WO2002002553A1

WO2002002553A1 - Compositions pharmaceutiques destinees au traitement de la nephropathie diabetique

Info

Publication number: WO2002002553A1
Application number: PCT/JP2001/005743
Authority: WO
Inventors: Atsuo Tahara; Takeshi Suzuki; Takeyuki Yatsu; Yuichi Tomura; Junko Tsukada
Original assignee: Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2001-07-03
Publication date: 2002-01-10
Also published as: AU2001267911A1

Description

明細書糖尿病性腎症治療用医薬組成物技術分野

本発明は、糖尿病性腎症治療剤、とりわけ顕性期糖尿病性腎症及び早期糖尿病性腎症の治療剤に係るものである。背景技術

糖尿病性腎症とは、慢性の高血糖状態により引き起こされる細小血管障害の一つであり、微量アルブミン尿を経て蛋白尿、腎機能障害、高血圧、浮腫などの徴候を示し腎不全に至る。病状は、腎症前期、早期腎症期、顕性腎症期、腎不全期、透析療法期の 5段階を経て進行する。一般に糖尿病性腎症は、早期には比較的緩除に進行しその病変も可逆性であるが、蛋白尿が陽性となる顕性期になると病変は不可逆性となり急速な腎機能低下を来して末期腎不全に至るとされている (Di abetes, 46, S104-S111, 1997)。

糖尿病初期における腎機能変化の特徴として、微量アルブミン尿と糸球体過剰濾過が挙げられる（Am. J. Med. , 72, 375-380, 1982/Br. Med. J. , 4, 257-259, 1972)。早期糖尿病性腎症においては糸球体内圧の上昇が腎症進行に深く関わっているとされ、糖尿病性腎症が糸球体血行動態の異常に起因するという糸球体過剰濾過説はよく知られている。即ち、糸球体の輸入細動脈と輸出細動脈抵抗の変化によって生ずる糸球体内圧の上昇に起因する糸球体過剰濾過が、腎組織障害に先行して生じ、これがアルブミン尿の惹起と糖尿病性腎症の発症の引き金であると考えられている (Am. J. Med. , 80, 443-453, 1986b)。

一方、顕性期腎症は、臨床的にタンパク尿の認められる病期であり、既に腎機能（糸球体濾過値）が低下しはじめている場合が多い。糖尿病患者にタンパク尿が現れると、数年の経過で腎不全へ進行すると見なされ、如何ともし難い、すなわち治療の難しい疾患であった。糖尿病性腎症の治療は、基本的には①厳格な血糖コントロール、 ②血圧コントロール、 ③タンパク制限食の 3つを基本とした治療が行われ、血圧コントロールにはアンジォテンシン変換酵素（AC E)阻害剤やカルシウム拮抗薬が使用されている。しかし、現在の治療法では、腎症がある程度進行し多量のタンパク尿が出現してくると、増悪をくい止めることは困難である。また、末期腎不全 '透析に進行すると、非糖尿病性腎疾患に比べて予後が悪い。

Bardou らは、バソプレシンが欠損したラットに対しストレブトゾトシン（STZ) を投与して糖尿病を誘発させると、通常の STZ誘発性糖尿病ラットに比べて腎症の発症が減弱されることを報告しており、この結果より生体内においてバソプレシンが糖尿病性腎症の増悪因子として機能しており、治療のターゲットとなり得る可能性が示唆される (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:10397-10402, 1999) 。

1960年代よりバソプレシン構造アナログの合成研究が盛んに行われ、多くのぺプチド性バソプレシン受容体拮抗剤が合成された。しかし、当業者の間では、バソプレシン受容体拮抗剤の臨床への期待は以下の問題から薄れた状況にあった。問題点は、 ®V_1AV₂拮抗作用を有しており、純粋な V_1A拮抗薬或いは V₂拮抗薬が見出されていない、 ②ぺプチド構造を有するため経口投与が不可能である、 ③慢性的に投与すると拮抗作用が消失して、ァゴニスト作用のみが残る、 ④種差が大きく、ラットでは極めて有効でありながら、ィヌ ·サル · ヒトではほとんど拮抗作用がみられない、等である（治療， Vol.81増刊号 ,p309- 314, 1999) 。

事実、 STZ誘発糖尿病性腎症ラットにおいて、 V_1A受容体拮抗剤として知られる 0PC- 21268 (化学名： 1一 [1一 [4— [3— （ァセチルァミノ）プロボキシ] ベンゾィル] ピぺリジン— 4一ィル] — 1, 2, 3, 4—テトラヒドロー 2—キノリノン）を餌に混入して一日量 250mg/kgを摂取させたところ、尿中タンパク排泄量が減少したことが報告されている（Journal of the American Society of Nephrology, Vol.9, Abst. A3284, 1998) 。一方、ヒトの臨床においては、非インスリン依存性糖尿病の早期腎症患者に 0PC-21268 lOOmg投与後 6 0 - 90分で微量アルブミンの尿中排泄量の有意な減少が見られたものの、顕性期腎症患者に対しては投与後 0— 1 20分を通して有意な減少は見られなかった結果が報告されている (Journal of Diabetes and Its Complications, Vol.9, No.4, p326-329, 1995) 。顕性期糖尿病性腎症において明確に尿タンパクを低下させ、且つ、腎機能を改善させることができ、しかも全身血行動態に影響を与えず降圧治療と併用可能な治療薬の創製が求められている。また、早期糖尿病性腎症においても尿中アルプミン排泄量を低下させ、且つ、全身血行動態に影響せずに糸球体血行動態に特異的に作用することにより糸球体過剰濾過を是正できる治療薬、換言すれば、腎症の進展を抑制できる薬剤の創製が求められている。発明の開示

発明者は、種差による影響を受けずにラットと同等以上にヒト V_1A受容体に対して極めて高い親和性及び選択性を有する化合物であれば、顕性期糖尿病性腎症及び Z又は早期糖尿病性腎症の治療薬となり得ると考えて、係るプロフィールを備えた化合物の探索を目的として鋭意研究を行った。

その結果、本発明者は（Z) — 4，— {4， 4—ジフルオロー 5— [2—ォキソ - 2 - (4ーピペリジノピペリジノ) ェチリデン] 一 2, 3, 4, 5—テトラヒドロ— 1 H- 1一ベンゾァゼピン一 1一カルボ二ル} ― 2—メチルー 3—フラニリド（以下、「化合物 A」と略記する）又はその製薬学的に許容される塩が、実施例 1に示す通り、ヒトの V_1A受容体に極めて高い親和性と選択性を有することを見出した。

更に、この化合物が実施例 2と 3に示す通り、顕性期糖尿病性腎症ラットに対して、血圧に影響することなく夕ンパク尿及び腎糸球体病変の優れた改善効果を有することを確認して発明を完成させた。

また、この化合物が実施例 4と 5に示す通り、早期糖尿病性腎症ラットに対して、尿中アルブミン排泄量を低下させ、全身性の血圧に影響することなく腎糸球体過剰濾過を抑制する効果を有することを確認して発明を完成させた。

更に、本発明者は医薬品原料として化合物 A又はその塩の工業的製造を検討する過程において、 1Z2フマル酸塩のみが安定して単一の結晶形を生じることを見出して発明を完成させた。即ち、本発明は、化合物 A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する顕性期糖尿病性腎症治療用医薬組成物に関し、特には、顕性期糖尿病性腎症患者のタンパク尿改善剤、或いは顕性期糖尿病性腎症患者の腎機能改善剤に関する。更に、本発明は、顕性期糖尿病性腎症治療剤の製造の為の化合物 A又はその製薬学的に許容される塩の使用に関する。更に、本発明は、化合物 A又はその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、顕性期糖尿病性腎症の治療方法に関する。

更に、本発明は、化合物 A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する早期糖尿病性腎症治療用医薬組成物に関し、特には、早期糖尿病性腎症患者のアルブミン尿改善剤、或いは早期糖尿病性腎症患者の腎糸球体過剰濾過の改善剤に関する。更に、本発明は、早期糖尿病性腎症治療剤の製造の為の化合物 A又はその製薬学的に許容される塩の使用に関する。更に、本発明は、化合物 A 又はその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、早期糖尿病性腎症の治療方法に関する。

更に、本発明は、化合物 A又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する糖尿病性腎症の進展抑制用医薬組成物に関する。更に、本発明は、糖尿病性腎症の進展抑制剤の製造の為の化合物 A又はその製薬学的に許容される塩の使用に関する。更に、本発明は、化合物 A又はその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、糖尿病性腎症の進展抑制方法に関する。更に、本発明は、新規な化合物 A · 1 / 2フマル酸塩に関する。

' 化合物 Aは、バソプレシン受容体拮抗作用を有する化合物として、その塩酸塩の製造方法が公開技報番号 9 7 - 9 9 5 2号に開示されている。

また、国際公開 W〇 9 5 / 0 6 0 3 5号には、ラットの及びゥサギの ₂受容体結合試験を開示して、以下の一般式（I ) で示される化合物が及びノまたは V ₂受容体拮抗作用を有し、これらの知見に基づき腎疾患（ネフローゼ、腎炎、糖尿病性腎症、慢性若しくは急性腎不全）他多数の疾患の予防及び Z又は治療に有用である可能性が示唆されているが、各疾患について具体的な実験は記載されていない。また、化合物 Aまたはその塩は具体的に開示されていない。

(式中の記号は公報参照）

本発明者は、上記の一般式（ I ) に含まれる無数の化合物の内で、とりわけ化合物 Aまたはその塩がヒトの V _{1 A}受容体に対する親和性 ·選択性が極めて高い優れた拮抗剤であることを見出した。更に、この化合物 Aまたはその塩が、 OPC-21268 が STZ 誘発性糖尿病性腎症ラットの尿中タンパク排泄量を減少させた用量の約 1 %程度の極めて低用量で顕性期糖尿病性腎症ラットのタンパク尿及び腎糸球体病変を改善すること、及び、早期糖尿病性腎症ラットのアルブミン尿及び糸球体過剰濾過を改善することを確認し、これに基づいて本発明を完成した。本発明の医薬は顕著に優れた顕性期糖尿病性腎症の治療剤、早期糖尿病性腎症の治療剤、及びノ又は、糖尿病性腎症の進展抑制剤である。

また、化合物 Aの 1 Z 2フマル酸塩は 1 0 %未満の水一エタノール系からの結晶化においては、結晶多形を形成しない為、安定性や溶解性に関する問題が少ないと考えられる。一般に結晶多形を有する化合物（フリー体又は塩）を医薬品原料とする場合において、原末中に複数の結晶形が含まれると安定性や溶解性においてばらつきが出るために医薬品原末としての規格が担保できない。また、薬物体内動態、さらには薬としての効果に影響を与える可能性がある。従って、結晶多形を有しない化合物 Aの 1 / 2フマル酸塩は安定した薬としての効果を期待できる点で医薬品原料として優れている。以下、本発明を更に詳細に説明する, 化合物 Aは広範囲の無機及び有機の酸あるいは塩基との製薬学的に許容しうる酸及び塩基付加塩を形成しうる。このような塩も、本発明の一部をなす。例えば、塩酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩、フマル酸、リンゴ酸、クェン酸、コハク酸、メシル酸等の有機酸との塩、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、ジエタノールアミン等の有機塩基との塩等が挙げられる。これらの塩は常法により製造できる。また、本発明の医薬の有効成分である化合物 A又はその塩には各種異性体の混合物及びその単離されたもの、水和物、溶媒和物の全てが含まれる。また本発明の医薬の有効成分である化合物 Aまたはその塩には結晶多形を有する化合物（フリー体又は塩）もあり、それら結晶形の全てを包含する。本発明の医薬の有効成分として好ましいのは化合物 Aの 1 / 2フマル酸塩である。

化合物 Aまたはその塩は前記の公開技報番号 9 7 - 9 9 5 2号に記載された製法により、又は後記の実施例 1の製法で、或いはそれに準じて容易に入手可能である。

本発明の薬剤は、経口または非経口投与に適した有機又は無機の担体、陚形剤、その他の添加剤を用いて、常法に従って、経口固形製剤、経口液状製剤または注射剤として調製することができる。最も好ましいのは患者が自ら容易に服用でき且つ保存、持ち運びに便利な経口固形製剤である。

経口固形製剤としては、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤等が用いられる。このような固形製剤においては、一つ又はそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な希釈剤、例えば乳糖、マンニト一ル、ブドウ糖、微結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウムと混合される。組成物は常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加剤、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル口ース（H P M C ) のような結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、スターチ、タルクのような潤滑剤、繊維素グリコール酸カルシウムのような崩壊剤、ラクトースのような安定化剤、グルタミン酸又はァスパラギン酸のような溶解補助剤、酸化チタンのような着色剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必要によりショ糖、ゼラチン、寒天、ぺクチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル口一スフタレ一トなどの糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被膜してもよい。

経口液状製剤は、製薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば精製水、ェタノ一ルを含む。この組成物は不活性な希釈剤以外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。

静注、筋注、皮下注などの注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁剤を包含する。水性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えば注射用蒸留水及び生理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、例えばプロピレングリコ一ル、ポリエチレングリコール、オリ一ブ油のような植物油、エタノ一ルのようなアルコール類、ポリソルべ一ト 8 0等がある。このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えばラクト一ス）、溶解補助剤（例えば、グルタミン酸、ァスパラギン酸）のような補助剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保管フィル夕一を通す濾過、殺菌剤の配合又は照射によって無菌化される。これらはまた無菌の固体組成物を製造し、使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。本発明の有効成分である化合物 A又はその塩の投与量は、投与ルート、疾患の症状、投与対象の年齢、性別等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常経口投与の場合成人 1人当たり有効成分約 1乃至 5 0 O m g Z日、好ましくは 1 0乃至 2 0 O m g /日であり、これを 1回で、あるいは 2〜4回に分けて経口投与される。

尚、本発明の薬剤はインスリン製剤、スルホニル尿素系薬剤、スルホンアミド系薬剤、ビグアナイド系薬剤、アルドース還元酵素阻害剤、 αダルコシダーゼ阻害剤、インスリン抵抗性改善薬、ソマトメジン C製剤、その他血糖降下薬、プロスタノイド関連薬、 A E C阻害剤、アンジォテンシン Π受容体拮抗剤、トロンポキサン合成酵素阻害剤、ビタミン Β製剤、漢方製剤、カルシウム拮抗剤、利尿剤等の糖尿病の治療に用いる薬剤と同時にまたは時間をおいて併用することができる。インスリン製剤としてはインスリン、中性インスリン、無晶性インスリン亜鉛水性懸濁、二相性イソフェンインスリン水性懸濁、イソフェンインスリン水性懸濁、インスリン亜鉛水性懸濁、プロ夕ミンインスリン亜鉛水性懸濁、結晶性ィンスリン亜鉛水性懸濁；スルホニル尿素系としてはトルプタミド、グリクロビラミド、ァセトへキサミド、トラザミド、クロルプロパミド、ダリペンクラミド、ダリクラジド；スルホンアミド系薬剤としてはダリブゾール；ビグアナイド系薬剤としては塩酸メトホルミン、塩酸ブホルミン；アルドース還元酵素阻害剤としてはェパルレスタツト；ひグリコシダーゼ阻害剤としてはポグリポース、ァカルポース；インスリン抵抗性改善剤としては卜ログリタゾン、ピオグリタゾン；ソマトメジン C製剤としてはメカセルミン；その他血糖降下薬としてはナテグリニド；プロスタノイド関連薬としてはベラプロスト、アルプロスタジルアルファデックス、リポ P G E リマプロス卜アルファデックス； A C E阻害剤としてはマレイン酸ェナラプリル；漢方製剤としては牛車腎気丸；等が挙げられる。図面の簡単な説明

図 1は化合物 A · 1 / 2フマル酸塩の各種晶出条件の結晶の粉末 X線回折スぺクトルの多重記録図を示す。

図 2は化合物 A · 1 / 2フマル酸塩の結晶の T G— D S Cの熱重量分析を示す。図 3は試験例 2の顕性タンパク尿を呈する STZ誘発糖尿病性腎症ラッ卜試験プ口トコ一ルを示す。

図 4は尿中アルブミン排泄量に対する化合物 Aの作用を示す。

図 5は尿中タンパク排泄量に対する化合物 Aの作用を示す。

図 6は収縮期血圧に対する化合物 Aの作用を示す。

図 7は腎糸球体病変に対する化合物 Aの作用を示す。

図 8は試験例 3の高血圧を伴う糖尿病性顕性期腎症ラット試験プロトコールを示す。

図 9は尿中アルブミン排泄量に対する化合物 Aの作用を示す。

図 1 0は尿中タンパク排泄量に対する化合物 Aの作用を示す。図 1 1は収縮期血圧に対する化合物 Aの作用を示す。

図 1 2は腎糸球体病変に対する化合物 Aの作用を示す。

図 1 3は試験例 4の微量アルブミン尿を呈する STZ誘発糖尿病性早期腎症ラッ卜試験プロトコ一ルを示す。

図 1 4は尿中アルブミン及び 4型コラーゲン排泄量に対する化合物 Aの作用を示す。

図 1 5は全身及び腎循環動態に対する化合物 Aの作用を示す。

図 1 6は糸球体血行動態に対する化合物 Aの作用を示す。

図 1 7は試験例 5の微量アルブミン尿を呈する STZ誘発糖尿病性早期腎症ラッ卜試験プロトコ一ルを示す。

図 1 8は尿中アルブミン及び 4型コラーゲン排泄量に対する化合物 Aの作用を示す。

図 1 9はクレアチニンクリアランス及び収縮期血圧に対する化合物 Aの作用を示す。

図 2 0は腎糸球体病変に対する化合物 Aの作用を示す。

図 2 1は尿細管病変に対する化合物 Aの作用を示す。

発明を実施するための最良の形態

以下に実施例及び試験例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等に限定されるものではない。

実施例 1 '

化合物 A (フリー体)

4 一 [ ( 2 —メチルフラン— 3 —力ルポニル）ァミノ ] 安息香酸 (104. 30g, 426雇 ol)、塩化チォニル（37. 3ml, 511誦 ol)及びジメチルホルムアミド (0. 70ml)のテトラヒドロフラン（500ml)の混合溶液を室温下、 7時間攪拌した。反応液を減圧下濃縮し、ァセトニトリル aoomi)を加え再び濃縮した。残渣のァセト二トリル（300ml)溶液を、（Z ) — 4 ' 一 { 4 , 4ージフルオロー 5— [ 2—ォキソー 2— ( 4—ピペリジノピペリジノ）ェチリデン] 一 2 , 3 , 4 , 5—テトラヒドロ— 1 H— 1—ベンゾァゼピン（138.48g, 356匪 ol,公開技報番号 97-9952号）のァセトニトリル（1， 000ml)溶液に氷冷下ゆつくりと滴下して、滴下後 1時間室温で攪拌し、終夜放置した。生じた結晶を濾取し、化合物 Aの塩酸塩（215.37g)を淡褐色粉末として得た。この塩酸塩（150.10g)に氷冷下、水（400ml)、 1 M水酸化ナトリウム水溶液（1, 875ml)及びクロ口ホルム（800ml)を加え、同温度にて 1 5分間攪拌した。有機層を分取した後、水層をクロ口ホルム（300mlX2)にて抽出し、有機層を合わせて無水硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸ェチル（150ml)及びへキサン（300ml)を加え、室温にて 19時間攪拌した。析出した固形物を濾取した後、 50°Cにて 72時間減圧下にて乾燥し、化合物 A (127.35g)を淡黄色粉末として得た。実施例 2

( 1) 化合物 A · 1 /2フマル酸塩（lot 2)

化合物 A (0.50g)をエタノール（5ml)に溶解し、フマル酸—エタノール溶液 (0.25mol/l, 1.62ml)を加えた後、室温にて 116時間静置した。析出した固体を濾取し、エタノール—酢酸ェチル混合溶液（1:2)にて洗浄した後、 60°Cにて 168時間減圧下にて乾燥し、表題化合物（0.48g)を橙白色結晶性粉末として得た。

(2) 化合物 A · 1 2フマル酸塩の再結晶化（lot 6)

化合物 A · 1/2フマル酸塩（2.08g)を加熱還流下、エタノール一水混合溶媒 (90:10, 40ml)に溶解した後、室温にて 159時間静置した。析出した固体を濾取し、冷エタノールにて洗浄した後、 50°Cにて 336時間減圧下にて乾燥し、表題化合物 (1.41g)を濃帯褐白色結晶性粉末として得た。 '

即 239- 241°C

1H -薩 R(DMS0 - d₆) δ :1.25-1.75 (1 OH, m), 1.75-1.95 (2H, i), .35-2.90 (7H, m), 2.65 (3H, s), 2.95-3.25 (2H, m), 3.98 (1H, d, J-12.9Hz), 4.45 (1H, d, J=12.9Hz),

6.53 (1H, s), 6.75-6.90 (2H, m), 7.00-7.23 (4H, m), 7.29 (1H, t, J=7.5Hz), 7.47-

7.60 (4H, m), 9.78 (1H, s).

(3) 化合物 A · 1 Z2フマル酸塩の再結晶化（lot 9) , 化合物 A · 1/2フマル酸塩（2.02g)を加熱還流下、エタノール一水混合溶媒 (90:10, 43ml)に溶解した後、室温にて 15時間攪拌した（攪拌子を使用）。析出した固体を濾取し、冷エタノールにて洗浄した後、 50 にて 336時間減圧下にて乾燥し、表題化合物（1.57g)を微帯褐白色結晶性粉末として得た。

(4) 化合物 A · 1/2フマル酸塩の再結晶化（lot 12)

化合物 A · 1/2フマル酸塩（6.02g)を加熱還流下、エタノール一水混合溶媒 (90:10， 145ml)に溶解した後、室温にて 15時間攪拌した（攪拌羽根を使用）。析出した固体を濾取し、冷エタノールにて洗浄した後、 50°Cにて 431時間減圧下にて乾燥し、表題化合物（4.35g)を帯褐白色結晶性粉末として得た。

(5) 化合物 A · 1Z2フマル酸塩の再結晶化（lot 15)

化合物 Α · 1Z2フマル酸塩（4. llg)にエタノール（151ml)を加え、 56°Cにて 30 分間攪拌し、均一溶液とした。同温度にてフマル酸一エタノール溶液 (0. 5M, 13.3ml)を加えて 10分間攪拌した後、室温にて 15時間攪拌した（いずれの攪拌条件にも攪拌羽根を使用）。析出した固体を濾取し、冷エタノールにて洗浄した後、 50°Cにて 288時間減圧下にて乾燥し、表題化合物（4.31g)を微帯褐白色結晶性粉末として得た。参考例 1

化合物 A ·塩酸塩

化合物 A(0.56g)をメタノール（6ml)に溶解し、 4 N塩酸—酢酸ェチル（4.5ml)を加えて濃縮した後、残渣を水一エタノール（1:10, 3ml)で加熱溶解し、室温にて終夜静置した。析出した固体を濾取し、エタノール—酢酸ェチル混合溶液（1:1)にて洗浄した後、 60°Cで減圧下にて乾燥し、表題化合物（0.31g)を淡黄色結晶性粉末として得た。 mp 229-231°C

参考例 2

化合物 A ·硫酸塩

化合物 A (0.50g)をエタノール（5ml)に溶解し、硫酸一エタノール溶液 (lmol/1, 0.81ml)を加えた後、室温にて 116時間静置した。析出した固体を濾取し、エタノ一ルー酢酸ェチル混合溶液（1： 2)にて洗浄した後、 60でにて 168時間減圧下にて乾燥し、表題化合物（0.31g)を淡黄色結晶性粉末として得た。 mp 224-227T 参考例 3

化合物 A · 1/2コハク酸塩

化合物 A (0.50g)をエタノール（5ml)に溶解し、コハク酸一エタノール溶液 (lmol/1, 0.81ml)を加えた後、室温にて 116時間静置した。析出した固体を濾取し、ェ夕ノ一ルー酢酸ェチル混合溶液（1： 2)にて洗浄した後、 60°Cにて 168時間減圧下にて乾燥し、表題化合物（0.21g)を淡橙色結晶性粉末として得た。 mp 187-190°C 参考例 4

化合物 Α··メタンスルホン酸塩

化合物 A(0.50g)をエタノール（5ml)に溶解し、メタンスルホン酸一エタノール溶液（lmol/1, 0.81ml)を加えた後、室温にて 116時間静置した。析出した固体を濾取し、ェタノ一ルー酢酸ェチル混合溶液（1:2)にて洗浄した後、 60 にて 168時間減圧下にて乾燥し、表題化合物（0.45g)を淡橙色結晶性粉末として得た。

即 256-258°C 化合物 Aの塩酸塩、硫酸塩、 1Z2コハク酸塩及びメタンスルホン酸塩は晶出条件の違いにより粉末 X線回折パターンが変化し、結晶多形が観られたが、 1Z 2フマル酸塩は晶出条件の違いにより粉末 X線回折パターンは変化しなかった。また、 1Z2フマル酸塩は、いずれの晶出条件においても同様の TG—D S C曲線を示し、結晶転移、脱水等のピークは認められず、一本の吸熱ピークのみを示した。

図 1に、化合物 A · 1Z2フマル酸塩の表 1の晶出条件の結晶の Cu—Ko;線を使用して得られる粉末 X線回折スぺクトル図を示す。

表 1

再結晶溶媒攪拌

実施例 2 (2) Lot 6 エタノール/水 = 9 ： 1

実施例 2 (3) Lot 9 エタノール Z水 =9 ： 1 攪拌子

実施例 2 (4) Lot 12 エタノール Z水 =9 ： 1 攪拌羽根

実施例 2 (5) Lot 15 エタノール攪拌羽根測定条件は以下の通りである。

装置；理学電機製 RIN IOGS型粉末 X線回折装置

夕ーゲット； Cu 電圧； 40kV 電流； 40mA スキャンスピード 3.0°/min 図 2に化合物 A · 1 /2フマル酸塩の結晶の TG— DSC熱重量分析結果を示す。測定条件は以下の通りである。

装置；理学製 TG8110 (TG— DS C) 型熱分析装置

試料量；約 10mg 試料セル；アルミニウムオープンセル，

窒素ガス流量 50〜100ml/min 昇温速度； 10°C/min 実施例 3 錠剤

以下の処方をのカプセル剤を製造した。

表 2

実施例 4 錠剤

化合物 Α · 1Z2フマル酸塩 100g、 HPMC 2910300g、ポリソルベート 8 0 50gをメタノール ·水混液（9:1) 4550gに溶解した。次に、流動層造粒機（ュ二グラット、大川原製作所社製）を用いて、乳糖 442g、及び炭酸水素ナトリウム 150gを流動化し、前記溶解液を噴霧して造粒末を得た。得られた造粒物 834g、結晶セルロース（商品名アビセル P HI 02、旭化成社製） 240g、クロスカルメロースナトリウム（商品名 Ac—D i— S o 1、旭化成社製） 120g、ステアリン酸マグネシウム 6gを均一に混合し、この混合物をロータリ一式打錠機（畑製作所社製)' を用いて打錠圧 700kg/杵で一錠あたり 150mg (化合物 A · 1

lOmg) 直径 7.5mmの錠剤を製造した。実施例 5 注射剤

表 3

上記成分を混合し、注射剤とした試験例 1 ヒトバソプレシン V_1A受容体親和性及び選択性試験

(1) ヒトバソプレシン受容体発現細胞膜標本を用いた受容体結合試験

(方法）

①膜標本作製

ヒトのバソプレシン (AVP)受容体サブタイプ発現 Chinese hamster ovary (CHO) 細胞及び膜標本の作製は報告されている方法によって行った (Br. J. Pharmacol., 125:1463-1470, 1998) ₀ 即ち、ヒト発現ベクターの pEF- BOS (Nucle . Acids. Res. , 18:5322, 1990) に各ヒト AVP 受容体遺伝子及び dihydrofolate reductase 遺伝子を組み込み、 LipofectAMINE 試薬を用いて dihydrofolate reductase遺伝子欠損 CH0細胞に導入を行った。その後、 CH0細胞を核酸非存在下、 100 nMの amethopterin及び 10% FCS存在下の MEM- alphaメディゥムで 2 週間培養を行い、生存したコロニーを取り出し、更に amethopterin の添加濃度を 1 Mまで上げて培養を続け、 CH0細胞の選択を行った。コンフルェントに増殖させた細胞を PBSで洗浄した後、氷冷した低張 buffer(10mM Tris- HC1, 5mM EDTA, pH=7.4)にスクレーパーを用いて回収した。集めた細胞をホモジナィズし、遠心分離（35, OOOXg 20 分， 4 。C)をした後、得られた膜サンプルを保存 buffer (50mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, pH=7.4)で懸濁して- 80 °Cで使用するまで保存した。

②受容体結合実験

飽和結合実験は膜標本と種々の濃度の [¾]AVP(0.05-3. OnM)を混和させてチューブ内でィンキュベーションを行った。置換実験では一定濃度（0.5-1. OnM)の [¾]AVP と膜標本を種々の濃度の化合物 A ·フマル酸塩と混和してインキュベーシヨンを行った。アツセィは全量 250 a 1 で、アツセィバッファ一は 50mM Tris-HCl, 10mM MgCl₂, 0.1% BSA(pH=7.4)で行い、インキュベーション時間は室温 (25 °C)で 1時間行った。インキュべ—シヨン終了後、氷冷した Tris buffer (50 Tris-HCl, ΙΟιΜ MgCl₂, pH=7.4)を添加して反応を停止させ、吸引濾過を行って 96-well GF/C UniFilterに膜標本を回収した。フィルタ—を洗浄した後、放射活性を計測した。非特異的結合は非放射ラベルの AV 1 Μ)を用いて求めた。化合物 Αの各膜標本に対する [¾]AVP の特異的結合を 50%抑制する濃度（IC₅。値）はィ匕合物 Aの置換曲線の回帰分析から求めた。阻害定数 ( 値）は = Ιϋ₅₀/(1+[ϋ/^) 'から求めた（[L]はチューブ内の放射リガンドの濃度、（解離定数）は飽和結合実験から Scatchard plot解析から求めた値）。

(2) ラット組織膜標本を用いた受容体結合試験

①膜標本作製

ラットを放血致死させた後、肝臓、腎臓及び下垂体を摘出した。全ての操作は 4 °C環境下で行った。肝臓 (J.Biol. Chem., 258:9283— 9289, 1983)、腎臓

(J. Biol. C em.， 247:6167-6175, 1972)及び下垂体前葉

(Biochem. Biophys. Res. Com匪. , 115:492-498, 1983)膜標本は定法に従って調製した。

②受容体結合実験

(1) の受容体結合試験と同様の方法で試験を行った。

(結果）

(1) ヒトパソプレシン受容体発現細胞膜標本を用いた受容体結合試験化合物 Αはヒト V_1A受容体に対して高い親和性を示した ( =0.30±0.02 nM)。化合物 Aは ν_1Β¾ = 2¾500 ± 2500 nM), V₂(381 ± 74 nM)受容体に対して V t _A 受容体に比して少なくとも 1000倍以上低親和性であった。

(2) ラット組織膜標本を用いた受容体結合試験

化合物 Aはラット肝臓 V_1A受容体に対して高い親和性を示した（ = 0.50 ± 0.04 nM)。化合物 Aは V_1A受容体に比して下垂体 V_1B½ = 1510 ± 190 nM),腎臓 V ₂ ( = 72. 2 ± 15. 4 nM)受容体に対して低親和性であった。

化合物 Aのヒト及びラットの V _{1 A}受容体に対する親和性、選択性を表 4に示す。表 4

表 4に示したとおり化合物 Aはラッ卜及びヒトの V _{1 A}受容体に対して非常に強い親和性を示した。また、ヒトの V _{1 A}受容体に対する選択性は、ラット受容体の場合の約 9倍高い結果を示した。以上の結果から、化合物 Aは極めて強力かつ選択的なヒト V _{1 A}受容体拮钪剤であることが確認された。

一方、 0PC-21268はヒト V _{1 A}受容体にはほとんど親和性を示さず、これが臨床の顕性期糖尿病性腎症患者に対して無効であった理由と考えられる。試験例 2 顕性タンパク尿を呈する STZ誘発糖尿病性腎症ラット試験

化合物 Aの蛋白尿を呈する重篤な糖尿病性顕性腎症モデルにおける改善効果について、現在汎用されている治療薬であるマレイン酸ェナラプリルを比較対照として検討した。 '

(方法）

① STZ誘発糖尿病ラットの作製

実験には雄性 Wi s t ar rat (日本チヤ—ルス ·リバ—、 8週齢）を用いた。ペントバルビタール麻酔下（50mg/kg)に大腿静脈より STZ (50mg/kg)をクェン酸バッファーに溶解して投与し糖尿病を誘発させた。正常群は STZの代わりに同液量のクェン酸バッファーを静脈内投与した。

② STZ誘発糖尿病ラットにおける化合物 Aの腎症改善効果の検討

実験プロトコールを図 1に示した。 STZを投与して糖尿病を惹起させてかち 1 6 週間後に尿中アルブミン排泄量、尿中タンパク排泄量、血圧、血糖値を測定し、各パラメ—夕—が均等になるように糖尿病ラットを 3群に分けた。

1 ) 正常群（n=18) 2 ) 糖尿病対照群： 0. 5%メチルセルロース溶液経口投与（n=24)

3 ) 化合物 A投与群：化合物 A · 1 / 2フマル酸塩（3mg/lig/day)経口投与（n=24)

4 ) ェナラブリル投与群：マレイン酸ェナラプリル（1 Omg/kg/day)経口投与（n=24) 群分け日より各薬物を 0. 5%メチルセル口一ス溶液に懸濁して 5 ml/kgの液量にて 1日 1回 8週間連投し、 2週ごとに採血及び採尿（24時間蓄尿）、体重、尿量、飲水量、収縮期血圧の測定を行った。得られた血液は直ちに徐蛋白を行い、定法に基づき血糖値を測定した。また、得られた尿サンプルより尿中アルブミン濃度及び尿中タンパク濃度を測定し、尿量を乗じて尿中アルブミン排泄量及び尿中夕ンパク排泄量を算出した。また、尿中 4型コラーゲン濃度も測定し、同時に測定した尿中クレアチニン量で補正をして尿中 4型コラーゲン排泄量を算出した。尿糖値は定法に基づき測定を行つた。

また、連投 8週目の採尿実験終了後にエ-テル麻酔下に下大動脈より全採血を行い、血漿中クレアチニン量及び血中尿素窒素を測定した後に灌流固定を行い腎臓を摘出して組織病変の検討を行った。血漿中クレアチニンは同時に測定した尿中クレアチニン量と体重で補正を行いクレアチニンクリアランスを算出した。収縮期血圧は無麻酔下でのカフ圧迫による非観血的測定法 (PS-200A、理研開発株式会社)で尾動脈の収縮期圧を測定した。

腎組織固定及び病理検査は、エーテル麻酔下に腎臓を生理食塩水及びリン酸緩衝 10%ホルマリン液で 10分間灌流固定し、中央部より約 4龍厚の横断スライスを作製し、更にリン酸緩衝 10%ホルマリン液に浸漬固定した。この腎臓固定材料より、パラフィン切片を作製し、 H&E染色及び PAS染色を施して鏡検を行った。糸球体病変は各ラットにっき 100個の糸球体を下記のグレードに従って分類した。ノーマル異常なし

グレード 1 メサンギゥム領域の 1 /2未満で基質の増加が見られる

グレード 2 メサンギゥム領域の 1 /2以上で基質の増加が見られる

グレード 3 糸球体の一部がポウマン嚢と癒着し、硬化像を呈する

(結果）

①体重、血糖値、尿糖値、尿量及び飲水量に対する化合物 Aの作用正常群では経時的な体重増加が認められたが、糖尿病対照群では体重の増加は見られず、正常群と比して有意に減少していた。血糖値及び尿糖値においても糖尿病対照群で有意な上昇が認められ、試験期間を通じて常に高血糖及び高尿糖を呈し続けた。また、糖尿病対照群では試験期間中を通じて常に尿量及び飲水量の顕著な増加が認められた。これらの糖尿病対照群で見られた体重減少、高血糖ノ尿糖、多飲多尿に対して化合物 A及びェナラプリルは何の影響も示さなかった。

②尿中アルブミン排泄量、尿中タンパク排泄量及び尿中 4型コラーゲン排泄量に対する化合物 Aの作用

尿中アルブミン排泄量及び尿中タンパク排泄量の薬物連投 8週後の結果を図 4 と 5に示した。正常群に比して糖尿病対照群において尿中アルブミン排泄量及び尿中タンパク排泄量の有意な増加が認められた。尿中アルブミン排泄量及び尿中タンパク排泄量においては化合物 A (3mg/kg/day)投与群及びェナラプリル ( 10mg/kg/day)投与群でともに改善効果を示した。尿中 4型コラーゲン排泄量においても正常群に比して糖尿病対照群で有意に上昇が認められ、化合物 A投与群で有意な改善効果が、ェナラブリル投与群では有意ではないが改善傾向が認められた。

③クレアチニンクリアランス、血中尿素窒素及び収縮期血圧に対する化合物 Aの作用

正常群に比して糖尿病対照群においてクレアチニンクリアランスの有意な上昇が認められ、化合物 A投与群で有意な低下作用が認められた。ェナラプリル投与群では低下傾向を示すのみであった。血中尿素窒素においては、正常群、糖尿病対照群及び各薬物投与群全てにおいて著明な差は認められなかった。

収縮期血圧の薬物連投 8週後の結果を図 6に示した。血圧においては、正常群と比して糖尿病対照群において有意な上昇が認められた。化合物 A投与群では血圧に全く影響を示さなかったが、ェナラプリル投与群では有意な降圧作用を示した。

④腎糸球体病変に対する化合物 Aの作用

各グレード別の糸球体病変出現率を図 7に示した。正常群に比して糖尿病対照群では病変の出現率及びそのグレードは顕著に増加した。薬物投与群では化合物

Aにおいてグレード 1病変において有意な改善が、グレード 2及び 3病変においても改善傾向が認められたが、ェナラプリルでは改善効果は認められなかった。試験例 3 高血圧を呈する STZ誘発顕性期糖尿病性腎症ラッ卜試験

高血圧を合併した糖尿病性腎症における化合物 Aの腎症改善作用について検討することを目的として、自然発症高血圧ラッ卜に片腎摘出を施した後に STZ投与を行い、高血圧を伴う糖尿病ラットを作製して評価を行った。対照薬にはマレイン酸ェナラプリルを使用した。

(方法）

①高血圧を呈する糖尿病性腎症ラットの作製

実験には雄性自然発症高血圧ラット（SHR,日本チヤ一ルス *リバー， 8週齢）を用いた。ペントバルビタール（50mg/kg, i. p. )麻酔下に右腎を摘出し、 1 週後に大腿静脈より STZ (35 mg/kg)をクェン酸バッファーに溶解して投与し、糖尿病を惹起させた。非糖尿病群は同じく SHRに右腎摘出を施さず、 STZの代わりに同液量のクェン酸バッファ—を静脈内投与した。

②高血圧を呈する糖尿病性腎症ラットにおける化合物 Aの腎症改善効果の検討実験プロトコ—ルを図 8に示した。 STZ投与 1週後に尿中アルブミン排泄量、タンパク排泄量、収縮期血圧、血糖値を測定し、各パラメーターが均等になるように糖尿病ラットを 3群に分けた。

1 ) 非糖尿病群 (n=20)

2 ) 糖尿病対照群： 0. 5%メチルセルロース溶液経口投与（n=24)

3 ) 化合物 A投与群：化合物 A · 1 Z 2フマル酸塩（3mg/kg/day)経口投与（n=24)

4 ) ェナラブリル投与群：マレイン酸ェナラプリル（l Omg/kg/day)経口投与（n=24) 群分けした当日より各薬物を 0. 5%メチルセルロースに懸濁して 5 ml/kgの液量にて 1日 1回 8週間経口投与し、 2週ごとに採血、採尿（24時間蓄尿時の尿量及び飲水量測定）、体重測定及び収縮期血圧測定を行った。試験例 1と同様にして、血糖値、尿中アルブミン排泄量、尿中タンパク排泄量、尿中 4型コラーゲン排泄量、尿糖値、クレアチニンクリアランス、血中尿素窒素、糸球体病変を測定、算出した。 .

(結果）

①体重、血糖値、尿糖値、尿量及び飲水量に対する化合物 Aの作用

非糖尿病群では経時的な体重増加が認められたが、糖尿病対照群では体重の増加は見られず、非糖尿病群と比して糖尿病対照群の体重は有意に減少していた。血糖値及び尿糖値においても糖尿病対照群で有意な上昇が認められ、試験期間を通じて常に高血糖及び高尿糖を呈し続けた。また、糖尿病対照群では試験期間中を通じて常に尿量及び飲水量の顕著な増加が認められた。これらの糖尿病対照群で見られた体重減少、高血糖/尿糖、多飲多尿に対して化合物 A及びェナラブリルは何の影響も示さなかった。

尿中アルブミン排泄量及び尿中タンパク排泄量の薬物連投 8週後の結果を図 9 と 1 0に示した。非糖尿病群に比して糖尿病対照群において尿中アルブミン排泄量及び尿中タンパク排泄量の有意な増加が認められた。尿中アルブミン排泄量び尿中タンパク排泄量においては化合物 A及びェナラプリル投与群で改善効果が見られた。尿中 4型コラーゲン排泄量においても非糖尿病群に比して糖尿病対照群で有意に上昇が認められ、化合物 A及びェナラプリル投与群で有意な改善効果が認められた。

非糖尿病群に比して糖尿病対照群においてクレアチニンクリアランスの有意な上昇が認められ、化合物 A投与群で有意な低下作用が認められた。ェナラプリル投与群では低下傾向を示すのみであった。血中尿素窒素においては、非糖尿病群に比して糖尿病対照群では有意な上昇が認められたが、薬物投与による改善効果は認められなかった。

収縮期血圧の薬物連投 8週後の結果を図 1 1に示した。収縮期血圧においては、非糖尿病群で経時的な血圧上昇が認められたのに対して糖尿病対照群では若干の低下が認められた。化合物 A投与群では血圧に全く影響を示さなかったが、ェナラプリル投与群では有意な降圧作用を示した。， . ④腎糸球体病変に対する化合物 Aの作用

各グレード別の糸球体病変出現率を図 1 2に示した。非糖尿病群に比して糖尿病対照群では病変の出現率及びそのグレードは顕著に増加した。化合物 A及びェナラブリル投与群では各グレードでの病変改善作用が認められた。試験例 2と 3の結果より、化合物 Aが、対照化合物であるェナラプリルより低用量で尿中アルブミン Z夕ンパク排泄量増加及びクレアチニンクリァランス上昇を改善することが示された。この時の薬物投与群の血中尿素窒素値が正常群と変化がないことから、このクレアチニンクリアランスの改善による腎機能の過度の低下は起こっていないことが示唆された。

化合物 Aは降圧作用を有さないにも関わらずェナラプリルと同等以上の腎症改善作用を示したことから、降圧作用に依存せず、腎臓特異的な作用機序を有していることが示唆された。一方、腎糸球体病変については、本試験において糖尿病対照群では非糖尿病群に比して明らかに差別化できる病変が認められ、化合物 A による有意な改善効果が認められた。

化合物 Aによる尿中アルブミン/タンパク排泄量増加の改善作用については、上昇したクレアチニンクリアランスを低下させ、糸球体過剰濾過を改善することにより糸球体内圧を低下させた結果であると考えられる。

以上の結果より、顕性蛋白尿を呈する糖尿病性腎症ラット及び高血圧を伴う糖尿病性腎症ラットに対して、化合物 Aは最も汎用されている治療薬であるマレイン酸ェナラプリルよりも低用量でタンパク尿、腎機能及び腎糸球体病変を改善できることが確認された。更には、血圧に影響を与えないことから、従来使用されている降圧剤との併用治療も可能であることが示唆された。試験例 4 微量アルブミン尿を呈する STZ誘発糖尿病性早期腎症ラット試験（4 週間経口連続投与）

化合物 Aの 4週間経口連続投与による微量アルブミン尿を呈する糖尿病性早期腎症ラットにおける腎症及び腎機能改善効果について、現在汎用されている治療薬であるェナラブリルを比較対照として検討した。

(方法)

① STZ誘発糖尿病性早期腎症ラットの作製

実験には雄性 Wi s t arラット（日本チヤ一ルス 'リバ—、 10週齢）を用いた。プロトコ一ルの概略を図 1 3に示した。ラットは STZ投与前に尿中アルブミン排泄量を測定し、均等に 4群に分けた。

1 ) 正常群： 0. 5%メチルセルロース溶液経口投与（n=9)

2 ) 糖尿病対照群： 0. 5%メチルセルロース溶液経口投与（n=9)

3 ) 化合物 A投与群：化合物 A · 1/2フマル酸塩（3mg/kg/day)経口投与（n=9)

4 ) ェナラプリル投与群：マレイン酸ェナラプリル（10 mg/kg/day)経口投与 (n=9)

ペントバルビ夕一ル (50 mg/kg)麻酔下にラット大腿静脈より STZ (50 mg/kg) をクェン酸バッファーに溶解して投与し糖尿病を誘発させた。正常群には STZの代わりに同液量の生理食塩水を静脈内投与した。 STZ投与翌日より各薬物を 0. 5% メチルセルロース溶液に懸濁して 5 ml/kgの液量にて 1日 1回の経口連続投与を開始した。薬物連投後 4週目において、代謝ケージにて 24時間採尿を覚醒下において行い、得られた尿サンプルより尿中アルブミン、 4 型コラーゲン及びクレアチニン排泄量を求めた。

②化合物 Aの全身血行動態及び腎機能に対する作用

上記採尿実験を終了したラットはその後も 1 日 1回の薬物投与を継続し、同一週において腎クリアランス実験を行った。全身血行動態及ぴ腎機能測定当日は、薬物投与を行ってから 2時間後にイナクチン（l OOmg/kg)麻酔下にラットの右大腿動脈に血圧測定及び採血用のポリエチレンカテーテルを挿入した。また左右大腿静脈に薬物投与用のカテーテルを挿入した。ィヌリンクリアランス測定のため、右大腿静脈の力ニューレより生理食塩水に溶解した 1 ィヌリン溶液を 1. 5ml/kg 投与した後、正常群では 0. lml/min、糖尿病群では 0. 2 ml/minの容量にて持続注入を行った。左側腹部を切開し左腎を露出させ左腎動脈を剥離した後、腎血流量測定用プローブを装着し、電磁血流計に接続した。更に左腎輸尿管を剥離した後、末梢側を結紮しポリエチレンカテーテルを挿入して、経時的に尿を採取した。血圧は動脈に挿入したカテーテルを圧トランスデューサに接続し、ポリグラフシステムを介して連続的に記録した。心拍数は血圧の脈派より夕コメ一夕一を駆動することにより測定した。腎血流量もポリグラフシステムを介し血圧と同様に連続的に記録した。ィヌリンの持続注入開始後約 1時間程度の安定期間をおき、血行動態及び尿量が安定したことを確認してから 20分間の採尿を開始した。採尿開始 10分後の中間点において、平均血圧、心拍数及び腎血流量を計測し基礎値とした。血中ィヌリン濃度測定及びへマトクリツト値算出のため、同時点において動脈血を採取し、直ちに同量の生理食塩水を静脈内へ補液した。

③化合物 Aの糸球体血行動態に対する作用

20分間の採尿終了後左腎を注意深く周囲の組織より剥離し、血管支配が少ない腎外側部位の皮膜を切開（直径 1醒、深さ 0. 3mm程度）した。そして、マイクロマニピユレ一夕に装着したペンシル型 CCD生体顕微鏡の先端を、尿細管を傷つけないよう腎表面に対して斜めに導いた。マイクロマニピュレータを操作し、実験の侵襲によって血流が阻害されず、糸球体輸入、輸出細動脈及び糸球体外周が確認できる糸球体を 1個体につき 2 - 6個観察した。糸球体画像はビデオカセットレコーダによりテープに連続的に記録し、糸球体輸入、輸出細動脈及び糸球体径の計測に用いた。糸球体血行動態の測定終了後、腹部大動脈より血中クレアチニン濃度測定用血液を採取し、左腎を摘出して湿重量を測定した。

④血中及び尿中パラメータ—測定

試験例 1と同様にして、血糖値、尿中 4型コラーゲン排泄量、尿中アルブミン排泄量、尿中タンパク排泄量、クレアチニンクリアランスを測定した。ィヌリン濃度はアルカリヒ—ティング法によりグルコースの影響を除いた後、アンスロン法により定量した。血漿及び尿中ィヌリン濃度よりィヌリンクリアランスを求め糸球体濾過率とした。 (結果）

①体重、血糖値、尿糖値及び尿量に対する化合物 Aの作用

正常群に比して糖尿病対照群では有意な体重の減少が見られた。血糖値、尿糖値及び尿量においても正常群に比して糖尿病対照群で有意な上昇が認められた。これらの糖尿病対照群で認められた体重減少、高血糖、高尿糖及び多尿に対して化合物 A及びェナラプリルは有意な作用を示さなかった。

②尿中アルブミン及び 4型コラーゲン排泄量に対する化合物 Aの作用

各群の薬物連投 4週時での尿中アルブミン及び 4型コラゲン排泄量を図 1 4 に示した。正常群に比して糖尿病対照群において尿中アルブミン及び 4型コラーゲン排泄量の有意な増加が認められた。これらに対して化合物 A及びェナラブリル投与群でともに有意な改善効果が認められた。

③全身及び腎循環動態に対する化合物 Aの作用

各群の薬物連投 4週時での各パラメ—夕一の値を図 1 5に示した。平均血圧は正常群と糖尿病対照群との間で有意な変化は認められず、腎血流量も糖尿病対照群で増加傾向があるものの有意ではなかった。一方、クレアチニンクリアランスは正常群に比して糖尿病対照群で増加傾向を示し、糸球体濾過率は有意な増加が認められた。化合物 A投与群では平均血圧及び腎血流量に有意な変化は示さなかつたが、クレアチニンクリアランス及び糸球体濾過率は低下傾向を示した。ェナラプリル投与群では平均血圧は糖尿病対照群に比して有意に低下した。また、腎血流量は有意な増加が認められ、クレアチニンクリアランスは低下傾向、糸球体濾過率はわずかに増加傾向を示した。

④糸球体血行動態に対する化合物 Aの作用

各群の薬物連投 4週時での各パラメ一夕—の値を図 1 6に示した。正常群に比して糖尿病対照群では糸球体輸入細動脈径の著しい増加が見られたものの、輸入細動脈径には有意な変化は見られず、輸入 Z輸出細動脈径比は有意に増加した。加えて糸球体径も正常群に比して糖尿病対照群で有意に増加をしていた。化合物 A投与群では輸入細動脈径には有意な変化は認められなかったが、輸出細動脈径の増加が認められ、その結果、輸入 Z輸出細動脈径比の増加は有意に改善された。また、糸球体径の減少傾向が認められた。ェナラプリル投与群においても輸入細動脈径には有意な変化は認められず、輸出細動脈径の有意な増加のみが認められ、輸入/輸出細動脈径比の増加は改善された。また、糸球体径の減少傾向が認められた。

STZ誘発糖尿病性早期腎症ラットにおいて、化合物 Aの 4週間連続経口投与により尿中アルブミン及び 4型コラーゲン排泄量に対して改善作用を示した。また、全身血圧及び腎血流量などマクロな血行動態には影響を与えずに糸球体濾過率の増加を減弱させたことより、糸球体過剰濾過を直接的に抑制することが示唆された。化合物 Aは輸出細動脈径を増加させ、輸入 Z輸出細動脈径比の上昇を抑制したことにより、糸球体内圧上昇に対して改善作用を有することが示唆された。よつて化合物 Aは全身血行動態には影響せずに糸球体輸出細動脈を拡張させ糸球体血行動態に特異的に作用する事により、糸球体過剰濾過の発症ひいては糖尿病性早期腎症を改善したと考えられる。

本試験結果より、 A C E阻害剤であるェナラプリルも糸球体輸出細動脈を拡張させ糸球体過剰濾過の是正及び糖尿病性早期腎症改善作用を有することが示唆された。しかし、ェナラプリル投与群の糸球体濾過率は糖尿病対照群と同程度に増加しており、強い降圧作用と腎血流量の増加といったマクロな血行動態的変化による奏効機序を併せ持つことが示唆された。一方、化合物 Aはェナラプリルとは異なり、全身血行動態とは独立し糸球体血行動態に対する特異的な作用により糸球体過剰濾過を抑制し、糖尿病性早期腎症改善作用を示したと考えられる。試験例 5 微量アルブミン尿を呈する STZ誘発糖尿病性早期腎症ラット試験（1

6週間経口連続投与）

化合物 Aの 16 週間経口連続投与による微量アルブミン尿を呈する糖尿病性早期腎症ラットにおける腎症改善効果について、現在汎用されている治療薬であるェナラプリルを比較対照として検討した。

(方法） ① STZ誘発糖尿病性早期腎症ラットの作製

実験には雄性 Wi s t arラット（日本チヤ一ルス ' リバ—、 13週齢）を用いた。プロトコ一ルの概略を図 1 7に示した。ペントバルビタール（50 mg/kg)麻酔下にラット大腿静脈より STZ (50 rag/kg) をクェン酸バッファーに溶解して投与し糖尿病を誘発させた。正常群には STZの代わりに同液量の生理食塩水を静脈内投与した。

② STZ誘発糖尿病性早期腎症ラットにおける化合物 Aの腎症改善効果の検討

ラットは STZ投与 4週後に尿中アルブミン及び 4型コラーゲン排泄量、血圧、血糖値、尿糖値を測定し、各パラメ—ターが均等になるように糖尿病ラットを 4 群に分けた。

1 ) 正常群： 0. 5 メチルセルロース溶液経口投与（n=20)

2 ) 糖尿病対照群： 0. 55¾メチルセルロース溶液経口投与（n=20)

3 ) 化合物 A投与群：化合物 A · 1 / 2フマル酸塩（3mg/kg/day)経口投与（n=20)

4 ) ェナラプリル投与群：マレイン酸ェナラプリル（10mg/kg/day)経口投与 (n=20)

5 ) 化合物 A +ェナラプリル投与群：化合物 A · 1 / 2フマル酸塩（3mg/kg/day) +マレイン酸ェナラプリル（1 Omg/kg/day)経口投与（n=20)

群分け日より各薬物を 0. 5%メチルセルロース溶液に懸濁して 5 ml/kgの液量にて 1日 1回 16週間経口連続投与を行い、 4週毎に採血及び採尿（24時間蓄尿）、体重、尿量、飲水量、収縮期血圧の測定を行った。得られた血液は直ちに徐蛋白を行い、定法に基づき血糖値を測定した。また、得られた尿サンプルより尿中ァルブミン排泄量を算出した。また、尿中 4型コラーゲン濃度も測定し、同時に測定した尿中クレアチニン量で補正をして尿中 4型コラーゲン排泄量を算出した。尿糖値は定法に基づき測定を行った。また、連続投与 16週目の採尿実験の翌日にエーテル麻酔下に下大動脈より全採血を行い、血漿クレアチニン濃度を測定し、右腎臓を摘出して重量を測定した後に灌流固定して左腎臓を摘出して組織病変の検討を行った。

試験例 1と同様にして、クレアチニンクリアランス、収縮期血圧、血糖値、尿中 4型コラーゲン排泄量、尿中アルブミン排泄量を測定し、腎組織固定及び病理検査を行った。

糸球体病変は各ラットにっき 100個の糸球体を下記のスコア一に従って分類した。スコア一 0 ：異常なし/スコア一 1 ：糸球体の一部の上皮細胞あるいは係蹄壁に硝子様物質の沈着が見られる/スコア一 2 ：糸球体全体の上皮細胞あるいは係蹄壁に硝子様物質の沈着が見られる/スコア— 3 ：スコア一 2の変化に加え、糸球体の一部がポーマン嚢と癒着し、硬化像を呈する

尿細管病変は尿細管内の尿円柱の出現頻度によって下記のスコア一に従って分類した。スコア— 0 ：尿円柱なし Zスコア一 1 ：皮質あるいは髄質外帯の少数の尿細管に小型の尿円柱が散在する（切片上 10箇所以下） Zスコア一 2：皮質及び髄質外帯の少数の尿細管に大型の尿円柱が散在する（切片上 10箇所以上） /スコァ— 3：皮質及び髄質外帯の尿細管に大型の尿円柱が散在する（切片上 10箇所以上）

(結果）

正常群では経時的な体重増加が認められたが、糖尿病対照群では体重の増加は見られず、正常群に比して有意に減少していた。血糖値及び尿糖値は糖尿病対照群では糖尿病誘発後 4週目より有意な上昇が認められ、試験期間を通じて常に高血糖及び高尿糖を呈し続けた。また、糖尿病対照群では試験期間中を通じて常に尿量及び飲水量の顕著な増加が認められた。これらの糖尿病対照群で見られた体重減少、高血糖/尿糖、多飲多尿に対して化合物 A及びェナラプリルは何の影響も示さなかった。

尿中アルブミン及び 4型コラーゲン排泄量の薬物連投 16週後の結果を図 1 8に示した。正常群に比して糖尿病対照群において尿中アルブミン排泄量及び尿中 4 型コラーゲン排泄量の有意な増加が認められた。これらの尿中アルブミン及び 4 型コラーゲン排泄量増加に対して化合物 A投与群、ェナラプリル投与群及び化合物 A +ェナラプリル投与群はともに有意な改善効果を示した。 ③クレアチニンクリアランス及び収縮期血圧に対する化合物 Aの作用クレアチニンクリアランス及び収縮期血圧の薬物連投 16 週後の結果を図 1 9 に示した。正常群に比して糖尿病対照群ではクレアチニンクリアランスの有意な変化は認められなかったが、化合物 A投与群及び化合物 A +ェナラプリル投与群において有意な、ェナラプリル投与群において有意ではないが低下傾向が認められた。収縮期血圧においては、正常群に比して糖尿病対照群において低下傾向が認められた。化合物 A投与群では血圧に全く影響を示さなかったが、ェナラブリル及び化合物 A +ェナラプリル投与群では有意な降圧作用を示した。

④腎糸球体及び尿細管病変に対する化合物 Aの作用

糸球体及び尿細管病変出現率を図 2 0及び図 2 1に示した。糸球体病変においては、正常群での病変出現率は全体の約 5%であり、ほとんどがスコア - 1の軽度病変を示すに過ぎなかった。一方、糖尿病対照群では正常群と比較して病変の出現率及びその程度は顕著に増悪した。薬物投与群ではいずれの群においても糖尿病対照群との間で明らかな差は認められなかったが、糸球体硬化像を呈するスコァ— 3に着目した場合、化合物 A及び化合物 A +ェナラプリル投与群において改善傾向が見られた。尿細管病変出現率においては、正常群と比較して糖尿病対照群ではその頻度及び程度が増悪する傾向が認められた。化合物 A投与群では尿円柱の頻度及び程度を改善する傾向が認められたが、ェナラプリル投与群及び化合物 A +ェナラプリル群では改善は認められなかった。化合物 A投与による血圧に対する影響は全く起こらなかったのに対して、ェナラプリル及び化合物 A +ェナラプリル投与では有意な降圧作用が認められた。高血圧を有する糖尿病患者に A C E阻害薬を投与して血圧を下降させると尿中アルブミン排泄量が減少することはよく知られており、本試験においてもェナラブリル投与によって有意な降圧作用が認められたことより、ェナラプリルによる尿中アルブミン排泄量低下をはじめとする腎症改善作用機序の一部にこの降圧作用が関与していることが示唆された。一方、化合物 Aは降圧作用を有さないにも関わらずェナラプリルと同等の腎症改善作用を示したことから、降圧作用に依存せず、腎臓特異的な作用機序を有していることが示唆された。

糸球体硬化病変及び尿細管病変においては化合物 Aの投与によって改善傾向が認められたことより、化合物 Aは腎病変の進行を遅延させる効果を有している可能性が強く示唆された。化合物 Aは、パソプレシン受容体拮抗剤の 3つの問題点（① V _{1 A} V ₂拮抗作用を有し、純粋な V _{1 A}拮抗薬或いは V ₂拮抗薬が見出されていない、 ②慢性的に投与すると拮抗作用が消失して、ァゴニスト作用のみが残る、 ③種差が大きく、ラットでは極めて有効でありながら、ィヌ ·サル · ヒトではほとんど拮抗作用がみられない）を全て解決した優れたプロフィールの化合物であり、顕性期糖尿病性腎症ラットに対する治療効果 (タンパク尿、腎機能及び腎糸球体病変の改善）、及び、早期糖尿病性腎症ラットに対する治療効果 (アルブミン尿、腎糸球体過剰濾過の改善）は、ヒトの臨床においても充分に反映されると考えられる。試験例 6 早期糖尿病性腎症患者に対する臨床試験

(方法）

早期糖尿病性腎症患者に対する臨床試験は以下の条件で行った。

対象： I型糖尿病による早期腎症の患者 2 0名（4 5歳以上）

披検薬：化合物 A - 1 / 2フマル酸塩

剤形： 2 0及び 4 O m g錠

用量：ブラゼポ、 2 0、 6 0及び 1 2 0 m g Z日（1日 1又は 2回投与）投与期間： 6週間（2 8日）

投与方法：試験は多重中心、プラセボコントロールの二重盲検用量斬増法で行う。全ての患者に被検薬の 3段階の用量とプラセボを投与し、プラセボ投与期間は被検薬投与期間の間に無作為に割り当てる。各患者の全治療期間は 2 4週間であり、前後に Run- i n期間 2週間と Was h ou t期間 4週間が加わる。

評価指標：（一次指標）投与開始から治療後（2 4週）のアルブミン排泄量の変化。（二次指標）治療期間の最後の投与後、次の治療期間迄のアルブミン排泄量の変化。尿浸透圧、 4型コラーゲン、尿中 N—ァセチルー /3—D—グルコース— アミニダーゼ及び T G F— ]3排泄、静脈アルギニンバソプレシンの変化。

評価方法：

アルブミン排泄量と尿浸透圧は Run- in期の最後に 2 4時間 X 3回の蓄尿サンプルを用いて確実性のあるベースライン値を評価する。アルブミン排泄量と尿浸透圧は各治療期間の最後と次の治療開始の際に 2 4時間 X 3回の蓄尿サンプルを用いて再評価する。患者を各治療期間の初日（通院 4、 7、 1 0及び 1 3 ) に少なくとも 8時間入院させ、患者は各治療期間の最初の投与を病院で受ける。患者を最後の投与日（通院 4、 7、 1 0及び 1 3 ) に 2 4時間入院させ、患者は各治療期間の最後の投与を病院で受ける。尿中の 4型コラーゲン、クレアチニン、 N—ァセチルー i3— D—ダルコ一ス—アミニダーゼ及び T G F— j8量は通院 1の無作為化の前と通院 4、 7、 1 0、 1 3及び 1 4の際に少量の尿により測定して、生体マーカ一の治療効果を評価する。静脈アルギニンバソプレシンは通院 1、 4、 7、 1 0、 1 3及び 1 4の際に測定する。産業上の利用可能性

本発明によれば、顕性期糖尿病性腎症患者のタンパク尿、低下した腎機能及び腎糸球体病変の改善に有効な治療剤、及び Z又は、早期糖尿病性腎症患者のアルブミン尿と腎糸球体過剰濾過の改善及び疾患の進展の抑制に有効な治療剤を提供できる。

Claims

請求の範囲

1. (Z) 一 4'_ {4， 4—ジフルオロー 5— [2—ォキソ一 2— (4—ピペリジノピペリジノ）ェチリデン] 一 2， 3， 4, 5—テトラヒドロー 1 H— 1 一ベンゾァゼピン一 1—力ルポ二ル} 一 2—メチル— 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する顕性期糖尿病性腎症治療用医薬組成物。

2. 顕性期糖尿病性腎症患者のタンパク尿改善剤である請求の範囲第 1項記載の医薬組成物。

3. 顕性期糖尿病性腎症患者の腎機能改善剤である請求の範囲第 1項記載の医薬組成物。

4. 顕性期糖尿病性腎症治療剤の製造の為の（Z) — 4，一 {4, 4ージフルォロ — 5— [2—ォキソ— 2— (4—ピペリジノピペリジノ）ェチリデン] 一 2， 3, 4, 5—テトラヒドロ一 1 H— 1一ベンゾァゼピン一 1 _力ルポ二ル} 一 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩の使用。

5. (Z) —4，一 {4， 4—ジフルオロー 5— [2—ォキソ一 2一 (4ーピペリジノピペリジノ）ェチリデン] — 2， 3, 4, 5—テトラヒドロー 1 H— 1 一ベンゾァゼピン一 1—力ルポ二ル} 一 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、顕性期糖尿病性腎症の治療方法。

6 · (Z) _4，ー {4， 4ージフルオロー 5— [2—ォキソ一 2— (4ーピペリジノピペリジノ）ェチリデン] — 2， 3, 4, 5—テトラヒドロー 1 H— 1 一ベンゾァゼピン一 1一力ルポ二ル} ― 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する早期糖尿病性腎症治療用医薬組成物。

7. 早期糖尿病性腎症患者のアルブミン尿改善剤である請求の範囲第 6項記載の医薬組成物。

8. 早期糖尿病性腎症患者の腎糸球体過剰濾過の改善剤である請求の範囲第 6項記載の医薬組成物。

9. 早期糖尿病性腎症治療剤の製造の為の（Z) — 4，一 {4， 4ージフルオロー 5— [2—ォキソ一 2— (4—ピペリジノピペリジノ）ェチリデン] ー2， 3， 4, 5—テトラヒドロー 1H_ 1—ベンゾァゼピン一 1—カルボ二ル} 一 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩の使用。

1 0. (Z) 一 4，一 {4， 4—ジフルオロー 5 _ [2—ォキソ一 2— (4—ピぺリジノピペリジノ）ェチリデン] — 2, 3, 4, 5—テトラヒドロ一 1H— 1一ベンゾァゼピン一 1一カルボ二ル} 一 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、早期糖尿病性腎症の治療方法。

1 1 · (Z) 一 4，一 {4, 4ージフルオロー 5 - [2—ォキソ— 2 - (4ーピぺリジノビペリジノ）ェチリデン] 一 2, 3, 4， 5—テトラヒドロー 1H— 1—ベンゾァゼピン一 1一力ルポ二ル} - 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含有する糖尿病性腎症の進展抑制用医薬組成物。

1 2. 糖尿病性腎症の進展抑制剤の製造の為の（Z) -4'- {4, 4—ジフルォ Π- 5 - [2—ォキソ一 2— (4一ピペリジノピペリジノ) ェチリデン] - 2 , 3, 4, 5—テトラヒドロー 1 H— 1—ベンゾァゼピン一 1—力ルポ二ル} - 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩の使用。

1 3. (Z) -4'- {4, 4ージフルオロー 5— [2—ォキソ一 2— (4ーピぺリジノピペリジノ）ェチリデン] — 2， 3, 4, 5—テトラヒドロー 1H— 1一ベンゾァゼピン一 1一力ルポ二ル} - 2—メチルー 3—フラニリド又はその製薬学的に許容される塩の治療有効量を患者に投与することを含む、糖尿病性腎症の進展抑制方法。

14. (Z) 一 4'— {4, 4—ジフルオロー 5— [2—ォキソ _ 2— (4—ピぺリジノピペリジノ) ェチリデン] 一 2, 3, 4, 5—テトラヒドロー 1H— 1一ベンゾァゼピン— 1一力ルポ二ル} 一 2ーメチルー 3—フラニリド · 1 / 2フマル酸塩。