) et fragmenté (digestion par une enzyme de restriction).
Le lavage post-hybridation se fait avec 4 X 250μl de PBS.
Dans un volume final de 20μl, l'extension est effectuée pendant 1 H 30 min à 45°C en présence de Thermoséquenase (8U), du tampon de la thermoséquenase, de ddNTP (10μM final) dont un biotinylé. Les lavages post-extension se font pendant 2 X 90 sec avec H2O à
80°C. la Streptavidine-Phycoérythrine (0.1mg/ml) est utilisée pendant 10 min à l'obscurité pour la révélation.
Les lavages post-révélation se font dans 4 X 250μl de tampon de lavage.
Pour ces deux exemple antérieurement, ou En même temps que le dépôt des sondes, ou postérieurement audit dépôt, différents sites élémentaires, appartenant à la zone périphérique (5), sont affectés de manière générale au contrôle de la détermination biologique effectuée par ailleurs dans la zone centrale (4).
A cette fin, dans la zone périphérique (5), dix sites élémentaires (10), correspondant à la rangée I selon figure 1 et aux positions 2 à 11 , sont affectés ensemble à l'identification numérique de la biopuce. A cette fin, chaque site élémentaire (10) d'identification, comprend un marqueur fixé ou lié par l'intermédiaire du pyrrole, susceptible de générer un signal d'identification, par exemple un signal lumineux. La combinaison des signaux d'identification, obtenus lors du traitement de la biopuce, génère un code d'identification en format binaire. Comme montré à titre d'exemple à la figure 3, les sites 7 ; 8 et 11 comportent un marqueurs fixé ou lié par l'intermédiaire du pyrrole (1) , alors que les autres sites de la rangée I n'en comportent pas (0). D'où dans la figure 3 le code 0000011001, ce qui est un codage binaire dont le nombre est 1 x 24 + 1 x 23 + 1 x 2° = 16 + 8 + 1 = 25. Ce nombre est donc caractéristique du plan de dépôt et/ou de l'affectation de la puce à une analyse donnée.
Dans la zone périphérique (5), deux sites élémentaires (11 et 12) dits respectivement de contrôle positif et de contrôle négatif, prédéterminés en positions ( D0 et C0 ) comprennent respectivement un ligand susceptible de se lier avec l'espèce cible, et un ligand non susceptible de se lier avec ladite espèce cible, dans les conditions de contact avec liaison entre l'espèce cible précitée et les autres ligands dans la zone centrale (4). les ligands fixés dans les zones 11 et 12 sont chacun différents des ligands ou sondes présents dans la zone centrale (4).
Cette disposition permet de valider les étapes de préparations de l'échantillon biologique à étudier et/ou l'étape d'hybridation
Dans la zone périphérique (5) deux sites élémentaires 13 et 14, de contrôle qualité, prédéterminé en position (B0 et G0).
Il s'agit de contrôle qualité des différentes étapes de la réalisation de la biopuce. II peut donc s'agir comme dans l'exemple 1 de sites élémentaires de contrôle qualité comprenant un électrolyte qui permet de valider le process de fabrication de la biopuce à savoir si la biopuce est bien potentiellement adressable.
Il peut s'agir de sites élémentaires de contrôle qualité du système de détection, par exemple comprenant un pyrrole - oligonucleotide -biotine sur lequel est susceptible de s'accrocher l'avidine couplée à un marqueur.
Enfin, il peut s'agir de sites élémentaires de contrôle qualité de la préparation de l'échantillon et de l'hybridation. Ces ligands subissent donc le même traitement que l'échantillon à analyser.
Toujours dans la zone périphérique (5), un site élémentaire (15 ), dit non traité , prédéterminé en position ( E0), demeure exempt de tout traitement , et ou un site élémentaire (16 ), dit traité, prédéterminé en position
(F0), demeure libre de tout ligands , par exemple avec une couche d'un polymère conducteur électronique. Cette disposition permet d'apprécier le "bruit de fond" susceptible d'être généré par le support lui-même ou son traitement, en particulier dans les sites élémentaires précédemment définis.
Dans la zone périphérique (5), dix sites élémentaires (17 ) d'étalonnage, prédéterminés en position (toute la rangée Z, des positions
2 à 11), sont affectés ensemble à la mesure quantitative des signaux dits de sortie générés par un des marqueurs fixés ou liés, par l'intermédiaire du pyrrole, sur le support (2).
Ces sites élémentaires d'identification comprennent des quantités respectivement différentes ( de 104 à 109 molécules) d'une ou plusieurs espèces de marqueurs. Cette disposition permet d'établir une calibration de la lecture.
Dans la zone périphérique (5), six sites élémentaires (18 ), dits de calibration, prédéterminés en position (colonne 13, des positions B à G), sont affectés ensemble à la calibration interne de la biopuce. Ces sites élémentaires de calibration comprennent des quantités respectivement différentes (de 104 à 109 molécules) d'une espèce cible « calibrateur », n'ayant aucune homologie avec les cibles d'intérêt. Cette disposition permet d'apprécier la quantité et l'efficacité de l'hybridation. Pour terminer, le support (2) comprend un organe (19 ), dit détrompeur, déposé dans la zone périphérique (5) sur le support (2), qui peut consister en un site élémentaire supplémentaire, et qui permet de repérer en position relative la biopuce (1 ).
Comme le montre la description précédente, dans la zone centrale (4) les sites élémentaires sont au nombre de cent vingt-huit et distribués selon deux axes orthogonaux, à savoir en huit rangées référencées A à H selon un axe, et douze colonnes référencées 2 à 11 , selon un autre axe perpendiculaire.
La zone périphérique (5) comprend quant à elle deux lignes ou rangées référencées Z et I, et deux colonnes référencées 0 et 13, encadrant la zone centrale (4) de forme rectangulaire.

Claims

REVENDICATIONS
1 ) Biopuce (1 ) comprenant un support (2) dont une face utile (2a) comprend une surface opératoire (3) avec un réseau de sites élémentaires (Xn) disposé sur ladite surface opératoire, et une multiplicité de ligands fixés chacun en nombre multiple en des sites élémentaires respectivement différents, caractérisée en ce que les sites élémentaires (Xn) sont distribués entre, d'une part une zone centrale (4) affectée à une détermination biologique d'au moins une espèce cible, comprenant des sites élémentaires dits actifs, comprenant chacun en nombre multiple des ligands dits actifs, respectivement différents, intervenant directement dans la détermination biologique, et une zone périphérique (5) circonscrivant au moins en partie la zone centrale, comprenant des sites élémentaires dits de contrôle, comprenant le cas échéant des ligands dits de contrôle. 2) Biopuce selon la revendication 1 caractérisée en ce que le contour de la surface opératoire(3) a une forme généralement polygonale, par exemple rectangulaire, avec des angles arrondis
3) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que, dans la zone centrale (4), les sites élémentaires, au nombre de X multiplié par n, sont distribués selon deux axes orthogonaux, par exemple en quatre, huit ou seize (X=4, 8, 16) rangées selon un axe, et six, douze ou vingt-quatre colonnes respectivement (n = 6, 12, 24) selon un autre axe
4) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), y sites élémentaires (10) d'identification, prédéterminés en position, sont affectés ensemble à l'identification numérique de ladite biopuce, chaque site élémentaire d'identification comprenant ou non un ligand marqué susceptible de générer un signal d'identification, la combinaison des signaux d'identification présents ou absents respectivement dans les sites élémentaires d'identification générant un code d'identification en format binaire de la biopuce
5) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la zone périphérique (5) comprend deux lignes et deux colonnes, encadrant la zone centrale de forme quadrangulaire
6) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), deux sites élémentaires, (11 , 12) dits respectivement de contrôle positif et de contrôle négatif, prédéterminés en position, comprennent respectivement deux ligands susceptible et non susceptible respectivement de se lier avec une espèce cible, dans les conditions de contact avec liaison entre ladite espèce cible et au moins un autre ligand dans la zone centrale (4) 7) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), un site élémentaire (14) dit non-traité, prédéterminé en position, demeure exempt de tout traitement et/ou de toute électrode, et/ou un site élémentaire (15), dit traité, prédéterminé en position, demeure libre de tout ligand, par exemple revêtement avec un couche d'un polymère conducteur électronique
8) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), z sites élémentaires (17) dits d'étalonnage, prédéterminés en position, sont affectés ensemble à la mesure quantitative du ou des signaux, dits de sortie, générés par un ou des marqueurs fixés ou liés, directement ou indirectement, sur le support (2), lesdits sites élémentaires d'identification comprenant des quantités respectivement différentes d'un même ligand marqué avec le dit marqueur
9) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que, dans la zone périphérique (5), t sites élémentaires (18) dits de calibration, prédéterminés en position, sont affectés ensemble à la calibration interne de ladite biopuce, lesdits sites élémentaires de calibration comprenant des quantités respectivement différentes d'une même espèce cible, en tant que ligand
10) Biopuce selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le support comprend au moins un organe (19), dit détrompeur, disposé dans la zone périphérique (5) sur le support
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