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WO2002061051A1 - Milieu de culture solide et procédé d'élaboration - Google Patents

Milieu de culture solide et procédé d'élaboration Download PDF

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Publication number
WO2002061051A1
WO2002061051A1 PCT/JP2001/006872 JP0106872W WO02061051A1 WO 2002061051 A1 WO2002061051 A1 WO 2002061051A1 JP 0106872 W JP0106872 W JP 0106872W WO 02061051 A1 WO02061051 A1 WO 02061051A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
water
amount
medium
solid medium
dissolved
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/006872
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuyoshi Sotoyama
Yasuo Fukuwatari
Yoichiro Yano
Kenji Kiyotaki
Minoru Nakagawa
Kenichiro Karino
Kazue Sasaki
Original Assignee
Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Morinaga Milk Industry Co., Ltd. filed Critical Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
Priority to EP01955635A priority Critical patent/EP1357179B1/en
Priority to KR1020037009964A priority patent/KR100540864B1/ko
Priority to US10/432,089 priority patent/US7176014B2/en
Priority to CA2428999A priority patent/CA2428999C/en
Priority to NZ526740A priority patent/NZ526740A/en
Priority to AU2001277742A priority patent/AU2001277742B8/en
Priority to JP2002561608A priority patent/JP3712708B2/ja
Priority to DE60133775T priority patent/DE60133775T2/de
Publication of WO2002061051A1 publication Critical patent/WO2002061051A1/ja
Priority to HK04106381A priority patent/HK1063644A1/xx

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
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    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
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    • G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/32—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Bacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a solid medium used for growth, testing, and the like of various microorganisms, and a method for producing the same.
  • Prior art 1 and prior art 2 are applied to improve the preservability of the medium, and must be dried until the final solid medium composition has a water content of 50% or less. Therefore, there is a problem that it takes a long time as much as about 3 hours to completely restore the medium at the time of use.
  • the restoration is not sufficient if the restoration is performed for a relatively short time of 1 to 10 minutes.
  • Staphylococcus aureus ATCC which is an important bacterial species for microbiological testing of foods, etc.
  • Bacillus 'Stealoza-Mophilus nore' Calli-lactis Bacillus 'Stealoza-Mophilus nore' Calli-lactis (Bacillus stearothermophilus lightning. It has a point. That is, the conventional dry solid medium has a problem that it takes a long time for reconstitution and is not suitable for a quick and accurate measurement test of the number of microorganisms.
  • An object of the present invention is to provide a solid medium which is excellent in water absorption rate, is capable of smearing a large amount of sample in a short time, and is most suitable for quick and accurate measurement of the number of microorganisms, and a method for producing the same. .
  • the present inventors have conducted intensive studies in view of the above-mentioned conventional technology, and as a result, dissolved each component of the solid medium in a larger amount of dissolved water than a predetermined amount, solidified the obtained solution, and dried the solidified medium.
  • the solid medium obtained by removing almost the same amount of water as the excess amount of dissolved water does not inhibit the growth of microorganisms due to drying, has excellent water absorption rate, and smears a large amount of sample in a short time
  • the present invention has been found to be a suitable solid medium for a rapid and accurate measurement of the number of microorganisms.
  • the present invention includes dissolving each component other than the dissolving water of the solid medium in the dissolving water, solidifying the obtained solution, and drying the solidified medium to remove water. It is an amount that the average water absorption rate of the solid medium for 10 minutes after the removal of water is at least 0.05 ml Z minutes, and the amount of dissolved water is almost the same as the amount of water to be removed, and it is larger than the predetermined amount.
  • a solid medium obtained by the method for producing a solid medium characterized by having an average water absorption rate of at least 0.05 ml Z min for 10 minutes hereinafter, also referred to as “solid medium of the present invention”). ).
  • the amount of water to be removed is preferably at least 5% of dissolved water, more preferably at least 30% of dissolved water.
  • the solid medium of the present invention preferably has a water content of at least 90%.
  • the present invention also includes dissolving each component other than the dissolved water of the solid medium in the dissolved water, solidifying the obtained solution, and drying the solidified medium to remove water.
  • the amount of water absorbed is 10 minutes average water absorption rate of the solid medium after removal of water is at least 0.05 ml / min, and the amount of dissolved water is almost the same as the amount of water to be removed, and is larger than a predetermined amount.
  • a method for producing a solid medium is .
  • the amount of water to be removed is preferably at least 5% of dissolved water, and more preferably at least 30% of dissolved water.
  • the solid medium means a medium which is solid when a plate, a slant medium, or the like solidified with a gelling agent such as agar is used.
  • the prescribed amount of dissolved water is the amount of water in the composition used to specify the medium, although the medium is generally specified (defined) by its composition.
  • the predetermined amount of dissolved water means the amount of water that is mixed to dissolve components other than water in the solid medium, and if there is a component in the solid medium that has been made into an aqueous solution, Does not include the amount of water.
  • the average water absorption rate for 10 minutes refers to the total weight (B) of a sample plate (circular, 9 cm outside diameter, 8.6 cm inside diameter (area: 58.1 cm 2 ), medium volume 15 g), and Add 10 ml of ion-exchanged water to the top to start absorbing water. After 10 minutes, discard the unabsorbed water, wipe off the water adhering to the Petri dish wall, and remove the total weight of the sample plate after the water absorption treatment ( A) is the water absorption rate calculated by the following formula. The measurement is performed at 25 ° C. If the area of the sample plate is different from the above area, conduct the test using ion-exchanged water in an amount of 10 ml per area, and convert to the water absorption rate per area.
  • the water content of the solid medium means the water content percentage (%) obtained by the water content Z (solid content + water content) X 100 in the solid medium. Both the water content and the solid content are weight.
  • the culture medium is a nutrient that allows microorganisms such as bacteria, yeasts, and molds to grow and proliferate, and is also a place for the growth.
  • the culture medium contains, as medium components, components necessary for the growth of microorganisms: sugars such as glucose and lactose; amino acids; nitrogen sources such as peptone, nitrate and ammonium salts; inorganic salts such as potassium, phosphorus and magnesium; and vitamins. And other growth factors.
  • the medium is roughly classified into a liquid medium in which the medium components are simply dissolved in dissolving water and a solid medium in which the gelling agent is added to the liquid medium and solidified.
  • the present invention provides a solid medium.
  • the solid medium of the present invention is, as defined above, a solid medium (culture medium) when a plate or a slant medium solidified with a gelling agent such as agar is used. ).
  • gelling agent examples include agar, gelatin, dielan gum, carrageenan and the like.
  • composition of the solid medium of the present invention include the following compositions. Ordinary agar medium, standard agar medium, deoxycholate agar medium, EMB medium, Endo medium specified in microbiological test methods such as the Japanese Food Sanitation Law, the Japanese Pharmacopoeia, and the International Dairy Federation Standards (IDF STANDARD) , BCP-supplemented plate agar medium, egg yolk-added mannitol salt agar medium, potato dextrose agar medium, bioredred bile lactose lactose (VRBL) agar medium, yeast extract-glucose-chloramphenicol-l-agar medium, acidic MRS medium, Ml 7 medium, Baird- Parker agar medium (ETGP agar medium), etc.
  • Ordinary agar medium standard agar medium, deoxycholate agar medium, EMB medium, Endo medium specified in microbiological test methods such as the Japanese Food Sanitation Law, the Japanese Pharmacopoeia
  • each predetermined amount of each component of each solid medium described in Reference 1 is shown.
  • the solid medium composition of a normal agar medium (pH 7.0-7.4) is as follows: meat extract 5 g, peptide 10 g, sodium chloride (NaC 1) 1-2 g, agar 12-15 g, purified water (dissolved) (Water) 1000 ml (1 liter) is each predetermined amount of each component.
  • the solid medium composition of the standard agar medium is 2.5 g of yeast extract, 5 g of peptone, 1 g of glucose, 15 g of agar, and 1000 ml (1 liter) of purified water (dissolved water). Each predetermined amount of a component.
  • the solid medium composition of Deoxycholate agar medium (pH 7.0-7.4) is 10 g of leptone, 10 g of lactose, 1 g of sodium deoxycholate, sodium chloride (NaC1) 5, K2HPO42 neutral red 0.033 g, iron citrate ammonium 2 g agar 15 g
  • Purified water (dissolved water) 1000 ml (1 liter) is the prescribed amount of each component.
  • Solid medium composition of the EMB medium (.. PH6 6 ⁇ 7 0) peptone 10 g, lactose 10:., K 2 HP0 4 2 g Eojin Y0 4 g, methylene blue one 0.065:, agar 18 g, distilled water (Dissolved water) 1000 ml (1 liter) is each predetermined amount of each component.
  • Endo medium solid medium composition (pH7. 0 ⁇ 7. 4), the peptone 10 g, meat E key scan 3 g, lactose 10 g, Na 2 S0 3 1. 6 g, basic fuchsin 0 .. 1 g, 15 g of agar and 1000 ml (1 liter) of purified water (dissolved water) are the prescribed amounts of each component.
  • the solid medium composition of the plate count agar medium with BCP (pH 6.0-7.0) is 2.5 g of yeast extract, 5 g of peptone, 1 g of glucose, 1 g of Tween 80, 0.1 g of L-cysteine, 0.1 g of bromide 0.06 g of cresol purple, 15 g of agar, and 1000 ml (1 liter) of purified water (dissolved water) are the prescribed amounts of each component.
  • Yolk-supplemented mannitol salt agar medium [pH 7.2 to 7.6, fresh yolk solution (dissolved yolk with the same amount of physiological saline) 50 to 60 ml are mixed after autoclaving before plating. I do.
  • the composition of the solid medium is as follows: meat extract 2.5 g, peptone 10 g, man 10 g of knit, 75 g of sodium chloride (NaC1), 0.025 g of phenol blade, 15 g of agar, and 1000 ml (1 liter) of purified water (dissolved water) are the prescribed amounts for each component.
  • the solid medium composition of the potato dextrose agar medium (pH 5.6 to 5.7) consists of 200 g of potato leachate, 20 g of glucose, 15 g of agar, and 100 ml (1 liter) of purified water (dissolved water) for each component. Each predetermined amount.
  • Roh Ioredzutoretsudo bile salt lactose VRBL
  • agar pH7. 4 ⁇ 0. 1
  • Yeast extract over dextrose - Kuroramufueniko solid body medium composition one Roux agar ( ⁇ 6 ⁇ 6), the yeast extract 5 g, Pudou sugar (C 6 H 12 0 6) 20g, Kuroramufue Nicole (CnH I2 Cl 2 N 2 05 ) or O carboxymethyl tetracycline (C Z 2H 3 0N 2 0 ,,) 0. 1 g, agar. 12 to 15 g, water (dissolved water) 1000 ml a predetermined amounts of each component.
  • the solid medium composition of the acidic MRS medium (adjusted to pH 5.4 with acetic acid) is 10 g of peptone 1 (trypsin digest of casein), 10 g of meat extract, 5 g of yeast extract (powder), 5 g of glucose ( C6H 06) 20:, Tween 80 (Sorbitan mono-oleate) lml, hydrogen orthophosphate dipotassium (K 2 HP0 4) 2 g , sodium acetate trihydrate (CH 3 C0 2 Na'3H 2 0 ) 5 g, Kuen monobasic Anmoniumu (C 6 H 6 0 7 ( NH 4) 2) 2 g, magnesium sulfate heptahydrate (MgS0 4 '7H 2 0) 0.
  • Manganese sulfate tetrahydrate (MnS0 4 - 4H 20 ) 0.05 g of agar, 9-18 g of agar, and 1000 ml of water (dissolved water) are quantitative for each component.
  • Ml 7 medium [pH 7.1-7.2, lactose (C HwOn) is mixed with 10% lactose (C 12 H 22 011) as a sterile aqueous solution after high-pressure steam sterilization before plate formation. ]
  • the solid medium composition is: peptone 1 (casein trypsin digest) 2.50 g, peptone 2 (meat pepsin digest) 2.50 g, peptone 3 (soybean papain digest) 5.00 g, yeast Extract (powder) 2.50 g, meat extract 5.00 g, 5-glycerol Emissions salt (disodium salt) (C 6 H 7 0 6 PNa 2) 19.
  • magnesium sulfate heptahydrate MgS0 4 '7H 2 0
  • 25 g Asukorubin acid
  • C 6 H 8 0 6 Asukorubin acid
  • 50 g lactose (d 2H 22 0n) 5 g
  • agar 9 18 g water (dissolved water) 1000 m 1 is the predetermined amounts of each component.
  • Baird-Parker agar medium [pH 6.8, 10 ml of 1% aqueous solution of potassium tellurite and 50 ml of 50% milk yolk are mixed after autoclaving before high pressure steam sterilization.
  • a solid medium What is necessary is just to dissolve each component of above in the dissolving water, and to solidify.
  • a predetermined amount of each medium component described in a literature or the like as a solid medium composition or newly specified (defined) is dissolved in dissolving water, the pH is adjusted as necessary, and the solution is added to the solution. Then, a gelling agent is added, heated and dissolved, sterilized, dispensed into a container such as a petri dish, and solidified.
  • the amount of water to be removed is such that the average water absorption rate of the solid medium after water removal for 10 minutes is at least 0.05 mlZ. This amount can vary depending on the medium composition (especially the gelling agent), but by using the method described in Test Example 3 below, a medium containing various excess amounts of dissolved water was prepared, and the average water absorption was measured for 10 minutes. It can be determined by measuring the speed.
  • the amount of water to be removed is preferably at least 5% of the dissolved water, more preferably at least 30% of the dissolved water.
  • the amount of the dissolved water in the solid medium is set to be larger than the predetermined amount in advance, so that the amount corresponds to the predetermined amount after the water is removed. Make sure that the amount of water to be included in the solid medium. Therefore, the amount of dissolved water should be substantially the same as the amount of water to be removed, and should be larger than the predetermined amount.
  • substantially the same amount means that the amount obtained by subtracting the amount of water to be removed from the total amount of dissolved water obtained by adding the increased amount to the predetermined amount is substantially the same as the predetermined amount (usually, 97 110 3%).
  • the additional amount of dissolved water is described in the literature as the solid medium composition, or when the amount of dissolved water (predetermined amount of dissolved water) in a newly specified composition is defined as 100%.
  • the amount of the dissolved water is 5 to 150%.
  • the solid medium of the present invention containing predetermined water and having a sufficient water absorption rate can be prepared as a result of the operation of drying and removing dissolved water.
  • the concentration of the agar is preferably 1.0 to 3% (by weight) with the amount of the dissolved water being 100%.
  • the heating and melting is preferably performed at 100 ° C.
  • sterilization can be performed together with the melting. Sterilization can be performed by a conventional method, a high-pressure steam sterilization method, or the like.
  • a petri dish When a petri dish is used as the container, it is preferable to dispense an amount of the solid medium after drying and removing in a range of 10 to 30 ml.
  • drying and removing method for removing water from the medium examples include a vacuum drying method, a vacuum drying method, a hot air drying method, an infrared drying method, and a high frequency drying method, but are not limited thereto. is not.
  • the solid medium of the present invention has an average water absorption rate of at least 0.05 ml / min for 10 minutes as defined above. If a solid medium of the standard size as defined above is absorbed by at least 0.5 ml per 10 minutes per plate, it is possible to apply a large amount of sample to the solid medium in a short time. It becomes possible.
  • a solid medium having an average water absorption rate of at least 0.05 ml / min for 10 minutes can be produced by drying the medium and removing an appropriate amount of water as described above.
  • the amount of medium per exposed area (area in contact with air) of the solid medium may be an amount that can provide the average water absorption rate in the above range for 10 minutes. If the medium volume is too small, a sufficient average water absorption rate of 10 minutes may not be obtained.
  • the solid medium of the present invention will contain approximately a predetermined amount of dissolved water after removal of water. Therefore, no inhibition of microbial growth due to drying is observed. This is because the predetermined amount of the dissolved water in the composition used for specifying the solid medium is determined so that the microorganism to be cultured grows. Alternatively, a medium having a composition that does not inhibit growth of the microorganism to be cultured is selected.
  • the water content of the solid medium is at least 90%.
  • microorganisms requiring a high water content can be cultured.
  • the solid culture medium when the water content in the final solid medium composition is less than 90%, microorganisms such as Suphylococcus aureus A TCC 6538 P Since the growth is almost completely inhibited, the solid culture medium must have a water content of at least 90% in order to culture this microorganism.
  • the solid medium of the present invention is suitable for culture without causing any inhibition of the growth of microorganisms such as NIZ0C953.
  • the solid culture medium of the present invention has a sufficient amount of water dissolved therein and is dried to maintain a sufficient water absorption rate and to grow microorganisms caused by drying. No inhibition is observed.
  • the solid medium composition of the standard agar medium is 2.5 g of yeast extract, 5 g of peptone, 1 g of glucose, 15 g of agar, 15 g of purified water (dissolved water) and 1000 ml of purified water (each component) as described in Reference 1. It is quantitative.
  • each of the medium components of 2.5 g of yeast extract, peptone 5 :, and 1 g of glucose is preferably used in an amount of 5 to 150% (50 to 1500 ml) based on a predetermined amount (1000 ml) of the dissolved water as 100%.
  • the pH of the solution was adjusted to 6.8 to 7.2, 15 g of agar was added, and the mixture was heated at 121 ° C for 15 minutes by high-pressure steam sterilization. And sterilize with dissolution.
  • Sterilizing the treated medium was aseptically dispensed sixteen to thirty-eight g minute per one Petri dish, cold ⁇ of reduced pressure a medium solidified later at a pressure of 10 3 Pa using a dryer (manufactured by LABC0NC0 companies) Dry by the drying method to remove dissolved water.
  • the gl-body culture medium produced by the above method has no rapid growth of microorganisms due to no inhibition of the growth of microorganisms due to drying, has a high water absorption rate, and can apply a large amount of sample in a short time. This is the most suitable solid medium for the measurement test.
  • yeast extract manufactured by Oriental Yeast
  • peptone manufactured by Difco
  • glucose manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the fixed amount 1000 ml was taken as 100%, and in addition to this amount, the amount of dissolved water (purified water) was dissolved in 1200 ml of dissolved water mixed with 20% (200 ml) to obtain about 1200 ml of a solution.
  • the pH of the lysis solution was adjusted to 7.2 using 0.1 mol / 1 sodium hydroxide solution, and 15 g of agar (manufactured by Ina Food Industry Co., Ltd.) was added. The mixture was heated at 121 ° C for 15 minutes using a sterilizer and sterilized with dissolution.
  • the water removal is performed by adding water equivalent to the total amount of dissolved water (200 ml) added in addition to the predetermined amount, ie, the total amount of dissolved water (purified water) (1200 ml) by 1 unit.
  • a value of 00% indicates that about 17% (200 ml) of water was removed by drying. Therefore, the water content of the solid medium is adjusted to about 98% by removing the water.
  • the solid medium (standard agar medium) plate manufactured by the above method was tested by the test method described below, and as a result, the average water absorption rate was 0.15 ml / min for 10 minutes, and it was possible to smear a large amount of sample. It was the best solid medium for rapid and accurate measurement of microbial count without any inhibition of microbial growth due to drying.
  • Example 2 Example 2
  • Meat extract (Merck) 2.5 g, Peptone (Difco) 10 g, Sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries) 75 g, Mannit (Wako Pure Chemical Industries) 10 g, and Phenol Red (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.025 g was added to the amount of dissolved water (purified water), assuming that a predetermined amount (1000 ml) of dissolved water (purified water) in a known solid medium composition was 100%.
  • a predetermined amount (1000 ml) of dissolved water (purified water) in a known solid medium composition was 100%.
  • the pH of the solution was adjusted to 7.4 using 0.1 mo 1/1 sodium hydroxide solution, and 15 g of agar (manufactured by Ina Food Industry Co., Ltd.) was added.
  • the solution was heated at 121 ° C for 15 minutes using Iwasaki Medical Instrument Co., Ltd.), and sterilized with dissolution.
  • the sterilized solid medium was poured into a 9 cm diameter plastic petri dish (manufactured by Eiken Keiki Co., Ltd.) in a sterile room at a rate of 16 g per sheet, cooled and solidified, and the solidified medium was dried using a dryer (manufactured by LABC0NCO).
  • the solution was dried under reduced pressure at a pressure of 10 3 Pa to remove about 1 ml of dissolved water.
  • a solid medium plate having a medium amount of 15 g was obtained.
  • the removal of the water is about 6%, with the total amount of dissolved water (purified water) (1066 ml) corresponding to the total amount of dissolved water (66 ml), which is greater than the predetermined amount, being 100%. (66 ml) of water was removed by drying.
  • the water content of the solid medium is adjusted to about 90%.
  • the solid medium (Mannite salt agar medium) plate produced by the above method was tested by the test method described below. As a result, the average water absorption rate was 0.07 ml / min for 10 minutes. Possible, microbial vegetation caused by drying of the genus Suirococcus It was the most suitable solid medium for the rapid and accurate measurement of the number of microorganisms without any growth inhibition.
  • a solid medium having a new composition was prepared by modifying the composition of a known solid medium.
  • the pH of the above solution was adjusted to 7.0 using 0.1 mo 1/1 sodium hydroxide solution, and 15 g of agar (manufactured by Ina Food Industry Co., Ltd.) was added. Heat at 121 ° C for 15 minutes using a medical instrument manufacturer, and reduce with melting.
  • the sterilized solid medium was poured into a 9 cm diameter plastic petri dish (manufactured by Eiken Kiki Co., Ltd.) in a sterile room at a rate of 20 g per sheet, cooled and solidified, and the solidified medium was dried using a dryer (manufactured by LABC0NC0).
  • the solution was dried by a vacuum drying method at a pressure of 10 3 Pa to remove 5 ml of dissolved water. As a result, a solid medium plate having a medium amount of 15 g was obtained.
  • the removal of the water is carried out by adding about 25% of the total amount of dissolved water (purified water) (1200 ml), which is equivalent to the total amount of dissolved water (300 ml) mixed more than the predetermined amount, ie, about 25%. % (300 ml) of dissolved water was removed by drying. Therefore, by removing the dissolved water, the water content of the solid medium was adjusted to about 96%.
  • the solid culture medium (ordinary agar medium) produced by the above method was tested by the test method described later.
  • the average water absorption rate was 0.17 ml / min for 10 minutes, and a large amount of sample could be smeared and dried. It was the most suitable solid medium for the rapid and accurate measurement of the number of microorganisms without any inhibition of the growth of microorganisms caused by the microorganism.
  • Test example 1 The average water absorption rate was 0.17 ml / min for 10 minutes, and a large amount of sample could be smeared and dried. It was the most suitable solid medium for the rapid and accurate measurement of the number of microorganisms without any inhibition of the growth of microorganisms caused by the microorganism.
  • This test was performed to compare the prior art with the present invention using the results of the microbial growth test as an index.
  • Sample 1 a solid medium produced by the same method as in Example 1 of the present invention.
  • Sample 2 Change the medium type to a standard agar medium, set the dispensed amount of medium and the amount of reconstituted water (sterile water) for dry solid medium to 15 ml, and set the reconstitution time for dry solid medium to 5 minutes.
  • Sample 3 Change the medium type to the standard agar medium, set the dispensed amount of medium and the amount of reconstituted water (sterile water) of dry solid medium to 15 ml, and set the reconstitution time of dry solid medium to 5 minutes.
  • the microbial growth of each sample was tested by the following test method.
  • Test strains were purchased from Staphylococcus aureus j ATCC 6538P, which was provided by the microorganism depositary organization American 'Type' cultivation company, Culture Co., Ltd., and from the Dutch Dairy Research Institute (NI ZO). Bacillus stearothermophi lus var. Calidolactis NIZ 0 C 9 o 3.
  • a predetermined amount of dissolved water with a known solid medium composition was used, that is, a known solid was used.
  • the solid medium composition of the standard agar medium is 2.5 g of yeast extract, 5 g of peptone, 1 g of glucose, 15 g of agar, and 1000 ml of purified water (predetermined amount of dissolved water). 0.1 ml of the diluted solution of the test strain was smeared on one plate of each sample. After culturing for an hour, the number of colonies was visually observed. The test was performed five times, and the average number of villages was calculated.
  • C953 was detected without any inhibition of its growth and proved to be excellent in that it was possible to quickly and accurately measure the number of microorganisms.
  • Sample 4 a solid medium produced by the same method as in Example 2 of the present invention, except that the dissolved water was removed by drying, and the water content of the solid medium was 90%.
  • Sample 5 A solid medium produced in the same manner as in Example 2 of the present invention except that the dissolved water was removed by drying, and the water content of the solid medium was adjusted to 80%.
  • the solid medium composition of the mannitol salt agar medium was 2.5 g of meat extract, 10 g of peptone, 75 g of sodium chloride, 10 g of mannitol, 0.025 g of phenolyl agar. 5 g, 100 ml of purified water (predetermined amount of dissolved water).
  • Sample 6 a solid medium produced by the same method as in Example 1 of the present invention except that the dissolved water was not mixed in more than a predetermined amount and the dried out of the dissolved water was not performed.
  • Sample 7 Dissolved water was added 2.5% more than the specified amount, and 2.5% of the total amount of this dissolved water was mixed.
  • Sample 8 A solid medium produced by the same method as in Example 1 of the present invention except that 5% of the dissolved water was added in a predetermined amount and 5% of the total amount of the dissolved water was dried and removed.
  • Sample 9 A solid produced by the same method as in Example 1 of the present invention except that 40% of the dissolved water was added in a predetermined amount and 30% of the total amount of the dissolved water was dried and removed. Culture medium.
  • the water absorption rate of each sample was tested by the following test method. The measurement was performed at 25 ° C.
  • the total weight (B) of the sample plate was measured, and the plate medium (circular, 9 cm outside diameter, 8.6 inside diameter) 10 ml of ion-exchanged water was added to the medium (area: 58.1 cm 2 ), medium volume 15 g) to start absorbing water. After 10 minutes, the water that had not been absorbed was discarded and attached to the petri dish wall. The attached water was wiped off, the total weight (A) of the sample plate after the water absorption treatment was measured, and the average water absorption rate for 10 minutes was calculated by the following equation.
  • the percentage of dry removal of dissolved water (e) is calculated from the reduced amount of water (c), which is monitored and determined in the same manner as in Test Example 2, with the total amount of dissolved water (d) being 100%. I get it.
  • the solid culture medium of the present invention produced by the production method of the present invention has an excellent water absorption rate, is capable of smearing a large amount of sample in a short time, and is most suitable for a rapid test for measuring the number of microorganisms.
  • the solid culture medium of the present invention produced by the production method of the present invention can apply a large amount of sample, it has high detection accuracy of microorganisms and is most suitable for an accurate measurement test of the number of microorganisms.
  • the solid culture medium of the present invention produced by the production method of the present invention does not show any inhibition of the growth of microorganisms due to drying, it is optimized for an accurate test for measuring the number of microorganisms.
  • the production method of the present invention has an excellent water absorption rate, enables a large amount of sample to be smeared in a short time, and enables production of a solid medium most suitable for quick and accurate measurement of the number of microorganisms.

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Description

明細 固体培地及びその製造方法 技術分野
本発明は、 各種微生物の増殖、 試験等に使用する固体培地及びその製造方法に 関する。 背景技術
従来、 固体培地を乾燥させた例として、 プラスチック製のシャーレに注入して 固化させたものを凍結真空乾燥した乾燥固体培地が知られている （特公昭 6 0 - 1 9 9 8 8号公報。 以下、 従来技術 1と記載する。 ） 。
また、 寒天等のゲル化剤を含み、 無菌水を添加すると容易にほぼフィルム化前 の培地に復元されるフィルム状の乾燥固体培地が知られている （特開平 6— 3 1 1 8 8 0号公報。 以下、 従来技術 2と記載する。 ） 。
しかしながら、 これらの従来技術には、 次に記載するとおりの問題点があった。 前記従来技術 1及び従来技術 2は、 培地の保存性を向上させるために適用され るもので、 最終的な固体培地組成中の水分含量が 5 0 %以下となるまで、 乾燥さ れていることから、 使用時の培地の完全な復元に約 3時間にも及ぶ長い時間を必 要とするという問題点を有している。
また、 前記従来技術により得られた乾燥固体培地は、 前記のとおり復元に長時 間を必要とするため、 1乃至 1 0分間という比較的短時間の復元では、 復元が不 十分であり、 微生物検査に使用した場合、 後記する試験例の結果から明らかなと おり、 培地が十分に復元していないため、 食品の微生物検査等において重要な菌 種であるス夕フイロコッカス 'ァウレウス （Staphylococcus aureus ) A T C C
6 5 3 8 P、 バシラス 'ステアロザ一モフィラス ·ノ レ 'カリ ドラクテイス (Bacillus stearothermophilus雷. calidolactis ) N I Z 0 C 9 5 3等の 微生物の生育が一部阻害され、 正確な微生物数を計測できないという問題点を有 している。 即ち、 従来の乾燥固体培地は、 復元のために長時間を要し、 迅速で正確な微生 物数の測定試験には適さないという問題点を有している。
また、 固体培地の作成後、 培地表面の過剰な水分を除くために、 乾燥すること が知られている。 この乾燥では、 所定の組成で作成した固体培地から溶解水の一 部が除去されることになるので、 実際に微生物が培養されるときの水分含量は、 固体培地の特定に用いられる組成における量である所定量からかなり異なること になる。 このような培地の乾燥が微生物の培養に与える影響は無視できないもの である。 例えば、 綿栓した試験管で培地を数週間保存した場合でも、 乾燥などの ために微生物の生育が悪くなることがあることが知られている。 また、 コント口 ールされた水分の除去が行われないので、 固体培地の組成が一定にならないこと がある。 従って、 微生物の培養試験、 特に培地の水分含量の影響を受けやすい微 生物の培養試験においては、 再現性のある正確な結果が得られないことがある。 発明の開示
本発明の目的は、 吸水速度に優れ、 短時間に大量の試料を塗抹することが可能 で、 迅速で正確な微生物数の測定試験に最適な固体培地、 及びその製造方法を提 供することである。
本発明者らは、 前記従来技術に鑑みて、 鋭意検討した結果、 固体培地の各成分 を所定量より多い量の溶解水に溶解し、 得られる溶液を固化し、 固化した培地を 乾燥して溶解水の過剰量とほぼ同量の水を除去することにより得られる固体培地 が、 乾燥に起因する微生物の生育阻害が認められず、 吸水速度に優れ、 短時間に 大量の試料を塗抹することが可能であり、 迅速で正確な微生物数の測定試験に最 適な固体培地であることを見い出し、 本発明を完成した。
本発明は、 固体培地の溶解水以外の各成分を溶解水に溶解し、 得られる溶液を 固化し、 固化した培地を乾燥して水を除去することを含み、 除去する水の量は、 水の除去後の固体培地の 1 0分間平均吸水速度が少なくとも 0 . 0 5 m l Z分と なる量であり、 溶解水の量は、 除去する水の量とほぼ同量、 所定量より多いこと を特徴とする固体培地の製造方法によって得られる、 1 0分間平均吸水速度が少 なくとも 0 . 0 5 m l Z分である固体培地 （以下、 「本発明の固体培地」 ともい う） を提供する。
本発明の固体培地においては、 除去する水の量が、 溶解水の少なくとも 5%で あることが好ましく、 溶解水の少なくとも 30%であることがさらに好ましい。 本発明の固体培地は、 水分含量が少なくとも 90%であることが好ましい。 本発明はまた、 固体培地の溶解水以外の各成分を溶解水に溶解し、 得られる溶 液を固化し、 固化した培地を乾燥して水を除去することを含み、 除去する水の量 は、 水の除去後の固体培地の 10分間平均吸水速度が少なくとも 0. 05ml/ 分となる量であり、 溶解水の量は、 除去する水の量とほぼ同量、 所定量より多い ことを特徴とする固体培地の製造方法を提供する。 .
本発明の製造方法においては、 除去する水の量が、 溶解水の少なくとも 5%で あることが好ましく、 溶解水の少なくとも 30%であることがさらに好ましい。 本明細書において、 固体培地とは、 寒天等のゲル化剤で固化させた平板、 斜面 培地等の使用時に固体状の培地を意味する。
溶解水の所定量とは、 培地は一般にその組成により特定 （定義） されているが、 その培地の特定に用いられる組成における水の量である。 溶解水の所定量とは、 固体培地の水以外の成分を溶解するために配合される水の量を意味し、 固体培地 の成分に水溶液とされた成分がある場合には、 この成分中の水の量は含まない。
10分間平均吸水速度とは、 試料平板 （円形、 外径 9 cm、 内径 8. 6 cm (面積： 58. 1 cm2) 、 培地量 15 g) の総重量 （B) を測定し、 平板培地 上にイオン交換水 10mlを添加して吸水を開始し、 10分経過時点で未吸水の 水を廃棄し、 シャーレ壁面に付着している水分を拭き取り、 吸水処理後の試料平 板の総重量 （A) を測定し、 次式により算出される吸水速度である。 測定は 25 °Cで実施される。 試料平板の面積が上記面積と異なる場合には、 上記面積当たり 10mlになる量のイオン交換水を用いて試験を行い、 上記面積当たりの吸水速 度に換算する。
吸水速度 （ml/分） = (A-B) /10
乾燥による水の除去量は、 乾燥減量の測定により算出される。 即ち、 乾燥前の 培地重量 （a) 及び乾燥後の培地重量 （b) から、 乾燥減量、 いわゆる減水量 (c) は、 a_b = cにより求められる。 次いで、 溶解水の総配合量 （d) と、 前記減水量 （c ) から水の除去量、 すなわち水の乾燥除去百分率 （e ) (%) が 次式により求まる。
e (%) = c /d x 1 0 0
固体培地の水分含量とは、 固体培地中の水分量 Z (固形分量 +水分量） X 1 0 0で求められる水分含量百分率 （％) を意味する。 なお、 水分量及び固形分量は ともに重量である。 発明を実施するための最良の形態
培地は、 細菌、 酵母、 又はカビ等の微生物を生育、 繁殖せしめる栄養物であり、 また、 その生育の場でもある。 通常培地は、 培地成分として、 微生物の生育に必 要な成分であるグルコース、 乳糖等の糖類、 アミノ酸、 ペプトン、 硝酸塩、 アン モニゥム塩等の窒素源、 カリウム、 リン、 マグネシウム等の無機塩類、 ビタミン 等の生育因子を含有している。 また培地は、.単に培地成分を溶解水に溶解させた 液体培地と液体培地にゲル化剤を添加して固化させた固体培地に大別されている。 本発明は固体培地を提供するものであり、 本発明の固体培地とは、 前記定義した とおり、 寒天等のゲル化剤で固化させた平板、 斜面培地等の使用時に固体状の培 地 （培養基） である。
ゲル化剤としては、 寒天、 ゼラチン、 ジエランガム、 カラギーナン等を例示す ることができる。
本発明の固体培地の組成を具体的に例示するならば、 以下のものの組成が挙げ られる。 日本国食品衛生法、 日本国薬局方、 国際酪農連盟の規格基準 （I D F STANDARD) 等の微生物試験法等に規定されている普通寒天培地、 標準寒天培地、 デォキシコレート寒天培地、 E MB培地、 遠藤培地、 B C P加プレートカウント 寒天培地、 卵黄加マンニット食塩寒天培地、 ポテトデキストロース寒天培地、 バ ィォレットレツド胆汁酸塩乳糖 （VRBL) 寒天培地、 酵母エキス—ブドウ糖一クロ ラムフヱニコ一ルー寒天培地、 酸性 MR S培地、 M l 7培地、 Baird— Parker寒 天培地 （ETGP寒天培地） 等 [日本薬学会編、 「乳製品試験法 ·注解」、 金原出版 株式会社、 第 1 1 1乃至 1 2 5頁、 平成 2年 4月 1 0日 （文献 1 ) 、 「I D F STANDARD (1991年改訂版） 」、 社団法人日本国際酪農連盟発行、 第 3 0 6頁、 第 470頁、 第 645乃至 647頁、 平成 3年 12月 25日 （文献 2)、 坂崎利一 監修、 「新 細菌培地学講座 '下11 (第二版） 」 、 株式会社近代出版、 第 62乃 至 63頁、 1996年 8月 15日 （文献 3) 。 ] である。
尚、 参考までに文献 1に記載される前記各固体培地の各成分の各所定量を示す。 普通寒天培地 （pH7. 0〜7. 4) の固体培地組成は、 肉エキス 5 g、 ぺプ トン 10 g、 塩化ナトリウム （NaC 1) 1〜2 g、 寒天 12〜15 g、 精製水 (溶解水） 1000ml ( 1リットル） が各成分の各所定量である。
標準寒天培地 （pH 6. 8〜7. 2) の固体培地組成は酵母エキス 2. 5 g、 ペプトン 5 g、 グルコース 1 g、 寒天 15 g、 精製水 （溶解水） 1000ml ( 1リツトル） が各成分の各所定量である。
デォキシコレート寒天培地 （pH7. 0〜7. 4) の固体培地組成は、 ぺプト ン 10 g、 乳糖 10 g、 デォキシコ一ル酸ナトリウム 1 g、 塩化ナトリゥム （N a C 1) 5 ：、 K2HPO42 ニュートラルレッド 0. 033 g、 クェン酸鉄 アンモニゥム 2 g 寒天 15 g 精製水 （溶解水） 1000ml ( 1リツ トル） が各成分の各所定量である。
EMB培地 （pH6. 6〜7. 0) の固体培地組成は、 ペプトン 10 g、 乳糖 10 ：、 K2HP042 g ェォジン Y0. 4 g、 メチレンブル一 0. 065 ：、 寒天 18 g、 精製水 （溶解水） 1000ml ( 1リットル） が各成分の各所定量 である。
遠藤培地 （pH7. 0〜7. 4) の固体培地組成は、 ペプトン 10 g、 肉ェキ ス 3 g、 乳糖 10 g、 Na2S031. 6 g、 塩基性フクシン 0.. 1 g、 寒天 15 g、 精製水 （溶解水） 1000ml ( 1リツトル） が各成分の各所定量である。
BCP加プレートカウント寒天培地 （pH6. 0〜7. 0) の固体培地組成は、 酵母エキス 2. 5 g、 ペプトン 5 g、 グルコース l g、 Twe e n 80 1 g、 L—システィン 0. 1 g、 ブロムクレゾールパープル 0. 06 g、 寒天 15 g、 精製水 （溶解水） 1000ml ( 1リツトル） が各成分の各所定量である。
卵黄加マンニット食塩寒天培地 [pH 7. 2〜7. 6.、 新鮮卵黄液 （卵黄を同 量の生理食塩水で溶解したもの） 50〜60mlは、 高圧蒸気滅菌後平板とする 前に混和する。 ] の固体培地組成は、 肉エキス 2. 5 g、 ペプトン 10 g、 マン ニット 10 g、 塩化ナトリウム （NaC 1) 75 g、 フエノ一ルレヅド 0. 02 5 g、 寒天 15 g、 精製水 （溶解水） 1000ml ( 1リットル） が各成分の各 所定量である。
ポテトデキストロース寒天培地 （pH 5. 6〜5. 7) の固体培地組成は、 ポ テト浸出液 200 g、 グルコース 20 g、 寒天 15 g、 精製水 （溶解水） 100 0ml ( 1リツトル） が各成分の各所定量である。
次に、 文献 2に記載される前記各固体培地の各成分の各所定量を示す。
ノ ィォレヅトレツド胆汁酸塩乳糖 （VRBL)寒天培地 （pH7. 4±0. 1) の 固体培地組成は、 ペプトン 7g、 酵母エキス 3 g、 乳糖 （C H^O ·Η20) 10 g、 塩化ナトリウム （NaCl) 5 s 胆汁酸塩 1. 5 g、 中性紅 0. 03 g、 クリ ス夕ルバイオレット 0. 002 g、 寒天 12〜 18 g、 水 （溶解水） 1000m 1が各成分の各所定量である。
酵母エキスーブドウ糖—クロラムフエニコ一ルー寒天培地 （ρΗ6· 6) の固 体培地組成は、 酵母エキス 5 g、 プドウ糖 （C6H1206) 20g、 クロラムフエ二 コール (CnHI2Cl2N205) 又はォキシテトラサイクリン (CZ2H30N20,,) 0. 1 g、 寒天 12〜 15 g、 水 （溶解水） 1000 mlが各成分の各所定量である。
酸性 MRS培地 （酢酸により pH 5. 4に調整。 ） の固体培地組成は、 ぺプト ン 1 (カゼインのトリプシン分解物） 10 g、 肉エキス 10 g、 酵母エキス （粉 末） 5 g、 グルコース （C6H 06) 20 ：、 Tween 80 (Sorbitan mono-oleate) lml、 オルトリン酸水素二カリウム （K2HP04) 2 g、 酢酸ナトリウム三水和物 (CH3C02Na'3H20) 5 g、 クェン酸二アンモニゥム （C6H607(NH4)2) 2 g、 硫酸 マグネシウム七水和物 （MgS04'7H20) 0. 2 g、 硫酸マンガン四水和物 （MnS04- 4H20) 0. 05 g、 寒天 9〜 18 g、 水 （溶解水） 1000mlが各成分の各所 定量である。
Ml 7培地 [pH 7. 1〜7. 2、 乳糖 （C HwOn) は 10%乳糖 （C12H220 11) 滅菌水溶液として、 高圧蒸気滅菌後平板とする前に混和する。 ] の固体培地 組成は、 ペプトン 1 (カゼインのトリプシン分解物） 2. 50 g、 ペプトン 2 (肉のペプシン分解物） 2. 50 g、 ペプトン 3 (大豆のパパイン分解物） 5. 00 g、 酵母エキス （粉末） 2. 50 g、 肉エキス 5. 00g、 5—グリセロリ ン酸塩 （ニナトリウム塩） （C6H706PNa2) 19. 00 g、 硫酸マグネシウム 7水 塩 （MgS04'7H20) 0. 25 g、 ァスコルビン酸 （C6H806) 0. 50 g、 乳糖 (d 2H220n) 5 g、 寒天 9 18 g、 水 （溶解水） 1000 m 1が各成分の各所定 量である。
次に、 文献 3に記載される前記各固体培地の各成分の各所定量を示す。
Baird—Parker寒天培地 （ETGP寒天培地） [pH6. 8、 亜テルル酸カリウム 1%水溶液 10ml及び卵黄 50%乳液 50 m 1は、 高圧蒸気滅菌後平板とする 前に混和する。 ] の固体培地組成は、 ペプトン 10 g、 肉エキス 5g、 酵母ェキ ス 1 g、 塩化リチウム 5 g、 グリシン 12 g、 ピルビン酸ナトリウム 10 g、 寒 天 17 g、 精製水 （溶解水） 1000mlが各成分の各所定量である。
次に、 本発明の固体培地の製造方法について説明する。
本発明の固体培地の製造方法においては、 溶解水の量が所定量より多いこと及 び固化の後に乾燥して水を除去することの他は、 通常の固体培地の製造と同様に、 固体培地の各成分の溶解水への溶解、 及び、 固化を行えばよい。 例えば、 固体培 地組成として文献等に記載されている、 又は新たに特定 （定義） された所定量の 各培地成分を溶解水に溶解し、 必要に応じて pHを調整し、 前記溶解液に、 ゲル 化剤を添加し、 加熱溶解し、 滅菌し、 シャーレ等の容器に分注し、 固化すればよ い。
除去する水の量は、 水の除去後の固体培地の 10分間平均吸水速度が少なくと も 0. 05mlZ分となる量である。 この量は、 培地組成 （特にゲル化剤） によ り変化し得るが、 後記試験例 3に記載のような方法により、 種々の過剰量の溶解 水を含む培地を作成して 10分間平均吸水速度を測定することにより、 定めるこ とができる。
除去する水の量は、 好ましくは、 溶解水の少なくとも 5%であり、 より好まし くは、 溶解水の少なくとも 30%である。
所定量の溶解水を用いて作成した固体培地に対し、 このような水の除去を行つ た場合、 水の除去後の固体培地における水の量はかなり少なくなり、 乾燥に起因 する微生物の生育阻害が認められることがある。 本発明においては、 固体培地の 溶解水の量を予め所定量よりも多くしておくことで、 水の除去後に所定量に相当 する水の量が固体培地に含まれるようにする。 従って、 溶解水の量は、 除去する 水の量とほぼ同量、 所定量より多くする。 ここでほぼ同量とは、 その多くした量 を所定量に加えた溶解水の総配合量から、 除去する水の量を除いた量が、 所定量 とほぼ同量 （通常には、 9 7〜1 0 3 %) になる量である。
通常には、 溶解水の追加量は、 固体培地組成として文献等に記載されている、 又は新たに特定された組成における溶解水量 （溶解水の所定量） を 1 0 0 %と定 義した場合に、 その 5乃至 1 5 0 %であり、 この量の溶解水を、 溶解水の所定量 に加えて、 多く配合する。 これにより、 溶解水の乾燥除去操作の結果物として、 所定の水分を含み、 かつ十分な吸水速度を有する本発明の固体培地が調製できる。 ゲル化剤として寒天を使用した場合には、 寒天の添加濃度は、 前記溶解水の所 定量を 1 0 0 %として、 その 1 . 0乃至 3 % (重量） が好ましい。 また、 加熱溶 解は、 寒天を十分に溶解するので、 1 0 0 °C以上が好ましく、 1 2 1 °Cで 1 5分 以上加熱すれば、 溶解と共に滅菌することもできる。 滅菌は、 常法により、 高圧 蒸気滅菌法等により実施することができる。
容器としてシャーレを使用した場合には、 乾燥除去後の固体培地の量が 1 0乃 至 3 0 m lの範囲の量を分注することが好ましい。
培地からの水の除去のための乾燥除去方法としては、 減圧乾燥法、 真空乾燥法、 温風乾燥法、 赤外線乾燥法、 高周波乾燥法等を例示することができるが、 これら に限定されるものではない。
本発明の固体培地は、 上記の定義による 1 0分間平均吸水速度が少なくとも 0 . 0 5 m l /分である。 上記の定義に示したような標準的な大きさの固体培地 1平 板当たり 1 0分間で少なくとも 0 . 5 m lの吸水があれば、 固体培地に、 短時間 に大量の試料を塗抹することが可能となる。 1 0分間平均吸水速度が少なくとも 0 . 0 5 m l /分である固体培地は、 培地を乾燥して、 上述のような適当量の水 を除去することにより製造できる。 なお、 固体培地の露出面積 （空気に触れる面 積） 当たりの培地量は、 上記の範囲の 1 0分間平均吸水速度が得られる量であれ ばよい。 培地量が少なすぎると、 十分な 1 0分間平均吸水速度が得られないこと がある。
本発明の固体培地は、 水の除去後にほぼ所定量の溶解水を含んでいることにな るため、 乾燥に起因する微生物の生育阻害が認められない。 固体培地の特定に用 いられる組成における溶解水の所定量は、 培養しょうとする微生物が生育するよ うに定められるからである。 あるいは、 培養しょうとする微生物に対し、 生育阻 害の認められない組成の培地が選択されるからである。
固体培地の水分含量は少なくとも 90%であることが好ましい。 これにより、 高い水分含量を要求する微生物も培養することができる。 例えば、 後記する試験 例の結果からも明らかなとおり、 最終的な固体培地組成中の水分含量を 90%未 満とした場合、 ス夕フイロコヅカス 'ァウレウス (Staphylococcus aureus) A TCC 6538 P等の微生物の生育がほぼ完全に阻害されるため、 この微生物 を培養するためには、 固体培地の水分含量を少なくとも 90%とすることが必要 である。
更に、 比較的乾燥に弱く、 食品の微生物検査等において重要な菌種であるス夕 フイロコッカス ·ァウレウス （Staphylococcus aureus ) AT C C 6538 P、 バシラス ·ステアロザ一モフィラス ·ノ レ ·力リ ドラクテイス （Bacillus stear othermophilus var. calidolactis ) N I Z 0 C 953等の微生物の生育の阻 害を一切惹起させずに培養するためには、 本発明の固体培地が適している。 本発 明の固体培地は、 前記のとおり、 固体培地の溶解水の量を所定量より多く配合し て、 乾燥することにより、 十分な吸水速度を ί 持し、 かつ乾燥に起因する微生物 の生育阻害が認められない。
本発明の固体培地の製造方法の理解を一層容易とするため、 前記文献 1に記載 の標準寒天培地の製造方法を例として説明する。
即ち、 標準寒天培地の固体培地組成は文献 1に記載されるとおり、 酵母エキス 2. 5 g、 ペプトン 5 g、 グルコース 1 g、 寒天 15 g、 精製水 （溶解水） 10 00mlが各成分の各所定量である。
よって、 酵母エキス 2. 5 g、 ペプトン 5 ：、 及びグルコース 1 gの各培地成 分を、 溶解水の所定量 （ 1000ml) を 100%として、 この量より好ましく は 5乃至 150% (50乃至 1500ml) 多く配合した溶解水に溶解し、 約 1 050ml乃至 2500mlの溶解液を得る。 前記溶解液の p Hを 6. 8乃至 7. 2に調整し、 寒天 15 gを添加し、 高圧蒸気滅菌法により 12 1°Cで 15分加熱 し、 溶解と共に滅菌する。
滅菌処理済みの培地を無菌的にシャーレに 1枚当たり 16〜38 g分注し、 冷 却固化し、 のち固化した培地を乾燥機 （LABC0NC0社製） を使用して 103Paの 圧力で減圧乾燥法により乾燥し、 溶解水を除去する。
前記乾燥除去により、 溶解水の過剰に配合した量の水を除去し、 かつ 10分間 平均吸水速度が少なくとも 0. 05mlZ分である固体培地を調製する。
前記方法により製造された gl体培地は、 乾燥に起因する微生物の生育阻害が認 められず、 吸水速度に優れ、 短時間に大量の試料を塗抹することが可能で、 迅速 で正確な微生物数の測定試験に最適な固体培地である。 実施例
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、 本発明は以下の実施例に 限定されるものではない。 実施例 1
酵母エキス （オリエンタル酵母社製） 2. 5 g、 ペプトン （ディフコ社製） 5 g、 及びグルコース （和光純薬工業社製） 1 gを、 既知の固体培地組成における 溶解水 （精製水） の所定量 （ 1000ml) を 100%として、 この量に加えて、 溶解水 （精製水） の量を 20% (200ml) 多く配合した溶解水 1200ml に溶解し、 約 1200mlの溶解液を得た。 前記溶解液の pHを、 0. lmo l /1水酸化ナトリウム溶液を使用して、 7. 2に調整し、 寒天 （伊那食品工業社 製） 15 gを添加し、 オートクレープ （岩楣医療器械製作所社製） を使用して 1 21°Cで 15分加熱し、 溶解と共に滅菌した。
滅菌処理済みの固体培地を無菌室内で直径 9 cmのプラスチック製シャーレ
(栄研器材社製） に 1枚当たり 18 g分注し、 冷却固化し、 固化した培地を乾燥 機 （LABC0NC0社製） を使用して 103Paの圧力で減圧乾燥法により乾燥し、 水 3mlを除去した。 この結果、 培地量 15 gの固体培地平板が得られた。
前記水の除去は、 前記所定量に加えて多く配合した溶解水の量 （ 200ml) の全量に相当する水、 即ち、 溶解水 （精製水） の総配合量 （1200ml) を 1 00%として、 約 17% (200ml) の水を乾燥により除去したことを示す。 よって、 前記水の除去により、 固体培地の水分含量は、 約 98%に調整される。 前記方法により製造された固体培地 （標準寒天培地） 平板は、 後記試験方法で 試験した結果、 10分間平均吸水速度は 0. 15 ml/分であり、 大量の試料を 塗抹することが可能で、 乾燥に起因する微生物の生育阻害が認められない迅速で 正確な微生物数の測定試験に最適な固体培地であった。 実施例 2
肉エキス （メルク社製） 2. 5 g、 ペプトン （ディフコ社製） 10 g、 塩化ナ トリウム （和光純薬工業社製） 75 g、 マンニット （和光純薬工業社製） 10 g、 及びフヱノールレッド （和光純薬工業社製） 0. 025 gを、 既知の固体培地組 成における溶解水 （精製水） の所定量 （ 1000ml) を 100%として、 この 量に加えて、 溶解水 （精製水） の量を 6. 6% (66ml) 多く配合した溶解水 1066 m 1に溶解し、 約 1066 m 1の溶解液を得た。 前記溶解液の p Hを、 0. 1 mo 1/1水酸化ナトリウム溶液を使用して、 7. 4に調整し、 寒天 （伊 那食品工業社製） 15 gを添加し、 ォ一トクレーブ （岩楣医療器械製作所社製） を使用して 12 1°Cで 15分加熱し、 溶解と共に滅菌した。
滅菌処理済みの固体培地を無菌室内で直径 9 cmのプラスチック製シャーレ (栄研器材社製） に 1枚当たり 16 g分注し、 冷却固化し、 固化した培地を乾燥 機 （LABC0NCO社製） を使用して 103Paの圧力で減圧乾燥法により乾燥し、 溶 解水約 lmlを除去した。 この結果、 培地量 15 gの固体培地平板が得られた。 前記水の除去は、 前記所定量より多く配合した溶解水の量 （66ml) の全量 に相当する水、 即ち、 溶解水 （精製水） の総配合量 （1066ml) を 100% として、 約 6% (66ml) の水を乾燥により除去したことを示す。
よって、 前記溶解水の除去により、 固体培地の水分含量は、 約 90%に調整さ れる。
前記方法により製造された固体培地 （マンニット食塩寒天培地） 平板は、 後記 試験方法で ¾験した結果、 10分間平均吸水速度は 0. 07ml/分であり、 大 量の試料を塗抹することが可能で、 ス夕フイロコッカス属の乾燥に起因する微生 物の生育阻害が認められない迅速で正確な微生物数の測定試験に最適な固体培地 であった o 実施例 3
既知の固体培地の組成を改変した新たな組成の固体培地を作成した。
ペプトン （ディフコ社製） 10 g、 肉エキス （メルク社製） 5 g、 及び塩化ナ トリウム （和光純薬工業社製） 2 gを、 既知の固体培地組成における溶解水 （精 製水） の所定量 （ 1000ml) より少ない 900mlを所定量とし、 この量を 100%として、 この量に加えて、 溶解水 （精製水） の量を約 33. 3% (30 0 ml) 多く配合した溶解水 1200mlに溶解し、 約 1200 m 1の溶解液を 得た。 前記溶解液の pHを、 0. 1 mo 1/1水酸化ナトリウム溶液を使用して、 7. 0に調整し、 寒天 （伊那食品工業社製） 15 gを添加し、 ォ一トクレーブ (岩楣医療器械製作所社製） を使用して 121°Cで 15分加熱し、 溶解と共に減 し/こ o
滅菌処理済みの固体培地を無菌室内で直径 9 cmのプラスチック製シャーレ (栄研器材社製） に 1枚当たり 20 g分注し、 冷却固化し、 固化した培地を乾燥 機 （LABC0NC0社製） を使用して 103Paの圧力で減圧乾燥法により乾燥し、 溶 解水 5mlを除去した。 この結果、 培地量 15 gの固体培地平板が得られた。 前記水の除去は、 前記所定量より多く配合した溶解水の量 （ 300ml) の全 量に相当する水、 即ち、 溶解水 （精製水） の総配合量 （ 1200ml) を 100 %として、 約 25% (300ml) の溶解水を乾燥により除去したことを示す。 よって、 前記溶解水の除去により、 固体培地の水分含量は、 約 96%に調整さ れ 。
前記方法により製造された固体培地 （普通寒天培地） 平板は、 後記試験方法で 試験した結果、 10分間平均吸水速度は 0. 17ml/分であり、 大量の試料を 塗抹することが可能で、 乾燥に起因する微生物の生育阻害が認められない迅速で 正確な微生物数の測定試験に最適な固体培地であった。 試験例 1
この試験は、 微生物生育試験の結果を指標として、 従来技術と本発明を比較す るために行った。
( 1 ) 試料の調製
次に示す 3種類の試料をそれぞれ 5回反復して調製した。
試料 1 ：本発明の実施例 1と同一の方法により製造した固体培地。
試料 2 ：培地の種類を標準寒天培地に変更し、 培地の分注量及び乾燥固体培地の 復元水 （滅菌水） の量をそれそれ 15mlとし、 乾燥固体培地の復元時 間を 5分間とし、 余分な復元水 （遊離水） を傾斜して放棄したことを除 き、 従来技術 1の実施例 1と同一の方法により製造した固体培地。
試料 3 ：培地の種類を標準寒天培地に変更し、 培地の分注量及び乾燥固体培地の 復元水 （滅菌水） の量をそれそれ 15mlとし、 乾燥固体培地の復元時 間を 5分間とし、 余分な復元水 （遊離水） を傾斜して放棄したことを除 き、 従来技術 2の実施例 1と同一の方法により製造した固体培地。
( 2 ) 試験方法
各試料の微生物生育を、 次の試験方法により試験した。
試験菌株として、 微生物寄託機関であるァメリカン 'タイプ 'カルチヤ一 ·コ レクシヨンより分譲されたス夕フィロコ ヅカス ·ァゥレウス （Staphylococcus a ureus j ATCC 6538 P、 及びオランダ酪農研究所 （NI ZO) より分譲 されたバシラス ·ステアロザ一モフィラス ·ノ ル ·力リ ドラクテイス （Bacillus stearothermophi lus var. calidolactis ) N I Z 0 C 9 o 3を使用した。 既知の固体培地組成による所定量の溶解水を使用し、 即ち、 既知の固体培地組 成の溶解水量をそのまま使用し、 乾燥工程を付加することなく、 従来どおり、 常 法で調製した標準寒天培地の 1平板に 0. 1ml塗抹し、 37°Cで 48時間培養 した場合に、 前記試験菌株の 100個の集落が得られる各試験菌株の希釈液を調 製した。
尚、 標準寒天培地の固体培地組成は、 酵母エキス 2. 5 g、 ペプトン 5 g、 グ ルコース 1 g、 寒天 15 g、 精製水 1000ml (溶解水の所定量） である。 各試料の 1平板に、 前記試験菌株の希釈液を 0. 1ml塗抹し、 37°〇で48 時間培養し、 集落数を肉眼で観察した。 尚、 試験は 5回行い、 集落数の平均値を 算出した。
( 3 ) 試験結果
この試験の結果は、 表 1に示すとおりである。 表 1から明らかなとおり、 従来 技術の試料 2及び試料 3に比較して、 本発明の試料 1が、 食品の微生物検査等に おいて重要な菌であるス夕フイロコッカス 'ァウレウス （Staphylococcus aureu s) A T C C 6 5 3 8 P、 及びバシラス ·ステアロザーモフィラス ·ノ レ ·力 U ドラクテイス (Bacillus stearothermophi lus var. calido丄 actis ) N I Z 0
C 9 5 3の生育が一切阻害されることなく検出され、 迅速に正確な微生物数の 計測ができる点で優れていることが判明した。
以上の結果から、 従来技術の乾燥固体培地は、 復元のために長時間を必要とし、 迅速で正確な微生物数の測定試験には適さないということが判明した。
尚、 培地の種類、 培地の分注量及び乾燥固体培地の復元水 （滅菌水） の量、 並 びに、 乾燥固体培地の復元時間を 1乃至 1 0分間の範囲で適宜変更して試験した が、 ほぼ同様の結果が得られた。 表 1
Figure imgf000016_0001
試験例 2
この試験は、 微生物生育試験の結果を指標として、 固体培地の適正な水分含量 を調べるために行った。 ( 1 ) 試料の調製
次に示す 2種類の試料をそれそれ 5回反復して調製した。
試料 4 ：乾燥して溶解水を除去し、 固体培地の水分含量を 9 0 %としたことを除 き、 本発明の実施例 2と同様の方法により製造した固体培地。 試料 5 ：乾燥して溶解水を除去し、 固体培地の水分含量を 8 0 %としたことを除 き、 本発明の実施例 2と同様の方法により製造した固体培地。
( 2 ) 試験方法
各試料の微生物生育を、 試験菌株として、 前記ス夕フイロコッカス ·ァウレゥ ス （Staphylococcus aureus ) A T C C 6 5 3 8 Pのみを使用したことを除き、 前記試験例 1の試験方法と同一の方法により試験した。
また、 乾燥に伴う固体培地の水分含量の変化は、 乾燥減量によりモニタ一した。 即ち、 乾燥前の培地重量 （a ) 及び乾燥後の培地重量 （b ) から、 乾燥減量、 い わゆる減水量 （c ) を、 a— b = cにより求めた。 次いで、 溶解水の総配合量よ り、 前記減水量 （c ) を除いて残存する水分量を求めた。 この残存水分量及び前 記水分含量の定義に基づいて、 乾燥後の水分含量を求め、 乾燥に伴う固体培地の 水分含量の変化をモニタ一した。
尚、 マンニット食塩寒天培地の固体培地組成は、 肉エキス 2 . 5 g：、 ペプトン 1 0 g：、 塩化ナトリウム 7 5 g、 マンニット 1 0 g、 フエノ一ルレヅド 0 . 0 2 5 g寒天 1 5 g、 精製水 1 0 0 0 m l (溶解水の所定量） である。
( 3 ) 試験結果
この試験の結果は、 表 2に示すとおりである。 表 2から明らかなとおり、 固体 培地の水分含量を、 8 0 %、 いわゆる 9 0 %未満とした場合、 ス夕フイロコッカ ス ·ァウレウス （Staphylococcus aureus) A T C C 6 5 3 8 Pの生育がほぼ 完全に阻害されることから、 微生物数が測定不可能となり、 正確な微生物数の計 測のためには、 水分含量が少なくとも 9 0 %であることが必要であることが判明 し,
尚、 培地の種類を適宜変更し、 水分含量を変更して試験したが、 ほぼ同様の結 果が得られた。 表 2
Figure imgf000018_0001
試験例 3
この試験は、 吸水速度試験の結果を指標として、 固体培地組成として文献等に 記載されている溶解水量を 1 0 0 %として、 この溶解水の適正な除去量 （％) を 調べるために行った。
( 1 ) 試料の調製
次に示す 4種類の試料をそれそれ 5回反復して調製した。
試料 6 ：溶解水を所定量より多く配合せず、 溶解水の乾燥除去を行わないことを 除き、 本発明の実施例 1と同様の方法により製造した固体培地。 試料 7 ：溶解水を所定量の 2 . 5 %多く配合し、 この溶解水の総配合量の 2 . 5
%を乾燥除去したことを除き、 本発明の実施例 1と同様の方法により製' 造した固体培地。
試料 8 ：溶解水を所定量の 5 %多く配合し、 この溶解水の総配合量の 5 %を乾燥 除去したことを除き、 本発明の実施例 1と同様の方法により製造した固 体培地。
試料 9 ：溶解水を所定量の 4 0 %多く配合し、 この溶解水の総配合量の 3 0 %を 乾燥除去したことを除き、 本発明の実施例 1と同様の方法により製造し た固体培地。
( 2 ) 試験方法
各試料の吸水速度を、 次の試験方法により試験した。 尚、 測定は 2 5 °Cで実施 した。
試料平板の総重量 （B ) を測定し、 平板培地 （円形、 外径 9 c m、 内径 8 . 6 cm (面積： 58. 1 cm2) 、 培地量 15 g)上にイオン交換水 10 mlを添 加して吸水を開始し、 10分経過時点で未吸水の水を廃棄し、 シャーレ壁面に付 着している水分を拭き取り、 吸水処理後の試料平板の総重量 （A) を測定し、 次 式により 10分間平均吸水速度を算出した。
吸水速度 （ml/分） = (A-B) /10
また、 溶解水の乾燥除去百分率 （e) は、 溶解水の総配合量 （d) を 100% として、 前記試験例 2と同一の方法でモニタ一され求まる減水量 （c) から、 次 式により求まる。
e (%) =c/dx 100
( 3 ) 試験結果
この試験の結果は、 表 3に示すとおりである。 表 3から明らかなとおり、 培地 を乾燥し、 溶解水の少なくとも 5%を除去した場合、 吸水速度が少なくとも 0. 05 ml/分となることから、 短時間に大量の試料を塗抹することが可能となり、 従って、 迅速な微生物数の測定のためには、 溶解水の少なくとも 5%を除去する ことが必要であることが判明した。 また、 溶解水の少なくとも 30%を除去した 場合、 吸水速度が少なくとも 0. 2ml/分となることから、 短時間に一層大量 の試料を塗抹することが可能となり、 従って迅速な微生物数の測定のためには、 溶解水の少なくとも 30%を除去することが好ましいことが判明した。
尚、 培地の種類を適宜変更して試験したが、 ほぼ同様の結果が得られた。
表 3
Figure imgf000020_0001
産業上の利用の可能性
本発明により奏せられる効果は次のとおりである。
1 ) 本発明の製造方法により製造される本発明の固体培地は、 吸水速度に優れ、 短時間に大量の試料を塗抹することが可能であり、 迅速な微生物数の測定試験に 最適である。
2 ) 本発明の製造方法により製造される本発明の固体培地は、 大量の試料を塗 抹することができることから、 微生物の検出精度が高く、 正確な微生物数の測定 試験に最適である。
3 ) 本発明の製造方法により製造される本発明の固体培地は、 乾燥に起因する 微生物の生育阻害が認められないことから、 正確な微生物数の測定試験に最適で める。
4 ) 本発明の製造方法により吸水速度に優れ、 短時間に大量の試料を塗抹する ことが可能で、 迅速で正確な微生物数の測定試験に最適な固体培地を製造するこ とができる。 '

Claims

請求の範囲
1. 固体培地の溶解水以外の各成分を溶解水に溶解し、 得られる溶液を固化 し、 固化した培地を乾燥して水を除去することを含み、 除去する水の量は、 水の 除去後の固体培地の 10分間平均吸水速度が少なくとも 0. Ο δπιΐΖ分となる 量であり、 溶解水の量は、 除去する水の量とほぼ同量、 所定量より多いことを特 徴とする固体培地の製造方法によって得られる、 10分間平均吸水速度が少なく とも 0. 05 ml/分である固体培地。
2. 除去する水の量が、 溶解水の少なくとも 5%である請求項 1記載の固体 培地。
3. 除去する水の量が、 溶解水の少なくとも 30%である請求項 1記載の固 体培地。
4. 固体培地の水分含量が少なくとも 90 %である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の固体培地。
5. 固体培地の溶解水以外の各成分を溶解水に溶解し、 得られる溶液を固化 し、 固化した培地を乾燥して水を除去することを含み、 除去する水の量は、 水の 除去後の固体培地の 10分間平均吸水速度が少なくとも 0. 05ml/分となる 量であり、 溶解水の量は、 除去する水の量とほぼ同量、 所定量より多いことを特 徴とする固体培地の製造方法。
6. 除去する水の量が、 溶解水の少なくとも 5%である請求項 5記載の製造 方法。
7. 除去する水の量が、 溶解水の少なくとも 30%である請求項 5記載の製 造方法。
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