[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2003035082A1 - Medikament zur hemmung der expression eines zielgens - Google Patents

Medikament zur hemmung der expression eines zielgens Download PDF

Info

Publication number
WO2003035082A1
WO2003035082A1 PCT/EP2002/011971 EP0211971W WO03035082A1 WO 2003035082 A1 WO2003035082 A1 WO 2003035082A1 EP 0211971 W EP0211971 W EP 0211971W WO 03035082 A1 WO03035082 A1 WO 03035082A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
dsrna
strand
nucleotides
medicament
use according
Prior art date
Application number
PCT/EP2002/011971
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Limmer
Sylvia Limmer
Roland Kreutzer
Philipp Hadwiger
Original Assignee
Ribopharma Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE10160151A external-priority patent/DE10160151A1/de
Priority claimed from PCT/EP2002/000151 external-priority patent/WO2002055692A2/de
Priority to DE10230996A priority Critical patent/DE10230996A1/de
Priority to DE10230997A priority patent/DE10230997A1/de
Application filed by Ribopharma Ag filed Critical Ribopharma Ag
Priority to PCT/EP2002/011971 priority patent/WO2003035082A1/de
Priority to JP2003538370A priority patent/JP2005506385A/ja
Priority claimed from PCT/EP2002/011968 external-priority patent/WO2003035868A1/de
Publication of WO2003035082A1 publication Critical patent/WO2003035082A1/de
Priority to US10/382,634 priority patent/US20040038921A1/en
Priority to US10/666,458 priority patent/US20040126791A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/50—Methods for regulating/modulating their activity

Definitions

  • the invention relates to a medicament and a use for inhibiting the expression of a target gene.
  • a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell by means of RNA interference is known from DE 101 00 586 C1.
  • An oligoribonucleotide with a double-stranded structure is introduced into the cell.
  • One strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene. It is not known how such an oligoribonucleotide can be used in vivo to inhibit a target gene.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • an effective medicament and a use for inhibiting the expression of a target gene are to be provided.
  • a medicament for inhibiting the expression of a target gene is provided, the medicament being present in at least one administration unit which contains a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) which is suitable for inhibiting the expression of the target gene by means of RNA interference.
  • the dsRNA can be contained in the administration unit in an amount that enables a dosage of at most 5 mg per kg body weight and day.
  • a dsRNA is present when the ribonucleic acid consisting of one or two ribonucleic acid strands has a double-stranded structure. Not all nucleotides of the dsRNA need to have canonical Watson-Crick base pairings.
  • the target gene can be an oncogene, cytokine gene, idiotype protein gene (id protein gene), prion gene, gene for the expression of angiogenesis-inducing molecules, of adhesion molecules and cell surface receptors, of proteins which are involved in metastatic and / or invasive processes are involved, gene from proteinases and apoptosis and cell cycle regulating molecules, gene for expressing the EGF receptor, the multidrug resistance 1 gene (MDRI gene), preferably in pathogenic organisms Plasmodia, expressed gene or a component of a, in particular human pathogenic, virus.
  • id protein gene idiotype protein gene
  • prion gene gene for the expression of angiogenesis-inducing molecules, of adhesion molecules and cell surface receptors, of proteins which are involved in metastatic and / or invasive processes are involved, gene from proteinases and apoptosis and cell cycle regulating molecules, gene for expressing the EGF receptor, the multidrug resistance 1 gene (MDRI gene), preferably in pathogenic organisms
  • the administration unit can be designed for a single administration or intake per day. Then the entire daily dose is contained in one administration unit. If the administration unit is designed for repeated administration or ingestion per day, the dsRNA is contained therein in a correspondingly smaller amount that enables the daily dose to be reached.
  • the administration unit can also be used for a single administration or intake be designed for several days, e.g. B. by releasing the dsRNA over several days. The administration unit then contains a corresponding multiple of the daily dose.
  • the medicament contains the dsRNA in an amount sufficient to inhibit the expression of the target gene in an organism to be treated with it.
  • the drug can also be designed so that several units of the drug together contain the sufficient amount in total. The sufficient amount also depends on the pharmaceutical formulation of the drug.
  • the dsRNA is highly effective in vivo in a mammal or human in the low dosage of at most 5 mg per kg of body weight and day. This is particularly surprising because there are mechanisms in mammals and humans that recognize and break down double-stranded nucleic acids as foreign to the body.
  • the administration unit preferably contains the dsRNA in an amount which enables a dosage of at most 2.5 mg, in particular at most 200 ⁇ g, preferably at most 100 ⁇ g, particularly preferably at most 50 ⁇ g, in particular at most 25 ⁇ g, per kg of body weight and day. It has been shown that the dsRNA has an excellent effectiveness in inhibiting the expression of the target gene even in this even lower dosage.
  • the dsRNA is contained in the medicament in a preparation which, in particular, consists exclusively of a physiologically compatible solvent and the dsRNA dissolved therein.
  • the solvent is generally a buffer. It may contain additives, e.g. B. those that make the buffer physiologically compatible or durable. "Exclusively" means here that there are no substances which cause or mediate the uptake of the dsRNA into the target gene-expressing cells. Such substances are e.g. B. micellar structures, especially liposomes, or capsids. Surprisingly, it has been shown that a dsRNA which is only dissolved and administered in a physiologically compatible solvent is taken up by the cells containing the target gene and inhibits the expression of the target gene.
  • the dsRNA can be enclosed in the medicament by a micellar structure, preferably a liposome, a capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule, or bound to a polymeric nano- or microcapsule.
  • a micellar structure, a capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule can facilitate the uptake of the dsRNA in cells.
  • the dsRNA can be enclosed by a viral natural capsule or an artificial capsid produced by chemical or enzymatic means or a structure derived therefrom.
  • the polymeric nano- or microcapsule consists of at least one biodegradable polymer, for example polybutyl cyanoacrylate.
  • the polymeric nano- or microcapsule can transport and release dsRNA contained in or bound to it in the body.
  • the dsRNA can be administered orally, by inhalation, infusion or injection, in particular intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection.
  • the medicament therefore has a preparation which is suitable for inhalation, oral intake, infusion or injection, in particular for intravenous, intraperitoneal or intratumoral infusion or injection. How such a preparation can be produced is known from pharmacy.
  • a preparation suitable for inhalation, infusion or injection can consist of a physiologically compatible solvent, preferably a physiological saline solution or a physiologically compatible buffer, in particular a phosphate-buffered salt solution, and the dsRNA.
  • a physiologically compatible solvent preferably a physiological saline solution or a physiologically compatible buffer, in particular a phosphate-buffered salt solution, and the dsRNA.
  • a strand S1 of the dsRNA preferably has a region which is at least partially complementary to the target gene and in particular comprises fewer than 25 successive nucleotides.
  • the “target gene” is generally understood to mean the DNA strand of the double-stranded DNA coding for a protein, which is complementary to a DNA strand which serves as a template during transcription, including all the areas transcribed. The target gene is therefore generally the sense strand.
  • the strand S1 can thus be complementary to an RNA transcript formed during the expression of the target gene or its processing product, such as e.g. an mKNA.
  • the target gene can also be part of a viral genome.
  • the viral genome can also be the genome of a (+) strand RNA virus, in particular a hepatitis C virus.
  • the complementary region of the dsRNA can have 19 to 24, preferably 20 to 24, particularly preferably 21 to 23, in particular 22 or 23, nucleotides.
  • a dsRNA with this structure is particularly efficient in inhibiting the target gene.
  • the Strand S1 of the dsRNA can have less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, in particular 23, nucleotides. The number of these nucleotides is also the number of the maximum possible base pairs in the dsRNA. Such a dsRNA is particularly stable intracellularly.
  • dsRNA has a single-stranded overhang formed from 1 to 4, in particular 2 or 3, nucleotides.
  • a dsRNA has a better effectiveness in inhibiting the expression of the target gene at least at one end than a dsRNA without single-stranded overhangs.
  • One end is a region of the dsRNA in which there is a 5 'and a 3' strand end.
  • a dsRNA consisting only of strand S1 accordingly has a loop structure and only one end.
  • a dsRNA formed from the strand S1 and a strand S2 has two ends. One end is formed in each case by one end of strand S1 and one end of strand S2.
  • the single-stranded overhang is preferably located at the 3 'end of the strand S1. This localization of the single-stranded overhang leads to a further increase in the efficiency of the drug.
  • the dsRNA has a single-stranded overhang only at one end, in particular at the end located at the 3 'end of the strand S1.
  • the other end of a double-ended dsRNA is smooth, ie without overhangs. Surprisingly, it has been shown that an overhang at one end of the dsRNA is sufficient to increase the interference effect of the dsRNA, without lowering the stability to the same extent as by two overhangs.
  • a dsRNA with only one overhang has proven to be sufficiently stable and particularly effective both in various cell culture media and in blood, serum and cells. Inhibition of ex pression is particularly effective if the overhang is at the 3 'end of the strand S1. It is therefore sufficient, in particular in the case of a dsRNA with one or two smooth ends, if the administration unit contains the dsRNA in a quantity which comprises a dosage of at most 100 ⁇ g, preferably at most 50 ⁇ g, in particular at most 25 ⁇ g, per day and kg body weight allows.
  • the use of a double-stranded ribonucleic acid in a dosage of at most 5 mg per kg of body weight and day is also provided for inhibiting the expression of a target gene by means of RNA interference in a mammal or human.
  • FIG. 8 shows the GFP expression (FACS analysis) in the blood of the individual animals after treatment with specific (GFP group) and non-specific (control group) dsRNA,
  • the double-stranded oligoribonucleotides used have the following sequences:
  • GFP laboratory mice that express the green fluorescent protein (GFP) in all protein biosynthetic cells, double-stranded RNA (dsRNA) derived from the GFP sequence, or non-specific dsRNA intravenously injected into the tail vein.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • non-specific dsRNA intravenously injected into the tail vein.
  • the nonspecific dsRNA has neither homology to the GFP gene nor to a gene occurring in humans or mice.
  • the animals were sacrificed and GFP expression in tissue sections and in plasma was analyzed.
  • RNA synthesizer type Expedite 8909, Applied Biosystems, Rothstadt, Germany
  • RNA single strands evident from the sequence listing and the RNA single strands complementary to them were synthesized. Then the Purification of the raw synthesis products with the help of HPLC. NucleoPac PA-100, 9x250 mm from Dionex GmbH, Am Woertzbaum 10, 65510 Idstein, Germany, were used as columns; Low salt buffer used: 20 mM Tris, 10 mM NaC10, pH 6.8, 10% acetonitrile; used high salt buffer 20 mM Tris, 400 mM NaC10, pH 6.8, 10% acetonitrile.
  • the flow was 3 ml / minute.
  • the hybridization of the single strands to the double strand was carried out by heating the stoichiometric mixture of the single strands in 10 mM sodium phosphate buffer, pH 6.8, 100 mM NaCl, to 80-90 ° C. and then slowly cooling to room temperature over 6 hours.
  • mice The transgenic laboratory mouse strain TgN (GFPU) 5Nagy (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) was used, the GFP (with a beta-actin promoter and a CMV intermediate early enhancer) in all cells examined so far expressed (Hadjantonakis AK et al., 1993, Mech. Dev. 76: 79-90; Hadjantonakis AK et al., 1998 Nature Genetics 19: 220-222). GFP-transgenic mice can be clearly differentiated from the corresponding wild types (WT) based on the fluorescence (with a UV hand lamp). GFP-heterozygous animals were used for the experiments. These were bred by mating a corresponding WT animal with a heterozygous GFP-type animal.
  • WT wild types
  • the test was carried out in accordance with the German animal welfare regulations.
  • the animals were kept under controlled environmental conditions in groups of 3-5 animals in type III macro-lon cages from Ehret, Emmendingen, Germany at a constant temperature of 22 ° C. and a light-dark rhythm of 12 hours , Soft wood granulate 8/15 from Altromin, Germany was used as the litter.
  • the animals received tap water and standard Altromin 1324 pelletized from Altromin ad libidum.
  • the heterozygous GFP animals were kept in groups of 3 animals in cages as described above.
  • the injections of the dsRNA solution made intravenously (iv) into the tail vein in 12-hour cycle (between 5 and 30 7 00 17 30 as well as between 19 and 00 hours) for 5 days.
  • the injection volume was 60 ⁇ l per 10 g body weight and the dose was 2.5 mg dsRNA or 50 ⁇ g per kg body weight.
  • the division into the groups was as follows:
  • Group A PBS (phosphate buffered saline) each 60 ⁇ l per 10 g body weight
  • Group C 2.5 mg per kg of body weight of a further non-specific control dsRNA (K3 control with 2-nucleotide (nt) overhangs at both 3 'ends and a double-stranded region of 19 nucleotide pairs),
  • Group D 2.5 mg per kg of body weight dsRNA (specifically directed against GFP, hereinafter referred to as S1, with smooth ends and a double-stranded region of 22 nucleotide pairs),
  • Group E 2.5 mg dsRNA per kg body weight (specifically directed against GFP, hereinafter referred to as S7, with 2nt overhangs at the 3 'ends of both strands and a double strand region of 19 nucleotide pairs)
  • Group F 50 ⁇ g Sl-dsRNA per kg body weight (i.e. 1/50 of the dose of group D).
  • Organ removal Immediately after the animals were killed by CO inhalation, blood and various organs were removed (thymus, lungs, heart, spleen, stomach, intestine, pancreas, brain, kidney and liver). The organs were rinsed briefly in cold, sterile PBS and divided with a sterile scalpel.
  • the blood was kept on ice for 30 min immediately after removal, mixed, centrifuged for 5 min at 2000 revolutions per minute (Mini spin, Eppendorf AG, Barkhausenweg 1, 22331 Hamburg, Germany), the supernatant was removed and at -80 ° C stored (referred to here as plasma).
  • tissue pieces were dehydrated in an ascending alcohol series at RT (room temperature): 40% each 40% 70% methanol, 80% methanol, 2 x 96%
  • Immunoperoxidase staining against GFP The sections were deparaffinized 3 x 5 min in xylene, rehydrated in a descending alcohol series (3 x 3 min 100% ethanol, 2 x 2 min 95% ethanol) and then 20 min in 3% H 2 0 2 / Incubated methanol to block endogenous peroxidases. All of the incubation steps were subsequently carried out in a moist chamber. After washing 3 ⁇ 3 min with PBS, the first antibody (goat anti-GFP antibody, sc-5384, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Bergheimer Str. 89-2, 69115 Heidelberg, Germany) was 1: 500 in 1% Incubated BSA / PBS overnight at 4 ° C.
  • isolation buffer 50 M HEPES, pH 7.5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 2.5 mM EGTA; 10% glycerol; 0.1% Tween; 1 mM DTT; 10 mM ⁇ -glycerol phosphate; 1 mM NaF; 0.1 M Na 3 V0 4 with a protease inhibitor tablet "Co plete” from Röche Diagnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim) and homogenized 2 x 30 seconds with an Ultraturrax (DIAX 900, dispersing tool 6G, HEIDOLPH Instruments GmbH & Co.
  • DIAX 900 dispersing tool 6G, HEIDOLPH Instruments GmbH & Co.
  • SDS gel electrophoresis The proteins were electrophoretically separated in a multigel-long electrophoresis chamber from Whatman Biometra GmbH, Rudolf-Wissell-Str. 30, 37079 Göttingen, Germany using a denaturing, discontinuous 15% SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) according to Lä mli (Na ture 277: 680-685, 1970).
  • a separating gel with a thickness of 1.5 mm was first poured: 7.5 ml of acrylamide / bisacrylamide (30%, 0.9%), 3.8 ml of 1.5 M Tris / HCl, pH 8.4, 150 ⁇ l 10 % SDS, 3.3 ml double-distilled water, 250 ⁇ l ammonium persulfate (10%), 9 ⁇ l TE-MED (N, N, N ', N' -tetramethylenediamine) and covered with 0.1% SDS until polymerisation , The collecting gel was then poured: 0.83 ⁇ l acrylamide / bisacrylamide (30% / 0.9%), 630 ⁇ l 1 M Tris / HCl, pH 6.8, 3.4 ml double-distilled water, 50 ⁇ l 10% SDS, 50 ul 10% ammonium persulfate, 5 ul TEMED.
  • the proteins were mixed with an appropriate amount of 4-fold sample buffer (200 mM Tris, pH 6.8, 4% SDS, 100 mM DTT (dithiotreithol), 0.02% bromophenol blue, 20% glycerol) , denatured for 5 min in the heating block at 100 ° C, centrifuged briefly after cooling on ice and applied to the gel.
  • the same amounts of plasma or protein were used per lane (3 ⁇ l plasma or 25 ⁇ g total protein).
  • the electrophoresis was water-cooled at RT and constant 50 V.
  • the protein gel marker Kaleidoscope Prestained Standard became the length standard
  • both the gels after blotting and the blot branches after immunodetection were analyzed with Coomassie (0.1% Coomassie G250, 45% methanol, 10% ice cream). sig) colored.
  • Coomassie 0.1% Coomassie G250, 45% methanol, 10% ice cream.
  • sig colored.
  • the blot membrane was incubated for 1 h at RT after the transfer in 1% skim milk powder / PBS. The mixture was then washed three times for 3 min with 0.1% Tween-20 / PBS. All subsequent antibody incubations and washing steps were carried out in 0.1% Tween-20 / PBS.
  • FIG. 1 shows the inhibition of GFP expression in kidney sections
  • FIG. 2 in cardiac tissue and FIG. 3 in pancreatic tissue.
  • 4 to 6 Western blot analyzes of GFP expression in plasma and tissues are shown.
  • 4 shows the inhibition of GFP expression in plasma
  • FIG. 5 in the kidney
  • 6 shows total protein isolates from different animals. The same total protein amounts per lane were found in each case applied.
  • animals to which unspecific control dsRNA was administered (animals in groups B and C)
  • GFP expression was not reduced compared to animals which did not receive any dsRNA.
  • the percentage of GFP-positive lymphocytes in the blood was determined by means of FACS analysis (fluorescence activated cell sorting) after the end of the test, and the GFP expression in the whole blood was examined by Western blot analysis ,
  • GFP experimental animals with 2 to 3 animals each were kept in groups in cages as described above.
  • the injections were made in vaccination cages without anesthesia once a day, in the morning, intravenously (IV) into the tail vein over a period of 21 days.
  • the injection volume was 60 ⁇ l per 10 g body weight and the dose was 25 ⁇ g dsRNA (GFP-specific dsRNA) or 250 ⁇ g dsRNA (non-specific control dsRNA K4) per kg body weight.
  • the experimental animals were divided into two groups:
  • the GFP group consisted of 7 animals that received 25 ⁇ g / kg body weight of the GFP-specific dsRNA S7 / S11.
  • the control group consisting of 6 animals, received the non-specific control dsRNA K4 in a concentration of 250 ⁇ g / kg body weight.
  • the animals were sacrificed exactly 24 hours later, on day 22, with C0 2 , the brook space was opened and blood was immediately withdrawn by means of a heart puncture with a cannula. Approximately 100 ⁇ l whole blood was snap frozen in liquid nitrogen without further treatment for Western blot analysis. Most of the blood was mixed 1: 1 with 100 mM sodium citrate to inhibit blood coagulation, mixed gently, and kept in the dark at RT until FACS analysis.
  • an erythrolysis was carried out, which was automated using the Immunoprep Reagent Kit from Beckman Coulter GmbH - Diagnostics, Siemenstrasse 1, D-85716, Unterschleissheim, Germany on the Coulter® Q-Prep TM (from Beckman Coulter GmbH) according to the manufacturer's protocol.
  • 100 ⁇ l of the blood mixed with sodium citrate which were pipetted into a 5 ml FACS tube with a round bottom, were used.
  • the GFP-expressing cells were determined on the flow cytometer Coulter® EPICS XL TM from Beckman Coulter GmbH.
  • CD4 (Clone GK1.5) as a marker for natural killer T cells
  • CD8a (Clone 53-6.7) as a marker for cytotoxic T cells. All antibodies were obtained from BD Biosciences, Tullastrasse 8-12, 69126 Heidelberg, Germany. The staining with the corresponding antibodies was carried out before the erythrolysis described above. For this purpose, 10 ⁇ l antibodies were placed in 5 ml FACS tubes and 100 ⁇ l blood pipetted in, incubated darkened at RT for 30 min, and a 2-color fluorescence measurement was carried out after erythrolysis (excitation wavelength: 488 nm). As a control, the blood of two completely untreated GFP animals was also analyzed. The values of the percentage GFP expression for each individual animal thus result from the mean value of 6 individual measurements (a 1-color fluorescence measurement without staining and 5 2-color fluorescence measurements with antibody staining).
  • the electrophoretic separation was carried out in a multi-long electrophoresis chamber from Biometra with a denaturing, discontinuous 15% SDS-PAGE (polyacrylamide
  • the collecting gel was then poured: 0.83 ⁇ l acrylamide / bisacrylamide (30% / 0.9%), 630 ⁇ l 1 M Tris / HCl, pH 6.8, 3.4 ml double-distilled water, 50 ⁇ l 10% SDS, 50 ul 10% ammonium persulfate, 5 ul TEMED.
  • the whole blood was disrupted using ultrasound, with an appropriate amount of 4-fold sample buffer (200 M Tris, pH 6.8, 4% SDS, 100 mM DTT (dithiotreithol), 0.02% bromophenol blue, 20 % Glycerin) sets, denatured for 5 min in a heating block at 100 ° C, centrifuged briefly after cooling on ice and applied to the gel. 2 ⁇ l whole blood were used per lane. The run was water-cooled at RT and a constant electrical voltage of 50 V. The protein gel marker Kaleidoscope Prestained Standard from Bio-Rad was used as the length standard.
  • 4-fold sample buffer 200 M Tris, pH 6.8, 4% SDS, 100 mM DTT (dithiotreithol), 0.02% bromophenol blue, 20 % Glycerin
  • both the gels after blotting and the blot membranes after immunodetection were stained with Coomassie (0.1% Coomassie G250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid).
  • Coomassie 0.1% Coomassie G250, 45% methanol, 10% glacial acetic acid.
  • the blot membrane was incubated for 1 h at RT after transfer in 1% lean milk powder / PBS. Then it was washed three times each for 3 min with 0.1% Tween-20 / PBS. All subsequent antibody incubations and washing steps were carried out in 0.1% Tween-20 / PBS.
  • FIG. 7 corresponds to the mean values of the values shown in FIG. 8.
  • the application of 25 ⁇ g GFP-specific dsRNA per kg body weight and day in the GFP group thus resulted in a significant and specific compared to the control group, which received 250 ⁇ g of an unspecific control dsRNA per kg body weight and day during the experiment Reduction of GFP expression.
  • the dsRNA concentrations were significantly lower than those used in the first in vivo experiment.
  • the injections were carried out over a period of 10 hours over a period of 10 days, resulting in a total daily dose of 5 mg dsRNA per kg body weight.
  • the total daily dose in the second in vivo test described here was 25 ⁇ g dsRNA per kg body weight (the injections were made once a day for 21 days). This total daily dose is reduced 200-fold compared to the first in vivo experiment.
  • the total dose of dsRNA per kg body weight over the entire test period was 50 mg per kg body weight (2.5 mg / kg body weight x 20 injections) in the first in vivo experiment and 0.525 mg per kg body weight in the second in vivo experiment (25 ⁇ g / kg body weight x 21 injections). This corresponds to an approximately 95-fold lower amount of dsRNA. However, the reduction in GFP expression in the blood is comparable in both studies.
  • FIG. 9 shows that the application of the dsRNAs mentioned leads to no change in the blood composition over a period of 21 days.
  • the reduction in GFP expression in the group treated with GFP-specific dsRNA is therefore not due to a reduction in GFP-expressing blood cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Medikament zur Hemmung der Expression eines Zielgens, wobei das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vorliegt, welche eine mittels RNA-Interferenz zur Hemmung der Expression des Zielgens geeignete doppelsträngige Ribonukleinsäure in einer Menge enthält, welche eine Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht.

Description

Medikament zur Hemmung der Expression eines Zielgens
Die Erfindung betrifft ein Medikament und eine Verwendung zur Hemmung der Expression eines Zielgens.
Aus Jansen, B. et al . , The Lancet, Vol. 356, 2000, S. 1728 bis 1733 ist es bekannt, Antisinn-Oligonukleotide in Dosierungen von 0,6 bis 6,5 mg/kg und Tag Patienten zu verabrei- chen. Eine Dosierung von 0,6 mg/kg und Tag führte zu keiner Verminderung der Konzentration des von dem Zielgen kodierten Proteins. Als biologisch relevant wird eine dauerhafte Plasmakonzentration von über 1 mg/1 erachtet. Dies kann durch eine Dosierung des Antisinn-Oligonukleotids von etwa 2 mg/kg Körpergewicht und Tag erreicht werden. Die Therapie ist nur bei einem Teil der Patienten erfolgreich.
Aus der DE 101 00 586 Cl ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle mittels RNA- Interferenz bekannt. Dabei wird ein Oligoribonukleotid mit doppelsträngiger Struktur in die Zelle eingeführt. Ein Strang der doppelsträngigen Struktur ist dabei komplementär zum Zielgen. Es ist nicht bekannt, wie ein solches Oligoribonukleotid in vivo zur Hemmung eines Zielgens eingesetzt werden kann .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein wirksames Medikament und eine Verwendung zur Hemmung der Ex- pression eines Zielgens bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 16 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 15 und 17 bis 30.
BESTATIGUNGSKOPIE Erfindungsgemäß ist ein Medikament zur Hemmung der Expression eines Zielgens vorgesehen, wobei das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vorliegt, welche eine zur Hemmung der Expression des Zielgens mittels RNA-Interferenz geeignete doppelstrangige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält. Die dsRNA kann dabei in der Verabreichungseinheit in einer Menge enthalten sein, welche eine Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht. Eine dsRNA liegt vor, wenn die aus einem oder zwei Ribonukleinsäure-Strängen bestehende Ribonukleinsäure eine doppelstrangige Struktur aufweist. Nicht alle Nukleotide der dsRNA müssen kanonische Watson- Crick-Basenpaarungen aufweisen. Insbesondere einzelne nicht komplementäre Basenpaare beeinträchtigen die Wirksamkeit kaum oder gar nicht. Die maximal mögliche Zahl der Basenpaare ist die Zahl der Nukleotide in dem kürzesten in der dsRNA enthaltenen Strang. Das Zielgen kann ein Onkogen, Cytokin-Gen, Idiotyp-Protein-Gen (Id-Protein-Gen) , Priongen, Gen zur Expression von Angiogenese induzierenden Molekülen, von Adhäsions-Molekülen und Zelloberflächenrezeptoren, Gen von Protei- nen, die an metastasierenden und/oder invasiven Prozessen beteiligt sind, Gen von Proteinasen sowie Apoptose- und Zellzy- klus-regulierenden Molekülen, Gen zur Expression des EGF-Re- zeptors, das Multidrug-Resistance 1-Gen (MDRl-Gen) , ein in pathogenen Organismen, vorzugsweise Plasmodien, exprimiertes Gen oder ein Bestandteil eines, insbesondere humanpathogenen, Virus sein.
Die Verabreichungseinheit kann für eine einmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert sein. Dann ist die ge- samte Tagesdosis in einer Verabreichungseinheit enthalten. Ist die Verabreichungseinheit für eine mehrmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert, so ist die dsRNA darin in einer entsprechend geringeren das Erreichen der Tagesdosis ermöglichenden Menge enthalten. Die Verabreichungsein- heit kann auch für eine einzige Verabreichung bzw. Einnahme für mehrere Tage konzipiert sein, z. B. indem die dsRNA über mehrere Tage freigesetzt wird. Die Verabreichungseinheit enthält dann ein entsprechend Mehrfaches der Tagesdosis.
Das Medikament enthält die dsRNA in einer zur Hemmung der Expression des Zielgens in einem damit zu behandelnden Organismus ausreichenden Menge. Das Medikament kann auch so konzipiert sein, dass mehrere Einheiten des Medikaments zusammen die ausreichende Menge in der Summe enthalten. Die ausrei- chende Menge hängt auch von der pharmazeutischen Formulierung des Medikaments ab.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die dsRNA in vivo in der niedrigen Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körper- gewicht und Tag in einem Säugetier oder Menschen hochwirksam ist. Das ist insbesondere auch deshalb überraschend, weil es in Säugetieren und Menschen Mechanismen gibt, welche doppelstrangige Nukleinsäuren als körperfremd erkennen und abbauen.
Vorzugsweise enthält die Verabreichungseinheit die dsRNA in einer Menge, welche eine Dosierung von höchstens 2,5 mg, insbesondere höchstens 200 μg, bevorzugt höchstens 100 μg, besonders bevorzugt höchstens 50 μg , insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht. Es hat es sich nämlich gezeigt, dass die dsRNA sogar in dieser noch niedrigeren Dosierung eine ausgezeichnete Effektivität in der Hemmung der Expression des Zielgens aufweist.
Bei einer Ausgestaltung ist die dsRNA in dem Medikament in einer Zubereitung enthalten, welche, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel und der darin gelösten dsRNA besteht. Bei dem Lösungsmittel handelt es sich im Allgemeinen um einen Puffer. Darin können Zusätze enthalten sein, z. B. solche, welche den Puffer physio- logisch verträglicher oder haltbar machen. "Ausschließlich" bedeutet hier, dass keine Stoffe enthalten sind, welche die Aufnahme der dsRNA in das Zielgen exprimierende Zellen bewirken oder vermitteln. Solche Stoffe sind z. B. micellare Strukturen, insbesondere Liposomen, oder Kapside. Überra- schenderweise hat sich gezeigt, dass eine lediglich in einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel gelöste und verabreichte dsRNA von das Zielgen enthaltenen Zellen aufgenommen wird und die Expression des Zielgens hemmt. Obwohl es in der Zellkultur erforderlich ist, dsRNA durch Mikroinjektion, Li- pofektion, Viren, Viroide, Kapside, Kapsoide oder sonstige Hilfsmittel in die Zellen einzuschleusen, ist das in vivo überraschenderweise nicht erforderlich. Das Medikament kann auch ausschließlich aus der genannten Zubereitung bestehen. Ein solches Medikament ist dann beispielsweise zu intravenö- sen Applikationen geeignet.
Bevorzugt ist das Lösungsmittel eine physiologische Kochsalzlösung oder ein physiologisch verträglicher Puffer, insbesondere eine phosphatgepufferte Salzlösung.
Die dsRNA kann in dem Medikament von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegen. Eine micellare Struktur, ein Kapsid, ein Kapsoid oder eine polymere Nano- oder Mikrokapsel kann die Aufnahme der dsRNA in Zellen erleichtern. Die dsRNA kann von einem viralen natürlichen oder einem auf chemischem oder enzymatischem Wege hergestellten künstlichen Kapsid oder einer davon abgeleite- ten Struktur eingeschlossen sein. Die polymere Nano- oder Mikrokapsel besteht aus mindestens einem biologisch abbaubaren Polymer, z.B. Polybutylcyanoacrylat . Die polymere Nano- oder Mikrokapsel kann darin enthaltene oder daran gebundene dsRNA im Körper transportieren und freisetzen. Die dsRNA kann oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbesondere intravenöser, intraperitonealer oder in- tratumoraler Infusion oder Injektion, verabreicht werden. Bei einer Ausgestaltung weist das Medikament daher eine Zuberei- tung auf, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist. Wie eine solche Zubereitung hergestellt werden kann, ist aus der Pharmazie bekannt. Eine zur Inhalation, Infusion oder In- jektion geeignete Zubereitung kann im einfachsten Fall aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA bestehen.
Vorzugsweise weist ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen zumindest abschnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich auf. Unter dem "Zielgen" wird im Allgemeinen der DNA- Strang der doppeisträngigen für ein Protein kodierenden DNA verstanden, welcher komplementär zu einem bei der Transkription als Matrize dienenden DNA-Strang einschließlich aller transkribierten Bereiche ist. Bei dem Zielgen handelt es sich also im Allgemeinen um den Sinn-Strang. Der Strang Sl kann somit komplementär zu einem bei der Expression des Zielgens gebildeten RNA-Transkript oder dessen Prozessierungsprodukt, wie z.B. einer mKNA, sein. Bei dem Zielgen kann es sich aber auch um einen Teil eines viralen Genoms handeln. Das virale Genom kann auch das Genom eines (+) -Strang-RNA-Virus, insbe- sondere eines Hepatitis C-Virus, sein.
Der komplementäre Bereich der dsRNA kann 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweisen. Eine dsRNA mit dieser Struktur ist besonders effizient in der Inhibition des Zielgens. Der Strang Sl der dsRNA kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweisen. Die Zahl dieser Nukleotide ist zugleich die Zahl der in der dsRNA maximal möglichen Basenpaare. Eine solche dsRNA ist intrazellulär besonders beständig.
Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf- weist. Eine solche dsRNA weist gegenüber einer dsRNA ohne einzelsträngige Überhänge an mindestens einem Ende eine bessere Wirksamkeit bei der Hemmung der Expression des Zielgens auf. Ein Ende ist dabei ein Bereich der dsRNA, in welchem ein 5'- und ein 3 ' -Strangende vorliegen. Eine nur aus dem Strang Sl bestehende dsRNA weist demnach eine Schleifenstruktur und nur ein Ende auf . Eine aus dem Strang Sl und einem Strang S2 gebildete dsRNA weist zwei Enden auf. Ein Ende wird dabei jeweils von einem auf dem Strang Sl und einem auf dem Strang S2 liegenden Strangende gebildet.
Vorzugsweise befindet sich der einzelsträngige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl . Diese Lokalisation des einzelsträngigen Überhangs führt zu einer weiteren Steigerung der Effizienz des Medikaments. In einem Ausführungsbeispiel weist die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang auf. Das andere Ende ist bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d.h. ohne Überhänge, ausgebildet. Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass zur Verstärkung der Interferenz- Wirkung der dsRNA ein Überhang an einem Ende der dsRNA ausreichend ist, ohne dabei die Stabilität in einem solchen Maße zu erniedrigen wie durch zwei Überhänge. Eine dsRNA mit nur einem Überhang hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blut, Serum und Zellen als hinreichend be- ständig und besonders Wirksam erwiesen. Die Hemmung der Ex- pression ist besonders effektiv, wenn sich der Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet. Es ist daher insbesondere bei einer dsRNA mit einem oder zwei glatten Ende/n ausreichend, wenn die Verabreichungseinheit die dsRNA in einer Men- ge enthält, welche eine Dosierung von höchstens 100 μg, bevorzugt höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro Tag und kg Körpergewicht ermöglicht.
Vorzugsweise weist die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 auf, d.h. sie ist aus zwei Einzelsträngen gebildet. Besonders wirksam ist das Medikament, wenn der Strang Sl (Anti- sinn-Strang) eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Über- hang aufweist. Das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA ist dabei glatt ausgebildet. Der Strang Sl kann zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär sein.
Erfindungsgemäß ist weiterhin die Verwendung einer doppel- strängigen Ribonukleinsäure in einer Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht und Tag zur Hemmung der Expression eines Zielgens mittels RNA-Interferenz in einem Säugetier oder Menschen vorgesehen.
Wegen der vorteilhaften Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendung wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnungen beispielhaft erläutert. Als Abkürzung der Konzentrationsangabe "mol/1" wird dabei "M" verwendet. Es zeigen:
Fig. 1 GFP-spezifische Immunoperoxidase-Färbung an Nieren- Paraffinschnitten transgener GFP-Mäuse, Fig. 2 GFP-spezifische Immunoperoxidase-Färbung an Herz- Paraffinschnitten transgener GFP-Mäuse,
Fig. 3 GFP-spezifische Immunoperoxidase-Färbung an Pankre- as-Paraffinschnitten transgener GFP-Mäuse,
Fig. 4 Western-Blot-Analyse der GFP-Expression im Plasma,
Fig. 5 Western-Blot-Analyse der GFP-Expression in der Niere,
Fig. 6 Western-Blot-Analyse der GFP-Expression im Herz,
Fig. 7 Prozentuale GFP-Expression (FACS-Analyse) im Blut GFP-transgener Mäuse nach Behandlung mit spezifischer (GFP-Gruppe) und unspezifischer (Kontrollgruppe) dsRNA,
Fig. 8 Darstellung der GFP-Expression (FACS-Analyse) im Blut der Einzeltiere nach Behandlung mit spezifischer (GFP-Gruppe) und unspezifischer (Kontrollgruppe) dsRNA,
Fig. 9 Auswertung einer FACS-Analyse der exprimierten
Oberflächenmarker-Proteine CDllb, CD3 , CD4, CD8a und CD19 und
Fig. 10 Western Blot-Analyse der GFP-Expression im Blut der mit spezifischer dsRNA behandelten Tiere 4-7 (GFP-
Gruppe, 4 Spuren links) und der mit unspezifischer dsRNA behandelten Tiere 3-6 (Kontrollgruppe, 4 Spuren rechts) . Die eingesetzten doppelsträngigen Oligoribonukleotide weisen folgende Sequenzen auf :
Figure imgf000010_0001
Es wurde "GFP-Labormäusen" , die das Grün-fluoreszierende Protein (GFP) in allen Proteinbiosynthese betreibenden Zellen exprimieren, doppelstrangige RNA (dsRNA) , die aus der GFP- Sequenz abgeleitet wurde, bzw. unspezifische dsRNA intravenös in die Schwanzvene injiziert. Die unspezifische dsRNA hat weder zum GFP-Gen noch zu einem im Menschen oder der Maus vorkommenden Gen eine Homologie. Am Versuchsende wurden die Tiere getötet und die GFP-Expression in Gewebeschnitten und im Plasma analysiert.
Versuchsprotokoll :
Synthese der dsRNA:
Mittels eines RNA-Synthesizers (Typ Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) und herkömmlicher chemischer Verfahren wurden die aus dem Sequenzprotokoll ersichtlichen RNA-Einzelstränge und die zu ihnen komplementären RNA-Einzelstränge synthetisiert. Anschließend erfolgte die Reinigung der rohen Syntheseprodukte mit Hilfe der HPLC. Als Säulen wurden NucleoPac PA-100, 9x250 mm der Fa. Dionex GmbH, Am Wörtzgarten 10, 65510 Idstein, Deutschland, verwendet; eingesetzter Niedrigsalz-Puffer: 20 mM Tris, 10 mM NaC10 , pH 6,8, 10% Acetonitril; eingesetzter Hochsalz-Puffer 20 mM Tris, 400 mM NaC10 , pH 6,8, 10% Acetonitril. Der Fluss betrug 3 ml/Minute. Die Hybridisierung der Einzelstränge zum Doppelstrang erfolgte durch Erhitzen des stöchio etrischen Gemischs der Einzelstränge in 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, 100 mM NaCl, auf 80-90°C und nachfolgendes langsames Abkühlen über 6 Stunden auf Raumtemperatur.
Versuchstierhaltung und Versuchsdurchführung: Es wurde der transgene Labormausstamm TgN (GFPU) 5Nagy (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA) verwendet, der GFP (mit einem beta-Aktin-Promotor und einem CMV intermediate early enhancer) in allen bisher untersuchten Zellen expri- miert (Hadjantonakis AK et al . , 1993, Mech. Dev. 76: 79-90; Hadjantonakis AK et al . , 1998 Nature Genetics 19: 220-222). GFP-transgene Mäuse lassen sich eindeutig anhand der Fluoreszenz (mit einer UV-Handlampe) von den entsprechenden Wildtypen (WT) unterscheiden. Für die Versuche wurden GFP-hetero- zygote Tiere verwendet. Diese wurden gezüchtet, indem jeweils ein entsprechendes WT-Tier mit einem heterozygoten GFP-Typ- Tier verpaart wurde.
Die Versuchsdurchführung erfolgte gemäß den deutschen Tier- schutzbeStimmungen. Die Tiere wurden unter kontrollierten Um- weltbedingungen in Gruppen von 3-5 Tieren in Typ III Makro- lon-Käfigen der Fa. Ehret, Emmendingen, Deutschland bei einer konstanten Temperatur von 22°C und einem Hell-Dunkel-Rhythmus von 12 h gehalten. Als Sägemehleinstreu wurde Weichholzgranu- lat 8/15 der Fa. Altromin, Lage, Deutschland verwendet. Die Tiere erhielten Leitungswasser und Standardfutter Altromin 1324 pelletiert der Fa. Altromin ad libidum. Erster in vivo-Versuch:
Für die Versuchsdurchführung wurden die heterozygoten GFP- Tiere zu je 3 Tieren gruppenweise in Käfigen wie oben beschrieben gehalten. Die Injektionen der dsRNA-Lösung erfolgten intravenös (i.v.) in die Schwanzvene im 12 h-Turnus (zwischen 530 und 700 sowie zwischen 1730 und 1900 Uhr) über 5 Tage hinweg. Das Injektionsvolumen betrug 60 μl pro 10 g Körpergewicht und die Dosis betrug 2,5 mg dsRNA bzw. 50 μg pro kg Körpergewicht. Die Einteilung in die Gruppen war wie folgt:
Gruppe A: PBS (phosphate buffered saline) je 60 μl pro 10 g Körpergewicht,
Gruppe B : 2,5 mg pro kg Körpergewicht einer unspezifischen Kontroll-dsRNA (Kl-Kontrolle mit glatten Enden und einem Doppelstrangbereich von 22 Nu- kleotidpaaren) ,
Gruppe C: 2,5 mg pro kg Körpergewicht einer weiteren unspezifischen Kontroll-dsRNA (K3-Kontrolle mit 2-Nukleotid(nt) -Überhängen an beiden 3 ' -Enden und einem Doppelstrangbereich von 19 Nukleo- tidpaaren) ,
Gruppe D: 2 , 5 mg pro kg Körpergewicht dsRNA (spezifisch gegen GFP gerichtet, im Weiteren als Sl bezeichnet, mit glatten Enden und einem Doppelstrangbereich von 22 Nukleotidpaaren) ,
Gruppe E : 2,5 mg dsRNA pro kg Körpergewicht (spezifisch gegen GFP gerichtet, im Weiteren als S7 bezeichnet, mit 2nt-Überhängen an den 3 ' -Enden beider Stränge und einem Doppelstrangbereich von 19 Nukleotidpaaren) Gruppe F: 50 μg Sl-dsRNA pro kg Körpergewicht (also 1/50 der Dosis der Gruppe D) .
Nach der letzten Injektion von insgesamt 10 Injektionen wurden die Tiere nach 14-20 h getötet und Organe und Blut wie beschrieben entnommen.
Organentnahme : Sofort nach dem Töten der Tiere durch C0-Inhalation wurden Blut und verschiedene Organe entnommen (Thymus, Lunge, Herz, Milz, Magen, Darm, Pankreas, Gehirn, Niere und Leber). Die Organe wurden kurz in kaltem, sterilem PBS gespült und mit einem sterilen Skalpell zerteilt. Ein Teil wurde für immunhi- stochemische Färbungen in Methyl Carnoys (MC, 60% Methanol, 30% Chloroform, 10% Eisessig) für 24 h fixiert, ein Teil für Gefrierschnitte und für Proteinisolierungen sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert und ein weiterer, kleinerer Teil wurde für RNA-Isolierungen in RNA- easy-Protect (QIAGEN GmbH, Max-Volmer-Straße 4, 40724 Hilden) bei -80°C eingefroren. Das Blut wurde sofort nach der Entnahme für 30 min auf Eis gehalten, gemixt, 5 min bei 2000 Umdrehungen pro Minute (Mini spin, Eppendorf AG, Barkhausenweg 1, 22331 Hamburg, Deutschland) zentrifugiert, der Überstand ab- genommen und bei -80°C gelagert (hier als Plasma bezeichnet) .
Prozessieren der Biopsien:
Nach 24 h Fixierung der Gewebe in MC wurden die Gewebestücke in einer aufsteigenden Alkoholreihe bei RT (Raumtemperatur) dehydriert: je 40 min 70% Methanol, 80% Methanol, 2 x 96%
Methanol und 3 x 100% Isopropanol. Danach wurden die Gewebe in 100% Isopropanol auf 60°C im Brutschrank erwärmt, nachfolgend für 1 h in einem Isopropanol/Paraffin-Gemisch bei 60°C und 3 x für 2 h in Paraffin inkubiert und sodann in Paraffin eingebettet. Für Immunperoxidase-Färbungen wurden mit einem Rotationsmikrotom (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Heidelberger Str. 17 - 19, D-69226 Nussloch, Deutschland) Gewebeschnitte von 3 μm Schnittdicke angefertigt, auf Objektträger (Superfrost, Fa. Vogel GmbH & Co. KG, Medizinische Technik und Elektronik, Marburger Straße 81, 35396 Gießen, Deutschland) aufgezogen und für 30 min bei 60°C im Brutschrank inkubiert .
Immunperoxidase-Färbung gegen GFP: Die Schnitte wurden 3 x 5 min in Xylol deparaffiniert , in einer absteigenden Alkoholreihe (3 x 3 min 100% Ethanol, 2 x 2 min 95% Ethanol) rehydriert und danach 20 min in 3% H202/Methanol zum Blocken endogener Peroxidasen inkubiert. Alle Inkubationsschritte wurden im Folgenden in einer feuchten Kam- mer durchgeführt. Nach 3 x 3 min Waschen mit PBS wurde mit einem ersten Antikörper (Ziege anti-GFP-Antikörper, sc-5384, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Bergheimer Str. 89-2, 69115 Heidelberg, Deutschland) 1:500 in 1% BSA/PBS über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Inkubation mit dem biotinylierten Sekun- därantikörper (Esel anti-Ziegen IgG; Santa Cruz Biotechnology; 1:2000 Verdünnung) erfolgte für 30 min bei RT, danach wurde für 30 min mit Avidin D Peroxidase (1 : 2000-Verdünnung, Vector Laboratories, 30 Ingold Road, Burlingame, CA 94010, USA) inkubiert. Nach jeder Antikörperinkubation wurden die Schnitte 3 x 3 min in PBS gewaschen und Pufferreste mit Zellstoff von den Schnitten entfernt. Alle Antikörper wurden in 1% Rinderserumalbumin (BSA) /PBS verdünnt. Die Färbung mit 3 , 3 ' -Diaminobenzidin (DAB) wurde mit dem DAB Substrat Kit (Vector Laboratories) nach Herstellerangaben durchgeführt. Als nukleare Gegenfärbung wurde Hämatoxylin III nach Gill
(Merck KgaA, Frankfurter Str. 250, D-64293 Darmstadt) verwendet. Nach der Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe und 3 x 5 min Xylol wurden die Schnitte mit Entellan (Merck) eingedeckt. Die mikroskopische Auswertung der Färbung erfolgte mit dem 1X50 Mikroskop der Fa. OLYMPUS Optical Co. (Europa) GmbH, Wendenstr. 14-18, D-20097 Hamburg, Deutschland ausgestattet mit einer CCD-Camera (Hamamatsu Photonics K.K., Systems Division, 812 Joko-cho Hamamtsu City, 431-3196 Japan) .
Proteinisolierung aus Gewebestücken:
Zu den noch gefrorenen Gewebestücken wurden jeweils 800 μl Isolierungspuffer (50 M HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM ED- TA; 2,5 mM EGTA; 10% Glycerol; 0,1% Tween; 1 mM DTT; 10 mM ß- Glycerol-Phosphat; 1 mM NaF; 0,1 M Na3V04 mit einer Protea- se-Inhibitor-Tablette "Co plete" der Fa. Röche Diagnostics GmbH, Röche Applied Science, Sandhofer Str. 116, 68305 Mannheim) zugegeben und 2 x 30 Sekunden mit einem Ultraturrax (DIAX 900, Dispergierwerkzeug 6G, HEIDOLPH Instruments GmbH & Co. KG, Walpersdorfer Straße 12, D-91126 Schwabach) homogenisiert, dazwischen auf Eis abgekühlt. Nach 30 Minuten Inkubation auf Eis wurde gemischt und für 20 Minuten bei 10000 x g, 4°C, zentrifugiert (3K30, SIGMA Laborzentrifugen GmbH, An der Unteren Söse 50, D - 37507 Osterode am Harz) . Der Überstand wurde erneut 10 Minuten auf Eis inkubiert, gemischt und 20
Minuten bei 15000 x g, 4°C, zentrifugiert. Mit dem Überstand wurde eine Proteinbestimmung nach Bradford, 1976, modifiziert nach Zor & Selinger, 1996, mit dem Roti-Nanoquant-System der Fa. Carl Roth GmbH & Co., Schoe perlenstr . 1-5, 76185 Karls- ruhe, Deutschland nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Für die Protein-Eichgerade wurde BSA (bovines Serumalbumin) in Konzentrationen von 10 bis 100 μg/ml eingesetzt.
SDS-Gelelektrophorese : Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte in einer Multigel-Long Elektrophoresekammer der Fa. Whatman Biometra GmbH, Rudolf-Wissell-Str. 30, 37079 Göttingen, Deutschland mittels einer denaturierenden, diskontinuierlichen 15% SDS-PAGE (Polyacrylamid Gelelektrophorese) nach Lä mli (Na- ture 277: 680-685, 1970). Dazu wurde zunächst ein Trenngel mit 1,5 mm Dicke gegossen: 7 , 5 ml Acrylamid/Bisacrylamid (30%, 0,9%), 3,8 ml 1,5 M Tris/HCl, pH 8,4, 150 μl 10% SDS, 3,3 ml Aqua bidest., 250 μl Ammoniumpersulfat (10%), 9 μl TE- MED (N,N,N' ,N' -Tetramethylendiamin) und bis zum Auspolymeri- sieren mit 0,1% SDS überschichtet. Danach wurde das Sammelgel gegossen: 0,83 μl Acrylamid/Bisacrylamid (30%/0,9%), 630 μl 1 M Tris/HCl, pH 6,8, 3,4 ml Aqua bidest., 50 μl 10% SDS, 50 μl 10% Ammoniumpersulfat, 5 μl TEMED.
Vor dem Auftrag auf das Gel wurden die Proteine mit einer entsprechenden Menge an 4-fach Probenpuffer (200 mM Tris, pH 6,8, 4% SDS, 100 mM DTT (Dithiotreithol) , 0,02% Bromphenolblau, 20% Glycerin) versetzt, für 5 min im Heizblock bei 100°C denaturiert, nach dem Abkühlen auf Eis kurz abzentrifu- giert und auf das Gel aufgetragen. Pro Bahn wurde die gleichen Plasma- bzw. Proteinmengen eingesetzt (je 3μl Plasma bzw. 25 μg Gesamtprotein) . Die Elektrophorese erfolgte wassergekühlt bei RT und konstant 50 V. Als Längenstandard wurde der Proteingelmarker Kaleidoscope Prestained Standard der
Firma Bio-Rad Laboratories GmbH, Heidemannstraße 164, 80939 München, Deutschland verwendet.
Western Blot und Immundetektion: Der Transfer der Proteine vom SDS-PAGE auf eine PVDF (Polyve- nyldifluorid) -Membran (Hybond-P, Amersham Biosciences Europe GmbH, Munzinger Str. 9, D-79111 Freiburg, Deutschland) erfolgte im semi-dry Verfahren nach Kyhse-Anderson (J. Biochem. Biophys. Methods 10: 203-210, 1984) bei RT und einer konstan- ten Stromstärke von 0,8 A/cm2 für 1,5 h. Als Transferpuffer wurde ein Tris/Glycin-Puffer eingesetzt (39 M Glycin, 46 mM Tris, 0,1 % SDS und 20% Methanol). Zum Überprüfen des elek- trophoretisehen Transfers wurden sowohl die Gele nach dem Blotten als auch die Blotme branen nach der Immundetektion mit Coomassie (0,1% Coomassie G250, 45% Methanol, 10% Eises- sig) gefärbt. Zum Absättigen unspezifischer Bindungen wurde die Blotmembran nach dem Transfer in 1% Magermilchpulver/PBS für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurde je dreimal für 3 min mit 0,1% Tween-20/PBS gewaschen. Alle nachfolgenden Antikör- perinkubationen und Waschschritte erfolgten in 0,1% Tween- 20/PBS. Die Inkubation mit dem Primärantikörper (Ziege anti- GFP-Antikörper, sc-5384, Santa Cruz Biotechnology) in einer Verdünnung von 1:1000 erfolgte für 1 h bei RT. Danach wurde 3 x 5 min gewaschen und für 1 h bei RT mit einem Sekundäranti- körper (Esel anti-Ziege IgG, mit Meerrettich-Peroxidase markiert, Santa Cruz Biotechnology) in einer Verdünnung von 1:10000 inkubiert. Die Detektion erfolgte mit dem ECL-System der Fa. Amersham nach den Angaben des Herstellers.
In den Fig. 1 bis 3 ist die Inhibition der GFP-Expression nach intravenöser Injektion von spezifisch gegen GFP gerichteter dsRNA mittels Immunperoxidase-Färbungen von GFP an 3 μm Paraffinschnitten dargestellt. Im Versuchsverlauf wurde gegen GFP gerichtete dsRNA mit einem doppelsträngigen Bereich von 22 Nukleotid- (nt) paaren ohne Überhänge an den 3 ' -Enden (D) und die entsprechende unspezifische Kontroll-dsRNA (B) sowie spezifisch gegen GFP gerichtete dsRNA mit einem 19 Nukleo- tidpaare umfassenden Doppelstrangbereich mit 2nt-Überhängen an den 3 ' -Enden (E) und die entsprechende unspezifische Kon- troll-dsRNA (C) im 12 Stunden-Turnus über 5 Tage hinweg appliziert. (F) erhielt 1/50 der Dosis von Gruppe D. Als weitere Kontrolle wurden Tiere ohne dsRNA-Gabe (A) bzw. WT-Tiere untersucht. Die Fig. 1 zeigt die Inhibition der GFP-Expression in Nierenschnitten, Fig. 2 in Herz- und Fig. 3 in Pan- kreasgewebe. In den Fig. 4 bis 6 sind Western Blot-Analysen der GFP-Expression in Plasma und Geweben dargestellt . In der Fig. 4 ist die Inhibition der GFP-Expression im Plasma, in Fig. 5 in der Niere und in Fig. 6 im Herz gezeigt. In Fig. 6 sind Gesamtproteinisolate aus verschiedenen Tieren aufgetra- gen. Es wurden jeweils gleiche Gesamtproteinmengen pro Bahn aufgetragen. In den Tieren, denen unspezifische Kontroll- dsRNA verabreicht wurde (Tiere der Gruppen B und C) , ist die GFP-Expression gegenüber Tieren, die keinerlei dsRNA erhielten, nicht reduziert. Tiere, die spezifisch gegen GFP gerich- tete dsRNA mit 2nt-Überhängen an den 3 ' -Enden beider Stränge und einen 19 Nukleotidpaare umfassenden Doppelstrangbereich erhielten, zeigten eine signifikant inhibierte GFP-Expression in den untersuchten Geweben (Herz, Niere, Pankreas und Blut) , verglichen mit unbehandelten Tieren (Fig. 1 bis 6) . Bei den Tieren der Gruppen D und F, denen spezifisch gegen GFP gerichtete dsRNA mit glatten Enden und einem 22 Nukleotidpaare umfassenden Doppelstrangbereich appliziert wurde, zeigten nur jene Tiere, die die dsRNA in einer Dosis von 50 μg/kg Körpergewicht pro Tag erhielten, eine spezifische Inhibition der GFP-Expression, die allerdings weniger deutlich ausgeprägt war als die der Tiere in Gruppe E.
Die zusammenfassende Auswertung von GFP-Inhibition in den Gewebeschnitten und im Western Blot ergibt, dass die Inhibition der GFP-Expression im Blut und in der Niere am stärksten ist (Fig. 1, 4 und 5) .
Zweiter in vivo-Versuch:
In einer Zusatzstudie wurde untersucht, ob sich die im ersten Versuch als wirksam erwiesene in vivo applizierte Dosierung von 5 mg/kg Körpergewicht (KG) und Tag weiter reduzieren lässt. Dazu wurde für die intravenöse Injektion in die Schwanzvene der GFP-transgenen Mäuse die 200-fach geringere Dosierung von 25 μg/kg KG und Tag gewählt. Es wurde das aus der GFP-Sequenz abgeleitete GFP-spezifische dsRNA-Konstrukt S7/S11 verwendet, das sich in in vitro-Transkriptionen als besonders effektiv erwiesen hatte. Als unspezifische Kon- troll-dsRNA wurde K4 verwendet. K4 weist die gleiche Konstruktion wie S7/S11 auf (dsRNA mit 21 Basenpaarungen und ei- nem 2nt-Überhang am 3 ' -Ende des Antisinnstrangs Sl) . Die Se- quenz von K4 ist aus dem 5 ' -Ende des Neomycin-Resistenzgens abgeleitet.
Um die Wirksamkeit der GFP-spezifischen dsRNA zu untersuchen, wurde nach Versuchsende im Blut der prozentuale Anteil der GFP-positiven Ly phozyten mittels FACS-Analyse (Fluorescence Activated Cell Sorting) ermittelt, sowie die GFP-Expression im Gesamtblut durch Western Blot-Analyse untersucht.
Während der Versuchsdurchführung wurden die heterozygoten
GFP-Versuchstier zu je 2 bis 3 Tieren gruppenweise in Käfigen wie oben beschrieben gehalten. Die Injektionen erfolgten in Impfkäfigen ohne Betäubung einmal täglich, morgens, intravenös (i.v.) in die Schwanzvene über einen Zeitraum von 21 Ta- gen hinweg. Das Injektionsvolumen betrug 60 μl pro 10 g Körpergewicht und die Dosis betrug 25 μg dsRNA (GFP-spezifische dsRNA) bzw. 250 μg dsRNA (unspezifische Kontroll-dsRNA K4) pro kg Körpergewicht. Die Versuchstiere wurden in zwei Gruppen eingeteilt:
Die GFP-Gruppe bestand aus 7 Tieren, die 25 μg/kg Körpergewicht der GFP-spezifischen dsRNA S7/S11 erhielten. Die Kontrollgruppe, bestehend aus 6 Tieren, erhielt die unspezifische Kontroll-dsRNA K4 in einer Konzentration von 250 μg/kg Körpergewicht. Nach der letzten Injektion am Tag 21 wurden die Tiere genau 24 Stunden später, am Tag 22, mit C02 getötet, der Bachraum geöffnet und mittels Herzpunktion mit einer Kanüle sofort Blut entnommen. Ca. 100 μl Vollblut wurden ohne weitere Behandlung für Western Blot-Analysen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Der größte Teil des Blutes wurde zur Inhibition der Blutgerinnung 1:1 mit 100 mM Natriumeitrat versetzt, vorsichtig gemischt, und bis zur FACS-Analyse bei RT im Dunkeln aufbewahrt. FACS-Analyse:
Vor der FACs-Analyse wurde eine Erythrolyse durchgeführt, die automatisiert mit dem Immunoprep Reagenz Kit der Fa. Beckman Coulter GmbH - Diagnostics, Siemenstrasse 1, D-85716, Unter- schleissheim, Deutschland am Coulter® Q-Prep™ (Fa. Beckman Coulter GmbH) nach Herstellerprotokoll vorgenommen wurde. Dazu wurden je 100 μl des mit Natriumeitrat versetzten Bluts, die in ein 5 ml-FACS-Röhrchen mit Rundboden pipettiert wur- den, verwendet. Die Bestimmung der GFP-exprimierenden Zellen erfolgte am Durchflusscytometer Coulter® EPICS XL™ der Fa. Beckman Coulter GmbH.
Zusätzlich wurde mittels direkter Färbung und anschließender FACS-Analyse eine quantitative Analyse der B- und T-Zellen sowie der Granulozyten/ Makrophagen/ Monozyten vorgenommen. Folgende Phycoerythrin-markierten monoklonale Antikörper wurden verwendet :
Als Marker für B-Lymphozyten Ratten-anti-Maus CD19 (Clone 1D3),
als Marker für Granulozyten, Makrophagen, Monozyten CDU (Clone Ml/70) ,
als Marker für T-Lymphozyten Ratten anti-Maus CD3 (Clone 17A2) ,
und zur weiteren Differenzierung der T-Zellen:
CD4 (Clone GK1.5) als Marker für natürliche Killer T-Zellen und
CD8a (Clone 53-6.7) als Marker für zytotoxische T-Zellen. Alle Antikörper wurden von BD Biosciences, Tullastrasse 8-12, 69126 Heidelberg, Deutschland bezogen. Die Färbungen mit den entsprechenden Antikörpern wurden vor der oben beschriebenen Erythrolyse durchgeführt. Dazu wurden je 10 μl Antikörper in 5 ml FACS-Röhrchen vorgelegt und 100 μl Blut dazupipettiert, für 30 min bei RT abgedunkelt inkubiert, und nach der Erythrolyse eine 2-Farben-Fluoreszenzmessung durchgeführt (Anregungswellenlänge: 488 nm) . Als Kontrolle wurde zusätzlich das Blut von zwei völlig unbehandelten GFP-Tieren analy- siert. Die Werte der prozentualen GFP-Expression für jedes Einzeltier ergeben sich somit aus dem Mittelwert von 6 Einzelmessungen (eine 1-Farben-Fluoreszenzmessung ohne Färbung und je 5 2-Farben-Fluoreszenzmessungen mit Antikörperfär- bung) .
SDS-Gelelektrophorese :
Die elektrophoretische Auftrennung erfolgte in einer Multi- gel-Long Elektrophoresekammer von Biometra mit einer denatu- rierenden, diskontinuierlichen 15% SDS-PAGE (Polyacrylamid
Gelelektrophorese) nach Lämmli (Nature 277: 680-685, 1970). Dazu wurde zunächst ein Trenngel mit 1,5 mm Dicke gegossen: 7,5 ml Acrylamid/Bisacrylamid (30%, 0,9%), 3,8 ml 1,5 M Tris/HCl, pH 8,4, 150 μl 10% SDS, 3 , 3 ml Aqua bidest., 250 μl Ammoniumpersulfat (10%), 9 μl TEMED (N,N,N' ,N' -Tetramethyl- endiamin) und bis zum Auspolymerisieren mit 0,1% SDS überschichtet. Danach wurde das Sammelgel gegossen: 0,83 μl Acrylamid/Bisacrylamid (30%/0,9%), 630 μl 1 M Tris/HCl, pH 6,8, 3,4 ml Aqua bidest., 50 μl 10% SDS, 50 μl 10% Ammoniumpersul- fat, 5 μl TEMED.
Vor dem Auftrag auf das Gel wurde das Vollblut mittels Ultraschall aufgeschlossen, mit einer entsprechenden Menge an 4- fach Probenpuffer (200 M Tris, pH 6,8, 4% SDS, 100 mM DTT (Dithiotreithol) , 0,02% Bromphenolblau, 20% Glycerin) ver- setzt, für 5 min im Heizblock bei 100°C denaturiert, nach dem Abkühlen auf Eis kurz abzentrifugiert und auf das Gel aufgetragen. Es wurden pro Bahn je 2 μl Vollblut eingesetzt. Der Lauf erfolgte wassergekühlt bei RT und einer konstanten elek- trischen Spannung von 50 V. Als Längenstandard wurde der Pro- teingelmarker Kaleidoscope Prestained Standard der Firma Bio- Rad verwendet .
Western Blot: Der Transfer der Proteine vom SDS-PAGE auf eine PVDF (Polyve- nyldifluorid) -Membran (Hybond-P, Amersham) erfolgte im semi- dry Verfahren nach Kyhse-Anderson (J. Bioche . Biophys . Me- thods 10: 203-210, 1984) bei RT und einer konstanten Stromstärke von 0,8 mA/cm2 für 1,5 h. Als Transferpuffer wurde ein Tris/Glycin-Puffer eingesetzt (39 mM Glycin, 46 mM Tris, 0,1 % SDS und 20% Methanol) . Zum Überprüfen des elektrophoreti- schen Transfers wurden sowohl die Gele nach dem Blotten als auch die Blotmembranen nach der Immundetektion mit Coomassie (0,1% Coomassie G250, 45% Methanol, 10% Eisessig) gefärbt. Zum Absättigen unspezifischer Bindungen wurde die Blotmembran nach dem Transfer in 1% Mager ilchpulver/PBS für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurde je dreimal je 3 min mit 0,1% Tween- 20/PBS gewaschen. Alle nachfolgenden Antikörperinkubationen und Waschschritte erfolgten in 0,1% Tween-20/PBS . Die Inkuba- tion mit dem Primärantikörper gegen GFP (polyklonaler Ziege anti-GFP-Antikörper, sc-5384, Santa Cruz Biotechnology) in einer Verdünnung von 1:2000 erfolgte für 1 h bei RT zusammen mit dem Aktinantikörper (polyklonaler Ziege-anti-Aktin-Anti- körper, sc-1615, Santa Cruz Biotechnology) in einer Verdün- nung von 1:1000. Danach wurde 3 5 min gewaschen und für 1 h bei RT mit einem Sekundärantikörper (Esel anti-Ziege IgG, mit Meerrettich-Peroxidase markiert, Santa Cruz Biotechnology) in einer Verdünnung von 1: 10000 inkubiert. Die Detektion erfolgte mit dem ECL-System der Fa. Amersham nach den Angaben des Herstellers. Die Fig. 7, 8 und 10 zeigen die mittels FACS analysierte Inhibition der GFP-Expression in den Lymphozyten (Fig. 7 und 8) und im Vollblut mittels Western Blot-Analyse (Fig. 10) nach Injektion von spezifischer gegen GFP gerichtete dsRNA. Die in Fig. 7 dargestellten Werte entsprechen den Mittelwerten der in Fig. 8 dargestellten Werte. Die Applikation von 25 μg GFP- spezifischer dsRNA pro kg Körpergewicht und Tag in der GFP- Gruppe führte somit im Vergleich zu der Kontrollgruppe, die während des Versuchs 250 μg einer unspezifischen Kontroll- dsRNA pro kg Körpergewicht und Tag erhielt, zu einer signifikanten und spezifischen Reduktion der GFP-Expression. Die dsRNA-Konzentrationen lagen dabei deutlich unter den im ersten in vivo-Versuch verwendeten. Im ersten in vivo-Versuch waren die Injektionen über 10 Tage hinweg im 12 Stunden- Rhythmus erfolgt, so dass sich eine Gesamttagesdosis von 5 mg dsRNA pro kg Körpergewicht ergab. Im Vergleich dazu betrug die Gesamttagesdosis im hier beschriebenen zweiten in vivo- Versuch 25 μg dsRNA pro kg Körpergewicht (die Injektionen erfolgten einmal täglich über 21 Tage hinweg) . Diese Gesamtta- gesdosis ist gegenüber dem ersten in vivo-Versuch 200-fach verringert. Die Gesamtdosis an dsRNA pro kg Körpergewicht über den gesamten VersuchsZeitraum hinweg betrug im ersten in vivo-Versuch 50 mg pro kg Körpergewicht (2,5 mg/kg Körpergewicht x 20 Injektionen) um im zweiten in vivo-Versuch 0,525 mg pro kg Körpergewicht (25 μg/kg Körpergewicht x 21 Injektionen) . Dies entspricht einer ca. 95-fach geringeren Menge an dsRNA. Die Reduktion der GFP-Expression im Blut ist jedoch in beiden Studien vergleichbar.
Fig. 9 zeigt, dass die Applikation der genannten dsRNAs über einen Zeitraum von 21 Tagen zu keiner Veränderung der BlutZusammensetzung führt. Die Reduktion der GFP-Expression in der mit GFP-spezifischer dsRNA behandelten Gruppe ist daher nicht auf eine Verringerung GFP-exprimierender Blutzellen zurückzu- führen.

Claims

Patentansprüche
1. Medikament zur Hemmung der Expression eines Zielgens, wobei das Medikament in mindestens einer Verabreichungsein- heit vorliegt, welche eine zur Hemmung der Expression des Zielgens mittels RNA-Interferenz geeignete doppelstrangige Ribonukleinsäure (dsRNA) in einer Menge enthält, welche eine Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht.
2. Medikament nach Anspruch 1, wobei die Verabreichungseinheit die dsRNA in einer Menge enthält, welche eine Dosierung von höchstens 2,5 mg, insbesondere höchstens 200 μg, bevorzugt höchstens 100 μg, besonders bevorzugt höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht.
3. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in dem Medikament in einer Zubereitung enthalten ist, welche, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel und der darin gelösten dsRNA besteht.
4. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Lösungsmittel eine physiologische Kochsalzlösung oder ein physiologisch verträglicher Puffer, insbesondere eine phosphatgepufferte Salzlösung, ist.
5. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden ist.
6. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbeson- dere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumo- ralen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
7. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen zumindest ab- schnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist.
8. Medikament nach Anspruch 7 , wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
'9. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
10. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist.
11. Medikament nach Anspruch 10, wobei sich der einzelsträn- gige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet.
12. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
13. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
14. Medikament nach Anspruch 13, wobei der Strang Sl eine
Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf- weist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
15. Medikament nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten KNA- Transkript des Zielgens komplementär ist.
16. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure
(dsRNA) in einer Dosierung von höchstens 5 mg pro kg Körpergewicht und Tag zur Hemmung der Expression eines Zielgens mittels RNA-Interferenz in einem Säugetier oder Men- sehen.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 2,5 mg, insbesondere höchstens 200 μg, bevorzugt höchstens 100 μg, besonders bevorzugt höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körper- gewicht und Tag verwendet wird.
18. Verwendung nach Anspruch 16 oder 17, wobei die dsRNA in einer Zubereitung enthalten ist, welche, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel und der darin gelösten dsRNA besteht.
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Lösungsmittel eine physiologische Kochsalzlösung oder ein physiologisch verträglicher Puffer, insbesondere eine phosphatgepufferte Salzlösung, ist.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei die dsRNA von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem
Liposom, einem Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden ist.
21. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen, intraperitonealen oder intratumoralen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zum Zielgen zumindest ab- schnittsweise komplementären, insbesondere aus weniger als 25 aufeinander folgenden Nukleotiden bestehenden, Bereich aufweist.
23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei der komplementäre Bereich 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
25. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, wobei zumindest ein Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist .
26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei sich der einzelsträn- gige Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 26, wobei die dsRNA nur an einem, insbesondere dem am 3 ' -Ende des Strangs Sl gelegenen, Ende einen einzelsträngigen Überhang aufweist.
28. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 27, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist.
29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei der Strang Sl eine
Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf- weist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
30. Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 29, wobei der Strang Sl zum primären oder prozessierten RNA-Transkript des Zielgens komplementär ist.
PCT/EP2002/011971 2001-10-26 2002-10-25 Medikament zur hemmung der expression eines zielgens WO2003035082A1 (de)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10230996A DE10230996A1 (de) 2001-10-26 2002-07-09 Medikament zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms
DE10230997A DE10230997A1 (de) 2001-10-26 2002-07-09 Medikament zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels
PCT/EP2002/011971 WO2003035082A1 (de) 2001-10-26 2002-10-25 Medikament zur hemmung der expression eines zielgens
JP2003538370A JP2005506385A (ja) 2001-10-26 2002-10-25 膵臓癌を処置するための医薬
US10/382,634 US20040038921A1 (en) 2001-10-26 2003-08-11 Composition and method for inhibiting expression of a target gene
US10/666,458 US20040126791A1 (en) 2001-10-26 2003-09-19 Compositions and methods for treating trail-resistant cancer cells

Applications Claiming Priority (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10155280 2001-10-26
DE10155280.7 2001-10-26
DE10158411.3 2001-11-29
DE10158411 2001-11-29
DE10160151.4 2001-12-07
DE10160151A DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2001-12-07 Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
EPPCT/EP02/00152 2002-01-09
PCT/EP2002/000151 WO2002055692A2 (de) 2001-01-09 2002-01-09 Verfahren zur hemmung der expression eines zielgens und medikament zur therapie einer tumorerkrankung
EPPCT/EP02/00151 2002-01-09
PCT/EP2002/000152 WO2002055693A2 (de) 2001-01-09 2002-01-09 Verfahren zur hemmung der expression eines zielgens
DE10230996.5 2002-07-09
DE10230996A DE10230996A1 (de) 2001-10-26 2002-07-09 Medikament zur Behandlung eines Pankreaskarzinoms
PCT/EP2002/011971 WO2003035082A1 (de) 2001-10-26 2002-10-25 Medikament zur hemmung der expression eines zielgens
PCT/EP2002/011968 WO2003035868A1 (de) 2001-10-26 2002-10-25 Medikament zur erhöhung der wirksamkeit eines rezeptor-vermittelt apoptose in tumorzellen auslösenden arzeimittels

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10/382,634 Continuation-In-Part US20040038921A1 (en) 2001-10-26 2003-08-11 Composition and method for inhibiting expression of a target gene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003035082A1 true WO2003035082A1 (de) 2003-05-01

Family

ID=37667408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2002/011971 WO2003035082A1 (de) 2001-10-26 2002-10-25 Medikament zur hemmung der expression eines zielgens

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10230996A1 (de)
WO (1) WO2003035082A1 (de)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005002594A1 (fr) * 2003-07-08 2005-01-13 Institute Of Hematology, Chinese Academy Of Medical Sciences Medicament antitumoral d'interference de l'arn utilise dans la resistance pleiotrope
DE10350256A1 (de) * 2003-10-01 2005-06-02 Grünenthal GmbH PIM-1-spezifische siRNA-Verbindungen
US7196184B2 (en) 2002-01-22 2007-03-27 Alnylam Europe Ag Double-stranded RNA (DSRNA) and method of use for inhibiting expression of the AML-1/MTG8 fusion gene
US7348314B2 (en) 2001-10-12 2008-03-25 Alnylam Europe Ag Compositions and methods for inhibiting viral replication
US7473525B2 (en) 2001-01-09 2009-01-06 Alnylam Europe Ag Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
EP2292739A1 (de) 2006-03-24 2011-03-09 Institut National De La Recherche Agronomique Verfahrung zur Herstellung differenzierter Zellen vom Huhn, und Gene, die im Erhalt der Pluripotenz impliziert sind
US8101584B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US9074213B2 (en) 2001-01-09 2015-07-07 Alnylam Pharmacuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999032619A1 (en) * 1997-12-23 1999-07-01 The Carnegie Institution Of Washington Genetic inhibition by double-stranded rna
WO2000044895A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-03 Roland Kreutzer Verfahren und medikament zur hemmung der expression eines vorgegebenen gens
WO2000044914A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
WO2001036646A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Cancer Research Ventures Limited Inhibiting gene expression with dsrna
WO2001075164A2 (en) * 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
WO2002044321A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999032619A1 (en) * 1997-12-23 1999-07-01 The Carnegie Institution Of Washington Genetic inhibition by double-stranded rna
WO2000044914A1 (en) * 1999-01-28 2000-08-03 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for in vivo and in vitro attenuation of gene expression using double stranded rna
WO2000044895A1 (de) * 1999-01-30 2000-08-03 Roland Kreutzer Verfahren und medikament zur hemmung der expression eines vorgegebenen gens
WO2000063364A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 American Home Products Corporation Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
WO2001036646A1 (en) * 1999-11-19 2001-05-25 Cancer Research Ventures Limited Inhibiting gene expression with dsrna
WO2001075164A2 (en) * 2000-03-30 2001-10-11 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
WO2002044321A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BASS BRENDA L: "Double-stranded RNA as a template for gene silencing", CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, NA, US, vol. 101, no. 3, 28 April 2000 (2000-04-28), pages 235 - 238, XP002194756, ISSN: 0092-8674 *
CAPLEN N J ET AL: "Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA. UNITED STATES 14 AUG 2001, vol. 98, no. 17, 14 August 2001 (2001-08-14), pages 9742 - 9747, XP002232936, ISSN: 0027-8424 *
ELBASHIR SAYDA M ET AL: "Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells", NATURE, MACMILLAN JOURNALS LTD. LONDON, GB, vol. 411, no. 6836, 2001, pages 494 - 498, XP002206451, ISSN: 0028-0836 *
ELBASHIR SAYDA M ET AL: "RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs", GENES AND DEVELOPMENT, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS, NEW YORK, US, vol. 15, no. 2, 15 January 2001 (2001-01-15), pages 188 - 200, XP002204651, ISSN: 0890-9369 *

Cited By (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8729037B2 (en) 1999-01-30 2014-05-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8101584B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8114981B2 (en) 1999-01-30 2012-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US9133454B2 (en) 1999-01-30 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8114851B2 (en) 1999-01-30 2012-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US9902955B2 (en) 1999-01-30 2018-02-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8168776B2 (en) 1999-01-30 2012-05-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method for making a 21 nucleotide double stranded RNA chemically linked at one end
US8119608B2 (en) 1999-01-30 2012-02-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8202980B2 (en) 1999-01-30 2012-06-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8101742B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7473525B2 (en) 2001-01-09 2009-01-06 Alnylam Europe Ag Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US9074213B2 (en) 2001-01-09 2015-07-07 Alnylam Pharmacuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US9587240B2 (en) 2001-01-09 2017-03-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7745418B2 (en) 2001-10-12 2010-06-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting viral replication
US7763590B2 (en) 2001-10-12 2010-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a mutant gene
US7348314B2 (en) 2001-10-12 2008-03-25 Alnylam Europe Ag Compositions and methods for inhibiting viral replication
US7846907B2 (en) 2002-01-22 2010-12-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded RNA (dsRNA) and method of use for inhibiting expression of a fusion gene
US7196184B2 (en) 2002-01-22 2007-03-27 Alnylam Europe Ag Double-stranded RNA (DSRNA) and method of use for inhibiting expression of the AML-1/MTG8 fusion gene
WO2005002594A1 (fr) * 2003-07-08 2005-01-13 Institute Of Hematology, Chinese Academy Of Medical Sciences Medicament antitumoral d'interference de l'arn utilise dans la resistance pleiotrope
DE10350256A1 (de) * 2003-10-01 2005-06-02 Grünenthal GmbH PIM-1-spezifische siRNA-Verbindungen
EP2292739A1 (de) 2006-03-24 2011-03-09 Institut National De La Recherche Agronomique Verfahrung zur Herstellung differenzierter Zellen vom Huhn, und Gene, die im Erhalt der Pluripotenz impliziert sind

Also Published As

Publication number Publication date
DE10230996A1 (de) 2003-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1352061B1 (de) Verfahren zur hemmung der expression eine zielgens
AT392081B (de) Verfahren zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung von virusinfektionen
DE60310944T3 (de) Weitere neue formen von interferierende rns moleküle
DE60118067T2 (de) Pharmazeutische Zusammensetzung mit Dystrophin Exon 45 zur Behandlung von Duchenne-Muskeldystrophie
WO2003035868A1 (de) Medikament zur erhöhung der wirksamkeit eines rezeptor-vermittelt apoptose in tumorzellen auslösenden arzeimittels
DE10230997A1 (de) Medikament zur Erhöhung der Wirksamkeit eines Rezeptor-vermittelt Apoptose in Tumorzellen auslösenden Arzneimittels
WO2003062432A1 (de) Verfahren zur erhöhung der wirksamkeit eines inhibitors der aktivität einer tyrosinkinase
WO2003035876A1 (de) Verwendung einer doppelsträngigen ribonukleinsäure zur behandlung einer infektion mit einem (+)-strang-rna-virus
WO2003033700A1 (de) Verfahren zur hemmung der replikation von viren
DE69535155T2 (de) Für gdnf-kodierende rekombinante adenoviren
EP3199633A1 (de) Herabregulation der genexpression mittels nukleinsäure-beladener virus-ähnlicher partikel
WO2003035082A1 (de) Medikament zur hemmung der expression eines zielgens
EP0655926A1 (de) Neue sonde zur tumordiagnostik oder tumortherapie
DE69735533T2 (de) Lösliche Polypeptide bestehend aus der ersten Coiled coil Domäne aus Mensch- und Maus-Epimorphin
EP2178553B1 (de) Verwendung eines granulins oder einer granulin-ähnlichen verbindung zur therapie oder prophylaxe von chronischen schmerzen
WO2003106681A2 (de) Antisense oligonukleotide gegen pim1
EP1588172A2 (de) Verfahren zur identifizierung bhs-spezifischer proteine und fragmente davon
DE69433996T2 (de) Verwendung pharmazeutischer zusammensetzungen zur behandlung von neurodegenerativen krankheiten
DE69631041T2 (de) Promotor des utrophingens
DE69932807T2 (de) Familie von mechano-empfindlichen kaliumkanälen bei säugetieren, die durch polyungesättigte fettsäuren aktiviert werden und deren verwendungen
EP1841461B1 (de) Iniizierbares mittel zur zielgerichteten behandlung von retinalen ganglienzellen
DE69434564T2 (de) Pharmazeutische zusammensetzungen und deren verwendung insbesondere in der behandlung von neurodegenerativen krankheiten
WO2005054486A1 (ja) 遺伝子導入試薬調製法
DE69533804T2 (de) Mimetika von aus alternden Zellen abgeleiteten Hemmern der DNA-Synthese
DE69936632T2 (de) Hemmung der cytokin-herstellung

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10382634

Country of ref document: US

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP