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WO2003062272A1 - Nueva estrategia moduladora de la activacion de los linfocitos t basada en la regulación de la interaccion cd3e- nck. - Google Patents

Nueva estrategia moduladora de la activacion de los linfocitos t basada en la regulación de la interaccion cd3e- nck. Download PDF

Info

Publication number
WO2003062272A1
WO2003062272A1 PCT/ES2003/000039 ES0300039W WO03062272A1 WO 2003062272 A1 WO2003062272 A1 WO 2003062272A1 ES 0300039 W ES0300039 W ES 0300039W WO 03062272 A1 WO03062272 A1 WO 03062272A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nck
cd3ε
activation
interaction
protein
Prior art date
Application number
PCT/ES2003/000039
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Balbino ALARCÓN SÁNCHEZ
Diana GIL PAGÉS
Wolfgang Schamel
Francisco SÁNCHEZ MADRID
María MONTOYA SÁNCHEZ
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Universidad Autónoma de Madrid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Publication of WO2003062272A1 publication Critical patent/WO2003062272A1/es

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the immune system and more specifically to the development of regulatory treatments for the T lymphocyte-mediated immune response in pathological processes.
  • the development of these methods is based on the possibility of identifying new regulatory agents for T lymphocyte antigen receptor (TCR) function and on the use of new gene therapy strategies modulating intracellular signal transmission from said TCR.
  • TCR T lymphocyte antigen receptor
  • the cells respond to extracellular stimuli by means of receptors that cross the plasma membrane. Although some receptors are channels that allow ions to pass into the cytoplasm, most receptors do not transmit material through the membrane and depend on interaction with intracellular effector molecules to activate signal transmission pathways. In these cases, after ligand binding, surface receptors initiate signaling cascades within cells either after undergoing a conformational change or after forming aggregates (Bachmann and Ohashi, 1999; Cochran et al., 2001; Jiang and Hunter , 1999; Reth, 2001; Stoddard et al., 1992; Weiss and Schlessinger, 1998).
  • T lymphocyte antigen The receptor for T lymphocyte antigen (TCR) is responsible for the recognition of specific antigens bound to the major histocompatibility complex (MHC) present in so-called antigen presenting cells (APC).
  • MHC major histocompatibility complex
  • APC antigen presenting cells
  • IPC immune synapse
  • the TCR is concentrated in the IS forming a Supramolecular activation aggregate (SMAC) surrounded by a ring of adhesion molecules (Monks et al, 1998).
  • SMAC Supramolecular activation aggregate
  • TCR is composed of a TCR ⁇ / ⁇ heterodimer (or TCR ⁇ / ⁇ in T ⁇ lymphocytes) bound to a set of four dimer-organized polypeptides: the CD3 ⁇ -CD3 ⁇ and CD3 ⁇ -CD3 ⁇ heterodimers. and the CD3 ⁇ -CD3 ⁇ homodimer (Clevers et al., 1988).
  • TCR ⁇ / ⁇ recognizes the antigen / MHC complex and somehow transmits this information to CD3 components.
  • TCR subunits are type I membrane proteins, but unlike the TCR ⁇ / ⁇ heterodimer, CD3 components have cytoplasmic stems that can interact with intracellular signal transmission molecules.
  • the CD3 subunits each have one (CD3 ⁇ , CD3 ⁇ and CD3 ⁇ ) or three (CD3 ⁇ ) tyrosine and leucine motifs, called tyrosine-based activation motifs present in immunoreceptors (ITAM) (Reth, 1989).
  • ITAM immunoreceptors
  • src type 2 (SH2) homology domains such as ZAP70 tyrosine kinase ( reviewed in (Kane et al., 2000; Lin and Weiss, 2001; Qian et al., 1997).
  • ITAM phosphorylation is believed to be the earliest activation event that occurs after ligand binding to TCR.
  • the entire cytoplasmic stem of the CD3 subunits has been conserved throughout evolution, to date no role in activation has been described for sequences located outside ITAMs.
  • T lymphocytes play a critical role in regulating the immune response
  • drugs that block the activation of T lymphocytes has become desirable for the prevention of organ allograft rejection and for the control of diseases of etiology.
  • autoimmune rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, multiple sclerosis, type I diabetes, myasthenia gravis, to name a few, and allergic type.
  • it is also convenient to control the expansion of T lymphocytes in the case of T-cell lymphomas.
  • T lymphocytes For all these reasons, it is necessary to discover new agents that allow a selective inhibition of the activation of T lymphocytes and that therefore do not interfere with the functions of other tissues.
  • the specific activation pathways of T lymphocytes can be perfect targets for new and selective immunosuppressive agents and therapies.
  • current therapies for stimulating T lymphocytes in infections and tumors) are often insufficient to induce an adequate immune response, so that new strategies would allow expanding the efficacy of said treatments.
  • Nck and CD3 ⁇ proteins as used in the present invention, indicate to all those proteins that, with respect to these and regardless of their origin, have a homology of at least 30%, preferably at least 85%, or more preferably at least 95%.
  • Nck the NcK protein as used as a general reference in the present invention comes to indicate both the NcK ⁇ protein and the NcK ⁇ protein.
  • T lymphocyte activation that occurs in inflammatory or immune reactions following activation from antigen / MHC binding to the TCR antigen receptor is provided in the present invention, demonstrating the key role of the specific interaction between certain domains of CD3 ⁇ and Nck proteins in the modulation of signal transmission that takes place in said activation of lymphocytes.
  • the present invention provides methods for the modulation of inflammatory or immune T lymphocyte activation dependent on the CD3 ⁇ and Nck interaction by methods that allow the alteration of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ and Nck.
  • a specific object of the present invention is the modulation of said CD3 ⁇ -Nck interaction through the use of chemical substances that alter said interaction. If that such chemicals block the CD3 ⁇ -Nck interaction will be identified as substances that inhibit (antagonize) the immune or inflammatory response, whereas if they activate (agonists) said CD3 ⁇ -Nck interaction, substances that activate these immune or inflammatory responses will be identified.
  • a specific object of the present invention is the use of said substances that antagonize T lymphocyte activation in treatment protocols for diseases that cause pathological activation of T lymphocytes such as, among others, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, multiple sclerosis, type I diabetes and myasthenia gravis; allergic-type diseases; in the prevention and treatment of transplant rejection and T lymphocyte lymphomas.
  • a specific object of the present invention is the use of said T lymphocyte activation agonist substances in protocols for the treatment of diseases that have an inhibition of T lymphocytes such as, among others, infectious, bacterial and viral diseases, among others, and tumors.
  • Another object of the present invention is a method for the identification of said agonist and antagonist substances of the cellular function of the protein-protein CD3 ⁇ -Nck interaction that can occur in physiological and pathological processes, among others, inflammatory, autoimmune, allergic, infectious and tumorous.
  • a specific object of the present invention is a method for the identification of agonists and antagonists of the activation of T lymphocytes mediated by the interaction of CD3 ⁇ -Nck proteins, which comprises the following steps: a) generating a biological preparation of the protein interaction -protein that mimics the CD3 ⁇ -Nck interaction, b) adding the candidate chemical compound agonist or antagonist, and c) determining the blockade or activation of the protein-protein CD3 ⁇ -Nck interaction, identifying in the case of blocking an antagonist of the CD3 ⁇ interaction- Nck and in case of activation an agonist of the interaction
  • Another object of the present invention is the previous method of identifying agonists and antagonists of the CD3 ⁇ -Nck interaction characterized in that the biological preparation of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ -Nck is carried out using the human CD3 ⁇ and Nck proteins, their homologous forms. or peptides
  • Another specific object of the present invention is a peptide that mimics the biological activity of CD3 ⁇ -binding NcK characterized by the amino acid sequence of the SH3.1 domain of NcK ⁇ (SEQ ID NO2).
  • Another specific object of the present invention is a peptide that mimics the biological activity of NcK binding to CD3 ⁇ characterized by the amino acid sequence of the SH3.1 domain of NcK ⁇ (SEQ ID NO3) as an element of said biological preparation.
  • Another specific object of the present invention is a peptide that mimics the biological activity of Nck-binding CD3 ⁇ characterized by the amino acid sequence of the proline rich region (PRS) of CD3 ⁇ described in the present invention (SEQ ID NO1) as an element of said biological preparation.
  • PRS proline rich region
  • Another object of the present invention is a fusion protein that comprises, in addition to the amino acid sequence of human CD3 ⁇ and Nck proteins, their homologous forms or peptides (fragments) that mimic the biological activity of said proteins or their homologous forms, other amino acid sequences that facilitate the subsequent determination of the alteration of the CD3 ⁇ -Nck interaction as an element of said biological preparation (among others and as an example: GST-SH3.1, SH3.1-EGFP, Nck-EGFP and HA-Nck) .
  • Another object of the present invention is the previous method of identifying agonists and antagonists of the CD3 ⁇ -Nck interaction characterized in that the biological preparation of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ -Nck is carried out using the human CD3 ⁇ and Nck proteins, their homologous forms. or peptides (fragments) that mimic the biological activity of said proteins or their homologous forms derived from used cells or from preparations of purified or semi-purified proteins.
  • Another specific object of the present invention is a method of identifying agonists and antagonists of the CD3 ⁇ -Nck interaction characterized in that the biological preparation of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ -Nck is carried out in a cell-free environment (among other possibilities, the immunoprecipitation assays carried out in example 1 and the stimulation assay of the purified TCR with the anti-CD3 antibody UCHT1 and subsequent blocking with the APAl / 1 antibody, see example 4).
  • the protein-protein complexes that mimic the CD3 ⁇ -Nck interaction and that are part of the procedure for identifying agonists and antagonists of the CD3 ⁇ -Nck interaction can be identified and quantified using a wide range of protein labeling techniques, among others, by immunological techniques, as performed in the present invention (anti-Flag and anti HA).
  • Another object of the present invention is a method of identifying agonists and antagonists of the CD3 ⁇ -Nck interaction characterized in that the biological preparation of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ -Nck is carried out in a cellular environment, among other possibilities: a) assay functional quantification of cell extension and deployment, actin cytoskeleton polymerization, (see example 5), b) functional assay for quantification of cytokine secretion, IL-2 and TNF ⁇ (see example 5), c) functional assay for quantification of cell proliferation (see example 5), d) functional assay to quantify the formation of conjugates between lymphocytes and APC cells (see example 6), and e) functional assay to quantify IS maturation (see example 6).
  • Another object of the present invention is a method of identifying agonists and antagonists of the CD3 ⁇ -Nck interaction characterized in that the biological preparation of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ -Nck is carried out in a cellular environment, consisting of a two-hybrid assay (trap assay) (for a more detailed description of this type of assay as well as other examples of assays aimed at identifying compounds modulating protein interactions see: United States Patent 6,037,136 Beach, et al., March 14, 2000 Interactions between RaF proto-oncogenes and CDC25 phosphatases, and uses related thereto and United States Patent 5,723,436 Huang, et al, March 3, 1998 Calcineurin interacting protein compositions and methods).
  • trap assay for a more detailed description of this type of assay as well as other examples of assays aimed at identifying compounds modulating protein interactions see: United States Patent 6,037,136 Beach, et al., March 14, 2000 Interactions between RaF proto-onc
  • Another object of the present invention is the previous method of identifying agonists and antagonists of the CD3 ⁇ -Nck interaction characterized in that the biological preparation of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ -Nck and the determination of the blocking or activation of said interaction after the addition of an agonist or antagonist candidate is performed in a basal or control situation, of stimulation (anti-CD3 and APC cells loaded with superantigen or antigen, among others) or blocking (overexpression of SH3.1 of Nck and transduction of APA1 antibody / 1, among others) of said interaction according to the interest in identifying one or the other agent.
  • a specific test to identify a possible antagonist of the Nck-CD3 ⁇ interaction could consist of the tests carried out in example 5 or 6 of the present invention, where an antagonist would produce a block of the activation obtained after stimulation of the TCR complex either with the anti CD3 antibody UCHT1 or with APCs loaded with SEE both in the control situation (EGFP) and in the case of cells transfected with Nck-EGFP.
  • Chemical compounds that are candidates for testing as modulators of the CD3 ⁇ -Nck interaction can be produced, for example, by bacteria, yeasts, and other microorganisms (natural products), chemically produced (for example, small molecules including peptidomimetics), or produced by genetic engineering.
  • Another object of the present invention are methods for modulating the CD3 ⁇ and Nck interaction by means of gene manipulation that allow blocking of the protein-protein interaction of CD3 ⁇ and Nck and therefore the implantation of new gene therapy treatments for diseases in which it is necessary to block the activation of T lymphocytes such as, among others, autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, multiple sclerosis, type I diabetes and myasthenia gravis, allergic-type diseases, in the treatment and prevention of transplant rejection and treatment of T lymphocyte lymphomas.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, lupus erythematosus, multiple sclerosis, type I diabetes and myasthenia gravis, allergic-type diseases, in the treatment and prevention of transplant rejection and treatment of T lymphocyte lymphomas.
  • a specific object of the present invention is a treatment of gene therapy of diseases that occur with an activation of T lymphocytes characterized in that the blocking of the CD3 ⁇ -Nck interaction is carried out, among others, by overexpression of the SH3.1 domain of Nck or by transduction with a specific antibody ⁇ fico (APA1 / 1).
  • a nucleotide encoding the SH3.1 domain of Nck, the Nck protein, its homologous forms, or any other peptide (fragment) that mimics said functional activity of interaction with the PRS domain of CD3 ⁇ is inserted into a suitable vector, by example a plasmid.
  • Nucleic acid can be genomic DNA, cDNA or RNA.
  • DNA or RNA can be isolated and integrated into a vector by standard methods known in the state of the art. Such methods are described, for example, in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory 1989).
  • Another specific object of the present invention are the nucleotides (DNA, RNA or cDNA) that encode human CD3 ⁇ and Nck proteins, their homologous forms or peptides (fragments) that mimic the biological activity of said proteins or their homologous forms and that they form part of any of the above methods of modulating the CD3 ⁇ and Nck interaction.
  • those vectors that comprise the above nucleotides as well as all those host cells that contain said vectors are part of the present invention.
  • Nck is recruited to CD3 ⁇ after binding of ligands to TCR.
  • A Nck binds to CD3 ⁇ but not to the other CD3 subunits. COS cells transfected with the indicated constructs were used and precipitation (pd) was performed with the GST-Nck fusion protein followed by immunoblotting with anti-Flag or anti-CD3 ⁇ antibodies. A fraction of the total lysate from each transfectant was hybridized with the corresponding antibody to demonstrate the presence of the protein.
  • B Nck is recruited to the TCR after stimulation of intact T lymphocytes. Jurkat cells were stimulated for 5 min (time 5) with 10 ⁇ g / ml of the anti-CD3 antibody UCHT1 or incubated without antibody (time 0).
  • the TCR was immunoprecipitated with the anti-CD3 ⁇ SP34 antibody and immunoblotting was performed with an anti-Nck antibody.
  • a fraction of the total lysate (TL) from unstimulated cells was run in parallel to indicate the position of Nck.
  • C Transfected Nck binds to endogenous TCR upon activation. Jurkat cells were transfected, or not transfected, with a vector expressing Nck ⁇ labeled with an HA epitope. Immunoprecipitation with UCHT1 and immunoblotting with anti-HA was performed. Proteins running below the HA-Nck ⁇ position (arrow) probably correspond to fragments of the antibodies used for stimulation and immunoprecipitation.
  • D Nck constitutively binds to immobilized CD3 ⁇ .
  • Nck ⁇ and Nck ⁇ can be associated with TCR. Sepharose bead-coupled GST-Nck ⁇ and GST-Nck ⁇ were used to precipitate the TCR of Used from Jurkat cells not stimulated or stimulated with UCHT1.
  • D Identification of the TCR binding site in Nck. The indicated GST fusion proteins were used to precipitate the TCR, revealed by immunoblot with anti-CD3 ⁇ antibody. Nck ⁇ trn is a Nck mutant lacking the SH2 domain.
  • TCR to Nck Binding of TCR to Nck is independent of tyrosine kinase activity.
  • GST-SH3.1 was used to precipitate the TCR from Jurkat cells stimulated for 5 min with UCHTl, stimulated with pervanadate (PV) or not stimulated.
  • An immunoblot was performed with the anti-CD3 ⁇ antibody (upper left panel).
  • immunoprecipitation and immunoblotting with the anti-phosphotyrosine antibody 4G10 was performed from the same Usages (lower left panel).
  • the purified TCR was subsequently incubated with 50 ng / ml of the UCHT1 stimulating antibody, and subsequently with 1 ⁇ g / ml of the anti-CD3 ⁇ APA1 / 1 antibody or with 1 ⁇ g / ml of the control anti-CD3 ⁇ APA1 / 2 antibody before precipitation of the TCR with GST-SH3.1.
  • a monovalent Fab fragment of the anti-TCR stimulating antibody induces the conformational change in the TCR that promotes Nck binding.
  • TCR purified from 31.13 scV ⁇ 3 cells was incubated with 50 ng / ml UCHtl or 50 ng / ml of its Fab fragment before precipitation with GST-SH3.1.
  • C Model of T cell activation by the TCR. The binding of the antigen / MHC to the variable regions of the TCR ⁇ / ⁇ heterodimer promotes both aggregation and a conformational change in the TCR.
  • TCR aggregation would be necessary for activation of TCR-associated Lk and Fyn kinases from the src family, which subsequently phosphorylate ITAMs.
  • a conformational change occurs in the cytoplasmic stems of the CD3 subunits resulting in exposure of the proline-rich sequence of CD3 ⁇ (indicated as a P in the Figure) and in Nck recruitment.
  • Located at a second level would be the recruitment of ZAP70 tyrosine kinase and other signaling molecules to phosphorylated ITAMs and the recruitment of WASP, WD ?, SLP76 and Pak to Nck.
  • NcK ⁇ an adapter protein involved in the regulation of the actin cytoskeleton promoted by receptor binding (Buday, 1999; Li and She, 2000; Myung et al, 2000), interacts with the cytoplasmic stem of CD3 ⁇ specifically and that this interaction induces a modification in the TCR receptor that allows the binding of the entire TCR complex to Nck and, therefore, the activation of T lymphocytes.
  • this interaction also occurs in different types of T lymphocytes after being stimulated: Jurkat human T lymphocyte cell line,
  • the regions involved in both proteins, NcK and CD3 ⁇ have been identified at the molecular level in said interaction.
  • a proline-rich sequence (PRS) of the cytoplasmic domain of CD3 ⁇ has been identified, which is absent in the other CD3 subunits, and which has been identified in the present invention as being present within the region of CD3 ⁇ deleted in the mutants 9 and 10 ( Figure 2C) (SEQ ID NO 1) as directly related to the interaction with NcK ⁇ (Example 2).
  • the amino-terminal SH3 domain (SH3-1) of NcK ⁇ SEQ ID NO 2 has been identified as the region of this protein involved in interaction with CD3 ⁇ (Example 2). It should be noted that two human genes corresponding to NcK have been described that share 67% homology (Buday, 1997).
  • PRS-SH3 made it difficult to explain how Nck recruitment to TCR could be inducible. Since the PRS in CD3 ⁇ is located near ITAM, one possible explanation was that tyrosine phosphorylation in some way influenced the accessibility of PRS to Nck. However, in the present invention it could be concluded that the change in TCR after binding of Nck to TCR is independent of PTK activity and precedes ITAM phosphorylation in tyrosine (Example 3).
  • the characterization of the NcK-CD3 ⁇ interaction described for the first time in the present invention identifies NcK as an immediate effector of the TCR framed in the following model:
  • the binding of the antigen / MHC to the variable regions of the TCR ⁇ / ⁇ heterodimer promotes at the same time the aggregation and a conformational change in the TCR.
  • TCR aggregation would be necessary for activation of TCR-associated Lk and Fyn kinases from the src family, which subsequently phosphorylate ITAMs.
  • a conformational change occurs in the stems cytoplasmic subunits of CD3 resulting in exposure of the proline-rich sequence of CD3 ⁇ (indicated as a P in Figure 4C) and in Nck recruitment.
  • Located at a second level would be the recruitment of ZAP70 tyrosine kinase and other signaling molecules to the phosphorylated ITAMs.
  • Also at this level would be the recruitment to Nck of other proteins through domains other than SH3.1. These proteins are: WASP (third domain SH3), WD? (second SH3 domain), SLP76 (SH2 domain) and Pakl (second SH3 domain) (Buday, 1999; Li and She, 2000). Therefore, Nck has the potential to simultaneously bind to TCR and other important proteins involved in actin cytoskeleton polymerization and signal transduction, and thus can become a modulating site for T cell activation.
  • Example 1 Nck binds to CD3 ⁇ after the interaction of the TCR with its ligands.
  • yeast two-hybrid system based on recruitment of
  • Nck ⁇ interacts with the cytoplasmic stem of CD3 ⁇ .
  • Nck ⁇ specifically bound to a bait construct consisting of two tandem copies of the cytoplasmic stem of CD3 ⁇ , and also to a single copy (Table 1).
  • a GST-Nck ⁇ fusion protein to precipitate from Used COS cells transfected with the different CD3 subunits.
  • GST-Nck ⁇ bound CD3 ⁇ but not CD3 ⁇ , nor CD3 ⁇ , nor CD3 ⁇ , indicating that CD3 ⁇ is the only subunit of the CD3 complex that interacts with Nck ⁇ ( Figure 1A).
  • Nck and CD3 ⁇ interact in T lymphocytes
  • immunoprecipitation with anti-CD3 ⁇ was performed from the human T cell line Jurkat, followed by immunoblotting with anti-Nck (Figure IB).
  • Nck was co-precipitated together with CD3 ⁇ from Jurkat cells stimulated with the anti-CD3 antibody UCHTl for 5 min, but not from unstimulated cells.
  • the protein band detected by blot represents Nck
  • Jurkat cells were transiently transfected with Nck ⁇ labeled with an HA epitope (Figure 1C). Immunoblotting with anti-HA confirmed the presence of Nck ⁇ in CD3 ⁇ immunoprecipitates only when starting from cells transfected with HA-Nck ⁇ ( Figure 1C).
  • CD3 ⁇ of TCR stimulation a series of precipitation experiments were performed to identify the responsible regions in both CD3 ⁇ and Nck.
  • a set of deletion mutants comprising the entire cytoplasmic region of CD3 ⁇ ( Figure 2A) was transfected into COS cells. After metabolic labeling with 35 S-methionine, cells were used and GST-Nck ⁇ was used for precipitation assays.
  • Nck ⁇ interacts with wild-type CD3 ⁇ and also with mutants 7, 8, 11, and 12 but not with mutants 9 and 10 ( Figure 2B, upper panel).
  • a proline-rich sequence (PRS) that is absent in the other CD3 subunits, is contained within the CD3 ⁇ region deleted in mutants 9 and 10 ( Figure 2A). Deletion of this sequence prevents binding to Nck.
  • Nck Two human genes corresponding to Nck have been described that share 67% homology (Buday, 1999). These have an identical organization in three SH3 domains and one C-terminal SH2 domain.
  • Nck ⁇ the form we initially identified in the two-hybrid assay was Nck ⁇
  • the two forms bind comparably to TCR as demonstrated in precipitation experiments with GST-Nck ⁇ and GST-Nck ⁇ ( Figure 2C). Consequently, constructs of all or part of Nck ⁇ and Nck ⁇ were used interchangeably for the following experiments. Since Nck contains three SH3 domains, it seemed feasible that the Nck-CD3 ⁇ interaction was mediated by the binding of one or more of these SH3 domains to the CD3 ⁇ PRS.
  • Example 3. The change in the TCR that promotes its binding to Nck occurs before and independently of protein phosphorylation in tyrosine.
  • Nck-TCR binding is mediated by a SH3 domain suggests that binding of a ligand (antibody or antigen) to TCR promotes a conformational change that results in CD3 ⁇ PRS exposure.
  • a cell-free assay was performed from extracts of Jurkat cells transfected with the Fv (single inoglobulin chain) fragment attached to the N-terminus of TCR ⁇ . The Fv fragment that we used recognizes the NP and NIP haptens.
  • Example 5 The recruitment of Nck to the TCR is required for the activation of T lymphocytes.
  • Clones expressing EGFP alone or a fusion protein consisting of complete Nck bound to EGFP were also selected. It has been previously described that stimulation of Jurkat cells on anti-CD3 coated coverslips results in their extension and deployment in a few minutes, forming an F-actin ring that borders the periphery of the cells (Borroto et al., 2000; Bunnell et al., 2001). Since Nck is postulated to have a role in the rearrangement of the actin cytoskeleton (Buday, 1999), we performed a deployment test to test the effect of SH3.1 overexpression. Cells stably transfected with SH3.1-EGFP were less deployed and their actin cytoskeleton less polymerized than in cells expressing EGFP ( Figure 5A). It is notable that although the level of expression of Nck-EGFP was lower than that of EGFP and SH3.1-EGFP (data not shown), there was a clear enhancement of cell deployment.
  • the second approach consisted of transduction of T lymphocytes with the APA1 / 1 antibody, capable of blocking the Nck-CD3 ⁇ interaction by binding to PRS in CD3 ⁇ (Borroto et al, 1998).
  • Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy human donors were transduced with fluorescein-labeled APA 1/1. While anti-CD3 stimulation induced TCR to Nck association in non-transduced PBMC, the interaction was inhibited in APA1 / 1 transduced cells, suggesting that APA1 / 1 was blocking CD3 ⁇ PRS (Figure 5F).
  • Example 6 The overexpression of the Nck SH3.1 domain inhibits the formation of conjugates between T lymphocytes and APC and the maturation of the immune synapse.
  • T lymphocytes we analyzed the formation of T: APC conjugates.
  • TCR-induced signals increase integrin-mediated adhesion in a process dependent on the polymerization of the actin cytoskeleton (Dustin and Cooper, 2000). Since overexpression of the Nck SH3.1 domain inhibits TCR-stimulated induced actin polymerization, we predicted that conjugate formation would also be affected. This was confirmed in an experiment where Jurkat cells were stimulated with Raji APC loaded with SEE superantigen. Incubation with SEE produced a considerable increase in conjugate formation between Raji cells and the EGFP transfected Jurkat cell clone but not with the SH3.1 -EGFP transfected clone ( Figure 6A).
  • the human cell line of origin T named Jurkat was maintained in RPMI culture medium supplemented with fetal bovine serum (FBS, Sigma), 10%.
  • the COS7 monkey cell line was maintained in DMEM medium supplemented with 5% FBS.
  • the Jurkat line lacking the TCR ⁇ 31.13 chain was kindly provided by Dr. A. Alcover (Institut Pasteur, Paris).
  • the flag-CD3 ⁇ clone was obtained by stable transfection of the expression plasmid pSR ⁇ -FlagCD3 ⁇ in the Jurkat line.
  • the clones named EGFP, Nck-EGFP and SH3.1-EGFP were obtained by stable transfection of the corresponding expression vectors in a Jurkat line named J77clon20 (Niedergang et al., 1997).
  • the 31.13 scV ⁇ 3 clone was obtained by transfection of the expression vector for fusion of the V ⁇ 3 chain fused with the single chain Fv.
  • the Fv chain used is a derivative of the antibody against the hapten 3-nitro-4hydroxyphenylacetate Bl-8 (Reth et al., 1978).
  • Thymus and spleen cells were isolated from transgenic mice with an AND-type TCR (Rag2 - / -) (Kaye et al., 1992) or from BL6 mice. As presenting cells they they used the DCEKs (Kuhlmam et al., 1991).
  • the cd25h yeast strain was provided by Stratagene.
  • Plasmids.- The SOS ⁇ fusion protein was obtained by inserting the coding fragment by the cytoplasmic domain of human CD3 ⁇ into the yeast expression vector pSOS (Stratagene).
  • the vector pSOS ⁇ tandem encodes the fusion of the SOS protein with two copies of the human tail-directed cytoplasmic domain of human CD3 ⁇ .
  • Vectors encoding the control fusion proteins p SOS-MafB, pMyr-MafB, and pMyr-LamC were provided by Stratagene.
  • PCR fragments corresponding to the complete molecule or to a deletion of the amino terminal SH2 domain were obtained starting from the human Nck ⁇ gene.
  • the Ig- ⁇ immunoglobulin leader sequence including the signal for peptidase cleavage and the Flag epitope, was amplified by PCR from the vector pEVmb-INneo (Schamel and Reth, 2000). The resulting fragment replaced the human leader sequence in the human CD3 chains in obtaining the expression vectors pSR ⁇ Flag-CD3 ⁇ , -CD3 ⁇ and -CD3 ⁇ . Cytoplasmic deletions of the human CD3 ⁇ chain were generated by a PCR-based mutagenesis method as previously described (Mallabiabarrena et al., 1992).
  • the PCR products encoding the complete human Nck ⁇ protein and its first SH3 domain were cloned into the mammalian expression vector pEFGPNl (Clontech), to obtain the Nck-EGFP and SH3.1-EGFP fusion proteins.
  • Antibodies and Reagents. The mouse antibodies APA1 / 1, SP34 and APA1 / 2, which recognize the cytoplasmic portion of human CD3 ⁇ , the extracellular portion of human CD3 ⁇ and the cytoplasmic tail of CD3 ⁇ respectively have been previously described (Alarcón et al.
  • the rabbit anti-Nck antibody which recognizes both Nck ⁇ and Nck ⁇ , was obtained from the Pharmingen house, the mouse anti-phosphotyrosine monoclonal antibody, 4G10, from Upstate Biotechnology, the mouse anti-HA monoclonal antibody, 12CA5, from Boehringer Manriheim and Sigma's anti-Flag mouse monoclonal antibody, M2.
  • Staphylococcus aureus A and E enterotoxins, SEE and SEA were purchased from Toxin Technologies.
  • the Src family tyrosine kinase inhibitor, PP2 was purchased from Calbiochem.
  • the TCR AND specific antigenic peptide, PCC corresponding to amino acids 88-100 of pigeon cytochrome C, was synthesized by the method of N - (- 9-fluorenyl) methoxycarbonyl, (Fmoc), and purified by HPLC. All the culture media, amino acids and sugars necessary for the growth and transformation of the yeasts were purchased from Sigma and Merck.
  • Precipitation was then carried out under the same conditions for at least 4 hours or at most overnight.
  • the precipitates were washed 3 to 5 times with the cell lysis buffer (Brij 96 0.3%, 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.8, lOmM Iodoacetamide, lmM phenylmethylsulfonylfluoride, 1 ⁇ g / ml aproptinin, 1 ⁇ g / ml leupeptin, 1mM sodium orthovanadate and 20mM sodium fluoride).
  • the precipitates were subjected to SDS-PAGE and transfer to nitrocellulose filters (BioRad).
  • Treatment with the Src family tyrosine kinase inhibitor carried out during some stimulations consisted of pre-incubating the cells before stimulation for 30 minutes with the drug PP2 at a concentration of 20 ⁇ M, which was maintained afterwards during stimulation. Stimulations of less than 1 minute in duration were performed differently.
  • the cell suspension was concentrated by reducing its volume to half ml and was added already tempered at 37 ° C on an eppendorf with the 10 ⁇ g of stimulating antibody also tempered.
  • the lysis buffer was prepared at double the final concentration of use and kept on ice in aliquots of half ml during the stimulation to immediately add the stimulated cells. After lysis, postnuclear fractions were obtained that were subjected to previously described immunoprecipitation protocols (Alarcón et al., 1991).
  • TCR-CD3 complex The purification of the modified TCR-CD3 complex from the stable clone 31.13 was v ⁇ 3 with NP-sepharose and elution with NIP buffer was carried out as previously described (Schamel and Reth, 2000). Antibody transduction.- In order to introduce the APA1 / 1- Fitc and HP26-Fitc antibodies into living cells, the Gene Therapy Systems system called Bioporter Reagent was used. In-house specifications were followed, using the antibodies at a concentration of 250 ⁇ g / ml. The cells used were PBMCs isolated from healthy donor with Ficoll Hypaque (Rafer) and 2 ⁇ l of the reagent was used for every 2 x 10 6 cells.
  • Human Thl / Th2 Cytokine Cytometric Bead Assay kit Human Thl / Th2 Cytokine Cytometric Bead Assay kit.
  • Jurkat cells were stimulated on wells of p96 culture plates, treated with the anti-CD3 antibody UCHTl for 24 hours, and the supernatants were analyzed with the kit.
  • the cells were stimulated with Raji presenter cells loaded 30 minutes previously with SEE in different doses, in a 1: 1 ratio.
  • PBMCs (1 x 10 5 per dot) were seeded in p96 wells, treated with the anti-CD3 antibody UCHTl, at different doses, for 24 hours . Then 1 ⁇ Ci of [ 3 H] thymidine (Amersham) per well was added and the incorporation of this metabolite was measured 24 hours later.
  • CM-TMR loaded Raji cells (5mM for 20 min at 37 ° C) were added onto the chamber. Confocal images were acquired using a Leica TCS-SP confocal laser unit. Serial immunofluorescence and DIC images were obtained simultaneously at the indicated times. The most representative optical section of the green channel (EGFP, J77 cells), its corresponding DIC image (cell morphology) and the image of the red channel (CM-TMR, Raji cells) were superimposed to form a single image.
  • CD3 -gamma and CD3 -delta subunits of the T cell antigen receptor can be expressed within distinct functional TCR / CD3 complexes.
  • T cell receptor / CD3 complex a dynamic protein ensemble.
  • Laczko I., Hollosi, M., Vass, E., Hegedus, Z., Monostori, E., and Toth, G. K. (1998).
  • the SH2 and SH3 adapter Nck a two-gene family and a linker between tyrosine kinases and multiple signaling networks. Histol Histopathol 75, 947-55.
  • Tyrosine phosphorylation of Pyk2 is selectively regulated by Fyn during TCR signaling. J Exp Med 755, 1253-9.
  • Oligomeric antigen receptors a new view on signaling for the selection of lymphocytes. Trends Immunol 22, 356-60.
  • TCR / CD3 complex CD3 epsilon / delta and CD3 epsilon / gamma dimers associate indistinctly with both TCR alpha and TCR beta chains.

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Abstract

En la presente invención se proporciona el mecanismo molecular de la activación de los linfocitos T que tiene lugar en las reacciones inflamatorias o inmunitarias tras la activación a partir de la unión de antígeno/MHC al receptor de antígeno de TCR, demostrándose el papel clave de la interacción específica entre determinados dominios de las proteínas CD3ε y Nck en la modulación de la transmisión de señales que tiene lugar en dicha activación de los linfocitos. La presente invención proporciona procedimientos para la modulación de la activación de linfocitos T mediante procedimientos que permitan la alteración de la interacción proteína-proteína de CD3ε y Nck.

Description

NUEVA ESTRATEGIA MODULADORA DE LA ACTIVACIÓN DE LOS LINFOCITOS T BASADA EN LA REGULACIÓN DE LA INTERACCIÓN CD3ε- Nck
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se refiere al sistema inmunitario y más concretamente al desarrollo de tratamientos reguladores de la respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T en procesos patológicos. El desarrollo de estos métodos se basa en la posibilidad de identificación de nuevos agentes reguladores de la función del receptor de antígeno de los linfocitos T (TCR) y en el uso de nuevas estrategias de terapia génica moduladoras de la transmisión de señales intracelulares a partir de dicho TCR.
ESTADO DE LA TÉCNICA Las células responden a estímulos extracelulares por medio de receptores que atraviesan la membrana plasmática. Aunque algunos receptores constituyen canales que permiten el paso de iones al citoplasma, la mayoría de receptores no transmiten material a través de la membrana y dependen de la interacción con moléculas efectoras intracelulares para activar rutas de transmisión de señales. En estos casos, tras la unión de ligando, los receptores de superficie inician cascadas de señalización dentro de las células bien tras sufrir un cambio conformacional, bien tras formar agregados (Bachmann and Ohashi, 1999; Cochran et al., 2001 ; Jiang and Hunter, 1999; Reth, 2001 ; Stoddard et al., 1992; Weiss and Schlessinger, 1998).
El receptor para antígeno de los linfocitos T (TCR) es responsable del reconocimiento de antígenos específicos unidos al complejo principal de histocompatibilidad (MHC) presente en las así llamadas, células presentadoras de antígeno (APC). En la interfase linfocito T: APC, las dos membranas forman una estructura que se conoce como sinapsis inmunitaria (IS) (revisado en (Bromley et al., 2001 ; Dustin et al, 1998). El TCR se concentra en la IS formando un agregado supramolecular de activación (SMAC) rodeado por un anillo de moléculas de adhesión (Monks et al, 1998). La formación de la IS requiere de señales del TCR así como del reordenamiento del citoesqueleto de actina y se cree que es necesaria para que el TCR dé una señal sostenida que lleve a activación de los linfocitos T. El TCR se compone de un heterodímero TCRα/β (ó TCRγ/δ en los linfocitos T γδ) unido a un conjunto de cuatro polipéptidos organizados en dímeros: los heterodímeros CD3γ-CD3ε y CD3δ-CD3ε y el homodímero CD3ζ-CD3ζ (Clevers et al., 1988). TCRα/β reconoce al complejo antígeno/MHC y de alguna forma transmite esta información a los componentes CD3. Todas las subunidades del TCR son proteínas de membrana de tipo I, pero al contrario que el heterodímero TCRα/β, los componentes CD3 tienen tallos citoplásmicos que pueden interaccionar con moléculas de transmisión de señales intracelulares. Las subunidades de CD3 tienen cada una uno (CD3γ, CD3δ y CD3ε) ó tres (CD3ζ) motivos de tirosina y leucina, llamados motivos de activación basados en tirosina presentes en los inmunoreceptores (ITAM) (Reth, 1989). Una vez que son fosforilados por las tirosina quinasas de la familia src, los residuos de tirosina dentro de estos motivos se convierten en sitios de unión para proteínas con dominios de homología a src de tipo 2 (SH2), tales como la tirosina quinasa ZAP70 (revisado en (Kane et al., 2000; Lin and Weiss, 2001; Qian et al., 1997). Se cree que la fosforilación de los ITAM constituye el suceso de activación más temprano que ocurre tras la unión del ligando al TCR. De otro lado, aunque todo el tallo citoplásmico de las subunidades de CD3 se ha conservado a lo largo de la evolución, hasta la fecha no se ha descrito ningún papel en activación para las secuencias situadas fuera de los ITAM.
Varios son los métodos descritos para regular la función de los linfocitos. Dado que los linfocitos T desempeñan un papel fundamental en la regulación de la respuesta inmunitaria, el uso de fármacos que bloquean la activación de los linfocitos T se ha hecho deseable para la prevención del rechazo de alotransplantes de órganos y para el control de enfermedades de etiología autoinmune: artritis reumatoide, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, miastenia gravis, por citar algunas, y de tipo alérgico. Por otro lado, es conveniente también el control de la expansión de los linfocitos T en el caso de los linfomas de células T.
Actualmente, los fármacos más ampliamente usados para la prevención del rechazo de alotransplantes son la ciclosporina A y el FK506; ambos inhibidores de la serin fosfatasa calcineurina. Sin embargo, el uso crónico de ambos inhibidores plantea serios problemas de nefrotoxicidad y neurotoxicidad, posiblemente debidos a que la calcineurina, si bien juega un papel fundamental en la activación de los linfocitos T, se expresa en otros tejidos donde también desempeña funciones importantes. También se está utilizando una terapia inmunosupresora basada en el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales anti- linfocito. Estos tratamientos han demostrado eficacia en la prevención del rechazo de órganos pero adolecen también de problemas de toxicidad y de generación en el paciente de mecanismos de resistencia al tratamiento que impiden su uso crónico. Por todo esto, se hace necesario el descubrimiento de nuevos agentes que permitan una inhibición selectiva de la activación de los linfocitos T y que por lo tanto no interfieran con las funciones de otros tejidos. Las rutas de activación específicas de linfocitos T pueden constituirse en perfectas dianas para nuevos y selectivos agentes y terapias inmunosupresoras. Por otro lado, las terapias actuales de estimulación de los linfocitos T (en infecciones y tumores) son a menudo insuficientes para inducir una adecuada respuesta inmune por lo que nuevas estrategias permitirían ampliar la eficacia de dichos tratamientos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Definiciones: a) Formas homologas de las proteínas Nck y CD3ε, tal como se utiliza en la presente invención viene indicar a todas aquellas proteínas que, con respecto a éstas e independientemente de su origen, presentan una homología de al menos, un 30%, preferentemente de al menos un 85%, ó más preferentemente de, al menos, un 95%. b) Nck, la proteína NcK tal como se utiliza como referencia general en la presente invención viene a indicar indistintamente a la proteína NcKα como a la proteína NcKβ.
En la presente invención se proporciona la evidencia del mecanismo molecular de la activación de los linfocitos T que tiene lugar en las reacciones inflamatorias o inmunitarias tras la activación a partir de la unión de antígeno/MHC al receptor de antígeno de TCR, demostrándose el papel clave de la interacción específica entre determinados dominios de las proteínas CD3ε y Nck en la modulación de la transmisión de señales que tiene lugar en dicha activación de los linfocitos.
La presente invención proporciona procedimientos para la modulación de la activación de linfocitos T inflamatoria o inmunitaria dependiente de la interacción CD3ε y Nck mediante procedimientos que permitan la alteración de la interacción proteína- proteína de CD3ε y Nck.
Un objeto específico de la presente invención es la modulación de dicha interacción CD3ε-Nck mediante el uso de sustancias químicas que alteran dicha interacción. En el caso que dichas sustancias químicas bloqueen la interacción CD3ε-Nck se identificarán como sustancias inhibidoras (antagonistas) de la respuesta inmunitaria o inflamatoria, mientras que si activan (agonistas) dicha interacción CD3ε-Nck se identificarán sustancias activadoras de dichas respuesta inmunitaria o inflamatoria. Un objeto específico de la presente invención es el uso de dichas sustancias antagonistas de la activación de los linfocitos T en protocolos de tratamiento de enfermedades que cursan con una activación patológica de los linfocitos T como son, entre otras, enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes tipo I y miastenia gravis; enfermedades de tipo alérgico; en la prevención y en el tratamiento del rechazo de transplantes y linfomas de linfocitos T. Un objeto especifico de la presente invención es el uso de dichas sustancias agonistas de la activación de los linfocitos T en protocolos de tratamiento de enfermedades que cursan con una inhibición de los linfocitos T como son, entre otras, enfermedades infecciosas, bacterianas y virales entre otras, y tumorales.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para la identificación de dichas sustancias agonistas y antagonistas de la función celular de la interacción proteína- proteína CD3ε-Nck que puede producirse en procesos fisiológicos y patológicos, entre otros, tipo inflamatorios, autoinmunitarios, alérgicos, infecciosos y tumorales. Un objeto específico de la presente invención es un procedimiento para la identificación de agonistas y antagonistas de la activación de los linfocitos T mediada por la interacción de las proteínas CD3ε-Nck que comprende los siguientes pasos: a) generar una preparación biológica de la interacción proteína-proteína que mimetize la interacción CD3ε-Nck, b) añadir el compuesto químico candidato agonista ó antagonista, y c) determinar el bloqueo o activación de la interacción proteína-proteína CD3ε-Nck, identificándose en caso de bloqueo un antagonista de la interacción CD3ε-Nck y en caso de activación un agonista de la interacción
CD3ε-Nck.
Otro objeto de la presente invención es el anterior procedimiento de identificación de agonistas y antagonistas de la interacción CD3ε-Nck caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck se realiza utilizando las proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos
(fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas. Otro objeto específico de la presente invención es un péptido que mimetiza la actividad biológica de NcK de unión a CD3ε caracterizado por la secuencia de aminoácidos del dominio SH3.1 de NcKβ (SEQ ID NO2). Otro objeto específico de la presente invención es un péptido que mimetiza la actividad biológica de NcK de unión a CD3ε caracterizado por la secuencia de aminoácidos del dominio SH3.1 de NcKα (SEQ ID NO3) como elemento de dicha preparación biológica. Otro objeto específico de la presente invención es un péptido que mimetiza la actividad biológica de CD3ε de unión a Nck caracterizado por la secuencia de aminoácidos de la región rica de prolinas (PRS) de CD3ε descrita en la presente invención (SEQ ID NO1) como elemento de dicha preparación biológica. Otro objeto de la presente invención es una proteína de fusión que comprende, además de la secuencia de aminoácidos de las proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos (fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas, otras secuencias de aminoácidos que facilitan la posterior determinación de la alteración de la interacción CD3ε-Nck como elemento de dicha preparación biológica (entre otros y como ejemplo: GST-SH3.1, SH3.1-EGFP, Nck- EGFP y HA-Nck). Otro objeto de la presente invención es el anterior procedimiento de identificación de agonistas y antagonistas de la interacción CD3ε-Nck caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck se realiza utilizando las proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos (fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas provenientes de usados celulares o a partir de preparaciones de proteínas purificadas o semipurificadas.
Otro objeto específico de la presente invención es un procedimiento de identificación de agonistas y antagonistas de la interacción CD3ε-Nck caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck se realiza en un entorno libre de células (entre otras posibilidades, los ensayos de inmunoprecipitación realizados en el ejemplo 1 y el ensayo de estimulación del TCR purificado con el anticuerpo anti-CD3 UCHT1 y posterior bloqueo con el anticuerpo APAl/1, ver ejemplo 4). Los complejos proteína-proteína que mimetizan la interacción CD3ε -Nck y que forman parte del procedimiento de identificación de agonistas y antagonistas de la interacción CD3ε-Nck pueden ser identificados y cuantificados mediante una amplia gama de técnicas de mareaje de proteínas, entre otras, mediante técnicas inmunológicas, tal como se realiza en la presente invención (anti-Flag y anti HA).
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento de identificación de agonistas y antagonistas de la interacción CD3ε-Nck caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck se realiza en un entorno celular, entre otras posibilidades: a) ensayo funcional de cuantificación de extensión y despliegue celular, polimerización del citoesqueleto de actina, (ver ejemplo 5), b) ensayo funcional de cuantificación de secreción de citoquinas, IL-2 y TNFα (ver ejemplo 5), c) ensayo funcional de cuantificación de la proliferación celular (ver ejemplo 5), d) ensayo funcional de cuantificación de la formación de conjugados entre linfocitos y células APC (ver ejemplo 6), y e) Ensayo funcional de cuantificación de la maduración de la IS (ver ejemplo 6). Otro objeto de la presente invención es un procedimiento de identificación de agonistas y antagonistas de la interacción CD3ε-Nck caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck se realiza en un entorno celular, consistente en un ensayo de dos híbridos (trap assay) (para ver una descripción más detallada de este tipo de ensayo asícomo otros ejemplos de ensayos dirigidos a la identificación de compuestos moduladores de interacciones entre proteínas véase: United States Patent 6.037.136 Beach, et al., March 14, 2000 Interactions between RaF proto- oncogenes and CDC25 phosphatases, and uses related thereto y United States Patent 5.723.436 Huang, et al, March 3, 1998 Calcineurin interacting protein compositions and methods). Otro objeto de la presente invención es el anterior procedimiento de identificación de agonistas y antagonistas de la interacción CD3ε-Nck caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck y la determinación del bloqueo o activación de dicha interacción tras la adición de un candidato agonista o antagonista se realiza en una situación basal o de control, de estimulación (anti-CD3 y células APC cargadas con superantígeno ó antígeno, entre otros) o de bloqueo (sobreexpresión de SH3.1 de Nck y transducción del anticuerpo APA1/1, entre otros) de dicha interacción según el interés en identificar uno u otro agente. Así, un ejemplo concreto de un ensayo para identificar un posible antagonista de la interacción Nck-CD3ε podría consistir en los ensayos realizados en el ejemplo 5 ó 6 de la presente invención en donde un antagonista produciría un bloqueo de la activación obtenida tras la estimulación del complejo TCR ya fuera con el anticuerpo anti CD3 UCHT1 o con APC cargadas con SEE tanto en la situación control (EGFP) como en el caso de células transfectadas con Nck-EGFP. Y un ejemplo concreto de un ensayo para identificar un agonista de la interacción Nck-CD3ε podría consistir en los ensayos realizados en el ejemplo 6 de la presente invención en donde un agonista produciría una reversión del bloqueo del complejo TCR obtenido por la sobreexpresión del dominio SH3.1 de Nck tanto en la situación de control (EGFP) como en el caso de células transfectadas con Nck-EGFP. Finalmente, existen otros muchos tipos de ensayos, y que con la información suministrada por la presente patente, pueden ser aplicables gracias al conocimiento existente en el estado del arte y forman parte de la presente invención. Los compuestos químicos candidatos a ser probados como moduladores de la interacción CD3ε -Nck pueden ser producidos, por ejemplo, por bacterias, levaduras y otros microorganismos (productos naturales), producidos químicamente (por ejemplo, moléculas de pequeño tamaño incluyendo peptidomiméticos), o producidos por ingeniería genética.
Otro objeto de la presente invención son métodos para la modulación de la interacción CD3ε y Nck mediante manipulación génica que permiten el bloqueo de la interacción proteína-proteína de CD3ε y Nck y por tanto la implantación de nuevos tratamientos de terapia génica de enfermedades en las que sea necesario bloquear la activación de linfocitos T como, entre otras, enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes tipo I y miastenia gravis, enfermedades de tipo alérgico, en el tratamiento y prevención del rechazo de transplantes y el tratamiento de linfomas de linfocitos T. Así, un objeto específico de la presente invención es un tratamiento de terapia génica de enfermedades que cursan con una activación de los linfocitos T caracterizado porque el bloqueo de la interacción CD3ε-Nck se realiza, entre otros posibles, mediante la sobreexpresión del dominio SH3.1 de Nck o por transducción con un anticuerpo específico (APA1/1). En este método, un nucleótido codificante del dominio SH3.1 de Nck, la proteína Nck, sus formas homologas o cualquier otro péptido (fragmento) que mimetize dicha actividad funcional de interacción con el dominio PRS de CD3ε se inserta en un vector adecuado, por ejemplo un plásmido. El ácido nucleico puede ser DNA genómico, cDNA o RNA. Dichos DNA o RNA pueden ser aislados e integrados en un vector por métodos estándares conocidos en el estado del arte. Dichos métodos están descritos, por ejemplo, en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory 1989). Otro objeto específico de la presente invención son los nucleótidos (DNA, RNA o cDNA) codificantes de proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos (fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas y que entren a formar parte de cualquiera de los anteriores métodos de modulación de la interacción CD3ε y Nck. Además, forma parte de la presente invención aquellos vectores que comprenden los anteriores nucleótidos asícomo todas aquellas células huésped que contengan dichos vectores.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Nck es reclutada a CD3ε tras la unión de ligandos al TCR. (A) Nck se une a CD3ε pero no a las otras subunidades CD3. Células COS transfectadas con las construcciones indicadas fueron Usadas y se realizó una precipitación (pd) con la proteína de fusión GST-Nck seguida de inmunotransferencia con anticuerpos anti-Flag ó anti-CD3ζ. Una fracción del lisado total de cada transfectante fue hibridada con el anticuerpo correspondiente para demostrar la presencia de la proteína. (B) Nck es reclutada al TCR tras la estimulación de linfocitos T intactos. Células Jurkat fueron estimuladas durante 5 min (tiempo 5) con 10 μg/ml del anticuerpo anti-CD3 UCHT1 o se incubaron sin anticuerpo (tiempo 0). El TCR fue inmunoprecipitado con el anticuerpo anti-CD3ε SP34 y se realizó inmunotransferencia con un anticuerpo anti-Nck. Una fracción del lisado total (TL) de células no estimuladas fue corrida en paralelo para indicar la posición de Nck. (C) Nck transfectada se une al TCR endógeno tras la activación. Células Jurkat fueron transfectadas, o no transfectadas, con un vector que expresa Nckβ marcado con un epítopo HA. Se realizó una inmunoprecipitación con UCHT1 e inmunotransferencia con anti-HA. Las proteínas que corren debajo de la posición de HA-Nckβ (flecha) corresponden probablemente a fragmentos de los anticuerpos usados para la estimulación e inmunoprecipitación. (D) Nck se une de forma constitutiva a CD3ε inmovilizado. Se realizó una precipitación con GSTε a partir de células Jurkat transfectadas con HA-Nckβ seguida de inmunotransferencia con anti-HA. (E) La estimulación del TCR con anticuerpos induce su asociación a Nck inmovilizado. Células Jurkat transfectadas con Flag-CD3ε fueron estimuladas con UCHTl . El TCR fue precipitado con GST-Nckβ y revelado por inmunotransferencia con anti-Flag y con anti-CD3ζ. Una precipitación con GST a partir de Usados de células estimuladas fue corrido en paralelo como control negativo. (F) La estimulación con anticuerpo promueve la unión del TCR a Nck en linfocitos T no transformados. PBMC (células mononucleares de sangre periférica ) humanas fueron estimuladas con UCHTl y la unión del TCR a Nck fue demostrada después de una precipitación con GST-Nckβ e inmunotransferencia con anti-CD3ζ. (G) La estimulación con antígeno promueve el reclutamiento de Nck al TCR en linfocitos T aislados de timo y de bazo de ratón. Timocitos y células de bazo de ratones transgénicos para el TCR AND fueron estimulados (+) con DCEK APC previamente cargadas con antígeno PCC. Se realizó una inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-TCRβ H57 e inmunotransferencia con anti-Nck. El filtro fue posteriormente re-hibridado con anti-CD3ζ como control de carga. Figura 2.- El dominio SH3 amino-terminal de Nck se une a la secuencia rica en prolinas de CD3ε.
(A) Mapa de las deleciones realizadas en el tallo citoplásmico de CD3ε humano. Comparación de la secuencia de aminoácidos del tallo citoplásmico de la cadena CD3ε de diferentes especies. Los aminoácidos conservados son mostrados en tipo normal mientras que los no conservados se muestran en gris. Los aminoácidos correspondientes al PRS o al ITAM se muestran en negrita. Las secuencias delecionadas en los mutantes de CD3ε humano están indicadas con una línea discontinua y el número correspondiente. (B) Caracterización de la secuencia de unión a Nck en CD3ε. Las células COS fueron transfectadas con CD3ε de tipo silvestre (wt) o con los mutantes de deleción indicados (d7 a di 6) o se dejaron sin transfectar (nt). Se realizó una precipitación con GST-Nckβ tras marcar las células con 35S-metionina. Se muestran imágenes de Phosphorimager (paneles superiores). Se realizó una inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-CD3ε SP34 como control de la transfección (paneles inferiores). (C) Nckα y Nckβ se pueden asociar al TCR. Se usaron GST-Nckα y GST-Nckβ acoplados a bolitas de Sefarosa para precipitar el TCR de Usados de células Jurkat no estimuladas o estimuladas con UCHTl . (D) Identificación del sitio de unión al TCR en Nck. Las proteínas de fusión a GST indicadas fueron usadas para precipitar el TCR, revelado por inmunotransferencia con anticuerpo anti-CD3ζ. Nckβtrn es un mutante de Nck carente del dominio SH2.
Figura 3.- La inducción de la unión del TCR a Nck es independiente de la activación de tirosina quinasas y ocurre antes de que la fosforilación de proteínas en tirosina sea detectada.
(A) La unión del TCR a Nck es independiente de la actividad tirosina quinasa. Se utilizó GST-SH3.1 para precipitar el TCR de células Jurkat estimuladas por 5 min con UCHTl, estimuladas con pervanadato (PV) o no estimuladas. Se realizó una inmunotransferencia con el anticuerpo anti-CD3ζ (panel superior izquierdo). Como control de la activación de tirosina quinasas, se realizó una inmunoprecipitación y una inmunotransferencia con el anticuerpo anti-fosfotirosina 4G10 a partir de los mismos Usados (panel inferior izquierdo). Para estudiar el efecto del inhibidor de tirosina quinasas PP2 en la interacción TCR-Nck, células Jurkat fueron estimuladas 5 min con UCHTl en presencia (5+PP2) o en ausencia (5) de 20 μM PP2, y la asociación TCR-Nck fue revelada como arriba (panel superior derecho). El efecto del tratamiento con PP2 en la actividad tirosina quinasa fue demostrado por inmunoprecipitación e inmunotransferencia con 4G10 (panel inferior derecho). (B) La unión del TCR a Nck es detectada antes que la fosforilación de proteínas en tirosina. Las células Jurkat fueron estimuladas con UCHTl por los tiempos indicados antes de hacer una precipitación con GST-Nckβ e inmunotransferencia con anti-CD3ζ (panel superior). La inmunoprecipitación e inmunotransferencia con 4G10 fue realizada en paralelo para mostrar las fosforilación en tirosina de proteínas totales (panel intermedio), mientras que la inmunoprecipitación con UCHTl y la inmunotransferencia con 4G10 se realizó para mostrar CD3ζ fosforilado en tirosina (panel inferior). (C) Dependencia de la temperatura de la unión del TCR a Nck. Células Jurkat fueron estimuladas con UCHTl por 5 min a las temperaturas indicadas y tratadas como arriba para mostrar la asociación del TCR a Nck (panel superior) y el nivel de fosforilación en tirosina de proteínas totales (panel inferior). Figura 4.- La unión de un anticuerpo estimulador al TCR purificado induce un cambio conformacional que permite la unión del TCR a Nck. (A) La estimulación de TCR con anticuerpo purificado induce la unión de CD3ε a Nck. El complejo TCR del clon 31.13 scVβ3 que expresa el TCR-Fv fue purificado en columnas de NP-Sefarosa y fue eluido con NJP libre. El TCR purificado fue incubado subsecuentemente con 50 ng/ml del anticuerpo estimulador UCHTl, y posteriormente con 1 μg/ml del anticuerpo anti-CD3ε APA1/1 o con 1 μg/ml del anticuerpo control anti-CD3δ APA1/2 antes de la precipitación del TCR con GST-SH3.1. (B) Un fragmento monovalente Fab del anticuerpo estimulador anti-TCR induce el cambio conformacional en el TCR que promueve la unión de Nck. El TCR purificado de las células 31.13 scVβ3 fue incubado con 50 ng/ml UCHtl ó 50 ng/ml de su fragmento Fab antes de la precipitación con GST-SH3.1. (C) Modelo de activación de linfocitos T por el TCR. La unión del antígeno/MHC a las regiones variables del heterodímero TCRα/β promueve a la vez la agregación y un cambio conformacional en el TCR. La agregación del TCR sería necesaria para la activación de las quinasas de la familia src asociadas al TCR, Lck y Fyn, las cuales fosforilan subsecuentemente a los ITAM. De forma independiente, se produce un cambio conformacional en los tallos citoplásmicos de las subunidades de CD3 que resulta en la exposición de la secuencia rica en prolina de CD3ε (indicada como una P en la Figura) y en el reclutamiento de Nck. Situado en un segundo nivel estaría el reclutamiento de la tirosina quinasa ZAP70 y de otras moléculas señalizadoras a los ITAM fosforilados y el reclutamiento de WASP, WD?, SLP76 y Pak a Nck. Se muestra un modelo dimérico del TCR (Fernandez-Miguel et al., 1999; San José et al, 1998). Figura 5.- La interferencia con la interacción Nck-CD3ε inhibe la activación de los linfocitos T. (A) La sobrexpresión del dominio SH3 de unión a CD3ε de Nck inhibe la polimerización de actina y la extensión celular. Se estimularon transfectantes estables de células Jurkat que expresan formas fusionadas a EGFP de Nck completo (Nck-EGFP) o el dominio SH3.1 de Nck (SH3.1-EGFP) o el vector vacío (EGFP) durante 10 min sobre cubreobjetos recubiertos de 25 μg/ml UCHTl (anti-CD3) o poli-Usina (poly-D-Lys). Las células fueron fijadas y teñidas con faloidina marcada con Rojo Texas para mostrar la presencia de F- actina. El porcentaje de células extendidas fue estimado en el microcopio de fluorescencia y fue del 87% para células transfectadas con EGFP, del 91% para células transfectadas con Nck-EGFP y del 2% para células transfectadas con SH3.1-EGFP. (B) La sobrexpresión del dominio SH3 de Nck que se une a CD3ε inhibe la liberación de IL-2 producida por anti- CD3 (columna negra). Las células Jurkat que expresan las construcciones indicadas fueron estimuladas por 24 h en placas de 96 pocilios recubiertas de anti-CD3. Tras la estimulación, el sobrenadante fue recogido y se midió la cantidad de IL-2. (C y D) Efecto de la sobrexpresión de SH3.1 sobre la liberación de citoquinas inducida por superantígeno. Se estimularon células Jurkat que expresan las construcciones Nck-EGFP (triángulos), SH3.1-EGFP (círculos) y EGFP (cuadrados) durante 24 h con células Raji preincubadas con superantígeno (SEE). Tras la estimulación, el sobrenadante fue recolectado para medir la liberación de IL-2 y TNF-α. (E) La interferencia con la unión de Nck a CD3ε inhibe la proliferación de linfocitos T. Se transdujeron PBMC humanas con APAl/1 (círculos) o con el anticuerpo anti-CD4 HP2/6 (cuadrados) y se estimularon con UCHTl inmovilizado sobre plástico. 48 h más tarde, la proliferación fue estimada mediante la incorporación de 3H-timidina. Se representa la media aritmética y la desviación estándar de un experimento en cuatriplicado. (F) La transducción con el anticuerpo APA1/1 interfiere con la unión de CD3ε a Nck. PBMC humanas fueron transducidas o no con el anticuerpo APA1/1 y estimuladas durante 5 minutos con UCHTl . Se realizó una precipitación con GST-SH3.1 seguida de inmunotransferencia con anti-CD3ζ para evaluar la unión del TCR a Nck. Una inmunoprecipitación control con 4G10 seguida de inmunotransferencia con anti-CD3ζ fue realizada para evaluar el nivel de fosfo-CD3ζ. Figura 6.- La interferencia con la interacción Nck-CD3ε inhibe la formación de conjugados de linfocitos T con APC y la maduración de la sinapsis inmunitaria.
(A) Se incubaron células Raji marcadas con CMAC con 5 μg/ml de SEE y se mezclaron con células Jurkat en una relación 1 :1. Los conjugados se adhirieron a cubreobjetos recubiertos con poli-Usina y se contaron por examinación directa en el microscopio de fluorescencia. Las barras representan el porcentaje de conjugados relativo al número total de células Raji. Se muestra la media aritmética + el error estámdar de seis experimentos.
(B) Se marcaron células Raji con CMTMR y posteriormente con SEE y se depositaron en cubreobjetos recubiertos con fibronectina. Se añadieron células Jurkat transfectadas con Nck-EGFP y las células individuales se siguieron por video-microscopía confocal. Se tomaron imágenes a intervalos de 30" y se muestran imágenes representativas tomadas del video digital a los tiempos indicados. Cada fotograma representa la imagen DIC superimpuesta con las imágenes de fluorescencia de células Raji (rojo) y Nck-EGFP (verde). (C) Se formaron conjugados de células Jurkat y Raji como se describe en (A), se fijaron y se tiñeron para mostrar el TCR ó PKCΘ en rojo, imágenes de la derecha. A la izquierda se muestran las imágenes DIC correspondientes superimpuestas a la tinción en azul de células Raji. (D) Se determinó el porcentaje de conjugados con PKCΘ acumulado en el área de contacto relativo al número total de conjugados. Se muestra la media aritmética + el error estándar de cuatro experimentos independientes.
EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN En la presente invención se describe que NcKβ, una proteína adaptadora implicada en la regulación del citoesqueleto de actina promovida por la unión a receptor (Buday, 1999; Li and She, 2000; Myung et al, 2000), interacciona con el tallo citoplásmico de CD3ε de forma específica y que esta interacción induce una modificación en el receptor TCR que permite la unión de todo el complejo TCR a Nck y, por ende, la activación de los linfocitos T. Por otro lado, en la presente invención se ha verificado que esta interacción se produce igualmente en distintos tipos de linfocitos T tras ser estimulados: Línea celular de linfocitos T humanos Jurkat,
Linfocitos T humanos de sangre periférica y linfocitos T procedentes de timo y de bazo de ratón estimulados con anticuerpos anti CD3, y - Linfocitos T tímicos y de bazo de ratones transgénicos para el TCR AND estimulados con APCs cargadas con antígeno específico; que ha permitido demostrar que la estimulación del TCR con antígeno/MHC o con anticuerpos provoca una modificación del TCR que permite el reclutamiento de NcK a CD3ε (Ejemplo 1). Por otro lado, y por primera vez se han identificado a nivel molecular las regiones implicadas de ambas proteínas, NcK y CD3ε, en dicha interacción. Así, se ha identificado una secuencia rica en prolinas (PRS) del dominio citoplasmático de CD3ε, que está ausente en las demás subunidades de CD3, y que en la presente invención se ha identificado al estar presente dentro de la región de CD3ε delecionada en los mutantes 9 y 10 (Figura 2C) (SEQ ID NO 1) como la directamente relacionada con la interacción con NcKβ (Ejemplo 2). Por otro lado, se ha identificado el dominio SH3 amino-terminal (SH3-1) de NcKβ (SEQ ID NO 2) como la región de esta proteína implicada en la interacción con CD3ε (Ejemplo 2). Hay que indicar que se han descrito dos genes humanos correspondientes a NcK que comparten un 67% de homología (Buday, 1997). Estos dos genes tienen una estructura idéntica en tres dominios SH3 y un dominio SH2 C-terminal. Aunque la forma inicialmente identificada en el ensayo de dos híbridos (Ejemplo 1) fue NcKβ, en la presente invención se ha constatado que las dos formas se unen de forma comparable al TCR como se demuestra en experimentos de precipitación con GST-NcKα y GST-NcKβ. Consecuentemente, se utilizaron indistintamente construcciones de todo o parte de NcKα y NcKβ en los experimentos siguientes de la presente invención. La región SH3.1 de NcKα se describe en la SEQ ID NO 3. El hecho de que la interacción entre Nck y CD3ε fuera mediada por una interacción
PRS-SH3 hacía difícil explicar cómo el reclutamiento de Nck al TCR podía ser inducible. Puesto que el PRS en CD3ε está localizado cerca del ITAM, una explicación posible era que la fosforilación en tirosina influyera de alguna forma la accesibilidad del PRS para Nck. Sin embargo, en la presente invención se pudo concluir que el cambio en el TCR tras la unión de Nck al TCR es independiente de la actividad PTK y precede a la fosforilación de los ITAM en tirosina (Ejemplo 3).
Posteriormente, en la presente invención se comprobó que la estimulación del TCR en linfocitos vivos mediante la unión de ligando promueve un cambio conformacional que resulta en la exposición de la región PRS del CD3ε y su interacción y unión con la región SH3.1 de NcK (Ejemplo 4). La unión de ligando a TCR provocaría una readaptación de la cola de CD3ε en una estructura que permitiría la exposición de la región rica de prolina (PRS), mientras que en una situación de falta de estímulo del TCR la cola de CD3ε presentaría una estructura que impidiría la unión con NcK.
Además, se ha constatado que el bloqueo del sitio de interacción con NcK en CD3ε mediante la sobreexpresión del dominio SH3.1 de Nck o por transducción con un anticuerpo específico (APA1/1) provoca la inhibición de la activación de los linfocitos T (Ejemplo 5). Finalmente, se ha constatado que esta inhibición de la activación de los linfocitos T mediada por el TCR obtenida por la sobreexpresión del dominio de NcK de unión a CD3ε se produce por una reducción en el número de conjugados T:APC formados y por una inhibición de la maduración de la IS (Ejemplo 6).
En resumen, la caracterización de la interacción NcK- CD3ε descrita por primera vez en la presente invención identifica a NcK como un efector inmediato del TCR enmarcado en el siguiente modelo: La unión del antígeno/MHC a las regiones variables del heterodímero TCRα/β promueve a la vez la agregación y un cambio conformacional en el TCR. La agregación del TCR sería necesaria para la activación de las quinasas de la familia src asociadas al TCR, Lck y Fyn, las cuales fosforilan subsecuentemente a los ITAM. De forma independiente, se produce un cambio conformacional en los tallos citoplásmicos de las subunidades de CD3 que resulta en la exposición de la secuencia rica en prolina de CD3ε (indicada como una P en la Figura 4C) y en el reclutamiento de Nck. Situado en un segundo nivel estaría el reclutamiento de la tirosina quinasa ZAP70 y de otras moléculas señalizadoras a los ITAM fosfori lados. También en este nivel se situaría el reclutamiento a Nck de otras proteínas a través de dominios distintos de SH3.1. Estas proteínas son: WASP (tercer dominio SH3), WD? (segundo dominio SH3), SLP76 (dominio SH2) y Pakl (segundo dominio SH3) (Buday, 1999; Li and She, 2000). Por lo tanto, Nck presenta el potencial de unirse simultáneamente al TCR y a otras importantes proteínas implicadas en la polimerización del citoesqueleto de actina y en la transducción de señales y por tanto puede constituirse en un punto modulador de la activación de los linfocitos T.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma. Ejemplo 1.- Nck se une a CD3ε tras la interacción del TCR con sus ligandos. Utilizando el sistema de dos híbridos en levadura basados en el reclutamiento de
SOS (Aronheim, 2001) se determinó que Nckβ interacciona con el tallo citoplásmico de CD3ε. Nckβ se unió de forma específica a una construcción cebo consistente en dos copias en tándem del tallo citoplásmico de CD3ε, y también a una sola copia (Tabla 1). Para comprobar en otro sistema que Nck se une a CD3ε y si se une a otras subunidades de CD3, utilizamos una proteína de fusión GST-Nckβ para hacer precipitaciones a partir de Usados de células COS transfectadas con las diferentes subunidades de CD3. Encontramos que GST-Nckβ se unió a CD3ε pero no a CD3γ, ni a CD3δ, ni a CD3ζ, indicando que CD3ε es la única subunidad del complejo CD3 que interacciona con Nckβ (Figura 1A). Para comprobar si Nck y CD3ε interaccionan en linfocitos T se realizó una inmunoprecipitación con anti-CD3ε a partir de Usados de la línea celular T humana Jurkat, seguido de inmunotransferencia con anti-Nck (Figura IB). Nck fue coprecipitado junto con CD3ε a partir de células Jurkat estimuladas con el anticuerpo anti-CD3 UCHTl durante 5 min, pero no a partir de células no estimuladas. Para verificar que la banda proteica detectada en inmunotransferencia representa a Nck, las células Jurkat se transfectaron transitoriamente con Nckβ marcado con un epítopo HA (Figura 1 C). Mediante inmunotransferencia con anti-HA se comprobó la presencia de Nckβ en los inmunoprecipitados de CD3ε sólo cuando se partió de células transfectadas con HA-Nckβ (Figura 1C). De nuevo, la asociación de Nck a CD3ε fue inducida por la estimulación con anti-CD3. La unión de Nck a CD3ε dependiente de estimulación podría ser necesaria para una modificación de Nck o del mismo TCR. Para comprobar cuál de estas dos posibilidades es cierta, hicimos experimentos de precipitación usando proteínas de fusión a GST. Por una parte, comprobamos que Nck se asocia a una proteína de fusión consistente en GST unido al tallo citoplásmico de CD3ε de forma independiente de estimulación (Figura ID). Para el experimento recíproco se utilizaron células Jurkat transfectadas con CD3ε marcado con un epítopo flag. La precipitación con GST-Nckβ seguida de inmunotransferencia con anti-flag mostró que la asociación de CD3ε endógeno con Nck inmovilizado es dependiente de estimulación (Figura 1E). En el mismo experimento, encontramos que la unión del TCR a Nck podía ser seguida también por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-CD3ζ. Puesto que CD3ζ es la última subunidad que se ensambla en el TCR (para revisión ver (Jacobs, 1997), estos resultados sugieren que la estimulación con anti-CD3 induce una modificación en el TCR que permite la unión de todo el complejo TCR a Nck.
Para verificar si el reclutamiento de Nck podía ser reproducido con estímulos más fisiológicos y en diferentes linfocitos T, un número de sistemas diferentes fue utilizado. Primero, la asociación de CD3ε con Nck fue inducida tras la estimulación con anti-CD3 de linfocitos T humanos de sangre periférica (Figura 1F). De la misma forma, la estimulación de linfocitos T procedentes de timo y de bazo de ratón con anticuerpos anti-CD3 promovió la unión de CD3ε a GST-Nckβ (datos no mostrados). Finalmente, la asociación del TCR con Nck fue detectada también cuando linfocitos T tímicos y de bazo procedentes de ratones transgénicos para el TCR AND fueron estimulados con APCs cargadas con antígeno específico de ese TCR (Figura 1G). Esto demuestra que la estimulación del TCR con antígeno/MHC induce también el reclutamiento de Nck endógeno. En conjunto, estos resultados indican que la estimulación del TCR con anticuerpos o antígeno resulta en una modificación del TCR que permite el reclutamiento de Nck a CD3ε. Ejemplo 2.- El dominio SH3 amino-terminal de Nck se une a una secuencia rica en prolinas en CD3ε. Para comprender las bases moleculares de la dependencia de la interacción Nck-
CD3ε de la estimulación del TCR, se realizaron una serie de experimentos de precipitación para identificar las regiones responsables tanto en CD3ε como en Nck. Un conjunto de mutantes de deleción que comprenden toda la región citoplásmica de CD3ε (Figura 2A) fue transfectado en células COS. Después de hacer una mareaje metabólico con 35S- metionina, las células fueron Usadas y se usó GST-Nckβ para ensayos de precipitación. Estos experimentos demostraron que Nckβ interacciona con CD3ε de tipo silvestre y también con los mutantes 7, 8, 11 y 12 pero no con los mutantes 9 y 10 (Figura 2B, panel superior). Una secuencia rica en prolinas (PRS) que está ausente en las demás subunidades de CD3, se encuentra contenida dentro de la región de CD3ε delecionada en los mutantes 9 y 10 (Figura 2A). La deleción de esta secuencia impide la unión a Nck. Se han descrito dos genes humanos correspondientes a Nck que comparten un 67% de homología (Buday, 1999). Estos tienen una organización idéntica en tres dominios SH3 y un dominio SH2 C- terminal. Aunque la forma que inicialmente identificamos en el ensayo de dos-híbridos fue Nckβ, en realidad las dos formas se unen de forma comparable al TCR como se demuestra en experimentos de precipitación con GST-Nckα y GST-Nckβ (Figura 2C). Consecuentemente, se utilizaron indistintamente construcciones de todo o parte de Nckα y Nckβ para los experimentos siguientes. Puesto que Nck contiene tres dominios SH3 parecía factible que la interacción Nck-CD3ε fuera mediada por la unión de uno o varios de estos dominios SH3 al PRS de CD3ε. De acuerdo con esto, una forma truncada de Nck que carece del dominio SH2 se unió a CD3ε en el TCR de forma inducible, mientras que GST unida al dominio SH2 no precipitó el TCR (Figura 2D). Utilizando construcciones de GST unido a dominios SH3 individuales, encontramos que el dominio SH3 amino-terminal (SH3.1) de Nck, pero no otros, se une a CD3ε (Figura 2D). Esta unión fue también inducible, indicando que el dominio SH3.1 es el responsable de la unión de Nck a CD3ε. Como control de especificidad, comprobamos que el segundo dominio SH3 de Nck se une a Cbl de forma constitutiva (datos no mostrados), como ha sido descrito previamente (Wunderlich et al., 1999).
Ejemplo 3.- El cambio en el TCR que promueve su unión a Nck ocurre antes, y de forma independiente, de la fosforilación de proteínas en tirosina.
El hecho de que la interacción entre Nck y CD3ε fuera mediada por una interacción PRS-SH3 hacía difícil explicar cómo el reclutamiento de Nck al TCR podía ser inducible. Puesto que el PRS en CD3ε está localizado cerca del ITAM, una explicación posible era que la fosforilación en tirosina influyera de alguna forma la accesibilidad del PRS para Nck. Esta hipótesis fue comprobada utilizando inhibidores y activadores de tirosina quinasas. En primer lugar, se estimularon células Jurkat con pervanadato (PV), un tratamiento que incrementa el nivel de fosforilación en tirosina e induce una serie de procesos de activación parecidos a los estimulados por el TCR (Secrist et al., 1993). Al contrario que la estimulación con anticuerpos anti-CD3, la estimulación con PV no promovió la asociación del TCR con GST-SH3.1 (Figura 3A, panel superior izquierdo). Como control de que el tratamiento con PV había sido efectivo hicimos una inmunoprecipitación e inmunotransferencia con un anticuerpo anti-fosfotirosina (Figura 3 A, panel inferior izquierdo). En segundo lugar, se incubaron células Jurkat con PP2, un inhibidor muy potente de las tirosina quinasas (PTK) de la familia src (Hanke et al., 1996) tales como Lck y Fyn. Se cree que estas PTK son responsables de la iniciación de la cascada de activación promoviendo la fosforilación en tirosina dentro de los ITAMs (Lin and Weiss, 2001). La adición de PP2 previno completamente la fosforilación en tirosina estimulada por anti-CD3 (Figura 3 A, panel inferior derecho), mientras que la asociación del TCR con Nck no fue afectada (Figura 3A, panel superior derecho). Así, la unión de Nck al TCR parecía implicar cambios en el TCR independientes de la actividad PTK.
Se cree que la fosforilación de los ITAMs en tirosina es el suceso más temprano inducido tras la estimulación del TCR (Lin and Weiss, 2001). Puesto que la unión de Nck es independiente de la fosforilación en tirosina, estudiamos el curso temporal de ambos procesos. La estimulación del TCR por un tiempo tan corto como 5 segundos indujo su asociación a Nck (Figura 3B, panel superior), mientras que el nivel de fosforilación en tirosina no difirió del de células no estimuladas (Figura 3B, panel intermedio). Es más, no se detectó la fosforilación de CD3ζ a ese tiempo (Figura 3B, panel inferior); ésta fue claramente observable sólo tras 30 s de activación. Así, se puede concluir que el cambio en el TCR que permite el reclutamiento de Nck precede a la fosforilación de los ITAM en tirosina. Tras analizar la dependencia de temperatura de la unión Nck-CD3ε y de la fosforilación en tirosina se obtuvo evidencia adicional a favor de una completa independencia de la unión Nck-CD3ε respecto de la actividad PTK. La fosforilación de proteínas totales en tirosina activada tras estimulación del TCR estaba disminuida a 24°C y a 14°C y completamente ausente cuando las células se estimularon a 0°C (Figura 3C); mientras que la unión de Nck al TCR fue independiente de temperatura. Ejemplo 4.- La estimulación del TCR induce un cambio conformacional que resulta en la exposición de la PRS en CD3ε.
El hecho de que la unión Nck-TCR sea mediada por un dominio SH3 sugiere que la unión de un ligando (anticuerpo o antígeno) al TCR promueve un cambio conformacional que resulta en la exposición del PRS de CD3ε. Sin embargo, de los experimentos anteriores no podemos descartar posibles contribuciones de otros factores celulares. Para eliminar esta posibilidad, se realizó un ensayo libre de células a partir de extractos de células Jurkat transfectadas con fragmento Fv (cadena simple de in unoglobulina) unido al extremo N-terminal de TCRβ. El fragmento Fv que utilizamos reconoce los haptenos NP y NIP. Mediante el empleo de columnas de NP inmovilizado (hapteno de baja afinidad) y elución con N1P libre (hapteno de alta afinidad), fue posible purificar y eluir en condiciones suaves el complejo TCR completo (datos no mostrados). Una vez purificado, el TCR se incubó con UCHTl y se precipitó con GST-SH3.1. Mediante este experimento demostramos que la preincubación con anti-CD3 induce un cambio conformacional en el TCR purificado que permite su unión al dominio SH3.1 de Nck (Figura 4A). Previamente habíamos descrito que el anticuerpo monoclonal APAl/1 se une cerca de la región PRS de CD3ε (Borroto et al., 1998). La incubación con APAl/1 de TCR purificado y pre-activado con UCHTl previene su unión a GST-SH3.1 (Figura 4A). Por el contrario, APA1/2, un anticuerpo monoclonal específico contra el tallo citoplásmico de CD3δ (Alarcon et al., 1991), no tuvo efecto.
Para excluir que el entrecruzamiento con anticuerpo fuera la causa del cambio conformacional, se preparó un fragmento monovalente del anticuerpo anti-CD3 y se incubó con el TCR purificado. Como se muestra en la Figura 4B, el fragmento Fab indujo el cambio conformacional en el TCR que resulta en la exposición del sitio en CD3ε para la unión a Nck. En la Figura 4C se muestra un esquema de cómo la unión de ligando promueve a la vez el reclutamiento de Nck y la activación de PTK.
Ejemplo 5.- El reclutamiento de Nck al TCR es requerido para la activación de los linfocitos T.
El modelo en vigor de transmisión de señales por el TCR coloca a Nck muy por debajo del TCR. Sin embargo, la caracterización de la interacción Nck-CD3ε descrita arriba coloca a Nck como un efector inmediato del TCR. Para entender la importancia del reclutamiento de Nck por el TCR en la activación de los linfocitos T usamos dos aproximaciones diferentes tendentes a inhibir la interacción Nck-CD3ε. En la primera, sobreexpresamos el dominio SH3.1 de Nck con el fin de ocupar el PRS en CD3ε y prevenir la interacción del TCR con Nck endógeno. Se transfectaron establemente células Jurkat con un vector que expresa una proteína de fusión SH3.1-EGFP y se seleccionaron por citometría de flujo los clones que expresaban los niveles más altos. Se seleccionaron también clones que expresan EGFP sólo o una proteína de fusión formada por Nck completo unido a EGFP. Se ha descrito previamente que la estimulación de células Jurkat sobre cubreobjetos recubiertos de anti-CD3 resulta en su extensión y despliegue en unos pocos minutos, formando un anillo de F-actina que bordea la periferia de las células (Borroto et al., 2000; Bunnell et al., 2001). Puesto que se postula que Nck tiene un papel en el reordenamiento del citoesqueleto de actina (Buday, 1999), realizamos un ensayo de despliegue para comprobar el efecto de la sobreexpresión de SH3.1. Las células transfectadas de forma estable con SH3.1-EGFP se desplegaron menos y su citoesqueleto de actina se polimerizó menos que en las células que expresan EGFP (Figura 5A). Es notorio que aunque el nivel de expresión de Nck-EGFP fue inferior que los de EGFP y SH3.1-EGFP (datos no mostrados), había una clara potenciación del despliegue celular.
El despliegue de las células tiene lugar a los pocos minutos de estimularse el TCR. Para examinar el efecto de la sobreexpresión de SH3.1 en procesos más tardíos, los clones que expresan SH3.1-EGFP, Nck-EGFP y EGFP se estimularon con anti-CD3 unido a plástico y el sobrenadante de los cultivos fue recolectado 24 h después para analizar la liberación de IL-2. De forma similar al efecto sobre despliegue celular, el clon que expresa Nck-EGFP produjo más IL-2 después de estimular el TCR que el clon que expresa EGFP sólo, mientras que el clon que expresa SH3.1 no produjo nada (Figura 5B). Por el contrario, Nck-EGFP y SH3.1-EGFP no tuvieron efecto sobre la expresión de CD69 (datos no mostrados). Para estudiar la liberación de citoquinas con un estímulo diferente, los clones fueron incubados con APCs precargadas con el superantígeno SEE, y se midió la liberación de IL-2 y TNFα al sobrenadante de cultivo. La expresión de SH3.1 tuvo de nuevo un efecto inhibidor muy fuerte, reduciendo o incluso bloqueando la liberación de ambas citoquinas inducida por SEE, mientras que el clon transfectado con Nck completo produjo niveles más altos (Figura 5C y 5D).
La segunda aproximación consistió en la transducción de linfocitos T con el anticuerpo APA1/1, capaz de bloquear la interacción Nck-CD3ε uniéndose al PRS en CD3ε (Borroto et al, 1998). Se transdujeron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) procedentes de donantes humanos sanos con APA 1/1 marcado con fluoresceína. Mientras que la estimulación con anti-CD3 indujo la asociación del TCR a Nck en PBMC no transducidas, la interacción estaba inhibida en células transducidas con APA1/1, sugiriendo que APA1/1 estaba bloqueando el PRS de CD3ε (Figura 5F). Finalmente, se estimularon con UCHTl inmovilizado PBMC transducidas bien con APA1/1, bien con un anticuerpo control, y se analizó el efecto en proliferación celular 48 h más tarde. Encontramos que la expresión interna de APAl/1 inhibió la proliferación inducida por el TCR a todas las dosis de anticuerpo utilizadas (Figura 5E). Así, el bloqueo del sitio de interacción con Nck en CD3ε por sobreexpresión del dominio SH3.1 de Nck o por transducción con un anticuerpo específico, resulta en la inhibición de la activación de los linfocitos T.
Ejemplo 6.- La sobreexpresión del dominio SH3.1 de Nck inhibe la formación de conjugados entre linfocitos T y APC y la maduración de la sinapsis inmunitaria. Para investigar los mecanismos por los que la inhibición de la interacción Nck-
CD3ε reduce la activación de los linfocitos T, analizamos la formación de conjugados T:APC. Las señales inducidas por el TCR incrementan la adhesión mediada por integrinas en un proceso dependiente de la polimerización del citoesqueleto de actina (Dustin and Cooper, 2000). Puesto que la sobreexpresión del dominio SH3.1 de Nck inhibe la polimerización de actina inducida por estimulación del TCR, predijimos que la formación de conjugados también sería afectada. Esto se vio confirmado en un experimento donde células Jurkat fueron estimuladas con Raji APC cargadas con superantígeno SEE. La incubación con SEE produjo un aumento considerable de la formación de conjugados entre células Raji y el clon de células Jurkat transfectado con EGFP pero no con el clon transfectado con SH3.1 -EGFP (Figura 6A).
Puesto que el TCR se concentra en la IS (Dustin and Cooper, 2000; Monks et al., 1998), estudiamos si el reclutamiento de Nck al TCR también resulta en su reclutamiento a la IS. Utilizando videomicroscopía confocal encontramos que Nck-EGFP se concentra en la IS (Figura 6B) en un tiempo similar al del reclutamiento del TCR (Krummel et al., 2000) y datos no mostrados). En un experimento similar con células que expresan SH3.1-EGFP no pudimos ver la traslocación de esta proteína de fusión a la IS en las pocas células que formaron conjugados en presencia de SEE (datos no mostrados). De todas formas, investigamos el efecto de la sobreexpresión de SH3.1 en la formación y maduración de la IS. La tinción con anticuerpos anti-TCR mostró que la acumulación del TCR en la IS no fue afectada en las células que expresan SH3.1-EGFP comparada con las células que expresan EGFP (Figura 6C), indicando que la interacción Nck-CD3ε no es esencial para el reclutamiento del TCR a la IS. Posteriormente examinamos la asociación de PKCΘ con la IS. PKCΘ se trasloca a la IS madura y es, de hecho, un indicador de madurez (Dustin and Cooper, 2000; Monks et al, 1998). Encontramos que la traslocación de PKCΘ a la IS estaba inhibida en las células que expresan SH3.1-EGFP (Figura 6C). Haciendo una cuantificación en este experimento, encontramos que se redujo en tres veces el número de conjugados en los que PKCΘ se trasloca a la IS (Figura 6D). Así, la inhibición de la activación de los linfocitos T mediada por el TCR obtenida por la sobreexpresión del dominio de Nck de unión a CD3ε deriva de un doble efecto: una reducción en el número de conjugados T:APC formados y una inhibición de la maduración de la IS.
En la siguiente sección de Materiales y Métodos se identifican los plásmidos, líneas celulares, animales, anticuerpos y reactivos, así como una descripción detallada de los ensayos utilizados en dichos Ejemplos. MATERIALES Y MÉTODOS
Líneas Celulares y levaduras.- La línea celular humana de origen T denominada Jurkat fue mantenida en medio de cultivo RPMI suplementado con suero bovino fetal, (FBS, Sigma), al 10%. La línea celular de mono COS7 fue mantenida en medio DMEM suplementado con FBS al 5 %. La línea Jurkat carente de la cadena TCRβ 31.13 fue amablemente proporcionada por el Dr. A. Alcover (Instituto Pasteur, París). El clon denominado Flag-CD3ε fue obtenido por transfección estable del plásmido de expresión pSRα-FlagCD3ε en la línea Jurkat. Los clones denominados EGFP, Nck-EGFP y SH3.1- EGFP fueron obtenidos mediante transfección estable de los vectores de expresión correspondientes en una línea Jurkat denominada J77clon20 (Niedergang y cois., 1997). El clon 31.13 scVβ3 se obtuvo mediante la transfección del vector de expresión para la fusión de la cadena Vβ3 fusionada con la cadena única Fv. La cadena Fv utilizada es un derivado del anticuerpo contra el hapteno 3-nitro-4hidroxifenilacetato Bl-8 (Reth y cois., 1978). Las células de timo y bazo fueron aisladas de ratones transgénicos con un TCR de tipo AND (Rag2-/-) (Kaye y cois., 1992) o de ratones BL6. Como células presentadoras se utilizaron las DCEK (Kuhlmam y cois., 1991). La cepa de levadura cd25h fue proporcionada por Stratagene.
Plásmidos.- La proteína de fusión SOSε fue obtenida mediante la inserción del fragmento codificante por el dominio citoplásmico de CD3ε humano en el vector de expresión de levaduras pSOS (Stratagene). El vector pSOSεtandem codifica la fusión de la proteína SOS con dos copias del dominio citoplásmico de CD3ε humano orientadas cola con cabeza. Los vectores codificantes para las proteínas de fusión control p SOS-MafB, pMyr- MafB y pMyr-LamC fueron proporcionados por la casa Stratagene. Para las proteínas de fusión GST-Nckβ y GST-Nckβ truncado se obtuvieron fragmentos de PCR correspondientes a la molécula completa o a una delección del dominio SH2 amino terminal partiendo del gen de Nckβ humano. Estos fragmentos se insertaron en el vector pGEX4Tl en fase con la secuencia codificante para GST. Los plásmidos derivados de pGEX4Tl, codificantes para las proteínas de fusión GST-Nckβ, GST-SH3.1α, GST- SH3.2α y GST-SH2α fueron amablemente cedidos por el Dr.R.Geha (Children's Hospital , Harvard Medical School, Boston). Los vectores codificantes por GST-SH2β y las proteínas Nckα y Nckβ marcadas con el epítopo HA fueron amablemente cedidas por el Dr. X. Bustelo (Centro Nacional del Cáncer, Salamanca). La secuencia líder de la inmunoglobulina Ig-α, incluyendo la señal para el corte de la peptidasa y el epítopo Flag, fue amplificada mediante PCR a partir del vector pEVmb-INneo (Schamel y Reth, 2000). El fragmento resultante sustituyó la secuencia líder humana en las cadenas humanas de CD3 en la obtención de los vectores de expresión pSRαFlag-CD3ε,-CD3γ y -CD3δ. Las delecciones citoplásmicas de la cadena CD3ε humana fueron generadas mediante un método de mutagénesis basado en la PCR como fue descrito previamente (Mallabiabarrena y cois., 1992). Los productos de PCR codificantes para la proteína completa Nckβ humana y su primer dominio SH3 fueron clonados en el vector de expresión en mamíferos pEFGPNl (Clontech), para obtener las proteínas de fusión Nck-EGFP y SH3.1-EGFP. Anticuerpos y Reactivos.- Los anticuerpos de ratón APA1/1, SP34 y APA1/2, que reconocen la porción citoplásmica de CD3ε humano, la porción extracelular de CD3ε humano y la cola citoplásmica de CD3δ respectivamente se han descrito previamente (Alarcón y cois., 1991), así como el suero de conejo 448 específico contra CD3ζ (San José y cois., 2000) y el anticuerpo monoclonal de ratón HP26 contra CD4 humano (Carrera y cois., 1987). El anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD3 UCHTl fue donado por el Dr. P. Beverley (The Edward Jenner Institute for Vaccine Research, Berkshire, UK). Los fragmentos Fab fueron preparados utilizando el kit comercial Immunopure IgGl Fab Preparation Kit de Pierce. El anticuerpo monoclonal de ratón SP34 contra la región extracelular de CD3ε humano fue cedido por el Dr. C. Terhost. El anticuerpo de conejo anti-Nck, que reconoce tanto Nckα como Nckβ, fue obtenido de la casa Pharmingen, el anticuerpo monoclonal de ratón anti-fosfotirosina, 4G10, de Upstate Biotechnology, el anticuerpo monoclonal de ratón anti-HA, 12CA5, de Boehringer Manriheim y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-Flag, M2, de Sigma. Las enterotoxinas de Staphylococcus aureus A y E, SEE y SEA, se compraron a Toxin Technologies. El inhibidor de las tirosina quinasas de la familia de Src, PP2, se compró a Calbiochem. El péptido antigénico específico para el TCR AND, PCC, correspondiente a los aminoácidos 88-100 del citocromo C de paloma, se sintetizó por el método del N-(-9-fluorenil)metoxicarbonil, (Fmoc), y se purificó por HPLC. Todos los medios de cultivo, aminoácidos y azúcares necesarios para el crecimiento y transformación de las levaduras se compraron a Sigma y a Merck.
Ensayos de Precipitación o "Pulí down" (Pd).- En los ensayos de precipitación, o pulí down (Pd), se procedió siempre del mismo modo con las distintas proteínas de fusión GST utilizadas a lo largo de la presente invención. Se prepararon Usados bacterianos para absorber las proteínas de fusión a la matriz de sefarosa glutatión. Los protocolos seguidos para la lisis bacteriana y absorción a la matriz fueron los descritos por la casa comercial del sistema GST, Amersham Pharmacia Biotech. Por cada punto de precipitación se utilizó un volumen de la matriz entre 20 y 10 μl y un lisado celular de entre 10 y 20 x 106 células. Los Usados se preaclararon siempre con la proteína GST durante 1 hora a 4°C en condiciones de agitación. La precipitación se realizaba a continuación en las mismas condiciones durante 4 horas como mínimo o toda una noche como máximo. Los precipitados se lavaron entre 3 y 5 veces con el tampón de lisis celular (Brij 96 0.3% , 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH 7.8, lOmM Iodoacetamida, lmM fenilmetilsulfonilfluorido, 1 μg/ml aproptinina, 1 μg/ml leupeptina, 1 mM ortovanadato sódico y 20mM fluoruro sódico). Los precipitados se sometieron a SDS-PAGE y a transferencia a filtros de nitrocelulosa (BioRad). Rastreo de una genoteca de ADNc en busca de ligandos para el dominio citoplásmico de CD3ε mediante un sistema de dos híbridos en levadura.- Se utilizó el sistema denominado Cytotrap de la casa Stratagene. La levadura fue cotransformada con el plásmido pSOS-CD3ε Tándem y el plásmido pMyr-genoteca de acuerdo con los protocolos descritos por la casa Stratagene. En la cotransformación se analizaron 3 x 106 cotransformantes, de ellos se seleccionaron 15 clones por su capacidad de crecimiento en distintas condiciones de temperatura y fuente de carbono. Se aisló el plásmido correspondiente a la genoteca de estas 15 colonias y se analizó la capacidad de crecimiento dependiente del dominio citoplásmico de CD3ε cotransformando estos plásmidos junto con el plásmido pSOS vacío. Mediante este procedimiento se seleccionaron dos clones específicos que fueron secuenciados para identificar las proteínas correspondientes. Transfecciones de líneas celulares y mareaje metabólico.- Los protocolos de transfección de distintos tipos celulares, líneas Jurkat y COS7, tanto transitoria como estable, utilizados en la presente invención ya han sido descritos (Borroto y cois., 1998 y 1999; Pozo y cois., 1999) El mareaje metabólico de células COS y de las células Jurkat con 35S-Metionina (Amersham) ya ha sido descrito (Borrroto y cois., 1998). Estimulación e inmunoprecipitación.- Un total de entre 20 y 10 x 106 células Jurkat por punto de estimulación se resuspenden en 1 mi de medio RPMI HEPES 10 mM, pH 7.4, no suplementado, y se preincuban durante 2 horas a 37°C antes de la estimulación. A continuación se añaden 10 μg del anticuerpo estimulante y se incuban las células a 37°C durante el tiempo de la estimulación. Las células procedentes de la estimulación se Usaron siempre en el tampón de lisis Brij 96 0.3%. El tratamiento con pervanadato realizado en algunos casos para la activación de tirosina quinasas e inhibición de fosfatasas, en ausencia de estímulo, se ha descrito previamente (Wienands y cois., 1996). El tratamiento con el inhibidor de las tirosina quinasas de la familia Src realizado durante algunas estimulaciones consistió en preincubar las células antes de la estimulación durante 30 minutos con la droga PP2 a una concentración de 20μM, que se mantenía después durante la estimulación. Las estimulaciones de menos de 1 minuto de duración se realizaron de otro modo. La suspensión celular se concentraba al reducir su volumen a medio mi y se añadía ya atemperada a 37°C sobre un eppendorf con los 10 μg de anticuerpo estimulante también atemperados. Por otro lado, se preparaba el tampón de lisis al doble de la concentración final de uso y se mantenía en hielo en alícuotas de medio mi durante la estimulación para añadir inmediatamente las células estimuladas. Tras la lisis se obtenían fracciones postnucleares que se sometían a protocolos de inmunoprecipitación descritos previamente (Alarcón y cois., 1991).
Purificación del complejo TCR-CD3.- La purificación del complejo TCR-CD3 modificado a partir del clon estable 31.13 se vβ3 con NP-sefarosa y elución con tampón NIP fue realizada como ha sido descrito previamente (Schamel y Reth, 2000). Transducción de anticuerpos.- Para introducir en células vivas los anticuerpos APA1/1- Fitc y HP26-Fitc se utilizó el sistema de la casa Gene Therapy Systems denominado Bioporter Reagent. Se siguieron las especificaciones de la casa, utilizando los anticuerpos a una concentración de 250 μg/ml. Las células utilizadas fueron PBMCs aislados de donante sano con Ficoll Hypaque (Rafer) y se emplearon 2μl del reactivo por cada 2 x 106 células. La eficiencia del proceso se monitorizó mediante citometría de flujo, observándose rutinariamente un 100% de células positivas para los anticuerpos. Ensayos Funcionales.- La polimerización del citoesqueleto de actina inducida por estimulación del TCR se monitorizó mediante inmunofluorescencia. Las células se estimularon sobre cubreobjetos tratados con anticuerpos anti-CD3 (UCHTl) como ya ha sido descrito (Borroto y cois., 2000). La tinción de Actina -F se realizó permeabilizando las células con saponina al 0.1% y utilizando faloidina-Texas Red (Sigma). Las imágenes fueron analizadas con un microscopio confocal Radiance 2000. La secreción de citoquinas se cuantificó utilizando un sistema de la casa
Pharmingen denominado "Human Thl/Th2 Cytokine Cytometric Bead Assay kit". Las células Jurkat fueron estimuladas sobre pocilios de placas de cultivo p96, tratadas con el anticuerpo anti-CD3 UCHTl durante 24 horas, y los sobrenadantes fueron analizados con el kit. Alternativamente las células fueron estimuladas con células presentadoras Raji cargadas 30 minutos antes con SEE en distintas dosis, en una proporción 1 : 1.
Para medir la proliferación inducida por la estimulación del complejo TCR-CD3, los PBMCs transducidos con anticuerpo (1 x 105 por punto) fueron sembrados en pocilios de p96, tratadas con el anticuerpo anti-CD3 UCHTl, en distintas dosis, durante 24 horas. A continuación 1 μCi de [3H]timidina (Amersham) por pocilio fue añadido y la incorporación de este metabolito fue medida 24 horas más tarde.
Formación de conjugados y fluorescencia en tiempo real mediante microscopía confocal.- Células Raji fueron cargadas con CMAC (10 mM durante 20 minutos a 37°C en HBSS) y se incubaron por 20 minutos en presencia o ausencia de 5 μg/ml de SEE. Células J77 clon 20 (5 x 104 células por pocilio) se mezclaron con un número igual de células Raji y se plaquearon sobre láminas tratadas con poli-L-Lisina dentro de placas p24 (Costar). Las células se fijaron y tiñeron como ya se ha descrito (Borroto y cois., 1999, del Pozo y cois., 1999). Se realizó un análisis cuantitativo del número de conjugados formados mediante la observación directa de la morfología celular y la marca azul de CMAC de las células Raji con un microscopio de fluorescencia (Leica DMR). La proporción de conjugados con PKCΘ localizada en la región de contacto se calculó mediante la selección al azar de 200 conjugados diferentes. Para la microscopía en tiempo real, las células J77 se colocaron en HBSS con FBS al
2 % y se absorbieron a cubreobjetos tratados con fibronectina (20 μg/ml durante 20 horas a 4°C). Los cubreobjetos con las células se montaron en una cámara abierta "Atto flúor" (Molecular Probes). Entonces, células Raji cargadas con CM-TMR (5mM durante 20 minutos a 37°C) fueron añadidas sobre la cámara. Se adquirieron imágenes de confocal utilizando una unidad de láser confocal Leica TCS-SP. Inmunofluorescencia seriada e imágenes DIC fueron obtenidas simultáneamente a los tiempos indicados. La sección óptica más representativa del canal verde (EGFP, células J77), su correspondiente imagen DIC (morfología celular) y la imagen del canal rojo (CM-TMR, células Raji) se superpusieron para formar una imagen única.
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Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T caracterizado porque se basa en la regulación de la interacción proteína-proteína de CD3ε- Nck.
2.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 1 caracterizado porque se usan sustancias químicas que alteran dicha interacción mediante su inhibición (antagonistas).
3.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 1 caracterizado porque se usan sustancias químicas que alteran dicha interacción mediante su activación (agonistas).
4.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3 caracterizado porque dichas sustancias agonistas o antagonistas se identifican con un método que comprende los siguientes pasos: a) generar una preparación biológica de la interacción proteína-proteína que mimetize la interacción CD3ε-Nck, b) añadir la sustancia química candidata a agonista ó antagonista, y c) determinar el bloqueo o activación de la interacción proteína-proteína CD3ε-Nck, identificándose en caso de bloqueo un antagonista de la interacción CD3ε-Nck y en caso de activación un agonista de la interacción CD3ε-Nck.
5.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 4 caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-
Nck se realiza utilizando las proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos (fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas.
6.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 4 ó 5 caracterizado porque el péptido que mimetiza la actividad biológica de NcK de unión a
CD3ε comprende la secuencia de aminoácidos del dominio SH3.1 de NcKβ (SEQ ID
NO2).
7.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 4 ó 5 caracterizado porque el péptido que mimetiza la actividad biológica de NcK de unión a CD3ε comprende la secuencia de aminoácidos del dominio SH3.1 de NcKα (SEQ ID
NO3).
8.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 4 ó 5 caracterizado porque el péptido que mimetiza la actividad biológica de CD3ε de unión a Nck comprende la secuencia de aminoácidos de la región rica de prolinas (PRS) de CD3ε (SEQ ID NO1).
9.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a la 8 caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de las proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos (fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas está contenida en una proteína de fusión.
10.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 9 caracterizado porque la proteína de fusión es, entre otras, GST-SH3.1, SH3.1-EGFP, Nck- EGFP y HA-Nck.
11.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a la 10 caracterizado porque las proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos (fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas provienen de Usados celulares o a partir de preparaciones de proteínas purificadas o semipurificadas.
12.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a la 11 caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck se realiza en un entorno libre de células.
13.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T la reivindicación 12 caracterizado porque el entorno libre de células es, entre otras posibilidades, un ensayo de inmunoprecipitación y un ensayo de estimulación del TCR purificado.
14.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a la 13 caracterizado porque los complejos proteína-proteína que mimetizan la interacción CD3ε -Nck son identificados, entre otras posibilidades, por técnicas inmunológicas.
15.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a la 11 caracterizado porque la prepación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck se realiza en un entorno celular, entre otras posibilidades, un ensayo funcional de cuantificación de extensión y despliegue celular, un ensayo funcional de cuantificación de secreción de citoquinas (IL-2 y TNFα), un ensayo funcional de cuantificación de la proliferación celular, un ensayo fucional de cuantificación de la formación de conjugados entre linfocitos T y células APC, un ensayo funcional de cuantificación de la maduración de la IS y un ensayo de dos híbridos (trap assay).
16.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a la 15 caracterizado porque la preparación biológica de la interacción proteína-proteína de CD3ε-Nck y la determinación del bloqueo o activación de dicha interacción tras la adición de un candidato agonista o antagonista se realiza en una situación basal o de control, de estimulación (anti-CD3 y células APC cargadas con superantígeno ó antígeno, entre otros) o de bloqueo (sobreexpresión de SH3.1 de Nck y transducción del anticueφo APA1/1, entre otros) de dicha interacción según el interés en identificar uno u otro agente.
17.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a la 16 caracterizado porque las sustancias químicas candidatas a ser probadas como moduladores de la interacción CD3ε -Nck pueden ser producidos, por ejemplo, por bacterias, levaduras y otros microorganismos (productos naturales), producidos químicamente (por ejemplo, moléculas de pequeño tamaño incluyendo peptidomiméticos), o producidos por ingeniería genética.
18.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 1 caracterizado porque consiste en un tratamiento de terapia génica que permite la regulación de la interacción proteína-proteína de CD3ε y Nck.
19.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según la reivindicación 18 caracterizado porque la regulación es un bloqueo de la interacción CD3ε-Nck que se realiza, entre otras posibilidades, mediante la sobreexpresión del dominio SH3.1 de Nck o por transducción con un anticueφo específico (APA1/1).
20.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y de la 4 a la 19 caracterizado porque forma parte de un protocolo de tratamiento enfermedades que cursan con una activación patológica de los linfocitos T como son, entre otras, enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, diabetes tipo I y miastenia gravis; enfermedades de tipo alérgico; en la prevención y en el tratamiento del rechazo de transplantes y linfomas de linfocitos T.
21.- Procedimiento modulador de la activación de los linfocitos T según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y de la 3 a la 18 caracterizado porque forma parte de un protocolo de tratamiento de enfermedades que cursan con una inhibición de los linfocitos T como son, entre otras, enfermedades infecciosas, bacterianas y virales entre otras, y tumorales.
22.- Secuencia de nucleótidos (DNA, RNA o cDNA) codificantes de proteínas CD3ε y Nck humanas, sus formas homologas o péptidos (fragmentos) que mimetizan la actividad biológica de dichas proteínas o sus formas homologas caracterizada porque forma parte de un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 21.
23.- Vector de expresión caracterizado porque contiene una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 22.
24.- Célula huésped caracterizada porque contiene un vector de expresión según la reivindicación 23.
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